CN105899663B - 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途 - Google Patents

用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用了miRNA的新的人工模拟miRNA。将单链核酸作为人工模拟miRNA，所述单链核酸的X区域和Y区域连结，所述X区域为成熟miRNA的引导链序列或其部分序列，由相对于所述Y区域的连结侧区域(XB)及非连结侧区域(XF)构成，所述连结侧区域(XB)为在该区域内不进行分子内退火的序列，所述Y区域为与所述X区域的所述非连结侧区域(XF)进行分子内退火的序列。根据该人工模拟miRNA，可以抑制所述目标基因的表达。

Description

用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途
技术领域
本发明涉及一种抑制基因表达的人工模拟miRNA及其用途。
背景技术
已知微RNA(miRNA)作为抑制基因的表达的核酸分子，例如，报道有经过如下的生成工艺抑制基因所编码的蛋白质的转录。即，首先在核内生成miRNA转录产物(Pri-miRNA)。所述Pri-miRNA在5’末端具有帽子结构，在3’末端具有聚(A)。该Pri-miRNA被RNase(Drosha)切断，生成miRNA前体(Pre-miRNA)。所述Pre-miRNA采取具有环区域和茎区域的发夹结构。该Pre-miRNA移动至核外之后，被细胞质的RNase(Dicer)分解，双链的miRNA(成熟miRNA)被切出。所述成熟miRNA在各链的3’末端具有1～4个碱基的突出端。该双链的miRNA中，一条链被称为引导链，另一条链被称为过客链，所述引导链与类似于RNA诱导沉默复合体(RNA induced Silencing Complex，RISC)的复合体结合。通过该miRNA/RISC复合体与特定的mRNA的3’非翻译区域(3’UTR)结合，抑制来自所述mRNA的蛋白质的翻译。
已知miRNA与分化、细胞增殖、凋亡等生命现象或病毒感染症，癌等许多疾病密切相关(专利文献1、非专利文献1、非专利文献2)。由此，特别期待医疗区域中的应用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/056737A2
非专利文献
非专利文献1：Deiters,2009,The AAPS Journal,12,51-60
非专利文献2：Takeshita etal.,2010,Mol.Ther.,18,181-187
发明内容
发明所要解决的问题
在应用所述miRNA时，例如有使用双链的成熟miRNA的方法、使用所述成熟miRNA被切出之前的miRNA前体(Pre-miRNA)的方法等。但是，前者在使用之前必需将两条中的一条链核酸分子进行退火，有可能通过识别双链的TLR3等而产生自我免疫。另外，后者一般而言成为约50～180个碱基长、主要约70个碱基长的长核酸分子，因此，担心合成的成本高。
因此，本发明的目的在于，提供利用了miRNA的新的人工模拟miRNA。
用于解决问题的方案
为了实现上述目的，本发明的人工模拟miRNA的特征在于，
为X区域和Y区域连结成的单链核酸，
所述X区域为成熟miRNA的引导链序列或其部分序列，由相对于所述Y区域的连结侧区域(XB)及非连结侧区域(XF)构成，
所述连结侧区域(XB)为在该区域内不进行分子内退火的序列，
所述Y区域为与所述X区域的所述非连结侧区域(XF)进行分子内退火的序列。
本发明的组合物为用于抑制基因的表达的组合物，其特征在于，含有所述本发明的人工模拟miRNA。
本发明的组合物为药物组合物，其特征在于，含有所述本发明的人工模拟miRNA。
本发明的表达抑制方法为抑制目标基因的表达的方法，其特征在于，使用所述本发明的人工模拟miRNA。
本发明的疾病的治疗方法的特征在于，包含将所述本发明的人工模拟miRNA给药于患者的工序，所述人工模拟miRNA中的所述引导链或其部分序列为抑制参与所述疾病的基因的表达的成熟miRNA的引导链或其部分序列。
本发明的核酸分子为用于疾病的治疗的人工模拟miRNA，其特征在于，
所述人工模拟miRNA为所述本发明的人工模拟miRNA，所述人工模拟miRNA中的所述引导链或其部分序列为抑制参与所述疾病的基因的表达的成熟miRNA的引导链或其部分序列。
发明效果
根据本发明的人工模拟miRNA，可以容易地以低成本合成，且可以抑制所述基因所编码的蛋白质的翻译。
附图说明
图1是表示本发明的人工模拟miRNA的一例的概略图。
图2是表示本发明的人工模拟miRNA的一例的概略图。
图3是表示本发明的实施例1中的AXL mRNA量的相对值的图表。
图4是表示本发明的实施例1中的MET mRNA量的相对值的图表。
图5是表示本发明的实施例1中的CDK6mRNA量的相对值的图表。
图6是表示本发明的实施例2中的AXL mRNA量的相对值的图表。
图7是表示本发明的实施例2中的MET mRNA量的相对值的图表。
图8是表示本发明的实施例3中的AXL mRNA量的相对值的图表。
图9是表示本发明的实施例4中的HMGA2mRNA量的相对值的图表。
图10是表示本发明的实施例5中的AXL mRNA量的相对值的图表。
图11是表示本发明的实施例5中的表达细胞数的图表。
图12是表示本发明的实施例6中的细胞因子mRNA量的相对值的图表。
图13是表示本发明的实施例7中的CAB39mRNA量的相对值的图表。
图14是表示利用本发明的实施例7中的miRNA抑制表达的基因的数的图表。
图15是在本发明的实施例8中表示人Dicer1mRNA中的CRISPR/Cas9引导链的杂交的位置的概略图。
图16是表示本发明的实施例8中的AXL mRNA量的相对值的图表。
图17是在本发明的实施例8中表示人AGO mRNA中的CRISPR/Cas9引导链的杂交的位置的概略图。
图18是表示本发明的实施例8中的AXL mRNA量的相对值的图表。
图19是表示本发明的实施例9中的胚重量、肿瘤的体积比例、肿瘤块的数量的图表。
具体实施方式
只要没有特别提及，本说明书中使用的用语可以以本技术领域中所通常使用的含义使用。
本发明的人工模拟miRNA例如所述X区域配置于5’侧，所述Y区域配置于3’侧。
本发明的人工模拟miRNA例如所述X区域中的所述连结侧区域(XB)为0～12个碱基长。
本发明的人工模拟miRNA例如在所述非连结侧区域(XF)中，0～6个碱基相对于所述Y区域为非互补的碱基。
本发明的人工模拟miRNA例如所述Y区域在与所述X区域未连结的末端侧具有突出端。
本发明的人工模拟miRNA例如所述突出端为0～4个碱基长。
本发明的人工模拟miRNA例如所述引导链的部分序列为在所述引导链中3’末端侧的碱基缺失的序列。
本发明的人工模拟miRNA例如所述引导链的部分序列为在所述引导链中3’末端侧的1～10个碱基缺失的序列。
本发明的人工模拟miRNA例如所述引导链的部分序列为在所述引导链中3’末端的1个碱基缺失的序列、或在所述引导链中从3’末端连续的2～10个碱基长缺失的序列。
本发明的人工模拟miRNA例如所述成熟miRNA为miR-34a。
本发明的人工模拟miRNA例如所述X区域为12～24个碱基长，所述Y区域为6～18个碱基长。
本发明的人工模拟miRNA例如全长为18～42个碱基长。
本发明的表达抑制方法例如包含将所述人工模拟miRNA给药于细胞、组织或器官的工序。
本发明的表达抑制方法例如将所述人工模拟miRNA在活体内或活体外进行给药。
本发明的表达抑制方法例如将所述人工模拟miRNA给药于非人动物。
(1)人工模拟miRNA
本发明的人工模拟miRNA如上所述，其特征在于，
为X区域和Y区域连结成的单链核酸，
所述X区域为成熟miRNA的引导链序列或其部分序列，由相对于所述Y区域的连结侧区域(XB)及非连结侧区域(XF)构成，
所述连结侧区域(XB)为在该区域内不进行分子内退火的序列，
所述Y区域为与所述X区域的所述非连结侧区域(XF)进行分子内退火的序列。
本发明的人工模拟miRNA例如可以抑制目标基因的表达。表达抑制是指例如所述目标基因的翻译的抑制、即所述目标基因所编码的蛋白质的翻译的抑制，更详细而言，是指来自所述目标基因的mRNA的所述蛋白质的翻译的抑制。所述目标基因的表达抑制可以通过例如来自所述目标基因的转录产物的生成量的减少、所述转录产物的活性的减少、来自所述目标基因的翻译产物的生成量的减少、或所述翻译产物的活性的减少等来确认。所述蛋白质可列举例如成熟蛋白质、或者接受加工或翻译后修饰之前的前体蛋白质。
本发明的人工模拟miRNA通过采取上述的结构，例如可以Dicer非依赖或Ago非依赖地进行表达抑制。一般而言，在许多肿瘤细胞中，Dicer或Ago的表达降低，因此，在Dicer依赖或Ago依赖的分子中，表达抑制困难，但由于本发明的人工模拟miRNA为Dicer非依赖或Ago非依赖，因此，例如在Dicer或Ago的表达降低的肿瘤细胞中也可以有效地起作用。另外，由于本发明的人工模拟miRNA为单链的核酸分子，因此，例如也不需要如成熟miRNA那样将两条中的一条链进行退火，可以廉价地制造。进而，由于本发明的人工模拟miRNA为单链的核酸分子，因此，例如也可以避免被参与自我免疫的TLR3、RIG-I、MDA5所识别。
关于本发明的人工模拟miRNA，将所述X区域及所述Y区域的配置关系的概略示于图1。予以说明，图1为概略，例如各区域的长度、形状等没有限制。本发明的人工模拟miRNA既可以如图1(A)所示，所述X区域配置于5’侧、所述Y区域配置于3’侧，也可以如图1(B)所示，所述Y区域配置于5’侧，所述X区域配置于3’侧，优选为前者。前者的情况下，本发明的人工模拟miRNA从5’侧依次配置所述X区域中的所述非连结侧区域(XF)、所述连结侧区域(XB)和所述Y区域。后者的情况下，本发明的人工模拟miRNA从5’侧依次配置所述Y区域、所述X区域中的所述连结侧区域(XB)和所述非连结侧区域(XF)。
在本发明的人工模拟miRNA中，所述连结侧区域(XB)为在该区域内不进行分子内退火的序列，位于所述连结侧区域(XB)的一端的所述Y区域为与在位于所述连结侧区域(XB)的另一端的所述非连结侧区域(XF)进行分子内退火的序列。因此，在本发明的人工模拟miRNA中，所述X区域的所述连结侧区域(XB)例如也可以说通过所述Y区域和所述非连结侧区域(XF)的分子内退火而形成环。分子内退火例如也称为自我退火。本发明的人工模拟miRNA也称为在所述分子内退火的区域中形成双链。
本发明的人工模拟miRNA也可以称为其5’末端和3’末端未连结的线状单链核酸分子。本发明的人工模拟miRNA例如用于维持两末端的未结合，因此5’末端优选为非磷酸基。
在本发明的人工模拟miRNA中，所述X区域如上所述为成熟miRNA的引导链序列或其部分序列。成熟miRNA的引导链序列例如被注册于各种数据库(例如http://www.mirbase.org/等)。因此，例如可以基于这些公知的成熟miRNA的信息而设定所述X区域。所述成熟miRNA的引导链为被引入于RNA诱导沉默复合体(RISC)的Argonaute(Ago)蛋白质、与靶的mRNA结合的链。
在本发明的人工模拟miRNA中，各区域的长度没有特别限制。以下，例示条件，但本发明的人工模拟miRNA并不限定于这些记载。另外，在本发明中，碱基的数值范围公开全部的属于该范围的正的整数，例如与“1～4个碱基”的记载是指“1、2、3、4个碱基”的全部的公开(以下同样)。
所述X区域中的所述连结侧区域(XB)的长度(XB)的下限例如为0个碱基长、2个碱基长、4个碱基长，上限例如为12个碱基长、10个碱基长、8个碱基长，范围例如为0～12个碱基长、2～10个碱基长、4～8个碱基长、6个碱基长。
所述X区域中的所述非连结侧区域(XF)的长度(XF)的下限例如为6个碱基长、10个碱基长、14个碱基长，上限例如为22个碱基长、20个碱基长、18个碱基长，范围例如为6～22个碱基长、10～20个碱基长、14～18个碱基长。
所述非连结侧区域(XF)例如在与所述Y区域比对时，相对于所述Y区域，全碱基既可以为互补的，也可以具有非互补的碱基。后者的情况下，所述非连结侧区域(XF)的例如1个或数个碱基相对于所述Y区域为非互补的碱基。所述非互补的碱基的个数的下限例如为0个碱基、1碱基、2个碱基，上限例如为6个碱基、5个碱基、3个碱基，范围例如为0～6个碱基、1～5个碱基、2～3个碱基。另外，所述非互补的碱基例如既可以连续地位于所述非连结侧区域(XF)，也可以非连续地位于所述非连结侧区域(XF)。
所述非连结侧区域(XF)相对于所述Y区域具有非互补的碱基的情况下，将在所述非连结侧区域(XF)和所述Y区域中成为非互补的组合的各自的碱基也称为错配碱基。另一方面，将在所述非连结侧区域(XF)和所述Y区域中成为互补的组合的各自的碱基也称为匹配碱基。
在所述非连结侧区域(XF)中，所述错配碱基的场所没有特别限制。在本发明的人工模拟miRNA中，所述X区域位于5’侧时，所述非连结侧区域(XF)中的所述错配碱基的场所例如将5’末端碱基作为第1位碱基，为第1位、第6位。所述非连结侧区域(XF)中的所述错配碱基的个数没有特别限制。所述错配碱基的个数为1个时，例如为第1位或第6位，其为2个以上时，例如至少包含第1位及第6位。
将本发明的人工模拟miRNA中的所述错配碱基的位置的概略示于图2。予以说明，图2为概略，例如各区域的长度等没有限制。图2为所述X区域位于5’侧的人工模拟miRNA的实例，在所述X区域的所述非连结侧区域(XF)中，将5’末端碱基作为第1位，为在第1位及第6位具有错配碱基的形态。图2中，N表示碱基，被圆包围的N表示错配碱基，被四方形包围的N表示在用线连结的碱基间互补的匹配碱基。
在本发明的人工模拟miRNA中，所述X区域的长度(X)没有特别限制，下限例如为12个碱基长、16个碱基长、18个碱基长，上限例如为24个碱基长、22个碱基长、20个碱基长，范围例如为12～24个碱基长、16～22个碱基长、18～20个碱基长。
在本发明的人工模拟miRNA中，所述Y区域的长度(Y)没有特别限制，下限例如为6个碱基长、9个碱基长、12个碱基长，上限例如为18个碱基长、16个碱基长、14个碱基长，范围例如为6～18个碱基长、9～16个碱基长、12～14个碱基长。
所述Y区域例如既可以含有与所述X区域的所述非连结侧区域(XF)进行分子内退火的序列，也可以仅由所述序列构成。前者的情况下，所述Y区域例如除所述进行分子内退火的序列之外，进而可以在与所述X区域未连结的末端侧具有突出端。该情况下，所述Y区域由所述进行分子退火的序列和所述突出端构成。在此，所述Y区域的突出端例如在将所述Y区域和所述非连结侧区域(XF)比对的情况下，为所述Y区域与所述非连结侧区域(XF)相比过量地具有的末端的碱基。突出端的长度(O)例如可以用下述式表示。突出端的长度(O)＝[Y区域的全长的碱基数(Y)]－[非连结侧区域(XF)的碱基数(XF)]
O＝Y－XF
O：突出端的长度
Y：Y区域的全长的碱基数(Y)
XF：非连结侧区域(XF)的碱基数(XF)
所述突出端的长度(O)没有特别限制，下限例如为0个碱基长、1个碱基长，上限例如为4个碱基长、3个碱基长，范围例如为0～4个碱基长、1～3个碱基长、2个碱基长。
所述突出端的序列没有特别限制，例如从3’侧可以例示UU、CU、GC、UA、AA、CC、UG、CG、AU、TT等。所述突出端例如可以通过设为TT而附加对RNA分解酶的耐性。
在本发明的人工模拟miRNA中，将所述X区域的非连结侧区域(XF)和所述Y区域比对时，两者的长度之差(Y－XF或XF－Y)没有特别限制。所述差的下限例如为0个碱基长、2个碱基长、3个碱基长，上限例如为15个碱基长、10个碱基长、5个碱基长，范围例如为0～15个碱基长、2～10个碱基长、3～5个碱基长。所述Y区域例如在具有所述突出端的情况下，比所述非连结侧区域(XF)长。
在本发明的人工模拟miRNA中，来自所述成熟miRNA的序列例如既可以为所述引导序列的全长，也可以为所述引导序列的部分序列。所述引导链的部分序列例如为在所述引导链(全长)中3’末端侧的碱基缺失的碱基，作为具体例，为在所述引导链中3’末端侧的1个或数个碱基缺失的序列。从所述引导链全长中缺失的碱基的数目没有特别限制，下限例如为1个碱基、2个碱基、3个碱基，上限例如为10个碱基、7个碱基、6个碱基、5个碱基，范围例如为1～7个碱基、2～6个碱基、3～5个碱基。所述引导链的部分序列既可以为在所述引导链中3’末端的碱基(1个碱基)缺失的序列，也可以为从3’末端连续的碱基缺失的序列，后者的情况下，例如为在所述引导链中从3’末端连续的碱基长(例如2～10个碱基长)缺失的序列。
本发明的人工模拟miRNA的全长(T)没有特别限制，下限例如为18个碱基长、23个碱基长、28个碱基长，上限例如为42个碱基长、38个碱基长、34个碱基长，范围例如为18～42个碱基长、23～38个碱基长、28～34个碱基长。
在本发明的人工模拟miRNA中，所述成熟miRNA的种类没有特别限制，可以根据目标基因的种类而适当选择。
作为所述成熟miRNA，可列举例如hsa-miR-34a(序列号1)、hsa-let-7a(序列号2)、hsa-let-7f(序列号3)、hsa-miR-150(序列号4)、hsa-miR-29b(序列号5)等成熟miRNA。
hsa-miR-34a(序列号1)
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
hsa-let-7a(序列号2)
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
hsa-let-7f(序列号3)
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
hsa-miR-150(序列号4)
UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
hsa-miR-29b(序列号5)
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
miR-34a的引导链将例如AXL、MET、CDK4、CDK6、SIRT1、CCND1、SIRT1、BCL-2等作为靶，通过这些目标基因的表达抑制，可以预防或治疗例如肺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等疾病。
let-7a的引导链将例如HMGA2(highmobilitygroupAT-hook2，高迁移率族蛋白A2)、KRAS、NRAS、HRAS、MYC、TLR4等作为靶，通过这些目标基因的表达抑制，可以预防或治疗例如肺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等疾病。
let-7f的引导链将例如HMGA2(highmobilitygroupAT-hook2，高迁移率族蛋白A2)、KRAS、NRAS、HRAS、MYC、TLR4等作为靶，通过这些目标基因的表达抑制，可以预防或治疗例如肺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等疾病。
miR-150的引导链将例如COL1A1、COL4A4、SMAD2、SP1等作为靶，通过这些目标基因的表达抑制，可以预防或治疗例如肺纤维症、肝纤维症等疾病。
miR-29b的引导链将例如COL1A1、MCL1，DNMT3A，DNMT3B，TCL1A，TGFb3等作为靶，通过这些目标基因的表达抑制，可以预防或治疗例如肺癌、大肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺纤维症、肝纤维症等疾病。
本发明的人工模拟miRNA的构成单元没有特别限制，可列举例如核甙酸残基。所述核甙酸残基可列举例如核糖核甙酸残基及去氧核糖核甙酸残基。在本发明的人工模拟miRNA中，所述核甙酸残基例如优选核糖核甙酸残基。所述核甙酸残基可列举例如未被修饰的非修饰核甙酸残基及被修饰的修饰核甙酸残基。本发明的人工模拟miRNA例如通过含有所述修饰核甙酸残基，可以提高核酸酶耐性，提高稳定性。另外，本发明的人工模拟miRNA例如除所述核甙酸残基之外，可以进一步含有非核甙酸残基。
本发明的人工模拟miRNA例如在除所述非修饰核糖核甙酸残基之外含有所述修饰核糖核甙酸残基的情况下，所述修饰核糖核甙酸残基的个数没有特别限制，例如为“1个或数个”，具体而言，例如为1～5个、1～4个、1～3个、1或2个。相对于所述非修饰核糖核甙酸残基的所述修饰核糖核甙酸残基例如可以为核糖残基被去氧核糖残基置换的所述去氧核糖核甙酸残基。本发明的人工模拟miRNA例如在除所述非修饰核糖核甙酸残基之外含有所述去氧核糖核甙酸残基的情况下，所述去氧核糖核甙酸残基的个数没有特别限制，例如为“1或数个”，具体而言，例如为1～5个、1～4个、1～3个、1或2个。
所述核甙酸残基例如含有糖、碱基及磷酸作为构成要素。所述核糖核甙酸残基例如具有核糖残基作为糖，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及U(尿嘧啶)作为碱基，所述去氧核糖残基例如具有去氧核糖残基作为糖，具有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)作为碱基。
所述非修饰核甙酸残基的所述各构成要素例如与天然存在的物质相同或实质上相同，具体而言，例如与在人体中天然存在的物质相同或实质上相同。
所述修饰核甙酸残基的例如所述未修饰核甙酸残基的构成要素的任一种可以被修饰。所述修饰核甙酸残基可列举例如天然存在的核甙酸残基、人工修饰的核甙酸残基等。
所述修饰核甙酸残基例如可以为所述未修饰核甙酸的代替物的残基。所述代替物可列举例如人工核酸单体残基。作为具体例，可列举例如PNA(肽核酸)、LNA(LockedNucleic Acid，锁核酸)、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene bridged Nucleic Acid，2’-O,4’-C-亚乙基桥联核酸)等。
在所述核甙酸残基中，所述碱基没有特别限制。所述碱基例如既可以为天然的碱基，也可以为非天然的碱基。所述碱基例如既可以为来自天然，也可以为合成品。所述碱基例如可以使用一般的碱基、其修饰类似物等。
本发明的人工模拟miRNA例如可以含有标识物质，被所述标识物质标识化。所述标识物质没有特别限制，可列举例如荧光物质、色素、同位素等。所述标识物质可列举例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3色素、Cy5色素等荧光团，所述色素可列举例如Alexa488等Alexa色素等。所述同位素可列举例如稳定同位素及放射性同位素，优选为稳定同位素。另外，所述稳定同位素例如没有标识的化合物的物性变化，作为示踪物的性质也优异。所述稳定同位素没有特别限制，可列举例如2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S及36S。
本发明的人工模拟miRNA如上所述，可以抑制所述目标基因的表达。因此，本发明的人工模拟miRNA例如可以作为基因成为原因的疾病的治疗剂使用。本发明的人工模拟miRNA例如具有抑制参与所述疾病的基因的表达的成熟miRNA的引导链或其部分序列的情况下，例如通过所述目标基因的表达抑制，可以治疗所述疾病。在本发明中，“治疗”例如含有所述疾病的预防、疾病的改善、预后的改善的意义，可以为任一种。所述疾病没有特别限制，例如可以根据目标疾病而适当设定所述表达抑制序列。作为所述疾病，可列举例如：乳腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、前列腺癌、胆囊癌、子宫体癌、宫颈癌、卵巢癌、骨肉瘤、白血病等癌、肺纤维症、肝纤维症等疾病。
本发明的人工模拟miRNA的使用方法没有特别限制，例如对具有所述目标基因的给药对象给药所述人工模拟miRNA即可。
所述给药对象可列举例如细胞、组织或器官。所述给药对象可列举例如人、除人之外的非人哺乳类等非人动物。所述给药例如可以为活体内，也可以为活体外。所述细胞没有特别限制，可列举例如：HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞、COS细胞等各种培养细胞、ES细胞、造血干细胞等干细胞、从初代培养细胞等生物体中分离出的细胞等。
在本发明中，成为表达抑制的对象的所述目标基因没有特别限制，可以设定所期望的基因。而且，如上所述，根据所述目标基因的种类选择所述成熟miRNA即可。
关于本发明的人工模拟miRNA的使用，可以参照后述的本发明的组合物、表达抑制方法及治疗方法等记载。
本发明的人工模拟miRNA如上所述可以抑制目标基因的表达，因此，例如作为医药品、诊断药、农药、医学、生命科学等研究工具是有用的。
本发明的人工模拟miRNA的合成方法没有特别限制，可以采用以往公知的核酸的制造方法。所述合成方法可列举例如利用基因工程方法的合成法、化学合成法等。基因工程方法可列举例如体外转录合成法、使用载体的方法、利用PCR盒的方法。所述载体没有特别限制，可列举质粒等非病毒载体、病毒载体等。所述化学合成法没有特别限制，可列举例如亚磷酰胺(Phosphoroamidite)法及H-磷酸酯法等。所述化学合成法使用可能例如市售的自动核酸合成机。所述化学合成法一般而言使用酰胺(Amidite)。所述酰胺没有特别限制，作为市售的酰胺，可列举例如RNA Phosphoramidites(2’-O-TBDMSi、商品名、三千里制药)、ACE Amidite及TOM Amidite、CEE Amidite、CEM Amidite、TEM Amidite等。
(2)组合物
本发明的表达抑制用组合物如上所述为用于抑制目标基因的表达的组合物，以含有所述本发明的人工模拟miRNA为特征。本发明的组合物的特征在于，含有所述本发明的人工模拟miRNA，其它的构成没有任何限制。本发明的表达抑制用组合物例如也可以称为表达抑制用试剂。
根据本发明，例如通过对所述目标基因存在的对象进行给药，可以进行所述目标基因的表达抑制。
另外，本发明的药物组合物如上所述，其特征在于，含有所述本发明的人工模拟miRNA。本发明的药物组合物的特征在于，含有所述本发明的人工模拟miRNA，其它的构成没有任何限制。本发明的药物组合物例如也可以称为医药品。
根据本发明，例如通过给药于基因成为原因的疾病的患者，可以抑制所述基因的表达，治疗所述疾病。在本发明中，“治疗”如上所述，例如含有所述疾病的预防、疾病的改善、预后的改善的意义，可以为任一种。
在本发明中，成为治疗的对象的疾病没有特别限制，可列举例如基因的表达成为原因的疾病。根据所述疾病的种类，将成为其疾病的原因的基因设定为所述目标基因，进而，根据所述目标基因选择所述成熟miRNA的引导链或其部分序列即可。
本发明的表达抑制用组合物及药物组合物(以下，称为组合物)，其使用方法没有特别限制，例如对具有所述目标基因的给药对象给药所述人工模拟miRNA即可。
所述给药对象可列举例如细胞、组织或器官。所述给药对象可列举例如人、除人之外的非人哺乳类等非人动物。所述给药例如可以为活体内，也可以为活体外。所述细胞没有特别限制，可列举例如：HeLa细胞、293细胞、NIH3T3细胞、COS细胞等各种培养细胞、ES细胞、造血干细胞等干细胞、从初代培养细胞等生物体中分离出的细胞等。
所述给药方法没有特别限制，例如可以根据给药对象而适当确定。所述给药对象为培养细胞的情况下，可列举例如使用转染试剂的方法、电穿孔法等。
本发明的组合物例如既可以仅含有本发明的人工模拟miRNA，也可以进一步含有其它的添加物。所述添加物没有特别限制，例如优选药学上所允许的添加物。所述添加物的种类没有特别限制，例如可以根据给药对象的种类而适当选择。
在本发明的组合物中，所述人工模拟miRNA例如可以与所述添加物形成复合体。所述添加物例如也可以称为复合剂。通过所述复合体形成，例如可以有效地传递所述人工模拟miRNA。
所述复合剂没有特别限制，可列举聚合物、环糊精、金刚合金等。所述环糊精可列举例如线状环糊精共聚物、线状氧化环糊精共聚物等。
所述添加剂此外可列举例如载体、对目标细胞的结合物质、缩合剂、融合剂、赋形剂等。
(3)表达抑制方法
本发明的表达抑制方法如上所述为抑制目标基因的表达的方法，其特征在于，使用所述本发明的人工模拟miRNA。本发明的表达抑制方法的特征在于，使用所述本发明的人工模拟miRNA，其它的工序及条件没有任何限制。
在本发明的表达抑制方法中，所述基因的表达抑制的机制没有特别限制，可列举例如成熟miRNA所引起的表达抑制。
本发明的表达抑制方法包含例如对所述目标基因存在的对象给药所述人工模拟miRNA的工序。通过所述给药工序，例如使所述人工模拟miRNA与所述给药对象接触。所述给药对象可列举例如细胞、组织或器官。所述给药对象可列举例如人、除人之外的非人哺乳类等非人动物。所述给药例如可以为活体内，也可以为活体外。
本发明的表达抑制方法例如既可以单独给药所述人工模拟miRNA，也可以给药含有所述人工模拟miRNA的所述本发明的组合物。所述给药方法没有特别限制，例如可以根据给药对象的种类而适当选择。
(4)治疗方法
本发明的疾病的治疗方法如上所述，其特征在于，包含将所述本发明的人工模拟miRNA给药于患者的工序，所述人工模拟miRNA中的所述引导链或其部分序列为抑制参与所述疾病的基因的表达的成熟miRNA的引导链或其部分序列。本发明的治疗方法的特征在于，使用所述本发明的人工模拟miRNA，其它的工序及条件没有任何限制。
本发明的治疗方法例如可以引用所述本发明的表达抑制方法等。所述给药方法没有特别限制，例如可以为经口给药及非经口给药的任一种。
(5)人工模拟miRNA的用途
本发明的用途为用于抑制所述目标基因的表达的所述本发明的人工模拟miRNA的用途。
本发明的核酸分子为用于疾病的治疗的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为所述本发明的人工模拟miRNA，所述人工模拟miRNA中的所述引导链或其部分序列为抑制参与所述疾病的基因的表达的成熟miRNA的引导链或其部分序列。
以下，通过实施例等，详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例]
(实施例1)
基于成熟miR-34a的引导链，合成本发明的人工模拟miRNA，确认AXL及MET的表达抑制。
(1)核酸样品的合成
作为阳性对照的miRNA，合成由以下所示的引导链(序列号1)及过客链(序列号6)构成的人成熟miR-34a。
另外，作为阴性对照，合成由使所述成熟miR-34a中的所述引导链的碱基组成打乱序列(Scramble)的引导链打乱序列(序列号7)及与其对应的过客链(序列号8)构成的成熟miR-34a打乱序列。
而且，作为实施例的人工模拟miRNA，合成具有成熟miR-34a的引导链(序列号1)的引导发夹RNA(以下，也称为“ghR”)。具体而言，合成ghR-34a(G22/P18)(序列号9)。在ghR-34a(G22/P18)的下述序列中，下线部对应于所述引导链。另外，作为相对于实施例的人工模拟miRNA的阴性对照，合成打乱了所述引导链的碱基组成的ghR-34a打乱序列(序列号10)。在ghR-34a打乱序列的下述序列中，下线部对应于成熟miR-34a打乱序列的引导链。将这些miRNA的概略示于以下。
成熟miR-34a
引导链(序列号1)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’
过客链(序列号6)
5’-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU-3’
成熟miR-34a打乱序列
引导链(序列号7)
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUG-3’
过客链(序列号8)
5’-CAACCGACCCGAUAACGAUACA-3’
ghR-34a(G22/P18)(序列号9)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUAGCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ghR-34a(G22/P18)打乱序列(序列号10)
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCGGUUGACCCGAUAACGGUACCUC-3’
[化1]
(2)mRNA的检测
将所述miRNA导入于人非小细胞性肺癌细胞株(NCI-H1299)，进行人成熟miR-34a靶向的AXL mRNA、MET mRNA及CDK6mRNA的检测。
将所述miRNA在注射用蒸馏水(大塚制药、以下同样)中溶解，制备100μmol/L的miRNA溶液。在AXL及MET mRNA的检测中使用NCI-H1299细胞(ATCC社)。培养基使用含有10％FBS的RPMI-1640(Invitrogen)。培养条件设为37℃、5％CO2。
首先，将细胞在所述培养基中进行培养，将该培养液在24孔板上以成为1×104细胞/孔的方式分注各500μL。进而，将所述孔中的细胞培养24小时之后，使用转染试剂RNAiMAX Transfection Reagent(商品名、Life Technologies社)，按照随附的实验方案转染所述miRNA。关于转染，如下设定每所述孔的组成。在下述组成中，(B)为Opti-MEM(商品名、Invitrogen)，(C)为所述RNA溶液，将两者合并添加49μL。予以说明，在所述孔中，所述miRNA的最终浓度设为5nmol/L、50nmol/L。转染后，将所述孔中的细胞培养2天。
[表1]
而且，对得到的培养细胞，使用ISOGEN试剂(商品名、NIPPON GENE)，按照随附的实验方案回收RNA。
接着，使用逆转录酶(商品名M-MLV reversetranscriptase、Invitrogen)，按照随附的实验方案，从所述RNA合成cDNA。而且，将合成的所述cDNA作为模板进行定量PCR，测定AXL cDNA的量及MET cDNA的量。另外，AXL mRNA及CDK6mRNA将GAPDH mRNA作为内部对照，将其cDNA的量合并进行测定。MELmRNA将β-肌动蛋白mRNA作为内部对照，将其cDNA的量合并进行测定。
所述定量PCR使用作为试剂的FastStart Universal SYBR Green Master(商品名、Roche)、作为热循环仪的MX3000P(商品名、Stratagene)、作为分析设备的MxPro(商品名、Stratagene)(以下，同样)。在所述AXL cDNA、CDK6cDNA及GAPDH cDNA、所述MET cDNA及β-肌动蛋白cDNA的扩增中，分别使用下述引物集。反应液的总量设为25μL，分别测定3次。
AXL引物集
5’-CTCAACCAGGACGACTCCAT-3’(序列号11)
5’-AGACCGCTTCACTCAGGAAA-3’(序列号12)
CDK6引物集
5’-AAGTTCCAGAGCCTGGAGTG-3’(序列号13)
5’-CGATGCACTACTCGGTGTGA-3’(序列号14)
GAPDH引物集
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’(序列号15)
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’(序列号16)
MET引物集
5’-CAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3’(序列号17)
5’-TGTCCAACAAAGTCCCATGA-3’(序列号18)
β-肌动蛋白引物集
5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’(序列号19)
5’-TGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’(序列号20)
作为对照，对所述miRNA未添加的细胞，也进行同样的处理及测定(mock)。另外，阴性对照使用所述成熟miR-34a打乱序列及所述ghR-34a打乱序列。
而且，算出将miRNA未添加的对照(mock)中的AXL mRNA或MET mRNA设为1时的各转染细胞中的AXL mRNA、MET mRNA及CDK6mRNA的相对值。将上述结果示于图3、图4及图5。图3为AXL mRNA的结果，图4为MET mRNA的结果，图5为CDK6mRNA的结果，在图3、图4及图5中，左棒表示转染时的miRNA的终浓度为5nmol/L的结果，右棒表示转染时的miRNA的终浓度为50nmol/L的结果。
如图3、图4及图5所示，使用作为实施例的人工模拟miRNA的ghR-34a(G22/P18)的情况下，AXL mRNA的量、MET mRNA的量及CDK6mRNA的量均与对照相比减少，显示与成熟miR-34a同等结果。因此，可以说，利用实施例的人工模拟miRNA，也抑制AXL mRNA、MET mRNA及CDK6mRNA分别编码的蛋白质的转录。
进而，实施例的ghR-34a(G22/P18)与双链的成熟miRNA-34a不同，为单链的核酸分子，因此，在使用时不需要将各单链退火，另外，也可以避免被参与自然免疫的TLR3等识别。另外，实施例的ghR-34a(G22/P18)的总碱基数为比成熟miRNA-34a的总碱基数44个碱基少的40个碱基，因此，可以廉价合成。进而，为了避免被TLR3等识别，也可以考虑对生物体给药作为单链的茎环结构的miRNA前体(Pre-miRNA)，使成熟miRNA-34a在生物体内生成。但是，miRNA-34a的Pre-miRNA为72个碱基长，非常长，与此相对，实施例的ghR-34a(G22/P18)如上所述短至40个碱基长，因此，也难以被TLR3以外的各种TLR识别。因此，根据本发明的人工模拟miRNA，也可以避免给药导致的TLR的影响。
(实施例2)
对作为实施例1的人工模拟miRNA的ghR-34a(G22/P18)，使引导链的3’末端侧缺失，确认AXL及MET的表达抑制。
将作为实施例1的人工模拟miRNA的ghR-34a(G22/P18)(序列号9)作为基准，合成使引导链的3’末端缺失的小型化人工模拟miRNA。在下述序列中，下线部对应于引导链。将这些miRNA的概略示于以下。
ghR-34a(G22/P18)(序列号9)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUAGCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ghR-34a(G21/P17)(序列号21)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGGCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ghR-34a(G20/P16)(序列号22)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUCUAAGACAAUGCCCUC-3’
ghR-34a(G19/P15)(序列号23)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUAAGACAAUGCCCUC-3’
ghR-34a(G18/P14)(序列号24)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGAAGACAAUGCCCUC-3’
ghR-34a(G17/P13)(序列号25)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACAAUGCCCUC-3’
[化2]
除使用所述miRNA以外，与上述实施例1同样地操作，进行人成熟miR-34a靶向的AXL mRNA及MET mRNA的检测。予以说明，转染时的miRNA的终浓度设为25nmol/L。阴性对照设为上述实施例1中的ghR-34a打乱序列(序列号10)。将上述结果示于图6及图7。图6为AXLmRNA的结果，图7为MET mRNA的结果。
如图6及图7所示，通过使引导链的3’末端进一步缺失的小型化人工模拟miRNA，也可得到同样的结果。在将核酸分子给药于生物体的情况下，其长度越短，参与自我免疫的TLR越难以识别，例如可以抑制自我免疫导致的炎症性细胞因子等产生。所述小型化人工模拟miRNA的全长为38个碱基长以下，即使与miRNA-34a的Pre-miRNA(72个碱基长)进行比较，也为特别短的核酸分子。因此，根据本发明的人工模拟miRNA，不仅可以避免识别双链的TLR3等的影响，而且也可以避免其它的TLR的影响。
(实施例3)
进行作为实施例1的人工模拟miRNA的ghR-34a(G17/P13)(序列号25)的改变，确认AXL的表达抑制。
以下，表示作为实施例1的人工模拟miRNA的ghR-34a(G17/P13)及基于其而改变的人工模拟miRNA的概略。G17/P13为在将5’末端设为第1位碱基时、在第1位和第6位具有错配碱基、在3’末端具有2个碱基长的突出端的人工模拟miRNA。因此，作为改变的人工模拟miRNA，合成了将2个碱基长的突出端变更为dTdT的G17/P13dTdT，将对应于第6位碱基的碱基变更为匹配碱基的G17/P13Match1，将2个碱基长的突出端变更为dTdT、将对应于第6位碱基的碱基变更为匹配碱基的G17/P13dTdT Match1，将对应于第1位及第6位的碱基的碱基变更为匹配碱基的G17/P13Match2，将对应于第1位及第6位的碱基的碱基变更为匹配碱基、将2个碱基长的突出端变更为dTdT的G17/P13dTdT Match2。在下述序列中，下线部为引导链的序列，序列内部中的被四方形包围的部分为匹配碱基，序列的3’末端中的被四方形包围的部分为变更为dTdT的突出端。
[化3]
G17/P13(序列号25)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACAAUGCCCUc-3’
G17//P13dTdT(序列号26)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACAAUGCC-3’
G17/P13Match1(序列号27)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACaUGCCCUC-3’
G17/P13dTdT Match1(序列号28)
5’-UGGCAGUGUUUAGCUGAGACATGCGC-3’
G17/P13Match2、(序列号29)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACaTGCCUC-3'
G17/P13dTdT Match2(序列号30)
5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGAGACATGCC-3’
[化4]
除使用所述miRNA以外，与上述实施例1同样地操作，进行人成熟miR-34a靶向的AXL mRNA的检测。予以说明，转染时的miRNA的终浓度设为25nmol/L。阴性对照设为上述实施例1中的ghR-34a打乱序列(序列号10)。
将上述结果示于图8。图8为AXL mRNA的结果。如图8所示，将2个碱基长的突出端变更为dTdT的情况下，在将对应于第6位碱基的碱基变更为匹配碱基而将错配设为一处的情况、将对应于第1位及第6位碱基的碱基变更为匹配碱基而没有错配的情况、这些情况组合的情况的任一种下，AXL mRNA的量均减少，显示与G17/P13同样的结果。
(实施例4)
对成熟hsalet-7a-1的引导链，合成本发明的人工模拟miRNA，确认HMGA2的表达抑制。
(1)miRNA的合成
作为阳性对照的miRNA，合成由以下所示的引导链(序列号2)及过客链(序列号31)构成的人成熟let-7a-1。另外，作为阴性对照，合成数据库上的任何mRNA都不作为目标的序列(非-靶)。而且，作为实施例的人工模拟miRNA，合成具有成熟let-7a-1的引导链(序列号2)的ghR-let-7a G18/P14(序列号34)。在ghR-let-7a G18/P14的下述序列中，下线部对应于所述引导链的部分序列。将这些miRNA的概略示于以下。
成熟hsa-let-7a-1
引导链(序列号2)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’
过客链(序列号31)
5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’
非-靶对照
引导链(序列号32)
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’
过客链(序列号33)
5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’
ghR-let-7a G18/P14(序列号34)
5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUCCUACUACCUCCUC-3’
[化学式5]
(2)mRNA的检测
除将所述miRNA导入于人肺癌细胞株A549细胞株(ATCC社)，使用下述引物集以外，与上述实施例1同样地操作，进行人成熟let-7a靶向的HMGA2mRNA的检测。予以说明，转染时的miRNA的终浓度设为25nmol/L。所述非-靶设为根据RNA数据库分析预测为与人的RNA结合的可能性最低、或脱靶效应最低的序列。
HMGA2引物集
5’-GAAGCCACTGGAGAAAAACG-3’(序列号35)
5’-CTTCGGCAGACTCTTGTGAG-3’(序列号36)
将上述结果示于图9。图9为HMGA2mRNA的结果。如图9所示，使用实施例的人工模拟miRNA ghR-let-7a G18/P14的情况下，HMGA2mRNA的量显示与成熟let-7a同等结果。
(实施例5)
将实施例1中制作的ghR-34a(G17/P13)(序列号25)导入于人非小细胞性肺癌细胞株(NCI-H1299)，确认AXL的表达抑制及细胞增殖的抑制。予以说明，作为阳性对照的miRNA，使用实施例1中合成的人成熟miR-34a。
通过与上述实施例1同样的方法，进行NCI-H1299细胞的培养、所述ghR-34a(G17/P13)或所述miR-34a的转染、转染后的培养。而且，将进行转染的天设为0天，进一步进行培养。予以说明，在从转染第1天，用PBS清洗细胞，继续同样地进行培养。与上述实施例1同样地操作，测定从转染规定天数(1、2、3、4、5天)后的AXL mRNA的表达量，求出AXL mRNA的表达量的相对值。另外，确认从转染4天后的细胞数。予以说明，分别对所述ghR-34a(G17/P13)及所述miR-34a，作为对照，使用变更为打乱序列的与上述实施例1相同的所述ghR34a打乱序列及所述成熟miR-43a打乱序列，同样地进行处理，测定表达量。将上述结果示于图10及图11。
图10为表示AXL mRNA的结果的图表，纵轴表示表达量的相对值，横轴表示天数。如图10所示，与miRNA未添加的对照进行比较，所述ghR-34a(G17/P13)与阳性对照的所述miR-34a同样地，在从转染5天后也可以确认表达抑制能力。
图11为表示表达细胞数(×104个)的图表。如图11所示，转染所述ghR-34a(G17/P13)的结果，可以抑制细胞增殖，直至与转染所述miR-34a的情况同程度。
(实施例6)
将实施例2中制作的ghR-34a(G17/P13)(序列号25)导入于人末梢血的单细胞，确认炎症性细胞因子的诱导。予以说明，作为阳性对照的miRNA，使用实施例1中合成的人成熟miR-34a。
对从人末梢血中分离出的单细胞进行所述ghR-34a(G17/P13)或所述miR-34a的转染、转染后的培养。培养的条件设为2×105细胞/孔/96孔板，转染的条件设为LipofectaminRNAiMAx转染试剂0.6μl/孔/200μl。而且，从转染24小时后，从培养的细胞中提取RNA，通过实时PCR测定细胞因子(IL-6、TNFα)的mRNA的表达量。另外，使用所述24小时后的培养上清液，利用ELISA法测定细胞因子(IL-6、TNFα)的蛋白质表达量。另外，对所述ghR-34a(G17/P13)，作为对照，使用变更为打乱序列的下述ghR34a打乱序列(G17/P13)，同样地进行处理，测定表达量。对所述miR-34a，作为对照，使用变更为打乱序列的所述成熟miR-43a打乱序列，同样地进行处理，测定表达量。另外，对未处理的单细胞(正常(Normal))及miRNA未添加的细胞(mock)，也同样地进行测定。
ghR-34a(G17/P13)打乱序列(序列号37)
5’-UGUAUCGUUAUCGGGUCAUAACGAUACCUU-3’
而且，算出将所述成熟miR-34a打乱序列的导入细胞的表达量设为1时的各种细胞中的细胞因子mRNA的表达量的相对值。将上述结果示于图12(A)。另外，将细胞因子浓度的绝对量示于(B)。
图12(A)为表示细胞因子的mRNA表达量的相对值的图表，图12(B)为表示细胞因子的蛋白质表达量的相对值的图表。如图12(A)及(B)所示，使用所述ghR-34a(G17/P13)的情况下，与所述miR-34a相比，各细胞因子的mRNA及蛋白质的表达均被显著抑制。由上述结果得知：本发明的人工模拟miRNA为与miRNA相比更难以诱导炎症性细胞因子的核酸。
(实施例7)
对实施例2中制作的ghR-34a(G17/P13)(序列号25)，确认是否产生与成熟mi-R34a的过客链同样的副作用。
如上述实施例1所示，成熟mi-R34a为由引导链和过客链构成的双链，所述引导链将AXL mRNA作为靶mRNA。另一方面，成熟mi-R34a的所述过客链(miR-34a-3P)也结合于与其互补的mRNA(具体而言，CAB39mRNA)，显示基因表达抑制的作用。但是，所述过客链导致的表达抑制为不期望的表达抑制，认为是副作用。因此，确认所述成熟mi-R34a的所述过客链导致的副作用、即CAB39mRNA的表达抑制是否由所述ghR-34a(G17/P13)也产生。
通过与上述实施例1同样的方法进行NCI-H1299细胞的培养、所述ghR-34a(G17/P13)或所述人成熟miR-34a的转染、转染后的培养。而且，与上述实施例1同样地操作，提取从转染2天后的RNA，测定CAB39mRNA的表达量，将未处理细胞(正常)的表达量设为1，求出表达量的相对值。另外，分别对所述ghR-34a(G17/P13)及所述miR-34a，使用变更为打乱序列的与上述实施例6相同的所述ghR-34a(G17/P13)打乱序列及与上述实施例1相同的所述成熟miR-43a打乱序列，同样地进行处理，求出表达量的相对值。将上述结果示于图13。
图13为表示CAB39mRNA的表达量的相对值的图表。如图13所示，使用所述miR-34a的情况下，确认CAB39mRNA的表达抑制，但使用所述ghR-34a(G17/P13)的情况下，几乎看不到CAB39mRNA的表达抑制、即副作用。
另外，对所述提取的RNA，使用GeneChip(商品名GeneChip Human GenomeU133Plus 2.0Array、Affymetrix社)进行mRNA的网罗分析。而且，作为通过所述成熟mi-34a的导入而表达降低的基因，选择基础尺度信号(base scale signal)为1000以上、且表达降低至1/2的115个基因，其中，对作为所述过客链的靶基因的利用miRDB(miRNA数据库)算法所预测的14个基因，利用所述ghR-34a(G17/P13)确认表达抑制的有无。将上述结果示于图14。
图14为表示因转染的miRNA而表达被抑制的基因的有无的图表，纵轴表示信号比(log2)。如图14所示，通过所述成熟miRNA的导入而因所述过客链被表达抑制的14个基因中，没有因所述ghR-34a(G17/P13)而表达被抑制的基因。
(实施例8)
将实施例2中制作的ghR-34a(G17/P13)(序列号25)导入于DICER1缺失或AGO2缺失的肺癌细胞株，确认是否可以DICER非依赖性地或AGO非依赖性地抑制AXLmRNA的表达。
人的体内的来自生物体的miRNA采取发夹结构，其在生物体内被Dicer及Ago切断，成为如上所述的双链的成熟型miRNA，参与基因的表达抑制。因此，关于基因的表达抑制，可以说是来自生物体的miRNA为Dicer依赖性及Ago依赖性。因此，关于本发明的人工模拟miRNA，确认是否可以DICER非依赖性地或AGO非依赖性地抑制基因表达。
(1)DICER非依赖性的确认
使用CRISPR/Cas9系统，由H1299制作DICER1缺失的肺癌细胞株。图15表示人Dicer1mRNA中的CRISPR/Cas9引导链的杂交的位置。对得到的2株(#1、#2)，利用蛋白质印迹法确认DICER1的蛋白质表达，结果，没有看到表达，另外，作为内在性miRNA的let-7a、miR-18a的表达也显著减少。由前者的结果可以确认：DICER1以蛋白质水平缺失，由后者的结果可以确认：DICER1功能缺失。
除使用DICER1缺失细胞株(#1、#2)以外，通过与上述实施例1同样的方法进行所述细胞株的培养、所述ghR-34a(G17/P13)(序列号25)的转染、转染后的培养。而且，与上述实施例1同样地操作，测定从转染2天后的AXL mRNA的表达量。而且，将未处理细胞(Non-treat)的表达量设为1，求出AXL mRNA的表达量的相对值。另外，对所述ghR-34a(G17/P13)，使用变更为打乱序列的与上述实施例6相同的所述ghR-34a(G17/P13)打乱序列，同样地进行处理，求出表达量的相对值。将上述结果示于图16。
图16为表示AXL mRNA的结果的图表，纵轴表示表达量的相对值。如图16所示，通过与未处理细胞的比较得知：所述ghR-34a(G17/P13)在DICER1缺失细胞株中也可以抑制AXLmRNA的表达。即，得知：根据本发明，可以DICER1非依赖性地抑制mRNA的表达。
(2)AGO2非依赖性的确认
使用CRISPR/Cas9系统，由H1299制作AGO2缺失的肺癌细胞株。图17表示人AGO2mRNA中的CRISPR/Cas9引导链的杂交的位置。对得到的2株(#1、#2)，利用蛋白质印迹法确认AGO2的蛋白质表达，结果没有看到表达。另外，将相对于GAPDH的siRNA转染，确认GAPDH的表达，结果，所述siRNA的GAPDH表达抑制活性显著降低。由前者的结果可以确认：AGO2以蛋白质水平缺失，由后者的结果可以确认：AGO2功能缺失。
除使用AGO2缺失细胞株(#1、#2)以外，通过与上述实施例1同样的方法进行所述细胞株的培养、所述ghR-34a(G17/P13)或与上述实施例1相同的所述ghR-34a打乱序列的转染、转染后的培养。而且，与上述实施例1同样地操作，测定从转染2天后的AXL mRNA的表达量。而且，将未处理的表达量设为1，求出AXL mRNA的表达量的相对值。将上述结果示于图18。
图18为表示AXL mRNA的结果的图表，纵轴表示表达量的相对值。如图18所示，得知：所述ghR-34a(G17/P13)不仅在H1299细胞中、而且在AGO2缺失细胞株中也可以抑制AXLmRNA的表达。即，得知：根据本发明，不仅DICER1、而且AGO2可以非依赖性地抑制mRNA的表达。
(实施例9)
将实施例1中制作的ghR-34a(G17/P13)(序列号25)导入于肺癌模型小鼠，确认治疗效果。
作为肺癌模型小鼠，使用活化型KRAS敲入小鼠(参照Johnson et al.,Nature vol410,p.1111,26April 2001)。对6周龄的小鼠(每1给药组8只)，将所述ghR-34a(G17/P13)(序列号25)或与上述实施例6相同的所述ghR34a(G17/P13)打乱序列在0.5mg/kg体重的给药量、间隔4天、总计7次的条件下使用小鼠用喷雾器进行气管给药。给药的载体使用壳聚糖。而且，从给药开始2第1天测定肺的重量的测定、肺全体积中的肿瘤的体积比例、肺表面的肿瘤块的数量。将上述结果示于图19。
图19中，(A)为表示肺重量的图表，(B)为表示肺全体积中的肿瘤的体积比例的图表，(C)为表示肺表面的肿瘤块的数量的图表。如图19(A)、(B)及(C)所示，与导入有打乱序列的核酸进行比较，通过所述ghR-34a(G17/P13)(序列号25)的给药，肺重量的增加、体积比例、肿瘤块的数量显著减少。
以上，参照实施方式，对本申请发明进行说明，但本申请发明并不限定于上述实施方式。本申请发明的构成或详细可以进行在本申请发明的范围内本领域技术人员能够理解的各种各样的变更。
该申请主张以2013年12月26日所申请的日本申请日本特愿2013-269599为基础的优先权，在此引入其公开的全部。
[工业上的可利用性]
根据本发明的人工模拟miRNA，可以容易地以低成本合成，且可以抑制所述基因所编码的蛋白质的翻译。由于本发明的人工模拟miRNA可以如上所述抑制目标基因的表达，因此，例如作为医药品、诊断药及农药、以及农药、医学、生命科学等研究工具是有用的。

Claims (7)

1.一种人工模拟miRNA，其碱基序列如序列号25所示。
2.一种表达抑制用组合物，其用于抑制目标基因的表达，其特征在于，含有权利要求1所述的人工模拟miRNA。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的人工模拟miRNA。
4.根据权利要求1所述的人工模拟miRNA在制备抑制目标基因表达的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述药物为给药于细胞、组织或器官的药物。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中，所述药物为用于在活体内或活体外给药的药物。
7.根据权利要求4或5所述的用途，其中，所述药物为给药于非人动物的药物。
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