JP2012503494A - ナノ粒子を含む遺伝子運搬体 - Google Patents
ナノ粒子を含む遺伝子運搬体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012503494A JP2012503494A JP2011539457A JP2011539457A JP2012503494A JP 2012503494 A JP2012503494 A JP 2012503494A JP 2011539457 A JP2011539457 A JP 2011539457A JP 2011539457 A JP2011539457 A JP 2011539457A JP 2012503494 A JP2012503494 A JP 2012503494A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- oligonucleotide
- aunp
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
- A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
- A61K33/242—Gold; Compounds thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
- C12N2310/127—DNAzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/70—Nanostructure
- Y10S977/773—Nanoparticle, i.e. structure having three dimensions of 100 nm or less
Abstract
Description
本発明は、ナノ粒子を含む遺伝子運搬体に関する。
先天性及び後天性原因による癌及び遺伝的疾患に対する臨床治療方法として、遺伝子治療が注目を浴びてきた。効率的な遺伝子伝達システムは、遺伝的疾患及び癌の臨床治療を焦点とするシステムであって、最近高い関心を浴びるようになった(1)。高い形質転換効率と蛋白質発現をさせるために、組換えウイルスを遺伝子キャリアとして利用することが研究初期の観点であった(2)。しかしながら、このようなシステムは、ウイルス由来の蛋白質が強力な免疫反応を発生させる決定的な限界により、FDAの承認を受けられなかった(3)。また、ウイルス伝達システムは、プロセスを拡大させる面で制限的である(4)。その結果、陽イオン性脂質、ポリマー、デンドリマー(dendrimer)及びペプチドのような数多い非ウイルス性遺伝子伝達システムが開発された(5)。しかしながら、非ウイルス性遺伝子伝達システムはその相当数が、細胞内・外の障害により、ウイルスシステムと比較して著しく形質転換効率が有意に減少された。したがって、多い研究者らは、安全且つ効率的なウイルス性伝達ベクターに焦点を合わせて研究をした。
本発明者らは、正常細胞に影響を与えることなく、ターゲット遺伝子の発現を抑制できる物質(例えば、ターゲット遺伝子に特異的なオリゴアンチセンスDNAs)に対する効率的な遺伝子伝達システムを開発するために鋭意研究した。その結果、ナノ物質表面に共有結合によりユニバーサル結合パートナーを導入して、この結合パートナーに結合する結合カウンターパートナーに抑制分子または発現しようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子を結合させて新規な遺伝子伝達システムを開発して、この遺伝子伝達システムがターゲット分子の発現を非常に効率的に抑制させるか発現させることを究明することにより、本発明を完成した。
(i)本発明は、ナノ粒子を含む遺伝子運搬体を提供する。より具体的には、(a)ナノ物質と、(b)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、(c)(i)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)を含む運搬対象(cargo)を含む遺伝子運搬体を提供する。
図1は、一本鎖DNAで機能化された金(Au)ナノ粒子−アンチセンスの概略図である。Au nanoparticle:金ナノ粒子;Antisense DNA:アンチセンス DNA;Target mRNA:ターゲットmRNA。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
特に言及しない限り、固体/固体は、(重量/重量)%、固体/液体は、(重量/容量)%、そして液体/液体は、(容量/容量)%である。
(一本鎖DNA機能化されたAuNP-shRNAコンジュゲートの製造)
アニリングバッファ(0.3M NaClを含む1×PBS)でAuNP・αGFPまたはAuNP・RNA I(10nM)をshRNAと10分間徐々にシェークして混合した後、10分間55℃で反応させて、約1時間4℃に冷却させた。生成されたコンジュゲートを12,000gで10分間ダウンさせた後、上澄み液を除去して、コンジュゲートペレットをDMEM培地で再懸濁した。上述の沈殿及び再懸濁段階を3回繰り返して行った。生成されたコンジュゲート(10nM)を最終濃度1nMになるように組織培養培地に添加した。
製造者の指示にしたがって、MEGAshortscriptTM キット(Ambion, USA)を利用してT7プロモーター配列及び以後短いヘアーピン構造のp53及びMCL-1配列を含む合成オリゴヌクレオチドからshRNAを合成した。PCRを利用してオリゴヌクレオチドを増幅することにより、DNAテンプレートを製造した。AuNP・αGFPと混成化されるshRNA-p53及びshRNA-Mcl1の合成のために、sh-p53-テンプレート(5'-TAATACGACTCACTATAGGGACGGCAGCGTGCAGCTCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTT;下線の部位, T7プロモーター)及びsh-Mcl-1L-テンプレート-1(5'-TAATACGACTCACTATAGGGACGGCAGCGTGCAGCTCCCCCGGGACTGGCTAGTTAAACTTCAAGAGAGTTTAACTAGCCAGTCCCGTTTTTGGAAA-3';下線の部位、T7プロモーター)をそれぞれ利用した。AuNP・αRNA Iと混成化されるshRNA-Mcl1の合成のために、sh-Mcl-1L-テンプレート-2(5'-TAATACGACTCACTATAGGCTCTAGCAGAGCCGAGATCCCCGGGACTGGCTAGTTAAACTTCAAGAGAGTTTAACTAGCCAGTCCCGTTTTTGGAAA-3';下線の部位、T7プロモーター)。利用されたPCRプライマーは、T7-1(5'-TTAATACGACTCACTATAGG-3')及びsh-p53-R(5'-AAGACTCCAGTGGTAA-3')、shMCL-1-R(5'-TTACCAAAAACGGGACTGGCT-3')であった。合成されたshRNAsをillustraTM MicroSpinTM G-50 columns(GE; Little Chalfont, Buckingham shire, UK)を利用して精製した。
HEK293(4.5×105)またはHeLa(3.0×105)細胞を、金-ナノ粒子で機能化された短いヘアーピンRNAと6-ウェルディッシュで反応させた。細胞を10%プロテアーゼ抑制剤カクテル(Sigma)を含むNP-40溶解緩衝液(50mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.15M NaCl及び1% NP-40)で溶解させた。定量的蛋白質分析のために、標準BSA溶液(Pierce, Rockford, IL, USA)を利用して、標準曲線を確立して、同量の総蛋白質を含む細胞溶解物を10%ポリアクリルアミドゲルで分離して、ニトロセルロース膜に移してウェスタンブロット分析を行った。抗-p53単一クローン抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)及び抗-MCL1-Lポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)を、それぞれp53及びMCL-1Lを検出するために利用した。
総RNAを製造者の指示にしたがって、TRI Reagent(登録商標) Solution(Ambion)を利用して細胞株から抽出した。3μgの総RNAを、テンプレートとしてPrimScriptTM 1st-Strand cDNA合成キット(Takara; Otsu, Shiga, Japan)を使用してcDNA合成を行った。PCRは、2μlのRT反応物を含む総20μl容量で行った。PCR産物を2%アガロースゲルで分析した。利用されたプライマーは、次のようである: p53-F(正方向), 5'-AGCTTTGAGGTGCGTGTTTG-3'及びp53-R(逆方向), 5'-TCAGCTCTCGGAACATCTCG-3'; MCL-1L-F(正方向), 5'-TGGTCGGGGAATCTGGTAAT-3'及びMCL-1L-R(逆方向), 5'-GTAAGGTCTCCAGCGCCTTC-3';及びGAPDH-F(正方向), 5'-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3'及びGAPDH-R(逆方向), 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3'。
β-カテニンmRNA-切断DNAzyme(図13に記載された配列)を製造して、これの5’-末端配列を、金ナノ粒子にコンジュゲーションされたGFPアンチセンスオリゴヌクレオチドにアニーリングするように考案した(図13)。DNAzymeをGFPアンチセンスオリゴヌクレオチド-コンジュゲーションされた金ナノ粒子にアニーリングするために、次の過程を行った。金ナノ粒子溶液(36.5nM)1mlを4℃で13,000rpmで40分間遠心分離した。上澄み液を除去して、ペレットを脱塩(saline-free)リン酸緩衝液(pH.7.5)に溶解された1% BSA溶液1mlと迅速に混合した。常温で30分間ペレット溶液を反応させた後、溶液を4℃で13,000rpmで40分間遠心分離した。金ナノ粒子を含むペレットを脱塩リン酸緩衝液(pH.7.5)300μlに再懸濁して120nMになるように製造した後、今後の利用のために4℃に保管した。上述のように製造されたBSA-保護された金ナノ粒子の多様な量(図14に示された濃度)とDNAzymeオリゴヌクレオチド(10μM)10μlを混合した。混合溶液に20mM MgCl2及びTris/HCl(20mM, pH7.5)を添加した。DNAzymeを金ナノ粒子にアニーリングするために、DNA-混合された溶液に95℃、2分間及び42℃、10分間熱を加えた後、常温に徐々に冷やした。このようにDNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子が製造された。金ナノ粒子にアニーリングするDNAzymeの量を15%天然(非変性)ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。DNAzyme(10μM)の固定された量を、BSA-保護された金ナノ粒子の増加する量(0, 0.5, 1, 2, 4, 10及び15μl)と混合した。ゲルを2時間電気泳動して、EtBr(ethidium bromide)で染色した後、UV照射器(UV transilluminator)を利用してDNAを検出した(図14A)。
大腸癌細胞株SW480をATCC(American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)から購入して、5% CO2 湿度調節された37℃培養器で10% FBS、120μgペニシリン/ml、及び200μgストレプトマイシン/mlが添加されたDMEM培地を利用して維持した。50-60%コンフルエンスを得るために、6×104 細胞を10%FBSを含む培地下で12-ウェルプレートにプレーティングした。製造者の指示にしたがって、リポフェクタミンTM 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を利用して細胞に緑色蛍光蛋白質(GFP)発現プラスミドDNAをトランスフェクションさせた。培養培地を入れ換えることにより、トランスフェクション試薬を完全に除去した。GFPプラスミドをトランスフェクションして24時間後、GFPアンチセンスオリゴヌクレオチド−変形された金ナノ粒子を利用してアンチセンスDNAzymeオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを行った。DNAzymeの形質転換は、各オリゴヌクレオチドの所望の濃度を有する金ナノ粒子を利用して行った。DNAzyme-アニーリングされた金ナノ粒子のトランスフェクション24時間後、蛍光顕微鏡を利用して細胞から放出される緑色蛍光を測定した(図14B)。緑色蛍光をモニタリングした後、細胞を収得して溶解緩衝液(20mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.1% NP-40, 20mM EDTA, 10%グリセロール及び10mM KCl)で破壊して、ウェスタンブロット分析を行った。
本研究は、ターゲット遺伝子に特異的なアンチセンスDNAを積載及び伝達するためのフラットフォームとして、一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子(以下、‘金ナノ粒子遺伝子伝達システム(gold nanoparticle gene delivery system: AuNP GDS)’という)を利用する遺伝子伝達システムを開発した。
テストされた全ての細胞において、Mcl-1L-AS-FITCから出る蛍光光を蛍光顕微鏡分析を通じて確認して、AuNP GDS-Mcl-1L-AS-FITCは、優れた形質転換(transfection)効率を示した(図2)。一本鎖DNAで機能化された金ナノ粒子が細胞内に容易に入ることについては、既に報告された。しかしながら、本研究結果では、二本鎖DNA(20個の塩基対)を部分的に含むAuNP GDS-ASコンジュゲートがほぼ100%効率で細胞内に入ることを確認した。AuNP GDS-ASコンジュゲートは、アニーリングバッファ(0.3M NaClを含む1×PBS)で0.1または1μMアンチセンスオリゴヌクレオチドとAuNP GDSを徐々に混合した後、10分間55℃でアニーリングさせて、1時間室温までインキュベーションした。生成されたコンジュゲートをpH 7.4のPBS(Phosphate Buffer Saline)緩衝液で3回洗浄後、細胞に適用した。
その後、アンチセンスオリゴがターゲット遺伝子発現をノックダウンさせるかをテストした。AuNP GDS-Mcl-1L-AS コンジュゲートをHeLa細胞に適用して、ウェスタンブロット分析を利用し、MCL-1Lの定量を分析するために形質転換をさせた後、24時間培養して蛋白質サンプルを製造した。図3に示したように、AuNP GDS-Mcl-1L-ASコンジュゲートは、MCL-1Lアンチセンス濃度依存方式において、MCL-1L発現を効率的にノック-ダウンさせた。0.1μM Mcl-1L ASがリポソーム含有試薬(Lipofectamine 2000, Invitrogen)を使用して細胞内に伝達された時、ノック-ダウン効率は、AuNP GDS(9.8vs. 19.5%)よりさらに低く、このような結果は、AuNP GDSシステムが、アンチセンスDNAを運搬するにおいて、リポソーム含有試薬を利用することよりさらに効率的であることを意味する。
遺伝子伝達システムとしてAuNP GDSを使用できるかどうかを検証するために、遺伝子をターゲットとする二つの追加的なアンチセンスだけではなく、他のヒト細胞株(HEK 293T, Human Embryonic Kidney 293T、韓国細胞株銀行)をテストした。
金ナノ粒子と結合された一本及び二本鎖DNAオリゴヌクレオチドが、細胞内で非結合されたDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドより相対的に著しく安定的であることが確認された。[16] このような安定性は、ヌクレアーゼ(nuclease)の酵素的活性を不活性化させることができる立体的妨害(steric hindrance)及び高い局所的塩の濃度によるものである。アンチセンス核酸(nucleic acid)として効果的であるためには、アンチセンス核酸の活性が細胞内で長いインキュベーション時間安定的に維持されなければならない。
アニーリングバッファ(0.3M NaClを含む1xPBS)において、0.1または1μM FITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドとAuNP GDSを10分間徐々に混合した後、10分間55℃でインキュベーションさせて、1時間室温で冷却させた。生成されたコンジュゲートを4℃で20分間10,000gで遠心分離した。AuNP GDS上にFITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドのローディング(loading)は、FITC-アンチセンスオリゴヌクレオチドのカリブレーションキュアー(calibrations cure)を利用して、カップリング反応後、上澄み液(supernatant)の蛍光を測定して評価した(図6)。
0, 1, 5または10nM 金ナノ粒子-抗GFPでHeLa細胞を形質転換させた後、48時間インキュベーションした。トリパンブルー(trypan blue)で死滅した細胞を染色した後、生存する細胞数を計算した。
shRNAがターゲット遺伝子発現をノックダウンさせるかをテストした。siRNAは、ターゲット遺伝子の発現を抑制する効率的な遺伝子ノックダウン方法である。sh-p53-1[18]の場合、AuNP GDSに相補的な配列の次に、p53コーディング領域に相補的な塩基配列(5'-GACUCCAGUGGUAAUCUACUUCAAGAGAGUAGAUUACCACUGGAGUCUU-3')が連結されている。p53 sh RNAの合成過程は、図8Cに示した。T7プロモーターシーケンスの後ろ部分に抗EGFPオリゴシーケンスとループ構造を形成するp53に相補的なシーケンスを有したPCR DNAを合成して、これを鋳型としてMEGAshortscript TM Kit(Ambion,THE RNA COMPANY)を利用してsh-p53を自体製作した。アンチセンスオリゴと同じ方法でAuNP GDS-sh-p53-1コンジュゲートを製作し、293T細胞に適用した。ウェスタンブロット分析を利用して、p53の定量を分析するために形質転換をさせた後、24時間培養して蛋白質サンプルを製造した。図8aに示したように、AuNP GDS-sh-p53コンジュゲートは、結合したsh-p53アンチセンスの濃度に依存的にp53の発現を効率的にノックダウンさせた。
金ナノ粒子遺伝子伝達システム(AuNP GDS)を利用して、抗RNA I配列を含んでいる二本鎖DNAの細胞内に伝達が可能であるかをテストした。細胞内で伝達された遺伝子の活性を測定するために、発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を使用した。図9に示されたように、pGL3-controlプラスミドを鋳型としてルシフェラーゼ遺伝子(塩基配列2431-2450)とSV40プロモーターを含んだPCR DNAを製作するために、それに相補的なヌクレオチド配列を有するプライマーと293T細胞で複製可能な起源のSV40プロモーター及び抗RNA I配列を有するプライマーを利用して連鎖重合酵素反応(PCR, Polymerase Chain Reaction)を行った。製作されたPCR DNAに5'末端と3'末端に抗RNA Iの配列を有する一本鎖DNAを作るために、それぞれのプライマーの5'部分に存在する抗RNA I配列の次にC6リンカーを含めた。PCR反応を通じて獲得した三つの生成物(5',3'-抗RNA I-Luc., 5’-抗RNA I-Luc.,3’-抗RNA I-Luc)をAuNP-GDSにコンジュゲーションさせた。まず、AuNPとの相補的な結合を容易にするために、それぞれの生成物を95℃で5分間変性させた後、アニーリングバッファ(0.3M NaClを含む1xPBS)でAuNP GDSと共に10分間55℃でインキュベーションさせて、1時間室温で冷却させた。次の過程は、アンチセンスオリゴAuNP GDS製作過程と同一である。製作されたAuNP GDS-Luc(ルシフェラーゼ遺伝子)を293T細胞に適用させた。ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で発現させた後、細胞を回収して活性を測定した(Luciferase Assay Kit, PROMEGA)。ルシフェラーゼ発光酵素は、基質である活性ルシフェリン(Luciferin)との酸化還元作用により光を発するようになる。図9aに示したように、5’に抗RNA Iヌクレオチド塩基配列を有した生成物(5’-抗RNA I-Luc)が活性を示した。AuNP-GDSを利用して二本鎖DNA遺伝子の細胞内の伝達も容易であることを確認した。
Rosiら[15]により開発された一本鎖DNA機能化された金ナノ粒子は、ヒト細胞にアンチセンスDNAを効果的に運搬し、結果的にターゲット遺伝子の発現をノックダウンさせると明かされた。また、このような機能化された金ナノ粒子は、リポソーム含有試薬により運搬されたアンチセンスDNAより低い細胞毒性を示した。それぞれターゲット遺伝子(gene of interest)を個別的に合成する必要がある、共有結合を通じて金ナノ粒子にクロス結合された(cross-linked)アンチセンスDNAを運搬できるシステムの不具合を克服するために、本発明者らは、一本鎖DNA機能化されたAuNPを、ターゲット遺伝子に特異的な小さいヘアーピンRNA(shRNA)の運搬のための普遍的な運搬体に利用できるかどうかをテストした。本発明者らは、EGFPのコーディング部位(1198から1215までの塩基)に相補的な配列(αEGFPオリゴ)を有するDNAオリゴヌクレオチド(oligo)を利用したが、このようなαEGFPオリゴは、ヒト組織培養において、他の遺伝子の発現を干渉することなく、効率的に細胞内に伝達されて、EGFP発現を抑制させた[15]。AuNP・αEGFPオリゴ複合体は、チオール化されたαEGFPオリゴを有する13nm金ナノ粒子を機能化して製造した[16]。
p53遺伝子に特異的なshRNAをインビトロで合成し、共有結合を通じてAuNPにクロス結合されたαEGFPオリゴにアニーリングした後、これにより生成されたコンジュゲートをHEK293細胞に処理した。p53遺伝子に対するshRNA(shRNA-p53)は、αEGFPオリゴに相補的な配列を含み、これに67個のヌクレオチド配列が結合されて、このshRNAは、ヘアーピンを形成する(図10)。ヘアーピンは、短い干渉RNAとして機能し、9個のヌクレオチドで構成されたループにより連結された(flanked)p53の内部コーディング部位(895から931までの塩基配列)に相応する逆方向(inverted direct)反復配列を含む[17]。AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートをHEK293細胞に処理して、ウェスタンブロット分析を利用して、p53を量的に分析するために24時間形質転換させた後、蛋白質試料を抽出した。図11Aから分かるように、AuNP・αEGFP・shRNA-p53コンジュゲートは、shRNA-p53濃度依存的にp53蛋白質の発現を効果的にノックダウンさせた。50nM以上の濃度でshRNA-p53を処理することにより、p53蛋白質の発現を90%以上抑制させた。リポソーム含有試薬を利用してshRNA-p53が細胞内に運搬された場合、ノックダウン効率が、AuNP・αEGFPを利用した場合と類似であった(図11B)。本発明者らは、また他のヒト細胞株であるHeLa細胞株において、AuNP・αEGFPにアニーリングされたshRNA-p53のトランスフェクションをテストし、HEK293細胞と類似した結果を得た(図11B)。このような結果は、AuNP・αEGFP-媒介のshRNAの運搬が特定細胞株に局限されるものではないことを意味する。
また、本研究者らは、Escherichia coli 内ColE1-タイププラスミドの複製のためのアンチセンスRNAであるRNA Iの一部配列(AuNP・RNA I)を含むオリゴヌクレオチド(オリゴ)を含む一本鎖DNA機能化されたAuNPをテストした[19]。RNA Iオリゴの配列に相補的な配列を有することを除いては、図11Eに記載された実験に利用されたshRNA-Mcl-1Lと類似したshRNAをAuNP・RNA Iにアニーリングして、その結果生成されたコンジュゲートをHEK293細胞と反応させた。図11Eに示されたのと類似した結果が得られた(図12)。
[1] a) F. McCormick, Nat. Rev. Cancer 2001, 1, 130-141 b) J. B.Opalinska, A. M. Gewirtz, Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1, 503-514.
[2] M. A. Kay, J. C. Glorioso, L. Naldini, Nat. Med. 2001, 7, 33-40.
[3] a) S. E. Raper, N. Chirmule, F. S. Lee, N. A. Wivel, A. Bagg, G.-P. Gao, J. M. Wilson, M. L. Batshaw, Mol. Genet. Metab. 2003, 80, 148-158 b) S. Hacein-Bey-Abina, C. von Kalle, M. Schmidt, F. Le Deist, N. Wulffraat, E. McIntyre, I. Radford, J. L. Villeval, C. C. Fraser, M. Cavazzana-Calvo, et. al., N. Engl. J. Med. 2003, 348, 255-256 c) J. J. Green, R. Langer,D. G. Anderson, Acc. Chem. Res., 2008, 41, 749-759.
[4] I. M. Verma, N. Somia, Nature 1997, 389, 239-242.
[5] a) M. A. Mintzer, E. E. Simanek, Chem. Rev. 2009, 109, 259-302 b) X. Guo, F. C. Szoka Jr., Acc. Chem. Res., 2003, 36, 335-341 c) R. K. Tekade, P. V. Kumar,N. K. Jain, Chem. Rev., 2009, 109, 49-87 d) K. S. Soppimath, T.M. Aminabhavi, A. R. Kulkarni, W. E. Rudzinski, J. Control. Release, 2001, 70, 1-20.
[6] a) M. Prato, K. Kostarelos, A. Bianco, Acc. Chem. Res., 2008, 41, 60-68 b) J.Cheon, J.-H. Lee, Acc. Chem. Res., 2008, 41, 1630-1640 c) B. G. Trewyn, I. I. Slowing, S. Giri, H.-T. Chen, V. S.-Y. Lin, Acc. Chem. Res., 2007, 40, 846-853 d) I. I. Slowing, J. L. Vivero-Escoto, C.-W. Wu, V. S.-Y. Lin, Adv. Drug Deliv. Rev., 2008, 60, 1278-1288 e) C. J. Murphy, A. M. Gole, J. W. Stone, P. N. Sisco, A. M. Alkilany, E. C. Goldsmith, S.C. Baxter, Acc. Chem. Res., 2008, 41, 1721-1730
[7] M.-C. Daniel, D. Astruc, Chem. Rev. 2004, 104, 293-346.
[8] a) K. K. Sandhu, C. M. Mclntosh, J. M. Simard, S. W. Smith, V. M. Rotello, Bioconjugate Chem. 2002, 13, 3-6; b) ACS nano 2008, 2213 c) M. Thomas, A. M. Klibanov, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 9138-9143 d) C. Agbasi-Porter, J. Ryman-Rasmussen, S. Franzen, D. Feldheim, Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1178-1183; e) C.-Y. Tsai, A.-L. Shiau, P.-C. Cheng, D.-B. Shieh, D.-H. Chen, C.-H. Chou, C.-S. Yeh, C.-L. Wu, Nano lett. 2004, 4, 1209-1212; f) N. L. Rosi, D. A. Giljohann, C. S. Thaxton, A. K. R. Lytton-Jean, M. S. Han, C. A. Mirkin, Science 2006, 312, 1027-1030.
[9] J.-R. Bertrand, M. Pottier, A. Vekris, P. Opolon, A. Maksimenko, C. Malvy, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 296, 1000-1004.
[10] S. J. Hurst, A. K. R. Lytton-Jean, C. A. Mirkin, Anal. Chem. 2006, 78, 8313-8318.
[11] C. Skoda, B. M. Erovic, V. Wachek, L. Vormittag, F. Wrba, H. Martinek, G. Heiduschka, P. Kloimstein, E. Selzer, D. Thurnher, Oncol. Rep. 2008, 19, 1499-1503.
[12] R. Agami, R. Bernards, Cell, 2000,102, 55-66.
[13] L.-C. Dai, X. Wang, X. Yao, L.-S. Min, F.-C. Qian, J.-F. He, Acta Pharmacologica Sinica 2006, 27, 1453-1458.
[14] S. Bi, F. Lanza, J. M. Goldman, Cancer Research 1994, 54, 582-586.
[15] B. Polisky, Cell 1988, 929-932.
[16] a) Z. Wang, A. G. Kanaras, A. D. Bates, R. Cosstick, M. Brust, J. Mater. Chem. 2004, 14, 578 b) D.S. Seferos, A. E. Prigodich, D. A. Giljohann, P. C. Patel, C. A. Mirkin, Nano Lett. 2009, 9, 308-311.
[17] I. Heo, V. N. Kim, Cell 2009, 139, 28-31.
[18] A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R.Science. 2002 Apr 19;296(5567):550-3. Epub 2002 Mar 21.。
Claims (18)
- (a)ナノ物質と、
(b)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、
(c)(i)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、
を含む遺伝子運搬体(gene delivery system)。 - 前記ナノ物質は、8〜100nmの大きさを有するナノ粒子であることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子運搬体。
- 前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子であることを特徴とする、請求項2に記載の遺伝子運搬体。
- 前記ナノ粒子は、金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項3に記載の遺伝子運搬体。
- 前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、末端にチオール基またはアミン基が結合されていることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子運搬体。
- 前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、非−ヒトヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子運搬体。
- 前記結合カウンターパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチドは、3〜100個のヌクレオチドから構成されたことを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子運搬体。
- 前記(c)において、発現を減小させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム(ribozyme)、DNAzymeまたはPNAであることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子運搬体。
- 前記(c)において、発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子は、RNAまたはDNAであることを特徴とする、請求項1に記載の遺伝子運搬体。
- (a)ナノ物質と、
(b)前記ナノ物質の表面と共有結合で連結された(covalently linked to)ユニバーサル結合パートナー(universal binding partner)としてのオリゴヌクレオチドと、
(c)(i)前記結合パートナーに相補的な配列を含む結合カウンターパートナー(binding counter-partner)としての相補的オリゴヌクレオチド、(ii)発現を減少させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子(inhibitory molecule)または発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子(inducing molecule)を含む運搬対象(cargo)と、を含む遺伝子運搬体を細胞に接触させる段階を含むカーゴを細胞に運搬する方法。 - 前記ナノ物質は、8〜100nmの大きさを有するナノ粒子であることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記ナノ粒子は、金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、末端にチオール基またはアミン基が結合されていることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記ユニバーサル結合パートナーとしてのオリゴヌクレオチドは、非−ヒトヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記結合カウンターパートナーとしての相補的オリゴヌクレオチドは、3〜100個のヌクレオチドから構成されたことを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記(c)において、発現を減小させようとするターゲット遺伝子に相補的な配列を有する抑制分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、siRNA、shRNA、miRNA、リボザイム(ribozyme)、DNAzymeまたはPNAであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記(c)において、発現させようとするターゲット遺伝子の配列を有する誘導分子は、RNAまたはDNAであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20090107234 | 2009-11-06 | ||
KR10-2009-0107234 | 2009-11-06 | ||
PCT/KR2010/001679 WO2011055888A1 (en) | 2009-11-06 | 2010-03-18 | Nanoparticle-based gene delivery systems |
KR10-2010-0024120 | 2010-03-18 | ||
KR1020100024120A KR101230913B1 (ko) | 2009-11-06 | 2010-03-18 | 나노입자-기반된 유전자 운반체 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012503494A true JP2012503494A (ja) | 2012-02-09 |
Family
ID=43970114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011539457A Pending JP2012503494A (ja) | 2009-11-06 | 2010-03-18 | ナノ粒子を含む遺伝子運搬体 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8871509B2 (ja) |
EP (1) | EP2496268A4 (ja) |
JP (1) | JP2012503494A (ja) |
KR (1) | KR101230913B1 (ja) |
WO (1) | WO2011055888A1 (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5896901B2 (ja) * | 2009-08-04 | 2016-03-30 | カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチCouncil Of Scientific & Industrial Research | Dna担持支持金ナノ粒子、その調製のためのプロセスおよびその使用 |
KR101337684B1 (ko) * | 2011-10-17 | 2013-12-30 | 성균관대학교산학협력단 | 표적지향 및 치료가 가능한 다기능성 핵산 기반 항암제, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물 |
EP2864345B1 (en) * | 2012-06-25 | 2019-12-11 | Emory University | Particle-nucleic acid conjugates and therapeutic uses related thereto |
KR101596552B1 (ko) * | 2013-02-13 | 2016-02-23 | 중앙대학교 산학협력단 | 금나노입자-앱타머 결합체를 기반으로 하는 단백질 전달체 및 이의 제조 방법 |
US10287578B2 (en) | 2013-06-14 | 2019-05-14 | The University Of Notre Dame | DNAzyme-nanoparticle conjugates and methods of use thereof |
KR20150006742A (ko) * | 2013-07-09 | 2015-01-19 | (주)바이오니아 | 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 |
KR20150006743A (ko) * | 2013-07-09 | 2015-01-19 | (주)바이오니아 | 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 |
CN105899663B (zh) | 2013-12-26 | 2019-07-26 | 学校法人东京医科大学 | 用于基因表达控制的人工模拟miRNA及其用途 |
JP6425142B2 (ja) | 2013-12-27 | 2018-11-21 | 株式会社ボナック | 遺伝子発現制御のための人工マッチ型miRNAおよびその用途 |
BR112017013664A2 (ja) | 2014-12-27 | 2018-03-13 | Bonac Corporation | Naturally occurring type miRNA for gene expression control, and its use |
WO2016109522A1 (en) * | 2014-12-30 | 2016-07-07 | Emory University | Particle-nucleic acid conjugates and therapeutic uses related thereto |
KR101734308B1 (ko) | 2015-01-21 | 2017-05-12 | 한국과학기술연구원 | siRNA 표적-특이적 전달을 위한 RNA/DNA 나노입자 및 이를 포함하는 전달체 |
EP3276003B1 (en) * | 2015-03-27 | 2022-07-20 | Bonac Corporation | Single-chain nucleic acid molecule having delivery function and gene expression control ability |
WO2018195338A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Atyr Pharma, Inc. | Compositions and methods for treating lung inflammation |
SG11202012043RA (en) | 2018-07-03 | 2021-01-28 | Gilead Sciences Inc | Antibodies that target hiv gp120 and methods of use |
CA3142513A1 (en) | 2019-06-25 | 2020-12-30 | Gilead Sciences, Inc. | Flt3l-fc fusion proteins and methods of use |
KR20220047277A (ko) | 2019-07-16 | 2022-04-15 | 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 | Hiv 백신, 및 이의 제조 및 사용 방법 |
JP7398556B2 (ja) | 2019-09-30 | 2023-12-14 | ギリアード サイエンシーズ, インコーポレイテッド | Hbvワクチン及びhbvを治療する方法 |
CA3128035A1 (en) | 2020-08-13 | 2022-02-13 | Bioasis Technologies, Inc. | Combination therapies for delivery across the blood brain barrier |
TWI815194B (zh) | 2020-10-22 | 2023-09-11 | 美商基利科學股份有限公司 | 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法 |
US20220233714A1 (en) * | 2021-01-27 | 2022-07-28 | Vanderbilt University | Nanogold-dna bioconjugates and methods of use thereof |
KR20230160699A (ko) | 2022-05-16 | 2023-11-24 | 주식회사 엔이에스바이오테크놀러지 | 나노 입자-crispr 결합체를 기반으로 하는 유전자 조작 및 이의 제조 방법 |
WO2023224388A1 (ko) * | 2022-05-17 | 2023-11-23 | 주식회사 엔이에스바이오테크놀러지 | 금속 나노 입자-핵산 결합체를 기반으로 하는 유전자 운반체 |
KR102494402B1 (ko) | 2022-05-24 | 2023-02-06 | 주식회사 엔이에스바이오테크놀러지 | 나노입자-올리고t 결합체를 기반으로 하는 메신저 rna 운반체 |
WO2024015741A1 (en) | 2022-07-12 | 2024-01-18 | Gilead Sciences, Inc. | Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009075817A1 (en) * | 2007-12-06 | 2009-06-18 | Minerva Biotechnologies Corporation | Method for treating cancer using interference rna |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5352775A (en) | 1991-01-16 | 1994-10-04 | The Johns Hopkins Univ. | APC gene and nucleic acid probes derived therefrom |
CA2140624C (en) | 1992-07-22 | 2001-05-01 | Arnold J. Levine | P53 vaccine |
FR2732357B1 (fr) | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose |
FR2740344B1 (fr) | 1995-10-31 | 1997-11-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Application de la proteine gax au traitement de cancers |
EP1268769A2 (de) * | 2000-03-31 | 2003-01-02 | Memorec Stoffel GmbH Medizinisch-Molekulare Entwicklung | Verfahren zur extraktion von nukleinsäuren |
EP1215199A1 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-19 | Sony International (Europe) GmbH | Linker molecules for selective metallisation of nucleic acids and their uses |
CA2453417A1 (en) * | 2001-07-10 | 2003-06-26 | North Carolina State University | Nanoparticle delivery vehicle |
JP2005287507A (ja) * | 2004-03-10 | 2005-10-20 | Japan Science & Technology Agency | カチオン性金ナノ粒子及びポリエチレングリコール修飾カチオン性金ナノ粒子並びにそれらの核酸との複合体 |
US20080213177A1 (en) | 2004-05-24 | 2008-09-04 | Thomas William Rademacher | Nanoparticles Comprising Rna Ligands |
-
2010
- 2010-03-18 US US12/809,996 patent/US8871509B2/en active Active
- 2010-03-18 WO PCT/KR2010/001679 patent/WO2011055888A1/en active Application Filing
- 2010-03-18 JP JP2011539457A patent/JP2012503494A/ja active Pending
- 2010-03-18 KR KR1020100024120A patent/KR101230913B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2010-03-18 EP EP20100723475 patent/EP2496268A4/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009075817A1 (en) * | 2007-12-06 | 2009-06-18 | Minerva Biotechnologies Corporation | Method for treating cancer using interference rna |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6012046169; Science Vol. 312, 2006, p. 1027-1030 * |
JPN6012046171; J. Am. Chem. Soc. Vol. 131, 200902, p. 2072-2073 * |
JPN6013042030; Int. J. Pharm. Vol. 364, 2008, p. 94-101 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US8871509B2 (en) | 2014-10-28 |
US20110229966A1 (en) | 2011-09-22 |
KR20110050338A (ko) | 2011-05-13 |
EP2496268A1 (en) | 2012-09-12 |
KR101230913B1 (ko) | 2013-02-07 |
EP2496268A4 (en) | 2013-06-19 |
WO2011055888A1 (en) | 2011-05-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8871509B2 (en) | Nanoparticle-based gene delivery systems | |
Limoni et al. | Engineered exosomes for targeted transfer of siRNA to HER2 positive breast cancer cells | |
JP6236498B2 (ja) | 非対称性干渉rnaの組成物およびその使用 | |
Ibrahim et al. | MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR-33a is efficacious in a model of colon carcinoma | |
Dua et al. | Nucleic acid aptamers targeting cell-surface proteins | |
Akhtar et al. | Toxicogenomics of non-viral drug delivery systems for RNAi: potential impact on siRNA-mediated gene silencing activity and specificity | |
Mok et al. | Multimeric small interfering ribonucleic acid for highly efficient sequence-specific gene silencing | |
HyeáJang et al. | A functionalized gold nanoparticles-assisted universal carrier for antisense DNA | |
Ryou et al. | Delivery of shRNA using gold nanoparticle–DNA oligonucleotide conjugates as a universal carrier | |
Kardani et al. | Inhibition of miR‐155 in MCF‐7 breast cancer cell line by gold nanoparticles functionalized with antagomir and AS1411 aptamer | |
JP6297034B2 (ja) | 癌幹細胞を検出するためのEpCAMアプタマー | |
JPWO2009078470A1 (ja) | 多糖/2本鎖rna複合体 | |
KR101678876B1 (ko) | 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 및 이의 제조방법 | |
Li et al. | Rigidified DNA triangle-protected molecular beacon from endogenous nuclease digestion for monitoring microRNA expression in living cells | |
Zhao et al. | Inhibitory effect of aptamer-carbon dot nanomaterial-siRNA complex on the metastasis of hepatocellular carcinoma cells by interfering with FMRP | |
KR20210031494A (ko) | 핵산 나노입자, 이를 포함하는 약물 조성물, 독소루비신 함유 약물 및 그 제조 방법 | |
JP5252622B2 (ja) | 高いヌクレアーゼ耐性と優れたrna干渉効果を発現可能な二本鎖rna | |
Hong et al. | Building a chimera of aptamer–antisense oligonucleotide for silencing galectin-1 gene | |
Trehan et al. | siRNA: Sojourn from Discovery to Delivery Challenges and Clinics. | |
KR101484441B1 (ko) | 유전자 전달을 위한 gmp 나노입자 | |
JP5092123B2 (ja) | 遺伝子導入剤 | |
Kubo et al. | In Vivo RNAi Efficacy of Palmitic Acid‐Conjugated Dicer‐Substrate siRNA in a Subcutaneous Tumor Mouse Model | |
CN104189920B (zh) | 逆转肿瘤多药耐药的基因组合物h‑R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其应用 | |
JP2008167739A (ja) | Rna干渉効果が高い修飾型二本鎖rna | |
Beals et al. | Rationally designed DNA therapeutics can modulate human TH expression by controlling specific GQ formation in its promoter |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120904 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121204 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130827 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20131127 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20131204 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140311 |