JPWO2009078470A1 - 多糖／２本鎖ｒｎａ複合体 - Google Patents

多糖／２本鎖ｒｎａ複合体

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Abstract

本発明の目的は、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAに対して、RNA干渉効果の減弱を伴うことなく、細胞導入性及び分解酵素耐性が向上している新規な二本鎖RNAを提供することである。β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と２本鎖RNAの複合体において、以下の(i)〜(iii)を充足させることにより、RNA干渉効果を有効に保持したまま、細胞導入性及び分解酵素耐性が顕著に向上させることができる(i)前記２本鎖RNAが、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAである。(ii)前記２本鎖RNAには、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合している。(iii)前記多糖と前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化している。

Description

本発明は、標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAと、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖との複合体であって、該２本鎖RNAの作用に基づくRNA干渉効果を有効に奏することができ、更には前記多糖に機能性分子を結合させることによって、該機能性分子の作用に基づく有用な機能をも発揮し得る多糖/2本鎖RNA複合体に関する。
近年、21塩基の短い2本鎖RNA (small interfering RNA：siRNA )を利用するRNA干渉(RNA interference：RNAi)法が注目されている。このRNAi法は、100塩基対程度の2本鎖ＲＮＡを細胞内へ導入させることにより、細胞質内でDicerの働きにより20〜25塩基対程度の2本鎖RNAへと分解され、その後複数のタンパク質とRNA/タンパク質複合体を形成し（この複合体をRICS:RNA-induced silencing complexと呼ぶ）、標的遺伝子から産出されたmRNAの相同部位と結合し強力に遺伝子発現を抑制するというものである。今日では、3’末端に2塩基のダングリングエンドをもつ21塩基長の化学的に合成した2本鎖RNAを利用する方法が主流となっている。また、近年、J. Rossiらの報告により、27塩基対からなる2本鎖RNAが21塩基長からなるsiRNAに比べ100倍程度高いRNA干渉効果を示すことが明らかとなった（非特許文献１参照）。これは、27塩基対からなるRNAがRNase III様の酵素であるDicerによって21塩基長のsiRNAに切断された後、タンパク複合体であるRISCにそのまま認識され、高効率にsiRNA効果を発揮できる為だと考えられている。
このような合成RNAを用いて行うRNA干渉法は、サンプル調整も比較的容易であり、取り扱い操作も簡便であるため、ライフサイエンス分野のみならずバイオビジネス分野においても大きな注目を浴びている。
しかしながら、この優れたRNA干渉法でも、細胞内での安定性、細胞導入性、細胞内局在化、遺伝子発現抑制効果、ターゲット特異性等の点では、更なる改善が望まれている。最近、合成siRNAにおいて、ヌクレアーゼ耐性を高めたり、高活性なRNA干渉効果を獲得するために、siRNAに様々な化学修飾を施すことが試みられている。例えば、エキソヌクレアーゼからの分解耐性を獲得する為に、siRNAの末端をアミノ基やチオール基、アベーシックなどに修飾したsiRNAが合成されている。しかしながら、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAにおいて末端に修飾を施すと、たとえヌクレアーゼ耐性や細胞導入率を向上させることができても、RNA干渉効果が著しく減少すると既に報告されている。このように、従来技術では、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAにおいて、ヌクレアーゼ耐性及び細胞導入率が高く、更に優れたRNA干渉効果をも奏させることができていないのが現状である。
一方、筋肉内注射製剤の臨床薬として実際に使用されている多糖として、β−１，３−グルカンが存在する。この多糖は天然では３重螺旋構造をとっていることが古くから知られている（非特許文献２参照）。また、この多糖は、既に生体内での安全性が確認されており、筋肉内注射薬として約２０年の使用実績がある（非特許文献３参照）。更に、β−１，３−グルカンには、薬物デリバリー能があり、当該β−１，３−グルカンと薬剤とを共有結合させることによって、該薬物をターゲットへのデリバリーが可能になることも報告されている（特許文献１参照）。
β−１，３−グルカンは、天然では３重螺旋構造をとっていることが分かっている。この多糖を極性溶媒に溶解して、独立して存在する１本鎖にした後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、核酸１本・多糖２本からなる３重螺旋複合体が形成することが明らかにされている（非特許文献４参照）。このような３重螺旋複合体において、核酸と多糖は主として水素結合に因って複合化されていると考えられている。
また、近年、本発明者等によって、β−１，３−グルカンと遺伝子とを含む複合体を形成させることにより、遺伝子のデリバリーが可能になることが明らかにされている（特許文献２参照）。更に、細胞膜透過性官能基および脂質膜かく乱性官能基を有するβ−１，３−グルカンを用いた核酸導入法が報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、これらはいずれも一本鎖の核酸を細胞内に導入するための方法が記載されているのみであり、二本鎖のsiRNA等に関するものではない。特許文献４には、β−1,3−グルカンを利用して、遺伝情報を有する２本鎖ＤＮＡを標的細胞に導入する方法が報告されているが、その導入効率は悪く、実用化は難しいと考えられる。
従って、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAに対して単にβ−１，３−グルカンを複合させたのでは、３重螺旋構造が形成されないか、３重螺旋が形成されてもRNAが二本鎖でなくなる可能性があり、効果が期待できない。また、RNA干渉作用を有する2本鎖RNAは、遺伝情報を有するDNAとは細胞内での要求される作用機序が異なり、細胞内でRISCと複合体を形成して標的遺伝子から産出されたmRNAの相同部位と結合することがその基の発現に重要であるため、特許文献４に記載の方法を、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAに適用しても、DNAの場合と同様に導入効率が低いか、細胞内でRNA干渉効果の大きな減弱を来すことが予測される。
国際公開第96/014873号パンフレット 国際公開第01/34207号パンフレット 特開2006-69913号公報 特開2005-204612号公報 J. Rossi et. al. Nature Biotech., 23, 222-226 (2005) Theresa M. et al. J. Am. Chem. Soc., 120, 6909 (1998) Hasegawa, Oncology and Chemotherapy, 8, 225 (1992) 櫻井和朗等、Polym. Preprints. Jpn., 第49巻、第4054頁、2000年
そこで、本発明は、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAに対して、RNA干渉効果の減弱を伴うことなく、細胞導入性及び分解酵素耐性を向上させることを主な目的とする。
本発明者等は、前記課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と２本鎖RNAの複合体において、下記の(i)〜(iii)を充足させることにより、RNA干渉効果を有効に保持したまま、細胞導入性及び分解酵素耐性を顕著に向上させ得ることを見出した。
(i)前記２本鎖RNAが、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖を有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAである。
(ii)前記２本鎖RNAには、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合している。
(iii)前記多糖と前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化している。
本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる多糖/2本鎖RNA複合体及びその製造方法を提供する。
項１．β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と２本鎖RNAの複合体であって、
前記２本鎖RNAが、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAであり、
前記２本鎖RNAには、前記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、
前記多糖と、前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化している、
ことを特徴とする、多糖/2本鎖RNA複合体。
項２．前記１本鎖ポリデオキシアデニンに対して２つの前記多糖が複合化することにより、前記１本鎖ポリデオキシアデニンと前記多糖が3重鎖螺旋構造を形成している、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項３．前記センス鎖RNAが１５〜５０個のリボヌクレオチドで構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと同数のリボヌクレオチドで構成されている、項１記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項４．前記センス鎖RNAが、２１個のリボヌクレオチドで構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと同数のリボヌクレオチドで構成されている、項１記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項５．前記センス鎖RNAが、２７個のリボヌクレオチドで構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと同数のリボヌクレオチドで構成されている、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項６．前記１本鎖ポリデオキシアデニンが、20〜100個のデオキシアデニンで構成されている、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項７．前記１本鎖ポリデオキシアデニンが直接又はリンカーを介して前記センス鎖RNA又はアンチセンス鎖RNAの５’末端及び/又は３’末端に結合している、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項８．前記多糖類が、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、及びスクレログルカンよりなる群から選択される少なくとも１種である、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項９．前記多糖類が、機能性分子が結合されてなるβ−１，３−グルカンである、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１０．前記機能性分子が、細胞膜透過性分子、又は2本鎖RNAに対して分解酵素耐性を付与できる分子である、項９に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１１．前記機能性分子が、ペプチド、カチオン性分子、ポリエチレングリコールである、項９に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１２．前記２本鎖RNAの標的遺伝子が、前記多糖と結合する受容体を有する細胞に内在するものである、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１３．前記細胞が、当該細胞膜表面にDectin-1を発現している細胞である、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１４．前記Dctin-1と結合することによって誘導されるシグナルを通じて細部内に送達されることを特徴とする、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１５．前記標的遺伝子が、外部からの刺激などを通じてその転写産物を過剰に産生することによって病態の発症または症状の悪化に関与する因子であるか、又は前記の標的遺伝子が変異した部位を有し、その転写産物が直接病因に関与する因子であることを特徴とする、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１６．前記標的遺伝子によって過剰に転写された産物が、炎症を誘導する因子であることを特徴とする、項１５に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１７．前記標的遺伝子によって過剰に転写された産物が、TNFα、インターロイキン及びMIFからなる群より選択される少なくとも１種である、項１５に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１８．前記標的遺伝子によって過剰に転写された産物が、細胞内活性のオン・オフを左右する因子である、項１５に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項１９．前記標的遺伝子によって過剰に転写された産物が、細胞表面受容体であり、且つ該細胞表面受容体により病体が発症または悪化に作用する因子である、項１５記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項２０．前記標的遺伝子が、変異した部位を有することによって、その転写産物が正常な細胞の機能を喪失させるか、または細胞毒性を有する物質となって蓄積して、炎症や細胞死などの病態の発症・悪化を誘導する因子である、項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
項２１．項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体の製造方法であって、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAであり、
前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しているポリヌクレオチド結合２本鎖RNA １モルに対して、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖を１〜６モルの割合で混合することにより、前記１本鎖ポリデオキシアデニンと前記多糖を複合化させる工程を含む、
ことを特徴とする、多糖/2本鎖RNA複合体の製造方法。
項２２．β−１，３−グルカン骨格を有する多糖/2本鎖RNA複合体の、iv vitro又はex vivoにおける標的遺伝子の発現を抑制するための使用であって、
前記多糖/2本鎖RNA複合体は、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAを含み、前記２本鎖RNAには、前記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、前記多糖と、前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化しているものである、使用。
項２３．細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
β−１，３−グルカン骨格を有する多糖/2本鎖RNA複合体を細胞内に導入する工程を含み、
前記多糖/2本鎖RNA複合体は、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAを含み、前記２本鎖RNAには、前記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、前記多糖と、前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化しているものである、標的遺伝子発現抑制方法。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、２本鎖RNAによるRNA干渉効果を保持したまま、優れた細胞導入性及び分解酵素耐性を備えているので、RNA干渉効果を奏する従来の２本鎖RNA分子に比して、その実用的価値が高められている。それ故、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、例えば、ガンやエイズ等の疾病の治療に有効な遺伝子医薬として応用できる。
また、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、その多糖部分に、細胞膜透過性分子や分解酵素耐性を付与できる分子等の種々の機能性分子を結合させることもできるので、当該機能性分子に基づく有用効果をも備えさせることができ、多様な分子設計が可能であり臨床上の有用性も高い。
更に、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体を構成する2本鎖RNAが、27個のリボヌクレオチドからなるセンス鎖RNAと、該センス鎖RNAと完全相補的な27個のリボヌクレオチドからなるアンチセンス鎖RNAから構成されている場合は、前述する本発明の効果が一層有効に奏される。限定的な解釈を望むものではないが、その理由は次のように考えられる。上記構造の2本鎖RNAを有する多糖/2本鎖RNA複合体は、細胞内に導入された後に、Dicerの働きにより27塩基長の2本鎖RNAは21塩基長で3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つsiRNAに効率的に変換されるので、27塩基長の末端にポリデオキシアデニンを介して結合した多糖は離脱する。即ち、多糖は2本鎖RNAの細胞導入性やヌクレアーゼ耐性等の向上に関し重要な役割を担うが、RNA干渉反応には悪影響を及ぼさない。一般に、修飾されたRNA干渉分子は、RNA干渉効果が減弱するという報告があるが、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、上記したようにDicerの働きにより多糖は離脱するため、RNA干渉効果は妨げられない。それ故、上記構造の2本鎖RNAを有する多糖/2本鎖RNA複合体は、細胞導入性やヌクレアーゼ耐性等を向上させつつ、本来備わっているRNA干渉効果を有効に発現させることができる。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、RNA干渉効果を担う部分として、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAがハイブリダイズしており、前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAを含む。ここで、標的配列に相補的な塩基配列を有するセンス鎖RNAは、当該標的配列に対して100％マッチする相補的な配列を意味する。
ここで、標的遺伝子とは、RNA干渉効果によって遺伝子発現の抑制対象となる遺伝子である。本発明の多糖/2本鎖RNA複合体において、標的対象遺伝子については、特に制限されず、該多糖/2本鎖RNA複合体の用途に基づいて適宜選択することができる。
本発明においては、標的遺伝子が多糖と結合し得る受容体を細胞表面に発現している細胞内に存在していることが望ましく、このような細胞としては、例えばβ-グルカンの受容体であるDectin-1を発現している細胞であることが好ましい。β−１，３−グルカン骨格を有する多糖は、細胞表面のDctin-1と結合することによって誘導されるシグナルを通じ、細部内に送達される。
本発明における標的遺伝子としては、特に制限されるものではないが、医薬用途への使用という観点からは、病態に関与しており、その発現抑制が望まれている遺伝子が好適である。当該標的遺伝子の具体例としては、(a)外部からの刺激などを通じてその転写産物を過剰に産生することによって病態の発症または症状の悪化に関与する因子をコードする遺伝子、(b)標的遺伝子が変異した部位を有し、その転写産物が直接疾患の発症に関与する因子をコードする遺伝子が挙げられる。
上記標的遺伝子としては、TNFα、インターロイキン、MIF等のサイトカイン等の炎症を誘導する因子をコードする遺伝子が挙げられる。
また、(a)の標的遺伝子が、細胞内活性のオン・オフを左右する因子をコードする遺伝子である場合が包含される。このような遺伝子としては、プロテインキナーゼ（例えば、Raf、MEK、Jak2等）、転写因子（例えばStat5等）等が挙げられる。
さらに、(a)の標的遺伝子としては、標的遺伝子が、細胞表面受容体をコードするものであり、且つ該細胞表面受容体により病体が発症または悪化に作用する因子をコードするものである場合も包含される。このような遺伝子としては、TNFR（腫瘍壊死因子受容体）、PDGFR（血小板由来成長因子受容体）、インターロイキン受容体等をコードする遺伝子が挙げられる。
(b)の標的遺伝子としては、当該標的遺伝子が変異した部位を有することによって、その転写産物が正常な細胞の機能を喪失させるか、または細胞毒性を有する物質となって蓄積して、炎症や細胞死などの病態の発症・悪化を誘導する因子をコードする遺伝子を指す。このような遺伝子としては、Jak2 変異V617F、ATN1 変異 CAG リピート、TTR変異V30M, KT14変異 R125C 等が挙げられる。
標的遺伝子中の標的配列については、RNA干渉効果によって遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知の方法で、具体的には、NCBIのBLASTサーチ等を用いて適宜決定することができる。例えば、標的遺伝子のコード領域(ORF)の開始コドンから５０〜１００塩基下流のエキソン部分にある塩基"AA"に続く１９〜３０塩基からなる領域であって、GC含有量が50%前後の領域を標的配列とすればよい。このような標的配列に対する相補鎖を採用することで、優れたRNA干渉効果を獲得することが、当業界で経験的に明らかにされている。また、例えば、上記標的配列は、IDT社（Integrated DNA Technologies, INC）のマニュアル（Dicer Substrate RNAi Design）に従って設定することが出来る。また最近では、（i）アンチセンス鎖RNAの5’末端がA/Uペアであり、（ii）センス鎖RNAの5’末端がG/Cペアであり、（iii）アンチセンス鎖RNAの5’末端側に5つ程度のA/Uペアがあり、且つ（vi）2本鎖中に9つ以上のG/Cペアが無い2本鎖RNAを設計することで高いRNA干渉効果をもつ2本鎖RNAをデザインできると報告されている（Ui-Tei et. al, NucleicAcids Res., 32, 936-948 (2004)）。
前記センス鎖RNAを構成するリボヌクレオチドの数としては、RNA干渉効果を発現可能である限り特に制限されないが、例えば、１５〜５０個、１９〜３０個、好ましくは２１〜２７個、更に好ましくは２１個又は２７個が挙げられる。
また、前記アンチセンス鎖RNAは、前記センス鎖RNAとハイブリダイズして二本鎖を形成可能なRNAである。即ち、当該アンチセンス鎖RNAは、前記センス鎖RNAに対して相補的なヌクレオチド配列を含むRNAである。当該アンチセンス鎖RNAは、必ずしも、前記センス鎖RNAの全長に対する相補的な配列を有していなくてもよいが、前記センス鎖RNA中の１５塩基長以上、好ましくは１９塩基長以上の領域に対する相補的な配列を有していることが好ましい。
前記アンチセンス鎖を構成するリボヌクレオチドの数についても特に制限されるものではないが、例えば、１５〜５０個、１９〜３０個、好ましくは２１〜２７個、更に好ましくは２１個又は２７個が挙げられる。なお、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖は、リボヌクレオチド数が相互に異なっていてもよいが、それぞれのリボヌクレオチド数が同数であることが好ましい。
また、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖は、ハイブリダイズした２本鎖の状態で、センス鎖RNAの5'末端側（即ちアンチセンス鎖の3'末端側）と3'末端側（即ちアンチセンス鎖の5'末端側）の何れか一方又は双方の末端において、ダングリングエンド（オーバーハング）を有していても良い。また、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖が、相互に同数のリボヌクレオチドから構成されている場合には、ハイブリダイズした２本鎖の状態で、センス鎖RNAの5'末端側（即ちアンチセンス鎖の3'末端側）と3'末端側（即ちアンチセンス鎖の5'末端側）の双方が平滑末端（ブランドエンド）、即ち、前記センス鎖RNAと前記アンチセンス鎖が完全相補的にハイブリダイズした構造であってもよい。ここで、ダングリングエンドとは、センス鎖RNAとアンチセンス鎖がハイブリダイズした2本鎖の状態において、センス鎖RNA又はアンチセンス鎖の末端部分が、対合するヌクレオチドが存在しないために、1本鎖の状態で存在している末端構造である。また、平滑末端とは、センス鎖RNAとアンチセンス鎖がハイブリダイズした2本鎖の状態において、センス鎖RNAの末端部分とそれに対合するアンチセンス鎖の末端部分が完全に対合しており、ダングリングエンドを有していない末端構造である。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体を構成する2本鎖RNAの好適な態様として、前記センス鎖RNAが２７個のリボヌクレオチドで構成されており、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと完全相補的な２７個のリボヌクレオチドで構成されているものが挙げられる。即ち、2本鎖RNAがこのような構造を有するときには、5’及び3’両末端は平滑末端となる。
また、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体を構成する2本鎖RNAの他の具体例として、前記センス鎖RNA及び前記アンチセンス鎖RNAが共に２１個のリボヌクレオチドから構成されており、且つ前記センス鎖RNAの５’末端及び前記アンチセンス鎖RNAの５’末端に２個のリボヌクレオチドからなるダングリングエンドが形成されているものが挙げられる。即ち、このような２本鎖RNAの場合には、前記アンチセンス鎖RNAの３’末端側から１〜１９個目のリボヌクレオチド配列は、前記センス鎖RNAの５’末端側から３〜２１番目のリボヌクレオチドに相補的な配列である。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体を構成する２本鎖RNAには、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の４つの末端の内のいずれか少なくとも１つに、１本鎖ポリデオキシアデニンが直接又はリンカーを介して結合している。即ち、前記センス鎖RNAの５’末端、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の５’末端、及び前記アンチセンス鎖の３’末端の中の少なくとも１つの末端に、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合している。当該１本鎖ポリデオキシアデニンの結合本数については、特に限定されないが、RNA干渉効果を効率的に奏させるという観点から、好ましくは１〜３、更に好ましくは１又は２、特に好ましくは１である。
本発明において、前記２本鎖RNAに対する前記１本鎖ポリデオキシアデニンの結合本数が１であり、且つ前記１本鎖ポリデオキシアデニンが前記センス鎖の５’末端に結合しているものが好適である。このように、前記センス鎖の５’末端に対してのみ前記１本鎖ポリデオキシアデニンが結合している場合には、２本鎖RNAに基づく、RNA干渉効果を顕著ならしめることができる。更に、前記センス鎖の５’末端に対してのみ前記１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、且つ前記２本鎖RNAの前記センス鎖と前記アンチセンス鎖の構成ヌクレオチド数がそれぞれ27個の場合には、RNA干渉効果をより一層増強して発現させることも可能になる。
また、センス鎖RNA及びアンチセンス鎖RNAが21個のリボヌクレオチドで構成されている場合には、センス鎖/アンチセンス鎖、5’末端/3’末端のいずれに１本鎖ポリデオキシアデニンが結合していてもよく、優れたRNA干渉効果を発揮することができる。
前記１本鎖ポリデオキシアデニンを構成するデオキシアデニンの数としては、後述するβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖との複合体形成が可能であることを限度として、特に限定されるものではないが、例えば、10〜100個、好ましくは20〜100個、より好ましくは20〜80個、更に好ましくは40〜60個が挙げられる。
1本鎖ポリデオキシアデニンはβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖と良好な複合体を形成し、このようにして得られる多糖/2本鎖RNA複合体は高い分解酵素耐性を有する。
前記１本鎖ポリデオキシアデニンは、前記２本鎖RNAのセンス鎖RNA及び／又はアンチセンス鎖RNAの末端リボヌクレオチドに直接結合していてもよいが、リンカーを介して結合していてもよい。好ましくは、後者、即ちリンカーを介して結合しているものである。
RNA鎖の５’末端に１本鎖ポリデオキシアデニンを直接結合させるには、具体的には、RNA鎖の５’末端のリボヌクレオチドの５’の炭素原子と、１本鎖ポリデオキシアデニンの３’末端の３’の炭素原子とエステル結合したリン酸残基とをエステル結合させればよい。また、RNA鎖の３’末端に、１本鎖ポリデオキシアデニンを直接結合させるにはRNA鎖の３’末端のリボヌクレオチドの３’の炭素原子とエステル結合したリン酸残基と、１本鎖ポリデオキシアデニンの５’末端の５’の炭素原子とをエステル結合させればよい。
また、前記１本鎖ポリデオキシアデニンと前記２本鎖RNAのセンス鎖RNA及び／又はアンチセンス鎖RNAとをリンカーを介して結合させる場合、当該リンカーとして、例えば、二官能性リンカーが挙げられる。
ここで、二官能性リンカーとしては、官能基を２つ含むリンカーであれば特に制限されないが、例えば、N-スクシニミジル＝3-(2-ピリジルジチオ)プロピナート、N-4-マレイミド酪酸、S-(2-ピリジルジチオ)システアミン、ヨードアセトキシスクシンイミド、N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N-[5-(3’-マレイミドプロピルアミド)−１−カルボキシペンチル]イミノジアセティクアシッド、N-スクシニミジル3-マレイミドプロピオン酸等を使用できる。
前記のものの他に、前記二官能性リンカーとして、下記の構造のものを使用することもできる。
Figure 2009078470
ここで、前記一般式(L-4)〜（L-21）において、ｎ１は、１〜40の整数、好ましくは2〜20の整数、更に好ましくは2〜12の整数を示す。
また、前記一般式（L-22）〜(L-24)において、ｎ２は、１〜20の整数、好ましくは１〜10の整数、更に好ましくは1〜6の整数を示す。
また、前記一般式（L-25）において、ｎ３及びｎ４は、同一又は異なって、１〜20の整数、好ましくは１〜10の整数、更に好ましくは1〜6の整数を示す。
前記一般式(L-4)〜（L-25）に示すリンカーは、その右側又は左側のいずれに１本鎖ポリデオキシアデニンが結合していてもよい。好ましくは、左側に１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、右側に前記２本鎖RNAのセンス鎖RNA及び／又はアンチセンス鎖RNAの末端が結合するように構成されているものである。
また、前記２本鎖RNAのセンス鎖RNA及び／又はアンチセンス鎖RNAの末端リボヌクレオチドにおけるリンカーの結合部位については、特に限定されるものではない。例えば、当該リンカーは、前記センス鎖RNA及び／又はアンチセンス鎖RNAの末端リボヌクレオチドのリン酸残基を構成する水素原子と置換されて結合していてもよく、また当該末端リボヌクレオチドの水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していてもよい。更に、前記１本鎖ポリデオキシアデニンの末端デオキシリボヌクレオチドにおけるリンカーの結合部位についても、特に限定されない。例えば、当該リンカーは、前記１本鎖ポリデオキシアデニンの末端デオキシリボヌクレオチドのリン酸残基を構成する水素原子と置換されて結合していてもよく、また当該末端デオキシリボヌクレオチドの水酸基を構成する水素原子と置換されて結合していてもよい。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体には、RNA干渉効果以外の所望の機能を担う部分として、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖を含む。
β−１，３−グルカンとは、グルコースがβ１→３グルコシド結合により結合された多糖であり、主鎖のグルコース残基数に対する側鎖のグルコース残基数の割合（以下、側鎖率と略記する）の異なる各種のものが知られている。本発明に使用される多糖類については、β−１，３−グルカン骨格を有する限り特に制限されないが、前記１本鎖ポリデオキシアデニンとの複合化を容易ならしめ、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体の細胞内導入率をより一層向上させるという観点から、側鎖率の比較的高いβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖が好適に使用される。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体に使用される多糖として、具体的には、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、スクレログルカン等が例示される。これらの中でも、シゾフィランは、細胞内導入性及び酵素分解耐性の向上を一層顕著ならしめることができるので、本発明において好適な多糖である。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体に使用される多糖の分子量については、特に制限されず、使用する多糖の種類、前記１本鎖ポリデオキシアデニンの鎖長等に応じて適宜設定すればよい。具体的には、該多糖の分子量として、通常25,000〜2500,000、好ましくは25,000〜150,000が例示される。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、前記2本鎖RNAに連結している１本鎖ポリデオキシアデニンと前記多糖が複合化することによって形成されている。前記１本鎖ポリデオキシアデニンと前記多糖との複合化構造については、特に制限されないが、通常、前記１本鎖ポリデオキシアデニンに対して２つの前記多糖を複合化させた3重鎖螺旋構造が好適である。このような3重鎖螺旋構造の形成は、具体的には以下の方法に従って実施できる。β−１，３−グルカン骨格を有する多糖は、天然若しくは水中では、3重螺旋構造をとっている。この多糖を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）等の極性溶媒に溶解して１本鎖にした後、１本鎖ポリデオキシアデニンが連結した2本鎖RNAを加え、溶媒を水に戻すこと（再生過程）によって、2本鎖RNAに連結したポリヌクレオチド１本鎖部分と２つの多糖からなる、3重螺旋型に複合化された構造（会合構造）が形成される。このようなポリヌクレオチドと多糖の複合化は、主に、水素結合と疎水性相互作用を介して形成されると考えられる。
また、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体に含まれる前記多糖は、機能性分子が結合していてもよい。このように機能性分子が結合した多糖を使用することによって、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体に、該機能性分子に基づく有用機能を備えさせることが可能になる。このような機能性分子としては、具体的には、ペプチド、タンパク質、糖、アミノ酸、DNA、RNA、低分子有機・無機材料、コレステロール、デンドリマー、脂質、高分子材料等が例示される。
前記ペプチドとしては、例えば、３〜４０個、好ましくは６〜３０個、更に好ましくは８〜２５個のアミノ酸から構成されるペプチドが挙げられる。具体的には、細胞膜透過ペプチド（オクタアルギニン（R8）、ペネトラチン等）、核局在化シグナルペプチド配列(HIV-1 Tat、SV40 T抗原等)、核外移行性シグナルペプチド(HIV-1 Rev、MAPKK等)、細胞膜融合ペプチド（gp41、バイアルフュージョンペプチド等）が挙げられる。中でも、本発明において、R8は好適に使用される。R8は細胞内への導入を促進する作用があり、R8が結合した多糖を使用すれば、多糖/2本鎖RNA複合体を細胞内に一層効率的に導入できるという利点が得られる。
前記タンパク質としては、生体内に存在するタンパク質、薬理作用を有するタンパク質、分子認識作用を有するタンパク質等を使用でき、該タンパク質の一例として、エクスポーチン/インポーチン・タンパク質、フェブロネクチン、アビジン、抗体等を挙げることができる。
前記糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、ガラクトサミン等の単糖、これらを任意に組み合わせたオリゴ糖又は多糖等が挙げられる。
前記低分子有機・無機材料としては、例えば、スペルミン、スペルミジン等のカチオン性分子；FITC、Alexa、Cy3、Cy5等の蛍光物質；ビオチン；量子ドット；金微粒子等が挙げられる。
前記デンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
前記脂質としては、例えば、リノール酸、DOPE（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine）等が挙げられる。
前記高分子材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
前記機能性分子の中でも、好ましくはペプチド、カチオン性分子、ポリエチレングリコールであり、更に好ましくはペプチドである。また、前記機能性分子の中でも、細胞膜透過性を有する分子（細胞膜透過性分子）、及び2本鎖RNAに対して分解酵素耐性を付与できる分子が好適である。上記機能性分子の内、細胞膜透過性分子としてはペプチド等が挙げられ、2本鎖RNAに対して分解酵素耐性を付与できる分子としてはポリエチレングリコールが挙げられる。
前記多糖に機能性分子を結合させるには、前記多糖の側鎖に前記機能性分子を直接又はリンカーを介して連結すればよい。多糖の側鎖に、機能性分子を結合させる方法としては、種々の反応が考えられるが、主鎖のグルコシド結合に影響を与えることなしに、側鎖に選択的に導入する方法を選択することが望ましい。このような方法として、例えば以下の方法が例示される。即ち、先ず、シゾフィラン等の主鎖から分枝された１，６−グルコピラノシド結合を持つグルコース残基を、過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤を用いて酸化し、開環してアルデヒドをつくる。次いで、該アルデヒド基を、アミノ基を持つ機能性分子、又はアミノ基を有するリンカーに連結された機能性分子のアミノ基を用いて、水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤の存在下で還元アミノ化する。これによって、機能性分子が結合した多糖が合成できる。
また、他の方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。先ず、シゾフィラン等の主鎖から分枝された１，６−グルコピラノシド結合を持つグルコース残基を、過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤を用いて酸化し、開環してアルデヒドをつくる。次いで、亜塩素酸ナトリウムで該アルデヒド基をカルボン酸に酸化した後に、アジ化ジフェニルホスホリルを用いて、アミノ基を持つ機能性分子、又はアミノ基を有するリンカーに連結された機能性分子とカルボン酸の縮合反応を行う方法でも、同様に目的物を得ることができる。
多糖に機能性分子を結合させる場合、機能性分子の結合割合としては、例えば、多糖の側鎖100個当たり、機能性分子が１〜200個、好ましくは1〜100個、特に好ましくは１〜50個が例示される。このような機能性分子の結合割合は、上記方法において、分枝グルコース残基に対する過ヨウ素酸ナトリウム等の酸化剤の添加量を制御することにより調整できる。
前記多糖に機能性分子を結合させる場合、前記多糖の側鎖に前記機能性分子をリンカーを介して連結することが望ましい。このようなリンカーとしては、前述する二官能性リンカーが好適に使用される。
また、前記多糖において、前記機能性分子又はそれを連結させるリンカーの結合部位については、特に限定されるものではないが、前記機能性分子又はそれを連結させるリンカーが、前記多糖のβ−１，３−グルカンの主鎖から分枝された１，６−グルコピラノシド結合を持つグルコースの１，２−ジオール部位と置換されて結合していることが好ましい。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、公知の方法に従って調製することができる。具体的には、以下の(1)〜(3)の工程で製造する方法が例示される：(1)前記１本鎖ポリデオキシアデニンが直接又はリンカーを介して結合したポリヌクレオチド結合２本鎖RNAを公知の方法に従って調製する、(2)また、別途、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖を用意する、或いは機能性分子が直接又はリンカーを介して結合しているβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖（修飾型多糖）を調製する、(3)次いで、DNA結合２本鎖RNAに結合した１本鎖ポリデオキシアデニンと前記多糖又は前記修飾型多糖とを用いて複合体を形成させる。
前記方法の(3)の工程において、前記ポリヌクレオチド結合２本鎖RNAと、前記多糖又は前記修飾型多糖とを1：1〜1：5、好ましくは1：1.3〜1：2のモル比で混合し、前記ポリヌクレオチド結合２本鎖RNAの１本鎖ポリデオキシアデニン領域と前記多糖又は前記修飾型多糖を複合化させることが好ましい。このようなモル比で、前記ポリヌクレオチド結合２本鎖RNAと、前記多糖又は前記修飾型多糖とを複合体形成条件下に晒すことにより、両者を効率的に相互作用させることが可能になり、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体の製造効率を向上させることができる。
本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、細胞内に導入されることにより、細胞内での標的遺伝子の発現を抑制することができるので、標的遺伝子の発現抑制を目的とした医薬として使用できる。本発明の多糖/2本鎖RNA複合体の細胞内への導入量や方法は、従来siRNAの場合と同様である。なお、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体は、単独でも優れた細胞内移行能を示すので、siRNAの細胞内への導入に使用されている従来の遺伝子導入試薬を用いずに、或いは従来の遺伝子導入試薬の使用量を低減して、細胞内に導入することも可能である。なお、本発明の多糖/2本鎖RNA複合体の標的遺伝子の発現抑制は、in vivoで行ってもよく、またin vitro又はex vivoで行うこともできる。
また、本発明は、細胞内で標的遺伝子の発現を抑制するための、上記多糖/2本鎖RNA複合体の使用をも提供する。更に、本発明は、上記多糖/2本鎖RNA複合体を利用した標的遺伝子の発現抑制方法をも提供する。これらの使用及び方法において、多糖/2本鎖RNA複合体、その使用方法等については上述の通りである。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下、シゾフィラン及び機能性分子が連結されたシゾフィランを、それぞれ「SPG」及び「修飾SPG」と表記することがある。また、ポリデオキシアデニンを「ポリ（dA）」又は「poly(dA)」と表記することもある。また、ポリエチレングリコールを「PEG」と表記することもある。
実施例１
１．修飾型SPGの合成
３重螺旋構造のSPGを文献（Ａ．Ｃ．Ｓ．３８（１），２５３（１９９７）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９，１２１−１３５（１９８１））記載の定法に従って製造した。即ち、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ．Ｆｒｉｅｓ（ＡＴＣＣ ４４２００）を最少培地を用いて７日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量４５万の３重螺旋構造のSPGを得た。以下、斯くして得られたSPGを「SPG1」と表記することもある。
次いで、調製された分子量45万のSPG1 100mgを蒸留水80mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム26.4mg（側鎖グルコースに対して0.8当量）を少量の蒸留水に溶解させ、4℃にて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液を透析膜（排除限界：14,000）で透析後、凍結乾燥させ、白色固体（アルデヒド基が導入されたSPG）を得た。斯くして得られた化合物を用いて、ペプチド、スペルミン、又はPEGの連結を行った。
ペプチドの連結
上記で得られた白色固体をジメチルスルホキシド35mlに溶解させ、2-アミノエタノール（大過剰）を加え、2日間室温で攪拌した後、300mgの水素化ホウ素ナトリウム（大過剰）を添加した。反応溶液を透析膜（排除限界：14,000）で透析した後、凍結乾燥させ白色固体を得た。斯くして得られた、アミノ基が導入されたSPGに、以下の方法に従って、ペプチドを連結させた。
ペプチドとしてR8（アミノ酸配列：CRRRRRRRR（配列番号１））、tat（アミノ酸配列：CGGSGRKKRRQRRRPPQ（配列番号２））、及びRGD（アミノ酸配列：CRGD）を用いて、これをアミノ基が導入されたSPGに連結した。具体的には、上記ペプチドのチオール基部位とSPGに導入されたアミノ基部位とを、リンカーとしてN-Succinimidyl 3-Maleimidopropionate (SMP)を用いて連結した。参考文献：Takahisa Anada et al., Journal of Controlled Release, Volume 108, Issues 2-3, 28 November 2005, Pages 529-539；Matsumoto Takahiro, et al., Biochim Biophys Acta,1670(2),(2004),91-104。
以下、斯くして得られたR8ペプチド修飾SPG、tatペプチド修飾SPG、及びRGDペプチド修飾SPGを、それぞれ「SPG2」、「SPG3」及び「SPG4」と表記する。
スペルミンの連結
上記で得られた白色固体とスペルミン（シグマ社；構造式NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2）を用いて還元的アミノ化反応を行うことにより、SPGに導入されたアルデヒド基部位とスペルミンのアミノ基部位とを連結した。スペルミンのアミノ基部位と、SPGに導入されたアルデヒド基部位とを還元的アミノ化反応を用いて連結した。参考文献：Matsumoto Takahiro et al., Biochim Biophys Acta,1670(2),(2004),91-104；NAGASAKI Takeshi et al.,Bioconjugate chemistry 2004, vol. 15, pp. 249-259。
以下、斯くして得られたスペルミン修飾SPGを、「SPG5」と表記する。
PEGの連結
上記で得られた白色固体と、アミノ基を導入したPEG（Methoxypolyethlene glycol amine（平均分子量 5000）, シグマ社, 構造式；H2NCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3）を用いて還元的アミノ化反応を行うことにより、SPGに導入されたアルデヒド基部位とPEGのアミノ基部位とを連結した。参考文献：Ryouji Karinaga, Biomaterials. 2005 Aug ;26 (23):4866-73.
以下、斯くして得られたPEG修飾SPGを、「SPG6」と表記する。
２．センス鎖の5’末端にポリｄAを有する2本鎖RNAの合成
27塩基長のRNA鎖の5’末端に40塩基長のDNA鎖(ポリアデニン;polyA40)をもつ67塩基長のDNA-RNAキメラポリヌクレオチドを合成し、これをセンス鎖とした。上記67塩基長からなるDNA−RNAキメラポリヌクレオチド中のRNA領域に対し完全相補的な配列をもつ27塩基長のアンチセンスRNAを合成し、2つをアニーリングさせることにより、40塩基長の１本鎖ポリデオキシアデニン領域をもつ2本鎖オリゴヌクレオチド（DNA結合２本鎖RNA）を形成させた。
また、別途、上記DNA-RNAキメラポリヌクレオチド中のDNA領域とRNA領域との間に下記構造式に示すリンカーXを挿入したDNA-RNAキメラポリヌクレオチド（リンカー有り）を合成した。
Figure 2009078470
このDNA-RNAキメラポリヌクレオチド（リンカー有り）と、該キメラポリヌクレオチドのRNA領域に対し完全相補的な配列をもつ27塩基長のアンチセンスRNAとをアニーリングさせ、40塩基長の１本鎖ポリデオキシアデニン領域をもち、DNAと2本鎖RNAがリンカーで結合したDNA-RNAキメラ2本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。
また、コントロールとしてDNA領域を持たない27塩基長からなる2本鎖RNAも合成した。また、一般に広く使用されている21塩基長からなるsiRNAもコントロールとして使用した。ここで使用しポリヌクレオチドはRenilla luciferase遺伝子と相同配列をもつアンチセンスRNAを含むものであり、細胞中においてRNA干渉反応を行うようデザインした2本鎖ポリヌクレオチドである。
また、上記合成において、1本鎖RNAは、UVスペクトル検出器を用い、260nmの吸光度を測定することにより濃度を算出した。また2本鎖RNAのアニーリングは、universal buffer（林化成株式会社）中、同モルのセンス鎖およびアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドを混合し、92℃で２分間加熱した後、4℃まで徐々に温度を下げることより行った。
使用したRNA及びDNA−RNAキメラオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
センス鎖：
21s: 5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’（配列番号３）
27s: 5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC -3’ （配列番号４）
pA40-27R1: 5’- (a)40 - CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC -3’ （配列番号５）
pA40-27R2:5’- (a)40 -X- CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC -3’ （配列番号６）
アンチセンス鎖：
21as：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG−5’ （配列番号７）
27as：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5’ （配列番号８）
上記センス鎖の配列において、「(a)40」は、40塩基長ポリアデニンを意味する。また、センス鎖pA40-27R2においてXは前記リンカーXを示す。
３．各種SPG/2本鎖RNA複合体の形成
未修飾及び修飾SPGを、ポリｄAを有する2本鎖RNAと複合体を形成させるために、ポリｄAを有する2本鎖RNA溶液（2本鎖RNAの濃度10μM、Buffer: universal buffer（林化成株式会社）中に1％DMSOを含むもの）に各種SPGを混合し、4℃で3日間インキュベートした。各種SPGはDMSO(ジメチルスルフォシキド)に溶解させた状態のものを使用し、ポリｄAを有する2本鎖RNA 1モル当たり各種SPGが2モルとなる割合で混合した。なお、2本鎖RNA溶液中でのDMSOの最終濃度は1容量％になるよう設定した。1容量％DMSO水溶液が細胞及びRNA干渉効果へ影響を及ぼさないことは前実験で確認している。
作製した各種SPG/2本鎖RNA複合体の構造を図１に示す。これらのSPG/2本鎖RNA複合体が合成されていることについては、20％ポリアクリルアミドゲルを用いて確認した。具体的には、10μl（2μM）のハイブリッド溶液を20％ ポリアクリルアミドゲルにアプライし、250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation)でゲル解析を行った。結果を図２に示す。その結果、ポリｄAを有する2本鎖RNAは27塩基長の2本鎖RNAよりも移動距離が小さい位置にバンドが確認され、目的のポリｄAを有する2本鎖RNAが形成されていることを確認した。また、各種SPG/2本鎖RNA複合体はポリアクリルアミドのウェル上に残っており、SPGとポリｄAを有する2本鎖RNAが複合体を形成していることが確認された。
また、SPG/2本鎖RNA複合体についてCDスペクトル解析を行った結果を図３に示す。図３中の左図では、DNA-RNAキメラ2本鎖オリゴヌクレオチドのCDスペクトルが示されている。その2本鎖にSPGを添加したSPG/2本鎖RNA複合体では、二本鎖のスペクトルが大きく変動していることから、2本鎖がSPGと複合体を形成していると判断される(5℃で実施)。図３中の右図は、形成された複合体の解離温度をCDスペクトルで調べた結果である。温度変化による281.6 nmのCD値の変動を調べることで、二本鎖の熱力学的挙動がわかる。二本鎖の場合、70℃付近でCD強度が減少していることから、約70℃において二本鎖が解離していることがわかる。一方、SPG/2本鎖RNA複合体では、その二本鎖の解離部分の他に、47℃付近で急激なCD強度の減少がみられる。これは、二本鎖が複合体から解離するために生じているものであり、この結果から複合体の解離温度は約47℃であるといえる。
４．各種SPG/2本鎖RNA複合体のDicerによるプロセシング
27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体について、Dicerによるプロセシングを検討した。Dicerによる切断実験は、20mM Tris-HCl(pH 8.0), 15 mM NaCl, 2.5mM Mg2Cl溶液中、0.5 UのリコンビナントDicer（Gene Therapy Systems社製）と最終濃度2μMになるよう調整した27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体をサンプルチューブに10μl準備し、37℃に設定したインキュベーター中、12時間インキュベートした。その後、Dicerによる切断反応を停止させる為に、2μlのDicer Stop Solution (Gene Therapy Systems社製)を反応溶液に加え、更に2μlのローデングダイを加えた。得られた産物を20％ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス社製）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation製)でゲル解析を行った。また、コントロールとしてDicer処理していない21塩基長の2本鎖RNAからなるsiRNA(21 siRNA)を用いた。
図４に結果を示す。その結果、27塩基長の2本鎖RNAである27s/27as、及び、センス鎖の５’末端に40塩基長の１本鎖ポリデオキシアデニン領域を持つpA40-27R1/27asは、リコンビナントDicer存在下において21塩基長のsiRNAと同様の位置にバンドが確認され、Dicerの切断によって2塩基のダングリングエンドを含む21塩基長のsiRNAが生成していることが強く示唆された。また、SPG（１〜6）とpA40-27R1/27asで複合体を形成させたものにおいても、リコンビナントDicerによりプロセシングを受け2塩基のダングリングエンドを含む21塩基長のsiRNAが生成していることが強く示唆された。
この結果より、長鎖の１本鎖ポリデオキシアデニンやSPGが存在する状態においても27塩基長からなる2本鎖RNA（SPG/2本鎖RNA複合体）は、リコンビナントDicerにより21塩基長のsiRNAへプロセシングされるという知見が得られた。
５．各種SPG/2本鎖RNA複合体の分解酵素耐性
(5-1)SPG/2本鎖RNA(27塩基長)複合体の分解酵素耐性について
27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体（以下、試験サンプルと表記することもある）のヌクレアーゼ耐性を検討した。実験は、最終濃度が2 μMになるよう調整した試験サンプルを10％FBS（三光純薬株式会社）を含むRPMI-1640培地（インビトロジェン社製）中(最終量110μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h後にそれぞれ10μl取り、2μlのローデングダイを含むサンプルチューブに添加した。分解反応を停止させる為、サンプル採取後すぐ液体窒素中にて凍結し、−20℃にて保存した。得られた産物を20％ ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで70分間サンプルを電気泳動した。その後、銀染色キット（GEヘルスケア バイオサイエンス社製）で産物を染色し（染色条件は製品マニュアル参照）、ChemiImager 4000(Alpha Innotech corporation製)でゲル解析を行った。また、比較として、一般にsiRNA法で使用されている3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長のsiRNAも同様の方法で分解酵素耐性を検討した。結果を図５に示す。
その結果、2塩基のダングリングエンドを含む21塩基長の２本鎖RNA（21 siRNA）は10％FBSを含む培地中において速やかに分解されているのに対し、27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体は、非常に高い分解酵素耐性が確認された。また、27塩基長の2本鎖RNAよりも、ポリｄAを有する2本鎖RNAの方が高い分解酵素耐性を示し、更に、ポリｄAを有する2本鎖RNAよりも各種SPG/2本鎖RNA複合体の方が高い分解耐性を示した。特に、SPG/2本鎖RNA複合体は48時間後においても殆どヌクレアーゼにより分解されていないことが明らかとなった。この結果より、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体は、血清を含む培地中で極めて高い安定性を保有していることが確認された。
(5-2)SPG/2本鎖RNA(21塩基長)複合体の分解酵素耐性について
21塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、ポリｄTを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体（ｄA,dT；以下、試験サンプルと表記することもある）のヌクレアーゼ耐性を検討した。
使用したRNA及びDNA−RNAキメラオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。
センス鎖：
21 s : 5’-GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU-3’ （配列番号９）
pA40-21 : 5’- (a) 40 - GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU-3’ （配列番号１０）
pT40-21 : 5’- (t) 40 - GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU-3’ （配列番号１１）
アンチセンス鎖 :
21 as : 3’- UUUCGGGUCUAGCAGUGGUGG -5’ （配列番号１２）
上記センス鎖の配列において、「(a)40」は、40塩基長ポリdAを意味し、「(t)40」は40塩基長のｄTを意味する。
実験は、最終濃度が40 nMになるよう調整した試験サンプルを10％FBS（MP Biomedicals, inc.製）を含むRPMI-1640培地（シグマ社製）中(最終量100μl)、37℃でインキュベートし、0h、0.25h、3h、6h、12h、24h、48h後にサンプル回収し、分解反応を停止させる為、-80℃で凍結した。得られた試験サンプルをphenol抽出、クロロホルム処理、エタノール沈殿により精製し、20%ポリアクリルアミドゲルを用い250Vで60分間試験サンプルを電気泳動した。その後、SYBER Gold（インビトロジェン社製）で染色し、ルミノイメージアナライザーLAS3000（FUJIFILM社製）でゲルの解析を行った。結果を図６に示す。
1塩基のダングリングエンドを含む21塩基長の2本鎖RNA（naked siLamin 21bp）と複合体形成を行っていない2本鎖RNA（naked siLamin dA40）、ポリｄTを有するSPG/2本鎖RNA複合体（SPG complex siLamin dT40）は10% FBSを含む培地中において速やかに分解されるのに対し、ポリdAを有するSPG/2本鎖RNA複合体（SPG complex siLamin dA40）は、高い分解酵素耐性が確認された。
６．ポリdA−2本鎖RNA/SPG複合体の細胞毒性
(6-1)ポリdA−2本鎖RNA(27塩基長)/SPG複合体のHeLa細胞に対する細胞毒性
27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体（以下、試験サンプルと表記することもある）のHeLa細胞に対する細胞毒性を評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を９６wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含ない新しい培地をウェルにそれぞれ90 μl加えた。各種試験サンプルの細胞毒性は、細胞内における毒性を評価する為に、LipofectamineTM 2000(インビトロジェン社製)で2試験サンプルを積極的に細胞中へ導入させることにより評価した。試験サンプルの最終濃度が0nM, 0.2nM, 0.5nM, 1nM, 2nM, 5nM, 10nM, 20nM, 50nMになるようLipofectamineTM 2000 (インビトロジェン社製)と混合し複合化させて、その10μlを上記の90 μlの培地を含むHeLa細胞へ加え、1ウェルあたりの最終量を100 μlとした。なお、試験サンプルとLipofectamineTM 2000の複合化は、1ウェルあたり5μlの試験サンプルの水溶液と5 μlのLipofectamineTM 2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作製した。試験サンプルを導入したHeLa細胞は5％ CO2 存在下、37℃で48時間インキュベートした。その後、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ社製）中のCellTiter-Glo Reagent を各ウェルに50μl加え、約60min攪拌後、ルミノメータ（MicroLumat LB96p: BERTHOLD社製）で各ウェル中のLuminescence量を測定した。測定したLuminescence量は生細胞中のATPに依存するので、コントロール細胞のLuminescence量（RNAが0nM、LipofectamineTM 2000が0μlのとき。これを生存率100％とする。）と各種試験サンプルを導入した細胞のLuminescence量の相対値を算出することにより、各ウェル中の生存率を算出した（プロメガ社CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayマニュアル参照。）。
今回使用した試験サンプルの最大濃度である10nMのときの細胞生存率の結果を図７に示す。その結果、全てのSPG/2本鎖RNA複合体において細胞毒性は十分に許容される範囲であった。
(6-2)ポリdA−2本鎖RNA(21塩基長)/SPG複合体のRAW264.7細胞に対する細胞毒性
21塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNAの複合体（以下、試験サンプルと表記することもある）のRNA干渉効果を核膜の構成成分であるLamin A/Cをターゲットとして評価を行った。使用したRNA及びDNA−RNAキメラオリゴヌクレオチドの配列は、上記(5-2)欄に示される通りである。
実験前に5×104cells/mlに調整したRAW264.7細胞（マウス由来マクロファージ様細胞）を96wellプレート上にそれぞれ100μl播き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、新しい培地を90μl添加し、濃度調整を行ったポリdAを有する2本鎖RNA/SPG複合体溶液を10μlずつRAW264.7細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ポリdAを有する2本鎖RNA/SPG複合体は最終濃度600nM（siRNA濃度）になるように調整を行った。試験サンプルを導入した後、37℃で24時間インキュベートし、-80℃にて凍結を行い、RNeasy mini kit（QIAGEN社製）を用いてtotalRNAを抽出し、PrimerScript RT regent kit（タカラバイオ社製）を用いてcDNAを作製し、SYBR prmix Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いてReal Time PCR反応を、Smart Cycler II（Cepheid社製；タカラバイオ社販売）を用いてLaminA/CのmRNA量を測定し、LaminA/CｍRNA発現量をハウスキーピング遺伝子として一般的なGAPDHにより補正を行いLaminA/CのmRNA発現量とした。結果を図８に示す。
比較対象として、naked si RNA dA40 (LaminA/C)、SPG only、SPGとnaked si RNA dA40 (LaminA/C)を細胞へ添加する直前に混合したものでのRNA干渉効果の結果を示す。naked si RNA dA40 (LaminA/C)、SPG only、SPGとnaked si RNA dA40 (LaminA/C)を細胞へ添加する直前に混合したものでは、RNA干渉効果を示さず、ポリdAを有する2本鎖RNAのSPG複合体のみでRNA干渉効果が確認された。この結果よりSPG単体によるRAW264.7細胞へのLaminA/CのmRNA抑制効果は確認されず、さらにnaked状態のsiRNAでも同様に抑制効果は確認されなかった。
７．ポリdA−2本鎖RNA/SPG複合体のRNA干渉効果
27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNA、及び各種SPG/2本鎖RNA複合体（以下、試験サンプルと表記することもある）のRNA干渉効果をウミシイタケルシフェラーゼをターゲットとして評価した。実験前に1x105cell/mlに調整したHeLa細胞（ヒト子宮頸ガン細胞、東北大学加齢医学研究所）を９６wellプレート上にそれぞれ100μl撒き、37℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェル上の古い培地を取り除き、抗生物質を含まない新しい培地をウェルにそれぞれ80 μl加え、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼを発現するベクター(psiCHECKTM-2 Vector: プロメガ社製)とLipofectamineTM 2000 (商品名、インビトロジェン社製)の複合溶液を10μlずつHeLa細胞が入ったそれぞれのウェルに加えた。ここで発現ベクターは１ウェルあたり0.02μgになるように、またLipofectamineTM 2000は１ウェルあたり0.2μlになるよう設定し、OptiMem(インビトロジェン社製)で必要量を調整した。また、複合体を形成させる為に、発現ベクターとLipofectamineTM 2000をOptiMemを用いて混合した後、室温で30分間インキュベートした。上記複合溶液を加えた後、細胞を5％ CO2 存在下、37℃で4時間インキュベートした。その後、試験サンプルを最終濃度が0.2nM又は0.5nMになるようLipofectamineTM 2000 (インビトロジェン社製)と複合体を形成させて複合溶液を調製し、その10μlを発現ベクターを導入したHeLa細胞に加えた。ここで、1ウェルあたりの最終量は100 μlとなる。なお、試験サンプルとLipofectamineTM 2000の複合溶液は、1ウェルあたり5 μlの試験サンプル水溶液と5 μlのLipofectamineTM 2000 (0.2μl) OptiMem溶液を混合し、30分間室温でインキュベートすることにより作製した。試験サンプルを導入した後、48時間インキュベートし、Dula-GloTMLuciferase Assay System（プロメガ社製）を用いてホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼの発現量をルミノメータ（MicroLumat LB96p: BERTHOLD社製）で測定し、ホタルルシフェラーゼの発現量をコントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼの発現量(%)を算出した。
図９にRNA干渉効果の結果を示す。図９はサンプル各種SPG/2本鎖RNA複合体の添加濃度0.5nM時のRNA干渉効果を表している。また、比較として、siRNA法で使用されている3’末端に2塩基のダングリングエンドを持つ21塩基長のsiRNA、27塩基長の2本鎖RNA、ポリｄAを有する2本鎖RNAのRNA干渉効果の結果も示している。その結果、SPG/2本鎖RNA複合体は、27塩基長の2本鎖RNAに比べRNA干渉効果が減少していた。この理由として、SPG1を加えることによりオリゴヌクレオチドとリポフェクトアミンの相互作用が弱まったため細胞導入性が27nt dsRNAよりも劣り、結果として遺伝子発現抑制能が27nt dsRNAよりも弱まったと考えられる。一方、SPGを機能性分子で修飾した修飾型SPG（SPG2〜SPG6）を用いて調製した各種SPG/2本鎖RNA複合体は、27塩基長の2本鎖RNAの遺伝子発現抑制能と同程度のRNA干渉効果を示し、SPG1を用いて調製したSPG/2本鎖RNA複合体に比べ遺伝子発現抑制能が高いことが明らかとなった。これらの結果は、SPGに導入した機能性分子が細胞導入性を向上させたことが要因になっていると考えられる。
以上の結果を総合すると、各種SPG/2本鎖RNA複合体は非常に優れた分解酵素耐性を示し、且つ毒性も殆ど無いため、通常のsiRNAに比べて、持続性及び安全性が高いことが明らかとなった。更に、SPGを様々な機能性分子で修飾することにより、細胞毒性が強い遺伝子導入剤を使用しなくても、単独で細胞内へ到達できるSPG/2本鎖RNA複合体を構築することも可能であることが確認された。
参考試験例１
特許文献４（櫻井和朗等、Polym. Preprints. Jpn., 第49巻、第4054頁、2000年）に開示される技術では、RNA干渉効果を奏する２本鎖RNAに適用しても、導入効率が低いことを明らかにするために以下の試験を行った。
EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）蛋白は、238アミノ酸からなる蛍光性蛋白質である。遺伝子操作により生成されたEGFP遺伝子を、pEGFPベクターを用いて生体細胞に導入すると、細胞内に局在せず細胞全体にわたって分布し、励起光を受けることにより発色団を形成し、蛍光を発する性質を有している（図１１）。
このようなpEGFPベクターを制限酵素Sph Iで断裁し、その3’末端がハイブリダイズするようなアダプターODN（デオキシヌクレオチド）とpoly(dA)80mer を連結させ、SPGと複合化させた（図１０）。
Dectin-1を強制発現しているRAW細胞に、さまざまな長さ（例えば、800〜2500 bp）の両端複合化DNAを添加し、DNA側鎖に蛍光物質であるAlexaを化学修飾した（図１２）。Alexa が検出される細胞数を数えることで、細胞への導入率とDNAの長さの関係を調べた。結果を図１３に示す。図１３において、図１０の方法で作製されたCMV-EGFPの細胞導入率を１として示す。
図１３より、二重鎖DNAの長さが長いほど導入効率が減少することが示された。即ち、本法は長いpDNAを細胞導入させるデリバリー技術としては実用性が低いことが示された。
合成した各種SPG/RNA複合体の構造を示す図である。 各種SPG/RNA複合体の形成の有無を確認した結果を示す図である。 左図はSPG/RNA複合体の形成の有無をCDスペクトル解析を用いて確認した結果、並びに右図はSPG/RNA複合体の解離温度をCDスペクトル解析を用いて確認した結果を示す図である。 各種SPG/RNA複合体のDicerによるプロセシングを検討した結果を示す図である。 各種SPG/RNA（27塩基長）複合体のヌクレアーゼ耐性を評価した結果を示す図である。 種SPG/RNA（21塩基長）複合体のヌクレアーゼ耐性を評価した結果を示す図である。 各種SPG/RNA（27塩基長）複合体の細胞毒性を評価した結果を示す図である。 各種SPG/RNA（21塩基長）複合体の細胞毒性を評価した結果を示す図である。 各種SPG/RNA複合体のRNA干渉効果を評価した結果を示す図である。 CMV-EGFPの作製方法を示す略図である。 pEGFPベクターを用いてEGFP遺伝子を生体細胞内に導入したときの細胞の顕微鏡写真である。 参考試験例１で使用された蛍光物質Alexaが化学修飾された両端複合化DNAの作製方法を示す略図である。 参考試験例１の結果を示す図である。
配列番号１はR8の配列を表す。
配列番号２はtatの配列を表す。
配列番号３は21Sの配列を表す。
配列番号４は27sの配列を表す。
配列番号５はpA40-27R1 RNA領域の配列を表す。
配列番号６はpA40-27R2 RNA領域の配列を表す。
配列番号７は21asの配列を表す。
配列番号８は27asの配列を表す。
配列番号９は21sの配列を表す
配列番号１０はpA40-21の配列を表す。
配列番号１１はpT40-21の配列を表す。
配列番号１２は21asの配列を表す。

Claims (13)

  1. β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と２本鎖RNAの複合体であって、
    前記２本鎖RNAが、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAであり、
    前記２本鎖RNAには、前記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、
    前記多糖と、前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化している、
    ことを特徴とする、多糖/2本鎖RNA複合体。
  2. 前記センス鎖RNAが１５〜５０個のリボヌクレオチドで構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと同数のリボヌクレオチドで構成されている、請求項１記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  3. 前記センス鎖RNAが、２１個のリボヌクレオチドで構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと同数のリボヌクレオチドで構成されている、請求項１記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  4. 前記センス鎖RNAが、２７個のリボヌクレオチドで構成され、且つ前記アンチセンス鎖RNAが前記センス鎖RNAと同数のリボヌクレオチドで構成されている、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  5. 前記１本鎖ポリデオキシアデニンが、20〜100個のデオキシアデニンで構成されている、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  6. 前記１本鎖ポリデオキシアデニンが直接又はリンカーを介して前記センス鎖RNA又はアンチセンス鎖RNAの５’末端及び/又は３’末端に結合している、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  7. 前記多糖類が、シゾフィラン、カードラン、レンチナン、パーキマン、グリホラン、及びスクレログルカンよりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  8. 前記多糖類が、機能性分子が結合されてなるβ−１，３−グルカンである、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  9. 前記２本鎖RNAの標的遺伝子が、前記多糖と結合する受容体を有する細胞に内在するものである、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  10. 前記細胞が、当該細胞膜表面にDectin-1を発現している細胞である、請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体。
  11. 請求項１に記載の多糖/2本鎖RNA複合体の製造方法であって、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAであり、
    前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しているポリヌクレオチド結合２本鎖RNA１モルに対して、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖を１〜６モルの割合で混合することにより、前記１本鎖ポリデオキシアデニンと前記多糖を複合化させる工程を含む、
    ことを特徴とする、多糖/2本鎖RNA複合体の製造方法。
  12. β−１，３−グルカン骨格を有する多糖/2本鎖RNA複合体の、iv vitro又はex vivoにおける標的遺伝子の発現を抑制するための使用であって、
    前記多糖/2本鎖RNA複合体は、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAを含み、前記２本鎖RNAには、前記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、前記多糖と、前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化しているものである、使用。
  13. 細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
    β−１，３−グルカン骨格を有する多糖/2本鎖RNA複合体を細胞内に導入する工程を含み、
    前記多糖/2本鎖RNA複合体は、標的遺伝子中の標的配列に相補的な塩基配列からなるセンス鎖RNA、及び該センス鎖RNAに相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖RNAを有し、且つ前記標的遺伝子の発現を抑制できる２本鎖RNAを含み、前記２本鎖RNAには、前記センス鎖RNA及びアンチセンス鎖の少なくとも一方の末端に、直接又はリンカーを介して、１本鎖ポリデオキシアデニンが結合しており、前記多糖と、前記１本鎖ポリデオキシアデニンが複合化しているものである、標的遺伝子発現抑制方法。
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