CN101918554A - 多糖/双链rna复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种具有RNA干扰效应的新型双链RNA，所述新型双链RNA不减弱RNA干扰效应，并且细胞导入性及降解酶抗性提高。具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖与双链RNA的复合物通过满足下述(i)～(iii)，可以有效保持RNA干扰效应，同时显著地提高细胞导入性及降解酶抗性。(i)所述双链RNA具有有义链和反义链，所述有义链由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链含有与所述有义链互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制上述靶基因表达；(ii)所述双链RNA中，所述有义链及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接；(iii)所述多糖与所述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。

Description

多糖/双链RNA复合物
技术领域
本发明涉及一种多糖/双链RNA复合物，是双链RNA与具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖的复合物(complex)，所述双链RNA能够抑制靶基因表达，所述复合物基于上述双链RNA的作用能够有效地发挥RNA干扰效应，并且通过使上述多糖与功能性分子连接，还能够发挥基于上述功能性分子的作用的有用的功能。
背景技术
近年，利用21个碱基的短双链RNA(小干涉RNA：siRNA)的RNA干涉(RNA interference：RNAi)法受到关注。上述RNAi法通过将100个左右碱基对的双链RNA导入细胞内，在细胞质内通过切酶(Dicer)的作用分解为20～25个左右碱基对的双链RNA，之后与多种蛋白质复合，形成RNA/蛋白质复合物(该复合物称作RICS：RNA诱导沉默复合物)，所述复合物与由靶基因产生的mRNA的同源位点结合，从而强力地抑制基因表达。今天，利用在3’末端具有2个碱基悬端(dangling end)的21个碱基长度的化学合成的双链RNA的方法成为主流。另外，近年，J.Rossi等人报道了27个碱基对的双链RNA比21个碱基长度的siRNA产生高100倍左右的RNA干扰效应(参见非专利文献1)。推断这是由于27个碱基对的RNA被作为RNaseIII样酶的切酶切割成21个碱基长度的siRNA后，蛋白质复合物RISC识别siRNA，使得可以高效地产生siRNA效果。。
由于使用上述合成RNA进行的RNA干涉法中样品制备较容易，操作也简单，因此siRNA法不仅在生命科学领域并且在生物技术商业领域也备受关注。
但是，上述优异的RNA干涉法期望进一步改善下述问题，在细胞内的稳定性、细胞导入性、细胞内定位、基因表达抑制效果、靶向特异性等。最近为了提高合成siRNA的核酸酶耐性、获得高活性的RNA干扰效应，尝试在siRNA上进行各种化学修饰。例如为了提高对核酸外切酶消化的抗性，合成了在siRNA末端用氨基、巯基或脱碱基位点等修饰的siRNA。但是，已经有报道指出如果对具有RNA干扰效应的双链RNA的末端进行修饰，即使能够提高核酸酶抗性及细胞导入率，但RNA干扰效应显著减弱。如上所述，现状是现有技术还不能提高具有RNA干扰效应的双链RNA的核酸酶抗性及细胞导入性，实现更优异的RNA干扰效应。
另一方面，作为实际上用作肌肉内注射制剂的临床用药的多糖有β-1，3-葡聚糖。一直以来已知上述多糖具有天然的三螺旋结构(参见非专利文献2)。另外，已确认了上述多糖在体内的安全性，作为肌肉内注射剂已使用了约20年(参见非专利文献3)。进而，有报道指出β-1，3-葡聚糖具有药物传递能力，通过使上述β-1，3-葡聚糖与药物形成共价键，可以将该药物传递至靶点(参见专利文献1)。
已知β-1，3-葡聚糖具有天然的三螺旋结构。有报道指出将上述多糖溶解于极性溶剂中，形成独立存在的单链后，加入单链核酸，通过用水替代溶剂(复性过程)，可以形成由核酸单链·多糖双链组成的三螺旋复合物(参见非专利文献4)。推断上述三螺旋复合物中核酸和多糖主要通过氢键复合。
另外，近年本发明人等公开了通过形成含有β-1，3-葡聚糖和基因的复合物，可以传递基因(参见专利文献2)。并且还报道了使用含有细胞膜穿透性官能团及脂质膜破裂性官能团的β-1，3-葡聚糖的核酸导入法(参见专利文献3)。但是，上述任何一个报道均只记载了将单链核酸导入细胞内的方法，不涉及双链siRNA等。专利文献4报道了利用β-1，3-葡聚糖将具有遗传信息的双链DNA导入靶细胞的方法，但认为其导入率差，难以实用化。
因此，使β-1，3-葡聚糖单独与具有干扰效应的双链RNA复合，可能不能形成三螺旋结构，或者虽然形成三螺旋但RNA不再是双链，无法期待效果。另外，具有RNA干涉作用的双链RNA在细胞内要求的作用机制方面与具有遗传信息的DNA不同，在细胞内与RISC形成复合物并与由靶基因产生的mRNA的同源位点相结合，所以即使将专利文献4中记载的方法适用于具有RNA干扰效应的双链RNA，但预测其与DNA的情况相同即导入率低，或者引起RNA干扰效应在细胞内的显著减弱。
专利文献1：国际公开第96/014873号说明书
专利文献2：国际公开第01/34207号说明书
专利文献3：日本特开2006-69913号公报
专利文献4：日本特开2005-204612号公报
非专利文献1：J.Rossi et.al.Nature Biotech.，23，222-226(2005)
非专利文献2：Theresa M.et al.J.Am.Chem.Soc.，120，6909(1998)
非专利文献3：Hasegawa，Oncology and Chemotherapy，8，225(1992)
非专利文献4：樱井和朗等、Polym.Preprints.Jpn.，第49卷、第4054页、2000年
发明内容
因此，本发明的主要目的在于不减弱具有RNA干扰效应的双链RNA的RNA干扰效应，并且提高细胞导入性及降解酶抗性。
本发明人等为了解决上述课题反复深入研究，结果发现具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖与双链RNA的复合物通过满足下述(i)～(iii)，可以有效保持RNA干扰效应，同时显著地提高细胞导入性及降解酶抗性。
(i)所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA具有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，。
(ii)上述双链RNA中，上述有义链及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接。
(iii)上述多糖与上述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
基于上述发现，通过进一步的反复研究完成了本发明。
即，本发明提供下述多糖/双链RNA复合物及其制造方法。
项1.一种多糖/双链RNA复合物，其特征在于，为具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖与双链RNA的复合物，
所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA具有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，
上述双链RNA中，上述有义链RNA及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接，
上述多糖与上述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
项2.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，通过使两个上述多糖与上述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物，上述单链多脱氧腺嘌呤与上述多糖形成三螺旋结构。
项3.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述有义链RNA由15～50个核苷酸构成，并且上述反义链RNA由与上述有义链RNA数量相同的核苷酸构成。
项4.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述有义链RNA由21个核苷酸构成，并且上述反义链RNA由与上述有义链RNA具有数量相同的核苷酸构成。
项5.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述有义链RNA由27个核苷酸构成，并且上述反义链RNA由与上述有义链RNA数量相同的核苷酸构成。
项6.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述单链多脱氧腺嘌呤由20～100个脱氧腺嘌呤构成。
项7.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述单链多脱氧腺嘌呤直接或者通过连接体与上述有义链RNA或者反义链RNA的5’末端及/或3’末端相连接。
项8.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述多糖类为选自裂裥菌素、凝胶多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰树花多糖及小核菌葡聚糖中的至少一种。
项9.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述多糖类为连接有功能性分子的β-1，3-葡聚糖。
项10.如项9所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述功能性分子为细胞膜穿透性分子或能够赋予双链RNA降解酶抗性的分子。
项11.如项9所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述功能性分子为肽、阳离子性分子、聚乙二醇。
项12.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述双链RNA的靶基因是细胞的内源基因，所述细胞具有与上述多糖结合的受体。
项13.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述细胞为在该细胞膜表面表达Dectin-1的细胞。
项14.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其特征在于，所述多糖/双链RNA复合物通过由与上述Dectin-1结合诱导的信号被转导至细胞内部。
项15.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其特征在于，上述靶基因是与疾病的发病或者症状的恶化相关的因子，所述疾病的发病或者症状的恶化是由于因外部刺激等过量产生转录产物而引起的；或者上述靶基因是具有上述靶基因发生变异的位点、且其转录产物为与病因直接相关的因子。
项16.如项15所述的多糖/双链RNA复合物，其特征在于，由上述靶基因过量转录的产物是诱导炎症的因子。
项17.如项15所述的多糖/双链RNA复合物，其中，由上述靶基因过量转录的产物为选自TNFα、白介素及MIF中的至少一种。
项18.如项15所述的多糖/双链RNA复合物，其中，由上述靶基因过量转录的产物为控制细胞内活性的开·关因子。
项19.如项15所述的多糖/双链RNA复合物，其中，由上述靶基因过量转录的产物为细胞表面受体，并且为作用于病体发病或恶化的因子。所述病体发病或恶化是由该细胞表面受体引起的。
项20.如项1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，上述靶基因是下述因子，所述因子具有变异位点，因此其转录产物丧失正常的细胞功能，或者变为具有细胞毒性的物质并蓄积，从而诱导炎症或细胞死亡等病态的发病·恶化。
项21.一种多糖/双链RNA复合物的制造方法，所述方法为项1所述的多糖/双链RNA复合物的制造方法，所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA具有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，其特征在于，包括下述工序：通过以相对于1摩尔多核苷酸连接双链RNA、具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖为1～6摩尔的比例进行混合，使上述单链多脱氧腺嘌呤和上述多糖复合的工序，所述多核苷酸连接双链RNA在上述有义链及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接。
项22.一种具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖/双链RNA复合物在体外或离体(ex vivo)用于抑制靶基因表达的应用，
所述多糖/双链RNA复合物含有双链RNA，所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA具有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，在上述双链RNA中在上述有义链RNA及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接，上述多糖与上述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
项23.一种靶基因表达抑制方法，所述抑制方法抑制细胞内靶基因的表达，
所述方法包含将具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖/双链RNA复合物导入细胞内的工序，
所述多糖/双链RNA复合物含有双链RNA，所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA具有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，在上述双链RNA中在上述有义链RNA及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤相连接，上述多糖与上述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
本发明的多糖/双链RNA复合物，保持由双链RNA产生的RNA干扰效应，同时还具有优异的细胞导入性及降解酶抗性，因此与具有RNA干扰效应的现有双链RNA分子相比，其使用价值提高。因此，本发明的多糖/双链RNA复合物例如可以用作对治疗癌症或艾滋等疾病有效的基因药物。
另外，本发明的多糖/双链RNA复合物，由于其多糖部分可以与细胞膜穿透性分子或能赋予降解酶抗性的分子等各种功能性分子相连接，因此可以使其具有基于该功能性分子的有用效果，可以进行多样的分子设计，在临床上的有用性也很高。
进而，构成本发明的多糖/双链RNA复合物的双链RNA由27个核苷酸的有义链RNA、及与该有义链RNA完全互补的27个核苷酸的反义链RNA构成时，上述本发明的效果更加有效。考虑其理由如下，但不限定于该解释：含有具有上述结构的双链RNA的多糖/双链RNA复合物被导入细胞内后，通过切酶的作用27个碱基长度的双链RNA有效地转换为21个碱基长度且在3’末端具有2个碱基悬端的siRNA，因此通过多脱氧腺嘌呤连接于27个碱基长度的末端的多糖脱离。即，多糖担负着与提高双链RNA的细胞导入性或核酸酶抗性等有关的重要作用，但对RNA干涉反应不产生不良影响。有报道指出，一般而言被修饰的RNA干涉分子减弱RNA干扰效应，但本发明的多糖/双链RNA复合物如上所述由于切酶的作用导致多糖脱离，所以不妨碍RNA干扰效应。因此，含有具有上述结构的双链RNA的多糖/双链RNA复合物可以提高细胞导入性或核酸酶抗性等，并且能有效地发挥其本来具有的RNA干扰效应。
具体实施方式
本发明的多糖/双链RNA复合物作为担负RNA干扰效应的部分含有双链RNA，所述双链RNA将具有与靶基因中的靶序列互补的碱基序列的有义链RNA、及具有与上述有义链互补的碱基序列的反义链RNA杂交，能抑制上述靶基因的表达。此处，具有与靶序列互补的碱基序列的有义链RNA，是指与该靶序列100％配对的互补序列。
此处，所谓“靶基因”是指由于RNA干扰效应抑制其基因表达的基因。本发明的多糖/双链RNA复合物中，对靶对象基因无特殊限制，可以根据上述多糖/双链RNA复合物的用途进行适当选择。
在本发明中，优选靶基因存在于在细胞表面表达受体的细胞内，所述受体能够与多糖结合，作为上述细胞，优选例如表达Dectin-1的细胞，所述Dectin-1为β-葡聚糖的受体。具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖，通过因与细胞表面的Dectin-1结合而诱导的信号被转导至细胞内部。
作为本发明中的靶基因，没有特殊的限制，但从用于药物用途的观点考虑，优选与疾病相关、希望能抑制其表达的基因。作为上述靶基因的具体例，可以举出下述基因：(a)编码与疾病的发病或者症状的恶化相关的因子的基因，所述疾病的发病或者症状的恶化是通过外部刺激等过量产生转录产物而引起的，(b)编码下述因子的基因，所述因子具有靶基因变异的位点且其转录产物与疾病的发病直接相关。
作为上述靶基因，可以举出编码细胞因子等诱导炎症的因子的基因，所述细胞因子例如为TNFα、白介素、MIF等。
另外，(a)的靶基因包括为编码控制细胞内活性开·关因子的基因的情况。作为上述基因，可以举出蛋白激酶(例如Raf、MEK、Jak2等)、转录因子(例如Stat5等)等。
进而，作为(a)的靶基因，还包括靶基因为编码细胞表面受体的基因，并且还为编码作用于病体发病或恶化的因子的基因的情况，所述病体发病或恶化是由该细胞表面受体引起的。作为上述基因，可以举出编码TNFR(肿瘤坏死因子受体)、PDGFR(血小板衍生生长因子受体)、白介素受体等的基因。
作为(b)的靶基因，是指编码下述因子的基因，所述因子具有该靶基因发生变异的位点，因此其转录产物丧失正常的细胞功能，或者变为具有细胞毒性的物质并蓄积，从而诱导炎症或细胞死亡等病态的发病·恶化。作为上述基因，可以举出Jak2变异V617F、ATN1变异CAG重复、TTR变异V30M、KT14变异R125C等。
对靶基因中的靶序列没有特别限制，只要该基因的表达可以被RNA干扰效应抑制即可。靶序列可以根据公知方法适当确定，具体而言可以使用NCBI BLAST搜索等。例如靶序列可以是由19～30个碱基组成的区域，位于碱基“AA”之后，所述碱基“AA”处于靶基因编码区(ORF)起始密码子的50～100个碱基下游的外显子区中，靶序列的GC含量为50％左右。本领域技术人员根据经验可知通过采用与上述靶序列互补的链，可以获得优异的RNA干扰效应。另外，例如上述靶序列可以根据IDT公司(Integrated DNA Technologies，INC.)的说明(Dicer Substrate RNAi Design)确定。最近有报道指出通过构建如下双链RNA可以产生具有高RNA干扰效应的双链RNA，所述双链RNA(i)在反义链RNA的5’末端具有A/U对；(ii)在有义链RNA的5’末端具有G/C对；(iii)在反义链RNA的5’末端具有5个左右的A/U对；且(iv)双链中不存在9个以上的G/C对。(Ui-Tei et al.，NucleicAcids Res.，32，936-948(2004))。
对构成上述有义链RNA的核苷酸数量没有特别限制，只要能发挥RNA干扰效应即可，例如可以举出15～50个、19～30个，优选21～27个、更优选21个或27个。
另外，上述反义链RNA为可以与上述有义链RNA杂交形成双链的RNA。即，上述反义链RNA为含有与上述有义链RNA互补的核苷酸序列的RNA。上述反义链RNA也可以不合与上述有义链RNA的全长互补的序列，优选具有与上述有义链RNA中的15个碱基长度以上的区域互补的序列，较优选具有与上述有义链RNA中的19个碱基长度以上的区域互补的序列。
对构成上述反义链核苷酸的数量没有特别限制，例如可以举出15～50个、19～30个、优选21～27个、更优选21个或27个。需要说明的是，上述有义链和上述反义链的核苷酸数量可以相互不相同，但优选两者的核苷酸数量相同。
另外，上述有义链RNA与上述反义链可以杂交成双链的状态，在有义链RNA的5’末端侧(即反义链的3’末端侧)和3’末端侧(即反义链的5’末端侧)的任一方或双方的末端具有悬端(突出端)。另外，上述有义链RNA与上述反义链相互由数量相同的核苷酸构成时，可以杂交成双链的状态，在有义链RNA的5’末端侧(即反义链的3’末端侧)与3’末端侧(即反义链的’末端侧)的双方为平滑末端(平端)，即可以为上述有义链RNA与上述反义链完全互补地杂交的结构。此处，所谓“悬端”是指在有义链RNA与反义链杂交成双链的状态下，由于有义链RNA或反义链的末端部分不存在配对的核苷酸，所以为以单链状态存在的末端结构。另外，所谓“平滑末端”是指在有义链RNA与反义链杂交的双链状态下，有义链RNA的末端部分和与该有义链配对的反义链的末端部分完全配对，而不具有悬端的末端结构。
作为构成本发明多糖/双链RNA复合物的双链RNA的优选方案，可以举出上述有义链RNA由27个核苷酸构成，并且上述反义链RNA由与上述有义链RNA完全互补的27个核苷酸构成的双链RNA。即，双链RNA具有上述结构时，5’及3’两末端为平滑末端。
另外，作为构成本发明多糖/双链RNA复合物的双链RNA的其他具体例，可以举出上述有义链RNA及上述反义链RNA均由21个核苷酸构成，并且在上述有义链RNA的5’末端及上述反义链RNA的5’末端形成由2个核苷酸构成的悬端。即，在上述双链RNA中从上述反义链RNA的3’末端侧开始的第1～19个核苷酸序列，是与从上述有义链RNA的5’末端侧开始的第3～21个核苷酸互补的序列。
构成本发明多糖/双链RNA复合物的双链RNA中，上述有义链及反义链的四个末端中的至少任一末端，直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤相连接。即，在上述有义链RNA的5’末端、上述有义链的3’末端、上述反义链的5’末端及上述反义链的3’末端中的至少一个末端，与单链多脱氧腺嘌呤相连接。对上述单链多脱氧腺嘌呤的连接个数没有特别限制，从有效地发挥RNA干扰效应这一观点考虑，优选为1～3，更优选为1或2，特别优选为1。
本发明中，优选与上述双链RNA连接的上述单链多脱氧腺嘌呤的连接个数为1，并且优选上述单链多脱氧腺嘌呤与上述有义链的5’末端相连接。如上所述，上述单链多脱氧腺嘌呤只与上述有义链的5’末端连接时，基于双链RNA，可以使RNA干扰效应显著。进而，上述单链多脱氧腺嘌呤只与上述有义链的5’末端连接，并且构成上述双链RNA的上述有义链和上述反义链的核苷酸数分别为27个时，可以进一步增强RNA干扰效应。
另外，有义链RNA及反义链RNA由21个核苷酸构成时，单链多脱氧腺嘌呤可以与有义链/反义链、5’末端/3’末端中的任一方连接，能够发挥优异的RNA干扰效应。
作为构成上述单链多脱氧腺嘌呤的脱氧腺嘌呤的数量没有特殊限制，只要能够与下述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖形成复合物即可，例如可以举出10～100个，优选20～100个，较优选20～80个，更优选40～60个。
单链多脱氧腺嘌呤与具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖形成良好的复合物时，上述得到的多糖/双链RNA复合物具有较高的降解酶抗性。
上述单链多脱氧腺嘌呤可以与上述双链RNA的有义链RNA及/或反义链RNA的末端核苷酸直接连接，也可以通过连接体连接。优选后者，即通过连接体连接。
为了使单链多脱氧腺嘌呤直接与RNA链的5’末端连接，具体而言可以使RNA链5’末端的核苷酸的5’碳原子和磷酸残基以酯键连接，所述磷酸残基通过酯键与单链多脱氧腺嘌呤3’末端的3’碳原子连接。另外，为了使单链多脱氧腺嘌呤与RNA链的3’末端直接连接，可以使与RNA链3’末端的核苷酸的3’碳原子通过酯键连接的磷酸残基、和单链多脱氧腺嘌呤5’末端的5’碳原子以酯键连接。
另外，通过连接体使上述单链多脱氧腺嘌呤与上述双链RNA的有义链RNA及/或反义链RNA连接时，作为上述连接体例如可以举出双官能连接体。
此处，对双官能连接体没有特别限制，只要为含有两个官能团的连接体即可，可以使用例如N-琥珀酰亚胺基＝3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯、N-4-马来酰亚胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫基)巯基乙胺、碘乙酸基琥珀酰亚胺、N-(4-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺、N-[5-(3’-马来酰亚胺丙酰胺)-1-羧戊基]亚氨基二乙酸、N-琥珀酰亚胺基-3-马来酰亚胺基丙酸酯等。
除上述连接体外，作为上述双官能连接体，还可以使用下述结构的连接体。
-O-CO-O-                         (L-1)
-NH-CO-O-                        (L-2)
-NH-CO-NH-                       (L-3)
-NH-(CH2)n1-                     (L-4)
-S-(CH2)n1-                      (L-5)
-CO-(CH2)n1-CO-                  (L-6)
-CO-(CH2)n1-NH-                  (L-7)
-NH-(CH2)n1-NH-                  (L-8)
-CO-NH-(CH2)n1-NH-CO-            (L-9)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-NH-CO-        (L-10)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-NH-C(＝S)-    (L-11)
-CO-O-(CH2)n1-O-CO-              (L-12)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-O-CO-          (L-13)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-O-C(＝S)-      (L-14)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO-             (L-15)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-CO-         (L-16)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-C(＝S)-     (L-17)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO-             (L-18)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-CO-         (L-19)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-NH-CO-         (L-20)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-C(＝S)-     (L-21)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH(CH2OH)-       (L-22)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH2-             (L-23)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH2-CO-          (L-24)
-O-(CH2)n3-S-S-(CH2)n4-O-P(＝O)2-(L-25)
此处，上述通式(L-4)～(L-21)中，n1表示1～40的整数，优选2～20的整数，更优选2～12的整数。
另外，上述通式(L-22)～(L-24)中，n2表示1～20的整数，优选1～10的整数，更优选1～6的整数。
另外，上述通式(L-25)中，n3及n4相同或不同，表示1～20的整数，优选1～10的整数，较优选1～6的整数。
上述通式(L-4)～(L-25)表示的连接体，其右侧或左侧的任一侧可以与单链多脱氧腺嘌呤相连接。优选结构为其左侧与单链多脱氧腺嘌呤连接，其右侧与上述双链RNA的有义链RNA及/或反义链RNA的末端相连接。
另外，对于上述双链RNA的有义链RNA及/或反义链RNA的末端核苷酸与连接体的连接位点没有特殊限制。例如，上述连接体可以通过取代构成磷酸残基的氢原子进行连接，所述磷酸残基为上述有义链RNA及/或反义链RNA的末端核苷酸的磷酸残基，另外也可以通过取代构成上述末端核苷酸的羟基的氢原子进行连接。进而，对于上述单链多脱氧腺嘌呤的末端脱氧核苷酸与连接体的连接位点没有特殊限制。例如，上述连接体可以通过取代构成磷酸残基的氢原子进行连接，所述磷酸残基为上述单链多脱氧腺嘌呤的末端脱氧核苷酸的磷酸残基，另外也可以通过取代构成上述末端脱氧核苷酸的羟基的氢原子进行连接。
本发明的多糖/双链RNA复合物中，作为担负除RNA干扰效应之外的所期待功能的部分，含有具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖。
所谓“β-1，3-葡聚糖”是指葡萄糖通过β1→3糖苷键连接而成的多糖，已知各种β-1，3-葡聚糖，所述β-1，3-葡聚糖侧链的葡萄糖残基数相对于主链的葡萄糖残基数比例(以下简称为侧链率)不同。对于本发明使用的多糖类没有特殊限制，只要具有β-1，3-葡聚糖骨架即可，但从使其易于与上述单链多脱氧腺嘌呤复合，进一步提高本发明的多糖/双链RNA复合物的细胞内导入率这一观点考虑，优选使用含有侧链率较高的β-1，3-葡聚糖骨架的多糖。
作为本发明多糖/双链RNA复合物中使用的多糖，具体而言，可以举出裂裥菌素、凝胶多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰树花多糖、小核菌葡聚糖等。上述多糖中，由于裂裥菌素能进一步显著提高细胞内导入性及酶降解抗性，因此为本发明中优选的多糖。
对于本发明多糖/双链RNA复合物中使用的多糖的分子量没有特殊限制，可以根据所使用多糖的种类、上述单链多脱氧腺嘌呤的链长等进行适当确定。具体而言，作为上述多糖的分子量，可以举出通常为25,000～2500,000，优选为25,000～150,000。
本发明的多糖/双链RNA复合物通过将单链多脱氧腺嘌呤和上述多糖复合而形成，所述单链多脱氧腺嘌呤与上述双链RNA连接。对于上述单链多脱氧腺嘌呤与上述多糖的复合结构没有特殊限制，通常优选将1个上述单链多脱氧腺嘌呤与2个上述多糖复合而成的三链螺旋结构。上述三链螺旋结构的形成可以根据下述方法具体实施。具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖在天然状态下或在水中为三螺旋结构。将上述多糖溶解于DMSO(二甲基亚砜)等极性溶剂成为单链后，加入连接有单链多脱氧腺嘌呤的双链RNA，通过用水替代溶剂(复性过程)，可形成由连接有双链RNA的多核苷酸单链部分与两个多糖形成的、复合为三螺旋型的结构(装配结构(association structure))。上述多核苷酸与多糖的复合主要是通过氢键和疏水性相互作用形成的。
另外，本发明的多糖/双链RNA复合物中含有的上述多糖可以与功能性分子连接。通过使用上述与功能性分子相连接的多糖，可以使本发明的多糖/双链RNA复合物具有基于该功能性分子的有用功能。作为上述功能性分子，具体而言可以举出肽、蛋白质、糖、氨基酸、DNA、RNA、低分子有机·无机材料、胆固醇、树状聚体(dendrimer)、脂质、高分子材料等。
作为上述肽，可以举出例如由3～40个，优选6～30个，更优选8～25个氨基酸组成的肽。具体而言，可以举出细胞膜穿透肽(八聚精氨酸(R8)、穿膜肽等)、核定位信号肽序列(HIV-1 Tat、SV40T抗原等)、核输出信号肽(HIV-1Rev、MAPKK等)、细胞膜融合肽(gp41、病毒融合肽等)。其中，本发明中优选使用R8。R8具有促进向细胞内导入的作用，如果使用连接有R8的多糖，则可以获得能将多糖/双链RNA复合物更有效地导入细胞内的优点。
作为上述蛋白质，可以使用存在于体内的蛋白质、具有药理作用的蛋白质、具有分子识别作用的蛋白质等，作为上述蛋白质的例子，可以举出输出蛋白/输入蛋白·蛋白质、纤连蛋白、抗生物素蛋白、抗体等。
作为上述糖，可以举出例如葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、半乳糖胺等单糖、任意组合上述单糖所得的寡糖或多糖等。
作为上述低分子有机.无机材料，可以举出例如精胺、亚精胺等阳离子性分子；FITC、Alexa、Cy3、Cy5等荧光物质；生物素；量子点；金微粒等。
作为上述树状聚体，可以举出例如聚酰胺-胺树状聚体等。
作为上述脂质，可以举出例如亚油酸、DOPE(1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺)等。
作为上述高分子材料，可以举出例如聚乙二醇、聚乙烯亚胺等。
上述功能性分子中，优选肽、阳离子性分子、聚乙二醇，更优选肽。另外，上述功能性分子中，优选具有细胞膜穿透性的分子(细胞膜穿透性分子)及能赋予双链RNA降解酶抗性的分子。上述功能性分子中，作为细胞膜穿透性分子可以举出肽等，作为能赋予双链RNA降解酶抗性的分子可以举出聚乙二醇。
对于上述多糖与功能性分子的连接，可以直接或通过连接体使上述功能性分子与上述多糖的侧链相连接。作为使功能性分子与多糖侧链相连接的方法，可以采用各种反应，优选对主链的糖苷键不产生影响的、选择性导入至侧链的方法。作为上述方法，例如可以举出以下方法。即，首先使用高碘酸钠等氧化剂氧化从裂裥菌素等的主链分枝出的具有1，6-吡喃葡萄糖苷键的葡萄糖残基，使其开环形成醛。然后，在硼氢化钠等还原剂存在下，使用具有氨基的功能性分子，或者使用与具有氨基的连接体相连接的功能性分子的氨基还原氨化上述醛基。通过上述方法可以合成与功能性分子相连接的多糖。
另外，作为其他方法，例如可以举出以下方法。首先，使用高碘酸钠等的氧化剂氧化从裂裥菌素等的主链分枝出的具有1，6-吡喃葡萄糖苷键的葡萄糖残基，使其开环形成醛。然后，使用次氯酸钠将上述醛基氧化成羧酸后，使用叠氮磷酸二苯酯使具有氨基的功能性分子、或者与含有氨基的连接体相连接的功能性分子和羧酸发生缩合反应，也同样可以得到目标产物。
多糖与功能性分子连接时，作为功能性分子的连接比例，例如可以举出相对于每100个多糖的侧链，功能性分子为1～200个，优选为1～100个，特别优选为1～50个。上述功能性分子的连接比例，在上述方法中可以通过控制相对于分枝葡萄糖残基的高碘酸钠等氧化剂的添加量进行调整。
上述多糖与功能性分子连接时，优选通过连接体将上述功能性分子连接于上述多糖的侧链。作为上述连接体，优选使用上述双官能连接体。
另外，对于上述多糖与上述功能性分子或连接体的连接位点没有特殊的限制，所述连接体与上述功能性分子连接，优选上述功能性分子或与上述功能性分子相连接的连接体取代具有1，6-吡喃葡萄糖苷键的葡萄糖的1，2-二醇部位进行连接，所述葡萄糖从上述多糖的β-1，3-葡聚糖的主链分枝出。
本发明的多糖/双链RNA复合物，可以按照公知的方法制备。具体而言，可以举出通过下述(1)～(3)工序进行制备的方法：(1)根据公知的方法制备多核苷酸连接双链RNA，所述多核苷酸连接双链RNA直接或通过连接体连接有上述单链多脱氧腺嘌呤，(2)另外，分别准备具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖，或制备直接或通过连接体连接有功能性分子相连接的具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖(修饰型多糖)，(3)然后，使用连接在DNA连接双链RNA上的单链多脱氧腺嘌呤和上述多糖或上述修饰型多糖形成复合物。
在上述方法的(3)的工序中，优选上述多核苷酸连接双链RNA与上述多糖或上述修饰型多糖以1∶1～1∶5、优选1∶1.3～1∶2的摩尔比进行混合，使上述多核苷酸连接双链RNA中的单链多脱氧腺嘌呤区域与上述多糖或上述修饰型多糖复合。以上述摩尔比，将上述多核苷酸连接双链RNA与上述多糖或上述修饰型多糖置于复合物形成条件下，由此可以使两者有效地相互作用，从而能够提高本发明的多糖/双链RNA复合物的制备效率。
本发明的多糖/双链RNA复合物由于可以被导入细胞内而抑制在细胞内的靶基因的表达，因此可以用作以靶基因的表达抑制为目的的药物。将本发明的多糖/双链RNA复合物向细胞内导入的导入量或者方法，与现有的siRNA的情况相同。需要说明的是，由于本发明的多糖/双链RNA复合物单独使用即具有优异的细胞内转移能力，因此可以不使用用于将siRNA导入细胞内的现有基因导入试剂，或减少现有基因导入试剂的使用量，而将本发明的多糖/双链RNA复合物导入细胞内。需要说明的是，本发明的多糖/双链RNA复合物的靶基因的表达抑制可以在体内进行，或者也可以在体外或离体进行。
另外，本发明也提供了用于抑制在细胞内靶基因的表达的、上述多糖/双链RNA复合物的应用。并且，本发明还提供了利用上述多糖/双链RNA复合物的靶基因表达的抑制方法。上述应用及方法中，关于多糖/双链RNA复合物及其使用方法等如上所述。
实施例
以下基于实施例详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。需要说明的是，以下分别用“SPG”及“修饰SPG”表示裂裥菌素及连接有功能性分子的裂裥菌素。另外，用“聚(dA)”或“poly(dA)”表示多脱氧腺嘌呤。另外，用“PEG”表示聚乙二醇。
实施例1
1.修饰型SPG的合成
根据文献(A.C.S.38(1)，253(1997)；Carbohydrate Research，89，121-135(1981))记述的方法制备三螺旋结构的SPG。即，使用最少的培养基静置培养从ATCC(美国标准菌种收藏所)得到的裂褶菌(ATCC44200)7天后，将离心分离细胞成分及不溶残渣得到的上清液进行超音处理，得到分子量45万的三螺旋结构的SPG。以下有时也用“SPG1”表示上述得到的SPG。
然后，将制备的分子量45万的100mg SPG1溶解于80ml蒸馏水中。将26.4mg高碘酸钠(相对于侧链葡萄糖为0.8当量)溶解在少量的蒸馏水中，在4℃下边冷却搅拌边缓慢加入上述SPG1溶液中。用透析膜(排阻极限：14,000)透析反应液后，冷冻干燥，得到白色固体(导入醛基的SPG)。使用上述得到的化合物，进行肽、精胺、或者PEG的连接。
肽的连接
将上述得到的白色固体溶解于35ml二甲基亚砜中，加入2-氨基乙醇(过量)，室温下搅拌2日后，加入300mg的硼氢化钠(过量)。用透析膜(排阻极限：14,000)透析反应液后，冷冻干燥，得到白色固体。按照以下方法将肽连接到上述得到的导入了氨基的SPG上。
作为肽使用R8(氨基酸序列：CRRRRRRRR(序列号1))、tat(氨基酸序列：CGGSGRKKRRQRRRPPQ(序列号2))及RGD(氨基酸序列：CRGD)，将上述肽与导入了氨基的SPG相连接。具体而言，使用作为连接体的N-琥珀酰亚胺基-3-马来酰亚胺基丙酸酯(SMP)将上述肽的巯基部位与被导入SPG的氨基部位相连接，参考文献：Takahisa Anada et al.，Journal of Controlled Release，Volume108，Issues2-3，28November2005，Pages 529-539；Matsumoto Takahiro，et al.，Biochim Biophys Acta，1670(2)，(2004)，91-104。
以下分别用“SPG2”、“SPG3”及“SPG4”表示上述得到的R8肽修饰SPG、tat肽修饰SPG及RGD肽修饰SPG。
精胺的连接
使用上述得到的白色固体与精胺(Sigma Corporation公司；结构式NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2)进行还原氨化反应，从而使导入SPG的醛基部位与精胺的氨基部位相连接。使用还原氨化反应连接精胺的氨基部位与被导入SPG中的醛基部位。参考文献：Matsumoto Takahiro et al.，Biochim Biophys Acta，1670(2)，(2004)，91-104；NAGASAKI Takeshi et al.，Bioconjugate chemistry 2004，vol.15，pp.249-259。
以下用“SPG5”表示上述得到的精胺修饰SPG。
PEG的连接
使用上述得到的白色固体与导入了氨基的PEG(甲氧基聚乙二醇胺(平均分子量5000)，Sigma Corporation，结构式：H2NCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3)进行还原氨化反应，由此将被导入SPG中的醛基部位与PEG的氨基部位相连接。参考文献：Ryouji Karinaga，Biomaterials.2005 Aug；26(23)：4866-73.
以下用“SPG6”表示上述得到的PEG修饰SPG。
2.在有义链的5’末端含有聚dA的双链RNA的合成
合成在27个碱基长度的RNA链的5’末端含有40个碱基长度的DNA链(聚腺嘌呤；polyA40)的67个碱基长度的DNA-RNA嵌合体多核苷酸，将其作为有义链。合成具有与上述67个碱基长度的DNA-RNA嵌合体多核苷酸中的RNA区域完全互补序列的27个碱基长度的反义RNA，通过对两者进行退火，形成含有40个碱基长度的单链多脱氧腺嘌呤区域的双链寡核苷酸(DNA连接双链RNA)。
另外，分别合成在上述DNA-RNA嵌合体多核苷酸中的DNA区域与RNA区域之间插入下述结构式表示的连接体的DNA-RNA嵌合体多核苷酸(含有连接体)。
对上述DNA-RNA嵌合体多核苷酸(含有连接体)、及具有与上述嵌合体多核苷酸中的RNA区域完全互补序列的27个碱基长度的反义RNA进行退火，合成含有40个碱基长度的单链多脱氧腺嘌呤区域的、DNA与双链RNA以连接体连接的DNA-RNA嵌合体双链寡核苷酸。
另外，合成不合DNA区域的27个碱基长度的双链RNA作为对照。另外，还使用通常被广泛使用的21个碱基长度的siRNA作为对照。此处使用的多核苷酸是含有与海肾荧光素酶基因具有相同序列的反义RNA，是为了在细胞中进行RNA干扰反应而设计的双链多核苷酸。
另外，上述合成中通过使用UV光谱检测仪测定260nm的吸光度算出单链RNA的浓度。另外双链RNA的退火如下进行，即在通用缓冲液(林化成株式会社)中混合等摩尔量的有义链及反义链寡核苷酸，在92℃下加热2分钟后，缓慢降低温度至4℃。
使用的RNA及DNA-RNA嵌合体寡核苷酸的序列如下所示。
有义链：
21s：5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’(序列号3)
27s：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’(序列号4)
pA40-27R1：5’-(a)40-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’(序列号5)
pA40-27R2：5’-(a)40-X-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’(序列号6)
反义链：
21as：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG-5’(序列号7)
27as：3’-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5’(序列号8)
上述有义链序列中，“(a)40”表示40个碱基长度的聚腺嘌呤。另外，有义链pA40-27R2中X表示上述连接体X。
3.各种SPG/双链RNA复合物的形成
为了使未修饰及修饰SPG与含有聚dA的双链RNA形成复合物，在含有聚dA的双链RNA溶液(双链RNA的浓度为10μM；缓冲液：通用缓冲液(林化成株式会社)中含有1％DMSO)中混合各种SPG，在4℃下培育3天。各种SPG以溶解在DMSO(二甲基亚砜)的状态进行使用，以相对于含有聚dA的1摩尔双链RNA，各种SPG为2摩尔的比例进行混合。需要说明的是，设定双链RNA溶液中的DMSO的最终浓度为1容量％。在预实验中确认了1容量％DMSO水溶液对细胞及RNA干扰效应不产生影响。
制备的各种SPG/双链RNA复合物的结构示于图1。使用20％聚丙烯酰胺凝胶确认是否合成了上述SPG/双链RNA复合物。具体而言，将10μl(2μM)杂交溶液加入20％聚丙烯酰胺凝胶中，在250V下对样品进行70分钟电泳。之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)，用ChemiImager 4000(AlphaInnotech公司)进行凝胶分析。结果示于图2。结果表明含有聚dA的双链RNA在迁移距离小于27个碱基长度的双链RNA的位置出现条带，因此确认形成了目标产物即含有聚dA的双链RNA。另外，各种SPG/双链RNA复合物残留于聚丙烯酰胺的孔中，从而确认了SPG与含有聚dA的双链RNA形成了复合物。
另外，对SPG/双链RNA复合物进行CD光谱解析，结果示于图3。图3中的左图表示DNA-RNA嵌合体双链寡核苷酸的CD光谱。由于双链中添加有SPG的SPG/双链RNA复合物与双链的光谱相比变化较大，所以可以判断双链与SPG形成了复合物(在5℃下进行)。图3中的右图为使用CD光谱测定所形成复合物的解离温度的结果。通过研究随温度变化在281.6nm的CD值的变化，可以了解双链的热力学行为。双链由于在70℃附近CD强度下降，因此可知双链在约70℃下解离。另一方面，SPG/双链RNA复合物除了上述双链解离的区域外，还可以观察到在47℃附近CD强度急剧下降。这是由于双链从复合物解离而产生的，由上述结果可知复合物的解离温度为约47℃。
4.利用切酶对各种SPG/双链RNA复合物的加工
研究利用切酶对27个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物进行加工。利用切酶的切割实验如下所述：在样品管中准备下述溶液，在20mM Tris-HCl(pH为8.0)、15mM NaCl及2.5mM MgCl2的溶液中含有0.5U重组切酶(GeneTherapy Systems公司制)和10μl最终浓度调节至2μM的27个碱基长度的双链RNA，或含有聚dA的双链RNA，或各种SPG/双链RNA复合物，然后在设定为37℃的培养箱中温育样品12小时。之后为了终止利用切酶的切割反应，向反应溶液中加入2μl切酶终止溶液(Gene Therapy Systems公司制)，再加入2μl加样染料。将得到的样品产物在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳70分钟。之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience公司制)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)，用ChemiImager 4000(Alpha Innotech公司制)进行凝胶分析。另外，使用由未经切酶加工的21个碱基长度双链RNA构成的siRNA(21siRNA)作为对照。
结果示于图4。结果表明作为27个碱基长度的双链RNA的27s/27as及在有义链的5’末端具有40个碱基长度单链多脱氧腺嘌呤区域的pA40-27R1/27as在重组切酶存在下，在与21个碱基长度的siRNA的相同的位置观察到条带，强有力地表明通过切酶的切割生成了具有2个碱基悬端的21个碱基长度的siRNA。另外，也强有力地表明在由SPG(1～6)和pA40-27R1/27as形成的复合物中，通过重组切酶加工也生成了具有2个碱基悬端的21个碱基长度的siRNA。
上述结果表明，即使在存在长链单链多脱氧腺嘌呤或SPG的状态下，27个碱基长度的双链RNA(SPG/双链RNA复合物)也可以通过重组切酶被加工成21个碱基长度的siRNA。
5.各种SPG/双链RNA复合物的降解酶抗性
关于(5-1)SPG/双链RNA(27个碱基长度)复合物的降解酶抗性。
研究27个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物(以下有时也记作试验样品)的核酸酶抗性。实验如下进行：在37℃下在含有10％FBS(三光纯药株式会社)的RPMI-1640培养基(Invitrogen公司制)中(最终体积为110μl)温育试验样品，所述试验样品的最终浓度被调节为2μM。在0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时后分别取10μl，将其加入含有2μl加样染料的样品管中。为了终止降解反应，样品采集后迅速在液氮中冻干，并且在-20℃下保存。在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶对所得产物进行电泳70分钟。之后，用银染色试剂盒(GEHealth Care Bioscience公司制)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)，用ChemiImager 4000(Alpha Innotech公司制)进行凝胶分析。另外，作为对照也使用相同的方法研究通常在siRNA法中使用的在3’末端具有2个碱基悬端的21个碱基长度的21siRNA的降解酶抗性。结果示于图5。
结果表明具有2个碱基悬端的21个碱基长度的双链RNA(21siRNA)在含有10％FBS的培养基中迅速降解，而27个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物具有非常高的降解酶抗性。另外，合有聚dA的双链RNA与27个碱基长度的双链RNA相比显示出高降解酶抗性，并且各种SPG/双链RNA复合物与含有聚dA的双链RNA相比显示出高降解酶抗性。特别是表明SPG/双链RNA复合物在48小时后几乎未被核酸酶降解。上述结果表明含有聚dA的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物在含有血清的培养基中具有极高的稳定性。
关于(5-2)SPG/双链RNA(21个碱基长度)复合物的降解酶抗性。
研究21个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA、含有聚dT的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物(dA，dT；以下有时也记作试验样品)的核酸酶抗性。
使用的RNA及DNA-RNA嵌合体寡核苷酸的序列如下所示。
有义链：
21s：5’-GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU-3’(序列号9)
pA40-21：5’-(a)40-GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU-3’(序列号10)
pT40-21：5’-(t)40-GGUGGUGACGAUCUGGGCUUU-3’(序列号11)
反义链：
21as：3’-UUUCGGGUCUAGCAGUGGUGG-5’(序列号12)
上述有义链的序列中，“(a)40”表示40个碱基长度的聚dA，“(t)40”表示40个碱基长度的dT。
实验如下进行：在37℃下在含有10％FBS(MP Biomedicals，inc.制)的RPMI-1640培养基(Sigma Corporation公司制)中(最终体积为100μl)温育试验样品，所述试验样品的最终浓度被调节为40nM。在0小时、0.25小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时后回收样品，为了终止降解反应在-80℃下冻干。通过苯酚提取、氯仿处理、醇沉等对得到的试验样品进行精制，在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶对试验样品电泳60分钟。之后，使用SYBER Gold(Invitrogen公司制)进行染色，用Lumino image analyzer LAS3000(FUJIFILM公司制)进行凝胶分析。结果示于图6。
结果表明含有1个碱基悬端的21个碱基长度的双链RNA(nakedsiLamin 21bp)、没有形成复合物的双链RNA(naked siLamind A40)及含有聚dT的SPG/双链RNA复合物(SPG complex siLamin dT40)在含有10％FBS的培养基中迅速降解，而含有聚dA的SPG/双链RNA复合物(SPG complex siLamin dA40)具有较高的降解酶抗性。
6.聚dA-双链RNA/SPG复合物的细胞毒性
(6-1)聚dA-双链RNA(27个碱基长度)/SPG复合物对HeLa细胞的细胞毒性
评价27个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物(以下有时也记作试验样品)对HeLa细胞的细胞毒性。将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞；东北大学老年医学研究所)接种在96孔板上，每孔为100μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，加入不含抗生素的新培养基，每孔为90μl。为了评价细胞内的毒性，通过使用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司制)将2种试验样品有效地导入细胞中来评价各种试验样品的细胞毒性。将试验样品与LipofectamineTM2000(Invitrogen公司制)混合进行复合，使试验样品的最终浓度为0nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM，将10μl上述溶液加入上述含有90μl培养基的HeLa细胞中，使每个孔的最终体积为100μl。需要说明的是，试验样品与LipofectamineTM2000的复合如下制备：将每孔5μl的试验样品水溶液与每孔5μl的LipofectamineTM2000(0.2μl)OptiMem溶液混合，将上述混合溶液在室温下温育30分钟。导入试验样品的HeLa细胞在5％CO2存在下，在37℃下培养48小时。之后，将CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒(Promega公司制)中的CellTiter-Glo试剂加入各孔中，每孔中加入50μl，搅拌约60分钟后，使用发光计(MicroLumat LB96p：BERTHOLD公司制)测定各孔中的发光量。由于测定的发光量依赖于活细胞中的ATP，因此计算对照细胞的发光量(RNA为0nM，LipofectamineTM2000为0μl时。将其视为存活率100％。)和导入了各种试验样品的细胞的发光量的相对值，由此可以算出各孔中的存活率(参见Promega公司CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒手册。)。
图7表示在此次使用的试验样品的最大浓度10nM时的细胞存活率的结果。结果表明，全部SPG/双链RNA复合物的细胞毒性均在被充分允许的范围内。
(6-2)聚dA-双链RNA(21个碱基长度)/SPG复合物对RAW264.7细胞的细胞毒性
以作为核膜构成成分的LaminA/C作为靶标评价21个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA的复合物(以下有时也记作试验样品)的RNA干扰效应。使用的RNA及DNA-RNA嵌合体寡核苷酸的序列如上述(5-2)栏中所示。
将实验前调节至5×104细胞/ml的RAW264.7细胞(来自鼠巨噬细胞样细胞)接种在96孔板上，每孔为100μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，加入90μl新培养基，将调节了浓度的含有聚dA的双链RNA/SPG复合物溶液各10μl分别加入含有RAW264.7细胞的孔中。将含有聚dA的双链RNA/SPG复合物的最终浓度调节至600nM(siRNA浓度)。导入试验样品后，在37℃下培养24小时，在-80℃下冷冻干燥，使用RNeasy小型试剂盒(QIAGEN公司制)提取总RNA，使用PrimerScript RT试剂盒(TAKARA BIO公司制)制备cDNA，使用SYBR prmix Ex Taq(TAKARA BIO公司制)测定实时PCR反应，使用Smart Cycler II(Cepheid公司制；TAKARA BIO公司销售)测定LaminA/C的mRNA量，通过使用通常用作管家基因的GAPDH对LaminA/C的mRNA表达水平进行补正，从而测定LaminA/C的mRNA表达水平。结果示于图8。
评价naked siRNA dA40(LaminA/C)、SPG only、以及SPG和naked siRNA dA40(LaminA/C)在加入细胞之前刚刚混合的混合物的RNA干扰效应，将结果作为比较对象。结果表明，naked siRNA dA40(LaminA/C)、SPGonly、以及SPG和naked siRNA dA40(LaminA/C)在加入细胞之前刚刚混合的混合物不具有RNA干扰效应，仅在含有聚dA的双链RNA的SPG复合物中确认到RNA干扰效应。上述结果表明单独使用的SPG对RAW264.7细胞不具有LaminA/C的mRNA抑制效果，并且naked状态的siRNA也同样不具有抑制效果。
7.聚dA-双链RNA/SPG复合物的RNA干扰效应
以海肾荧光素酶为靶标评价27个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA及各种SPG/双链RNA复合物(以下有时也记作试验样品)的RNA干扰效应。将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞；东北大学老年医学研究所)接种在96孔板上，每孔为100μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，加入不含抗生素的新培养基，每孔为80μl，将表达萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的载体(psiCHECKTM-2 Vector：Promega公司制)与LipofectamineTM2000(商品名；Invitrogen公司制)的复合溶液加入各加入了含有HeLa细胞的孔中，每孔加入10μl。设定表达载体使每个孔为0.02μg，另外设定LipofectamineTM2000使每个孔为0.2μl，使用OptiMem(Invitrogen公司制)将其调节为所需量。为了形成复合物，使用OptiMem将表达载体与LipofectamineTM2000混合，然后在室温下培养30分钟。加入上述复合溶液后，在5％CO2存在下，于37℃培养细胞4小时。之后，将试验样品与LipofectamineTM2000(Invitrogen公司制)形成复合物来制备复合溶液，使试验样品的最终浓度为0.2nM或0.5nM，将10μl上述溶液加入导入了表达载体的HeLa细胞中。此时，每个孔的最终体积为100μl。需要说明的是，试验样品和LipofectamineTM2000的复合溶液如下制备：将每孔5μl的试验样品水溶液与每孔5μl的LipofectamineTM2000(0.2μl)OptiMem溶液混合，将上述混合溶液在室温下温育30分钟。导入试验样品后，温育48小时，使用Dual-GloTM荧光素酶分析系统(Promega公司制)和发光计(MicroLumat LB96p；Berthold公司制)测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的表达水平。并以萤火虫荧光素酶的表达水平为对照计算海肾荧光素酶的表达水平(％)。
图9表示RNA干扰效应的结果。图9表示样品各种SPG/双链RNA复合物的添加浓度为0.5nM时的RNA干扰效应。另外，作为对比也表示出了siRNA法中使用的在3’末端具有2个碱基悬端的21个碱基长度的siRNA、27个碱基长度的双链RNA、含有聚dA的双链RNA的RNA干扰效应的结果。结果显示SPG/双链RNA复合物与27个碱基长度的双链RNA相比RNA干扰效应降低。考虑其理由为，通过加入SPGl，寡核苷酸与转染试剂的相互作用减弱，因此SPG/双链RNA复合物的细胞导入性比27nt dsRNA差，结果导致基因表达抑制能也比27nt dsRNA弱。另一方面，使用以功能性分子修饰SPG所得的修饰型SPG(SPG2～SPG6)制备的各种SPG/双链RNA复合物显示出与27个碱基长度的双链RNA的基因表达抑制能具有相同程度的RNA干扰效应，可知比使用SPG1制备的SPG/双链RNA复合物的基因表达抑制能高。认为上述结果表明导入到SPG的功能性分子提高了细胞导入性。
综合上述结果表明各种SPG/双链RNA复合物具有非常优异的降解酶抗性且几乎无毒性，因此与普通的siRNA相比具有较高的持续性及安全性。进一步表明通过使用各种功能性分子修饰SPG，可以构建出SPG/双链RNA复合物，所述SPG/双链RNA复合物即使不使用细胞毒性强的基因导入剂，单独即可到达细胞内。
参考试验例1
为了证明专利文献4(樱井和朗等、Polym.Preprints.Jpn.，第49卷、第4054页、2000年)公开的技术即使适用于具有RNA干扰效应的双链RNA但是导入率较低而进行了如下实验。
EGFP(增强型绿色荧光蛋白)为238个氨基酸的荧光性蛋白质。使用pEGFP载体将通过基因操作生成的EGFP基因导入活体细胞时，其不定位于细胞内而是分布于全部细胞中，通过激发光照射形成发色团，而具有发出荧光的性质(图11)。
使用限制酶Sph I切割上述pEGFP载体，将接合体ODN(脱氧核苷酸)和poly(dA)80mer连接，所述pEGFP载体的3’末端可以与接合体ODN杂交。将产物与SPG复合(图10)。
将各种长度(例如800～2500bp)的两端复合的DNA加入强迫表达Dectin-1的RAW细胞中，使用作为荧光物的Alexa对DNA侧链进行化学修饰(图12)。通过计数检测出Alexa的细胞数，研究导入细胞的导入率与DNA长度的关系。结果示于图13。图13中将使用图10方法制备的CMV-EGFP的细胞导入率记作1。
图13表明双链DNA的长度越长导入效率越降低。即，表明本法作为将较长的pDNA导入细胞的传递技术实用性较低。
附图说明
[图1]为表示合成的各种SPG/RNA复合物结构的图。
[图2]为表示确认各种SPG/RNA复合物是否形成的结果的图。
[图3]左图为表示使用CD光谱解析确认SPG/RNA复合物是否形成的结果的图，并且右图为表示使用CD光谱解析确认SPG/RNA复合物解离温度的结果的图。
[图4]为表示研究各种SPG/RNA复合物通过切酶加工结果的图。
[图5]为表示评价各种SPG/RNA(27个碱基长度)复合物核酸酶抗性结果的图。
[图6]为表示评价各种SPG/RNA(21个碱基长度)复合物核酸酶抗性结果的图。
[图7]为表示评价各种SPG/RNA(27个碱基长度)复合物细胞毒性结果的图。
[图8]为表示评价各种SPG/RNA(21个碱基长度)复合物细胞毒性结果的图。
[图9]为表示评价各种SPG/RNA复合物RNA干扰效应结果的图。
[图10]为表示CMV-EGFP制备方法的简图。
[图11]为使用pEGFP载体将EGFP基因导入活体细胞内时的细胞显微镜照片。
[图12]为表示被参考试验例1中使用的荧光物质Alexa化学修饰的两端复合DNA的制备方法的简图。
[图13]为表示参考试验例1结果的图。
序列表自由文本
序列号1表示R8的序列。
序列号2表示tat的序列。
序列号3表示21S的序列。
序列号4表示27s的序列。
序列号5表示pA40-27R1 RNA区域的序列。
序列号6表示pA40-27R2 RNA区域的序列。
序列号7表示21as的序列。
序列号8表示27as的序列。
序列号9表示21s的序列
序列号10表示pA40-21的序列。
序列号11表示pT40-21的序列。
序列号12表示21as的序列。
Figure IPA00001183258300011
Figure IPA00001183258300031

Claims (13)

1.一种多糖/双链RNA复合物，为具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖与双链RNA的复合物，其特征在于，
所述双链RNA具有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA含有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，
所述双链RNA中，所述有义链RNA及反义链RNA中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接，
所述多糖与所述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
2.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述有义链RNA由15～50个核苷酸构成，并且所述反义链RNA由与所述有义链RNA数量相同的核苷酸构成。
3.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述有义链RNA由21个核苷酸构成，并且所述反义链RNA由与所述有义链RNA数量相同的核苷酸构成。
4.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述有义链RNA由27个核苷酸构成，并且所述反义链RNA由与所述有义链RNA数量相同的核苷酸构成。
5.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述单链多脱氧腺嘌呤由20～100个脱氧腺嘌呤构成。
6.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述单链多脱氧腺嘌呤直接或者通过连接体与所述有义链RNA或者反义链RNA的5’末端及/或3’末端相连接。
7.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述多糖类为选自裂裥菌素、凝胶多糖、香菇多糖、茯苓多糖、灰树花多糖及小核菌葡聚糖中的至少一种。
8.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述多糖类为连接有功能性分子的β-1，3-葡聚糖。
9.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述双链RNA的靶基因是细胞的内源基因，所述细胞具有与所述多糖结合的受体。
10.如权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物，其中，所述细胞为在所述细胞膜表面表达Dectin-1的细胞。
11.一种多糖/双链RNA复合物的制造方法，所述方法为权利要求1所述的多糖/双链RNA复合物的制造方法，所述双链RNA具有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由有与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA含有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，其特征在于，包括下述工序：
通过以相对于1摩尔多核苷酸连接双链RNA，具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖为1～6摩尔的比例进行混合，使所述单链多脱氧腺嘌呤和所述多糖复合的工序，所述多核苷酸连接双链RNA在所述有义链及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接。
12.一种具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖/双链RNA复合物在体外或离体用于抑制靶基因表达的应用，
所述多糖/双链RNA复合物含有双链RNA，所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA含有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，在所述双链RNA中在所述有义链RNA及反义链中的至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤连接，所述多糖与所述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
13.一种抑制细胞内靶基因表达的方法，所述方法包括将具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖/双链RNA复合物导入细胞内的工序，
所述多糖/双链RNA复合物含有双链RNA，所述双链RNA含有有义链RNA和反义链RNA，所述有义链RNA由与靶基因中的靶序列互补的碱基序列组成，所述反义链RNA具有与所述有义链RNA互补的碱基序列，所述双链RNA能抑制所述靶基因表达，在所述双链RNA中，在所述有义链RNA及反义链的中至少一方的末端直接或通过连接体与单链多脱氧腺嘌呤相连接，所述多糖与所述单链多脱氧腺嘌呤形成复合物。
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