CN105452465A - 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺、生成鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的方法、包含所述化合物的药物组合物及其在治疗癌症中的使用方法。

Description

鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
序列表
本申请通过引用并入命名为“250_PCT1.ST25”的文件中的核苷酸序列，该文件大小为24kb，以IBM-PC机器格式创建于2014年7月27日，与MS-Windows具有操作系统兼容性，并随附提交。
相关申请
本申请要求于2013年7月31日提交的题为“SPHINGOLIPID-POLYALKYLAMINE-OLIGONUCLEOTIDECOMPOUNDS”的第61/860,274号美国临时申请的权益，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
发明领域
本文公开了包括鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺在内的鞘脂-聚烷基胺基化合物和生成鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的方法、所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物、包含所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的药物组合物及其用于调节基因表达的使用方法。所述寡核苷酸包括三链DNA和单链及双链寡核苷酸(包括反义分子)，和可用于治疗患癌受试者的RNAi分子例如双链DNA(dsDNA)，包括siRNA、siNA、miRNA、anti-miR及saRNA。
发明背景
治疗性寡核苷酸(包括双链RNA(dsRNA))在临床上的应用由于缺乏安全有效的递送系统而受到阻碍。已使用阳离子脂质来递送治疗性寡核苷酸，然而，其使用受限于细胞毒性和阳离子脂质主要在肝中累积的事实。
国际专利公开号WO2008/104978、WO2009/044392、WO2011/066475、WO2011/084193和WO2011/085056公开了经化学修饰的dsRNA，其通过引用整体并入本文。
US6,469,148中提供了用于大规模制备鞘氨醇的方法，US7,771,711中公开了鞘脂-聚烷基胺缀合物；二者均通过引用整体并入本文。
PCT公开号WO2010/150004涉及携带脂质分子的寡核苷酸及其作为基因表达抑制剂的用途。
仍然需要具有活性且安全的dsRNA治疗剂，其表现出以下中的至少之一：与未经修饰对应物相比增加的细胞摄取、增强的内体释放、增加的循环时间、有利的生物分布、降低的细胞毒性和降低的免疫原性，同时保留治疗活性。
发明概述
本文提供了含鞘脂-聚烷基胺缀合物的寡核苷酸化合物、所述化合物的制备方法及可用于生成所述化合物的中间体。本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物具有可用于例如提供与未经修饰核酸分子相比以下中的至少一者的结构和修饰：增加的细胞摄取、增强的内体释放、增加的循环时间、改进的生物分布、降低的毒性、降低的免疫原性、降低的脱靶效应(off-target)或增加的载入RISC化合物。鞘脂-聚烷基胺有益地与单链或双链核酸分子相连，并且可在癌症治疗中用作治疗剂。
在一个方面，本文提供了含鞘脂-聚烷基胺缀合物的化合物，其具有通式I：
其中
R1是支链或直链C7-C24烷基、烯基或多烯基；
R2、R3和R4各自独立地为氢、支链或直链聚烷基胺或其衍生物、核苷酸、寡核苷酸、偶联部分或保护基团；
R3’是氢、C1-C4烷基或保护基团；
A2、A3和A4各自独立地存在或不存在，但若存在则为C(O)、C(O)NHX、C(O)NHR5X、C(O)R5X、C(O)R5C(O)X、R5X或R5OC(O)X；
R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链C1-C20烃基链；
X存在或不存在，但若存在则为S、P、O或NH；
R2、R3或R4中的至少一者为支链或直链聚烷基胺或其衍生物；并且
R2、R3或R4中的至少一者为核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
或者所述化合物的盐。
在一些实施方案中，R1是C7-C24烷基、C10-C20烷基或C10-C16烷基。优选地，R1是C13烷基。
在一些实施方案中，A2是C(O)。在一些实施方案中，A4是C(O)。在一些实施方案中，R2是直链聚烷基胺或其衍生物。在一些实施方案中，R4是直链聚烷基胺或其衍生物。优选地，所述直链聚烷基胺是亚精胺或精胺。在一些实施方案中，R2是亚精胺。在其他实施方案中，R2是精胺。在一些实施方案中，R4是亚精胺。在其他实施方案中，R4是精胺。
在一些实施方案中，R3’是氢，A2是C(O)，A3不存在，R2是精胺并且在本文中提供为具有通式(Ia)的化合物：
其中
A4存在或不存在，但若存在则选自由C(O)、C(O)NHX、C(O)NHR5X、C(O)R5X、C(O)R5C(O)X,、R5X和R5OC(O)X组成的组；
R3是氢或保护基团；
R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链C1-C20烃基链；并且
每个R6独立地为氢或保护基团；
或者所述化合物的盐。
在一些实施方案中，R3’是氢，A2是C(O)，A3不存在，R2是亚精胺并且在本文中提供为具有通式(Ib)的化合物：
其中
A4存在或不存在，但若存在则选自由C(O)、C(O)NHX、C(O)NHR5X、C(O)R5X、C(O)R5C(O)X、R5X和R5OC(O)X组成的组；
R3是氢或保护基团；
R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链C1-C20烃基链；并且
每个R6独立地为氢或保护基团；
或者所述化合物的盐。
在通式I、Ia和Ib的多种实施方案中，A4是C(O)NHR5X，其中R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分。在一些这样的实施方案中，R5是C6烃基链并且X是O。
在通式I、Ia和Ib的多种实施方案中，R4是偶联部分。偶联部分可选自亚磷酰胺；胺(-NH2)；羧基(-COOH)或活化羧基包括NHS酯；巯基(-SH)和二硫键(-S-S-)，其还原为巯基；羰基(-CHO)；氰基(-CN)、羟基(-OH)和叠氮化物包括芳基叠氮化物。在一些实施方案中，R5是亚磷酰胺，例如2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺。在一些实施方案中，R4是活化羰基，优选NHS酯。
在通式I、Ia和Ib的多种实施方案中，R4是2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺，并且在本文中提供为具有如下所示通式(IIa)或(IIb)的化合物：
其中，R3和R6各自独立地为氢或保护基团。
在通式I、Ia和Ib的多种实施方案中，A4是C(O)NHR5C(O)X，R4是NHS酯，R5是C6烷基链，X是O，并且在本文中提供为具有通式IIIa或IIIb的化合物：
其中，R3、R3’和R6各自独立地为氢或保护基团。
在以上公开的任意通式的多种实施方案中，R4是寡核苷酸。所述寡核苷酸是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸，其可以被部分或完全化学修饰。
所述单链寡核苷酸为例如选自由以下组成之组的反义分子：反义DNA、反义RNA、反义DNA/RNA嵌合体、外显子跳跃分子、anti-miR、aRNA、适体、合成mRNA、lncRNA和shRNA。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是双链核酸(dsNA)分子。所述双链寡核苷酸为例如dsRNA，如siRNA、miRNA或miRNA模拟物。
在所述方法、用于使用的化合物或用途的一些实施方案中，经化学修饰的dsNA分子包含：
a.具有5’端和3’端的8至49个核苷酸的有义链；
b.长度为15至49个核苷酸的反义链，并且每条链均具有5’端和3’端；
c.反义链的15至49个核苷酸序列与靶基因RNA的连续序列互补；
d.有义链的8至49个核苷酸序列与反义链互补。
在一些实施方案中，反义链与有义链不对称，例如，有义链的长度为8至14个核苷酸，而反义链的长度为15至23个核苷酸。在一些实施方案中，反义链和有义链的长度各自独立地为19至23个核苷酸。在一些实施方案中，反义链与有义链的长度相同。在一些实施方案中，反义链和有义链的长度为19至23个核苷酸，优选19个核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含两组或更多组共价连接但并非通过共价键(即，有义链是“带切口”)相连的连续核苷酸。
在一些实施方案中，双链核酸分子是具有如下结构的双链RNA(dsRNA)：
5’(N)x-Z33(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)
其中，N和N’各自为未经修饰核糖核苷酸、经修饰核糖核苷酸或非常规部分；
其中，(N)x和(N’)y分别为寡核苷酸，其中每个连续的N或N’通过共价键与下一N或N’相连；
其中，x和y各自独立地为15至49之间的整数；
其中，z”存在或不存在，但若存在则为与有义链的5’端共价连接的封端部分；
其中，Z和Z’各自独立地存在或不存在，但若存在则为1至5个连续核苷酸或非核苷酸部分或在其所在链之3’端共价连接的其组合；
其中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与反义链的3’端、有义链的3’端或有义链的5’端中的至少一者共价连接；
其中，(N’)y的序列与(N)x的序列基本互补，并且其中(N)x包含与靶RNA中的连续序列互补的反义序列；
前提是当鞘脂-聚烷基胺缀合物与有义链的5’端相连时，z”不存在。
在dsRNA的一些实施方案中，连接各个连续的N或N’的各共价键独立地选自磷酸二酯键或磷酸二酯键。
在dsRNA的某些实施方案中，x＝y；并且x和y各自为15至49的整数，或17至40，优选18至25。在一些实施方案中，x＝y＝19、20、21、22或23。优选地，x＝y＝19或21。
在某些实施方案中，x＝y＝19。在一些实施方案中，x为19至25的整数，y为15至17的整数，从而产生具有15至17个核苷酸碱基对的dsRNA。
鞘脂-聚烷基胺缀合物优选地与有义链(N’)y的3’端、反义链(N)x的3’端或有义链(N’)y的5’端中的至少一者共价连接；在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N)x的3’端共价连接。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N’)y的3’端共价连接。(N)x或(N’)y的3’端可分别包括Z或Z’，例如鞘脂-聚烷基胺缀合物与之相连的核苷酸或非核苷酸突出(overhang)。所述化合物还可包含与有义链的5’端共价连接的封端部分(z”)。
在一些优选实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N’)y的5’端共价连接。在这样的化合物中，一个或多个核苷酸或非核苷酸部分或其组合与(N)x的3’端和/或(N)y的3’端共价连接。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N’)y的3’端或5’端相连时，Z存在。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺缀合物与(N)x的3’端或(N’)y的5’端相连时，Z存在。
在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补，(N)x的序列与靶RNA完全互补。(N’)y的序列还可与(N)x的序列完全互补，并且(N)x的序列与靶RNA部分互补。在这样的化合物中，例如，反义链[(N)x]的5’端核苷酸与靶RNA错配。
在dsRNA的一些实施方案中，N和N’各自为未经修饰的核糖核苷酸。
在dsRNA的一些实施方案中，N或N’中的至少一者为经糖修饰的核糖核苷酸。
在dsRNA的一些实施方案中，N或N’中的至少一者为选自以下的非常规部分：DNA、LNA、镜像核苷酸、2’5’连接的核苷酸和无碱基部分。
在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补，并且(N)x的序列与靶RNA完全互补。
在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补，并且(N)x的序列与靶RNA部分互补。
在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列部分互补，并且(N)x的序列与靶RNA部分互补。
在一些实施方案中，反义链[(N)x]的5’端核苷酸与靶RNA错配。
在本文所述任意通式的一些实施方案中，其中靶RNA是mRNA，优选人mRNA。在其他实施方案中，靶RNA是非编码RNA，或长或短，转录自哺乳动物基因组。
在另一个方面，本文提供了包含本文所公开化合物或所述化合物的盐及载体的组合物。在一些优选实施方案中，所述化合物包括鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，其包括上文公开的特征。在一些实施方案中，所述载体是药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物配制用于皮下、腹膜内或瘤内施用。
在第三方面，本文提供了用于在患癌受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗量的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，从而治疗癌症。
还提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或所述化合物的盐或包含所述化合物或所述化合物的盐的组合物，其用于治疗癌症。
还提供了所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或所述化合物的盐用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
在又一方面，提供了用于增强治疗性寡核苷酸内体释放入细胞之细胞质的方法，包括使所述细胞与鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸相接触，从而增强内体释放。可以使所述细胞直接与所述化合物或与所述化合物的组合物相接触。还提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，其用于增强治疗性寡核苷酸内体释放入细胞的细胞质中。
还提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物用于制备用于增加治疗性寡核苷酸内体释放入细胞之细胞质的药物的用途。
在另一方面，本文提供了鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺。所述亚磷酰胺可用于产生鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。在鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺的某些实施方案中，鞘脂是鞘氨醇；其中聚烷基胺是精胺或亚精胺。下文中还提供了合成鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺的方法。
鞘脂-聚烷基胺缀合物与寡核苷酸的偶联可以在寡核苷酸的化学合成期间或之后实施，从而形成鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物。鞘脂-聚烷基胺缀合物可以与寡核苷酸的末端或与寡核苷酸中的内在位置相连。鞘脂-聚烷基胺缀合物可偶联为亚磷酰胺、H-膦酸酯或磷酸三酯衍生物。本领域技术人员将确定合适的化合物及偶联方法。
该公开内容意在涵盖本文多种实施方案中公开的特征组合的任意和全部修改或变化。尽管本文中对具体实施方案进行了举例说明和描述，但应理解，本发明涵盖用于实现相同目的的这些实施方案之特征的任何安排。在阅读本文描述之后，形成未在本文具体描述之实施方案的上述特征之组合对于本领域技术人员而言是明显的。
附图简述
图1提供了用于生成鞘脂-精胺亚磷酰胺和鞘脂亚精胺亚磷酰胺的化学合成途径。对该合成的描述提供于下文的实施例2中。
图2是示出2，鞘脂聚烷基胺siRNA化合物的海肾荧光素酶活性剂量依赖性敲低而其未缀合的对应物并非如此的图。
图3是示出鞘脂-精胺siRNA化合物的海肾荧光素酶活性剂量依赖性敲低而其未缀合的对应物并非如此的图。
图4是示出细胞提取物和血浆中鞘脂-精胺siRNA的有义链和反义链的稳定性的PAGE凝胶的图。
图5是示出血浆中鞘脂精胺siRNA化合物的水平的图。
图6A、6B和7是示出鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物未激发免疫应答的结果的图。
图8是示出鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物未活化补体的结果的图。
图9A和9B是示出肝和脾中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累积水平的图。
图10是示出皮下施用之后LLC1肿瘤细胞中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累积水平的图。
图11是示出皮下施用之后LLC1肿瘤细胞中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累积水平的图。
图12是示出肿瘤中由鞘脂-精胺siRAC1化合物进行RAC1mRNA的RNAi介导的切割所得RACE产物的PAGE凝胶图。
图13A和13B示出未经处理和经鞘脂-精胺siRNA处理之细胞的FACS移位。
现在将描述的化合物、方法、材料和实施例仅为示例性，而无意于限制；与本文所述的那些相似或等同的材料和方法可用于实施或测试本发明。本发明的其他特征和优点将从以下详述和权利要求显而易见。
发明详述
本文公开了可用于生成鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的鞘脂-聚烷基胺衍生物，所述化合物可用于调节靶基因表达，特别是用于下调靶基因表达。本文公开的化合物表现出以下中的一个或多个：与未经修饰的双链核酸化合物相比提高的中靶(on-target)活性、降低的脱靶活性、增加的摄入细胞伴随增加的内体释放入细胞质、提高的核酸酶稳定性(核酸外切酶和/或核酸内切酶)和降低的免疫调节。不希望受到理论约束，鞘脂-聚烷基胺的存在通过在核内体中产生“质子海绵效应”为体液中的寡核苷酸提供了稳定性、增加细胞摄入并促进内体逃逸。所述分子和组合物能够下调、敲低、减弱、降低或抑制靶基因表达，并且可用于治疗患有与其中基因表达具有不利后果之疾病或病症或和/或与这样的疾病或病症相关的症状或有罹患这样的疾病或病症之风险的受试者。
因此，在某些方面，提供了可用于下调基因表达的经修饰dsRNA化合物和包含所述化合物的药物组合物。所述靶基因是哺乳动物或非哺乳动物靶基因。
定义
应注意，本文中使用的单数形式包括复数形式，另有清楚说明的内容除外。当本发明的方面或实施方案以马库什组或其他替代组的形式描述时，本领域技术人员将认识到本发明还因而以任意单独成员或组成员之亚组的形式描述。
本文所用术语“抑制”是指将基因的表达或所述基因之产物的活性降低至足以获得期望的生物或生理效应的程度。抑制是完全抑制或部分抑制。
术语“dsNA”和“ssNA”还包括saNA(短活化核酸)分子，其以转录和/或转录后水平诱导靶基因表达。例如，活化NA可通过靶向基因启动子诱导相关基因的有效转录活化。
本文公开的dsNA分子可利用本领域技术人员已知的技术化学地或生物地合成。
“siNA抑制剂”、“dsRNA抑制剂”、“dsRNA分子”是能够将基因表达或所述基因之产物的活性降低至足以实现期望的生物或生理效应之程度的化合物。本文所用术语“siNA抑制剂”是指siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA中的一个或多个。抑制还可指下调，或者对于RNAi而言沉默。dsRNA分子包括有义链和反义链，所述有义链也称为过客链，其与靶RNA具有同源性；所述反义链也称为引导链，其与有义链完全或部分互补。
本文所用术语靶基因的“抑制”或“基因表达的下调”意指基因表达(转录或翻译)或多肽活性的抑制。靶RNA序列的多核苷酸序列是指靶mRNA、靶RNA或与靶mRNA或RNA优选地具有至少70％同一性、更优选80％同一性、甚至更优选90％或95％同一性的其任意同源序列。因此，本发明涵盖本文所述经过突变、改变或修饰的多核苷酸序列。术语“mRNA多核苷酸序列”和“mRNA”可互换使用。
术语“靶RNA”是指与dsNA或ssNA的至少一条链同源或互补或者与miRNA具有同源性的RNA分子。靶RNA分子可以是mRNA(信使RNA)和lncRNA(长非编码RNA)或lincRNA(大基因间非编码RNA)，包括但不限于天然反义RNA(ASRNA)和eRNA(增强子RNA)以及pre-miRNA或pro-miRNA。未经加工的mRNA、核糖体RNA和病毒RNA序列也可以是靶标。
靶RNA通常由dsNA或ssNA调节。调节通常是指转录后下调(例如，通过RNAi或AS活性)或上调(例如，通过anti-miR活性)。在一些实施方案中，ss-或dsNA(单链或双链核酸)可以调节其靶RNA而不影响其水平，而非通过调节其功能(例如，阻断miRNA活性的anti-miR)。在其他实施方案中，靶RNA是指在NA与靶标之间不存在直接序列同源性时其水平受ssNA和/或dsNA影响的RNA。这可发生在例如当靶RNA表达的活化在转录水平而非转录后水平实现时的RNAa情况下。
本文所用术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，指包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)在内的核苷酸序列。该术语应理解为包括由核苷酸类似物产生的RNA或DNA类似物作为等同物。贯穿本公开，给出了mRNA序列代表相应的基因。
“寡核苷酸”或“低聚物”是指约2至约100个核苷酸或更长的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。在一些实施方案中，所述寡核苷酸是mRNA。所述寡核苷酸中的每个DNA或RNA核苷酸可以独立地为天然的或合成的，和/或经修饰或未经修饰的。修饰包括糖、碱基和核苷酸间修饰。本文所公开的寡核苷酸包括单链分子和双链分子，其调节基因表达。寡核苷酸包括反义分子(经RNAi或RNASEH机制切割的分子，包括DNA，RNA或DNA/RNA嵌合体)、双链RNA(dsRNA)(包括siRNA、siNA、miRNA、saRNA等)、抗miR、miR模拟物、核酶、适体、外显子跳跃分子、合成mRNA等。“调节基因表达”包括下调(例如，siRNA)基因表达或上调(例如，saRNA)基因表达。
如本文中使用的，“接头(linker)”和“键(linkage)”是指连接一个化学部分与另一化学部分的一个或多个原子，例如鞘脂-聚烷基胺与亚磷酰胺或鞘脂-聚烷基胺与寡核苷酸。接头是含一个原子或例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个原子的链的核苷酸或非核苷酸剂，所述原子包括碳、氧、硫、氮和磷原子或其组合。接头的实例包括相对低分子量的基团，例如酰胺、酯、碳酸酯和醚，以及较高分子量的连接基团，例如聚乙二醇(PEG)以及烷基链。
本文所用术语“双链体区”是指双链分子中的区，其中两个互补或基本互补的寡核苷酸彼此形成碱基对，通常通过沃森-克里克碱基配对或通过允许双链体形成的任何其他方式。例如，具有19、20、21、22个核苷酸单元的寡核苷酸链可以与19、20、21、22个核苷酸单元的互补寡核苷酸碱基配对，或者可以与每条链上的15、16、17或18个核苷酸碱基配对，使得该“双链区”由15、16、17或18个碱基对组成。其余碱基对可以例如作为5’和3’突出存在。另外，在双链体区内，不要求100％的互补性；允许在双链体区内基本互补。
本文所用术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘，优选氟、氯或溴。
术语“(C7-C24)烷基”通常是指具有7至24个碳原子的直链或支链烃基并且包括例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2,2-二甲基丙基、正己基、正庚基、正辛基等。优选(C10-C14)烷基，最优选甲基和乙基。术语“(C2-C8)烯基”和“(C2-C8)炔基”通常分别指具有2-8个碳原子和1个双键或三键的直链和支链的烃基，包括乙烯基、3-丁烯-1-基、2-乙烯基丁基、3-辛烯-1-基等，和丙炔基、2-丁炔-1-基、3-戊炔-1-基等。优选(C2-C6)烯基和炔基，更优选(C2-C4)烯基和炔基。
术语“(C1-C8)亚烷基”通常是指具有1至8个碳原子的二价直链或支链烃基，包括例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、2-甲基亚丙基、亚戊基、2-甲基亚丁基、亚己基，2-甲基亚戊基、3-甲基亚戊基、2,3-二甲基亚丁基、亚庚基、亚辛基等。优选(C1-C4)亚烷基，更优选(C1-C2)亚烷基。
“偶联部分”是包含用于实际缀合方法之靶标的官能团。偶联部分的非限制性实例如下：亚磷酰胺；胺(–NH2)；羧基(-COOH)或活性羧基包括NHS酯；巯基(-SH)和二硫键(-S-S-)，其被还原成巯基；羰基(-CHO)；氰基(-CN)；羟基(-OH)；叠氮化物，包括芳基叠氮化物。
本文所用术语“胺保护基团”是指这样的化学部分，其在期望时可以容易地附接到胺基(并形成被保护的胺)以保护所述胺免受非期望的化学反应而后在稍后的点从所述受保护的胺去除以露出原始的胺。胺保护基团的实例可见于参考文献例如Green和Wuts(1991，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，Wiley，NewYork，第2版)和Bodansky(1993，PrinciplesofPeptideSynthesis，Springer，Berlin)中。胺保护基团的实例包括但不限于乙酰基、苯甲酰基、苄氧羰基、对甲氧苄基羰基、甲氧羰基、叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基(FMOC)、苄基、氨基甲酸酯基、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基(DMPM)、对甲氧基苯基(PMP)、单甲氧基三苯甲基(MMT)、二甲氧三苯甲基(DMT)和甲苯磺酰基。
术语“羟基保护基团”，也称为“醇保护基团”，是指这样的化学部分，其在期望时可以容易地附接到羟基(并形成被保护的羟基)以保护所述羟基免受非期望的化学反应而后在稍后的点从所述受保护的羟基去除以露出原始的羟基。羟基保护基团的实例在本领域中是公知的，并且可见于Green和Wuts(1991，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，Wiley，NewYork，第二版)和Bodansky(1993，PrinciplesofPeptideSynthesis，Springer，Berlin)。羟基保护基团的非限制性实例包括4,4'-二甲氧三苯甲基(DMT)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)、三甲基甲硅烷基(TMS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、乙酰基、苄基和苯甲酰基。
本文所用术语“磷酸根部分”是指通式-[O-P(O)(R')-O]2-的单磷酸根部分、通式-[O-P(O)(R')-O-P(O)(R')-O]3-的二磷酸根部分、或通式-[O-P(O)(R')-O-P(O)(R')-O-P(O)(R')-O]4-的三磷酸根部分，其中R'各自独立地为O-、S-、BH3 -或N-，优选这样的单、二和三磷酸根部分，其中(i)R'各自为O-；或(ii)R'中之一，优选与α位磷酸根原子相连的R'，为S-或BH3 -，而其它R'为O-，以及其任何质子化形式。优选如上所定义的单磷酸根部分，例如–[O-PO3]2-、-[O-PO2S]2-和-[O-PO2(BH3)]2-，更优选-[O-PO3]2-。
本文所用术语“磷酸根连接部分”是指通式-[O-P(O)(R')]-的部分，其中R'是O-、S-、BH3 -或N-，优选O-、S-或BH3 -，更优选O-，及其质子化形式。
本文所用术语“鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺”是指可用于共价连接鞘脂-聚烷基胺与核苷酸的鞘脂-聚烷基胺亚酰胺衍生物。
术语“鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子”和“鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物”可互换并且指与鞘脂-聚烷基胺缀合物相连的寡核苷酸。在一些非限制性实施方案中，鞘脂-聚烷基胺是鞘脂-精胺或鞘脂-亚精胺。
术语“保护基团”是指稳定反应性基团/官能团的反应性基团/官能团的化学修饰。用于寡核苷酸合成的保护基团的实例包括用于保护5’羟基的DMT或用于保护2’-羟基的TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)或TOM(三异丙基甲硅烷基氧基甲基)。TFA保护不稳定的胺基。
本文所公开的多种核苷类似物可以根据本领域中已知的任何合适的技术或规程合成，并且优选地包括合成步骤期间存在胺和/或羟基保护基团。
在一些实施方案中，寡核苷酸是单链寡核苷酸例如反义分子。在一些实施方案中，寡核苷酸是反义分子。在一些实施方案中，反义分子包含DNA。在其他实施方案中，反义寡核苷酸是DNA/RNA嵌合体，例如公开在美国专利号6,410,323和6,426,220中。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸是双链寡核苷酸例如siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方案中，双链分子还包含至少一个2’O烷基糖修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，所述2’O-烷基糖修饰的核糖核苷酸包含2’O-甲基(甲氧基)糖修饰或2’甲氧基乙基(2’MOE)糖修饰。其他反义修饰包括核苷酸间键修饰，包括硫代磷酸酯键。
根据一个方面，本文提供了鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸dsRNA分子，其包含未修饰的和经修饰的核糖核苷酸(例如2’O-甲基(2’OMe)或2’脱氧基、2’氟代(2’Fl)糖修饰的核糖核苷酸)，任选至少一个非常规部分和至少一个鞘脂-聚烷基胺部分。在一些实施方案中，经化学修饰的dsRNA包含至少一个选自由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键修饰的组的经修饰核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核糖核苷酸是2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链中的一些或全部嘧啶核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链中的一些或全部嘌呤包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些优选实施方案中，反义链在核酸酶敏感位置包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些优选实施方案中，反义链在核酸酶敏感位置包含2’Fl糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链在核酸酶敏感位置包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链(例如，(N’)y)包含一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA在化合物的3’末端是平端的，即所述dsRNA或siRNA在由有义链或过客链的3'端和反义链或引导链的5'端限定的端处为平端。在一些实施方案中，所述3’端包含3’Pi(3’端磷酸)。在一些实施方案中，所述5’端包含5’Pi(5’端磷酸)。
在一些实施方案中，双链分子还包含至少一个选自由具有糖修饰、碱基修饰或核苷酸间键修饰的核糖核苷酸组成的组的经修饰核糖核苷酸，并且可包含一个或多个非常规部分，包括DNA、TNA(苏糖核酸)、LNA(锁核酸)、ENA(乙烯桥联核酸)、L-DNA和L-RNA、PNA(肽核酸)、阿糖胞苷、膦酰基羧酸或膦基羧酸核苷酸(PACE核苷酸)、或具有6碳糖的核苷酸。对于本文描述的分子而言，使用所有类似物或对核苷酸/寡核苷酸的修饰，前提是所述类似物或修饰不会显著不利地影响核苷酸/寡核苷酸的性质，例如功能。
在一些实施方案中，核苷酸选自具有天然的或经合成修饰的碱基的那些。天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的经修饰碱基包括吡唑并三嗪、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、核糖-2-硫代尿苷、核糖-4-硫代尿苷、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其他8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤，其他氮杂和去氮杂腺嘌呤，其他氮杂和去氮杂鸟嘌呤、5-甲基鸟苷、5-三氟甲基尿嘧啶、5-甲基胞苷和5-三氟胞嘧啶。在一些实施方案中，低聚物中的一个或多个核苷酸被肌苷取代。
经修饰脱氧核糖核苷酸包括例如5’OMeDNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3'-磷酸)；PACE(脱氧核糖腺苷3'膦酰乙酸、脱氧核糖胞苷3'膦酰乙酸、脱氧核糖鸟苷3'膦酰乙酸、脱氧核糖胸苷3'膦酰乙酸)。
桥联核酸包括LNA(2'-O，4'-C-亚甲基桥联核酸腺苷3'单磷酸、2'-O，4'-C-亚甲基桥联核酸5-甲基-胞苷3'单磷酸、2'-O，4'-C-亚甲基桥联核酸鸟苷3'单磷酸，5-甲基-尿苷(或胸苷)3'单磷酸)；和ENA(2'-O，4'-C-亚乙基桥联核酸腺苷3'单磷酸、2'-O，4'-C-亚乙基桥联核酸5-甲基-胞苷3'单磷酸、2'-O，4'-C-亚乙基桥联核酸鸟苷3'单磷酸、5-甲基-尿苷(或胸苷)3'单磷酸)。
糖修饰包括在糖残基的2’部分的修饰，并且涵盖氨基、氟、烷氧基(例如甲氧基)、烷基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫酯、C1-C10低级烷基、经取代低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基等，如欧洲专利EP0586520B1或EP0618925B1中所述。
在一个实施方案中，经修饰分子包含至少一个在糖部分包含2’修饰(“2’糖修饰)的核糖核苷酸。在某些实施方案中，经糖修饰的部分包含2’O-烷基或2’-氟或2’O-烯丙基或任何其他2’修饰。在一些实施方案中，优选的2’O-烷基是2’O-甲基(甲氧基)糖修饰。其它稳定用修饰也是可能的(例如，末端修饰)。
在一些实施方案中，寡核苷酸的主链经修饰，并且包含磷酸酯-D-核糖实体，但也可以含有硫代磷酸酯-D-核糖实体、三酯、硫酯(thioate)、2’-5’桥联主链(也可以称为2’5’连接的核苷酸或5’-2’)、PACE等。其他修饰包括可逆或不稳定的磷酸三酯键，例如分别在US2009093425和US2011294869中公开的。
本文所用术语“非配对核苷酸类似物”是指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，包括但不限于：6脱氨基腺苷(Nebularine)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、DS、Pa、N3-MEriboU、N3-MEriboT、N3-MEdC、N3-ME-dT、N1-ME-dG、N1-ME-dA、N3-乙基-dC、N3-MEdC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸(2’OH)。在其他实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是脱氧核糖核苷酸(2’H)。此外，多核苷酸类似物可以制备为其中的一个或多个核苷酸的结构基本上是改变的，因而更适合作为治疗剂或实验剂。核苷酸类似物的一个例子是其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸主链被替换为与肽中所见类似的聚酰胺主链的肽核酸(PNA)。PNA类似物已被证明耐受酶降解，并在体内和体外有增强的稳定性。其他修饰包括聚合物主链、环状主链、非环状主链、硫代磷酸酯-D-核糖主链、三酯主链、硫酯主链、2’-5’桥联主链、人工核酸、吗啉代核酸、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸酸(TNA)、阿拉伯糖苷和镜像核苷(例如，β-L-脱氧核糖核苷代替的β-D-脱氧核糖核苷)。包括LNA核苷酸在内的siRNA化合物的实例在Elmen等(NAR2005年，33(1)：439-447)中公开。
其他修饰包括3’端修饰，也称为封端部分。这样的末端修饰选自由以下组成的组：核苷酸、经修饰核苷酸、脂质、肽、糖和反向无碱基部分。这样的修饰并入例如在有义和/或反义链的3’端。
本文所用术语“封端部分”包括无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、修饰无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分，包括2’O烷基修饰；反向无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分及其修饰；C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5’O-ME核苷酸；和核苷酸类似物，包括4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯，3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-脱水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏呋喃戊糖基核苷酸；无环3',4'-开环核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸、5'-5'-反向无碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；和桥联或非桥联甲基磷酸酯和5'-巯基部分。
某些优选的封端部分是无碱基核糖或无碱基脱氧核糖部分；反向无碱基核糖或无碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA。在一些实施方案中，用一个或多个反向核苷酸例如反向胸苷或反向腺苷来合成所述分子(参见，例如，Takei等，2002，JBC277(26)：23800-06)。在一些实施方案中，反向无碱基脱氧核糖部分与有义链(N’)y的5’端共价连接。
“末端官能团”包括卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基。
本文所用术语“非常规部分”是指无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、经修饰脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸键与相邻核苷酸相连的核苷酸；吡唑并三嗪核苷酸类似物、苏糖核酸(TNA)部分；解锁核酸(UNA)、桥联核酸，包括锁核酸(LNA)和亚乙基桥联核酸(ENA)和吗啉代化合物。
“TNA”是指(L)-α-苏呋喃糖基核苷酸。该TNA亚磷酰胺通过(3'–->2')磷酸二酯键与相邻TNA、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸相连。TNA包含四碳糖(Schoning等，Science2000.290：1347-51)。在一些实施方案中，除了TNA之外，所述siRNA化合物还包含至少一个选自由具有糖修饰、碱基修饰或核苷酸间键修饰的核糖核苷酸组成的组的经修饰核糖核苷酸，并且可包含DNA、镜像核苷酸(L-DNA，L-RNA)和经修饰核苷酸例如LNA(锁核酸)、ENA(亚乙基桥联核酸)、PNA(肽核酸)、阿糖胞苷、膦酰基羧酸或膦基羧酸核苷酸(PACE核苷酸)或含6碳糖的核苷酸。
在本文中有时所称“无碱基核苷酸”或“无碱基核苷酸类似物”更适当地指假核苷酸或非常规部分。核苷酸是核酸的单体单元，由核糖或脱氧核糖、磷酸和碱基(DNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；RNA中的腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。经修饰核苷酸在糖、磷酸和/或碱基中的一者或更多者中包含修饰。无碱基假核苷酸缺少碱基，因而在严格意义上并非核苷酸。无碱基脱氧核糖部分包括例如无碱基脱氧核糖-3’-磷酸酯；1,2-二脱氧-D-核糖呋喃基-3-磷酸酯；1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸酯。反向无碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖无碱基；3’,5’反向脱氧无碱基5’-磷酸酯。
“镜像”核苷酸是与天然核苷酸或常用核苷酸具有相反手性的核苷酸，即天然核苷酸(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)，在镜像核糖核苷酸的情况也称为L-RNA，和“镜像异构体(spiegelmer)”。镜像核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸并且还可包含至少一个糖、碱基和/或主链修饰。参见美国专利号6,586,238。此外，美国专利号6,602,858公开了核酸催化剂，其包含至少一个L核苷酸取代。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸(镜像dT)和L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3'-磷酸(镜像rG)；L-尿苷-3’-磷酸(镜像dU)。
在一些实施方案中，经修饰核糖核苷酸是经2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链中的一些或全部嘧啶核糖核苷酸包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链中的一些或全部嘌呤包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些优选实施方案中，反义链在核酸酶敏感位置包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链在核酸酶敏感位置包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链[例如(N’)y]包含一个或多个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，siRNA在化合物的3’端为平端，即dsRNA或siRNA在由有义链或过客链的3'端和反义链或引导链的5'端限定的端为平端。
在其他实施方案中，所述两条链中至少有一条在3’端具有至少一个核苷酸的3’突出；该突出包含至少一个脱氧核糖核苷酸。所述链中的至少一条任选地在3’端包含至少一个核苷酸的突出。该突出由约1至约5个核苷酸组成。
在多个实施方案中，所述突出独立地选自核苷酸、非核苷酸及其组合。在一些实施方案中，Z和/或Z'各自独立地包含C2、C3、C4、C5或C6烷基部分，任选C3[丙烷，-(CH2)3-]部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH)、丙二醇和丙二醇的磷酸二酯衍生物(“C3Pi”)。在一些优选实施方案中，Z和/或Z'各自包含两个烃部分，并且在一些实例中是C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。每个C3通过共价键与相邻C3共价缀合，优选磷酸基键。在一些实施方案中，磷酸基键是硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯或磷酸二酯键。
在一个特定实施方案中，x＝y＝19并且Z包含C3-C3。在一些实施方案中，所述C3-C3突出通过共价键(例如磷酸二酯键)与(N)x或(N’)y的3’端共价连接。在一些实施方案中，第一个C3与第二个C3之间的键是磷酸二酯键。在一些实施方案中，3’非-核苷酸突出是C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，3’非-核苷酸突出是C3Pi-C3Ps。在一些实施方案中，3’非-核苷酸突出是C3Pi-C3OH(OH是羟基)。在一些实施方案中，3’非-核苷酸突出是C3Pi-C3OH。
在多个实施方案中，所述烷基部分包含烷基衍生物，包括C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基部分，其包含末端羟基、末端氨基或末端磷酸基。在一些实施方案中，所述烷基部分是C3烷基或C3烷基衍生物部分。在一些实施方案中，所述C3烷基部分包括丙醇、丙基磷酸酯或丙基硫代磷酸酯或它们的组合。
C3烷基部分通过磷酸二酯键与(N’)y的3’端和/或(N)x的3’端共价连接。在一些实施方案中，所述烷基部分包括丙醇、丙基磷酸酯或丙基硫代磷酸酯。
在其他实施方案中，所述两条链中至少有一条在3'端具有至少一个核苷酸的3’突出；该突出包含至少一个脱氧核糖核苷酸。所述链中的至少一条任选地在3'端包含至少一个核苷酸的突出。该突出由约1至约5个核苷酸组成。
RNA双链体的长度为约15至约49个核糖核苷酸，或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49、优选18至40、18至27、18至25或19至23个核糖核苷酸。在一些实施方案中，每条链(低聚物)的长度独立地选自由约18至约40个核苷酸、优选18至27、18至25、19-23、更优选19个核糖核苷酸组成的组。
在一些实施方案中，dsRNA的反义链与靶核酸之间的互补性是完美的。在其他实施方案中，所述经修饰siRNA化合物的反义链与靶核酸基本互补，即所述反义链与靶核酸之间有一个、两个或多至三个错配。在一些实施方案中，反义链与靶mRNA在5’端核苷酸处错配。
在某些实施方案中，dsRNA分子的反义链与有义链之间的互补性是完美的。在一些实施方案中，所述链基本互补，即所述反义链与所述有义链之间有一个、两个或多至三个错配。在一些实施方案中，反义链与有义链完全互补。
寡核苷酸
反义
术语“反义”(AS)或“反义片段”是指具有抑制反义活性的寡核苷酸片段(包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或两者的混合物)，所述活性引起靶基因内源性基因组拷贝的表达减少。AS的序列被设计为与感兴趣的靶mRNA互补，并形成RNA：AS双链体。此双链体形成可以防止相关mRNA的加工、剪切、转运或翻译。此外，某些AS核苷酸序列可以在与它们的靶mRNA杂交时激发细胞RNaseH活性，导致mRNA降解(Calabretta等，1996：Antisensestrategiesinthetreatmentofleukemias.SeminOncol.23(1)：78-87)。在这种情况下，RNaseH将切割双链体的RNA组分并且可潜在释放AS从而进一步与靶RNA的其他分子杂交。另一种作用(action)模式是AS与基因组DNA相互作用的结果，从而形成可转录失活的三链螺旋(triplehelix)。
许多评论都涉及反义(AS)技术及其治疗潜力的主要方面(参见例如，Wright和Anazodo，1995.AntisenseMoleculesandTheirPotentialForTheTreatmentOfCancerandAIDS.CancerJ.8：185-189；Scanlon等，1995Oligonucleotides-mediatedmodulationofmammaliangeneexpression.FASEBJ.9：1288；Gewirtz，1993.Oligodeoxynucleotide-basedtherapeuticsforhumanleukemias，StemCellsDayt.11:96)。
反义寡核苷酸的序列靶片段选择为使得该序列显示出适合的对于与其互补模板的寡核苷酸双链体形成而言重要的能量相关特征，并显示出就自二聚或自互补而言的低潜力(Anazodo等，1996)。例如，计算机程序OLIGO(引物分析软件，3.4版)可用来确定反义序列解链温度、自由能特性，并估计潜在自二聚体形成和自互补性质。该程序允许这两个参数的定性估计的判定(潜在二聚体形成和自互补)，并提供了“无潜力”或“一些潜力”或“基本上完全潜力”的指示。使用这个程序，一般将靶片段选择为具有这些参数没有潜力的估计。然而，其中一类具有“一些潜力”的片段可用。如在本领域中已知的，在选择中利用参数的平衡。此外，寡核苷酸同样根据需要来选择，使得类似物替代基本上不影响功能。
硫代磷酸酯反义寡核苷酸在有效浓度时通常不显示显著的毒性，并且在动物中表现出充足的药代动力学半衰期(Agrawal，1996.Antisenseoligonucleotides：towardsclinicaltrials，TIBTECH，14：376)，并且是核酶抗性的。
单链寡核苷酸已示出在RNAi中工作，参见例如Lima等,(2012)Cell150：883-894，并由Davidson和Monteys(2012)Cell150：873-875综述。
RNAi寡核苷酸
细胞中长dsRNA的存在激发被称为“dicer”的核糖核酸酶III酶的活性(Bass，2000，Cell，101，235；Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Hammond等，2000，Nature，404，293)。Dicer参与dsRNA加工为称为siNA或siRNA的短dsRNA段(piece)(Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Bass，2000，Cell，101，235；Berstein等，2001，Nature，409，363)。来源于dicer活性的短干扰RNA的长度通常为约21至约23个核苷酸，并且包括约19个碱基对的双链体(Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Elbashir等，2001，GenesDev.，15，188)。Dicer还参与从与翻译控制有关的保守结构的前体RNA切割21-和22-个核苷酸小临时RNA(stRNA)(Hutvagner等，2001，Science，293，834)。RNAi应答的特征还在于核酸内切酶化合物，通常称为RNA诱导的沉默化合物，其介导具有与siRNA双链体之反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间(Elbashir等，2001，GenesDev.，15，188)。
已对多种系统中的RNAi进行了研究。Fire等，1998，Nature，391，806，首先观察了秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的RNAi.Bahramian和Zarbl，1999，MolecularandCellularBiology，19，274-283以及Wianny和Goetz，1999，NatureCellBiol.，2，70描述了哺乳动物系统中的dsRNA介导的RNAi。Hammond等，2000，Nature，404，293描述了用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等，2001，Nature，411，494和Tuschl等，国际PCT公开号WO01/75164描述了通过在包括人胚肾细胞和HeLa细胞在内的培养的哺乳动物细胞中引入合成21-核苷酸RNA的双链体诱导的RNAi。对果蝇胚胎裂解物的研究(Elbashir等，2001，EMBOJ.，20，6877和Tuschl等，国际PCT公开号WO01/75164)披露了对介导高效RNAi活性所必需的siRNA长度、结构、化学组成和序列的某些要求。
核酸分子(例如，具有本文所公开的结构特征)可通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制；参见例如，Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公开号WO01/36646；Fire，国际PCT公开号WO99/32619；Mello和Fire，国际PCT公开号WO01/29058；Li等，国际PCT公开号WO00/44914；Hutvagner和Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等，2002，RNA，8，842-850。
对应于已知基因的siRNA的选择和合成已有广泛报道；(参见例如Ui-Tei等，JBiomedBiotech.2006；2006：65052；Chalk等，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.MolBiol.；2004，252：457-69；Levenkova等，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等，NAR.2004，32(3)：936-48；DePaula等，RNA2007，13：431-56)。
例如，经修饰siRNA的用途和生成，参见例如，Braasch等，Biochem.2003，42(26)：7967-75；Chiu等，RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公开WO2004/015107(atugenAG)和WO02/44321(Tuschl等)。美国专利号5,898,031和6,107,094描述了经化学修饰的低聚物。美国专利公开号2005/0080246和2005/0042647分别涉及具有交替基序的低聚化合物和具有经化学修饰核苷酸间键的核酸分子。
其他修饰已被公开。5'-磷酸酯部分的并入示出增强果蝇胚胎中siRNA的活性(Boutla等，Curr.Biol.2001，11:1776-1780)，并且为人HeLa细胞中的siRNA功能所需(Schwarz等，Mol.Cell，2002，10：537-48)。Amarzguioui等(NAR，2003，31(2)：589-95)示出siRNA的活性依赖于2’-O-甲基修饰的定位。Holen等(NAR2003，31(9)：2401-07)报道了具有小数量的2’-O-甲基修饰核苷的siRNA给出与野生型相比良好的活性，但该活性随2’-O-甲基修饰核苷数目的增加而降低。Chiu和Rana(RNA.2003，9：1034-48)描述了在有义或反义链(完全修饰链)中经2’-O-甲基修饰的核苷的并入相对于未经修饰siRNA而言显著降低了siRNA活性。据报道，在反义链5'端置入2’-O-甲基严重限制活性而置于反义的3'端和有义的两端被耐受(Czauderna等，NAR2003，31(11)：2705-16；WO2004/015107)。本文所公开的分子提供了这样的优点，即它们稳定且活跃，而且可用于制备用于治疗各种疾病的药物组合物。
属于本发明共同受让人并通过引用整体并入本文的PCT专利公开号WO2008/104978、WO2009/044392、WO2011/066475和WO2011/084193公开了dsRNA结构。
属于本发明共同受让人的PCT公开号WO2008/050329和美国第11/978,089号涉及促凋亡基因的抑制剂，并通过引用整体并入本文。
PCT专利公开号WO2004/111191和WO2005/001043涉及用于增强RNAi的方法。
目前正在积极研究microRNA在癌症中的作用，并且用于基因调节的新靶标正在连续鉴定出来，参见例如Iorio和Croce(2012)EMBOMolMed4：143-159和Chen等,(2012)J.Biomed.Sci.19：90。
本文提供了将靶基因的表达调节为与对照相比至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括使靶基因的mRNA转录物与本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物相接触。
还提供了本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物，其用于将靶基因的表达调节为与对照相比至少20％、30％、40％或50％。
还提供了本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于制备用于将靶基因的表达调节为与对照相比至少20％、30％、40％或50％的药物的用途。
本文还提供了一种在哺乳动物中将靶基因的表达调节为与对照相比至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括将本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子施用于所述哺乳动物。
本文还提供了本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子用于将哺乳动物中靶基因的表达调节为与对照相比至少20％、30％、40％或50％。
本文还提供了本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子在制备用于将将哺乳动物中靶基因的表达调节为与对照相比至少20％、30％、40％或50％的药物中的用途。
在一些优选实施方案中，所述哺乳动物是人。
调节基因表达是下调基因表达或上调基因表达。在一些实施方案中，调节基因表达是上调基因表达。在一些优选的实施方案中，调节基因表达是下调基因表达。在一些实施方案中，下调基因表达通过RNAi的方式发生。
在多种实施方案中，靶基因表达的下调选自由以下组成的组：下调基因功能(其例如通过用天然基因/多肽等的已知相互作用因子进行酶测定或结合测定来研究)、下调基因的多肽产物(其例如通过Western印迹、ELISA或免疫沉淀等来研究)和下调基因的mRNA表达(其例如通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交等来研究)。
在其他实施方案中，调节是上调，并且靶基因表达的上调选自由以下组成的组：上调基因功能(其例如通过用天然基因/多肽等的已知相互作用因子进行酶测定或结合测定来研究)、上调基因的多肽产物(其例如通过Western印迹、ELISA或免疫沉淀等来研究)和上调基因的mRNA表达(其例如通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交等来研究)。
在一些优选实施方案中，可用于与鞘脂-聚烷基胺缀合的寡核苷酸是RNA干扰(RNAi)寡核苷酸。RNAi寡核苷酸是基于核酸的分子，其能够以哺乳动物细胞的RNA干扰途径机制通过相互作用诱导RNA干扰，从而以序列特异性方式降解或抑制转基因的信使RNA(mRNA)转录物的翻译。两种主要的RNAi寡核苷酸是小(或短)干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA或miR)。RNAi寡核苷酸可以例如反义RNA、siRNA、siNA、miRNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)。RNAi寡核苷酸可以采用标准的合成剂化学合成或采用编码能够诱导RNAi之RNA能的表达盒重组合成。在一些实施方案中，寡核苷酸是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。单链寡核苷酸包括反义分子(DNA、RNA或DNA/RNA嵌合体)和miRNA模拟物。双链寡核苷酸包括siRNA、siNA、shRNA和miRNA。
RNAi寡核苷酸可以采用标准的合成剂化学合成或采用编码能够诱导RNAi之RNA的表达盒重组合成。RNAi多核苷酸表达盒可以在细胞中转录产生小发夹RNA，其可作为siRNA，独立的有义和反义链线性siRNA或miRNA起作用。RNA聚合酶III转录的DNA包含选自如下列表中的启动子：U6启动、H1启动子和tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括U1、U2、U4和U5启动子、snRNA启动子、微小RNA启动子和mRNA启动子。
siRNA包含双链结构，该双链结构一般含有15至49个碱基对，优选18至25个碱基对，并与在细胞中表达的靶基因或RNA中的编码序列具有相同(完美互补)或几乎相同(部分互补)的核苷酸序列。siRNA可具有双核苷酸3'突出。siRNA可以由两个退火的多核苷酸或形成发夹结构的单个多核苷酸构成。本发明的siRNA分子包含有义区和反义区。在一个实施方案中，缀合物的siRNA由两个寡核苷酸片段装配而成，其中一个片段包含所述siRNA分子的反义链的核苷酸序列，第二片段包含所述siRNA分子的有义区的核苷酸序列。在另一个实施方案中，有义链通过接头分子与反义链相连，所述接头分子例如多核苷酸接头或非核苷酸接头。微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA基因产物，其长度为约22个核苷酸并且指导其靶mRNA的破坏或翻译抑制。如果miRNA与靶mRNA之间的互补性是局部的，则靶mRNA的翻译被抑制。如果互补是广泛的，则靶mRNA被切割。对于miRNA，所述化合物与通常位于mRNA的3'UTR的靶位点相结合，该靶位点通常与所述miRNA具有仅部分同源性。“种子区(seedregion)”–miRNA的5'端上与其靶标形成完美碱基配对的约七(7)个连续核苷酸延伸-对miRNA特异性起着关键作用。RISC/miRNA化合物与mRNA的结合可导致蛋白质翻译的抑制或mRNA的切割和降解。最近的数据表明，如果沿所述miRNA的整个长度具有完美同源性并且代之以其靶标仅在种子区示出完美碱基配对，则mRNA切割优先发生(Pillai等，2007)。
示例性鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸
下文提供的实例具有19个核苷酸的双链体区；然而，本文中公开的核酸分子可以具有15至49个核苷酸或18至40个核苷酸的任意位置双链体区，并且其中每条链的长度独立地为18至40个核苷酸。在每个双链体中，反义链(N)x示出在上面。“SL”是指鞘脂-聚烷基胺缀合物。鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸(双链核酸分子)的非限制性实例具有以下结构：鞘脂-聚烷基胺-dsRNA分子的非限制性实例具有如下结构(在上的链5’>3’代表反义链，在下的链3’>5”代表正义链)：
5’(N)19
3’SL-(N’)19
5’(N)19
3’(N’)19-SL
5’(N)19-SL
3’(N’)19
5’(N)19-C3Pi-C3Pi
3’(N’)19-SL
5’(N)19-C3Pi-C3Pi
3’PiC3-(N’）19-SL
5’(N)19-dTdT
3’PiC3-(N’)19-SL
5’(N)19-dTdT
3’dTdT-(N’)19-SL
5’(N)19-C3Pi-C3Pi
3’dTdT-(N’)19-SL
5’(N)19-dTdT-SL
3’PiC3-（N’)19-SL
5’(N）19-C3Pi-C3Pi
3’SL-(N’)19-z”
5’(N)19-C3Pi-C3Pi
3’HOC3-(N’)19-SL
其中N和N’各自独立地为未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸或非常规部分；
其中每个N通过共价键与相邻的N相连；
其中每个N’通过共价键与相邻的N’相连；
其中SL是与反义链或有义链的5’端或3’端共价连接的鞘脂-聚烷基胺缀合物；
其中C3OH、C3Pi等是指共价连接在链的3’端的C3非核苷酸部分；
其中dTdT是指胸苷二核苷酸；
其中z”是共价连接在有义链的5’端的封端部分。
对于所有上述结构，在一些实施方案中，(N)x的寡核苷酸序列与(N’)y的寡核苷酸序列完全互补。在其他实施方案中，反义链和有义链基本互补。在某些实施方案中，(N)x与哺乳动物mRNA完全互补。在其他实施方案中，(N)x与哺乳动物的mRNA基本互补。
还提供了一种药物组合物，其包含有效抑制哺乳动物或非哺乳动物基因表达的量的本文所公开鞘脂-聚烷基胺化合物和药学上可接受的载体，及其用于治疗本文所公开的任一疾病和病症的用途。在一些实施方案中，哺乳动物基因是人基因。在一些实施方案中，所述非哺乳动物基因与哺乳动物疾病优选人疾病有关。
还提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防本文所公开癌症的发病率或严重性或用于降低本文所公开癌症的风险或严重性的方法，其中所述癌症和/或症状或相关风险与哺乳动物基因或非哺乳动物基因的表达相关，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。在一个优选实施方案中，所述受试者为人受试者。本文提供了用于治疗的双链核酸分子。
还提供了用于治疗或预防癌症的发病率或严重性或用于降低癌症的风险或严重性的本文所公开的鞘脂-聚烷基胺化合物，其中所述癌症和/或症状或相关风险与哺乳动物基因或非哺乳动物基因的表达相关。
还提供了本文公开的鞘脂-聚烷基胺化合物用于制备用于治疗或预防癌症的发病率或严重性或用于降低癌症的风险或严重性的药物的用途，其中所述癌症和/或症状或相关风险与哺乳动物基因或非哺乳动物基因的表达相关。
siRNA合成
使用公共和专有算法生成潜在双链RNA分子的有义和反义序列。
根据上述规格的寡核苷酸基本如本文所述制备。通过任何本领域中所熟知用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的方法合成经修饰核酸分子。合成通常在市售合成仪(可得自AppliedBiosystems等)中进行。寡核苷酸合成在例如Beaucage和Iyer，Tetrahedron1992；48：2223-2311；Beaucage和Iyer，Tetrahedron1993；49：6123-6194以及Caruthers等，MethodsEnzymol.1987；154：287-313中有述；硫代酯的合成描述于Eckstein，Ann.Rev.Biochem.1985；54：367-402等中；RNA分子的合成描述于Sproat，HumanaPress2005，HerdewijnP.编著；Kap.2：17-31中；并且各下游工艺描述于Pingoud等，IRLPress，1989，OliverR.W.A.；Kap.7：183-208等中。
其他合成方法在本领域中是已知的，例如，Usman等，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等，1990，NAR.，18，5433；Wincott等，1995，NAR.23，2677-2684；和Wincott等，1997，MethodsMol.Bio.，74，59中所述的方法可利用常用核酸保护和偶联组，例如5'端的二甲氧三苯甲基和3'端的亚磷酰胺。根据需要加入经修饰(例如，2'-O-甲基化)核苷酸和未经修饰核苷酸。
在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸分开合成并在合成后例如通过连接反应连在一起(Moore等，1992，Science256，9923；Draper等，国际专利公开号WO93/23569；Shabarova等，1991，NAR19，4247；Bellon等，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等，1997，BioconjugateChem.8，204)，或者通过在合成和/或解保护之后杂交。
化学合成片段的重叠对(Overlappingpair)可采用本领域中公开的方法连接(例如，参见美国专利号6,121,426)。所述链分开合成并在管中彼此退火。通过HPLC将双链siRNA与未退火(例如，因为其中一种过量)的单链寡核苷酸分离。至于本文所公开的鞘脂-聚烷基胺化合物，可以合成两种或更多种这样的序列并连在一起备用。
在一个实施方案中，提供了双链核酸(例如，dsRNA、siRNA、siNA)，其下调哺乳动物或非哺乳动物靶基因的表达。双链分子在有义链和/或反义链上包含例如至少一个吡唑并三嗪核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链包含源自靶RNA序列的核苷酸序列，反义链与有义链互补。在一般情况下，与靶mRNA序列的一些偏差可以容忍而不会有损于siRNA活性(参见例如Czauderna等，2003，NAR31(11)，2705-2716)。本发明的dsRNA在转录后水平抑制基因表达而不破坏mRNA。不受理论约束，dsRNA可以靶向用于特异性切割和降解的mRNA和/或可以抑制由靶信息翻译。
一方面，提供了核酸分子(例如，siNA分子)，其中a)该核酸分子包括有义链和反义链；b)该分子的每条链的长度独立地为15至49个核苷酸；(c)该反义链的15至49个核苷酸的序列与靶RNA的序列互补；d)至少一个鞘脂-聚烷基胺缀合物共价连接在有义链的3’端、反义链的3’端或有义链的5’端；和e)有义链的15至49个核苷酸的序列与反义链的序列互补，并且包括靶RNA的15至49个核苷酸序列。
在一些实施方案中，反义链与反义链的长度相同。在一些实施方案中，反义链和有义链的长度是18至25或18至23或18至21或19至21或19个核苷酸。
鞘脂-聚烷基胺缀合物与核苷酸或寡核苷酸的偶联
可以在合成仪中将鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺缀合物与核苷酸的5’端相偶联，例如，在合成的最后步骤。或者，可以将鞘脂-聚烷基胺化合物与固体支持物相偶联，然后加入核苷酸，以形成具有2’或3’键(鞘脂-聚烷基胺共价连接到寡核苷酸的末端核苷酸之糖的2’或3’位)的缀合物。另一种可能性是制备寡核苷酸，然后，在后合成步骤，除去所选核苷酸上合适的保护基团后，将鞘脂-聚烷基胺缀合物附接或偶联到的末端核苷酸或内部核苷酸，以在寡核苷酸的末端位点或内部位点形成键。优选地，鞘脂-聚烷基胺缀合物连接到末端核苷酸，以形成在末端位点具有键的缀合物。对于siRNA寡核苷酸而言，鞘脂-聚烷基胺缀合物可直接或通过接头连接到有义链的一个末端或两个末端或者反义链的3’端。
鞘脂-聚烷基胺缀合物可以多种方式与寡核苷酸相偶联。可能的键包括酰胺、磷酸酯、硫醚、氨基和醚键。酰胺键可由使鞘脂-聚烷基胺的活化羧酸衍生物与连接到寡核苷酸的氨基接头反应来产生。活化可以利用本领技术人员已知的方法在溶液相中或在固相上来实现。非限制性实例包括使用碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl(EDC)或活化的NHS酯、硝基苯基、五氯苯基、酸酐或磺酰氯。此外，对于固体支持物反应而言，活化可以是酰氯的形式。磷酸酯键得自鞘脂-聚烷基胺缀合物的活性磷酸酯衍生物和寡核苷酸上的5’羟基的反应。活化的磷酸酯可以是例如亚磷酰胺、H-膦酸酯、三酯或二酯。
药物组合物
虽然本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子可以作为原料施用，但是优选其作为药物组合物提供。因此，本文提供了包含一种或更多种本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本文公开的两种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。
还提供了包含有效抑制靶基因表达的量的本文所公开的至少一种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物或所述化合物的盐和药学上可接受的载体的药物组合物。鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物可以在细胞内由内源细胞化合物进行处理(例如DICER)，以产生本文所公开的一种或更多种核酸分子。
还提供了包含药学上可接受的载体和有效抑制哺乳动物细胞中靶基因表达的量的本文所公开的一种或更多种化合物的药物组合物。
在一些实施方案中，本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物或所述化合物的盐是药物组合物中的主要活性成分。在其他实施方案中，本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物是含有两种或更多种治疗剂的药物组合物的活性组分之一，所述药物组合物还包含一种或更多种靶向一种或更多种靶基因或例如小分子药物的dsRNA分子。
还提供了制备药物组合物的方法，其包括：提供本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物；和将所述化合物与药学上可接受的载体相混合。
在一个优选实施方案中，将药物组合物的制备中所用的本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物和载体以药物有效剂量相混合。
还提供了试剂盒、容器和制剂，其包含本文所提供用于降低靶基因表达以将核酸施用或分布于患者的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。试剂盒可包括至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如瓶子(bottle)、小瓶(vial)、注射器和试管。所述容器可以由各种材料制成，例如玻璃、金属或塑料。在一个实施方案中，所述容器容纳本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。试剂盒还可以包括相关的指示和/或指南；用于此目的的试剂和其他组合物或工具也可以包括在内。
所述容器可以可选地容纳包含可有效治疗、诊断、预后或预防病症的活性剂(例如，鞘脂-精胺寡核苷酸化合物)的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或具有用皮下注射针可刺穿之阻塞物(stopper)的小瓶)。组合物中的活性剂可以是本文所公开的鞘脂-聚烷基胺化合物。
试剂盒还可包括第二容器，其包括药学上可接受的缓冲剂，并且还可以包括从商业和用户立场上所期望的其他材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、搅拌器、针头、注射器和/或插入有使用指示和/或说明书的包装。
容纳鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的容器可包括带标记的包装，并且该标记可以带有政府机构(例如美国食品和药物管理部门)规定形式的标注(notice)，该标注反映其中用于人施用的多核苷酸材料的制备、施用或销售在联邦法律下得到该机构批准。
剂量
鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的待施用可用剂量和具体施用方式将取决于这样的因素，如细胞类型、或者用于体内用途、年龄、体重和具体受试者及待治疗的其区域或器官、所用的具体核酸和递送方法、预期治疗或诊断用途以及该制剂的指示和形式，例如，裸的、混悬剂、乳剂、胶束或脂质体，如对于本领域技术人员而言将显而易见的。通常，剂量以较低的水平施用，然后增加直至达到期望的效果。
用于本文目的的“治疗有效剂量”由本领域已知的考虑测定。该剂量必须有效地实现改善，包括但不限于改进的存活率或更快速的恢复，或改善症状消除或缓解和由本领域技术人员选择为合适措施的其他指标。本文公开的dsRNA可以以单剂量或以多剂量施用。
核酸分子的合适剂量单元可以为0.001至0.25毫克/千克接受者体重/天、或0.01至20微克/千克体重/天、或0.01至10微克/千克体重/天、或0.10至5微克/千克体重/天、或0.1至2.5微克/千克体重/天。
可以添加合适量的核酸分子，并且这些量可以使用标准方法根据经验确定。细胞环境中各个核酸分子种类的有效浓度可为约1飞摩尔(femtomolar)、约50飞摩尔、100飞摩尔、1皮摩尔、1.5皮摩尔、2.5皮摩尔、5皮摩尔、10皮摩尔、25皮摩尔、50皮摩尔、100皮摩尔、500皮摩尔、1纳摩尔、2.5纳摩尔、5纳摩尔、10纳摩尔、25纳摩尔、50纳摩尔、100纳摩尔、500纳摩尔、1微摩尔、2.5微摩尔、5微摩尔、10微摩尔、100微摩尔或更多。
对于哺乳动物而言合适的剂量可以为0.01微克至1克/千克体重(例如，0.1微克、0.25微克、0.5微克、0.75微克、1微克、2.5微克、5微克、10微克、25微克、50微克、100微克、250微克、500微克、1毫克、2.5毫克、5毫克、10毫克、25毫克、50毫克、100毫克、250毫克或500毫克/千克)。
约0.1毫克至约140毫克每千克体重数量级的剂量水平可用于治疗上述病症(约0.5毫克至约7克/受试者/天)。可与载体材料组合物以产生单一剂型的活性成分的量根据接受治疗者及具体施用方式而改变。单位剂型通常包含约0.1毫克至约500毫克的活性成分。
应当理解，任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、药物组合以及正在进行治疗的具体疾病的严重程度。
包含本文所公开化合物的药物组合物可以每日一次、每日四次(qid)、每日三次(tid)、每日两次(bid)、每日(QD)施用，或在以医学上合适的任何时间间隔和任何持续时间施用。然而，治疗剂也可以含两、三、四、五、六或更多个亚剂量的剂量单位在一天中以合适的间隔给药。在这种情况下，包含在每个亚剂量中的核酸分子可以相应较小以达到总的日剂量单位。剂量单位也可配混为经数天的单剂量，例如，使用常规的持续释放制剂，其提供经数天时间持续且一致地释放dsRNA。持续释放制剂在本领域中是公知的。所述剂量单位可以含有每日剂量的相应倍数。该组合物可以这样的方式配混，多个单位核酸的总和一起含有足够的剂量。
递送
本文所公开的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物作为化合物本身(即作为裸siRNA)或作为药学上可接受的盐施用，并且单独施用或作为活性成分与一种或更多种药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂及媒介物组合施用。在一些实施方案中，用载体或稀释剂例如PBS或其他生理溶液制备的裸分子将鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物通过直接施用递送至靶组织。
术语“裸siRNA”指不含任何递送媒介物的siRNA分子，其作用是协助、促进或有利于进入细胞，包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、脂转染剂(lipofectin)或沉淀剂等。例如，PBS中的siRNA是“裸siRNA”。
药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物以及植入物载体通常是指不与本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物反应的惰性的、无毒固体或液体填料、稀释剂或包封材料。
此外，该组合物可包括人造氧载体，诸如全氟化碳(PFC)，例如潘氟隆(perflubron)。
用于本文公开化合物的改进递送的其他制剂可包括非配制化合物和与靶向抗体相结合的化合物(Song等，NatBiotechnol.2005.23(6)：709-17)或适体。
包含本文所公开化合物的裸化合物或药物组合物根据良好的医学实践来施用和给药，考虑进个体患者的临床状况、待治疗的疾病、施用部位和方法、施用安排、患者年龄、性别、体重和医学从业人员已知的其它因素。
鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物优选地经口、皮下或肠胃外包括静脉内、腹膜内以及输注技术施用。化合物的植入物也是有用的。
液体形式制备用于侵入性施用，例如注射。液体组合物包括水溶液，含和不含有机共溶剂、水或油混悬剂、含食用油的乳剂以及类似的药物媒介物。在一个具体实施方案中，施用包括静脉内施用。
治疗方法
一方面，本文提供了一种治疗患癌受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所公开的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物。在一些优选实施方案中，接受治疗的受试者是温血动物，特别是哺乳动物包括人。
在另一方面，本文提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，其用于治疗患有癌症的受试者。
在另一方面，本文提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物用于制备用于治疗癌症之药物的用途。
“治疗受试者”是指向受试者施用有效缓解与癌症相关症状的治疗性物质(即，鞘脂聚烷基胺寡核苷酸)以减轻严重性或治愈癌症、减缓癌症的发展、防止癌症发生或推迟癌症发作。“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施二者，其目的是预防癌症、延缓癌症发作或减轻癌症的症状。需要癌症治疗的那些包括已经患有癌症、容易患癌症和癌症待预防的那些。本文公开化合物在癌症发作之前、期间或之后施用。
“治疗有效剂量”是指药物化合物或组合物的量可有效地在受试者或其生理系统中实现改善，包括但不限于提高的存活率、更快速的恢复、改善或消除症状、延迟病症发作、减缓疾病及被本领域技术人员选择为合适的确定措施之其他指征的较慢发展。
本文提供了可用于治疗癌症的化合物、组合物和方法。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受控细胞生长为特征的生理状况，包括良性和恶性生长。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样的癌症的其他实例包括肾癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌在内的肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌、鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、包括胃肠癌在内的胃或胃部癌症、胃肠道间质瘤(GIST)、胰腺癌、头颈部癌、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞癌、卵巢男性细胞瘤、肝细胞瘤、血液恶性肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液恶性肿瘤、子宫内膜或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤、少突神经胶质瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、Wilm氏瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡NHL；中级弥漫型NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小无核裂细胞NHL；大体积疾病NHL；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)以及与瘢痣病相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的)和梅格斯综合征。本文所用“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)以及所有的癌前细胞和癌变细胞及组织。
此外，提供了一种与对照相比将靶基因的表达下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括使靶mRNA与本文所公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物相接触。
此外，提供了本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于与对照相比将靶基因的表达下调至少20％、30％、40％或50％，其中使所述分子与靶mRNA相接触。
还提供了本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于制备用于与对照相比将靶基因的表达下调至少20％、30％、40％或50％的药物的用途，其中使所述分子与靶mRNA相接触。
在多种实施方案中，鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物下调靶基因，其中下调选自包括下调基因功能、下调多肽和下调mRNA表达的组。
本文提供了一种与对照相比将靶基因的表达抑制至少20％、30％或40％、优选50％、60％或70％、更优选75％、80％或90％的方法，其包括使靶基因的mRNA转录物与本文公开的一种或更多种鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物相接触。
本文还提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸分子用于与对照相比将靶基因的表达抑制至少20％、30％或40％、优选50％、60％或70％、更优选75％、80％或90％，其中使所述鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物与靶RNA相接触。
本文还提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物在制备用于与对照相比将靶基因的表达抑制至少20％、30％或40％、优选50％、60％或70％、更优选75％、80％或90％的药物中的用途，其中使所述化合物与靶RNA相接触。
在一个实施方案中，本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物抑制靶基因多肽，其中抑制选自包括以下的组：功能的抑制(其例如通过用天然基因/多肽等的已知相互作用因子进行酶测定或结合测定来研究)、靶蛋白的抑制(其例如通过Western印迹、ELISA或免疫沉淀等来研究)和靶mRNA表达的抑制(其例如通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交等来研究)。
在其他实施方案中，提供了一种治疗患有或易患伴有提高水平的哺乳动物或非哺乳动物靶基因的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物从而治疗所述受试者。
在其他实施方案中，提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于治疗患有或易患伴有提高水平的哺乳动物或非哺乳动物靶基因的癌症的受试者。
在其他实施方案中，提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物在制备用于治疗患有或易患伴有提高水平的哺乳动物或非哺乳动物靶基因的癌症的受试者的药物中的用途。
不受到限制，与癌症相关的哺乳动物靶基因是PLK、RAC1或K-RAS。本领域技术人员将能够识别相关的癌症靶基因和产生活性的反义或dsRNA分子以靶向基因或基因转录产物。其他的例子包括致瘤基因的拮抗物(antimir)。
在其他实施方案中，提供了一种治疗患有或易患伴有哺乳动物或非哺乳动物靶基因功能降低的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效剂量的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物从而治疗所述受试者。
在其他实施方案中，提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于治疗患有或易患伴有哺乳动物或非哺乳动物靶基因功能降低的癌症的受试者。
在其他实施方案中，提供了本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物在制备用于治疗患有或易患伴有哺乳动物或非哺乳动物靶基因功能降低的癌症的受试者的药物中的用途。
例如，期望上调p53阴性肿瘤中p53表达的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。其他的例子包括未突变/缺失而只是下调肿瘤抑制剂；经常选择用于针对癌症发展以避免对癌细胞的免疫攻击的MHCI和用于肿瘤抑制剂miRNA的miRNA模拟物。RNA适体可用于治疗，并且很容易连接到鞘脂-聚烷基胺缀合物。RNA适体的非限制性例子公开在例如Zhou等(2012)，FrontiersinGenetics3，第234篇论文。
联合治疗
本文公开的治疗疾病的方法包括与其他抑制剂、改善鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的药理学性质的物质、或已知有效治疗患有或易患上文提到的任意疾病和病症的其他化合物联合或组合施用本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物与化学疗法或放射疗法一起施用。在一些实施方案中，鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物优选地以全身方式施用例如静脉内施用。
在另一个实施方案中，提供了包含本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物与至少一种其他治疗活性剂或治疗剂之组合的药物组合物。“联用”或“组合”是指之前、同时或之后。因此，这样的组合的单个组分从同一或单独的药物制剂依次或同时施用。
因此，在另一个实施方案中，另外的药学上有效化合物与本文公开的药物组合物联合施用。此外，本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物用于制备与第二治疗活性化合物用作辅助治疗剂以治疗所述病症的药物。用于与本文所公开的经化学修饰核酸分子组合的已知第二治疗剂的合适剂量容易地为本领域技术人员所理解。
在一些实施方案中，上文提到的组合提供为用于单一药物剂型。
“联合”是指该其他药学有效化合物在本文所公开的化合物或药物组合物施用之前、同时或之后施用。因此，上文提到的这样的组合的各个组分可以从同一或分开的药物制剂依次或同时施用。如同鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的情况，第二治疗剂可以通过任何合适的途径施用，例如通过口服、口腔、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、局部(经皮、经鼻等)、经皮(即，透皮)、或肠胃外(包括静脉内、肌内、皮下和冠状动脉内)施用。
在一些实施方案中，本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物与第二治疗剂(例如，dsRNA或化疗剂)通过相同途径施用，或者作为两种或更多种不同的药物组合物提供于单一组合物中。然而，在其他实施方案中，本文所公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物和第二治疗剂的不同施用途径是可能的或优选的。本领域技术人员知晓施用每种治疗剂的最佳施用方式，无论是单独的还是组合的。
在多种实施方案中，本文公开的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物是药物组合物中的主要活性组分。
根据本发明的治疗方案就施用模式、施用时间以及剂量而言实施，使得患者由本文所公开病症的不利后果的功能恢复得以改善或者推迟疾病发作。可与载体组合产生单一剂型的活性成分的量根据接受治疗者和具体施用方式而不同。单位剂型一般包含约0.1毫克至约500毫克活性成分。
已经以举例说明的方式对本发明进行了描述，应理解，所使用的术语旨在为描述性而非限制性。
根据上述教导可对本发明进行修改和变化。因此，应理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以不同于所具体描述的而实施。
在下文中参照实施例对本发明进行了详细说明，但不应解释为本发明限于此。
本文所引用的任何文献都不能认为是承认这些文献是相关的现有技术，或者认为赋予本申请的任何权利要求专利性的材料。关于内容的任何陈述或者任何文献的日期都是以申请人在提交时所获得的信息为基础，而且不构成对这样的陈述之正确性的承认。
实施例
无进一步详述，认为本领域技术人员可以采用前述描述最大程度地利用本发明。因此，将以下优选的具体实施方案理解为仅示例性的，并且不以任何方式限制所要求保护的发明。
未在本文中详细描述的本领域中已知的标准分子生物学方案一般基本如下中所述：Sambrook等，Molecularcloning：Alaboratorymanual，ColdSpringsHarborLaboratory，New-York(1989，1992)；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1988)；和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)以及Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)；Watson等，RecombinantDNA，ScientificAmericanBooks，NewYork；Birren等(编著)GenomeAnalysis：ALaboratoryManualSeries，第1-4卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998)以及美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所述的方法，其通过引用并入本文。聚合酶链反应(PCR)一般如在PCR规程中所述实施：AGuideToMethodsAndApplications，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)。原位(Incell)PCR与流式细胞组合可用于检测含特异性DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，Blood1996，87：3822.)。进行RT-PCR的方法在本领域中也是公知的。
实施例1.dsRNA的有义链和反义链的选择和生成
利用专有算法和靶基因的已知序列生成潜在dsNA的18聚和19聚序列。利用该方法产生的反义链序列与靶mRNA序列区段完全或基本互补。在一些实施方案中，反义序列与相应mRNA序列区段完全互补。一般而言，选择用于体外测试的具有特异性序列的双链核酸分子对人和第二物种例如大鼠、小鼠非人灵长类或兔基因具有特异性。
示例性化合物靶向Rac1(Homosapiensras相关C3肉毒杆菌毒素底物1(rho家族，小GTP结合蛋白Rac1)(RAC1)，转录物变体Rac1，mRNA)gi|156071503|ref|NM_006908.4|(SEQIDNO：1)；PLK1(Homosapienspolo样激酶1)gi|34147632|ref|NM_005030.3|(SEQIDNO：2)和KRAS(HomosapiensKirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)，转录物变体，mRNA)gi|575403058|ref|NM_033360.3(SEQIDNO：3)和(HomosapiensKirsten鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)，转录物变体b，mRNA)gi|575403057|ref|NM_004985.4|(SEQIDNO：4)。
在NCBI网站上可获得哺乳动物和非哺乳动物靶基因的靶RNA序列的多核苷酸序列[http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/]。
经化学修饰寡核苷酸的合成
化学合成有义链和反义链，并将经化学修饰的核苷酸单体并入链中。本文采用的化学修饰如下：
Rac1_28：有义链(5’>3’)CGUGCAAAGUGGUAUCCUG(SEQIDNO：5)，和反义链(5’>3’)CAGGAUACCACUUUGCACG(SEQIDNO：6)
Plk1_28有义链(5’>3’)AGAAGAUGCUUCAGACAGU(SEQIDNO：7)，和反义链(5’>3’)ACUGUCUGAAGCAUCUUCU(SEQIDNO：8)
Kras有义链(5’>3’)GUAAGGCAGACCCAGUAUA(SEQIDNO：9)反义链(5’>3’)UAUACUGGGUCUGCCUUAC(SEQIDNO：10)
表1提供了所合成示例性siRNA化合物的描述。
表1:所合成示例性siRNA链和靶向RAC1的化合物(siRAC1)：
表2：化合物表的说明
RAC1_28_S2045：
有义链(SEQIDNO：3)，其具有存在于(5’>3’)1、3、5、10、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、与5’端缀合的鞘脂-精胺部分和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：4)，其具有存在于(5’>3’)1、6、9、11、13、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
RAC1_28_S2081:
有义链(SEQIDNO：3)，其具有存在于(5’>3’)1、3、5、10、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、与5’端缀合的鞘脂-亚精胺部分和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：4)，其具有存在于(5’>3’)1、6、9、11、13、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
RAC1_28_S2281:
有义链(SEQIDNO：3)，其具有存在于(5’>3’)1、3、5、10、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、与5’端缀合的鞘脂-亚精胺部分和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：4)，其具有存在于(5’>3’)1、6、9、11、13、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’CY3部分。
RAC1_28_S2139
有义链(SEQIDNO：3)，其具有存在于(5’>3’)1、3、5、10、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、与5’端缀合的鞘脂-亚精胺部分和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：4)，其具有存在于(5’>3’)6、8、9、10、11、12、13、14、16和18位的2’-脱氧-氟糖修饰的核糖核苷酸、与3’端共价连接的dTdt突出和核苷酸1-2之间的硫代磷酸酯键、3’端核苷酸和dT及dT-dT。
RAC1_28_S1908(未缀合对照)：
CGUGCAAAGUGGUAUCCUG有义链(SEQIDNO：3)，其具有存在于(5’>3’)1、3、5、10、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
CAGGAUACCACUUUGCACG反义链(SEQIDNO：4)，其具有存在于(5’>3’)1、6、9、11、13、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
RAC1_28_S2132(未缀合对照)：
CGUGCAAAGUGGUAUCCUG有义链(SEQIDNO：3)，其具有存在于(5’>3’)1、3、5、10、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
CAGGAUACCACUUUGCACG反义链(SEQIDNO：4)，其具有存在于(5’>3’)1、6、9、11、13、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’CY3部分。
KRAS_2_S2309：
有义链(SEQIDNO：7)，其具有存在于(5’>3’)2、7、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、与5’端缀合的鞘脂-精胺部分和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：8)，其具有存在于(5’>3’)1、3、6、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
KRAS_2_S2087(未缀合对照)：
有义链(SEQIDNO：7)，其具有存在于(5’>3’)2、7、13、16和18位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：8)，其具有存在于(5’>3’)1、3、6、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
PLK1_28_S2272：
有义链(SEQIDNO：5)，其具有存在于(5’>3’)7、12和16位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、与5’端缀合的鞘脂-精胺部分和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：6)，其具有存在于(5’>3’)3、7、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
PLK1_28_S2054(未缀合对照)：
有义链(SEQIDNO：5)，其具有存在于(5’>3’)7、12和16位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸、5’C6氨基酸封端和3’磷酸。
反义链(SEQIDNO：6)，其具有存在于(5’>3’)3、7、15、17和19位的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和3’磷酸。
实施例2：鞘脂-精胺/亚精胺亚磷酰胺的合成
图1示出用于合成鞘脂-精胺/亚精胺-亚磷酰胺的方案。缩略语：TFA：三氟乙酸基；TBDMS：叔丁基二甲基甲硅烷基；CC-柱色谱法；MeOH-甲醇；THF-四氢呋喃；DSC–Di(琥珀)碳酸酯；DMAP-4-二甲氨基吡啶；DCM-4-(二氰基亚甲基)-2-甲基-6-(对二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃；TBAF-四正丁基氟化铵。
在下文中提供了合成步骤的细节：
化合物2
向D-赤式-鞘氨醇(1g化合物1)在MeOH(16mL)的溶液中添加三氟乙酸乙酯(0.6mL)和三乙胺(0.93mL)。将混合物搅拌16小时，然后在减压下将溶剂蒸发至干燥，得到粗化合物2。通过CC(二氧化硅，DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化粗产物。
化合物3
将化合物2(1g)溶解于THF(300mL)中，然后加入DSC(0.6g)和DMAP(0.17g)。将混合物搅拌6小时，并将溶剂蒸发至干。通过CC(二氧化硅，DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化粗产物，得到化合物3。
化合物4
将化合物9(0.33g)溶解于吡啶，然后加入DMAP(17mg)和化合物3(600mg)。将混合物搅拌16小时，然后将溶剂蒸发至干。通过CC(二氧化硅，己烷/EtOAc作为洗脱剂)纯化粗产物，得到化合物4。
化合物5
将化合物4(840g)溶解于DCM(300mL)中，然后加入DSC(0.5g)和DMAP(0.14g)。将混合物搅拌1小时，并加入精胺/亚精胺(0.25g)，将反应物搅拌16小时。通过CC(二氧化硅，DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化粗产物，得到化合物5。
化合物6
将化合物5(0.8克)溶解于MeOH(15ml)中，然后加入三氟乙酸乙酯(1.8mL)和三乙胺(3mL)，并将反应物搅拌6至8小时。蒸发溶剂至干，通过CC(二氧化硅，DCM/甲醇作为洗脱剂)纯化粗产物，得到化合物6。
化合物7
将化合物6溶解于THF(40mL)中，并加入1MTBAF(23毫升)在无水THF中的溶液。将混合物搅拌16小时，然后用EtOAc/水工作，并蒸发至干。通过CC(硅胶，DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化粗产物。
化合物8
将化合物7(2g)和DCI(137mg)溶解于干燥的新蒸馏的DCM(30mL)中。然后逐滴加入PCl-试剂(0.8mL)，并将混合物搅拌1小时。加入碎冰，并将该混合物用DCM(2×20ml)萃取，用冷的盐水洗涤合并的有机相，干燥并蒸发DCM。通过色谱法(洗脱剂：戊烷/EA/Et3N)纯化粗产物，得到可用于掺入寡核苷酸的无色至灰白色油。
化合物9：
将6-氨基己醇(1g)溶解在无水吡啶(10mL)中，然后加入TBDMS-Cl(1.5)。将混合物搅拌8小时，然后在减压下蒸发溶剂至干。用DCM/水进行工作，并蒸发溶剂，得到粗产物9。通过CC(二氧化硅，DCM/MeOH作为洗脱剂)纯化粗产物。
实施例3：嵌合寡核苷酸的合成
在合成期间通过偶联至寡核苷酸将鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺并入寡核苷酸，特别是并入可用于产生反义寡核苷酸化合物或双链RNA核酸分子的反义链和/或有义链，包括siRNA、siNA、anti-miR和miRNA。
对于大规模合成(20μmol)而言，将鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺(300mg)溶解于乙腈(1.65ml，0.15M)中。将鞘脂-聚烷基胺偶联两次(每个偶联步骤的偶联时间为10分钟)。
siRNA-鞘脂-聚烷基胺的裂解和去保护
对于与树脂(344mg)结合的寡核苷酸链(例如，siRNA链)，在密封管中加入NH4OH(33％在水中)：甲胺(33％在EtOH中)(体积/体积；总计3.44ml)，并在热区于65℃孵育3.5小时。3.5小时后，将该管冷却至室温，将该树脂在离心机中以4000rpm降速离心5分钟。将上清液倒入新的管中，并用EtOH：H2O(3.5ml×2)洗涤两次。合并上清液，并通过冷冻干燥进行干燥。将该寡核苷酸干燥后，在密封管中加入DMSO(0.344ml)和TEA3HF(3.44ml)并在热区于65℃孵育3小时。在此期间后，将寡核苷酸冷却至室温，并进一步冷却至-20℃。用预冷丁醇沉淀寡核苷酸。
由于所获得的两个峰，在HPLC上纯化siRNA-鞘脂-聚烷基胺化合物。峰1是期望的与鞘脂-聚烷基胺的siRNA缀合物，峰2是相同的缀合物，只是具有TFA保护基。
类似方法用于偶联单链及其他双链寡核苷酸分子。
发明人已经表明，鞘脂-聚烷基胺dsRNA化合物表现出与未经修饰dsRNA分子相比增加的细胞摄取和内体逃逸。
实施例4：鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的体外敲低活性(SL-精胺和SL-亚精胺)
用鞘脂聚烷基胺siRAC1化合物、鞘脂-精胺(SL-精胺-RAC1_28_S2045)或鞘脂-亚精胺(SL-亚精胺RAC1_28_S2081)对靶基因的体外敲低活性进行分析并与未缀合siRNA(RAC1_28-S1908)的活性进行比较。利用psiCHECKTM系统研究靶敲低活性。
所述psiCHECKTM表达系统(Promega)能够通过监测在其3’非翻译区(3’-UTR)携带抑制性寡核苷酸作用的靶位点的萤光素酶报告基因活性变化来评价抑制性寡核苷酸的内在效力，例如siRNA或反义。siRNA对该靶序列的活性通常源自被切割mRNA的裂解和随后的降解或由靶基因编码的蛋白质的翻译抑制。此外，psiCHECKTM-2载体含有第二报告基因、萤火虫荧光素酶，其转录在不同的启动子并且不受所研究的抑制性寡核苷酸的影响。这允许在不同的转染中标准化海肾荧光素酶的表达。
制备psiCHECKTM-2-基构建体用于RAC1siRNA的引导链(GS，反义)的中靶活性，引导链种子序列(GS-SM)的脱靶活性和/或所述过客链的靶活性(PS-CM，也称为siRNA的脱靶活性)。在该构建体中，将测试分子GS完整靶序列的一个拷贝克隆到位于海肾荧光素酶的3’-UTR中的多克隆位点，其在终止密码子的下游。将所述psiCHECKTM-2质粒转染进人HeLa细胞。将转染的HeLa细胞接种到96孔板的孔中，并用添加的目的siRNA在37℃孵育，一式两份，不加入转染剂。受试RAC1siRNA化合物的最终浓度为0.03、0.1、0.3和1μM。对照细胞未暴露于任何siRNA。
siRNA转染48小时后，收获细胞用于蛋白质提取。根据制造商的规程使用测定试剂盒测量个体细胞蛋白质提取物中的海肾和萤火虫萤光素酶活性。海肾荧光素酶活性值通过从同一样品获得的萤火虫荧光素酶的活性值归一化。siRNA活性表示为阴性对照细胞中受试样品中的归一化的剩余海肾萤光素酶活性占归一化海肾萤光素酶活性的百分比。
这项研究重复至少两次，代表性结果示于图2中。
如图2所示，就所有受试鞘脂聚烷基胺siRNA化合物而言的海肾萤光素酶活性的剂量依赖性敲低均得到证实，但其非缀合物对应物并非如此。
实施例5：鞘脂-精胺-siRNA化合物的体外敲低活性
利用与鞘脂精胺(分别为SL-精胺KRAS_2_S2309和SL-精胺-PLK1_28_S2272)缀合的siRNA双链体分析靶基因KRAS和PLK1的体外敲低活性，并与未缀合siRNA(分别为KRAS_2_S2087和PLK1_28_S2054)的活性进行比较。利用psiCHECKTM系统研究靶敲低活性，如上文的实施例4所述。将该研究重复至少两次，代表性结果示于图3中。
如图3所示，就所有受试鞘脂-精胺siRNA化合物而言的海肾萤光素酶活性的剂量依赖性敲低均得到证实，但其非缀合物对应物示出我们观察到的活性并非siRNA序列依赖性的。
实施例6：血浆和细胞提取物中鞘脂-精胺siRNA化合物的稳定性
在血浆和细胞提取物中对鞘脂精胺RAC1_28siRNA化合物对抗核酸酶降解的稳定性进行了分析。
在小鼠血浆和Ct26细胞提取中将鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物在37℃孵育24小时。在孵育0至24小时之间的时间点后，将1ng等分试样转移到TBE加载缓冲器，快速冷冻在液氮中，并储存在-20℃直至使用。将等分试样在冰上解冻，并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
基于凝胶迁移模式，如图4所述，发现所测试鞘脂精胺siRNA在血浆和细胞提取物中于37℃稳定至少24小时。
实施例7：鞘脂-精胺和鞘脂-亚精胺siRNA化合物的pK
在本实验中，在向大鼠静脉内施用1mg/kgsiRNA之后，将血浆中的鞘脂-精胺和鞘脂-亚精胺RAC1siRNA化合物的药物动力学(Pk)与非缀合RAC1siRNA进行比较。在siRNA施用后10分钟、30分钟、1小时、4小时、8小时和24小时后，将血液样品(从尾部收集，总体积约50μl)收集进EDTA收集管中。通过离心处理从所有的动物中获得采集的血液样品用于血浆分离(2500g，在室温下15分钟)。使用TritonX-100提取物从所述血浆中提取siRNA。为了确定样品中RAC1的siRNA水平，采用用于siRNA检测的茎环方法制备cDNA。按照标准规程实施qPCR。在对规程作出的一个小的改变中，以30秒延伸/延长时间使用SYBR快速ABIprism预混试剂盒(KAPA目录号KK-KK4605)。在反应混合物中每个样品使用0.4μl的各引物和6.2μl的水。
其结果示于图5中。如在图5中可见，血浆中鞘脂精胺siRNA化合物的水平在所研究的所有时间点均高于未缀合siRNA。例如，在静脉内注射1小时时于血浆中见到小于10％的未缀合的siRNA，而在血浆中可检测到大于70％的SL-精胺siRNA化合物(大于30％的鞘脂-亚精胺siRNA化合物，数据未示出)，这表明鞘脂精胺和鞘脂亚精胺siRNA化合物更高的停留和更长的循环时间。
实施例8：PBMC中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的细胞因子诱导
将鞘脂精胺RAC1siRNA化合物(RAC1_28_S2081)和鞘脂精胺RAC1siRNA化合物(RAC1_28_S2054)在PBMC生长培养基中稀释至400、200和20nM的浓度。以400nM的浓度对RAC1_28_S1908进行测试。将LPS溶于水(细胞培养级)以获得2000μg/ml的原液。
从按如下所述从血库获得的3个健康人供体的新鲜血液合并物(pool)中分离PBMC。用RPMI1640将全血稀释为1:2(10ml+10ml)。将稀释血液轻轻覆盖到Lymphoprep(比例1:3)上并在22℃离心25分钟(900g，破裂(breakoff))。从每个供体的中间相取出不透光PBMC环到新的50ml管中以产生供体合并物。用总计40mlRPMI1640洗涤PBMC并以800g离心10分钟。然后，将沉淀的细胞重悬于40mlPBMC生长培养基中。用自动细胞计数仪(TC20；BioRad公司)对PBMC进行计数。用PBMC生长培养基将细胞重悬至终浓度为3*106/ml。将每个PBMC合并物的1ml细胞悬浮液分入12孔板的每个孔中。在每个孔中，一式三份加入siRNA、阴性对照和阳性对照以达到最终浓度。将平皿孵育于37±1℃湿润的5±0.5％CO2/空气。24±2小时孵育期后，收集细胞，以800g离心7分钟，除去上清液，分为2等份并保存在[(-70)-(-80)℃]冷冻仪中用于量化IL-6和TNF-α分泌细胞因子。根据制造商的说明书利用HumanDuoSetELISA试剂盒(R&DSystems)测定IL-6和TNF-α细胞因子水平。对于IL6ELISA，在试剂盒的稀释剂中将PC样品稀释为1:100和1:1000。对于TNFαELISA，在试剂盒的稀释剂中将PC样品稀释为1:10和1:50。在这两种ELISA中，在试剂盒的稀释剂中以未稀释和稀释1:5对测试项目进行研究。
IL-6和TNFa的水平示于图6A和6B中。
如图6A所示，用PBMC孵育24小时后，与阴性对照(生长培养基)处理相比，阳性对照处理(LPS和CL075)诱导高且显著的IL-6分泌。任何所述siRNA包括鞘脂精胺和鞘脂亚精胺siRNA化合物均未观察到显著诱导IL-6细胞因子分泌。
如图6B所示，用PBMC培养24小时后，与阴性对照(生长培养基)处理相比，阳性对照处理(LPS和CL075)诱导高且显著的TNFα分泌。任何所述siRNA包括鞘脂精胺和鞘脂亚精胺siRNA化合物均未观察到显著诱导TNFα细胞因子分泌。
实施例9：PBMC中IFN应答基因活化
将人新鲜血液(室温)与室温的无菌0.9％NaCl以1:1的比例混合，并轻轻加载(1:2的比例)到Ficoll(Lymphoprep，Axis-Shield目录号1114547)上。将样品在摆动离心机中于室温(22℃，800g)离心30分钟，用RPMI1640培养基洗涤并离心(室温，250g)10分钟。对细胞进行计数并以1.5×106个细胞/ml的终浓度接种于生长培养基(RPMI1640+10％FBS+2mML-谷氨酰胺+1％青霉素–接种链霉素)中并在37℃孵育1小时，之后暴露于鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物。根据制造商的说明书利用2000试剂(Invitrogen)使用不同浓度的测试siRNA处理(使接触)细胞，并在5％CO2培养箱于37℃孵育24小时。
作为IFN应答的阳性对照，用多聚(I：C)或Thiazolaquinolone(CLO75)处理细胞；所述多聚(I：C)是双链RNA(dsRNA)的合成类似物，TLR3配体(InvivoGen目录号tlrl-pic)，终浓度为0.25至5.0μg/mL；Thiazolaquinolone(CLO75)是TLR7/8配体(InvivoGen目录号tlrl-c75)，终浓度为0.075至2μg/mL。浆用2000试剂处理的细胞用作IFN应答的阴性(参考)对照。
在孵育约24小时后，收集细胞并将上清液转移至新管中。立即将样品在液氮中冷冻，并且根据制造商的说明书使用IL-6，DuoSetELISA试剂盒(R&DSystemDY2060)和TNF-α，DuoSetELISA试剂盒(R&DSystemDY210)来测试IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。从细胞沉淀中提取RNA，并通过qPCR测量人基因IFIT1(干扰素诱导蛋白，其具有三十四肽重复序列1)和MX1(粘病毒(流感病毒)抗性1，干扰素诱导蛋白P78)的mRNA水平。将测得的mRNA量相对于参考基因肽基异构酶A(亲环素A；CycloA)的mRNA量进行归一化。通过对经处理细胞中IFIT1和MX1基因mRNA的量相对于未经处理细胞中该量进行比较来评价IFN-信号传导的诱导。qPCR结果是通过质量控制标准的那些，即标准曲线斜率的值在间隔[-4，-3]，R2>0.99，无引物二聚体。没有通过QC要求的结果不具备分析资格。
经鞘脂精胺和鞘脂亚精胺siRNA化合物处理的细胞中MX1和IFITmRNA的水平表示为经处理对照的倍数。如在图7中可见，用阳性对照CL075和聚(I：C)和处理之后，所测试的两种基因(IFIT1和MX1)的表达水平增加。在用所有的siRNA(包括所有测试浓度的未缀合的siRNA)处理之后，MX1和IFIT基因的表达水平没有显著变化。
实施例10：PBMC中的补体活化
利用用于补体终端SC5b-9化合物的定量的酶免疫测定对人血浆中鞘脂精胺和鞘脂亚精胺siRNA化合物活化补体的潜力进行了研究。将正常人血浆在37℃快速解冻，并立即转移到冰上。将血浆分成80μl样品并加入20μl以下各项。使用了如下对照：阳性对照溶液包括：酵母多糖、CVF和补体活化剂。阴性对照(盐水)溶液和50mMEDTA抑制剂对照溶液(比例1:5)。如研究方案中所述，将siRNA和盐水直接加入到血浆中。将试管在37℃下孵育1小时，同时轻轻摇动。将样品浸入冰中，并通过加入24μl的50mMEDTA和良好旋涡来终止补体反应。通过离心(20,000g×10分钟，4℃)从血清样品中除去颗粒。将上清液移到新管中并在-80℃冷冻直到对其进行SC5b-9定量分析。就ELISA而言，用SpecimenDiluent将上清液稀释为1:10。根据制造商的说明书使用SC5b-9ELISA试剂盒确定SC5b-9水平。
SC5b-9的水平示于图8中。如在图8中可见，鞘脂精胺和鞘脂亚精胺siRNA不诱导的SC5b-9化合物的生成，因此不活化人血浆中的补体。
实施例11:大鼠中的体内毒性
在BALB/c小鼠中单次静脉内(IV)施用2递增剂量水平及其相应对照后对未缀合的siRNA(RAC1_28_S1908)、鞘脂精胺siRNA(SL-精胺-RAC1_28_S2045)和鞘脂-亚精胺siRNA(SL-亚精胺-RAC1_28_S2081)的潜在毒性进行了评估。
动物接受单次推注IV注射入尾静脉之一，剂量为10mg/kg或50mg/kgsiRNA。每组由6只雄性和6只雌性BALB/cOlaHsd小鼠构成，其中将每组的一半(3只雄性和3只雌性)分配为24小时或7天终止时间点。在给药24小时和7天后对这些动物进行临床血液学和生化评估，接着进行总体宏观检查。
死亡率：在任何动物的整个7天的研究期间无死亡发生。临床体征：任何动物在给药当天和整个研究期间均未发现异常临床迹象。体重和体重增加：所有研究组的组平均体重和增加值看上去相似，在盐水对照组与经处理测试组之间未发现统计学差异。
血液学和生物化学：在1和7天的时间点，雄性和雌性试验组二者的所有血液学和生化指标看上去与盐水对照组相似。在两个终止时间点，雄性和雌性测试组二者的血小板和ALT参数均示出一些统计学显著变化；然而，所有值均在该株小鼠正常预期的范围内，看起来并未有任何生物学效应。
宏观检查：任何动物在每个终止时间点均未注意到大体病理发现。鉴于报告的发现并且在本研究条件下，可得出结论，可认为单次推注IV注射多至50mg/kgRAC1_28_S2045和10mg/kg的RAC1_28_S2081安全，毒性明智，因为未发现明显的死亡效应、观察到的临床症状、体重、临床病理学和在尸体剖检时大体病变的不利影响。
鉴于报告的结果可以得出结论：可认为单次推注IV注射多至50mg/kg鞘脂-精胺siRNA和10mg/kg的鞘脂-亚精胺siRNA安全，毒性明智，因为未发现明显的死亡效应、观察到的临床症状、体重、临床病理学和在尸体剖检时大体病变的不利影响。
为了评估siRNA在正常小鼠肝、脾和骨髓中的生物分布，检查了递送到这些组织中的siRNA的水平。静脉注射24小时后，对小鼠实施安乐死，获取组织，并利用茎环qPCR方法进行siRNA定量。
使用EZ-RNAII总RNA分离试剂盒(BiologicalIndustries#20-410-100)从视网膜样品制备总RNA。在一些情况下，由视网膜样品制备triton萃取物：将视网膜样品称重，向各样品中加入0.25％的x10体积预热的TritonX-100。将混合物涡旋，在95℃孵育10分钟，在冰上冷却(10分钟)，最后离心(20,000g，20分钟，4℃)。收集上清液。
至于总RNA样品(或triton提取物)中所含siRNA的特异性扩增，通过使用SuperscriptII试剂盒(Invitrogen，#18064-014)，1μg总RNA(或5μltriton提取物上清液)作为模板和茎&环(S&L)引物进行逆转录(RT)反应来制备互补DNA(cDNA)。所述引物与受试siRNA的反义链部分互补，此外在其5’-端具有茎&环结构。
RT引物：对于RAC1_28扩增：1648-2/Rac128ASRT
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGTGCAA(SEQIDNO：11)
所得cDNA用作siRNA扩增的模板，利用SYBER-Green基定量PCR(qPCR)方法(SYBRGreen主混合物，AppliedBiosystems；#4309155)和两个扩增引物：一个与siRNA序列互补，第二个与RT引物的茎&环区互补。
qPCR引物：
RAC1_281695-3/Rac128ASF2CGGCGGCAGGATACCACTTTG(SEQIDNO):12)
1681-1/Rev_3AGTGCAGGGTCCGAGGTATT(SEQIDNO:13)
为了进行测试样品中siRNA的绝对定量，将几种已知的siRNA量(10-3皮摩尔)掺入视网膜提取物，接着如上所述进行RNA提取和cDNA的制备，从而生成标准曲线。通过qPCR扩增由掺入的样品cDNA制备连续稀释液。将各反应中得到的Ct值(Ct＝阈值循环，其中荧光水平超过所选阈值界限的PCR循环)针对相应的(Log10)siRNA量值作图，以生成标准曲线，其通过内插法量化未知样品中的siRNA。
图9A和9B示出不同组织中每种siRNA的定量。如在图9A和9B中可见，在脾、肝和骨髓中都观察到了鞘脂精胺siRNA化合物的剂量依赖性累积。此外，与从用未缀合的siRNA处理的小鼠获取的组织中鉴定的siRNA的量相比，用鞘脂-精胺siRNA处理的小鼠的脾、肝和骨髓中所鉴定的siRNA量显著较高，与未缀合的siRNA(50mg/kgsiRNA剂量)相比，达到肝中鞘脂精胺siRNA累积高至约高出100倍。
实施例12：鞘脂-精胺siRNA化合物示出在小鼠LLC1肿瘤组织中提高的累积
在本实验中，在其侧腹携带实体Lewis肺癌(LLC1)肿瘤的C57BL小鼠中通过植入的ALZET微渗透泵(型号：ALZET渗透泵2001D型，200μl，8μl/h，1天，Corp.Cupertino，CA)以30mg/Kg剂量连续皮下(SC)递送24小时后，测定LLC1肿瘤中鞘脂-精胺siRNA(SL-精胺RAC1_28_S2045和RAC1_28_S2081)和未缀合RAC1siRNA(Rac1_28_S1908)化合物的浓度。每个实验组包括6只在其侧腹携带实体Lewis肺癌(LLC1)瘤的C57BL小鼠，泵植入48小时后，对小鼠实施安乐死，并且获取肿瘤，通过茎环qPCR方法进行siRNA定量。
递送至来自用30mg/kg鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物处理的小鼠的LLC1肿瘤细胞的siRNA水平显著高于来自用30mg/kg未缀合的siRNA处理的小鼠的肿瘤细胞中累积的siRNA量。如在图10中可见，与用相同量的未缀合siRNA处理的小鼠相比，在取自用鞘脂-精胺siRNA处理的小鼠的肿瘤细胞中可见高出约150倍的量的siRNA，而在取自用鞘脂-精胺siRNA化合物处理的小鼠的肿瘤细胞中可见高出约60倍的量的siRNA。
实施例13：小鼠SKOV3肿瘤中靶向RAC1mRNA的鞘脂-精胺siRNA化合物的敲低活性
利用cDNA末端快速扩增(RACE)证实3次腹腔内施用10mg/kg的鞘脂-精胺siRNA(RAC1_28_S2045)后小鼠SKOV肿瘤中RNAi介导的RAC1mRNA切割。RNAi介导的靶mRNA切割发生在与siRNA引导链的10-11位碱基互补的核苷酸之间，从而产生两个mRNA片段：5’片段，代表切割位点上游的区域和3’片段，代表切割位点下游的区域。可以使用RACE法检测下游片段的存在，其基于将寡核苷酸适体连接到该片段的5’端，接着使用适体特异性正向引物和基因特异性反向引物进行RT-PCR扩增。
在腹腔内(i.p.)注射表3列出的化合物24小时之后，从SKOV3肿瘤样品中提取RNA，并进行RACE分析。通过Southern印迹杂交用对该预测的mRNA-RACE适体连接具有特异性的寡核苷酸探针分析扩增产物。将用20nMRAC1转染的细胞用作阳性对照。
图11示出的结果表明通过缀合的siRNA产生了针对RNAi介导的RAC1mRNA切割预测的合适的特异性RT-PCR(RACE)产物。然而，RACE产物仅见于来自眼中注射了对照盐水的RNA样品。
实施例、14：鞘脂-精胺Cy3标记siRNA的细胞穿透，RAC128S2281显微镜检查
本研究的目的是确定RAC1_28_S2132(未缀合的Cy3siRNA)和RAC1_28_S2281(SL-精胺Cy3siRNA)对细胞的穿透。本研究包括siRNA处理，随后用早期核内体标志物(EEA1)进行免疫荧光染色(IF)。对细胞进行分析以限定沿测试时间点两种成分(siRNA和早期核内体)的共定位。
在荧光显微镜下利用ApoTome光学切片分析染色的细胞。以最大强度投影(MIP)切视格式(cut-viewformat)示出图像。切视功能创建拍摄的所有光学切片图像的二维图像。为了确定siRNA与早期核内体的共定位状态，单独一个色移考虑是不可靠的，而使用分析软件进行图像分析在这样的研究是至关重要的。在下面的分析中，使用AxioVision性质(信息和直方图)来处理测试的所有siRNA的Z堆栈图像，并评估选定区域的共定位。
表3：示出与EEA1共定位的细胞的检测
如从表3中可见，用鞘脂精胺siRNA化合物处理的细胞在时间点2小时、3小时、4小时和6小时示出siRNA与早期核内体的共定位。未缀合的siRNA未观察到该共定位，其在细胞中仅示出微弱的信号。
实施例15：通过FACS进行细胞内化动力学
在本研究中，对鞘脂-精胺siRNA化合物(RAC1_28_S2281)的内化动力学进行了分析。在补充有10％胎牛血清和4mML-谷氨酰胺的DMEM中于37C、5％CO2下培养HeLa细胞。
在处理前一天，将所述细胞接种在6孔组织培养板中。染色步骤包括用100nM鞘脂-精胺siRNA化合物(RAC1_28_S2281)或未缀合对照孵育细胞0.5、1、2、4和6小时。除去细胞培养基，在1mlPBS中洗涤细胞，并以1400rpm离心5分钟。然后将细胞重悬于PBS中，并通过FACS观察HeLa细胞中的Cy3siRNA检测。采用前(FSC-H)-对侧-散射(SSC-H)门控细胞以排除碎片和死细胞，并使用FL-2过滤器通过FACScalibur测量Cy3的强度。
可以使用无法穿透完整细胞膜的活体染料例如台盼蓝(TB)来完成外部荧光的猝灭，其将内在化的颗粒与表面附着颗粒区分开来。为了将内在化并在细胞内的siRNA同与细胞膜相结合的siRNA区分开，使用TB淬灭规程。用50μl0.4％台盼蓝在室温下孵育细胞10分钟，以允许细胞外的Cy3信号淬火。在该处理后，仅可以观察到来自细胞中的siRNA的Cy3信号。在图13A和13B中，实线表示未处理的细胞，虚线表示鞘脂精胺处理的细胞。如在图13A中可见，30分钟后在用缀合的siRNA(虚线)处理的细胞中已可观察到细胞信号的移位，这表明鞘脂精胺缀合的siRNA与细胞相结合。此移位增加，达到6小时后的大多数细胞完全染色。在用未缀合的siRNA处理的细胞的直方图几乎没有观察这种移位。此外，图13B示出的用TB处理的细胞的FACS分析表明在诱导2小时时用缀合的siRNA处理的细胞的信号移位。这表明在30分钟内已结合的用Cy3标记的鞘脂-精胺siRNA化合物(参见上文)内在化并见于细胞内。在用Cy3标记的用未缀合的siRNA处理的细胞之分析中未见到该细胞信号移位，表明未缀合的siRNA不能穿透细胞。
虽然上述实施例已经对实施本发明实施方案的具体方式进行了说明，但在实践中本领域技术人员将会理解实施本发明实施方案的替选方式，这些替选方式并未在本中详述。应理解，应认为本公开内容是本发明原理的示例，无意于将本发明限制在所举例说明的实施方案。
本领域技术人员将认识到或能够确认使用不超出常规实验、本文所述本发明具体实施方案的等同方案。这样的等同方案旨在涵盖于上述权利要求。

Claims (51)

1.一种包含鞘脂-聚烷基胺缀合物的化合物，其具有通式I：
其中
R1是支链或直链C7-C24烷基、烯基或多烯基；
R2、R3和R4各自独立地选自由以下组成的组：氢、支链或直链聚烷基胺或其衍生物、核苷酸、寡核苷酸、偶联部分和保护基团；
R3’是氢、C1-C4烷基或保护基团；
A2、A3和A4各自独立地存在或不存在，但若存在则选自由C(O)、C(O)NHX、C(O)NHR5X、C(O)R5X、C(O)R5C(O)X、R5X和R5OC(O)X组成的组；
R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链C1-C10烷基链；
X存在或不存在，但若存在则为S、P、O或NH；
R2、R3或R4中的至少一者是支链或直链聚烷基胺或其衍生物；并且
R2、R3或R4中的至少一者是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
或者所述化合物的盐。
2.权利要求1所述的化合物，其中R1是C7-C24烷基、C10-C20烷基或C10-C16烷基。
3.权利要求2所述的化合物，其中R1是C13烷基。
4.权利要求2或3所述的化合物，其中A2或A4是C(O)。
5.权利要求4所述的化合物，其中A2是C(O)。
6.权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中R2是直链聚烷基胺或其衍生物。
7.权利要求6所述的化合物，其中所述直链聚烷基胺是精胺或其衍生物。
8.权利要求7所述的化合物，其中R3’是H，A2是C(O)并且A3不存在。
9.权利要求8所述的化合物，其具有通式(Ia)：
其中
A4存在或不存在，但若存在则选自由C(O)、C(O)NHX、C(O)NHR5X、C(O)R5X、C(O)R5C(O)X、R5X和R5OC(O)X组成的组；
R3和R3’独立地为氢或保护基团；
R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链C1-C10烷基链；并且
每个R6独立地为氢或保护基团；
或者所述化合物的盐。
10.权利要求6所述的化合物，其中所述直链聚烷基胺是亚精胺或其衍生物。
11.权利要求10所述的化合物，其中R3’是H，A2是C(O)并且A3是键。
12.权利要求11所述的化合物，其具有通式(Ib)：
其中
A4存在或不存在，但若存在则选自由C(O)、C(O)NHX、C(O)NHR5X、C(O)R5X、C(O)R5C(O)X、R5X和R5OC(O)X组成的组；
R3和R3’独立地为氢或保护基团；
R4是核苷酸、寡核苷酸或偶联部分；
R5是任选地被一个或多个杂原子取代的支链或直链C1-C10烷基链；并且
每个R6独立地为氢或保护基团；
或者所述化合物的盐。
13.权利要求9或12所述的化合物，其中A4是C(O)NHR5X。
14.权利要求13所述的化合物，其中R5是C6烷基链并且X是O。
15.权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中R4是偶联部分。
16.权利要求15所述的化合物，其中所述偶联部分选自由以下组成的组：亚磷酰胺；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯；胺(-NH2)；羧基(-COOH)或活化羧基；巯基(-SH)和二硫键(-S-S-)；羰基(-CHO)；氰基(-CN)；羟基(-OH)和叠氮化物。
17.权利要求16所述的化合物，其中所述偶联部分是亚磷酰胺，并且其中所述亚磷酰胺是2-氰乙基N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺。
18.权利要求17所述的化合物，其具有通式IIa或IIb：
其中R3、R3’和R6各自独立地为氢或保护基团。
19.权利要求16所述的化合物，其中所述偶联部分是NHS酯，所述化合物具有通式IIIa或IIIb：
其中R3、R3’和R6各自独立地为氢或保护基团。
20.权利要求1至14中任一项所述的化合物，其中R4是寡核苷酸。
21.权利要求20所述的化合物，其中所述寡核苷酸是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。
22.权利要求21所述的化合物，其中所述单链寡核苷酸是选自由以下组成的组的反义分子：反义DNA、反义RNA、反义DNA/RNA嵌合体、外显子跳跃分子、anti-miR、aRNA、适体、合成mRNA和shRNA。
23.权利要求21所述的化合物，其中所述双链寡核苷酸是选自由以下组成的组的双链RNA(dsRNA)分子：siRNA、miRNA和miRNA模拟物。
24.权利要求21所述的化合物，其中所述寡核苷酸经部分或完全化学修饰。
25.权利要求23所述的化合物，其中所述双链寡核苷酸是具有如下结构的双链RNA(dsRNA)：
5’(N)x-Z3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)
其中N和N’各自为未经修饰核糖核苷酸、经修饰核糖核苷酸或非常规部分；
其中(N)x和(N’)y分别是寡核苷酸，其中每个连续的N或N’通过共价键与相邻的N或N’相连；
其中x和y各自独立地为15至49的整数；
其中z”存在或不存在，但若存在则为与所述有义链的5’端共价连接的封端部分；
其中Z和Z’各自独立地存在或不存在，但若存在则为共价连接在其所在链的3’端的1至5个连续核苷酸或非核苷酸部分或其组合；
其中所述鞘脂-聚烷基胺缀合物共价连接至所述反义链的3’端、所述有义链的3’端或所述有义链的5’端中的至少一者；
其中所述(N’)y的序列与所述(N)x的序列基本互补；并且其中(N)x包含与靶RNA中的连续序列互补的反义序列；
前提是当所述鞘脂-聚烷基胺缀合物连接在所述有义链的5’端时，z”不存在。
26.权利要求25所述的化合物，其中所述连接每个连续的N或N’的共价键是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键。
27.权利要求25或26所述的化合物，其中x＝y并且x和y各自为19、20、21、22或23，优选地，x＝y＝19。
28.权利要求25或26所述的化合物，其中x为19至25的整数，y为15至17的整数。
29.权利要求25至28中任一项所述的化合物，其中所述鞘脂-聚烷基胺缀合物共价连接至(N’)y的3’端。
30.权利要求25至28中任一项所述的化合物，其中所述鞘脂-聚烷基胺缀合物共价连接至(N)x的3’端。
31.权利要求25至28中任一项所述的化合物，其中所述鞘脂-聚烷基胺缀合物共价连接至(N’)y的5’端。
32.权利要求29或31所述的化合物，其中Z存在。
33.权利要求30或31所述的化合物，其中Z’存在。
34.权利要求25至33中任一项所述的化合物，其中N和N’各自为未经修饰的核糖核苷酸。
35.权利要求25至33中任一项所述的化合物，其中N或N’中的至少一者为糖修饰的核糖核苷酸。
36.权利要求25至33中任一项所述的化合物，其中N或N’中的至少一者为非常规部分，所述非常规部分选自由以下组成的组：DNA、LNA、镜像核苷酸、2’5’连接的核苷酸和无碱基部分。
37.权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述(N’)y的序列与所述(N)x的序列完全互补，并且所述(N)x的序列与所述靶RNA完全互补。
38.权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述(N’)y的序列与所述(N)x的序列完全互补，并且所述(N)x的序列与所述靶RNA部分互补。
39.权利要求25至36中任一项所述的方法，其中所述(N’)y的序列与所述(N)x的序列部分互补，并且所述(N)x的序列与所述靶RNA部分互补。
40.权利要求38或39所述的方法，其中所述反义链[(N)x]的5’端核苷酸与所述靶RNA错配。
41.权利要求25至40中任一项所述的化合物，其中靶RNA是mRNA或非编码RNA，或长或短，转录自哺乳动物基因组。
42.一种组合物，其包含权利要求1至19中任一项所述的化合物，或所述化合物的盐；和药学上可接受的载体。
43.一种组合物，其包含权利要求20至41中任一项所述的化合物或所述化合物的盐；和药学上可接受的载体。
44.一种用于治疗患癌受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗量的权利要求20至41中任一项所述的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或权利要求43所述的组合物。
45.权利要求20至41中任一项所述的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或权利要求43所述的组合物，其用于治疗癌症。
46.权利要求20至41中任一项所述的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物或权利要求43所述的组合物用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
47.权利要求44所述的方法或权利要求45至46所述的用途，其中所述化合物配制用于瘤内、全身、腹膜内或皮下施用。
48.一种用于增强治疗性寡核苷酸内体释放入细胞的胞质的方法，其包括使所述细胞与权利要求20至41中任一项所述的化合物或权利要求43所述的组合物相接触，从而增强内体释放。
49.一种鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺。
50.权利要求49所述的鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺，其中所述鞘脂是鞘氨醇；并且其中所述聚烷基胺是精胺或亚精胺。
51.一种合成鞘脂-聚烷基胺亚磷酰胺的方法，其基本上如说明书中所公开。
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