CN101263230A - 递送核糖核酸至细胞的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了导致双链RNA(dsRNA)在动物细胞内被摄取和靶mRNA降低的组合物、方法，以其用于制备治疗动物受试者的肿瘤坏死因子－α(TNF－α)相关炎症状态的药剂的混合物的用途，该混合物包含核酸递送增强多肽和dsRNA，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是两性的并包含核酸结合特性。

Description

递送核糖核酸至细胞的药物组合物

技术领域

本发明涉及递送核糖核酸进入细胞的方法和组合物。更具体的，本发明涉及递送双链多聚核苷酸进入细胞以修饰靶基因的表达、改变诸如细胞疾病状态或潜能等表型的方法和制剂。

发明背景

递送核酸进入动物和植物细胞长期是分子生物学研究和开发的重要目标。在基因治疗、反义治疗和RNA干扰(RNAi)治疗领域的新发展产生了开发将核酸引入细胞的更有效方法的需求。

多种多样的质粒和其它核酸“载体”已经被发展用于递送大多聚核苷酸分子进入细胞。通常这些载体与包含用于转化靶细胞的完整基因的大DNA分子合并，以表达科学或治疗目的的基因。

外源性核酸人工递送入细胞的过程通常被称为转染。细胞可用许多技术和材料转染，以摄取外源性的功能性核酸。最常使用的转染方法是磷酸钙转染和电穿孔。已经发展了许多其它转导细胞递送外源性DNA或RNA分子的方法，包括病毒介导的转导，阳离子脂质或脂质体的递送，以及许多靶向机械的或生化的膜破坏/渗透的方法(例如，使用去垢剂、微注射或离子枪)。

RNA干扰是细胞内序列特异性的转录后基因沉默的过程，由双链(ds)多聚核苷酸，通常是与靶信使RNA(mRNA)的一部分在序列上是同源的dsRNA启动。在细胞内引入合适的dsRNA导致内源的同源的mRNAs(即与引入的dsRNA共享实质序列一致性的mRNAs)的破坏。所述dsRNA分子被所谓的dicer的RNase III家族的核酸酶裂解成小干扰RNAs(siRNAs)，其长度为19-23个核苷酸(nt)。然后siRNAs合并入被称作RNA-诱导沉默复合物或“RISC”的多组分核酸酶中。该RISC通过它们与所述siRNA的同源性识别mRNA底物，并通过结合与破坏所述靶mRNA完成基因表达的沉默。

RNA干扰是新出现的修饰植物和动物特异基因表达的一项有前景的技术，因此，被期望提供治疗通过内源性基因表达的修饰可治疗的众多疾病和病症的有用工具。

本领域对递送siRNAs和其他小抑制核酸(siNAs)入细胞的更好的工具和方法仍然有长期的需求，特别是考虑到现有的递送核酸到细胞的技术被递送试剂的低效率和/或高毒性所限制这一事实。亟需将有效量、有活性的和持久状态的siNAs，并用非毒性载体递送到所选择的细胞、组织或隔室，以改变靶细胞的表型或疾病状态的方式，介导基因表达调节的调节的方法和配方。

发明概述

本发明的一个方面是包含多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的组合物，其中该多聚核苷酸递送增强多肽是两性的，并包含核酸结合特性。在一个相关的实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽包含约5到约40个氨基酸，并具有选自聚(Lys，Tryp)4∶1MW 20,000-50,000、聚(Orn，Trp)4∶1 MW 20,000-50,000、蜂毒肽、组蛋白H1、组蛋白H3和组蛋白H4、SEQ ID NOS 27-31、35-42、45、47、50-59、62、63、67、68、73、74、76、78-87、89-92、94-108、164-178和180-186的序列的全部或部分。

在另一个实施方式中，所述组合物导致dsRNA摄入动物细胞内。在另一个实施方式中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方式中，给予动物所述组合物。在一个相关的实施方式中，所述动物是哺乳动物。在另一个实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是乙酰化的。在一个相关的实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是聚乙二醇化的(pegylated)。在另一实施方式中，所述的dsRNA是由与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的部分基因互补的约10到约40个碱基对序列组成的小干扰核糖核酸(siRNA)。在一个相关的实施方式中，所述的dsRNA是由选自SEQ ID NOS：109-163和187的约10到约40个碱基对序列组成的siRNA。在另一个实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽是与dsRNA混合的、复合的或偶联的。在另一个实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽结合到所述dsRNA。在另一实施方式中，任一上述组合物进一步包括阳离子脂质。在一相关实施方式中，所述阳离子脂质选自N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲氯化铵、1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷、1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵、1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺、5-羧基精胺氨基乙酸双十八烷基酰胺、四甲基四棕榈酰精胺、四甲基四油酰精胺、四甲基四月桂基精胺、四甲基四肉豆蔻基精胺和四甲基二油酰精胺、DOTMA(N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲氯化铵)、DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙烷基溴化铵)、DDAB(双十八烷基二甲基溴化铵)、多价阳离子脂质体、脂精胺、DOSPA(2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵)、DOSPER(1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺，二-和四-烷基-四-甲基精胺)、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油酰精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)、TMDOS(四甲基二油酰精胺)DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(TRANSFECTAM

)、与非阳离子脂结合的阳离子脂质、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇、由DOSPA与DOPE的3∶1(w/w)混合物和DOTMA与DOPE的1∶1(w/w)混合物组成的阳离子脂质组合物。

本发明的另一方面是导致双链核糖核酸(dsRNA)摄入动物细胞内的方法，其包括用含有多聚核苷酸递送增强多肽和所述dsRNA的混合物孵育所述动物细胞，其中多聚核苷酸递送增强多肽是两性的，并包含核酸结合特性。

本发明的另一方面是修饰动物细胞内靶基因表达的方法，其包括用含有多聚核苷酸递送增强多肽和dsRNA的混合物孵育动物细胞，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是两性的，并包含核酸结合特性，其中所述dsRNA与所述靶基因区域互补。

在相关的实施方式中，任一上述方法中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。

本发明的另一方面是改变动物受试者的表型，其包括给予动物受试者多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的混合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是两性的，并包含核酸结合特性，其中所述dsRNA与所述受试者的靶基因区域互补。在相关的实施方式中，所述动物可以是哺乳动物。

在另一实施方式中，任一上述方法中所述多聚核苷酸递送增强多肽包含约5到约40个氨基酸，并具有选自聚(Lys，Tryp)4∶1MW20,000-50,000、聚(Orn，Trp)4∶1MW 20,000-50,000、蜂毒肽、组蛋白H1、组蛋白H3和组蛋白H4、SEQ ID NOS 27-31、35-42、45、47、50-59、62、63、67、68、73、74、76、78-87、89-92、94-108、164-178和180-186的序列的全部或部分。在相关实施方式中，任一上述方法中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是乙酰化的。在另一相关实施方式中，任一上述方法中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是聚乙二醇化的。在另一实施方式中，任一上述方法中所述dsRNA是由与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的部分互补的约10到约40个碱基对序列组成的小干扰核糖核酸(siRNA)。在相关实施方式中，任一上述方法中所述的dsRNA是由选自SEQ ID NOS 109-163和187的约10到约40个碱基对序列组成的siRNA。在另一实施方式中，任一上述方法中所述多聚核苷酸递送增强多肽是与dsRNA混合的、复合的或偶联的。在另一实施方式中，任一上述方法中所述多聚核苷酸递送增强多肽结合到所述的dsRNA。在另一实施方式中，任一上述方法进一步包括阳离子脂质。在一相关实施方式中，任一上述方法中所述阳离子脂质选自N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷、1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙烷基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵、1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺、5-羧基精胺氨基乙酸双十八烷基酰胺、四甲基四棕榈酰精胺、四甲基四油酰精胺、四甲基四月桂基精胺、四甲基四肉豆蔻基精胺和四甲基二油酰精胺、DOTMA(N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-氯化三甲铵)、DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙基溴化铵)、DDAB(双十八烷基二甲基溴化铵)、多价阳离子脂质体、脂精胺、DOSPA(2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵)、DOSPER(1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺，二-和四-烷基-四-甲基精胺)、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油酰精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)、TMDOS(四甲基二油酰精胺)DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(TRANSFECTAM)、与非阳离子脂结合的阳离子脂质、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇、由DOSPA与DOPE的3∶1(w/w)混合物和DOTMA与DOPE的1∶1(w/w)混合物组成的阳离子脂质组合物。

本发明的另一方面是包含多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的混合物在制备治疗动物受试者肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相关炎症状态的药物中的用途，其中所述聚核苷酸递送增强多肽是两性的，并包含核酸结合特性，其中所述药物能够降低TNF-αRNA水平，从而预防或减轻所述TNF-α相关炎症状态的发生或严重度。在一实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽包含约5个到约40个氨基酸，并具有选自聚(Lys，Tryp)4∶1 MW 20,000-50,000、聚(Orn，Trp)4∶1 MW20,000-50,000、蜂毒肽、组蛋白H1、组蛋白H3和组蛋白H4、SEQ IDNOS 27-31、35-42、45、47、50-59、62、63、67、68、73、74、76、78-87、89-92、94-108、164-178和180-186的序列的全部或部分。在一相关的实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是乙酰化的。在另一相关实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是聚乙二醇化的。在另一实施方式中，所述dsRNA是由与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的部分互补的约10到约40个碱基对序列组成的小干扰核糖核酸(siRNA)。在一相关的实施方式中，所述的dsRNA是由选自SEQ ID NOS 109-163和187的约10到约40个碱基对序列组成的siRNA。在另一实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽是与所述dsRNA混合的、复合的或偶联的。在另一实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽结合到所述dsRNA。在另一实施方式中，所述动物受试者是哺乳动物。

附图简要说明

图1显示复合或偶联到本发明的多聚核苷酸递送增强多肽(SEQID NO：35)的siRNAs的肽介导的摄取以及对细胞活性的影响。细胞摄取和细胞活性以百分比表示。

图2进一步显示复合或偶联到本发明的多聚核苷酸递送增强多肽(SEQ ID NO：35)的siRNAs的肽介导的摄取。细胞摄取以平均荧光密度(MFI)表示。

图3显示在人类单核细胞内的siRNAs与几种不同的多聚核苷酸递送增强多肽的肽介导的摄取。

图4显示用与几种不同的多聚核苷酸递送增强多肽复合的siRNAs暴露后，对人类单核细胞活性的影响。

图5显示与Ramicade处理的受试者的RA进展相比，siRNA/肽注射鼠的RA进展延迟。RA进展用爪评分指数测量。

图6提供了本发明的PN73合理设计的衍生的多聚核苷酸递送增强多肽在小鼠尾部成纤维细胞的摄取功效和活性研究的结果。

图7显示与脂质体介导的siRNAs的递送相比，复合到本发明的多聚核苷酸递送增强多肽的siRNAs的肽介导的摄取不引发干扰素反应。(A)：与脂质体复合的siRNA(B)：与PN73(1∶5)复合的siRNA。

图8显示偶联到多聚核苷酸递送增强多肽的siRNAs比复合到多聚核苷酸递送增强多肽的siRNAs在体外有更强的敲低活性。

图9显示与多聚核苷酸递送增强多肽的胆固醇偶联的siRNAs和未偶联的siRNAs之间的细胞摄取比较。

图10显示与多聚核苷酸递送增强多肽的胆固醇偶联的siRNAs能够挽救细胞摄取的血清抑制。

本发明示例性实施方式的描述

本发明通过提供利用与多聚核苷酸递送增强多肽组合的小干扰核糖核酸(siNA)或其前体的新型组合物和方法满足了这些需求，并实现了其它的目的和优势。所述多聚核苷酸递送增强多肽是天然的或人工多肽，根据它增强包括siNAs和它们前体的多核苷酸的细胞内递送或摄取的能力而被选择。

在本发明所述新型组合物内，所述siNA可与多聚核苷酸递送增强多肽混合或复合或偶联，形成增强细胞内siNA递送的组合物，与将靶细胞与裸siNA(即没有本发明的多聚核苷酸递送增强多肽的siNA)接触产生的递送相比。

在本发明的一些实施方式中，所述的多聚核苷酸递送增强多肽是组蛋白或多肽或肽片段、其衍生物、类似物或偶联物。在这些实施方式中，所述siNA与一个或多个全长组蛋白或至少部分对应组蛋白的部分序列的多肽混合、复合或偶联，例如下面组蛋白的一种或多种：组蛋白H1，组蛋白H2A，组蛋白H2B，组蛋白H3或组蛋白H4，或包含组蛋白至少部分序列的其一个或多个多肽片段或衍生物，通常是天然组蛋白的至少5-10或10-20个连续的残基。在更多具体的实施方式中，所述siRNA/组蛋白混合物、复合物或偶联物基本上没有两性化合物。在其他具体的实施方式中，所述的与组蛋白或多肽混合、复合或偶联的siNA包含双链RNA，例如具有30个或更少的核苷酸的双链RNA，且是小干扰RNA(siRNA)。在示例性实施方式中，所述组蛋白多聚核苷酸递送增强多肽包含组蛋白H2B的片段，例如下文中描述的命名为PN73的多聚核苷酸递送增强多肽。在另一具体实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽可被聚乙二醇化，以提高稳定性和/或功效，特别是在在体给药的环境下。

在本发明的另外的实施方式中，所述多聚核苷酸递送增强多肽被选择或合理设计为包含两性的氨基酸序列。例如，可以选择有用的多聚核苷酸递送增强多肽，其包含形成疏水序列域或基序的多个非极性或疏水氨基酸残基，连接到形成带电荷的序列域或基序的多个带电荷的氨基酸残基，形成两性肽。

在其他实施方式中，选择的所述多聚核苷酸递送增强多肽包含蛋白转导域或基序，以及融合生成肽域或基序。蛋白转导域是能够插入并优选穿过细胞膜的肽序列。融合生成肽是一种使例如胞质膜或包被内函体膜的脂膜去稳定的肽，其作用可被低pH加强。示例的融合生成域或基序可在广泛多样性的病毒融合蛋白和其它蛋白中发现，例如成纤维细胞生长因子4(FGF4)。

为了合理设计本发明中的多聚核苷酸递送增强多肽，利用蛋白的转导域作为易化核酸通过胞膜进入细胞的基序。在一些实施方式中，递送的核酸包被于内涵体内。内涵体内部pH低，导致融合形成肽基序使内涵体膜去稳定。内涵体膜的去稳定和裂解允许了siNA释放入胞浆，在那里该siNA能与RISC复合物结合，并定向于它的靶mRNA。

选择性并入本发明中的多聚核苷酸递送增强多肽的蛋白转导域的实例包括：

1.TAT蛋白转换域(PTD)(SEQ ID NO：1)KRRQRRR；

2.穿膜肽PTD(SEQ ID NO：2)RQIKIWFQNRRMKWKK；

3.VP22PTD(SEQ ID NO：3)DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD；

4.Kaposi FGF 信号序列(SEQ ID NO：4)AAVALLPAVLLALLAP，和SEQ ID NO：5)AAVLLP LLPVLLAAP；

5.人类β3整合素信号序列(SEQ ID NO：6)VTVLALGALAGVGVG；

6.gp41融合序列(SEQ ID NO：7)GALFLGWLGAAGSTMGA；

7.中美凯门鳄(Caiman crocodylus)Ig(v)轻链(SEQ ID NO：8)MGLGLHLLVLAAALQGA；

8.hCT-来源的肽(SEQ ID NO：9)LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP；

9.Transportan(SEQ ID NO：10)GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL；

10.低聚体(SEQ ID NO：11)TPPKKKRKVEDPKKKK；

11.精氨酸肽(SEQ ID NO：12)RRRRRRR；以及

12.两性模式肽(SEQ ID NO：13)KLALKLALKALKAALKLA。

选择性并入本发明中的多聚核苷酸递送增强多肽的病毒融合肽融合生成域的实例包括：

1.流感病毒HA2(SEQ ID NO：14)GLFGAIAGFIENGWEG；

2.Sendai F1(SEQ ID NO：15)FFGAVIGTIALGVATA；

3.呼吸道合胞病毒F1(SEQ ID NO：16)FLGFLLGVGSAIASGV；

4.HIV gp41(SEQ ID NO：17)GVFVLGFLGFLATAGS；以及

5.伊波拉病毒GP2(SEQ ID NO：18)GAAIGLAWIPYFGPAA。

在本发明的另外实施方式中，提供了与DNA结合域或基序合并的多聚核苷酸递送增强多肽，其在本发明的方法和组合物内，易化了多肽-siNA复合物的形成和/或增强了siNAs的递送。本文中示例的DNA结合域包括被描述为DNA结合调节蛋白的“锌指”域及下述表1确认的其他蛋白(参见，例如，Simpson，et al.，J.Biol.Chew，278：28011-28018，2003)。

^*该表显示了结合双链DNA的保守的锌指基序，其特征在于0-x(2，4)-C-x(12)-H-x(3)-H基序模式(SEQ E)NO：188)，根据本发明其自身可被用于选择和设计另外的多聚核苷酸递送增强多肽。

^**表1显示的Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、DrosBtd、DrosSp、CeT22C8.5和Y4pB1A.4的序列在本发明中分别被指定为SEQ ID NO：s 19、20、21、22、23、24、25和26。

用于构建本发明中的多聚核苷酸递送增强多肽的其他DNA结合域包括，例如HTV Tat蛋白序列的部分(参见下述实例)。

在本发明下面描述的示例性实施方式中，通过将前述的任一结构元件、域或基序合并入单链多肽中，合理设计和构建多聚核苷酸递送增强多肽，以有效的介导增强的siNAs进入靶细胞的递送。例如，所述TAT多肽蛋白转导域与命名为HA2的流感病毒红血球凝集素蛋白的N-末端20个氨基酸融合，产生了本发明中的示例的多聚核苷酸递送增强多肽。在本公开内容中提供了许多其他的多聚核苷酸递送增强多肽构建体，表明本发明的概念广泛应用于产生和使用增强siNA递送的多样化装配的有效多聚核苷酸递送增强多肽。

本发明的另外示例的多聚核苷酸递送增强多肽可选自下列肽：WETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQ ID NO：27)；GKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：28)，RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：29)，GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：30)，GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ IDNO：31)，聚Lys-Trp，4∶1，MW 20,000-50,000；和聚Orn-Trp，4∶1，MW 20,000-50,000。用于在本发明的组合物和方法中的另外的多聚核苷酸递送增强多肽包含全部或部分蜂毒肽蛋白序列。

仍有其他的示例的多聚核苷酸递送增强多肽在下述实例中被确定。在本发明的方法和组合物内，这些肽中的任一种或组合可以被选择或组合，以产生有效的多聚核苷酸递送增强多肽试剂，诱导或易化siNAs的细胞内递送。

在本发明更具体的方面，包含siRNA和多聚核苷酸递送增强多肽的混合物、复合物或偶联物可被选择性任选地与例如LIPOFECTIN脂质体

的阳离子脂质结组合(例如，混合或复合)。在本文中，意外公开了与单独的siRNA本身复合或偶联的多聚核苷酸递送增强多肽能完成足以介导RNAi的基因沉默的所述siNA的递送。然而，它进一步意外公开当与例如脂质体的阳离子脂质混合或复合时，siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽的复合物或偶联物显示更强的介导siNA递送和基因沉默的活性。为了制备由聚核苷酸递送增强多肽、siRNA和阳离子脂质组成的这些复合物，可以将所述siRNA和肽在合适的介质，例如细胞培养基中先混合在一起，此后，将阳离子脂质加入到混合物中，以形成siRNA/递送肽/阳离子脂质复合物。任选地，可以将所述siRNA和阳离子脂质在合适的介质，例如细胞培养基中先混合在一起，此后，将所述siRNA加入到混合物中，以形成siRNA/递送肽/阳离子脂质复合物。

在本发明的这些方面中，有用的阳离子脂质的实例包括N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷、1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙烷基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵、1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺、5-羧基精胺氨基乙酸双十八烷基酰胺、四甲基四棕榈酰精胺、四甲基四油酰精胺、四甲基四月桂基精胺、四甲基四肉豆蔻基精胺和四甲基二油酰精胺、DOTMA(N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙烷基溴化铵)、DDAB(双十八烷基二甲基溴化铵)、多价阳离子脂质体、脂精胺、DOSPA(2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵)、DOSPER(1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺，二-和四-烷基-四-甲基精胺)、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油酰精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)、TMDOS(四甲基二油酰精胺)DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(TRANSFECTAM

)。其他有用的阳离子脂质在例如美国专利号6,733,777、美国专利号6,376,248、美国专利号5,736,392、美国专利号5,686,958、美国专利号5,334,761和美国专利号5,459,127中描述过。

阳离子脂质任选地与非阳离子脂质组合，特别是中性脂，例如，诸如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇的脂类。由DOSPA与DOPE的3∶1(w/w)混合物和DOTMA与DOPE(LIPOFECTIN

，Invitrogen)的1∶1(w/w)混合物组成的阳离子脂质组合物通常用于转染本发明的组合物中。优选的转染组合物是那些能诱导更高级的真核细胞系充分转染的组合物。

在示例性实施方式中，本发明描述了包括与多聚核苷酸递送增强多肽混合、复合或偶联的例如短干扰核酸(siNA)的小核酸分子、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(mRNA)或短发夹RNA(shRNA)的小核酸分子的组合物的特征。

本发明中使用的术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”指能够抑制或下调基因表达或病毒复制的任一核酸分子，例如，通过以一种序列特异的方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默。在示例性实施方式中，所述siNA是包含自我互补有义区和反义区的双链多核苷酸分子，其中所述反义区包含与下调表达的靶核酸分子的核苷酸序列互补的核酸序列或其部分，所述的有义区包含与靶核酸序列或其部分对应(即其在序列上大多数相同)的核酸序列。

“siNA”指小干扰核酸，例如siRNA，其是短长度的双链核酸(或任选地，其较长的前体)，该小干扰核酸在靶细胞内没有不可接受的毒性。本发明中有用的siNAs的长度在一些实施方式中被优化在约21-23bp的长度。但是，包括siRNAs在内的有用的siNAs的长度没有特定的限制。例如，siNAs最初可被以一种前体形式呈递给细胞，该前体形式基本上不同于所述siNA的终末或加工形式，该终末或加工后形式在递送到靶细胞时或递送到靶细胞后，存在并发挥基因沉默活性。siNAs的前体形式，例如，包括前体序列元件，其在递送时或递送后被加工、降解、改变或裂解，以产生介导基因沉默的细胞内有活性的siNA。因此，在一些实施方式中，本发明内有用的siNAs具有，例如，大约100-200碱基对、50-100碱基对或少于约50个碱基对的前体长度，其在靶细胞内产生有活性的、加工后的siNA。在其他实施方式中，有用的siNA或siNA前体的长度大约是10到49bp，15到35bp或约21到30bp。

如上所述，在本发明的某些实施方式中，多聚核苷酸递送增强多肽用于易化包括siNAs大核酸前体在内的比常规siNAs更大的核酸分子的递送。例如，可以利用本发明中的方法和组合物增强代表“前体”的较大核酸向目标siNAs的传递，其中前体氨基酸在递送到靶细胞之前、之中或之后可被裂解或加工，形成调节靶细胞内基因表达的活性siNA。例如，siNA前体多聚核苷酸可选择为包含自身互补的有义区和反义区的环形、单链多聚核苷酸、有两个或更多的环状结构和茎部，其中所述反义区包含与靶核酸分子或其部分互补的核酸序列，所述有义区的核苷序列与靶核酸序列或其部分是对应的，而且其中所述的环形多聚核苷酸能被在体内或体外加工，以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。

哺乳动物细胞内，超过30个碱基对长的dsRNAs能活化通常由干扰素诱导的dsRNA依赖激酶PKR和2′，5-寡腺苷酸合成酶。活化的PKR通过磷酸化翻译转录因子起始真核启动子2α(eIF2α)抑制一般翻译，同时2′，5-寡腺苷酸合成酶通过活化RNase L导致非特异性的niRNA降解。本发明中所述的siNAs由于尺寸小(特指非前体形式)，通常少于30个碱基对，大多数通常在为约17-19，19-21或21-23个碱基对，从而避免了活化干扰素反应。

与长dsRNA非特异性效应相比，siRNA在哺乳动物系统内能介导选择性的基因沉默。带有一短环且茎上有19到27碱基对的发夹RNAs也选择性沉默与其双链茎上的序列互补的基因的表达。哺乳动物细胞能将短发夹RNA转换成siRNA，以介导选择性的基因沉默。

RISC介导含有与siRNA双链的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在与siRNA双链的反义链互补区的中间。研究已经表明当包含3′端2个核苷酸突出时，21个核苷酸的siRNA双链活性最高。而且，用2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸完全取代一条或两条siRNA链就消除了RNAi活性，然而用脱氧核苷酸(2′-H)取代siRNA3′末端突出的核苷酸被报道是耐受的。

研究已经表明用脱氧核苷酸取代有2个3′核酸突出的21-mersiRNA双链的3′突出片段对RNAi活性没有不利作用。已经报道用脱氧核苷酸取代所述siRNA的每端的多达4个核苷是耐受良好的，而用脱氧核苷酸完全取代则导致丧失RNAi活性。

可选地，所述siNAs可作为单一或多重的转录产物被递送，其由编码该单一或多重的siNAs并指导它们在靶细胞内表达的多聚核苷酸载体表达。在这些实施方式中，表达在靶细胞内的siRNAs的最终转录产物的双链部分的长度可以是，例如15到49bp、15到35bp或约21到30bp。在示例性实施方式中，siNAs的双链部分(其中两条链是配对的)并不局限于完全配对的核苷片段，可包含由于错配(相对应的核苷酸不是互补的)、凸起(一条链上缺少对应的互补核苷酸)、突出等等造成的非配对部分。能够包含非配对部分的程度是它们不干扰siNA形成。在更详细的实施方式中，“凸起”可包含1到2个非配对的核苷酸，且两条链配对的siNAs双链区域可包含从约1到7或约1到5的凸起。此外，可以出现的包含在siNAs双链区的“错配”部分的数目是从约1到7或约1到5。最容易发生的错配的核苷酸一个是鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。这些错配可归因于，例如，在编码有义RNA的对应DNA中C到T、G到A的突变，但其他的原因也是可预期的。而且，在本发明中，两条链配对的siNAs双链区可同时包含在指定的大约数目范围内的凸起和错配部分。

本发明中siNAs的末端结构可是钝性的或是粘性的(突出的)，只要siNA保留它沉默靶基因表达的活性即可。粘性(突出的)的末端结构并仅不局限于其他人报道的3′突出。相反，可以包括5′突出结构，只要它能，例如通过RNAi，诱导基因沉默效应。此外，只要突出不破坏siNA的基因沉默活性，突出核苷酸的数目并不局限于报道的2或3个核苷酸的限定，而可以是任何数目。例如，突出可包含从1到8个核苷酸，更常见的是从2个到4个核苷酸。有粘性末端结构的siNAs的总长度表示为配对双链部分的长度和在两末端一对包含突出的单链的长度的总和。例如，在两末端有4个核苷酸突出的19bp的双链RNA的示例中，总长度表示成23bp。而且，因为突出序列可能对靶基因的特异性低，它与靶基因序列并不是一定互补(反义)或相同(有义)。而且，只要siNA能维持它对靶基因的基因沉默效应，它可包含低分子量的结构(例如像tRNA、rRNA或病毒RNA等的天然RNA分子，或人工RNA分子)，例如，在末端的突出部分。

此外，siNAs的末端结构可具有茎-环结构，其中双链核酸的一侧末端由连接子(linker)核酸连接，例如，连接子RNA。双链区的长度(茎-环部分)可以是，例如15到49bp，经常是15到35bp，更常见的是约21到30bp。可选择地，表达在靶细胞内的siNAs的终末转录产物的双链区长度可以是，例如，约15到49bp、15到35bp，或约21到30bp。使用连接子片段时，对连接子的长度没有特别的限制，只要它不防碍茎部的配对。例如，为了稳定茎部的配对和抑制编码这部分的DNAs之间的再结合，连接子部分可有三叶草的tRNA结构。即便连接子的长度妨碍了茎部的配对，允许茎部配对也是可能的，例如，构建包含内含子的连接子部分，使内含子在前体RNA加工成成熟RNA的过程中被剪切掉，由此允许茎部配对。在茎-环siRNA中，没有环状结构的RNA任一端(头或尾)可有低分子量的RNA。正如上面描述的，这些低分子量的RNAs可包括诸如tRNA、rRNA或病毒RNA的天然RNA分子，或人工RNA分子。

siNA也可包含有与靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列的单链多聚核苷酸(例如，这种siNA分子不需要与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列存在于所述siNA分子中)，其中所述单链多聚核苷酸可进一步包含末端磷酸基团，例如5′-磷酸基(参见，例如Martinez，et al.，Cell.110：563-574，2002，和Schwarz，et al.，Molecular Cell 70：537-568，2002)，或5′，3′-二磷酸。

如本发明中使用的，术语siNA分子并不局限于只包含天然产生的RNA或DNA，也包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方式中，本发明中的短干扰核酸分子缺乏含有2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在某些实施方式中，短干扰核酸不需要含有2′-羟基基团的核苷酸存在来介导RNAi，正因如此，本发明中的短干扰核酸分子可任选不包括任何核糖核苷酸(例如，含有2′-羟基基团的核苷酸)。然而，不需要核糖核苷酸存在于siNA分子以支持RNAi的这些siNA分子可有包含具有2′-羟基基团一个或多个核苷酸的的一个附着连接子或多个连接子或其他附着或相联的基团、部分或链。任选地，siNA分子可在约5％、10％、20％、30％、40％或50％的核苷酸位置包含核糖核苷酸。

本发明中使用的术语siNA所指与其他用于描述能够介导序列特异性的RNAi的核酸分子的术语是等同的，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡核苷酸、化学修饰siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)，以及其他。

在其他实施方式中，本发明中使用的siNA分子可包含分离的有义和反义序列或区域，其中该有义和反义区是由核苷或非核苷连接子分子共价连接，或选择性的由离子相互作用、氢键、范氏化力相互作用、疏水相互作用和/或stacking相互作用非共价键连接。

在其他实施方式中，本发明中使用的siNA分子可包含单独的有义和反义序列或区域，其中该有义和反义区是由核苷或非核苷连接分子共价连接，或选择性的由离子相互作用、氢键、范德华力相互作用、疏水相互作用和/或堆积(stacking)相互作用非共价键连接。

“反义RNA”指有与靶基因mRNA互补序列的RNA链，并被认为通过与靶基因mRNA结合诱导RNAi。“有义RNA”有与反义RNA互补的序列，退火至它互补的反义RNA杂交形成siRNA。这些反义和有义RNA常规由RNA合成仪合成。

本发明中所使用的术语“RNAi构建体”是用于本说明书中的通用术语，包括小干扰RNAs(siRNAs)、发夹RNAs和其他能在体内被裂解形成siRNAs的RNA类型。本发明中的RNAi构建体也包括能够产生在细胞内形成dsRNAs或发夹RNAs的转录本和/或在体内产生siRNAs的转录本的表达载体(也被称为RNAi表达载体)。任选地，该siRNA包括单链或双链siRNA。

siHybrid分子是与siRNA有相似功能的双链核酸。siHybrid由RNA链和DNA链组成，而不是双链RNA分子。优选地，所述RNA链是反义链，与结合到靶mRNA的链相同。由DNA链和RNA链杂交产生的siHybrid有杂交互补部分和优选的至少一个3′突出末端。

本发明中使用的siNAs可由两个分离的寡核苷酸来组装，其中一条链是有义链，另一条是反义链，其中所述反义链和有义链本身是互补的(即每条链含有与另一条链的核苷酸序列互补的核苷酸序列；如此其中的反义链和有义链形成双股或双链结构，例如其中该双链区域约是19个碱基对)。所述反义链含有与靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述有义链可含有与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列。可选择地，siNA可由单一寡核苷酸来组装，其中siNA自身互补的有义和反义区通过基于核酸或基于非核酸的连接子来连接。

在另一实施方式中，根据本发明所述方法和组合物，用于细胞内递送的siNAs可是双股、不对称双股、含发夹或不对称发夹二级结构的多聚核苷酸，其有自身互补的有义和反义区，其中所述反义区包含与分离的靶核酸分子或其部分核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述有义区包含与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列。

发生在siNA的化学修饰的非限定性实例包括，但不限于，硫代磷酸酯核苷酸间键合(phosphorothioate internucleotide linkages)、2′-脱氧核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核苷酸、“通用碱基”核苷酸、″无环″核苷酸、5-C-甲基核苷酸，以及末端甘油基和/或反向脱氧脱碱基残基的掺入。已有研究表明这些化学修饰用于各种siNA构建体中时，可以保护细胞内RNAi活性，同时明显增加这些化合物的血浆稳定性。

在非限定性实例中，核酸分子中引入化学修饰的核苷酸为克服外源性递送的天然RNA分子固有的在体稳定性和生物活性的潜在限制提供了强大的工具。例如，因为化学修饰的核酸分子在血清中倾向于有更长的半衰期，所以使用化学修饰的核酸分子能够用更低剂量的特定核酸分子达到给定的治疗效应。而且，某些化学修饰能够通过靶向特定细胞或组织和/或改善核酸分子的细胞摄取提高核酸分子的生物活性。因此，即便与天然核酸分子，例如，与完全-RNA核酸分子相比，化学修饰的核酸分子的活性降低，但由于该分子改善的稳定性和/或递送，该修饰的核酸分子的总体活性比天然分子的活性要高。与天然未修饰的siNA不同，化学修饰的siNA也能将活化人类干扰素的可能性降低到最小。

本文描述的siNA分子，本发明的siNA分子的反义区包括在上述反义区的3′末端的硫代磷酸酯核苷酸间键合。

在本发明描述的siNA分子的任一实施方式中，所述的反义区包含上述反义区的5′末端的约1到约5个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在本发明描述的siNA分子的任一实施方式中，本发明siNA分子的3′末端核苷酸突起可包含在核酸糖、碱基或骨架上化学修饰的核糖核酸或脱氧核糖核酸。在本发明描述的siNA分子的任一实施方式中，3′末端核苷酸突起可包含一个或多个通用碱基核苷酸。在本发明描述的siNA分子的任一实施方式中，3′末端核苷酸突起可包含一个或多个无环核苷酸。

例如，在非限定性实例中，本发明描述了在一条siNA链中有1、2、3、4、5、6、7、8或更多的硫代磷酸酯核苷酸间键合的化学修饰的短干扰核酸(siNA)的特征。在另一实施方式中，本发明描述了在两条siNA链中分别有1、2、3、4、5、6、7、8或更多的硫代磷酸酯核苷酸间键合的化学修饰的短干扰核酸(siNA)的特征。硫代磷酸酯核苷酸间键合可以存在于siNA双股中的一条或两条寡核苷酸链中，例如存在于有义链、反义链或两条链。本发明中的siNA分子可在有义链、反义链或两条链的3′-末端、5′-末端、或既在3′-末端也在5′-末端包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键合。例如，本发明中示例的siNA可在有义链、反义链或两条链的5′-末端包含约1到约5个或更多(例如约连续的1、2、3、4、5或更多)的连续的硫代磷酸酯核苷酸间键合。在另一非限定性实例中，本发明中示例siNA分子可在有义链、反义链或两条链包含一个或更多(例如约连续的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的嘧啶硫代磷酸酯核苷酸间键合。在另一非限定性实例中，本发明中的示例siNA分子可在有义链、反义链或两条链包含一个或更多(例如约连续的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的嘌呤硫代磷酸酯核苷酸间键合。

siNA分子可由环状核酸分子组成，其中该siNA在长度上约38到约70个(例如，约38、40、45、50、55、60、65或70)核苷酸，有约18到约23个碱基对(例如，约18、19、20、21、22或23)，其中环状寡核苷酸形成有约19个碱基对和2个环的哑铃状结构。

环状siNA分子包含两个环基序，其中该siNA分子的一个或两个环部分是可生物降解的。例如，本发明中环状siNA分子被设计成该siNA分子的环部分的体内降解可以产生带有3′-末端突起，例如含有2个核苷酸的3′-末端核苷酸突起的双链siNA分子。

存在于siNA分子，优选在siNA分子的反义链，也可以选择在有义链和/或既在反义链也在有义链的修饰的核苷酸包含有与天然存在的核糖核苷酸相似的特性或特征的修饰核苷酸。例如，本发明描述了包括有Northern构象(例如，Northern假回转循环，参见例如，Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag ed.，1984)的修饰核苷酸的siNA分子。正因如此，存在于本发明中的siNA分子，优选在本发明中的siNA分子的反义链，也可以选择在有义链和/或既在反义链也在有义链的化学修饰核苷酸抵抗核酸酶的降解，同时保持介导RNAi的能力。非限定性的有northern构型的核苷酸实例包括锁核酸(LNA)核苷酸(例如，2′-O，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖)核苷酸)；2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2′-甲基-硫代-乙基、2′-脱氧-2′-氟核苷酸；2′-脱氧-2′-氯核苷酸，2′-叠氮核苷酸，和2′-O-甲基核苷酸。

双链siNA分子的有义链可在有义链的3′-末端、5′-末端或既在3′-末端也在5′-末端含有例如反向脱氧碱基部分(inverted deoxybasicmoiety)的末端帽部分。

偶联物的非限定性实例包括Vargeese，et al.，2003年4月30日递交的申请号10/427,160的美国申请文件中描述的偶联物和配体，通过引用的方式将其包括附图的整体并入本文。在另一实施方式中，所述偶联物通过生物可降解的连接子共价结合在化学修饰的siNA分子上。在一实施方式中，所述偶联分子结合在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的3′-末端。在另一实施方式中，所述偶联分子结合在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或两条链的5′-末端。在另一实施方式中，所述偶联分子结合在化学修饰的siNA分子或其任一组合物的有义链、反义链或两条链的3′-末端和5′-末端。在一个实施方式中，本发明的偶联分子包含易化化学修饰的siNA分子向例如细胞的生物系统内递送的分子。在另一实施方式中，结合到化学修饰的siNA分子的偶联物是聚乙烯乙二醇、人血清白蛋白或介导细胞的摄取的细胞受体的配体。在Vargeese et al.，2003年7月10日出版的美国专利申请公开号20030130186和2004年7月10日出版的美国专利申请公开号20040110296中描述了本发明涉及的能与化学修饰的siNA分子结合的特殊偶联分子的实例。用改善的药物动力学谱、生物利用度和/或siNA构建体的稳定性，同时保持siNA介导RNAi活性的能力来评价本发明中使用的偶联物的类型和siNA分子的偶联程度。这样，本领域的技术人员能筛选用各种偶联物修饰的siNA构建体，确定是否siNA偶联复合物拥有改善的特性，同时保持介导RNAi的能力，例如在本领域普遍熟悉的动物模型中。

siNA可进一步包含核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸连接子，其将该siNA有义区连接到该siNA反义区。在一实施方式中，核苷酸连接子可以是在长度上＞2的核苷酸，例如在长度上约3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在另一实施方式中，该核苷酸连接子可以是核酸适配子(aptamer)。本发明中所用的“适配子”或“核酸适配子”指特异性与靶分子结合的核酸分子，其中该核酸分子的序列包含在天然环境中被靶分子识别的序列。可选择地，适配子可以是与靶分子结合的核酸分子，其中所述靶分子并不与核酸天然结合。靶分子可以是任一感兴趣的分子。例如，适配子可用于与蛋白的配体结合域结合，由此防止天然存在的配体与所述蛋白的相互作用。这是一个非限定性的实例，本领域的技术人员会认识到用本领域公知的技术(参见，例如，Gold，et al.，Annu.Rev.Biochem.64：763，1995；Brody and Gold，J.Biotechnol.74：5，2000；Sun，Curr.Opin.Mol.Ther.2：100，2000；Yasser，J.Biotechnol.74：21，2000；Hermann and Patel，Science 287：820，2000；and Jayasena，Clinical Chemistry 45：1628，1999)很容易产生其他实施方式。

非核苷酸连接子可由脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂、聚烃类或其他聚合化合物(例如，诸如那些有2个到100个的乙烯乙二醇单位的聚乙二醇)组成。具体的实例包括由Seelaand Kaiser，Nucleic Acids Res.18：6353，1990，and Nucleic Acids Res.75：3113，1987；Cload and Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：6324，1991；Richardson and Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：5109，1991；Ma，et al.，Nucleic Acids Res.21：2585，1993，and Biochemistry 32：1751，1993；Durand，et al.，Nucleic Acids Res.18：6353，1990；McCurdy，et al.，Nucleosides & Nucleotides 10：281，1991；Jschke，et al.，Tetrahedron Lett.34：301，1993；Ono，et al.，Biochemistry 30：9914，1991；Arnold，et al.，国际公开号WO 89/02439；Usman，et al.，国际公开号WO 95/06731；Dudycz，et al.，国际公开号No.WO 95/11910and Ferentz and Verdine，J.Am.Chem.Soc.113：4000，1991描述的那些。“非核苷酸”进一步指可在一个或更多核酸单位的位置掺入到核酸链的任一基团或化合物，包括糖和/或磷酸盐替代物，并能允许剩余碱基发挥它们的酶活性。所述基团或化合物是脱碱基的，因为它不包含通常认为的例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶等核苷酸碱基，例如在所述糖的C1位置。

本发明中可被化学修饰的siNA分子的合成，包括：(a)siNA分子两条互补链的合成；(b)在合适得到双链siNA分子的条件下，使所述两条互补链一起退火。在另一实施方式中，所述siNA分子的两条互补链由固相寡核苷酸合成法(solid phase oligonucleotide synthesis)合成。在另一实施方式中，所述siNA分子的两条互补链由固相串联寡核苷酸合成法(solid phase tandem oligonucleotide synthesis)合成。

寡核苷酸(例如，某些修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸部分)用本领域已知的方案来合成，例如在Caruthers，et al.，Methodsin Enzymology 211：3-19，1992；Thompson，et al.，国际PCT申请公开号WO 99/54459；Wincott，et al.，Nucleic Acids Res.25：2677-2684，1995；Wincott，et al.，Methods MoI.Bio.74：59，1997；Brennan，et al.，Biotechnol Bioeng.61：33-45，1998；和Brennan，美国专利号6,001,311中描述的那样。包括本发明中某些siNA分子在内的RNA的合成遵循例如在Usman，et al.，J.Am.Chem.Soc.109：7845，1987；Scaringe，et al.，Nucleic Acids Res.18：5433，1990；以及Wincott，et al.，Nucleic Acids Res.23：2677-2684，1995；Wincott，et al.，Methods MoI.Bio.74：59，1997描述的一般方案。

例如，在Akhtar，et al.，Trends Cell Bio.2：139，1992；DeliveryStrategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995；Maurer，et al.，MoI.Membr.Biol.16：129-140，1999；Hofland and Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137：165-192，1999；and Lee，et al.，ACS Symp.Ser.752：184-192，2000种描述了本发明使用的递送核酸分子的补充的或互补的方法。Sullivan，et al.，国际PCT公开号WO 94/02595进一步描述酶核酸分子递送的一般方法。可以利用这些方案来补充或补足在本发明中涉及的几乎任一核酸分子的递送。

可通过本领域技术人员已知的多种方法将核酸分子和多聚核苷酸传送增强多肽给予细胞，这些方法包括，但不限于，在只包括siNA和多聚核苷酸传送增强多肽，或进一步包括诸如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、防腐剂等等一种或更多另外的成分的制剂内给药。在某些实施方式中，可将siNA和/或多聚核苷酸传送增强多肽包封在脂质体内，通过离子电渗疗法给予，或与例如水凝胶、环式糊精、生物可降解的毫微型胶囊、生物粘性微球或蛋白质载体合并(参见例如，O′Hare and Normand，国际PCT公开号WO 00/53722)。可选择地，核酸/肽/载体组合物可通过直接注射或使用灌输泵局部给予。用标准的针和注射器方法学或例如在Conry，etal，Clin.Cancer Res.5：2330-2337，1999，and Barry，et al，国际PCT公开号WO 99/31262中描述过的无针技术，可以在皮下、肌肉内或皮内直接注射本发明中的核酸分子。

本发明中的组合物可作为药用试剂有效使用。药用试剂预防、调节患者疾病状态或其他不良状态的出现或严重性，或治疗(在可监测或可衡量的程度减轻一个或多个症状)患者疾病状态或其他不良状态。

因此在另外的实施方式中，本发明提供了药物组合物和方法，其特征是存在或给药一个或更多多聚核酸，通常是一个或更多siNAs，其与多聚核苷酸传送增强多肽组合、复合或偶联，任选地与药学上可接受的诸如稀释剂、稳定剂、缓冲剂等载体配方。

本发明通过提供调节受试者特定疾病状态或其他不良状态相关的基因表达的短干扰核酸(siNA)分子满足其他的目的和优势。通常，该siNA靶向作为所述受试者疾病状态或不良状态相关的促成或起作用的因子高表达的基因。在本文中，该siNA将所述基因有效下调到预防、减轻或降低一个或更多相关疾病症状的严重度或复发的水平。可选择地，对各种不同的疾病模型，其靶基因的表达作为疾病或其他不良状态的结果或结局并不必然升高，但是，该靶基因的下调通过减少基因表达(即降低选择的mRNA的水平和/或该靶基因的蛋白产物)产生治疗效果。可选择地，本发明中的siNAs可选择地靶向减少一种基因的表达，导致其表达被靶基因的产物或活性反向调控的“下游”基因的上调。

在示例的实施方式中，本发明的组合物和方法用于调控肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达，以治疗或预防类风湿关节炎(RA)的症状的治疗工具。在本文中，本发明进一步提供了通过小核酸分子的RNA干扰(RNAi)，用于调整TNF-α的表达和活性的化合物、组合物和方法。在更详细的实施方式中，本发明提供了诸如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小-RNA(mRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子的小核酸分子，以及相关的方法，其对调节TNF-α和/或TNF-α基因的表达以预防或减轻哺乳动物受试者的RA症状是有效的。在这些和相关的治疗性组合物和方法中，与天然siNA分子的特性相比，化学修饰的siNAs的使用，例如通过提供增加的体内核酸酶降解的抗性和/或通过改善的细胞摄取，通常能够改善该修饰的siNAs的特性。正如根据本发明中公开的内容容易确定的那样，有多重化学修饰的有用的siNAs会保持它们的RNAi活性。因此，本发明中的siNA分子为多种治疗、诊断、靶标确认、基因组发现、遗传工程和药物基因组学的应用提供了有用的试剂和方法。

本发明中的siNAs可以任一形式给予，例如透皮或通过局部注射(例如，在牛皮癣斑的位置局部注射以治疗牛皮癣，或注射入罹患银屑病关节炎或RA的患者的关节内)。在更详细的实施方式中，本发明提供给予针对TNF-αmRNA的有效治疗剂量siNAs的制剂和方法，其有效下调所述TNF-αRNA，并由此降低或预防一个或更多TNF-α-相关的炎症状态。本发明提供了靶向与动物受试者所选疾病状态相关的一个或更多的基因表达的相对的方法和组合物，这些基因包括任一的大量基因，已知作为所选疾病状态相关的起因或起作用的因素，该基因表达异常增加。

本发明中的siNA/多聚核苷酸递送增强多肽混合物可与靶疾病状态的其他标准治疗联合给药，例如与有效针对诸如RA或银屑病的炎症性疾病的治疗试剂联用。本文中组合的有用和有效的试剂的实例包括非甾体类抗炎药(NSAIDs)、甲氨喋呤、金化合物、D-青霉胺、抗疟药、柳氮磺吡啶、糖皮质激素和其他诸如因福利美(infliximab)和entracept的TNF-α中和试剂。

本发明中带负电荷的多聚核苷酸(例如，RNA或DNA)可通过任意标准的方式给予患者，用或不用稳定剂、缓冲剂等等形成药物组合物。当用脂质体递送机制理想时，可以遵循形成脂质体的标准方案。本发明中的组合物也可制成口服的片剂、胶囊或酏剂、直肠给药的栓剂、注射给药的无菌液、悬液和本领域已知的其他的组合物来使用。

本发明也包括本文中描述的组合物的药学可接受的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，例如，盐酸盐、溴化氢盐、醋酸盐和苯磺酸盐。

药物组合物或制剂指形式适合给予(例如系统给药)细胞或包括例如人类的患者的组合物或制剂。合适的形式部分依赖于给药的用途或途径，例如口服、透皮或注射。这些形式不应该防止所述组合物或制剂到达靶细胞(即要递送带负电荷的核酸到达的细胞)。例如，注射入血流中的药物组合物应该是可溶的。其他因素在本领域是已知的，包括诸如毒性的考虑。

所用“系统给药”是指血流中的药物在体内系统的吸收或积聚，随后是遍布全身的分布。导致全身吸收的给药途径包括，但不限于，静脉内的、皮下的、腹腔内的、吸入、口服的、肺内的和肌肉内的。这些给药途径的每一种都使带负电荷的多聚体，例如，核酸，暴露于可以接近的患病组织。已经表明药物进入循环中的比率是分子量或体积的函数。包含本发明的化合物的脂质体和其他药物载体的使用能潜在地使药物定位于，例如，诸如网状内皮系统(RES)组织的某些组织类型。能易化药物与诸如淋巴细胞和巨噬细胞的细胞表面结合的脂质体制剂也是有用的。通过利用巨噬细胞和淋巴细胞对诸如癌细胞的异常细胞的免疫识别特异性，这种方法可提供药物到靶细胞增强的递送。

所用的“药学可接受的制剂”是指允许本发明中的核酸分子在最适合它们的理想活性的生理位置有效分布的组合物或制剂。适合用本发明中的核酸分子形成的试剂的非限定行实例包括：可以增强药物进入中枢神经系统(Jolliet-Riant和Tillement，Fundam.Clin.Pharmacol.13：16-26，1999)的P-糖蛋白抑制剂(例如聚醚P85)；生物可降解多聚体，诸如用于脑内移植后持续释放递送试剂的乳酸-羟基乙酸共聚物微球体(Emerich，D.F.，et al.，Cell Transplant 5：47-58，1999)(Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.)；以及诸如那些由聚α-氰基丙烯酸丁酯组成的纳米微粒，其能通过血脑屏障传送药物，并能改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry 25：941-949，1999)。用于本发明核酸分子传送策略的其他非限定性实例包括在Boado，et al.，J.Pharm.Sd.57：1308-1315，1998；Tyler，et al.，FEBS Lett.427：280-284，1999；Pardridge，et al.，PNAS USA.92：5592-5596，1995；Boado，Adv.DrugDelivery Rev.75：73-107，1995；Aldrian-Herrada，et al.，Nucleic Acids Res.26：4910-4916，1998；和Tyler，et al.，PNAS USA..96：7053-7058，1999中描述的材料。

本发明也包括用于储存或给药的组合物，其包括药学可接受的载体或稀释剂中的药学上有效剂量的理想化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是熟知的，并在例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，A.R.Gennaro ed.，1985中描述过。例如，可提供防腐剂、稳定剂、干燥剂和调味试剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和p-羟基苯甲酸。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。

药学上的有效剂量是指预防、抑制疾病状态的出现或治疗(在某种程度上减轻一种症状，优选所有的症状)疾病状态的所需剂量。药学上有效剂量依赖于疾病类型、使用的组合物、给药途径、被治疗哺乳动物的类型、被考虑的特定哺乳动物的生理特征、协同用药和本领域技术人员认识到的其他因素。一般，依据带负电荷多聚体的效力，给予活性成分的剂量在0.1mg/kg和100mg/kg体重/天。

水悬浮液包含与适合制备水悬浮液的赋型剂混合的活性原料。这些赋型剂是悬浮试剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或烯化氧物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷乙烯氧化物与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七碳氧乙烯鲸腊醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。这些水悬浮液也可包含一种或更多种防腐剂，例如乙烷基或n-丙烷基p-羟基苯甲酸、一种或更多显色剂、一种或更多调味剂和一种或更多诸如蔗糖或糖精的甜味剂。

油悬浮液可通过将活性成分悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或悬浮在诸如液体石蜡的矿物油中而制成。该油悬浮液可包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。可以加入甜味剂和调味剂以提供美味的口服制剂。可加入诸如抗坏血酸的抗氧化剂来保存这些组合物。

适合通过加水制备水悬浮液的散状的粉末和细粒提供了与分散或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散或湿润剂或悬浮剂的已在上文中例举过。其他的赋形剂，例如甜味剂、添加剂和显色剂也可以存在。

本发明中的药用组合物也可以是水包油乳液形式。油相可以使植物油或矿物油或两者的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和来源于脂肪酸和肌糖醇、酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及上述偏酯和环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。这些乳化剂也可以包含甜味剂和添加剂。

药物组合物可以是无菌注射的水性或油性的悬浮液形式。该悬浮液可根据已知的技术，用上面提及的合适的分散或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌的注射制剂也可以是在无毒的可互溶的稀释液或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中，可使用的有水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油常规作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的单-或双甘油酯。此外，在注射剂制备中可使用诸如油酸的脂肪酸。

siNAs也可以栓剂的形式给予，例如，药物的直肠给药。可通过将药物与无刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，该赋形剂常温下为固体、直肠温度下为液体，因此可以在直肠内溶化以释放药物。这些原料包括可可脂和聚乙二醇。

siNAs可被广泛的修饰以增强稳定性，通过用核酸酶抵抗基团修饰，例如，2′-氨基，2′-C-烯丙基，2′-氟基，2′-O-甲基，2′-H。综述参见Usman and Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman，et al.，Nucleic AcidsSymp.Ser.57：163，1994。SiNA构建体可以使用一般的方法进行凝胶电泳来纯化或通过高效液相来纯化，然后将其在水中重悬。

有修饰(碱基、糖和/或磷酸盐)的化学合成的核酸分子能防止它们被血清核糖核酸酶降解，这样可以增加它们的作用。参见例如，Eckstein，et al.，国际公开号WO 92/07065；Perrault，et al.，Nature 344：565，1990；Pieken，et al.，Science 253：314，1991；Usman和Cedergren，TrendsinBiochem.Sd.17：334，1992；Usman，et al.，国际公开号WO 93/15187；和Rossi，et al.，国际公开号WO 91/03162；Sproat，美国专利5,334,711；Gold，et al.，美国专利6,300,074。所有上述参考文献描述了可以发生在本发明描述的核酸分子的碱基、磷酸基和/或糖部分上的各种化学修饰。

在本领域中有一些描述糖、碱基和磷酸基修饰的实例，其可引入核酸分子内、明显增强它们的核酸酶稳定性和功效。例如，寡核苷酸通过用核酸酶抵抗基团修饰，例如，2′-氨基，2′-C-烯丙基，2′-氟基，2′-O-甲基，2′-H核苷酸碱基修饰来增强稳定性和/或增强生物活性。综述参见Usman和Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman，et al，Nucleic AcidsSymp.Ser.37：163，1994；Burgin，et al.，Biochemistry 35：14090，1996。核苷酸分子的糖修饰在本领域中已经被广泛描述。参见Eckstein，et al.，国际PCT申请公开号WO 92/07065；Perrault，et al.Nature 344：565-568，1990；Pieken，et al.，Science 253：314-317，1991；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.77：334-339，1992；Usman，et al.国际PCT申请公开号WO 93/15187；Sproat，美国专利号5,334,711和Beigelman，etal.，J Biol.Chem.270：25702，1995；Beigelman，et al.，国际PCT申请公开号WO 97/26270；Beigelman，et al.，美国专利号5,716,824；Usman，etal.，美国专利号5,627,053；Woolf，et al.，国际PCT申请公开号WO98/13526；Thompson，et al.，Karpeisky，et al.，Tetrahedron Lett.39：1131，1998；Earnshaw和Gait，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48：39-55，1998；Verma和Eckstein，Annu.Rev.Biochem.67：99-134，1998；和Burlina，et al.，Bioorg.Med.Chem.5：1999-2010，1997。这些公开的发表物描述了确定糖、碱基和/或磷酸修饰等掺入无调节催化作用的核酸分子的位置的一般方法和策略。鉴于这些讲述，只要siNA促进细胞内RNAi的能力没被明显抑制，就可以使用本发明描述的类似修饰来修饰本发明中的siNA核酸分子。

尽管用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5′-甲基磷酸酯键的寡核苷酸的核苷酸间键合的化学修饰改善了稳定性，但过多的修饰可导致某些毒性或降低活性。因此，设计核酸分子时，应该将这些核苷酸间键合的数量减到最少。降低这些键的浓度会减少毒性，并导致功效增加及这些分子的更高的特异性。

在一个实施方式中，本发明描述了修饰的siNA分子的特征，利用包括一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酸三酯、吗啉基、氨基甲酸酰胺、羧甲基、亚氨逐乙酸酯、聚酰胺、磺酸盐、磺酰胺、氨基磺酸盐、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)和/或烷矽(alkylsilyl)取代的磷酸骨架修饰。关于寡核苷酸骨架修饰的综述，参见Hunziker and Leumann，″Nucleic AcidAnalogues：Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，″VCH，1995，pp.331-417，和Mesmaeker，et al.，″Novel BackboneReplacements for Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications inAntisense Research，″ACS，1994，pp.24-39。

在Akhtar，et al.，Trends Cell Bio.2：139，1992；Delivery Strategiesfor Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995；Maurer，etal.，MoI.Membr.Biol.16：129-140，1999；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137：165-192，1999；和Lee，et al..ACS Symp.Ser.752：184-192，2000中描述了递送核酸分子的方法。Beigelman，et al.，美国专利号6,395，713和Sullivan，et al.，PCT公开号WO 94/02595进一步描述了传输核酸分子的一般方法。这些方法可用于基本任何核酸分子的递送。可通过本领域技术人员已知的多种方法将核酸分子给予细胞，这些方法包括，但不限于，包封在脂质体内、通过离子电渗疗法、或通过合并入其他载体，例如生物可降解的聚合体、水凝胶、环式糊精(参见，例如，Gonzalez，et al.，Bioconjugate Chem.70：1068-1074，1999；Wang，et al.，国际PCT申请公开号WO 03/47518和WO 03/46185)、聚(乳酸-乙二醇)酸(poly(lactic-co-glycolic)acid)(PLGA)和PLCA微球体(参见例如，美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US2002130430)、生物可降解的纳米囊和生物粘性微球，或通过蛋白质载体(O′Hare和Normand，国际PCT申请公开号WO 00/53722)。或者，通过直接注射或利用灌输泵局部传输核酸/载体组合物。使用标准的针和注射器方法或通过诸如在Conry，et al.，Clin.Cancer Res.5：2330-2337，1999和Barry，et al.，国际PCT申请公开号WO 99/31262中描述过的无针技术，可以皮下、肌肉内或皮内直接注射本发明的核酸分子。本发明中的分子可以用作药用试剂。药用试剂预防、调节受试者疾病状态的出现，或治疗(在某些程度上减轻一种症状，优选所有症状)受试者疾病状态。

术语“配体”指诸如药、肽、激素或神经递质的任意化合物或分子，其能够与诸如受体的另一种化合物直接或间接的相互作用。与配体相互作用的受体可存在细胞表面或另外是细胞内受体。配体与受体的相互作用可导致生化反应，或简单的是物理相互作用或联结。

本发明中使用的“不对称发夹”指线形siNA分子，包含反义区、包括核苷酸或非核苷酸的环部分，以及有义区。该有义区包含的核苷酸少于反义区的程度是有义区有足够可以与反义区配对的互补核苷酸，同时形成带环的双股。例如，本发明中的不对称发夹siNA分子可包括其长度足以介导T细胞RNAi的反义区(例如，约19到约22(例如，约19、20、21或22)个核苷酸)和包含约4到约8(例如，约4、5、6、7或8)个核苷酸的环区，以及含有约3到约18(例如，约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)个与反义区互补的核苷酸的有义区。该不对称发夹siNA分子也可包含可被化学修饰的5′-磷酸基团。该不对称发夹siNA分子的环部分可包含本发明中描述的核苷酸、非核苷酸、连接子分子或偶联分子。

本发明中所使用的“不对称双股”指包含有义区和反义区的两条分离的链的siNA分子，其中有义区包含少于反义区核苷酸的核苷酸，其少于的程度是有义区有足够与反义区配对的互补核苷酸，并形成双股。例如，本发明中的不对称双股siNA分子可包含其长度足够介导T细胞的RNAi的反义区(例如，约19到约22(例如，约19、20、21或22)个核苷酸)和含有约3到约18(例如，约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)个与反义区互补的核苷酸的有义区。

所用“调节基因表达”是指上调或下调靶基因的表达，其包括细胞内的mRNA水平、或mRNA翻译、或由靶基因编码的蛋白或蛋白亚基的合成的上调或下调。基因表达的调节也可由上调或下调的靶基因编码的一种或多种蛋白或蛋白亚基的存在、含量或活性来确定，这样受试蛋白或亚基的表达、水平或活性高于或低于在调节物缺乏(例如，siRNA)时观察到的。例如，术语“调节”可意味“抑制”，但“调节”该词的使用并不限于这个定义。

所用的“抑制”、“下调”或“降低”表达是指基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或相当RNA分子的水平，或由靶基因编码的一种或多种蛋白的水平或活性，被下调到低于缺乏本发明的核酸分子(例如，siNA)时观察到的程度。在一个实施方式中，利用siNA分子的抑制、下调或减少低于在失活或消弱分子存在时观察到的水平。在另一实施方式中，利用siNA分子的抑制、下调或减少低于在乱序或错配的siNA分子存在时观察到的水平。在另一实施方式中，用本发明的核酸分子的抑制、下调或减少的基因表达高于该分子不存在时。

基因“沉默”指通过靶向抑制细胞内基因表达，基因部分或全部的功能缺失，也可被称为“敲低(knock down)”。依赖环境和将要面对的生物学问题，可优选部分降低基因表达。可选择地，尽可能降低基因表达可能是理想的。沉默的程度由本领域公知的方法确定，在国际PCT申请公开号WO 99/32619中对其中一些方法作了综述。依赖于分析，基因表达的量化允许检测各种数量的抑制，这在包括预防和治疗方法在内的本发明的某些实施方式中是期望的，这些实施方式能够敲低基因表达，例如，就mRNA水平或蛋白水平或活性而言，可敲低等于或高于基线值(即，正常)或包括可能与靶向治疗的特定疾病状态或其他状态有关的表达水平升高的其他对照水平的10％、30％、50％、75％、90％、95％或99％的基因。

短语“抑制靶基因表达”指本发明中的siNA启动靶基因沉默的能力。为了检测基因沉默的程度，将表达特定构建体的目的有机体或培养细胞的样本或检测与没有构建体表达的对照样本对比。对照样本(没有构建体表达)被指定100％的相对值。当相对于对照的测定值是约90％，经常是50％，在某些实施方式中是25-0％时，就实现了对靶基因表达的抑制。适当的检测包括，例如，用本领域技术人员公知的诸如点印迹、northern印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能的技术进行的蛋白检测或mRNA水平检测，以及本领域技术人员已知的表型分析。

所用“受试者”是指有机体、组织或细胞，包括作为受试者的有机体或移植细胞的供体或受体或本身是siNA传送的受试者的细胞。因此“受试者”可指有机体、器官、组织或细胞，包括离体或体外处理用于体内(ex vivo)的器官、组织或细胞受试者，本发明的核酸分子可被本文中描述的多聚核酸递送增强多肽给予到这些“受试者”并被增强。示例性受试者包括哺乳动物个体或细胞，例如人类患者或细胞。

本发明中使用的“细胞”用其通常的生物学意义，并不指完整的多细胞有机体，例如，特别不指人类。该细胞可存在于有机体内，例如，鸟、植物和诸如人、牛、绵羊、猿、候、猪、狗和猫的哺乳动物。该细胞可是原核(例如，细菌细胞)或真核的(例如，哺乳动物或植物细胞)。该细胞可是体细胞系或生殖系来源、全能的或多能的、分裂的或不分裂的。该细胞也可起源于或包含配偶子或胚胎、干细胞或完全分化的细胞。

所用“载体”是指用于递送目标核酸的任何基于核酸-和/或病毒的技术。

所用“包含”是指包括，但不限于，“包含”该词后面的任何内容。因此，术语“包含”的使用提示列出的元素是必需的或强制的，但其他的元素是任选的，可以存在，也可以不存在。所用“由......组成”指包括且限于短语“由......组成”中的任何内容。因此，短语“由......组成”提示列出的元素是必需的或强制的，且不再存在其他的元素。所用“基本上由......组成”是指包括该短语中列出的任何元素，并限于不干扰或有助于在公开内容中详细说明的所列元素的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由......组成”提示所列出的元素是必需的或强制的，但其他元素依赖于它们是否影响所列元素的活性或作用是任选的，可以存在或不存在。

所用“RNA”是指包含至少一种核糖核苷酸基的分子。所用“核糖核苷酸”是指在β-D-核-呋喃糖部分的2′位置带羟基的核苷酸。这些术语包括双链RNA，单链RNA，分离RNA，例如部分纯化RNA、基本纯化RNA、合成RNA、重组产生的RNA，还包括通过添加、删除、替代和/或改变一个或多个核苷酸，与天然存在的RNA不同的改变的RNA。这些改变可包括将非核苷酸物质添加到诸如siNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸位置。本发明中的RNA分子内的核苷酸也包括非标准的核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNAs可被称作类似物或天然存在的RNA的类似物。

所用“高度保守序列区”是指靶基因中一个或多个区域的核苷酸序列从一代到另一代或从一个生物系统到另一个生物系统不会发生明显的变化。

所用“有义区”是指siNA分子中有与该siNA分子的反义区互补的序列的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可包含与靶核酸序列同源的核酸序列。

所用“反义区”是指siNA分子中有与靶核酸序列互补的序列的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区任选地包含有与该siNA分子的有义区互补的序列的核苷酸序列。

所用“靶核酸”是指其表达或活性将被调节的任何核酸序列。该靶核酸可以是DNA或RNA。

所用“互补”是指核酸通过传统的Watson-Crick或其他非传统的形式，能与另一核酸序列形成氢键。参考本发明的核酸分子，核酸分子与它互补序列的结合自由能足够允许核酸分子实施的相关功能，例如RNAi活性。核酸分子结合自由能的确定在本领域是公知的(参加，例如，Turner，et al.，CSHSymp.Quant.Biol，LII，1987，pp.123-133；Frier，et al.，Proc.Nat.Acad.Sd.USA 55：9373-9377，1986；Turner，et al.，J Am.Chem.Soc.709：3783-3785，1987.)互补百分比指在一个能与另一核酸序列(例如，第一个寡核苷酸的总共10个核苷酸中的5、6、7、8、9和10个核苷酸与另一个有10个核苷酸的核酸分子配对，分别代表50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补)形成氢键(例如Watson-Crick碱基配对)的核酸分子中相邻残基的百分比。“最佳互补”指核酸序列的所有相邻残基都与另一核酸序列相同数目的相邻残基氢键结合。

本发明中使用的术语“通用碱基”指与天然DNA/RNA碱基中的每一种形成碱基对的核苷酸碱基类似物，两者之间几乎没有区别。通用碱基非限定性实例包括C-苯基、C-萘基和其他芬芳类衍生物，次黄嘌呤核苷，唑羧酰胺，和诸如本领域已知的3-硝基吡咯，4-硝基吲哚，5-硝基吲哚和6-硝基吲哚(参见，例如，Loakes，Nucleic Acids Research29：2437-2447，2001)的硝基唑类衍生物。

本发明中使用的术语“无环核苷酸”指有无环核糖的任何核苷酸，例如其中任何核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)都是与核苷酸独立的或是不结合的。

本发明中使用的术语“生物可降解的”指在生物系统内降解，例如酶性降解或化学降解。

本发明中使用的术语“生物活性分子”指能启动或修饰系统内生物反应的化合物或分子。单独或与本发明考虑的其他分子合用的生物活性siNA分子的非限定性实例包括诸如抗体、胆固醇、激素、抗病毒药物、肽、蛋白、化疗剂、小分子、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶性核酸、反义核酸、三链形成寡核苷酸(triplex formingoligonucleotides)、2，5-嵌合体、siNA、dsRNA、等位同工酶、适配子、诱骗物(decoys)及其类似物的治疗性活性分子。本发明的生物活性分子也包括能调节其他生物活性分子的药物动力学和/或药效学的分子，例如，脂质和诸如多胺、聚酰胺、聚乙二醇和其他聚醚的聚合体。

本发明中使用的术语“磷脂”，指包含至少一个磷基团的疏水分子。例如，磷脂可包括含磷基团和饱和的或不饱和的烃基，任选地用OH，COOH，oxo，胺或取代的或非取代的芳基来替代。

所用“帽结构”是指已被合并入寡核苷酸的任一端的化学修饰(参见，例如，Adamic，et al.，美国专利号5,998,203，通过引用的方式并入本文)。这些末端修饰保护核酸分子不被核酸外切酶降解，并可在细胞内辅助核酸分子递送和/或定位。该帽结构可存在5′-末端(5′-帽)或存在3′-末端(3′-帽)或两末端都存在。在非限定性实例中，5′-帽包括，但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃芹菜糖基(erythrofuranosyl))核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环形核苷酸；1，5-己糖醇酐核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基的核苷酸；硫代磷酸酯联接；苏(糖)-戊呋喃芹菜糖基(threo-pentofuranosyl)核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸，3′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向脱碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基磷酸部分。

3′-帽结构的非限定性实例包括，但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤型呋喃芹菜糖基(erythrofuranosyl))核苷酸，；4′-硫代核苷酸，碳环形核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-双氨-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1，5-己糖醇酐核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基的核苷酸；二硫代磷酸酯；苏(糖)-戊呋喃芹菜糖基(threo-pentofuranosyl)核苷酸；无环3′，4′-seco核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向脱碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥连或非桥连的5′-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥连的甲基磷酸和5′-巯基部分(更多详细资料参见Beaucage and Lyer，Tetrahedron 49：1925，1993；通过引用的方式并入本文)。

所用术语“非核苷酸”指任何可以在一个或多个核酸单位处并入核酸链并能允许剩余碱基发挥它们的酶活性的基团或化合物，包括糖和/或磷酸替代物。该基团或化合物是脱碱基的，因为它不含通常认为的诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的核苷酸碱基，因此在1′-位置没有碱基。

本发明中所用的“核苷酸”正如如本领域公认的那样，包括天然碱基(标准的)和本领域熟知的修饰碱基。这些碱基一般位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸一般包括碱基、糖和磷酸基团。该核苷酸在糖、磷酸和/或碱基部分可不被修饰或被修饰，(也可被交替称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸及其它；参见，例如，上文引用的Usman和McSwiggen；Eckstein，et al.，国际PCT申请公开号WO 92/07065；Usman，et al.，国际PCT申请公开号WO93/15187；上引的Uhlman & Peyman，supra，所有这些都据此以引用的方式并入本文)。一些本领域已知的修饰核酸碱基的实例由Limbach，etal.，Nucleic Acids Res.22：2183，1994综述。可以引入核酸分子的碱基修饰的一些非限定性实例包括，次黄嘌呤核苷、嘌呤、四氢吡啶、二氢吡啶、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、萘基、氨苯基，5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)，5-烷基尿嘧啶(例如，胸腺嘧啶)，5-卤代尿嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿嘧啶)，丙炔和其他(Burgin，et al.，Biochemistry 35：14090，1996；Uhlman & Peyman，supra)。这方面所用的“修饰的碱基”指在1′位置除了腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶外的核苷碱基或它们的等价物。

所用的“靶点”是指靶RNA内的序列，是被靶向以被siNA构建体介导裂解，该siNA构建体在反义区含有与靶序列互补的序列。

所用“可检测水平的裂解”是指靶RNA裂解(及裂解产物RNAs的形成)的程度足以在靶RNA随机降解产生的RNA的背景上辨别出裂解产物。1-5％的靶RNA的降解产物的产生对大多数检测方法而言足够在背景上检测。

所用的“生物系统”是指来自包括但不限于人类、动物、植物、昆虫、细菌、病毒或其他来源的生物来源中的纯化的或非纯化的物质，其中该系统包括RNAi活性必需的成分。该术语“生物系统”包括，例如细胞、组织，或有机体，或其提取物。该术语生物系统也包括可以在离体环境中使用的重组RNAi系统。

本发明中使用的术语“生物可降解连接子”指核酸或非核酸连接子分子，其被设计称连接一个分子与另一个分子的生物可降解连接子，例如，连接本发明中的siNA分子或本发明siNA分子的有义和反义链与生物活性分子。这样设计生物可降解连接子使它的稳定性可根据特定目的来调节，诸如到特定组织或细胞类型的递送。基于核酸的生物可降解连接子分子的稳定性可用各种化学方法调节，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸的组合，例如2′-O-甲基，2′-氟基，2′-氨基，2′-O-氨基，2′-C-烯丙基，2′-O-烯丙基及其他的2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸。该生物可降解的核酸连接分子可以是二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸分子，例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长度的寡核苷酸，或含有基于磷键的单一核苷酸，例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键。该生物可降解核酸连接子分子也可包括核酸骨架、核酸糖或核酸碱基的修饰。

所用“脱碱基的”是指缺乏碱基或在1′碱基的位置有其他化学基团的糖部分，参见例如Adamic，et al.，美国专利5,998,203。

所用“未修饰的核苷酸”是指连接到β-D-核糖-呋喃糖的1′碳位置的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶这些碱基中的一个。

所用“修饰的核苷”是指在一个未修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸的化学结构处含有修饰的任何核苷酸碱基。式I-VII和/或本发明描述的其他修饰显示了修饰核苷酸的非限定性实例。

与本发明描述的2′-修饰的核苷酸相关，所用的“氨基”是指2′-NH₂或2′-O-NH₂，其可被修饰或不被修饰。例如，在Eckstein et al.，美国专利号5,672,695和Maralic-Adamic，et al.，美国专利号6,248,878中描述了这些修饰的基团。

siNA分子可与阳离子脂质复合，包裹在脂质体内，或以其他方式被递送到靶细胞或组织。所述核酸或核酸复合物可与生物高聚物合并或不合并，通过注射、灌输泵或支架局部给药。在另一实施方式中，聚乙二醇(PEG)可与本发明中的siNA化合物、多聚核苷酸递送增强多肽或这两者共价结合。结合的PEG可以是任何分子量的，优选从约2,000到约50,000道尔顿(Da)。

有义区可通过诸如聚核苷酸连接子或非核苷酸连接子的连接子分子连接到反义区。

“反向重复”指包含有义和反义元件的核酸序列，该有义和反义元件定位于当该重复序列被转录时，它们能形成双链siRNA的位置。该反向重复可选择在该重复的两元件之间包括连接子或诸如自我剪切核酶的异源序列。该反向重复元件的长度足以形成双链RNA。通常，该反向重复的每个元件的长度约15到约100个核苷酸，优选约20-30个碱基核苷酸，优选约20-25核苷酸长度，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30核苷酸。

“核酸”指单-或双-链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或联接的核酸，可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸有相似的结合特性，且以与参照核酸相似的方式被代谢。这类类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手型-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNAs)。

“大双链RNA”指任何长度大于40个碱基对(bp)例如，大于100bp或更特别的大于300bp的双链RNA。大双链的序列可以是mRNA的片段或完整的mRNA。本发明中没有限定该大dsRNA的最大尺寸。该双链RNA可包括修饰的碱基，其中该修饰可以是磷酸糖骨架或核苷的修饰。这些修饰可包括氮、硫杂原子或本领域公知的其他任何修饰。

双链结构可以由出现于诸如发夹结构或微RNA的自身互补RNA链形成或两条不同的互补RNA链退火形成。

“重叠”指两RNA片段在一条链上有多个核苷酸重叠的序列，例如，其中该多个核苷酸的数量少至2-5个核苷酸或约5-10个核苷酸或更多。

“一个或多个dsRNAs”指在碱基序列上互不相同的dsRNAs。

“靶基因或mRNA”指任一目的基因或mRNA。事实上，以前通过遗传学或测序确认的基因中的任何一个都代表一个靶点。靶基因或mRNA除包括代谢或结构基因或编码酶的基因外，还包括发育基因和调节基因。靶基因可以直接或间接影响表型特征的方式表达在正在研究其表型的细胞内或表达在有机体内。靶基因可以是内源性的或是外源性的。这些细胞包括成年或胚胎动物或包括配子的植物体内的任何细胞，或存在于永生细胞系或原代细胞培养的任何分离细胞。

在本说明书和所附的权利要求书中，“a”、“an”和“the”这些单数形式包括复数的指代，除非文中另有规定。

实施例

上述公开内容总体上描述了本发明，通过下面的实施例进一步示例本发明。描述这些实施例仅为说明本发明，而不是限制本发明的范围。尽管本文中使用了特殊的术语和值，这些术语和值同样被理解为示例性的，并不限定本发明的范围。

实施例1

包含与多聚核苷酸递送增强多肽复合的siRNA的组合物 的制备和特征

为了在本发明的候选siRNAs和多聚核苷酸递送增强多肽之间形成复合物，将适量siRNA与预定量的多聚核苷酸递送增强多肽组合，例如在

细胞培养基中(Invitrogen)，以明确的比例，并在室温孵育约10-30分钟。随后，将选定体积，例如，约50μl的该混合物与靶细胞接触，据预定的孵育时间孵育该细胞，在本实施例中是约2小时。该siRNA/肽混合物可任选包括细胞培养基或诸如胎牛血清的其他添加物。对于组蛋白H3、H4和H2b，进行了一系列实验将这些多聚核苷酸递送增强多肽与siRNA以不同的比例组合。通常，siRNA/组蛋白的比例从1∶0.01开始到1∶50。在96-孔微板内，每孔加入40pm siRNA。每孔含有50％汇合单层的β-gal细胞。下面表2中显示了转染效率的示例的最优化比例。

用常规的siRNA或与上述指定的组蛋白的一种复合的siRNA在9L/β-gal细胞上进行转染。siRNA被设计成能特异敲低β-半乳糖苷酶mRNA，活性表示为对照(对照细胞用没有多聚核苷酸递送增强多肽的脂质体转染)β-gal活性的百分比。

检测和/或定量siRNA递送效率的分析用常规方法来完成，例如β-半乳糖苷酶分析或流式细胞术方法。

使用9L/LacZ细胞，一种组成性表达β-半乳糖苷酶的细胞系，进行β-半乳糖苷酶分析。9L/LacZ细胞是组成性表达LacZ的大鼠角质瘤成纤维细胞，从ATCC(#CRL-2200)处获得。9L/LacZ细胞在补充1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和20％胎牛血清的Dulbecco′s改良必需培养基(DMEM)中生长。细胞在37℃、5％CO₂下培养，并补充有含100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素及0.25mg/ml两性霉素B(Invitrogen)的抗生素混合物。化学合成针对β-gal mRNA设计的siRNA双股，并将其与递送试剂使用以评价敲低效率。

肽合成

使用Rainin Symphony合成仪，在CLEAR-酰胺树脂上通过固相Fmoc化学法合成肽。用5当量HCTU和Fmoc氨基酸与过量的N-甲基吗啉作用40分钟进行偶联步骤。肽树脂用溶于DMF的20％吡啶处理两次，每次10分钟，以去除Fmoc。在完成整段肽合成时，用吡啶去除Fmoc基团，并用DMF充分洗涤。在6当量的N-甲基吗啉存在下，通过将3.0当量的3-马来酰亚胺丙酸和HCTU偶联到肽树脂的N-末端来制备马来酰亚胺修饰肽。偶联的程度用Kaiser测试来监控。加入10mL含2.5％水和2.5三异丙基硅烷(triisopropyl silane)的TFA，随后在室温下轻轻搅拌2小时，使肽从树脂上裂解下来。通过用醚研碎后过滤来收集产生的粗制肽。将该粗制产物溶于Millipore水中，冷冻干燥。粗制肽溶于15mL含0.05％TFA的水中和3mL乙酸中，将其通过5mL注射环以5mL/min的流速装载到Zorbax RX-C8反相柱(22mm ID × 250mm，5μm粒度)上。通过进行0.1％B/分钟的线性AB梯度洗脱完成纯化，其中溶剂A是溶于水中的0.05％TFA，溶剂B是溶于乙睛中的0.05％TFA。该纯化肽用HPLC和ESMS来分析。

siRNA合成和制备

用标准的2-氰乙基亚磷酰胺方法，在长链烷基胺可控微孔玻璃上完成寡核苷酸的合成，该长链烷基胺可控微孔玻璃由5′-O-二甲基三苯甲基-2′-O-t-丁基二甲基硅烷核糖核苷酸的选择或可适用的5′-O-二甲基三苯甲基-2′-脱氧-3′-O-琥珀酰胸腺嘧啶载体衍生。所有的寡核苷酸用ABI 3400DNA/RNA合成仪以0.2或1-μmol规模合成，用浓缩的NH₄OH从固相载体上裂解下来，并用3∶1混合的NH₄OH∶EtOH在55℃脱保护。通过用N-甲基吡咯烷酮/三乙胺/三乙胺三(氟氢酸)(体积比6∶3∶4)溶液(600μL每μmol)在65℃下孵育碱基去保护的RNA 2.5小时，实现2′-TBDMS保护基团的去保护。相应的合成模块：A、U、C和G的5′-二甲氧基三苯甲基-N-(tac)-′-O-(t-丁基二甲基硅烷)-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Proligo，Boulder CO)以及修饰的亚磷酰胺，5′DMTr-5-甲基-U-TOM-CE-亚磷酰胺、5′-DMTr-2′-OMe-Ac-C-CE亚磷酰胺、5′-DMTr-2′-OMe-G-CE亚磷酰胺、5′-DMTr-2′-OMe-U-CE亚磷酰胺、5′-DMTr-2′-OMe-A-CE亚磷酰胺(Glen Research)直接购自供应商。三乙胺-三氢氟酸、N-甲基吡咯烷酮和浓缩的氢氧化铵购自Aldrich。所有HPLC分析和纯化在带有Xterra^TM柱的Waters 2690上完成。所有其他的试剂购自Glen Research Inc。寡核苷酸纯化到97％以上的纯度，由RP-HPLC确定。用于给小鼠注射的siRNAs购自Qiagen，其退火后由HPLC纯化，含有体内注射可接受的内毒素水平。

细胞培养

原代人类单核细胞

来自健康供体的新鲜人类血样本购自Golden West Biologicals。为了分离单核细胞，收到血样本后，立即将其用PBS按1∶1比例稀释。外周血单个核细胞(PBMC)先通过Ficoll(Amersham)梯度从全血中分离。用Miltenyi CD14阳性选择试剂盒和提供的方案(MILTENYI BIOTEC)进一步从PBMCs中纯化单核细胞。为了评估单核细胞制备的纯度，用抗-CD14抗体(BD Biosciences)孵育细胞，然后用流式细胞术分选。单核细胞制备的纯度高于95％。

通过将0.1-1.0ng/ml的脂多糖LPS(Sigma，St Louis，MO)加入到培养的细胞中刺激肿瘤坏死因子±(TNF-±)产生进行活化人类单核细胞的操作。用LPS孵育3小时后收集细胞，根据厂商的说明，用Quantigene分析(Genospectra，Fremont，CA)确定mRNA水平。

小鼠尾部成纤维细胞

小鼠尾部成纤维(MTF)细胞来自C57BL/6J小鼠的尾部。尾巴断离后浸入70％的乙醇中，然后用剃刀片切成小段。这些小段用PBS洗三次，然后在37℃的摇床上用0.5mg/mL胶原酶、100单位/mL青霉素和100μg/mL的链霉素孵育以破坏组织。然后在完全培养基(含20％FBS、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和100单位/mL青霉素及100μg/mL链霉素的Dulbecco′s改良必需培养基)中培养尾巴片段直至细胞被确立。细胞在37℃、5％CO₂下，在上面列出的完全培养基中培养。

转染程序

该程序的第一天，从T75长颈瓶中获得饱和的9L/LacZ培养物，然后将这些细胞分离，稀释到10ml完全培养基中(DMEM，1xPS，1x丙酮酸钠，1x NEAA)。进一步将这些细胞稀释到1∶15，而后100μl的该制备液等分到96孔板的孔内，到转染的第二天将会产生约50％的细胞汇合。边缘孔留空，填充250μl水，然后将这些板非堆叠的置于37℃孵箱内过夜(5％CO₂孵箱)。

第二天，将转染复合物按每孔50μl在Opti-MEM中制备好。从板中移除培养基，用200μl PBS或Opti-MEM洗涤板孔一次。通过倒置，将这些板完全吸干。然后将转染混合物加入(50μl/孔)每孔中，边缘孔加入250μl水以防干燥。然后细胞在37℃(5％CO₂孵箱)至少孵育3小时。移除转染混合物，换为100μl完全培养基(DMEM，1x PS，1x丙酮酸钠，1xNEAA)。在确定的时间长度内培养细胞，然后将其收集用于酶学分析。

细胞活力(MTT分析)

用MTT分析(MTT-100，MatTek试剂盒)评价细胞活性。该试剂盒测定的是四唑盐的摄取及四唑盐到甲染料的转化。在脂质给药时期结束前1小时，通过将2mL的MTT浓缩液与8mL的MTT稀释液混合制备解冻和稀释的MTT浓缩液。每细胞培养插入物(insert)用含有Ca⁺²和Mg⁺²的PBS洗两次，然后转移到每孔含100μL混合MTT溶液的新96-孔转运板中。该96-孔传送板在37℃、5％CO₂中孵育3小时。孵育3小时后，移除MTT溶液，将培养物转移到每孔含有250μL MTT抽提液的另一96-孔给料盘中。在每培养孔的表面另外加入150μL MTT抽提液，样本在室温黑暗处最短放置2小时，最长24小时。然后，用枪头将该插入物膜穿透，使上孔和下孔的液体混合。200微升该混合抽提液与抽提空白(阴性对照)转移到96孔板内用微板读板仪测量。样本的光密度(OD)在读板仪570nm处测量，扣除650nm处的本底。细胞活力用百分比表示，用处理组的插入物的OD读数除以PBS处理的插入物的OD读数再乘以100来计算。基于本分析的目的，假定PBS对细胞活力没有影响，因此代表100％的细胞活力。

酶分析

用于酶检测的试剂购自Invitrogen(β-Gal检测试剂盒)和Fisher(PierceMicro BCA蛋白检测试剂盒，Catalog)

A：细胞裂解

·移除培养基，用200μl PBS洗一次，倒置吸干细胞板。

·每孔加入30μl取自β-Gal试剂盒的裂解液。

·冻融细胞两次以产生裂解产物。

B：β-Gal分析

·准备分析混合液(每孔50μl 1x缓冲液、17μl ONPG)。

·取新板，每孔加入65μl测定混合液。

·每孔加入10μl细胞裂解液。应该准备空白孔用以去除背景活性。

·在37℃孵育约20分钟，防止会耗竭ONPG、偏向于高表达的长时间孵育。

·加入100μl终止液。

·在420nm处测量OD值。

C：BCA分析

·准备BSA标准品(每孔150ul)，在每板上应有复点。

·每孔中加入145μl的水，每孔中加入5μl的细胞裂解液。

·根据厂商的说明书，制备终末测定试剂。

·每孔中加入150μl检测试剂。

·在37℃孵育约20分钟。

·562nm处测定OD值。

D：特异活性的计算

特异活性表达成nmol水解的ONPG/t/mg蛋白，其中t是37℃孵育的分钟时间；mg蛋白是用BCA方法确定的检测蛋白。

FITC/FAM偶联的siRNA的流式细胞术测定

使用Beckman Coulter FC500细胞分析仪(Fullerton，CA)进行荧光活化的细胞分选分析。根据使用的荧光探针(标记siRNA的FAM或Cy5以及标记CD14的FITC和PE)调整仪器。用碘化丙啶(Fluka，St Lois，MO)和AnnexinV(R&D系统，Minneapolis，MN)作为细胞活力和细胞毒性的指示剂。下面详述了简要的步骤方案。

a)与siRNA/肽复合物暴露后，细胞至少被孵育3小时。

b)用200μl PBS洗涤细胞。

c)用15μl TE分离细胞，在37℃孵育。

d)用30μl FACS溶液(含0.5％BSA和0.1％叠氮钠的PBS)将5孔内的细胞重悬。

e)将所有5孔的细胞合并到1管中。

f)每管中加5μl PI(碘化丙啶)。

g)根据厂商的说明书，用荧光活化的细胞分选(FCAS)分析细胞。

用于沉默β-半乳糖苷酶mRNA的siRNA序列如下：

C.U.A.C.A.C.A.A.A.U.C.A.G.C.G.A.U.U.U.DT.DT(有义)(SEQ IDNO：32)

A.A.A.U.C.G.C.U.G.A.U.U.U.G.U.G.U.A.G.dT.dT(反义)(SEQ ID NO：33)

表2显示了本实施例的数据。转染效率与测定的细胞裂解液中β-半乳糖苷酶的活性量成反比。转染时，测定的β-半乳糖苷酶的活性降低指示转染成功。因此，在没有转染时，测定的β-半乳糖苷酶的活性是100％，转染效率是O％。随着β-半乳糖苷酶的活性降低，转染效率增加。例如，在表2中，组蛋白H2B与siRNA导致62.03％的转染效率，这指示测定的β-半乳糖苷酶的活性降低了37.97％。用相同的确定转染效率的方法得到了表3呈现的数据。

表2：

9L/LacZ细胞中由多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA递送的效率

转染混合物	转染效率(％总细胞)	摩尔比：(siRNA∶肽)
			单独siRNA(40pmol/孔)	0.09％
阳离子脂质(Invitrogen)	84.32％	unknown
			组蛋白H2B	62.03％	1∶10-15
组蛋白H3	85.08％	1∶10-20
			组蛋白H4	72.07％	1∶4-8
GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO：31)	50.86％	1∶5-20
			WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQ ID NO：27)	98.29％	1∶0.5-4
聚Lys-Trp，4∶1，MW 20,000-50,000	71.92％	1∶2-8
			聚Orn-Trp，4∶1，MW 20,000-50,000	74.16％	1∶2-8

siRNA/肽/脂质

为了评价将阳离子脂质加入到siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽混合物、复合物或偶联物的效应，重复上面的操作程序，除了根据厂商的说明，将脂质体(Invitrogen)以恒定的浓度加入到siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽制剂中。

为了制备由GKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：28)、siRNA和

(Invitrogen)组成的组合物，siRNA和肽于室温下在Opti-MEM培养基中首先一起混合，此后，在室温下将

加入到混合物中形成siRNA/肽/阳离子脂质组合物。

为了制备由RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：29)、siRNA和

组成的组合物，肽和

在Opti-MEM细胞培养基中首先一起混合，在该混合物中加入siRNA，形成siRNA/肽

组合物。

为了制备使用GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：30)或GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO：31)的siRNA/肽/阳离子脂质组合物，这些成分以什么顺序加入到一起以制备siRNA/肽/阳离子脂质组合物并不重要。

为了制备siRNA/蜂毒肽/

siRNA和蜂毒肽首先在Opti-MEM细胞培养基中一起混合，然后将

加入到混合物中。

为了制备siRNA/组蛋白

组合物，组蛋白H1和

首先一起加入到Opti-MEM细胞培养基中，充分混合，然后加入siRNA，与组蛋白

混合物充分混合以形成siRNA/组蛋白H1/组合物。

表3：

在9L/LacZ细胞中，有或没有阳离子脂质时由多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA递送效率

转染混合物	有脂质的转染效率(％总细胞)	无脂质的转染效率(％总细胞)	转染混合物中siRNA∶肽比例
				单独siRNA	1.72％	0.11％
脂质体(无肽)	83.48％
				GKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：28)	89.67％	0.26％	1∶5-20
RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：29)	89％	0.59％	1∶1-5
				GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：30)	89.99％	54.58％	1∶5
GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO：31)	90.01％	50.86％	1∶5-10
				蜂毒肽	93.1％	5.15％	1∶20
组蛋白H1	93.39％	0.14％	1∶10-20

基于前面的结果，本发明中的示例性多聚核苷酸递送增强多肽基本上能增强细胞摄取siRNAs，同时可选择的阳离子脂质加入到本发明中某些siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽混合物中可基本上提高siRNA递送效率。

实施例2

包含与TAT-HA多聚核苷酸递送增强多肽偶联的siRNA的组合物的制备 及特征

本实施例描述了以共价键偶联到siRNA双链中的一条链的特定肽的合成及摄取活性。这些偶联物将siRNA有效到递送到胞浆。

肽合成

使用Rainin Symphony合成仪，在CLEAR-酰胺树脂上通过固相Fmoc化学法合成肽。用5当量HCTU和Fmoc氨基酸与过量的N-甲基吗啉作用40分钟进行偶联步骤。肽树脂用溶于DMF的20％吡啶处理两次，每次10分钟，以去除Fmoc。在完成整段肽的合成时，用吡啶去除Fmoc基团，并用DMF充分洗涤。在6当量的N-甲基吗啉存在下，通过将3.0当量的3-马来酰亚胺丙酸和HCTU偶联到肽树脂的N-末端来制备马来酰亚胺修饰肽。偶联的程度用Kaiser测试来监控。加入10mL含2.5％水和2.5三异丙基硅烷的TFA，随后在室温下轻轻搅拌2小时，使肽从树脂上裂解下来。通过乙醚研碎、随后过滤来收集产生的粗制肽。将该粗制产物溶于Millipore水中，冷冻干燥。粗制肽溶于15mL含0.05％TFA的水中和3mL乙酸中，将其通过5mL注射环以5mL/min的流速装载到Zorbax RX-C8反相柱(22mm ID × 250mm，5μm粒度)上。通过跑0.1％B/分钟的线性AB梯度完成纯化，其中溶剂A是溶于水中的0.05％TFA，溶剂B是溶于乙腈中的0.05％TFA。纯化的肽用HPLC和ESMS分析。

偶联物的合成

用标准的固相合成方法来制备肽和RNAs。肽和siRNA分子必须用特定的部分加入官能基以允许彼此共价结合。对肽而言，N-末端被官能化，例如，用3-马来酰亚胺丙酸。然而，已知诸如溴或碘乙酸基的其他官能团也起作用。对RNA分子而言，依照下面的合成方法，有义链的5′末端或反义链的3′末端用例如1-O-二甲氧三苯甲基-己基-二硫化物连接子被官能化。

5′修饰的C6SS-寡核苷酸(GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU(SEQID NO：34)；3.467mg；0.4582μmol)与溶于0.3ml 0.1M三乙胺醋酸(TEAA)缓冲液(pH 7.0)中的0.393mg(3eq)三(2-羧乙基)膦(TCEP)在室温下作用3h还原出自由的巯基。还原的寡核苷酸通过RP HPLC来纯化，在

MS C₁₈4.6×50mm柱上，用溶于0.1M TEAA缓冲液(pH 7)的0到30％的线性梯度的CH₃CN洗柱20分钟(t_r＝5.931min)

纯化的还原寡核苷酸(1.361mg，0.19085μtnol)溶于0.2ml 0.1M的TEAA缓冲液(pH＝7)中，然后将在肽N-末端(0.79mg，1.5eq)结合有马来酰亚胺部分的肽加入到寡核苷酸溶液中。加入肽后，沉淀立即形成，该沉淀在加入150μl 75％CH₃CN/0.1M TEAA时消失。室温下搅拌过夜后，产生的偶联物通过RP HPLC来纯化，在

MS C184.6×50mm柱上，用溶于0.1M TEAA缓冲液(pH 7)的0-30％的线性梯度的CH₃CN洗柱20分钟，接下来的5分钟内用100％C洗柱。偶联物的量用分光光度测定法来确定，基于在λ＝260nm处计算出摩尔吸光系数。MALDI质谱分析显示的观察到的偶联物的峰(10585.3amu)与计算出的质量是匹配的。产量：0.509mg，0.04815μmol，25.2％。

该肽偶联物有义链和附带的反义链通过90℃加热2分钟，随后37℃孵育1小时，在50mM醋酸钾、1mM醋酸镁和15mM HEPES、pH 7.4中退火。通过非变性(15％)聚丙烯酰胺凝胶电泳及随后的溴化乙锭染色证实了双链RNA偶联物的形成。

肽-siRNA偶联物的结构(SEQ ID NOS 34和35)

摄取实验

细胞在转染前一天于24-孔板内铺板，以使其在转染时能达到50-80％的汇合单层。为了形成复合物，siRNA和肽在Opti-培养基(Invitrogen)中稀释，然后在加入到用PBS洗涤的细胞中之前混合，使其复合5-10分钟。在每一种肽浓度(2-50μM)时，siRNA的终浓度是500nM。该偶联物也稀释于Opti-培养基中，添加到细胞的终浓度的范围从62.5nM到500nM。在500nM浓度时，就在该偶联物加入到细胞前，我们也将其与20％FBS组合。在37℃，5％CO₂条件下，转染细胞3小时。细胞用PBS洗涤，用胰酶处理，然后通过流式细胞术分析。通过Cy5荧光强度测定siRNA摄取，通过加入碘化丙啶评价细胞活力。

如图1所示，在小鼠尾部成纤维细胞内，与肽/siRNA复合物相比，肽/siRNA偶联物有更高的摄取百分比。进一步，与肽/siRNA复合物相比，肽/siRNA偶联物有更高的平均荧光强度(MFI；图2)。因此，这些数据提示在某些实施方式中，将多聚核苷酸递送增强多肽与siRNA分子偶联是理想的。

实施例3

siRNA/递送肽复合物的筛选表明多样化装配的合理设计的多聚核苷酸递 送增强多肽有效诱导9L/LacZ细胞中siRNA摄取

本实施例提供了本发明广泛多样化装配的合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽当与siRNAs复合后，增强siRNA摄取的另外的证据。

在平底96-孔板中，每孔铺约10,000个9L/lacZ细胞，使其在第二天转染时达到约50％的汇合。FAM-标记的siRNA和肽在Opti-

培养基(Invitrogen)中稀释到终浓度的2倍。siRNA和肽等体积混合，在室温下复合5-10分钟，然后取50μL加入到预先用PBS洗涤的细胞中。在37℃5％CO₂条件下转染细胞3小时。细胞用PBS洗涤，用胰酶处理，然后通过流式细胞术来分析。通过FAM荧光强度测定siRNA摄取，通过加入碘化丙啶评价细胞活力。下面的表4总结了在9L/LacZ细胞中，对应各种合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽的细胞摄取百分比数据。使用的肽和siRNA的浓度包括在表4内。

表4：

在9L/LacZ细胞中，由合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA摄取的效率

实施例4

离体siRNA/递送被多聚核苷酸递送增强多肽增强

本实施例说明了在LacZ细胞、鼠原代成纤维细胞和人类单核细胞内，siRNA摄取被本发明的多聚核苷酸递送增强多肽所增强。在9L/LacZ cells和小鼠成纤维细胞上进行的实验所用的材料和方法总体与上面描述的相同，除了鼠科动物实验中，小鼠尾部成纤维细胞(MTF)代替了9L/LacZ细胞。在人类单核细胞上进行的实验所用的材料和方法稍后描述。表5总结了在MTF细胞上进行转染的结果。表5包括所用肽的氨基酸序列，以及肽和偶联于eGFP siRNA的Cy5标记的浓度。表6总结了在MTF和9L/LacZ细胞上进行转染的结果。呈现在表6中的数据提供了一些肽/siRNA复合物在不同细胞类型中转染效率的比较。

表5：

在鼠尾部成纤维(MTF)细胞中，由合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA摄取的效率

肽ID#	氨基酸序列	状态	％摄取
				PN250	NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-酰胺(SEQ ID NO：35)	0.5mMsiRNA/40mM肽	85.9％
PN73	NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：59)	0.5mMsiRNA/5mM肽	94.5％
				PEG-PN509	Peg-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：90)	0.5mMsiRNA/25mM肽	91％
PN404	NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-酰胺(SEQ ID NO：91)	0.5mMsiRNA/25mM肽	50.4％
				PN361	NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：58)	0.5mMsiRNA/50mM肽	65％
PN27	AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQC(SEQ ID NO：38)	0.5mMsiRNA/5mM肽	60.7％
				PN58	NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺(SEQ ID NO：53)	1mM siRNA/20mM肽	3.7％
PN158	NH2-RVIRWFQNKRCKDKK酰胺(SEQ ID NO：67)	0.5mMsiRNA/50nM肽	86.2％
				PN316	Maleimido-RVIRWFQNKRSKDKK-酰胺(SEQ ID NO：92)	0.5mMsiRNA/100mM肽	84.8％
PN289	马来酰亚胺-WRFKQqQqQqQqQq-酰胺(SEQ ID NO：76)	0.5mMsiRNA/10mM肽	7％
				PN28	NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-酰胺(SEQ ID NO：39)	1mM siRNA/8mM肽	80.5％
PN173	GRKKRRQRRRPPQC(SEQ ID NO：36)	0.5mMsiRNA/130nM肽	94.8％
				PN159	KLALKLALKALKAALKLA-酰胺(SEQ ID NO：13)	0.5mMsiRNA/5mM肽	0％
PN161	NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺(SEQ ID NO：93)	0.5mMsiRNA/10nM肽	0％

表6：

在LacZ细胞和鼠尾部成纤维细胞中，由合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA摄取的效率

为了进一步描述多聚核苷酸递送增强多肽转染培养细胞的能力的特征，人类单核细胞用与不同浓度的PN73、PN250、PN182、PN58和PN158复合的200nM FITC标记的siRNA孵育。除LacZ和鼠成纤维细胞外，使用了人类单核细胞，因为它们是在治疗类风湿性关节炎中的靶向细胞型。

来自健康供体的新鲜人类血样本购自Golden West Biologicals。为了分离单核细胞，收到血样本后立即将其用PBS按1∶1比例稀释。外周血单个核细胞(PBMC)先通过Ficoll(Amersham)梯度法从全血中分离。利用Miltenyi CD14阳性选择试剂盒和提供的操作方案(MILTENYI BIOTEC)进一步从PBMCs中纯化单核细胞。为了评估单核细胞制备的纯度，用抗-CD14抗体(BD Biosciences)孵育细胞，然后用流式细胞术分选。单核细胞制备的纯度高于95％。

下面的描述是用于本实施例中的转染方案的简单概要。在贴壁细胞达到70～90％汇合单层及悬浮细胞每孔有100,000个细胞时进行铺板。为了制备siRNA/转染试剂复合物，Cy5-或FAM-偶联的siRNA和肽分别在Opti-

培养基(Invitrogen)中稀释到终浓度的2倍。siRNA和转染试剂等体积混合，在室温复合5-10分钟。对于siRNA-肽偶联物，该偶联物直接在Opti-

培养基中稀释。转染混合物加到预先用PBS洗涤的细胞中。在37℃、5％CO₂下转染细胞3小时。为了分析siRNA摄取，细胞用PBS洗涤，用胰酶处理(只用于贴壁细胞)，然后通过流式细胞术分析。通过细胞内Cy5或FAM荧光强度测定siRNA摄取。细胞活力用碘化丙啶(摄取)或AnnexinV-PE(染色)来确定。

前面的实验表明示例性的多聚核苷酸递送增强多肽，PN73，是治疗风湿性关节炎的理想候选物。图3说明了几种不同的多聚核苷酸递送增强多肽增强siRNA在培养的单核细胞中的摄取的能力。用使用脂质体的转染作为比较。也评价了每种肽对细胞活力的影响(图4)。这些数据表明了令人惊讶的和出乎意料的发现，即PN73肽可以高效低毒的转染人类单核细胞，提示它是治疗体内风湿性关节炎的理想候选物。

实施例5

通过siRNA与多聚核苷酸递送增强多肽的偶联增强siRNA/递送

本实施例提供了筛选的结果，评价siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽偶联物诱导或增强siRNA在9L/LacZ培养细胞系和来自鼠的原代成纤维细胞中摄取的活性。用于这些研究中的材料和方法总体与上面描述的相同，除了不需要用于产生siRNA/肽复合物的siRNA/肽混合之外。表7总结了在9L/LacZ细胞中进行转染的摄取百分比。表7包括了使用的肽及肽/siRNA偶联物的浓度。使用了与siRNA分子偶联的FAM-β-gal标记。表8总结了用MTF进行转染的结果。表8包括了使用的肽/siRNA偶联物及偶联到eGFP siRNA分子上的Cy5标记的浓度。

表7：

在LacZ细胞中，由偶联到siRNAs的合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA摄取的效率。

偶联物名称	肽ID#	肽/siRNA偶联物浓度	摄取％
				CoP267nfR137-1	PN267	检测到2.0μM	0％
CoP286nfR138-1	PN286	0.8μM	0％
				CoP287nfR138-1	PN287	0.8μM	0％
CoP284nfR164-1	PN284	检测到1.0μM	0％
				CoP282nfR165-1	PN282	检测到1.0μM	0％
CoP290nfR165-1	PN290	检测到1.0μM	0％
				CoP277nfR167-1	PN73	1.0μM	42.9％
CoP277nfR167-2	PN73	2.0μM	55.4％

表8：

在鼠尾部成纤维细胞中，由偶联到siRNAs的合理设计的多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA摄取的效率

偶联物名称	氨基酸序列	肽/siRNA偶联物浓度	％摄取
				Cy5-dsCoP278nfR270	马来酰亚胺-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-酰胺(SEQ ID NO：102)	0.5μM	96.3％
dsCoP277nfR317	马来酰亚胺-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：103)	4μM	83.5％
				dsCoP275nfR321	马来酰亚胺-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-酰胺(SEQ ID NO：37)	4μM	52.1％
dsCoP285nfR322-1	马来酰亚胺-Dmt-r-FKQqQqQqQqQq-酰胺(SEQ ID NO：74)	4uM	41.3％
				dsCoP236nfR332	马来酰亚胺-RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺(SEQ ID NO：52)	4μM	36.3％
dsCoP317nfR320	马来酰亚胺-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-酰胺(SEQ IDNO：104)	2μM	29.6％
				dsCoP316nfR347	马来酰亚胺-RVIRWFQNKRSKDKK-酰胺(SEQ ID NO：92)	2μM	17.1％
dsCoP289nfR268	马来酰亚胺-WRFKQqQqQqQqQq-酰胺(SEQ ID NO：76)	4μM	3.2％
				dsCoP276nfR319	马来酰亚胺-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-酰胺(SEQ ID NO：105)	2μM	3.6％
dsCoP298cfR248	NH2-WRFKC-酰胺(SEQ ID NO：106)	4μM	4.1％
				dsCoP280nfR362-1	马来酰亚胺-GRKKRRQRRRPPQ-酰胺(SEQ ID NO：43)	4μM	1.8％
dsCoP458nfR363-1	马来酰亚胺-KLALKLALKALKAALKLA-酰胺(SEQ ID NO：107)	4μM	10.8％
				dsCoP459nfR364-1	马来酰亚胺-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺(SEQ ID NO：108)	4μM	54.5％

前面的数据表明本发明中多样化装配的siRNA/肽偶联物高效介导siRNAs进入不同细胞类型的递送。

实施例6

组合到siRNA的多聚核苷酸递送增强多肽增强了 siRNA基因表达的敲低

本实施例表明了本发明的siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽复合物有效敲低靶基因的表达。在本研究中，检测了肽/siRNA复合物调节人类肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力，该基因在人类和其他哺乳动物受试者体内过表达时，提示介导了RA的发生或发展。

健康人类血购自Golden West Biologicals(CA)，用Ficoll-Pague plus(Amersham)梯度离心液从血中纯化外周血单个核细胞(PBMC)。然后用购自Miltenyi Biotech的微磁珠从PBMCs中纯化人类单核细胞。分离的人类单核细胞重悬在补充有4mM谷氨酸盐、10％FBS、1x非必需氨基酸和1x青-链酶素的IMDM中，储存在4℃直至使用。

人类单核细胞以每100μl含100,000个细胞的OptiMEM培养基(Invitrogen)每孔种植于96孔平底板中。转染试剂与siRNA按需要的浓度于室温下在OptiMEM培养基中混合20分钟(对于脂质体2000；Invitrogen)或5分钟(对于肽)。在孵育结束时，混合物中加入FBS(终浓度3％)，将50μl的该混和物加入到细胞。细胞在37℃下孵育3小时。转染后，将细胞转移到V-底板内，然后1500rpm离心沉淀细胞5分钟。细胞重悬在生长培养基中(含谷氨酸盐、非必需氨基酸和青-链霉素的IMDM)。孵育过夜后，细胞用1ng/ml的LPS(Sigma)刺激3小时。诱导后，按上述方法收集细胞用于mRNA定量，保留上清用于蛋白定量。

根据厂商的说明书，使用Genospectra(CA)的分支DNA技术(CA)测定mRNA。为了定量细胞内的mRNA水平，测定了管家基因(cypB)和靶基因(TNF-α)的mRNA，且TNF-α的读数用cypB来校正，获得相对的发光单位。为了定量蛋白水平，根据厂商的说明书，使用来自BD Bioscience的TNF-αELISA。

如下面的表9所示，这些siRNAs针对TNF-αmRNA的不同的靶区域。表9中列出的每个寡序列没有显示3′突出(例如，dNdN，其中N代表任一核苷酸)。

表9：

TNF-α基因的靶序列及靶向TNF-α的siRNA的寡序列的命名、定位

ID#	siRNA名称	靶序列定位	寡序列	SEQ ID NO：
					N125	TNF-α-1	516-534	GCGUGGAGCUGAGAGAUAA	109
N115	TNF-α-2	430-448	GCCUGUAGCCCAUGUUGUA	110
					N132	TNF-α-3	738-756	GGUAUGAGCCCAUCUAUCU	111
N108	TNF-α-4	360-378	CCAGGGACCUCUCUCUAAU	112
					N138	TNF-α-5	811-829	GCCCGACUAUCUCGACUUU	113
N113	TNF-α-6	424-442	UGACAAGCCUGUAGCCCAU	114
					N143	TNF-α-7	844-862	GGUCUACUUUGGGAUCAUU	115
N107	TNF-α-8	359-377	CCCAGGGACCUCUCUCUAA	116
					N137	LC1	806-828	AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU	117
N122	LC2	514-532	AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU	118
					N130	LC3	673-691	AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG	119
N101	LC4	177-195	AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA	120
					N140	LC5	820-838	AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU	121
N135	LC6	781-799	AAGGGUGACCGACUCAGCGCU	122
					N128	LC7	636-654	AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC	123
N127	LC8	612-630	AACCCAUGUGCUCCUCACCCA	124
					N118	LC9	472-490	AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC	125
N111	LC10	398-416	AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA	126
					N110	LC11	363-381	AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG	127
N105	LC12	265-287	CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA	128
					N104	LC13	264-282	AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU	129
N120	LC14	495-513	AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA	130
					N153	LC16	1535-1555	CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA	131
N136	LC17	787-807	CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA	132
					N152	LC18	1327-1347	CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA	133
N114	LC19	428-448	AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA	134
					N145	LC20	982-1002	UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA	135
N101	YC-1	177-195	CUGAAAGCAUGAUCCGGGA	136
					N103	YC-2	251-269	AGGCGGUGCUUGUUCCUCA	137
N106	YC-3	300-318	CCACCACGCUCUUCUGCCU	138
					N109	YC-4	362-380	AGGGACCUCUCUCUAAUCA	139
N113	YC-5	424-442	UGACAAGCCUGUAGCCCAU	140
					N115	YC-6	430-448	GCCUGUAGCCCAUGUUGUA	141
N117	YC-7	435-453	UAGCCCAUGUUGUAGCAAA	142
					N120	YC-8	495-513	CCAAUGCCCUCCUGGCCAA	143
N121	YC-9	510-528	CCAAUGGCGUGGAGCUGAG	144
					N123	YC-10	515-533	GGCGUGGAGCUGAGAGAUA	145
N125	YC-11	516-534	GCGUGGAGCUGAGAGAUAA	146
					N126	YC-12	558-576	GCCUGUACCUCAUCUACUC	147
N130	YC-13	673-691	CCUCCUCUCUGCCAUCAAG	148
					N132	YC-14	738-756	GGUAUGAGCCCAUCUAUCU	149
N133	YC-15	772-790	GCUGGAGAAGGGUGACCGA	150
					N134	YC-16	776-794	GAGAAGGGUGACCGACUCA	151
N136	YC-17	787-807	GCCCGACUAUCUCGACUUU	152
					N141	YC-18	841-859	GCAGGUCUACUUUGGGAUC	153
N143	YC-19	844-862	GGUCUACUUUGGGAUCAUU	154
					N144	YC-20	853-871	UGGGAUCAUUGCCCUGUGA	155

ID#	siRNA名称	靶序列定位	寡序列	SEQ ID NO：
					N146	YC-21	985-1003	GGUCGGAACCCAAGCUUAG	156
N147	YC-22	1179-1197	CCAGAAUGCUGCAGGACUU	157
					N148	YC-23	1198-1216	GAGAAGACCUCACCUAGAA	158
N149	YC-24	1200-1218	GAAGACCUCACCUAGAAAU	159
					N150	YC-25	1250-1268	CCAGAUGUUUCCAGACUUC	160
N151	YC-26	1312-1330	CUAUUUAUGUUUGCACUUG	161
					N154	YC-27	1547-1565	UCUAAACAAUGCUGAUUUG	162
N155	YC-28	1568-1585	GACCAACUGUCACUCAUU	163

表10、11和12说明了复合到本发明的多聚核苷酸递送增强多肽的特异寡序列靶向和敲低人类单核细胞中TNF-α基因表达水平的效力。

表10：

PN73/siRNA复合物介导的TNF-α敲低百分比

表11：

PN509/siRNA复合物介导的TNF-α敲低百分比

表12：

PN250/siRNA复合物介导的TNF-α敲低百分比

前面的结果(表10、11和12)表明用本发明的新型siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽组合物可以在哺乳动物细胞内达到敲低TNF-α基因表达的有效水平。

筛选和特征

LPS处理的人类单核细胞(CD14+)，在大约2小时内诱导TNF-α-特异性mRNA，在随后2小时，TNF-α的蛋白水平达到顶峰。使用脂质体2000将siRNA候选序列转染给单核细胞，然后用LPS处理感染的细胞，大约16小时后测定TNF-αmRNA的水平，通过敲低的活性来筛选siRNA。设计了56个siRNA序列并根据它们在活化的人类原代单核细胞内敲低TNF-αmRNA和蛋白的水平来筛选。一组有代表性的27个siRNA序列的活性范围是从80％的mRNA敲低活性到没有可检测的活性。通常，TNF-α蛋白水平比mRNA水平降低的更多，例如，TNF-αmRNA(TNF-α-1)50％的敲低导致TNF-α蛋白水平降低75％。获得了选择的siRNAs显示从30％到60％的敲低水平的剂量反应曲线。计算出的IC₅₀值在10pM到200pM。尽管评价的siRNA序列遍布于TNF-α的转录本，但鉴定的最有效的siRNAs位于两个区域：编码区的中间和3′-UTR。

实施例7

与siRNA偶联的多聚核苷酸递送增强多肽增强了siRNA 基因表达的敲低

本实施例表明本发明的肽-siRNA偶联物敲低了靶基因的表达。这些研究中的材料和方法与上面描述的那些相同，除了不需要siRNA和肽的混合。在本系列研究中，敲低实验包括，肽/siRNA-介导的敲低在脂质体存在和不存在时的比较。下面的表13说明了本实施例的结果。

表13：

脂质体存在和不存在时，肽/siRNA-介导的TNF-α基因表达的敲低

前面的数据(表13)表明与siRNAs偶联的本发明中多样化装配的多聚核苷酸递送增强多肽能够增强siRNA-介导的哺乳动物受试者内TNF-α基因表达的敲低。

实施例8

siRNA基因表达敲低的时程

本实施例呈现了与siRNA-介导的基因表达敲低的时程有关的研究。为了检测siRNA效应的持续时间，使用上文提到的siRNA转染方案，除了使用了来自eGFP表达小鼠的成纤维细胞之外。这里使用的转染试剂是脂质体。细胞在第18天时由于生长过度重新铺板。在第一次转染后的第19天进行第二次转染。转染后第19天，测定eGFP的水平。一起使用了GFPI siRNA(GFPI)及发夹siRNA(D#21)，以及作为对照的假或无义siRNA(Qiagen)。敲低活性用假siRNA(Qiagen对照)校正。值越高表明敲低活性越高。

表14：

由脂质体介导的siRNA转染敲低TNF-α基因表达的时程

前面的研究(表14)表明siRNA敲低活性在第3天左右变得明显，并持续到第9天，而在第17天左右靶基因的表达回复到基线水平。在第18天第二次转染后，出现了eGFP表达的另一次降低，提示该试剂可以反复给予细胞以产生反复的或持久的基因表达敲低。

实施例9

与多聚核苷酸递送增强多肽复合的siRNA介导的TNF-α基因表达敲低的 剂量依赖

本实施例表明在活化的人类单核细胞中，与示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73复合的siRNA介导的敲低活性依赖于肽-siRNA复合物的剂量浓度。

提供的PN73/siRNA复合物比例恒定，PN73和siRNA之间的比例约是PN73∶siRNA＝82∶1(表15)。400钠摩尔siRNA与33μM PN73在OptiMEM培养基中复合5分钟。复合后，复合物用OptiMEM连续稀释(1∶2比例)。该复合物加到人类单核细胞中进行转染。随后的诱导和mRNA的定量根据上文描述来完成。

表15：

TNF-α基因表达敲低的肽剂量依赖

在相关的系列实验中，siRNA被连续稀释，并与固定量的PN73(1.67μM)组合。作为选择的规定，该PN73多聚核苷酸递送增强多肽与滴定量的siRNA复合。PN73(1.67μM)与每一滴定量的LC20siRNA于室温下在OptiMEM培养基中复合5分钟。复合后，该复合物加到人类单核细胞中进行转染。下面表16中提供的诱导和mRNA定量的数据通过上文中描述的方法获得。

表16：

siRNA剂量依赖的TNF-α基因表达敲低

siRNA浓度(nM)	对照(％)	TNF-α基因表达(％)
			0.8nM	100.0％	84.7％
4nM	100.0％	59.4％
			20nM	100.0％	65.2％
100nM	100.0％	54.7％

实施例10

扩大哺乳动物细胞的siRNA敲低效应的多重给药方案

本实施例表明多重给药的方案会有效的扩大由本发明的siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽介导的哺乳动物细胞基因表达的敲低效应。这些研究使用的材料和方法与上文描述的相同，除了在指定的时间进行重复的转染外。假siRNA(Qiagen)用来作并列对照。表17总结了用肽/siRNA复合物多重转染的数据。TNF-α基因敲低活性百分比代表了总基因表达的百分比。

表17：

用肽/siRNA复合物多重转染后，TNF-α基因表达敲低活性

前述结果(表17)表明当适时(在本例中，首次转染后的约第5天到第7天之间)进行多重转染时，可以维持或重新诱导哺乳动物细胞内TNF-α基因表达敲低效应。

实施例11

体内siRNA/肽-介导的TNF-α基因表达敲低活性

该实施例提供了表明本发明的siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽组合物介导全身递送和siRNA导致的治疗性基因敲低的功效的体内数据，该组合物有效调节靶基因表达和以治疗的方式改变细胞的表型。

表达人类TNF-α的5周龄小鼠购自Hellenic巴斯德研究所，希腊)。一周两次通过静脉给予小鼠300μl生理盐水(4只小鼠)，同时一周一次给予RA药物类克(Ramicade)(5mg/kg)(2只小鼠)，或同时一周两次给予与PN73以1∶5摩尔比混合的LC20siRNA(2mg/kg)(2只小鼠)。在注射期间，收集血浆样本用于ELISA测试(R&D Systems)，同时一周两次进行作为RA疾病进展和治疗功效的公认指标的爪评分。下面的表18显示了来自处理小鼠的TNF-α蛋白的血浆水平。

表18：

ELISA检测的血浆中TNF-α蛋白量

^*这些数据代表了实验小鼠的平均值，单位是pg/ml。

上述结果表明在肽/siRNA-处理小鼠，循环中TNF-α蛋白水平与类克或生理盐水(对照)处理小鼠的水平相比有效下降。

本发明的siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽组合物和方法的体内功效的另外证据从上述进行爪评分(公认的RA疾病状态和疗效的指标)的鼠受试者获得。由于起点不同(一些动物在较早的点就有分数)，实验中所有的动物的分值都调整到0。根据下面的评分指标，每只爪子都给一个0到3的分值，最高值是12。

0：正常

1：爪或踝关节水肿或变形

2：爪和踝关节变形

3：腕关节或踝关节僵直

这些爪分值评估的结果以图表的形式呈现在图5。这些数据表明当多聚核苷酸递送增强多肽PN73注射入动物时，能递送治疗量的siRNAs(例如，LC20，TNF-α2和TNF-α9(UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ IDNO.187)))，这可由第8周时延迟的RA进展显示出。第8周时，与类克-处理鼠相比，PN73/siRNA处理鼠在爪评分指标方面，结果更好。在处理后11周进行爪分值评估时，PN73/LC20复合物得到了与类克-处理鼠可比的爪分值评估。PN73肽/LC20siRNA在1∶5的比例时，2mg/kg LC20与测试的LC20较低剂量相比，取得了最大的相对观测的RA进展的延迟。下面的表19总结了用PN73和siRNAs处理后评估的5个不同组中几种siRNAs的相对效应。

表19：

组总结

组标记	处理＊	SiRNA的相对效果
			TNF#1	LC20，类克，PBS	LC20与类克(Ramicade)效果相同
TNF#4	LC20和LC13	总体低爪评分
			TNF#5	偶联到PN73的LC20	总体低爪评分；偶联物比复合物具有更低的活性
TNF#6	LC20，YC12和LC17	总体低爪评分。YC12和YC17不如LC20有效
			TNF#7(图5)	LC20，TNF-α2和TNF-α9	到第8周时，LC20和TNF-α9比类克更有效；到第11周，LC20与类克效果相同

^*在PN73存在或不存在下，测试siRNAs；类克(Ramicade)是阳性处理对照；PBS是阴性处理对照。

上述结果表明本发明的siRNA和多聚核苷酸递送增强多肽组合物提供了用于调节基因表达以及治疗和管理疾病的有前景的新的治疗工具。本发明的siRNAs，例如，靶向人类TNF-α-特异性mRNAs使其降解的siRNAs，提供了比现有的RA的小分子、可溶性受体或抗体治疗更高的特异性、更低的免疫原性及更好的疾病的改善。筛选出靶向hTNF-α及单次给药产生30到85％敲低的50多个候选siRNA序列。比较了20多个计算机设计的肽复合物和/或共价分子的单核细胞荧光RNA摄取，发现许多有明显比脂质体或偶联胆固醇的siRNA更强的摄取，其IC₅₀值＜10pM。在体外活化的人类单核细胞中，肽-siRNA制剂有效敲低TNF-αmRNA和蛋白水平。

在组成性表达人类TNF-α的两个转基因小鼠模型中评估了一个示例性的候选递送肽/siRNA制剂。在6周龄开始时一周两次通过IV注射2mg/kg siRNA处理或用因福利美(infliximab)处理的动物在7周龄开始时显示了RA评分稳定性(爪和关节炎症)，与疾病状态持续到11周的对照相比。在9周龄时，siRNA处理动物的RA评分的降低与因福利美处理动物是相似的，但其血浆TNF-α蛋白水平明显低于因福利美处理动物的水平。

基于本发明的公开内容，抑制在诸如炎症的病理状态下发挥重要作用的靶基因(例如诸如TNF-α的细胞因子)的表达的siRNA的应用提供了减轻或预防哺乳动物受试者的例如RA的疾病症状的有效治疗。在本发明的方法和组合物范围内使用的示例性的肽/siRNA组合物提供了与它们降低或消除靶基因表达(例如，TNF-α表达)能力相关的优势，而不是像抗体或可溶性受体那样，与靶基因产物(例如，TNF-α)复合。

根据本发明的讲述，改善核酸系统给药提供了发展siRNAs作为药物的另一优势。这种情况下的具体挑战包括通过组织屏障递送siRNA到靶细胞或组织，维持siRNA的稳定性和使siRNAs以足够的有效量跨过细胞膜进入细胞的细胞内递送。本公开内容首次表明了包含靶向特异基因表达(诸如人TNF-α表达)的新型的肽/siRNA组合物的有效体内递送系统，其消弱了预示靶疾病的转基因动物模型中的疾病活性，正如用RA鼠模型研究所示例的那样。在相关研究中，本发明的组合物和方法有效抑制了来自RA患者的活化单核细胞内TNF-α的表达。这些研究提示RNAi通路通过作用于TNF-通路的细胞内效应有效介导细胞表型和疾病进展的改变，而且避免了由于循环中带有残余免疫反应性的的抗体/TNF-α复合物(其表现了现有RA抗体治疗的特征)导致的毒性效应。特别地，本文中所有的测试都具有最低化的相关的毒性效应，以使这些实例中显示的siNAs和多聚核苷酸递送增强多肽的剂量总与至少80-90％或更高的细胞活力水平相关。

实施例12

优化多聚核苷酸递送增强多肽的合理设计

本实施例提供了将本发明的多聚核苷酸递送增强多肽优化的示例性设计和数据。进行该合理设计操作的对象是组蛋白H2B-来源的多聚核苷酸递送增强多肽。

表20：

PN73的缺失和修饰

表20提供了PN73的原始结构及为优化基于PN73的多聚核苷酸递送增强多肽的合理设计产生的PN73衍生物的图表。每个肽涂灰色的C-末端代表该肽的疏水区域，每个肽涂黑色的N-末端代表其亲水区域。上面显示的PN73母肽是诱导或增强siRNA递送到细胞的多聚核苷酸递送增强多肽的一个实例。

为了更好的理解这个和其他多聚核苷酸递送增强多肽的功能-结构的活性关系，通过表征C-和N-末端功能以及PN73和其他化学部分偶联物的活性，进行了初级结构研究。

人类组蛋白2B(H2B)的氨基酸序列如下所示。

PN73、PN360和PN361是H2B的肽片段，它们代表的H2B蛋白的部分在下面的肽名后的括号内被标明。下面列出的PN360和PN361的氨基酸序列与在PN73内发现的对应序列对齐。在H2B氨基酸序列中的PN73肽片段加了下划线，代表H2B的氨基酸13到48。它也可以是H2B的氨基酸12到48。PN360与PN73共享N-末端但缺少PN73的C-末端，而PN361与PN73共享C-末端但缺少PN73的N-末端。PN73偶联物是与单siRNA链(例如，有义链)共价连接的PN73。PN404是PN73中所有的赖氨酸都被精氨酸替代的版本，PN509是聚乙二醇化的PN73(PEG分子量是1k道尔顿)衍生物，其N-末端是聚乙二醇化的。

H2B(组蛋白2B)氨基酸序列

MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDSKKPKRSRKESYSVYVY

KVLKVHPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRST

ITSREIQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK(SEQ ID NO：164)

PN73(13-48)

NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：59)

PN360(13-35；PN73的N-末端)

NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-酰胺(SEQ ID NO：57)

PN361(24-48；PN73的C-末端)

NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：58)

PN73(13-48)-siRNA(有义链)偶联物

siRNA-KGSKKAVTKAQKKDGKKJ1KRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO 59)

PN404(所有的赖氨酸都由精氨酸替代的PN73)

NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-酰胺(SEQ ID NO：91)

PN509(聚乙二醇化PN73)

PEG-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-酰胺(SEQ ID NO：90)。

图6提供了前述合理设计的PN73衍生的多聚核苷酸递送增强多肽在小鼠尾部成纤维细胞的摄取功效和细胞活力研究的结果。修饰的PN73在小鼠尾部成纤维细胞中的活性变化通过图例进行了说明。与PN404不同，PN509增加了摄取而没有增加毒性。PN73的N-末端的缺失部分降低活性，而去除C-末端残基则取消活性。PN73和PN509在原代细胞中都显示了比脂质体(Invitrogen，CA)更高的活性。

实施例13

乙酰化的多聚核苷酸递送增强多肽在血浆中的稳定性增加

本实施例的目的是确定示例性的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的修饰是否会增加该肽的稳定性及从而增加它的转染活性。比较了PN73未修饰的、N-末端聚乙二醇化的和N-末端乙酰化的形式在血浆中的稳定性。PN73的C末端被酰胺化。排阻色谱法和紫外探测仪合用来研究PN73未修饰的和修饰的形式在血浆孵育前后的稳定性的特征。

在无血浆的情况下，PN73未修饰的、聚乙二醇化和乙酰化的形式在大约9分钟时，显示了不同但有重叠的UV痕迹。然而，暴露血浆4小时后，未修饰的PN73和聚乙二醇化的PN73特异的UV痕迹不再存在，这提示出现了明显的降解。与此相比，乙酰化的PN73的独特UV痕迹仍然存在，提示这种修饰与未修饰的及聚乙二醇化的PN73形式相比，明显增加PN73在质粒中的稳定性。

这些数据显示了令人惊奇和出乎意料的发现，即PN73在血浆中的稳定性能够被PN73肽的N-末端乙酰化所增强。乙酰化的PN73肽的初级结构如下：

Ac-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：59)

实施例14

多聚核苷酸递送增强多肽不引发干扰素反应

本实施例的目的是比较用脂质体试剂与siRNA或示例性的多聚核苷酸递送增强多肽PN73肽与siRNA转染的细胞的干扰素反应。用ELISA(蛋白)和bDNA(mRNA水平)检测干扰素反应。

典型地，siRNA分子由脂质体介导的转染递送入细胞。然而，这通常导致较差的递送效率、体内炎症反应和抑制细胞生长的干扰素基因表达的上调。因此，脂质体介导的转染降低靶基因表达水平有限，使siRNA成为无效的治疗方法及基因表达研究工具。由PN73递送siRNA克服了这一问题。

图7提供了几种不同siRNAs的脂质体和PN73肽转染的bDNA分析的结果。浓度为1nM、10nM、100nM或200nM的siRNAs与脂质体或PN73结合。白介素1β(IL-1β)作为分子标志物确定干扰素反应，Qneg作为阴性对照。如图7所示，与100nM或200nM TNF-α9 siRNA复合的脂质体导致了IL-1βmRNA水平的显著增加。而且，所有其他测试的siRNAs都导致了IL-1βmRNA水平的轻度增加。与之相比，与PN73肽复合的相同的siRNAs不导致IL-IβmRNA水平的增加。

为了进一步表征用脂质体转染的细胞和PN73转染的细胞观察到的干扰素反应的不同，用ELISA检测确定下述分子标志物的蛋白表达水平：白介素1β(IL-1β)、干扰素-α(INF-α)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素12(IL-12)、MIP-1α，干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。表21总结了与siRNA结合的Lipofectamine或与siRNA结合的PN73转染的细胞的相对蛋白表达水平。

表21：

干扰素反应的分子标记物的相对蛋白表达水平

如表21所呈现的，无论使用什么转染试剂，siRNA LC20和LC17都没有干扰素反应。然而，用脂质体转染IFN-1或TNF-α9导致了IL-1β、IL-6和MIP-1α蛋白表达水平的增加。与此相比，用PN73所有测试的siRNAs转染没有诱导任一种所测试的干扰素反应标记物的能观测到的蛋白表达。

来自ELISA检测的这些数据显示了PN73介导的siRNAs的转染不引发干扰素反应这令人惊奇和出人意料的发现。

实施例15

与多聚核苷酸递送增强多肽偶联的siRNA比与多聚核苷酸递送增强多肽 复合的siRNA提供了更强的敲低活性

本实施例的目的是比较与示例性多聚核苷酸递送增强多肽PN73或偶联或结合的siRNAs LC13和LC20在人类单核细胞的敲低活性。前面已讨论了人类单核细胞的分离和转染及用于测量敲低活性的方法。Qneg代表随机的siRNA序列，在这些实验中作为阴性对照。观察的Qneg敲低活性被校正到100％(100％基因表达水平)，LC20和LC13的活性表示成阴性对照的相对百分比。LC20和LC13是靶向人类TNF-α基因的siRNAs。图8显示了siRNAs LC20和LC13在没有PN73(图8-C)、与PN73复合(图8-B)或与PN73偶联(图8-A)的情况下的敲低活性。测试的LC20和LC13的浓度范围从0nM到2.5nM。PN73在复合物和偶联物实验中都保持1∶1的比例。

正如预期的，在没有PN73时，LC20和LC13几乎没有显示敲低活性(图8-C)。当与PN73复合(图8-B)时，LC13和LC20导致了大约15％和30％的相对于Qneg对照的TNF-α基因表达的减少。然而，当siRNA与PN73偶联时，TNF-α的敲低活性降到60％以下(图8-A)。这与PN73/siRNA复合物相比，siRNA的敲低活性明显增加。因此，这些数据显示了当siRNA与示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN13偶联时，siRNA敲低活性明显增强这一令人惊奇及出乎意料的发现。

实施例16

多聚核苷酸递送增强多肽挽救了血清抑制的胆固醇 增强的siRNA摄取

本实施例表明将透膜肽加入到包含与胆固醇部分偶联的siRNA的递送制剂中以剂量依赖方式降低了血清对胆固醇-siRNA摄取的抑制效应。为了分析siRNA的摄取，细胞用PBS洗涤，胰酶处理(只对贴壁细胞)，然后通过流式细胞术分析。通过细胞内的Cy5或FAM荧光强度也测量了上文描述的指定为BA的siRNA的摄取，通过加入碘化丙啶或AnnexinV-PE评估细胞活力。为了区分来自荧光标记siRNA的膜插入的细胞摄取，用台盼蓝淬灭细胞膜表面的荧光。

表22：

PN73介导的转染挽救了血清诱导的胆固醇偶联的siRNA由平均荧光强度(MFI)检测的细胞摄取的抑制

血清百分比	单独胆固醇siRNA(MFI)	有20μMPN73的非偶联siRNA(MFI)
			0	24.8	32.9
5％	1.55	11.5
			10％	1.34	6.39
20％	1.19	5.85

表22的数据表明，血清的存在明显降低偶联于本发明的胆固醇部分的siRNA的细胞摄取。然而，在示例的递送增强肽PN73存在下，挽救了非偶联的siRNA细胞摄取。

比较了与透膜肽递送增强剂PN73复合的本发明的胆固醇偶联siRNA(胆固醇siRNA+PN73)，以及与PN73复合的非偶联siRNA(siRNA+PN73)的细胞摄取。如图9所示，非偶联的siRNA或胆固醇偶联的siRNA在高浓度的PN73时可以得到相同的细胞摄取活性。为了这些及相关的摄取分析，将胆固醇偶联的siRNA和siRNA/PN73复合物转染入前面所述的在Opti-

培养基中的小鼠尾部成纤维细胞(MTF)，加入固定或各种浓度的血清。用于胆固醇和复合物的siRNA的终浓度是0.2μM。通过流式细胞术评估摄取效率和平均荧光强度。

在小鼠尾部的成纤维(MTF)细胞中，进一步表征了PN73和另外的PN250挽救的胆固醇偶联的siRNA的细胞摄取的抑制的能力。图10说明了胎牛血清(FBS)逐渐增加的浓度对siRNA细胞摄取的影响。没有PN73或PN250时，偶联胆固醇的siRNA的细胞摄取在仅5％FBS存在下就显著减少。然而，在40μM PN73或80μM PN250存在时，siRNA的摄取被挽救。

前面的数据(表22和图10)表明siRNAs偶联胆固醇能明显增强它们的细胞摄取。然而，血清的存在大大减少或甚至消除偶联胆固醇的siRNAs的摄取。这可能是由于胆固醇部分与血清蛋白的结合抑制了结合胆固醇的siRNAs进入靶细胞的能力。然而，在递送增强试剂，例如透膜肽PN73和PN250存在下，血清抑制的细胞摄取被挽救。更具体地，透膜肽加入到包含偶联胆固醇部分的siRNA的递送制剂中降低血清对胆固醇-siRNA摄取的剂量依赖方式的抑制效应。

实施例17

示例的多聚核苷酸递送增强多肽的缺失分析

本实施例说明了使示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的siRNA细胞摄取和siRNA介导的靶基因敲低活性最优化的实验设计。

下面的表23显示了示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73和其截短的衍生物。下面列出的PN360和PN361的氨基酸序列与PN73对应的氨基酸序列一致。PN360与PN73共享N-末端，但缺少PN73的C-末端，而PN361与PN73共享C-末端，但缺少PN73的N-末端。PN766相当于PN73C-末端的15个氨基酸。PN73、PN360、PN361和PN766不带C-末端FITC(异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate))(即，-GK[EPSILON]G-酰胺)的标签。表23进一步显示了示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的11个截短形式，其是从PN73肽的N-末端依次缺失3个残基产生的，除PN768外。所有这些肽都带有C-末端FITC(异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate))(即，-GK[EPSILON]G-酰胺)的标签，所以含有该肽的细胞可通过荧光显微镜检测或通过流式细胞术分选。值得注意的是，PN766和PN708氨基酸序列相同，不同的是PN708带C-末端FITC标签。下面说明了要被检测转染活性的PN73的原始结构和截短形式。

表23：

PN73缺失系列

实施例18

示例的多聚核苷酸递送增强多肽的缺失分析

示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的功能域对多聚核苷酸递送增强多肽有效递送siNAs入细胞的能力至关重要。这些功能域包括膜粘附、融合和核苷酸结合区。简而言之，膜粘附描述了示例的多聚核苷酸递送增强多肽结合细胞膜的能力。融合特性反映了从细胞膜上分离，进入胞浆的能力。该肽的膜粘附和融合域在机制上密切相连(即肽进入细胞的能力)，因此很难在实验中分开。因此，将这两个特性(该肽的结构域)合并在一个分析中。定义多聚核苷酸递送增强多肽的每一上述结构域所采用的方法以下会更详细地讨论。最后，核酸结合描述了该肽结合核苷酸的能力。表24总结了确定示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的膜粘附/融合和核苷酸结合域的数据(并没显示所有检测浓度的数据)。

表24：

PN73肽缺失系列的功能域分析总结

NT＝没检测；给出的肽浓度(括号内)是那些达到了给定的摄取百分比或相对值MFI的浓度。

示例的多聚核苷酸递送增强多肽的膜粘附和融合域：

用原代小鼠尾部成纤维(MTF)细胞，通过细胞摄取分析离体检测了示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的全长和截短形式进入细胞的功效。接收到FITC-标记肽的培养细胞的数目用流式细胞术测量。细胞摄取肽的百分比表示成相对于培养细胞的总数目。此外，用平均荧光强度(MFI)评价在细胞内发现的FITC-标记肽的量。MFI与细胞内FITC-标记肽的量直接相关：越高的相对MFI值对应越高的细胞内FITC-标记肽的量。评估了浓度为0.63μM、2.5μM和10μM的表23中的肽；检测了2μM、10μM和50μM的PN768。

在转染前一天，将示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73全长和截短形式暴露于细胞。FITC-标签肽于室温下在Opti-培养基(Invitrogen)中稀释约5分钟，然后加入到细胞。细胞转染3小时后，用PBS洗涤，胰酶处理，然后通过流式细胞术分析。如上述方法确定细胞活力。用台盼蓝淬灭细胞膜表面的荧光以区分来自膜插入物的细胞摄取。

对于细胞摄取分析，检测的所有浓度的全长的FITC-标记的PN73肽(PN690)都达到了几乎100％的细胞摄取(10μM的结果显示在表24名为“％肽细胞摄取”的栏内)。剩下的PN73的截短形式，在10μM浓度时(除PN768，其需要50μM)达到的细胞摄取百分比(括号内的值)与PN690的细胞摄取百分比相似，提示PN73的N-末端对于该肽进入细胞的能力不是必需的。确定为PN768的示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的C-末端的5个残基对细胞摄取肽是足够的。然而，值得注意的且没有在表24中显示的是，在0.63μM时，PN73的截短形式显示出与肽的长度成比例的细胞摄取活性的降低。换句话说，测试的肽在浓度为0.63μM时的一般观测是，当PN73肽的长度降低时，它的细胞摄取活性降低，这就提示细胞摄取肽的活性是剂量依赖的。

这些结果表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽的所有截短形式都保留了进入高百分比的培养细胞的能力。

尽管细胞摄取分析表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的截短形式有相似的细胞摄取活性，但基于FITC-标记肽进入细胞的平均量的MFI测量显示P73的截短形式是有区别的。如表24名为“肽FITC MIF”的栏中，全长FTCC-标记的PN73肽(PN690)的MFI显示了剂量依赖的增加，10μM时达到了最高的MFI，大约是125单位。PN66、PN685和PN660的MFI水平与全长的PN73(PN690)的MFI相似。然而，PN735和PN655的MFI水平降低，分别是80MFI单位和60MFI单位。同时，观察到PN654、PN708、PN653、PN652、PN651和PN768的MFI检测明显降低，提示在缺失PN73的18个N-末端残基时，消除了该肽被细胞的有效摄取。

这些结果表明PN73的所有截短形式都能进入高百分比的培养细胞，特别地，示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的N-末端最初18个残基对该肽被培养细胞有效摄取是必需的。这些结果表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的截短衍生物(PN661；PN685；PN660；PN735和PN655)能有效的进入培养细胞。

总之，细胞摄取肽的数据表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的C-末端5个残基对进入细胞是足够的，提示该肽的膜粘附/融合域定位于C-末端。然而，肽FITC MFI数据表明去除示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的N-末端18个残基限制了该肽进入细胞的效率，提示该肽的N-末端对膜粘附/融合域的有效摄取特征是必需的。

示例的多聚核苷酸递送增强多肽的核苷酸结合域：

通过细胞摄取分析和MFI测量了缺失系列的每个肽复合及递送siRNA入原代MTF细胞的能力。通过比较缺失系列的不同肽的细胞摄取siRNA的相对量，显示了示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的核苷酸结合域的特点。肽或者显示高百分比的siRNA细胞摄取(40％或更高)，其与核苷酸结合域的存在是相关的。低百分比的siRNA细胞摄取(30％以下)反映了核苷酸结合域的缺如。

为了检测示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的全长和截短形式，如上所述用偶联Cy5或FAM的siRNA和肽处理MTF细胞。细胞洗涤后，用胰酶处理，然后通过流式细胞术分析。siRNA的细胞内摄取用细胞内Cy5荧光强度来测量；用台盼蓝淬灭细胞膜表面的所有荧光。摄取表示成相对细胞总数的值。

表24显示了肽与0.5μM Cy5偶联的siRNA的siRNA细胞摄取百分比结果。非FITC标记的PN73(PN643)在10μM浓度时达到了将近100％的摄取率(数据没显示)。然而，当PN73肽标记了FITC(PN690)标签时，在2.5μM时观测到的它的最大细胞摄取活性降低到了大约60％，提示加入FITC标签干扰该肽的细胞摄取活性。因此，在本检测中观测到的每个肽的细胞摄取活性可能不反映该肽真实的siRNA细胞摄取的活性。但是，如PN661所表示的，在去除PN73(PN690)N-端最末端的3个残基时，观测到siRNA细胞摄取的活性轻度降低。类似地，与全长PN73(PN690)相比，PN660和PN708在siRNA细胞摄取的活性方面都有中等程度的降低，

这些数据表明本发明的包括PN661、PN660和PN708在内的多聚核苷酸递送增强多肽能够结合核酸。相比之下，观察到PN685、PN735、PN655和PN654的siRNA摄取活性下降。没有观测到PN653、PN652或PN651有明显的siRNA摄取活性，这表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽(H2B蛋白的37-48个残基)的C-末端12个氨基酸不包含核苷酸结合域。另外，因为PN661、PN660和PN708肽不包括全长肽(PN690)的三个残基缺失，仍保留提到的siRNA结合能力。这些数据表明存在于示例的多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端的核苷酸结合域结合核酸的能力对N-末端特定残基的存在是敏感的。

总之，这些数据表明PN73缺失系列的siRNA细胞摄取活性提示PN708(残基34-48)是siRNA细胞摄取活性所必需的PN73最小的C-末端片段。这与示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的核苷酸结合域位于N-末端最初的24个残基是一致的。

进一步用MFI表征了PN73肽缺失系列转染siRNAs入细胞的能力，MFI确定了进入细胞的Cy5偶联的siRNA的相对平均量。用全长FITC-标记的PN73肽(PN690)递送Cy5偶联的siRNA达到了约50相对单位的MFI。PN73缺失系列的PN735、PN655、PN654和PN708肽显示了降低的MFI，范围从约34单位到44单位。PN73缺失系列的PN661、PN685和PN660的MFI水平略高于全长PN73(PN690)肽的值。与此相比，PN654、PN653、PN652和PN651的MFI相对很小或几乎没有(3-14单位)，提示用这些肽转染后，很少或几乎没有偶联Cy5的siRNA进入细胞。在PN653、PN652和PN651观测到的低MFI值与显示PN654、PN653、PN652和PN651不与siRNA复合或易化siRNA进入细胞的siRNA细胞摄取的数据是相关的。

用荧光显微成像比较了与多聚核苷酸递送增强多肽PN73复合的Cy5标记siRNAs和用脂质体转染(Invitrogen)的siRNAs的细胞定位。用脂质体递送的siRNA的定位特征是更多的点状染色，表明可能有内涵体的定位，而PN73显示了更均匀的核周染色。位于内涵体的siRNA不容易接近胞浆内的RISC复合物，不能沉默靶基因的表达。相比之下，用PN73介导递送时观察到的siRNA均匀的胞质分布是接近RISC复合物及降低靶基因表达的先决条件。这些结果表明本发明的多聚核苷酸递送增强多肽与阳离子脂质相比大大提高了siRNA的递送以及大大提高了靶基因沉默(敲低)。

这些数据表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73增强高效递送siRNA入细胞的能力依赖于该肽N-端最末端的24个残基。这些数据表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的较短的衍生体(PN661；PN685；PN660；PN735；PN655和PN708)能有效与siRNA复合并将其递送入细胞。

多聚核苷酸递送增强多肽的截短形式PN360和PN361的分析：

通过在如上描述的siRNA细胞摄取分析中表征PN360(C-末端)和PN361(N-末端)，显示PN73的C-末端和N-末端区域的功能-结构的活性关系。

表24表明删除PN73的部分N-末端(参见PN361)降低50％的siRNA细胞摄取活性；去除C-末端残基则取消了全部siRNA细胞摄取活性。这些数据表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的C-末端区域对该肽的核苷酸细胞摄取活性是必需的。

肽-siRNA偶联物增强共价连接的运输物递送入细胞：

示例的多聚核苷酸递送增强多肽的截短形式的肽细胞摄取活性和MFI测量提示这些肽可作为各种分子运输物的递送载体。这包括将理想的效应器分子，包括核酸和肽，共价连接到全长的PN73或其衍生物。通过用特殊的部分(脂质、肽和/或糖基团)修饰递送肽可以实现效应器分子到特定细胞类型和/或细胞内的细胞器的限定递送。

示例的多聚核苷酸递送增强多肽的缺失分析表明其N-末端对该肽结合及递送核酸(例如，siNAs)入细胞的能力是至关重要的。然而，即使在N-末端缺失的情况下，这些非核苷酸结合和严重削弱的核苷酸结合肽仍保留它们的膜粘附和融合域(例如，PN361；PN735；PN655；PN654；PN653；PN652和PN651及其衍生物)。鉴于这些肽不能结合核苷酸，通过将siNA共价连接到该肽的膜粘附和/或融合域，这些肽仍然可以用于递送siNA入细胞。因而，该siNA共价键补救了该肽不能结合核苷酸的缺陷并允许了有效的肽介导的siNA入细胞的递送。而且，siNA/肽偶联物不需要限定在选择的示例性多聚核苷酸递送增强多肽的截短形式，也可包括PN73全长和其衍生物。

下面是用于产生siNA/肽共价键的方法的非限定性实例。肽和siRNA分子必须用特定的部分加入官能基以允许彼此共价结合。对肽而言，N-末端加入了官能基，例如，用3-马来酰亚胺丙酸。然而，已知诸如溴或碘乙酸基的其他官能团也起作用。对RNA分子而言，依照下面的合成方法，有义链的5′末端或反义链的3′末端用例如1-O-二甲氧三苯甲基-己基-二硫化物连接子加入官能基。

5′修饰的siNA与溶于0.3ml 0.1M三乙胺醋酸(TEAA)缓冲液(pH 7.0)中的0.393mg(3eq)三(2-羧乙基)膦(TCEP)在室温下作用3h还原出自由的巯基。还原的寡核苷酸，在

MS C184.6×50mm柱上，用溶于0.1M TEAA缓冲液(pH 7)的0到30％的线性梯度CH₃CN洗脱20分钟(t_r＝5.931min)，通过RP HPLC来纯化。

制备上述的偶联物。纯化的还原siNA(1.361mg，0.19085μmol)溶于0.2ml 0.1M的TEAA缓冲液(pH＝7)中，然后将带有马来酰亚胺部分的肽结合到肽的N-末端(0.79mg，1.5eq)，加入到siNA溶液中。加入肽后，加入150μl 75％CH₃CN/0.1M TEAA溶解沉淀。室温搅拌过夜后，产生的偶联物通过RP HPLC纯化，在

MS C184.6×50mm柱上，用溶于0.1M TEAA缓冲液(pH 7)的0到30％的线性梯度CH₃CN洗脱20分钟，接下来的5分钟(t_r＝21.007min)内用100％C洗脱。偶联物的量用分光光度测定法来确定，基于在λ＝260nm处计算出的摩尔吸光系数。MALDI质谱分析显示的观测到的偶联物的峰(10585.3amu)与计算出的质量是匹配的。

该肽偶联物有义链与附带的反义链，在50mM醋酸钾、1mM醋酸镁和15mM HEPES、pH 7.4中通过90℃加热2分钟，随后37℃孵育1小时退火。通过非变性(15％)聚丙烯酰胺凝胶电泳及随后的溴化乙锭染色证实了双链RNA偶联物的形成。

下面的表25显示了细胞摄取活性的结果。

表25：

肽-siRNA偶联物摄取siRNA的细胞的百分比

表25的结果显示PN651-siRNA偶联物增强了siRNA进入细胞的摄取。然后，测量了MFI，其结果呈现在表26中。

表26：

由肽-siRNA偶联物递送的Cy5-siRNA的相对量(MFI)

表26显示的MFI结果与表25显示的siRNA摄取百分比的数据是一致的。这些数据表明PN651-siRNA偶联物增强siRNA进入细胞的摄取。

挑选出的示例多聚核苷酸递送增强多肽的截短形式的基因靶敲低活性：

本实施例表明了本发明的siRNA/多聚核苷酸递送增强多肽复合物有效敲低靶基因表达。特别地，评价了siRNA/多聚核苷酸递送增强复合物调节人类肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力。靶向hTNF-α基因的意义在于当它在人类和其他哺乳动物受试者过表达时，提示介导了风湿性关节炎(RA)的发生和进展。

用人类单核细胞作为一个模型系统，确定siRNA/多聚核苷酸递送增强复合物对hTNF-α基因表达的影响。Qneg代表随机的siRNA序列，作为阴性对照。观测的Qneg敲低活性被校正到100％(100％基因表达水平)，下列siRNAs A19S21、21/21和LC20中的每一种的敲低活性表示为阴性对照的相对百分比。A19S21、21/21和LC20是靶向人类TNF-αmRNA的siRNAs。示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN643(没有C-末端标记的全长PN73)、PN690(带有C-末端FITC标记的全长PN73)和来自缺失系列的截短的PN73形式，PN660、PN735、PN654和PN708与A19S21、21/21和LC20siRNAs复合，以确定它们对每种siRNA降低人类单核细胞hTNF-α基因表达水平的能力的影响

如下进行实验：人类单核细胞按100K/孔/100μl OptiMEM培养基(Invitrogen)种植在96孔平底板中。示例的多聚核苷酸递送增强多肽与20nM siRNA以1∶5的摩尔比于室温下在OptiMEM培养基中混合5分钟。在孵育结束时，混合物中加入FBS(终浓度3％)，将50μl的该混和物加入到细胞中。细胞在37℃下孵育3小时。孵育后，将细胞转移到V-底板内，1500rpm沉淀5分钟。将细胞重悬在生长培养基中(含谷氨酸盐、非必需氨基酸和青-链霉素的IMDM)。孵育过夜后，单核细胞用1ng/ml的LPS(Sigma)刺激3小时，以增加TNF-α表达水平。LPS诱导后，按上述方法收集细胞用于mRNA定量，如果需要保留上清用于蛋白定量。

根据厂商的说明书，使用Genospectra的分支DNA技术测定mRNA。为了定量细胞内的mRNA水平，测定了管家基因(cypB)和靶基因(TNF-α)的mRNA，TNF-α的读数用cypB来校正，获得相对的发光单位。

在上面表24中总结了示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的全长和截短的形式的敲低活性。“敲低活性”栏中的“+”表示肽/siRNA复合物的敲低活性是Qneg阴性对照siRNA的80％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低了20％)。“+/-”表示肽/siRNA复合物的敲低活性是Qneg阴性对照siRNA的约90％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低了10％)。最后，“-”表示肽/siRNA复合物与Qneg阴性对照相比没有明显的敲低活性。

总之，PN643(无FITC标记的全长PN73)和PN690(FITC标记的全长PN73)对所有测试的siRNAs有相同的siRNA敲低活性，在“敲低活性”栏中用“+”表示(表24显示的结果)。此外，PN660对所有测试的siRNAs有与PN643和PN690相似的siRNA敲低活性，这提示PN73肽N-端的最末端9个残基不影响siRNAs介导的靶向的TNF-αmRNA的敲低活性。PN654对A19S21和21/21siRNAs显示了中等的敲低活性，对LC20siRNA没有这种作用(敲低活性在敲低活性栏中显示为“±”)。然而，与PN708或PN735复合的siRNAs，对该siRNAs中的任一种而言都没有导致可观测的敲低活性。

这些结果表明示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73的截短形式，特别是PN660和PN654，不干扰siRNA降低靶基因mRNA水平的能力，提供了改善用于治疗诸如RA的人类疾病的治疗性siRNAs递送的新方法。

实施例19

多聚核苷酸递送增强多肽PN708的特征

本实施例进一步探究了与PN708肽复合的siRNAs的siRNA细胞摄取活性、MFI测量和敲低活性。在PN73缺失系列(参见实施例17中的表23)中列出可用肽。

如上述，细胞摄取分析确定接受当与肽复合时偶联Cy5的siRNA的细胞的数目。用流式细胞术来评估siRNA的细胞摄取。摄取用百分比表示，由含有偶联Cy5的siRNA的细胞数除以转染和未转染的培养细胞总数计算出。用流式细胞术来测量平均荧光强度(MFI)，确定在细胞内发现的偶联Cy5的siRNA的数量。MFI值直接与细胞内偶联Cy5的siRNA的数量相关，因此，MFI值越高代表细胞内偶联Cy5的siRNA的数量越多。

在本实施例中，使用了比前面的实施例更大范围的肽浓度，以确定siRNA细胞摄取活性和MIF测量的功效。而且，评估了细胞活力。在本实施例中，在5μM、10μM、20μM和40μM检测了示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN643(C-末端无标记的全长PN73)、PN690(C-末端有FITC标记的全长PN73)和PN708(由PN73N-末端缺失21个残基产生的15聚核苷酸)。也检测了2.5μM的PN643和PN690，还检测了1.25μM的PN690。80μM的PN643和PN708也被检测。

如下面表27显示的，非FTTC标记的PN73(PN643)肽在10μM浓度时达到了将近100％的siRNA摄取。然而，当PN73肽用FITC标签标记时，它最大的细胞摄取活性降低到约70％。PN708在siRNA细胞摄取活性方面显示了剂量依赖性的增加。PN708在80μM时，达到了95％的最大细胞摄取活性。对全长PN73肽，随着肽浓度增加，细胞活力降低。与此相比，用所有测试浓度的PN708肽孵育的细胞维持90％以上的细胞活力。Cy5-MFI测量进一步显示截短的肽PN708递送入细胞的Cy5-siRNA的量是全长PN73(PN690)肽的近乎两倍。

表27：

PN708的siRNA递送增强特征的总结

这些结果显示截短的示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN768(H2B残基34-38)有增加siRNA高效递送入细胞的能力，且没有不良影响细胞活力。

通过确定截短的示例多聚核苷酸递送增强多肽PN708对siRNA介导的靶基因表达降低的影响进一步显示了它的特征。在本实施例的这一部分，在评估PN708肽与siRNA组合增强靶基因表达的能力之前，去除PN708肽的C-末端FITC-标记。没有FITC-标记时，该截短的示例多聚核苷酸递送增强肽被名为PN766(参见实施例17中的表23)。评估了siRNA/肽复合物调节人类肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力。在本实施例中，随机的siRNA序列，Qneg，作为阴性对照，用siRNAs LC20和LC17靶向人类单核细胞中的hTNF-αmRNA。siRNA与测试的肽的摩尔比是1∶5；1∶10；1∶25；1∶50；1∶75和1∶100。使用的LC20和LC17的浓度都是20nM。

敲低结果显示1∶5、1∶10和1∶25的LC20/PN766和LC17/PN766 siRNA/肽复合物都降低hTNF-αmRNA水平到Qneg siRNA阴性对照的约70％-80％(即与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低了20％-30％)。1∶50、1∶75和1∶100的siRNA/肽比例对hTNF-αmRNA水平与Qneg对照相比没有明显影响。在PN766肽的存在下，没有观测到人类单核细胞的细胞毒性效应。

这些数据表明截短的示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN766与siRNA复合时明显降低靶基因mRNA水平，提示在治疗哺乳动物受试者的RA时，PN766是治疗性siRNAs的理想的siRNA递送肽。

实施例20

在示例的多聚核苷酸递送增强多肽内的氨基酸取代和缺失不影响肽介导 的siRNA细胞摄取活性

本实施例表明在下面表28中列出的由残基取代和/或缺失产生的突变示例多聚核苷酸递送增强多肽，与未修饰的示例的多聚核苷酸递送增强多肽相比，并不影响siRNA细胞摄取活性或MFI测量。下面的表28显示了在示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73内发生的残基取代。灰度突出区的氨基酸代表未修饰的、取代的和/或缺失的残基。灰度突出使辨认和比较PN73肽内的未修饰残基与突变的示例多聚核苷酸递送增强多肽PN644、PN645、PN646、PN647和PN729内的取代和/或缺失的残基变得容易。突变的示例多聚核苷酸递送增强多肽内的取代碱基用粗体表示并加了下划线。此外，粗体下划线的符号“∧”表示PN729内的一个缺失碱基。

通过碱基取代或缺失产生突变的示例的多聚核苷酸递送增强多肽的目的是评估这些修饰对siRNA细胞摄取活性和siRNAs进入细胞的效率的影响。

表28：

PN73残基取代和缺失系列

X＝代表取代的氨基酸；∧＝代表缺失的氨基酸

示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73内的特异的残基取代和/或缺失包括改变或增加芳香族氨基酸的数目和/或降低带负电荷的氨基酸的数目。带有芳香族官能基团的氨基酸(例如苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和其衍生物)通常存在蛋白的跨膜结构域，由于它们相对的非极性(疏水性)特征和易化蛋白的细胞膜穿透能力。带负电荷的氨基酸排斥带负电荷的核酸磷酸二酯键骨架，因此破坏了蛋白结合核酸的能力。因此，PN73肽内的芳香族氨基酸置换的合理性包括增强了肽的细胞穿透功能和/或去除带负电荷的氨基酸以增强肽的核酸结合。肽的核酸结合能力也可以通过简单的删除带负电荷的氨基酸或用带正电荷的或中性氨基酸取代带负电荷的氨基酸来增强。

如前所述完成siRNA细胞摄取分析和MFI测量。数据总结在以下的表29中。检测了0.63μM、1.25μM、2.5μM和5μM浓度的每种肽。这些结果显示尽管在示例的多聚核苷酸递送增强多肽PN73内存在残基取代和/或缺失，这些突变肽与未修饰的PN73的siRNA细胞摄取活性和MFI测量仍然相同。这些数据表明残基取代和/或缺失不影响肽的核酸结合和细胞膜穿透能力。而且，示例的多聚核苷酸递送增强多肽内的取代的和/或缺失的残基不影响细胞活力。

表29：

PN73突变体介导siRNA递送的特征总结

这些结果显示例如通过氨基酸取代或缺失或其组合产生的示例多聚核苷酸递送增强多肽的修饰高效率递送siRNA到高百分比的细胞。

实施例21

多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA细胞摄取活性

本实施例说明了与siRNA复合的在表30中列出的多聚核苷酸递送增强多肽介导的siRNA细胞摄取活性。表31总结了每种多肽的siRNA细胞摄取数据、平均荧光强度(MFI)测量和细胞活力数据。达到了75％或更高的siRNA细胞摄取百分比的多肽在“处理”栏中以灰度突出。这些突出的siRNA/肽复合物的每一种对应的siRNA细胞摄取的特定百分比在“siRNA细胞摄取百分比”栏中也以灰度突出。

表30：

基于siRNA细胞摄取活性筛选出的递送增强多肽

肽ID#	SEQ IDNO：	氨基酸序列	名称
				PN680	178	RSVCRQIKICRRRGGCYYKCTNRPY-酰胺	Androctonin
PN665	179	GFFALIPKIISSPLFKTLLSAVGSALSSSGDQE-酰胺	Paradaxin
				PN734	180	GTAMRILGGVIPRKKRRQRRRPPQ-酰胺	m-Calpain+TAT
PN681	181	KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK-酰胺	MARCKS
				PN694	182	RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺	穿膜肽
PN714	183	RQIRIWFQNRRMRWRR-酰胺	PenArg
				PN760	184	RKKRRQRRRPPVAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA-酰胺	TAT+肽P3a
PN759	185	LGLLLRHLRHHSNLLANIPRKKRRQRRRPP-	卵结合蛋白+TAT
				PN682	186	KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-酰胺	Pep-1

本实施例中的siRNA细胞摄取分析确定了在肽存在下接受偶联Cy5的LC20siRNA的细胞数目。LC20是用于siRNA靶向人类肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)mRNA的寡序列。细胞的siRNA摄取通过流式细胞术评估。摄取用百分比表示，由含有偶联Cy5的siRNA的细胞数除以转染和未转染的培养细胞总数计算出的。用流式细胞术来测量平均荧光强度(MFI)，确定在细胞内发现的偶联Cy5的siRNA的数量。MFI值直接与细胞内偶联Cy5的siRNA的数量相关，因此，MFI值越高代表细胞内偶联Cy5的siRNA的数量越多。

下面的方案用于检测表30中列出的多聚核苷酸递送增强多肽。在转染前一天，按每孔约80,000个小鼠尾部成纤维(MTF)细胞在24孔板内铺板，在完整培养基中培养。在0.5μM偶联Cy5的siRNA存在下，检测了0.63μM、2.5μM、10μM和40μM浓度的每种递送肽，阳性对照除外。为了形成siRNA/肽复合物，偶联Cy5的siRNA和肽分别在Opti-MEM培养基中稀释到终浓度的两倍。siRNA和肽等体积混合，在室温下复合5分钟，将该siRNA/肽复合物加到预先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤的细胞中。在37℃、5％CO₂条件下转染细胞3小时。细胞用PBS洗涤，用胰酶处理，然后通过流式细胞术来分析。通过细胞内Cy5荧光强度测定siRNA细胞摄取。细胞活力用碘化丙啶摄取或AnnexinV-PE(BD Biosciences)染色来确定。为了区分来自标记的siRNA(或荧光标记肽)的膜插入的细胞摄取，用台盼蓝淬灭细胞膜表面的所用荧光。台盼蓝以终浓度0.04％加入到细胞中，重新在流式细胞仪上运行样本以评估荧光强度是否有变化，该变化表明有定位于膜上的荧光。

表31：

多肽介导的siRNA递送筛选的数据(NT＝没有检测)

如表31名为“siRNA细胞摄取百分比”的栏显示，“没有处理”的阴性对照没有显示siRNA细胞摄取，而阳性对照肽达到了95％的siRNA细胞摄取百分比。与多聚核苷酸递送增强多肽PN680、PN681、PN709、PN760、PN759或PN682复合的Cy5偶联的LC20siRNA达到了超过75％或更高的siRNA细胞摄取活性百分比。多聚核苷酸递送增强多肽PN694和PN714分别展示了54％和43％的中等强度的siRNA细胞摄取活性。与此相比，多聚核苷酸递送增强多肽PN665和PN734没有显示明显的siRNA细胞摄取活性(低于5％)。

通过分析平均荧光强度(MFI)，进一步显示了多聚核苷酸递送增强多肽转染siRNAs入细胞的能力的特征。细胞摄取确定的是含有偶联Cy5的siRNA的细胞的百分比，而MFI测量确定了进入细胞的偶联Cy5的siRNA的相对平均量。如表31的名为“siRNA Cy5 MFI”栏显示，通过阳性对照肽PN643递送的偶联Cy5的siRNA达到了约7单位的MFI。正如预期的，“没有处理”阴性对照没有可测量的MFI。多聚核苷酸递送增强多肽PN665没有用MFI检测。PN743、PN694和PN714的MFI测量结果明显比阳性对照的MFI低。多聚核苷酸递送增强多肽PN680、PN709和PN682显示了与PN643阳性对照相似的MFI测量结果，而PN681的MFI是阳性对照MFI的两倍。令人惊奇地，多聚核苷酸递送增强多肽PN760和PN759的MFI测量结果分别是阳性对照MFI的约13倍和6倍多。

这些数据表明多聚核苷酸递送增强多肽PN680；PN681；PN709；PN760；PN759和PN682与siRNA复合时，有效递送siRNA入细胞。

实施例22

通过多聚核苷酸递送增强多肽转染入细胞的siRNAs 的基因表达敲低活性

本实施例表明了与多聚核苷酸递送增强多肽复合的siRNA有效敲低该siRNA靶基因的mRNA表达。特别地，评价了siRNA/肽复合物调节人类肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)基因表达的能力。靶向hTNF-α基因的意义在于当它在人类和其他哺乳动物受试者过表达时，提示介导了风湿性关节炎(RA)的发生和进展。

用人类单核细胞作为模型系统，确定siRNA/肽复合物对hTNF-α基因表达的影响。Qneg代表随机的siRNA序列，作为阴性对照。观测的Qneg敲低活性被校正到100％(100％基因表达水平)，下列siRNAs A19S21MD8、21/21MD8和LC20中的每一种的敲低活性表示为阴性对照的相对百分比。A19S21MD8、21/21MD8和LC20是靶向hTNF-αmRNA的siRNAs。

多聚核苷酸递送增强多肽PN602是在前面实施例中使用的酰基化形式的阳性对照，在本实施例中既作为siRNA有效递送入人类单核细胞的对照，也作为siRNA介导的hTNF-αmRNA水平的许可的敲低活性的阳性对照。多聚核苷酸递送增强多肽PN680和PN681与上面列出的siRNAs复合以确定它们对每种siRNA降低人类单核细胞内hTNF-α基因表达水平的能力的影响。下面的表32总结了所有三种多聚核苷酸递送增强多肽的敲低活性。“敲低活性”栏中的“+”表示肽/siRNA复合物的敲低活性是Qneg阴性对照siRNA的80％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低了20％)。“+/-”表示肽/siRNA复合物的敲低活性是Qneg阴性对照siRNA的约90％(与Qneg阴性对照相比，mRNA水平降低了10％)。最后，“-”表示肽/siRNA复合物与Qneg阴性对照相比没有明显的敲低活性。

根据上述的方案进行本实施例中人类单核细胞的转染。

根据厂商的说明书，使用Genospectra(CA)的分支DNA技术(CA)测定mRNA。为了定量细胞内的mRNA水平，测定了管家基因(cypB)和靶基因(TNF-α)的mRNA，且TNF-α的读数用cypB来校正，获得相对的发光单位。

表32：

与多聚核苷酸递送增强多肽复合的siRNAs的siRNA敲低活性

显示在表32中的结果表明，相比于与相同的多肽复合的Qneg阴性对照，所有三种与阳性对照PN602多聚核苷酸递送增强多肽以1∶5和1∶10的比例复合的siRNAs，都适度降低hTNF-α基因表达水平。然而，与多聚核苷酸递送增强多肽PN681以1∶5和1∶10的比例复合的相同siRNAs，相对于Qneg阴性对照siRNA/PN681复合物，显示了很小或几乎没有的敲低活性。与此相比，与任一种hTNF-α特异的siRNAs以1∶5比例复合的多聚核苷酸递送增强多肽PN680相对于Qneg/PN680对照复合物，展示了明显的hTNF-αmRNA敲低活性。而且，1∶10比例的LC20/PN680复合物与Qneg/PN680对照复合物相比也显示了明显的敲低活性。

这些数据表明多聚核苷酸递送增强多肽PN680递送siRNAs入细胞，并允许有效的siRNA介导的基因沉默。

尽管为了清楚理解，通过实施例详细描述了本发明，但对技术人员显而易见的是，一些变化和修饰，均在所附权利要求书的范围内，其通过说明而不是限制的方式被提出。为了节省篇幅，在本文中，将各种公开出版物和其他参考文献引入了前述的公开内容中。出于所有目的，将这些参考文献的每一篇以其整体通过引用并入本文。然而，值得注意的是，并入本文中讨论的各种公开出版物，仅仅因为它们的公开早于本申请的递交日期，鉴于在先的发明，发明人保留先于这些公开的权利。

序列表

<110>NASTECH PHARMACEUTICAL COMPANY，INC.

<120>递送核糖核酸到细胞的药物组合物

<130>04-03CIP-PCT

<140>

<141>

<150>11/223,699

<151>2005-09-08

<150>60/727,216

<151>2005-10-14

<150>60/733,664

<151>2005-11-04

<160>188

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人类免疫缺陷病毒

<400>1

Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

  1                   5

<210>2

<211>16

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体的描述：未知穿透PTD肽

<400>2

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>3

<211>34

<212>PRT

<213>单纯疱疹病毒

<400>3

Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr

  1               5                  10                  15

Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro

             20                  25                  30

Val Asp

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>4

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

<210>5

<211>16

<212>PRT

<213>人

<400>5

Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro

  1               5                  10                  15

<210>6

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>6

Val Thr Val Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly

  1               5                  10                  15

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：gP41融合肽

<400>7

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

  1               5                  10                  15

Ala

<210>8

<211>17

<212>PRT

<213>中美凯门鳄

<400>8

Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly

  1               5                  10                  15

Ala

<210>9

<211>24

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：hCT来源肽

<400>9

Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln

1                 5                  10                  15

Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro

             20

<210>10

<211>26

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：未知传递肽

<400>10

Gly Trp Thr L6u Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys

  1               5                  10                  15

Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

             20                  25

<210>11

<211>16

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：未知loligomer肽

<400>11

Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>12

<211>7

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：未知精氨酸肽

<400>12

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

  1               5

<210>13

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：两性模式肽

<400>13

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

  1               5                  10                  15

Leu Ala

<210>14

<211>16

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>14

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

  1               5                 10                   15

<210>15

<211>16

<212>PRT

<213>仙台病毒

<400>15

Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala

  1               5                  10                  15

<210>16

<211>16

<212>PRT

<213>呼吸道合胞病毒

<400>16

Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser AlaIle Ala Ser Gly Val

  1               5                  10                 15

<210>17

<211>16

<212>PRT

<213>人类免疫缺陷病毒

<400>17

Gly Val Phe Val Leu Gly Phe Leu Gly Phe Leu Ala Thr Ala Gly Ser

  1               5                  10                  15

<210>18

<211>16

<212>PRT

<213>伊波拉病毒

<400>18

Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala

  1              5                   10                  15

<210>19

<211>56

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>19

Ala Cys Thr Cys Pro Tyr Cys Lys Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ser Gly

  1              5                   10                  15

Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly

             20                  25                  30

Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His

         35                  40                  45

Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys

     50                  55

<210>20

<211>54

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>20

Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Asp Gly Glu Lys Arg Ser Gly Glu

  1               5                  10                  15

Gln Gly Lys Lys Lys His Val Cys His Ile Pro Asp Cys Gly Lys Thr

             20                  25                  30

Phe Arg Lys Thr Ser Leu Leu Arg Ala His Val Arg Leu His Thr Gly

         35                  40                  45

Glu Arg Pro Phe Val Cys

     50

<210>21

<211>55

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>21

Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Glu Gly Gly Gly Arg Gly Thr Asn

  1               5                  10                  15

Leu Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Pro Gly Cys Gly Lys

             20                  25                  30

Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Ser

         35                  40                  45

Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys

     50                  55

<210>22

<211>56

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>22

Ala Cys Ser Cys Pro Asn Cys Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Ser Asn

  1               5                  10                  15

Glu Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Glu Gly Cys Gly

             20                  25                  30

Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His

         35                  40                  45

Thr Gly Glu Arg Pro Phe Ile Cys

     50                  55

<210>23

<211>60

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>23

Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Thr Asn Glu Met Ser Gly Leu Pro Pro

  1               5                  10                  15

Ile Val Gly Pro Asp Glu Arg Gly Arg Lys Gln His Ile Cys His Ile

             20                  25                  30

Pro Gly Cys Glu Arg Leu Tyr Gly Lys Ala Ser His Leu Lys Thr His

         35                  40                  45

Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Leu Cys

     50                  55                  60

<210>24

<211>58

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>24

Thr Cys Asp Cys Pro Asn Cys Gln Glu Ala Glu Arg Leu Gly Pro Ala

  1               5                  10                  15

Gly Val His Ile Arg Lys Lys Asn Ile His Ser Cys His Ile Pro Gly

             20                  25                  30

Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg

         35                  40                  45

Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys

     50                  55

<210>25

<211>53

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>25

Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Ala Ile Lys His Gly Asp Arg Gly

  1               5                  10                  15

Ser Gln His Thr His Leu Cys Ser Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Tyr

             20                  25                  30

LysLys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Lys His Thr Gly Asp

        35                  40                  45

Arg Pro Phe Val Cys

     50

<210>26

<211>56

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的锌指基序

<400>26

Pro Gln Ile Ser Leu Lys Lys Lys Ile Phe Phe Phe Ile Phe Ser Asn

  1               5                  10                  15

Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ser Arg Ile His Ile Cys His Leu Cys Asn

             20                  25                  30

Lys Thr Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Gly His

         35                  40                  45

Ala Gly Asn Lys Pro Phe Ala Cys

     50                  55

<210>27

<211>31

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的多肽

<400>27

Trp Trp Glu Thr Trp Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn

  1               5                  10                  15

Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg

             20                  25                  30

<210>28

<211>16

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的多肽

<400>28

Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

  1               5                  10                  15

<210>29

<211>16

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的多肽

<400>29

Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>30

<211>39

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的多肽

<400>30

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys Lys Arg Arg

             20                  25                  30

Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

         35

<210>31

<211>22

<212>PRT

<213>未知生物体

<220>

<223>未知生物体描述：示例的多肽

<400>31

Gly Glu Gln Ile Ala Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Ile Asp Ile Ile Leu

  1               5                  10                  15

Lys Lys Lys Lys Ser Lys

             20

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组合DNA/RNA分子描述：合成siRNA

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>32

cuacacaaau cagcgauuutt         21

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>组合DNA/RNA分子描述：合成siRNA

<220>

<223>未知生物描述：合成siRNA

<400>33

aaaucgcuga uuuguguagt t        21

<210>34

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>34

gcaagcugac ccugaaguuc au      22

<210>35

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>35

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp

  1               5                  10                  15

Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly

             20                  25

<210>36

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>36

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys

  1               5                  10

<210>37

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>37

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

             20                  25

<210>38

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>38

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys

             20                  25

<210>39

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>39

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Ala Ala Val

  1               5                  10                  15

Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

             20                  25

<210>40

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>40

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln

  1               5                  10

<210>41

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>41

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp

  1               5                  10                  15

Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly

             20                  25

<210>42

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>42

Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Tyr Gly Arg

  1               5                  10                  15

Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly

             20                  25

<210>43

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>43

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

  1               5                  10

<210>44

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>44

Lys Leu Trp Lys Ala Trp Pro Lys Leu Trp Lys Lys Leu Trp Lys Pro

  1               5                  10                  15

<210>45

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>45

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

Arg Arg Arg Arg Arg Arg

             20

<210>46

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>46

Arg Leu Trp Arg Ala Leu Pro Arg Val Leu Arg Arg Leu Leu Arg Pro

  1               5                  10                  15

<210>47

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>47

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val

             20                  25

<210>48

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>48

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val

             20                  25

<210>49

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>49

Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val Ala Ala Val Ala

  1               5                  10                  15

Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

             20                  25

<210>50

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>50

Leu Leu Glu Thr Leu Leu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg

  1               5                  10                  15

Asn Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg

             20                  25                  30

Arg

<210>51

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>51

Ala Ala Val Ala Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Thr Arg Gln

  1               5                  10                  15

Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg Arg

             20                  25

<210>52

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>52

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>53

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>53

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>54

<211>35

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>54

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

  1               5                  10                  15

Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly

             20                  25                  30

Phe Leu Gly

         35

<210>55

<211>37

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>55

Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr

  1               5                  10                  15

Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg

             20                  25                  30

Leu Leu Arg Lys Gly

         35

<210>56

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>56

Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr

  1               5                  10                  15

Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg

             20                  25                  30

Leu Leu Arg Lys Gly Cys

         35

<210>57

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>57

Lys Gly ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys

             20

<210>58

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>58

Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser

  1               5                  10                  15

Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

             20                  25

<210>59

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>59

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

            20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

        35

<210>60

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>60

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

  1               5                  10                  15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

             20                  25

<210>61

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>61

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

  1               5                  10                  15

Leu Ala

<210>62

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>62

Lys G1u Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

  1               5                  10                  15

Lys Lys Arg Lys Val

             20

<210>63

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>63

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Gly

  1               5                  10                  15

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

             20                  25

<210>64

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>64

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

  1               5

<210>65

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>65

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

  1               5                  10

<210>66

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>66

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln

  1               5                  10                  15

Gln Gln Gln Gln

             20

<210>67

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>67

Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>68

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>68

Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala

  1               5                  10                  15

Asn Ile

<210>69

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>69

Gly Gln Met Ser Glu Ile Glu Ala Lys Val Arg Thr Val Lys Leu Ala

  1               5                  10                  15

Arg Ser

<210>70

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>70

Lys Leu Trp Ser Ala Trp Pro Ser Leu Trp Ser Ser Leu Trp Lys Pro

  1               5                  10                  15

<210>71

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>71

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

  1               5

<210>72

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>72

Ala Ala Arg Leu His Arg Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Ser Thr Glu

  1               5                  10                  15

Met Arg Arg Arg Arg

             20

<210>73

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>73

Gly Leu Gly Ser Leu Leu Lys Lys Ala Gly Lys Lys Leu Lys Gln Pro

  1               5                  10                  15

Lys Ser Lys Arg Lys Val

            20

<210>74

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>双甲基酪氨酸

<400>74

Xaa Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

  1               5                  10

<210>75

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>75

Trp Arg Phe Lys

  1

<210>76

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>76

Trp Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

  1               5                  10

<210>77

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>77

Tyr Arg Phe Lys

  1

<210>78

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>78

Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys

  1               5                  10

<210>79

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>79

Trp Arg Phe Lys Lys Ser Lys Arg Lys Val

  1               5                  10

<210>80

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>80

Trp Arg Phe Lys Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala

  1               5                  10                  15

Leu Leu Ala Pro

             20

<210>81

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>双甲基酪氨酸

<400>81

Xaa Arg Phe Lys

  1

<210>82

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>82

Tyr Arg Phe Lys

  1

<210>83

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>双甲基酪氨酸

<400>83

Xaa Arg Phe Lys

  1

<210>84

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>84

Trp Arg Phe Lys

  1

<210>85

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>双甲基酪氨酸

<400>85

Xaa Tyr Arg Trp Lys

  1               5

<210>86

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>双甲基酪氨酸

<400>86

Lys Phe Arg Xaa

  1

<210>87

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>87

Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys

  1               5

<210>88

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>88

Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys

  1               5                  10

<210>89

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>89

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ala Ala Val Ala

  1                       5              10              15

Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

             20                  25

<210>90

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>90

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>91

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>91

Arg Gly Ser Arg Arg Ala Val Thr Arg Ala Gln Arg Arg Asp Gly Arg

  1               5                  10                  15

Arg Arg Arg Arg Ser Arg Arg Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Arg

             20                  25                  30

Val Leu Arg Gln

         35

<210>92

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>92

Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Asp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>93

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>93

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

  1               5                  10                  15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

             20                  25

<210>94

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>94

Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

  1               5                  10                  15

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

             20                  25

<210>95

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>95

Lys Glu Thr Typ Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

  1               5                  10                  15

Lys Lys Arg Lys Val

             20

<210>96

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>96

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly

  1               5                  10                  15

Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val Cys

             20                  25

<210>97

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>97

Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

  1               5                  10                  15

<210>98

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>98

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>99

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>99

Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys

  1               5                  10                  15

Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys

             20                  25                  30

Gln

<210>100

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>100

Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg

  1               5                  10                  15

Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

             20                  25                  30

<210>101

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>101

Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser

  1               5                  10                  15

Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

             20                  25

<210>102

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>102

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp

  1               5                  10                  15

Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly

             20                  25

<210>103

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>103

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>104

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>104

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

  1               5                  10                  15

Lys Lys Arg Lys Val

             20

<210>105

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>105

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Ala Ala Val

  1               5                  10                  15

Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro

             20                  25

<210>106

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>106

Trp Arg Phe Lys Cys

  1               5

<210>107

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>107

Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys

  1               5                  10                  15

Leu Ala

<210>108

<211>27

<212>PRT

<213>人工序列

<223>人工序列描述：合成肽

<400>108

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu

  1               5                  10                  15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu

             20                  25

<210>109

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>109

gcguggagcu gagagauaa    19

<210>110

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>110

gccuguagcc cauguugua    19

<210>111

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>111

gguaugagcc caucuaucu    19

<210>112

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>112

ccagggaccu cucucuaau    19

<210>113

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>113

gcccgacuau cucgacuuu    19

<210>114

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>114

ugacaagccu guagcccau    19

<210>115

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>115

ggucuacuuu gggaucauu    19

<210>116

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>116

cccagggacc ucucucuaa    19

<210>117

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>117

aaucggcccg acuaucucga cuu    23

<210>118

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>118

aauggcgugg agcugagaga u      21

<210>119

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>119

aaccuccucu cugccaucaa g      21

<210>120

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>120

aacugaaagc augauccggg a      21

<210>121

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>121

aaucucgacu uugccgaguc u    21

<210>122

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>122

aagggugacc gacucagcgc u    21

<210>123

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>123

aaucagccgc aucgccgucu c    21

<210>124

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>124

aacccaugug cuccucaccc a    21

<210>125

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>125

aagcuccagu ggcugaaccg c    21

<210>126

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>126

aagucagauc aucuucucga a      21

<210>127

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>127

aagggaccuc ucucuaauca g      21

<210>128

<211>23

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>128

ccucagccuc uucuccuucc uga    23

<210>129

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>129

aauccucagc cucuucuccu u      21

<210>130

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>130

aaccaaugcc cuccuggcca a    21

<210>131

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>131

cugauuaagu ugucuaaaca a    21

<210>132

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>132

ccgacucagc gcugagauca a    21

<210>133

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>133

cuugugauua uuuauuauuu a    21

<210>134

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>134

aagccuguag cccauguugu a    21

<210>135

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>135

uagggucgga acccaagcuu a    21

<210>136

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>136

cugaaagcau gauccggga       19

<210>137

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>137

aggcggugcu uguuccuca       19

<210>138

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>138

ccaccacgcu cuucugccu       19

<210>139

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>139

agggaccucu cucuaauca    19

<210>140

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>140

ugacaagccu guagcccau    19

<210>141

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>141

gccuguagcc cauguugua    19

<210>142

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>142

uagcccaugu uguagcaaa    19

<210>143

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>143

ccaaugcccu ccuggccaa    19

<210>144

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>144

ccaauggcgu ggagcugag    19

<210>145

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>145

ggcguggagc ugagagaua    19

<210>146

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>146

gcguggagcu gagagauaa    19

<210>147

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>147

gccuguaccu caucuacuc    19

<210>148

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>148

ccuccucucu gccaucaag    19

<210>149

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>149

gguaugagcc caucuaucu    19

<210>150

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>150

gcuggagaag ggugaccga    19

<210>151

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>151

gagaagggug accgacuca    19

<210>152

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>152

gcccgacuau cucgacuuu    19

<210>153

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>153

gcaggucuac uuugggauc    19

<210>154

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>154

ggucuacuuu gggaucauu    19

<210>155

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>155

ugggaucauu gcccuguga    19

<210>156

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>156

ggucggaacc caagcuuag    19

<210>157

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>157

ccagaaugcu gcaggacuu    19

<210>158

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>158

gagaagaccu caccuagaa    19

<210>159

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>159

gaagaccuca ccuagaaau    19

<210>160

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>160

ccagauguuu ccagacuuc    19

<210>161

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>161

cuauuuaugu uugcacuug    19

<210>162

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>162

ucuaaacaau gcugauuug    19

<210>163

<211>18

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>163

gaccaacugu cacucauu    18

<210>164

<211>125

<212>PRT

<213>人

<400>164

Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys

  1               5                  10                  15

Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Ser Lys Lys Arg Lys Arg

             20                  25                  30

Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Val

         35                  40                  45

His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn Ser

     50                  55                  60

Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg Leu

 65                  70                  75                  80

Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln Thr

                 85                  90                  95

Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val Ser

            100                 105                 110

Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys

        115                 120                 125

<210>165

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>165

Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val

  1               5                  10                  15

Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

             20

<210>166

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>166

Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr

  1               5                  10                  15

Lys Val Leu Lys Gln

             20

<210>167

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>167

Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu

  1               5                  10                  15

Lys Gln

<210>168

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>168

Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

  1               5                  10                  15

<210>169

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>169

Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

  1               5                  10

<210>170

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>170

Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln

  1               5

<210>171

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>171

Tyr Lys Val Leu Lys Gln

  1               5

<210>172

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>172

Lys Val Leu Lys Gln

  1               5

<210>173

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>173

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Trp Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>174

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>174

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Trp Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>175

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>175

Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>176

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>176

Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Phe Lys Phe Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys

             20                  25                  30

Val Leu Lys Gln

         35

<210>177

<211>35

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>177

Lys Gly Ser Phe Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Phe Gly Lys

  1               5                  10                  15

Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Ser Phe Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val

             20                  25                  30

Leu Lys Gln

         35

<210>178

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>178

Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys

  1               5                  10                  15

Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr

             20                  25

<210>179

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>179

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys

  1               5                  10                  15

Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Asp Gln

             20                  25                  30

Glu

<210>180

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>180

Gly Thr Ala Met Arg Ile Leu Gly Gly Val Ile Pro Arg Lys Lys Arg

  1               5                  10                  15

Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln

             20

<210>181

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>181

Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser

  1               5                  10                  15

Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys

             20                  25

<210>182

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>182

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

  1               5                  10                  15

<210>183

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>183

Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg

  1               5                  10                  15

<210>184

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>184

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Val Ala Tyr Ile Ser

  1               5                  10                  15

Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe

             20                  25                  30

Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala

         35                  40

<210>185

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>185

Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala

  1               5                  10                  15

Asn Ile Pro Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro

             20                  25                  30

<210>186

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>186

Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys

  1               5                  10                  15

Lys Lys Arg Lys Val

             20

<210>187

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成siRNA

<400>187

uagcccaugu uguagcaaa    19

<210>188

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成的通式肽

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)..(5)

<223>此区域可包含2个或4个可变残基

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)..(18)

<223>可变残基

<220>

<221>MOD_RES

<222>(20)..(22)

<223>可变残基

<400>188

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

  1               5                  10                  15

Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa His

            20

Claims (37)

1. 包含多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的组合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是两性的并含有核酸结合特性。

2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽包含约5个到约40个的氨基酸，并包含选自聚(Lys，Tryp)4∶1MW20,000-50,000、聚(Orn，Trp)4∶1MW 20,000-50,000、蜂毒肽、组蛋白H1、组蛋白H3和组蛋白H4、SEQ ID NOS：27-31、35-42、45、47、50-59、62、63、67、68、73、74、76、78-87、89-92、94-108、164-178和180-186的序列的全部或部分。

3. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物导致所述dsRNA摄入动物细胞。

4. 如权利要求3所述的组合物，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。

5. 如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是对动物给药的。

6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述动物是哺乳动物。

7. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是乙酰化的。

8. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是聚乙二醇化的。

9. 如权利要求1所述的组合物，其中所述dsRNA是小干扰核糖核酸(siRNA)，该小干扰核糖核酸(siRNA)由与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的部分互补的约10个到约40个碱基对序列组成。

10. 如权利要求1所述的组合物，其中所述dsRNA是siRNA，该siRNA由选自SEQ ID NOS：109-163和187的约10个到约40个碱基对序列组成。

11. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽与所述dsRNA是混合的、复合的或偶联的。

12. 如权利要求1所述的组合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽结合于所述dsRNA。

13. 权利要求1所述的组合物，进一步包含阳离子脂质。

14. 如权利要求13所述的组合物，其中所述阳离子脂质选自N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷、1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵、1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺、5-羧基精胺氨基乙酸双十八烷基酰胺、四甲基四棕榈酰精胺、四甲基四油酰精胺、四甲基四月桂基精胺、四甲基四肉豆蔻基精胺和四甲基二油酰精胺、DOTMA(N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙基溴化铵)、DDAB(双十八烷基二甲基溴化铵)、多价阳离子脂质体、脂精胺、DOSPA(2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵)、DOSPER(1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺，二-和四-烷基-四-甲基精胺)、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油酰精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)、TMDOS(四甲基二油酰精胺)DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(

)、与非阳离子脂结合的阳离子脂质、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇、由DOSPA与DOPE的3∶1(w/w)混合物和DOTMA与DOPE的1∶1(w/w)混合物组成的阳离子脂质组合物。

15. 导致双链核糖核酸(dsRNA)摄入动物细胞的方法，其包括用含有多聚核苷酸递送增强多肽和所述dsRNA的混合物孵育所述动物细胞，其中多聚核苷酸递送增强多肽是两性的并包含核酸结合特性。

16. 修饰动物细胞内靶基因表达的方法，其包括用含有多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的混合物孵育所述动物细胞，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是两性的并包含核酸结合特性，其中所述dsRNA与靶基因区域互补。

17. 如权利要求15或16所述的方法，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。

18. 改变动物受试者表型的方法，其包括给予所述动物受试者多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的混合物，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是两性的并包含核酸结合特性，其中所述dsRNA与受试者靶基因区域互补。

19. 如权利要求18所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。

20. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽包含约5个到约40个的氨基酸，并包含选自聚(Lys，Tryp)4∶1MW 20,000-50,000、聚(Orn，Trp)4∶120,000-50,000、蜂毒肽、组蛋白H1、组蛋白H3和组蛋白H4、SEQ ID NOS 27-31、35-42、45、47、50-59、62、63、67、68、73、74、76、78-87、89-92、94-108、164-178和180-186的序列的全部或部分。

21. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是乙酰化的。

22. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是聚乙二醇化的。

23. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述dsRNA是由与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的部分互补的约10个到约40个碱基对序列组成的小干扰核糖核酸(siRNA)。

24. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述dsRNA是由选自SEQ ID NOS 109-163和187的约10个到约40个碱基对序列组成的siRNA。

25. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是与所述dsRNA混合的、复合的或偶联的。

26. 如权利要求15、16或18所述的方法，其中所述增强多聚核苷酸递送多肽结合于所述dsRNA。

27. 如权利要求15，16或18所述的方法，进一步包含阳离子脂质。

28. 如权利要求27所述的方法，其中所述阳离子脂质选自N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷、1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵、1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺、5-羧基精胺氨基乙酸双十八烷基酰胺、四甲基四棕榈酰精胺、四甲基四油酰精胺、四甲基四月桂基精胺、四甲基四肉豆蔻基精胺和四甲基二油酰精胺、DOTMA(N-〔1-(2，3-二油酰氧)丙基〕-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1，2-双(油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1，2-双十四烷基氧丙基-3-双甲基羟乙基溴化铵)、DDAB (双十八烷基二甲基溴化铵)、多价阳离子脂质体、脂精胺、DOSPA(2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵)、DOSPER(1，3-二油酰氧-2-(6-羧基精胺)-丙酰胺，二-和四-烷基-四-甲基精胺)、TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油酰精胺)、TMTLS(四甲基四月桂基精胺)、TMTMS(四甲基四肉豆蔻基精胺)、TMDOS(四甲基二油酰精胺)DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(

)、与非阳离子脂结合的阳离子脂质、DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇、由DOSPA与DOPE的3∶1(w/w)混合物和DOTMA与DOPE的1∶1(w/w)混合物组成的阳离子脂质组合物。

29. 包含多聚核苷酸递送增强多肽和双链核糖核酸(dsRNA)的混合物在制备治疗动物受试者的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相关炎症状态的药剂中的用途，其中所述的多聚核苷酸递送增强多肽是两性的并包含核酸结合特性，其中所述的药剂能够降低TNF-αRNA水平，从而预防或降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相关炎症状态的一个或多个症状的发生或严重性。

30. 如权利要求29所述的混合物的用途，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽包含约5个到约40个的氨基酸，并具有选自聚(Lys，Tryp)4∶1MW 20,000-50,000、聚(Orn，Trp)4∶120,000-50,000、蜂毒肽、组蛋白H1、组蛋白H3和组蛋白H4、SEQ ID NOS 27-31、35-42、45、47、50-59、62、63、67、68、73、74、76、78-87、89-92、94-108、164-178和180-186的序列的全部或部分。

31. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是乙酰基的。

32. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽的N-末端是聚乙二醇化的。

33. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述dsRNA是由与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因的部分互补的约10到约40个碱基对序列组成的小干扰核糖核酸(siRNA)。

34. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述dsRNA是由选自SEQ ID NOS 109-163和187的约10到约40个碱基对序列组成的siRNA。

35. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽是与所述dsRNA混合的，组合的或偶联的。

36. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述多聚核苷酸递送增强多肽结合于所述的dsRNA。

37. 如权利要求29所述混合物的用途，其中所述动物受试者是哺乳动物。

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