CN101208438A - 使用双链核糖核酸治疗炎性疾病的方法 - Google Patents

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CN101208438A CNA2005800326842A CN200580032684A CN101208438A CN 101208438 A CN101208438 A CN 101208438A CN A2005800326842 A CNA2005800326842 A CN A2005800326842A CN 200580032684 A CN200580032684 A CN 200580032684A CN 101208438 A CN101208438 A CN 101208438A
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崔坤元
陈力山
陈郁静
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Abstract

本发明公开了一种含有双链核糖核酸(dsRNA)的制剂在制备一种药剂中的用途，所述药剂用于治疗哺乳动物炎性疾病和抑制哺乳动物肿瘤坏死因子－α(TNF－α)的产生。

Description

使用双链核糖核酸治疗炎性疾病的方法
本发明涉及将核糖核酸递送至细胞的方法和组合物。更具体地，本发明涉及将双链多核苷酸递送至细胞中以改变靶基因的表达，从而改变细胞的表型，如疾病状态或潜能。
肿瘤坏死因子(TNF-α)的主要作用已经鉴定为参予或有关于与导致多种疾病的炎症过程的起始和/或持续。这些疾病包括类风湿性关节炎(RA)、克隆氏病(CD)、银屑病、强直性脊柱炎、斯提耳氏病(Still′sdisease)、多发性肌炎和皮肌炎，以及血管炎(包括贝切特氏病(Behcet′sdisease)和韦格纳氏肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis))(Lorenz和Kalden(2002)Arthritis Research 4(suppl 3)：S17-24)。脂肪组织的TNF-α产生还与糖尿病和肥胖症有关(Ruan和Lodish(2003)Cytokine Growth Factor Rev.14：447-55)。
已建立的治疗方法(包括甲氨喋呤)的限制已经导致将某些炎症介质作为替代治疗的治疗靶。在此联系中，已经开发了目前正进行试验的新型治疗剂，包括单克隆抗体、细胞因子受体-人免疫球蛋白(Ig)构建体，及重组人蛋白。对于用于治疗此类疾病的有效治疗方式仍有未满足的需要。
已知各种刺激可诱导产生TNF-α，包括内毒素、肿瘤细胞、一些病毒(包括HIV)、其他细胞因子，以及各种应激相关反应。已开发了用于非诊断研究的动物模型，这得到了美国食品与药品管理局(FDA)接受作为提供用于治疗克隆氏疾病患者的Remicade
Figure A20058003268400111
标记载体。鼠模型(Tg197、Tg211及Tg5453小鼠)来自组成性表达人TNF-α的转基因鼠的开发(Georgopoulos等，(1996)J.Inflammation 46：86-97)。几种其他抗TNF-α抗体治疗方法成功应用此动物模型以评价效能并证明其功效(HUMIRATM、英夫利昔单抗(Infliximab)、Adalimunab、依那西普(Etanercept)、AbgenixABX10131)。
将核苷酸递送至动物和植物细胞长期以来已是分子生物学研究和开发的重要目标。基因治疗、反义治疗和RNA干扰(RNAi)治疗已创造了将核苷酸引入细胞的更有效方法的开发需要。
已开发了质粒和其他核苷酸“载体”的不同阵列用于将大的多核苷酸分子递送至细胞。通常这些载体掺入大的DNA分子，该DNA分子含有用于将靶细胞转化成表达科学或治疗目的的基因的完整基因。
将外源性核苷酸人工递送至细胞内的方法通常被称为转染。使用多种技术和材料可将细胞转染成摄取来自外源性来源的功能性核苷酸。最常用的转染方法是磷酸钙转染和电穿孔。已经开发了多种用于将细胞转导成携带外源性DNA或RNA分子的方法，包括病毒介导的转导、阳离子脂质或脂质体递送，以及多种靶机械或生物化学膜破坏/渗透方法(如使用去污剂、显微注射或基因枪)。
RNA干扰是一种由双链(ds)多核苷酸启动的序列特异性转录后基因沉默，所述双链多核苷酸通常为与靶信使RNA(mRNA)的一部分具有序列同源性的双链核糖核酸(dsRNA)。合适的dsRNA引入细胞导致内源性同源mRNA(即与所引入的dsRNA具有显著的序列同源性)破坏。通过核糖核酸酶III(RNase III)家族被称为裂解酶的核酸酶将dsRNA分子裂解成短干扰RNA(siRNA)，其长度为19-23个核苷酸(nt)。然后，siRNA被掺入被称为RNA诱导的沉默络合物(RNA-induced silencing complex或RISC)的多成分核酸酶复合体。RISC通过其与siRNA的同源性而识别mRNA底物，并通过结合并破坏靶mRNA而实现基因表达沉默。
RNA干扰是用于改变植物和动物细胞特定基因表达的一种有前景的技术，并因此预期其可提供治疗易于通过改变内源性基因的表达而治疗的大范围疾病和病症的有用工具。
本领域中仍长期需要对于将siRNA和其他小抑制性核苷酸(siRNA)递送至细胞内的更好的工具和方法，尤其是考虑到这样一个事实：即用于将核苷酸递送至细胞内的现有技术受递送试剂的不良功效和/或高毒性限制。存在改进的方法和制剂的相关需要，用于以有效量、活性和持久状态及使用非毒性递送载体将siRNA递送至所选的细胞、组织或间隔以介导基因表达的调控，而不改变靶细胞的表型或疾病状态。
发明概述
本发明的一方面是含有双链核糖核酸(dsRNA)的制剂在一种药剂的制备中的用途，所述药剂用于治疗哺乳动物炎性疾病和抑制哺乳动物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生。优选地，所述炎性疾病为全身性疾病。更优选地，所述炎性疾病为类风湿性关节炎。在本发明的一个实施方案中，优选通过静脉内将所述制剂给药于哺乳动物的循环。在另一个实施方案中，将siRNA递送至血白细胞中，优选单核细胞。在另一个实施方案中，所述制剂的给药降低了哺乳动物循环中TNF-α的水平。在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。
本发明的另一方面是一种用于治疗哺乳动物炎性疾病的药物制剂，其含有双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA能够改变肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在哺乳动物细胞中的表达。在优选的实施方案中，含有氨基酸序列的所述肽选自：
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以及YKVLKQ(SEQ ID NO：174)。
在相关的优选实施方案中，所述dsRNA含有选自下述的核糖核酸序列：
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GACCAACUGUCACUCAUU(SEQ ID NO：163)。
最优选地，所述dsRNA含有选自下述的核糖核酸序列：
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AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID  NO：134)；及
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：135)。
附图简要说明
图1描述了被络合或缀合至本发明的增强多核苷酸递送的多肽(SEQID NO：35)的siRNA对肽介导的摄取和细胞活力的影响。细胞摄取和细胞活力以百分数表示。
图2进一步描述了被络合或缀合至本发明的增强多核苷酸递送的多肽(SEQ ID NO：35)的siRNA的肽介导的摄取。细胞摄取以百分数表示。
图3显示了使用几种不同的增强多核苷酸递送的多肽，siRNA在人单核细胞中的肽介导的摄取。
图4显示了注射siRNA/肽后的鼠与Ramicade处理的受治对象相比具有延迟的类风湿性关节炎进展。通过爪评分指数测定类风湿性关节炎进展。
图5提供了鼠尾成纤维细胞对于本发明合理设计的PN73衍生的增强多核苷酸递送的多肽的摄取功效及活力研究。
图6显示了在体内缀合至增强多核苷酸递送的多肽的siNA比与增强多核苷酸递送的多肽络合的siRNA具有更强的降低基因表达的活性。
具体实施方式
本发明通过提供应用短干扰核酸(siNA)或其前体并结合增强多核苷酸递送的多肽的组合物和方法满足了上述需要，并实现了另外的目标和优点。增强多核苷酸递送的多肽是因其增强细胞内多核苷酸包括siNA和它们的前体的递送或摄取的能力而选择的天然或人工多肽。
在本发明的新型组合物中，siNA可与增强多核苷酸递送的多肽掺和或络合或缀合，以形成与使用裸siNA(即无增强递送的多肽存在的siNA)接触靶细胞而产生的递送相比增强siNA的细胞内递送的组合物。
增强剂肽
本发明使用的“细胞”以其通常的生物学意义而使用，并且不是指完整的多细胞生物，如特别不是指人。所述细胞可存在于生物体中，如鸟、植物和哺乳动物如人、母牛、绵羊、猿、猴子、猪、狗及猫。所述细胞可为原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如哺乳动物细胞或植物细胞)。所述细胞为体细胞系来源或种系来源，全能或多能、分裂或未分裂。所述细胞还可衍生自或包括配子细胞或胚胎细胞、干细胞或全分化细胞。
“载体”是指用于递送所需核苷酸的基于任何核苷酸和/或病毒的技术。
“含有”是指“包括，但不限于”，不管在词“含有”之后是什么。因此，术语“含有”表明所列的元素是所需的或必须具备的，但其他元素为任选并可存在或不存在。“包含”是指“包括，但不限于”，不管在词“包含”之后是什么。因此术语“包含”表明所列的元素是所需的或必须具备的，但其他元素为任选并可存在或不存在。“基本包含”是指包括在此术语之后所列出的任何元素，并且限制于不干扰或促进公开的所列元素的活性或特定作用的其他元素。因此，术语“基本包含”表明所列的元素是所需的或必须具备的，但其他元素为任选并根据它们是否影响所列的元素的活性或作用可存在或不存在。
本发明使用的术语“可生物降解的”是指在生物系统中的降解，例如酶降解或化学降解。
本发明使用的术语“生物活性分子”是指可以引发或改变系统的生物反应的化合物或分子。本发明涉及的生物活性siNA分子单独或与其他分子组合使用的非限制性例子包括治疗活性分子，例如抗体、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化学治疗、小分子、维生素、辅助因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶核苷酸、反义核酸、形成三联体的寡核苷酸、2，5-A嵌合体、siNA、dsRNA、等位基因酶、适体、“诱饵”(decoy)及其类似物。本发明的生物活性分子还包括能够调节其他生物活性分子的药动学和/或药效学的分子，例如脂质和聚合物，如多胺、聚酰胺、聚乙二醇及其他聚醚。
本发明使用的术语“磷脂”是指含有至少一个磷基团的疏水分子。例如，磷脂可含有包含磷的基团及饱和或非饱和烷基基团，可被OH、COOH、氧、胺或取代或非取代的芳基任选取代。
术语“配体”是指能与另一种化合物如受体直接或间接相互作用的任何化合物或分子，例如药物、肽、激素或神经递质。与配体相互作用的受体可存在于细胞表面或可为细胞内受体。配体与受体的相互作用可产生生物化学反应，或可仅为物理相互作用或联系。
术语“非核苷酸”是指可取代一个或多个核苷酸元件包括糖和/或磷酸酯取代而掺入核酸链中并允许其余的碱基表现其酶活性的任何基团或化合物。所述基团或化合物因为不含有通常可被识别的核苷酸碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶而为脱碱基，并因此在1′位置缺少碱基。
本发明使用的“核苷酸”如本领域公知的包括天然碱基(标准的)，及本领域熟知的修饰的碱基。这些碱基通常位于核苷酸糖部分的1′位置。核苷酸通常含有碱基、糖及磷酸酯基团。核苷酸在糖位置、磷酸酯和/或碱基部分可为非修饰的或修饰的，(也可互换地指核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然的核苷酸、非标准的核苷酸及其他，参见，例如，Usman和McSwiggen，如上；Eckstein等，国际PCT公开No.WO 92/07065；Usman等，国际PCT公开No.WO 93/15187；Uhlman & Peyman，如上，均通过引用并入本文)。本领域已知的修饰的核苷酸碱基的几个例子由Limbach等，1994，Nucleic Acids Res.22，2183概述。可引入核酸分子的碱基修饰的一些非限制性例子包括，次黄嘌呤核苷、嘌呤、4-吡啶酮、2-吡啶酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶核苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(如5-甲基胞苷)、5-烷基尿核苷(如核糖胸腺嘧啶核苷)、5-卤尿核苷(如5-溴尿核苷)或6-吖嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔、及其他(Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman & Peyman，如上)。在此方面的“修饰的碱基”是指在1′位置与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶或胸腺嘧啶或其等同物不同的核苷酸碱基。
“靶位点”是指靶RNA中被“靶向”用于siNA构建体介导的裂解的序列，其中所述siNA构建体在其反义区含有与靶序列互补的序列。
“可检测水平的裂解”是指以足够辨别在由靶RNA的随机降解产生的RNA背景上的裂解产物的程度对靶RNA的裂解(及裂解的RNA产物的形成)。背景上的靶RNA的1-5％裂解产物的产生对于大多数检测方法足够用于检测。
“生物系统”是指生物来源的纯或非纯形式的材料，包括，但不限于人、动物、植物、昆虫、细菌、病毒，或其他来源，其中所述系统包含RNAi活性所需的组分。术语“生物系统”包括，例如，细胞、组织或生物体或其提取物。术语“生物系统”还包括可用于体外环境的重组RNAi系统。
本发明使用的术语“可生物降解的接头”是指被设计成可生物降解的接头以连接一个分子和另一个分子的核酸或非核酸接头分子，例如连接生物活性分子与本发明的siNA分子或与本发明siNA分子的有义链和反义链。可生物降解接头被设计以致其稳定性可为特定目的而调节，例如递送至特定组织或细胞类型。基于核酸的可生物降解接头分子的稳定性可通过使用各种化学方法而调节，例如核糖核酸、脱氧核糖核酸、及化学修饰的核苷酸例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基、及其他2′-修饰的或碱基修饰的核苷酸。可生物降解核酸接头分子可为二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸分子，例如长约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可含有具有磷基的键，例如磷酰胺或磷酸二酯键。可生物降解核酸接头分子还可含有核酸骨架、核酸糖，或核酸碱基修饰。
在本发明的某些实施方案中，增强多核苷酸递送的多肽是组蛋白，或多肽或肽片段，其衍生物、类似物或缀合物。在这些实施方案中，siNA与至少部分与组蛋白的部分序列对应的一种或多种全长的组蛋白掺和、络合或缀合，例如下述组蛋白中的一种或多种：组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3或组蛋白H4，或含有组蛋白至少部分序列(通常天然组蛋白的至少5-10或10-20个残基)的一种或多种肽片段或其衍生物。在更详细的实施方案中，siRNA/组蛋白混合物、络合物或缀合物基本无两亲化合物。在其他详细的实施方案中，与组蛋白或多肽掺和、络合或缀合的siNA含有双链RNA，例如具有30个或更少核苷酸的双链RNA，并且是短的干扰RNA(siRNA)。在典型实施方案中，增强组蛋白多核苷酸递送的多肽含有组蛋白H2B片段，例如下述的命名为PN73的增强多核苷酸递送的多肽。在又一些详细的实施方案中，增强多核苷酸递送的多肽可被聚乙二醇化以改进稳定性和/或功效，特别是在关于体内给药的上下文中。
在本发明的另外的实施方案中，选择或合理设计增强多核苷酸递送的多肽成含有两亲氨基酸序列。例如，可选择有用的增强多核苷酸递送的多肽，其包括形成疏水序列区或基序的多个非极性或疏水氨基酸残基与形成带电的序列区或基序的多个带电荷的氨基酸残基连接，形成两亲肽。
在本发明的其他实施方案中，选择含有蛋白质转导区或基序及融合肽区或基序的增强多核苷酸递送的多肽。蛋白质转导区是能够插入细胞膜并优选通过细胞膜运输的肽序列。融合肽是使脂质膜如质膜或包围内含体的膜不稳定的肽，其可在低pH被增强。典型的融合肽区或基序可见于大量的不同病毒融合蛋白及其他蛋白质，例如成纤维细胞生长因子4(FGF4)。
为合理设计本发明的增强多核苷酸递送的多肽，蛋白转导区被用作促进核酸通过质膜进入细胞的基序。在某些实施方案中，被运输的核酸被包裹在内含体中。内含体的内部具有低pH，导致融合肽基序使内含体的膜不稳定。内含体膜的不稳定和破坏使得siNA释放至细胞质，其中所述siNA可与RISC复合体结合并针对其靶mRNA。
本发明的典型的增强多核苷酸递送的多肽可选自下述肽：WWETWKPFQCMCMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQ ID NO：27)；GKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：28)，RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQID NO：29)，GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：30)，GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO：31)，聚赖氨酸-酪氨酸，4∶1，分子量20,000-50,000；及聚鸟氨酸-酪氨酸，4∶1，分子量20,000-50,000。用于本发明组合物和方法中的另外的增强多核苷酸递送的多肽含有二甲双胍蛋白序列的全长或部分。
其他典型的增强多核苷酸递送的多肽在下文实施例中鉴定。可选择或组合这些肽中的任一种或组合产生有效的增强多核苷酸递送的多肽制剂，以诱导或促进本发明方法和组合物中的siNA的细胞内递送。
在本发明的更详细方面，含有siRNA和增强多核苷酸递送的多肽的混合物、络合物或缀合物可任选与阳离子脂质如脂染素(LIPOFECTIN
Figure A20058003268400211
)组合(如掺和或络合)。在上下文中，令人意想不到地公开了单独络合或缀合至siRNA的增强多核苷酸递送的多肽通过RNAi实现了足够介导基因沉默的siRNA的递送。然而，本发明还意想不到地公开了siRNA/增强多核苷酸递送的多肽络合物或缀合物当与阳离子脂质如脂染素掺和或络合时会表现有更大的介导siRNA递送合基因沉默的活性。为产生这些含有增强多核苷酸递送的多肽、siRNA和阳离子脂质的组合物，可首先将siRNA和肽一起混合在合适的基质如细胞培养基中，之后将阳离子脂质添加至混合物中形成siRNA/递送肽/阳离子脂质组合物。任选地，可首先将肽和一起混合在合适的基质如细胞培养基中，之后添加siRNA形成siRNA/递送肽/阳离子脂质组合物。
本发明这些方面中的有用阳离子脂质的例子包括N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵、1，2-二油酰氧)-3-3-(三甲基铵)丙烷、1，2-二十四烷基氧丙基-3-二甲基羟基乙基溴化铵、及二甲基二十八烷基溴化铵、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷胺三氟乙酸盐、1，3-二油酰氧-2-(6-羧精胺)-丙酰胺、5-羧精胺甘氨酸二十八烷基酰胺、四甲基四十六酰精胺、四甲基四油酰精胺、四甲基四十二烷基精胺、四甲基四十四烷基精胺及四甲基二油酰精胺。DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1，2-二油酰氧-3，3-(三甲基铵)丙烷)、DMRIE(1，2-二十四烷基氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵)或DDAB(二甲基双十八烷基溴化铵)。多价阳离子脂质包括脂质精胺，特别是DOSPA(2，3-二油酰氧-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-三氟-醋酸丙烷铵)以及DOSPER(1，3-二油酰氧-2-(6羧精胺)-丙基-酰胺，及二烷基四甲基精胺和四烷基四甲基精胺，包括，但不限于TMTPS(四甲基四棕榈酰精胺)、TMTOS(四甲基四油酰基精胺)、TMTLS(四甲基四十二烷基精胺)、TMTMS(四甲基四十四烷基精胺)及TMDOS(四甲基二油酰基精胺)DOGS(二十八烷基-酰胺甘氨酰精胺(TRANSFECTAM
Figure A20058003268400221
)。其他有用的阳离子脂质描述于，例如美国专利No.6,733,777、美国专利No.6,376,248、美国专利No.5,736,392、美国专利No.5,686,958、美国专利No.5,334,761及美国专利No.5,459,127。
阳离子脂质可任选与非阳离子脂质组合，尤其是中性脂质，例如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)、DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或胆固醇。由DOSPA和DOPE的3∶1(w/w)混合物或DOTMA和DOPE的1∶1(w/w)混合物(LIPOFECTIN
Figure A20058003268400222
，Invitrogen)组成的阳离子脂质通常用于转染本发明的组合物。优选的转染组合物为诱导高级真核细胞系显著转染的那些。
双链siRNA分子
本发明使用的“不对称发夹结构”是指含有反义区的线性siNA分子、可含有核苷酸或非核苷酸的环部分，以及含有较反义区更少的核苷酸的有义区，少至有义区具有足够的与其碱基的互补核苷酸并形成具有环的双链形式。例如，本发明的不对称发夹结构siNA分子可含有长度足够介导T细胞RNAi的反义区(如约19至约22个(如约19、20、21或22个)核苷酸)，及含有约4至约8个(如约4、5、6、7或8个))核苷酸的环区，以及具有与反义区互补的约3至18个(如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)核苷酸的有义区。不对称发夹结构siNA分子还可含有可被化学修饰的5′-端磷酸酯基团。不对称发夹结构siNA分子的环区可含有核苷酸、非核苷酸、接头分子或本发明所述的缀合分子。
本发明使用的“不对称双链”是指具有两条分开的各自含有有义区和反义区的双链的siRNA分子，其中有义区含有少于反义区的核苷酸，少至有义区具有足够与反义区碱基对互补的核苷酸并形成双链。例如，本发明的不对称双链siNA分子可含有长度足够介导T细胞RNAi的反义区(如约19至约22个(如约19、20、21或22个)核苷酸)，以及具有与反义区互补的约3至约18个(如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)核苷酸的有义区。
“调节基因表达”是指靶基因的表达被上调和下调，其包括存在于细胞内mRNA水平、和mRNA翻译或靶基因编码的蛋白质或蛋白质亚基的合成的上调和下调。基因表达的调节还可通过被上调或下调的靶基因编码的一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的存在、量或活性来确定，这样主题蛋白质或亚基的表达水平或活性大于或小于无调节剂(如siRNA)观察到的。例如，术语“调节”是指“抑制”，但单词“调节”不限于该定义。
“抑制”、“下调”或“降低表达”是指基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同的RNA分子水平或由靶基因编码的一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的水平或活性减少至低于本发明核酸分子(如siNA)不存在的情况。在一个实施方案中，siNA分子的抑制、下调或减少至低于无活性或衰减分子存在时观察到的水平。在另一个实施方案中，siNA分子的抑制、下调或减少至低于如具有“零乱”序列或错配的siNA分子存在时观察到的水平。在另一个实施方案中，本发明核酸分子基因表达的抑制、下调或减少在所述核酸分子存在时较其不存在时要大。
基因“沉默”是指通过细胞内基因表达的靶向抑制功能部分或完全丧失，并还可被称为“使表达降低”。根据提出的情况和生物学问题，优选部分降低基因表达。可选地，尽可能多地降低基因表达是合乎需要的。基因沉默的程度可通过本领域已知的方法确定，其中某些方法在国际公布No.WO 99/32619中有概述。根据本文，基因表达的定量允许本发明某些实施方案中所需的各种量的抑制的检测，包括预防和治疗方法，其能够使靶基因表达降低，根据mRNA水平和蛋白质水平或活性，例如等于或大于基线(即正常情况)或其他对照水平的10％、30％、50％、75％、90％、95％或99％，包括与靶向治疗的特定疾病状态或其他病症相关联的升高的表达水平。
术语“抑制靶基因的表达”是指本发明的siNA引发靶基因的基因沉默的能力。为检测基因沉默的程度，对表达特定构建体的目的生物体或培养物中细胞的样品或测定与缺少构建体表达的对照样品进行比较。对照样品(缺少构建体表达)被指定一个100％的相对值。当相对于对照的检测值为约90％，常为50％，且在某些实施方案为25-0％时，可获得靶基因表达的抑制。合适的测定包括如使用本领域技术人员已知的技术检测蛋白质或mRNA水平，如斑点印迹、Northern点杂交、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能测定及本领域技术人员已知的表型测定方法。
“受治对象”是指生物、组织或细胞，其可包括作为受治对象或作为移植细胞的供体或受体或自身为siNA递送受治对象的细胞的生物体。因此，“受治对象”是指生物体、器官、组织或细胞，包括本发明的核酸分子可给药于和通过本发明所述的增强多核苷酸递送的多肽增强的体外或离体器官、组织或细胞受治对象。典型的受治对象包括哺乳动物个体或细胞，例如人类患者或细胞。
“RNA”是指含有至少一个核糖核苷酸残基的分子。
“核糖核苷酸”是指在β-D-核呋喃糖部分的2′位置具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA，单链RNA，分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA、重组RNA，及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变了的RNA。这些改变可包括非核苷酸物质例如添加至siNA的末端或中心，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可含有非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
“高保守序列区”是指靶基因中的一个或多个区的核苷酸序列在代次之间或生物系统之间明显不同。
“有义区”是指与siNA分子的反义区具有互补性的siNA分子。另外，siNA分子的有义区可含有与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
“反义区”是指与靶核酸序列具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。另外，siNA分子的反义区可任选含有与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。
“靶核酸分子”是指其表达或活性待调节的任何核酸序列。所述靶核酸可为DNA或RNA。
“互补性”是指一核酸可通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型与另一核酸序列形成氢键。参考本发明的核酸分子，一核酸分子与其互补序列的结合自由能足够使得核酸的相关功能继续进行，如RNAi活性。核酸分子的结合自由能的确定为本领域熟知(参见，例如，Turner等，1987，CSHSymp.Quant.Biol.LII pp.123-133；Frier等，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9373-9377；Turner等，1987，J.Am.Chem.Soc.109：3783-3785)。互补百分数是指核酸分子中可与另一核酸序列形成氢键(如Watson-Crick碱基对)的邻接残基的百分数(如，一寡核苷酸中的总体10个核苷酸中有5、6、7、8、9或10个核苷酸与具有10个核苷酸的另一核酸序列进行碱基配对，分别表示具有50％、60％、70％、80％、90％及100％的互补性)。“完全的互补性”是指核酸序列中的所有邻接残基与另一核酸序列中的相同数量的邻接残基成氢键。
本发明使用的术语“通用碱基”是指与各天然的DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，它们之间差异很小。通用碱基的非限制性例子包括本领域已知的C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物，次黄嘌呤核苷、吡咯氨甲酰，及硝基吡咯衍生物如3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚及6-硝基吲哚(参见，例如，Loakes，2001，Nucleic Acids Research，29，2437-2447)。
本发明使用的术语“无环核苷酸”是指具有无环核酸糖的任何核苷酸，例如其中核苷酸独立或组合性缺少任何核糖碳(C1、C2、C3、C4或C5)。
“脱碱基”是指在1′位置缺少碱基或具有其他化学基团取代1′位置碱基的糖部分，参见，例如，Adamic等，美国专利No.5,998,203。
“未修饰的核苷”是指碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之一连接至β-D-核呋喃糖的1′碳。
“修饰的核苷”是指在未修饰的核苷酸碱基、糖和/或磷酸酯的化学结构中包含修饰的任何核苷酸碱基。修饰的核苷的非限制性例子由式I-VII和/或本发明所述的其他修饰表示。
“帽结构”是指在寡核苷酸任一末端掺入的化学修饰(参见，例如Adamic等，美国专利No.5,998,203，通过引用并入本发明)。这些末端修饰保护核酸分子免受核酸外切酶降解，并且可有助于细胞内的递送和/或定位。所述帽结构可存在于5′-末端(5′-帽)或3′-末端(3′-帽)，或可同时存在于两个末端。  在非限制性实施例中，5′-帽包括，但不限于甘油基、反向的脱氧脱碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4′-硫核苷酸；碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基的核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-戊呋喃糖基核苷酸；非环状3′，4′-开环核苷酸；非环状3，4-二羟丁基核苷酸；非环状3，5-二羟戊基核苷酸；3′-3′-反向的核苷酸部分；3′-3′-反向的脱碱基部分；3′-2′-反向的核苷酸部分；3′-2′-反向的脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-磷酰胺；己磷酸酯；氨及己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-磷硫酰；二硫代磷酸酯或桥连或非桥连的甲基膦酸酯部分。
3′-帽的非限制性例子包括，但不限于甘油基、反向的脱氧脱碱基残基(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基的核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏-戊呋喃糖基核苷酸；非环状3′，4′-开环核苷酸；3，4-二羟丁基核苷酸；3，5-二羟戊基核苷酸、5′-5′-反向的核苷酸部分、5′-5′-反向的脱碱基部分；5′-磷酰胺；5′-磷硫酰；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥连和/或非桥连的5′-磷酰胺、磷硫酰和/或二硫代磷酸酯、桥连或非桥连的甲基膦酸酯和5′-疏基部分(更详细的内容参见Beaucage和Lyer，1993，Tetrahedron 49，1925；通过引用并入本发明)。
结合本发明所述的2′-修饰的核苷酸，“氨基”是指修饰或未修饰的2′-NH2或2′-O-NH2。所述修饰的基团描述于，如，Eckstein等，美国专利No.5,672,695和Matulic-Adamic等，美国专利No.6,248,878。
siNA分子可与阳离子脂质络合，包裹在脂质体内或以其它方式递送至靶细胞或组织。核酸或核酸络合物可通过注射、输注泵或支架局部给药，其掺入或不掺入生物聚合物中。在另一实施方案中，聚乙二醇(PEG)可共价结合本发明的siNA化合物、增强多核苷酸递送的多肽或同时结合两者。所结合的PEG可为任何分子量，优选约2,000至约50,000道尔顿(Da)。
有义区可通过接头分子，例如多核苷酸接头或非核苷酸接头连接至反义区。
“反向重复”是指含有定位的有义和反义单元的核酸序列，这样当该重复序列被转录时，有义和反义单元能够形成双链siRNA。反向重复可任选包括接头或异源序列例如两个重复元件之间的自我裂解核酶。反向重复的元件的长度足够形成双链RNA。典型地，反向重复的每个元件约15至约100个核苷酸长度，优选约20-30个碱基核苷酸，优选约20-25个核苷酸长度，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体。该术语包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接键的核酸，它们是合成的、天然存在的及非天然存在的，与参考核酸具有相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式被代谢。这些类似物的例子包括，但不限于，磷硫酰、磷酰胺、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
“长双链RNA”是指大小大于约40个碱基对(bp)的任何双链RNA，例如大于100bp或更特别地大于300bp。大的dsRNA序列可代表mRNA片段或完整mRNA。本发明中的dsRNA的最大大小不受限制。双链RNA可包括修饰的碱基，其中所述修饰可对于磷酸酯糖骨架或是对于核苷。所述修饰可包括本领域中已知的氮或硫杂原子或任何其他修饰。
双链结构可通过自我互补RNA链例如发夹结构或微RNA或通过两条不同的互补的RNA链退火而形成。
“重叠”是指两个RNA片段具有在一条链上多个核苷酸重叠的序列，例如，其中多个核苷酸(nt)为2-5个核苷酸或5-10个核苷酸或更多。
“一种或多种dsRNA”是指在序列基础上互不相同的dsRNA。
“靶基因或靶mRNA”是指感兴趣的任何基因或mRNA。确实，先前通过遗传方法或测序鉴定的任何基因可代表靶。靶基因或靶mRNA可包括发育基因和调节基因及代谢或结构基因或编码酶的基因。靶基因可以直接或间接影响表型特征的方式表达在表型被研究的这些细胞中或在生物体中表达。所述靶基因可为内源性或外源性的。这些细胞可包括成年或胚胎动物机体或植物的任何细胞，包括配子或例如存在于永久细胞系或原代细胞培养物的任何分离的细胞。
在典型的实施方案中，本发明的特征组合物包括小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(mRNA)或短发夹RNA(shRNA)可与增强多核苷酸递送的多肽掺和、络合或缀合。
如本发明所使用，术语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”，是指能够抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子，例如通过序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默。在典型的实施方案中，所述siNA是含有自我互补的有义区和反义区的双链多核苷酸分子，其中所述反义区含有与下调表达的靶核酸分子中的核苷酸序列互补的核苷酸序列或其部分，并且有义区含有与靶核酸序列或其部分对应(即序列上基本等同于)的核苷酸序列。
“siNA”是小的干扰核酸，例如siRNA，其为短长度的双链核酸(或任选其较长的前体)，并在靶细胞中无不可接受的毒性。在某些实施方案中，本发明中有用的siNA的长度优选为约21至23bp长。然而，有用的siNA，包括siRNA的长度无特别限制。例如，siNA可首先以前体形式出现于细胞中，所述前体形式与当递送至靶细胞或之后出现并发挥基因沉默活性的siNA最终形式或加工形式显著不同。siNA的前体形式可例如包括在递送同时或之后加工、降解、改变或裂解以产生在细胞内具有介导基因沉默活性的siNA的前体序列元件。因此，在某些实施方案中，本发明有用的siNA的前体长度，例如约100-200个碱基对，50-100个碱基对，或少于约50个碱基对，所述前体在靶细胞中产生活性、加工的siNA。在其他实施方案中，有用的siNA或siNA前体长度约10至49bp、15至35bp或约21至30bp。
如上所述，在本发明的某些实施方案中，增强多核苷酸递送的多肽用于促进较常规siNA更大的核酸分子包括siNA的大的核酸前体的递送。例如，本发明的方法和组合物可用于增强代表所需siNA的“前体”的较大核酸的递送，其中，所述前体氨基酸可在递送至靶细胞之前、过程中或之后被裂解或加工形成调节靶细胞内基因表达的活性siNA。例如，siNA前体多核苷酸可被选择作为环状的、单链多核苷酸，其具有两种或多种环结构及含有自我互补有义区和反义区的茎，其中反义区含有与靶核酸分子或其部分互补的核苷酸序列，有义区具有与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列，其中环状多核苷酸可在体内或体外加工产生能够介导RNAi的活性。
在哺乳动物细胞中，长于30个碱基对的dsRNA可活化通常由干扰素诱导的dsRNA-依赖性激酶PKR及2′-5′-寡腺苷酸合成酶。活化的PKR通过翻译因子真核起始因子2α(eIF2α)抑制通常的翻译，而2′-5′-寡腺苷酸合成酶通过活化RNase L导致非特异性的mRNA降解。本发明的siNA由于小的大小(特别是指非前体形式)，通常少于30个碱基对，最常见的约17-19、19-21或21-23个碱基对，避免了干扰素反应的激活。
与长dsRNA的非特异性反应大不相同，siRNA可介导哺乳动物系统的选择性基因沉默。具有短环和19至27个碱基对的茎的发夹RNA也选择性使与双链茎的序列同源的基因表达沉默。哺乳动物细胞可使短发夹RNA转化为siRNA以介导基因沉默。
RISC介导具有与siRNA双链的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解可发生于与siRNA双链的反义链互补的区域中部。研究显示当含有两个核苷酸3′-悬突时，21个核苷酸的siRNA双链最有活性。另外，使用2′-脱氧(2′-H)或2′-O-甲基核苷酸对一条或两条siRNA链的完全取代消除了RNAi活性，已报道使用脱氧核苷酸(2′-H)对3′-末端siRNA悬突核苷酸的取代可以忍受。
研究显示，使用脱氧核糖核苷酸取代具有2个核苷酸的3′悬突的21-mersiRNA双链的3′-悬突片段对RNAi活性没有不良影响。已报道，使用脱氧核糖核苷酸取代siRNA各末端上的达4个核苷酸可以忍受，而使用脱氧核糖核苷酸的完全取代不产生RNAi活性。
可选地，siNA可以单转录产物或多转录产物递送，所述转录产物由编码单siNA或多siNA及指导其在靶细胞内表达的多核苷酸载体表达。在这些实施方案中，在靶细胞内表达的siRNA最终转录产物的双链部分可为约例如15至49bp、15至35bp或约21至30bp长。在典型实施方案中，其中两条链配对的siNA的双链部分不限于完全配对的双链核苷酸片段，并由于错配可含有非配对部分(相应的核苷酸为非互补的)，膨泡(在一条链上缺少相应的互补核苷酸)、悬突，等等。可含有非配对部分可达其不干扰siNA形成的程度。在更详细的实施方案中，“膨泡”可含有1至2个非配对核苷酸，其中两条链配对的siNA的双链区可含有约1至7，或约1至个“膨泡”。另外，siNA双链区含有的“错配”部分的数目可为约1至7或约1至5。在错配中最常见的是，其中一种核苷酸为鸟嘌呤，其他的核苷酸为尿嘧啶。所述错配可归因于在编码有义RNA的相应DNA中例如C至T、G至A的突变或其混合物，但也包括其他原因。另外，本发明中其中两条链配对的siNA的双链区可同时含有膨泡和近似特定的数目范围的错配部分。
本发明siNA的末端结构可为钝端或粘端(悬突)，只要siNA保留其使靶基因表达沉默的功能。粘端(悬突)结构不仅限于其他人所报道的3′悬突。相反，可包括5′悬突结构，只要其能够诱导例如通过RNAi的基因沉默。另外，悬突的数量不限于已报道的2个或3个核苷酸的范围，但可为任何数目，只要悬突不损坏siRNA的基因沉默活性。例如，悬突可含有约1至8个核苷酸，更常见地约2至4个核苷酸。具有粘端的全长siNA的总长度可表示为配对的双链部分和同时在两个末端含有悬突的一对单链的长度总数。例如，在两个末端同时具有4个核苷酸的悬突的19bp双链RNA的典型例子中，总长度表示为23bp。另外，由于悬突序列对于靶序列具有低的特异性，其与靶基因序列不一定具有互补性(反义)或同一性(有义)。另外，只要siNA能够保持其对靶基因的基因沉默影响，其可含有低分子量结构(例如天然RNA分子，如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子)，例如，在一个末端的悬突部分。
另外，siNA的末端结构可具有茎环结构，其中双链核酸的一条的末端由接头核酸如接头RNA连接。双链区(茎环)的长度可为，例如，15至49bp，通常15至35bp，更常见约21至30bp长。可选地，靶细胞中表达的siNA的最终转录产物的双链区的长度可为，例如，约15至49bp，15至35bp，或约21至30bp长。当使用接头区时，接头长度无特别限制，只要其不阻碍茎部分的配对。例如，对于茎部分的稳定配对和抑制编码该部分的DNA之间的重组，所述接头部分可具有三叶草型tRNA结构。即使所述接头具有阻碍茎部分配对的长度，也有可能可构建包括内含子部分的接头部分，在前体RNA的加工成成熟的RNA过程中，所述内含子被剪切，从而允许茎部分的配对。在茎环siRNA的情况中，无环结构的RNA的任一末端(头或尾)可具有低分子量RNA。如上所述，这些低分子量RNA可包括天然RNA分子，例如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子。
siNA还可含有具有与靶核酸分子或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷酸(例如，其中在对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列的siNA分子中不需要存在这些siNA)，其中，所述单链多核苷酸可进一步含有末端磷酸酯，如5′-磷酸酯(参见，例如，Martinez等，Cell，110：563-574(2002)及Schwarz等，Molecular Cell，10：537-568(2002)，或5′，3′-二磷酸酯。
如本发明所使用，术语“siNA分子”不限于仅含有天然存在的RNA或DNA的分子，其还包括化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，本发明的短干扰核酸分子缺少含有2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸不需要具有介导RNAi的2′-羟基的核苷酸的存在，这样，本发明的短干扰核酸分子任选不包括任何核糖核苷酸(如具有2′-OH基团的核苷酸)。然而，这些siNA分子内不需要存在核糖核苷酸以支持RNAi的siNA分子可具有连接的一个接头或多个接头或其他连接或有关观点基团、部分或含有带有2′-OH基团的一个或多个核苷酸。任选地，siNA分子可在约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置含有核糖核苷酸。
如本发明所使用，术语“siNA”的意思与用于描述能够介导序列特异性的RNAi的其他术语例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)及其他的其他术语等同。
在其他实施方案中，用于本发明的siNA分子可含有分离的有义和反义序列或区域，其中所述有义和反义区通过核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或替代地通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用和/或堆积相互作用而非共价连接。
“反义RNA”是具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，并被认为通过结合至靶基因mRNA诱导RNAi。“有义RNA”具有与反义RNA互补的序列，并被退火至其互补的反义RNA以形成siRNA。这些反义和有义RNA使用RNA合成仪常规合成。
如本发明所使用，“RNAi构建体”是贯穿包括小干扰RNA(siRNA)、发夹RNA及可在体内裂解形成siRNA的其他RNA种类的总称。本发明RNAi构建体还包括能够产生形成细胞内dsRNA或发夹RNA的转录物的表达载体(也称为RNAi表达载体)，和/或可在体内产生siRNA的转录物。任选地，所述siRNA包括单链或双链siRNA。
小干扰杂交分子(siHybrid molecule)是功能与siRNA相似的双链核酸分子。与双链RNA分子不同，siHybrid分子含有RNA链和DNA链。优选地，所述RNA链是与靶mRNA结合的反义链。DNA和RNA链杂交而造成的siHybrid具有杂交的互补部分，并优选具有至少3′悬突。
用于本发明的siNA可装配有两条分离的寡核苷酸，其中一条链是有义链，另一条链是反义链，其中反义链和有义链为自我互补(即，各链含有与另一条链中的序列互补的核苷酸序列，例如，其中反义链和有义链形成双链或双链结构，例如，其中双链区约为19碱基对)。反义链可含有与靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，有义链可含有与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列互补的核苷酸序列。可选地，siNA可从单链寡核苷酸装配，其中siNA的自我互补有义区和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接。
在另外的实施方案中，根据本发明的方法和组合物用于细胞内递送的siNA可为具有双链、不对称双链、发夹结构或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其具有自我互补有义区和反义区，其中所述反义区含有与分离的吧核酸分子或其一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且所述有义区含有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。
可于siNA中进行的化学修饰的非限制性例子包括，但不限于磷硫酰核苷酸间键、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸，“通用碱基”核苷酸，“非环状”核苷酸、5-C-甲基核苷酸及末端甘油基和/或反向脱氧脱碱基残基的掺入。这些化学修饰，当用于各种siNA构建体时，显示可保护细胞内的RNAi活性，而同时，显著增加这些化合物的血清稳定性。
在非限制性实施例中，化学修饰的核苷酸引入核酸分子提供了克服被外源性递送的天然RNA分子固有的体内稳定性和生物利用度限制的强有力工具。例如，由于化学修饰的核酸分子倾向于具有较长的血清半衰期，其使用可使较低剂量的特定核酸分子能够具有预定的治疗效果。另外，某些化学修饰可通过靶向特定细胞或组织和/或改进核酸分子的细胞摄取而改进核酸分子的生物利用度。因此，即使化学修饰的核酸分子的活性较天然核酸分子减小，例如，当与等位RNA核酸分子相比，修饰的核酸分子由于分子的稳定性和/或递送改进，其总体活性可大于天然分子。与天然未修饰的siNA相比，化学修饰的siNA还可使活化人的干扰素活性的可能性减至最小。
在本发明所述的siNA分子的任何实施方案中，本发明的siNA分子的反义区在所述反义区的3′末端可含有磷硫酰核苷酸间键。在本发明所述的siNA分子的任何实施方案中，所述反义区在所述反义区的5′端可含有约一至约五个磷硫酰核苷酸间键。在本发明所述的siNA分子的任何实施方案中，本发明的siNA分子的反义区3′末端核苷酸悬突可含有在核酸糖、碱基或骨架处被化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在本发明所述的siNA分子的任何实施方案中，3′末端核苷酸悬突可含有一个或多个通用碱基核糖核苷酸。在本发明所述的siNA分子的任何实施方案中，3′末端核苷酸悬突可含有一个或多个非环状核糖核苷酸。
例如，在一个非限制性实施例中，本发明的特征是在一条siNA链中，化学修饰的短干扰核酸(siNA)具有约1、2、3、4、5、6、7、8或更多磷硫酰核苷酸间键。在另一个非限制性实施例中，本发明的特征是在两条siNA链中，化学修饰的短干扰核酸(siNA)各自具有约1、2、3、4、5、6、7、8或更多磷硫酰核苷酸间键。所述磷硫酰核苷酸间键可存在于siNA双链的一条或两条寡核苷酸链，例如存在于有义链，反义链，或同时存在于两条链。本发明的siNA分子在有义链，反义链，或两条链的3′端、5′端或两端可含有一个或多个磷硫酰核苷酸间键。例如，典型的本发明siNA分子可在有义链、反义链或同时在两条链含有约1至约5或更多(如约1、2、3、4、5或更多)连续的磷硫酰核苷酸间键。在另一非限制性实施例中，典型的本发明siNA分子可在有义链、反义链或同时在两条链含有约1条或多条(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)嘧啶磷硫酰核苷酸间键。在另一非限制性实施例中，典型的本发明siNA分子可在有义链、反义链或同时在两条链含有约1条或多条(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)嘌呤磷硫酰核苷酸间键。
siNA分子可含有环状核酸分子，其中所述siNA为约具有18至约23个(如，约18、19、20、21、22或23)碱基对的约38至约70个(如，38、40、45、50、55、60、65或70个)核苷酸长度，其中环状寡核苷酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃形结构。
环状siNA分子含有两个环基序，其中所述siNA分子的一个或两个环部分为可生物降解的。例如，本发明的环状siNA分子被设计成siNA分子的环部分在体内的降解产生具有包含约2个核苷酸的3′端核苷酸悬突的双链siNA分子。
存在于siNA分子且优选存在于siNA分子反义链，任选存在于有义链和/或同时存在于反义链和有义链中的修饰核苷酸，含有具有与天然存在的核糖核苷酸相似的性质或特征的修饰核苷酸。例如，本发明的特征是包括修饰的核苷酸的siNA分子具有Northern构象(如Northern假回转环，参见，例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag ed.，1984)。这样，存在于本发明的siNA分子中、优选存在于本发明的siNA分子反义链，及任选存在于有义和/或同时存在于反义链和有义链中的化学修饰的核苷酸，对核酸酶降解具有抵抗力，同时保持介导RNAi的能力。具有northern构象的核苷酸的非限制性例子包括锁核酸(LNA)核苷酸(如，2′-O，4′-C-亚甲基-(D呋核亚硝脲)核苷酸)、2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2′-甲基-硫-乙基、2′-脱氧-2′-氟核苷酸。2′-脱氧-2′-氯核苷酸、2′-叠氮基核苷酸，以及2′-O-甲基核苷酸。
双链siNA分子的有义链在有义链的3′-末端、5′-末端或同时在3′和5′-末端可具有末端帽部分，例如反向的脱氧碱基部分。
缀合物的非限制性例子包括描述于2003年4月30日提交的Vargeese等，美国申请序列号第10/427,160号，其完整内容包括附图通过引用并入本文。在另一实施方案中，缀合物通过可生物降解的接头与化学修饰的siRNA分子结合。在一个实施方案中，所述缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或同时在两条链的3′-末端结合。在另一实施方案中，所述缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或同时在两条链的5′-末端结合。在又一实施方案中，所述缀合物分子在化学修饰的siNA分子的有义链、反义链或同时在两条链的3′-末端和5′-末端或其任何组合形式结合。在一个实施方案中，本发明的缀合物分子包括促进化学修饰的siNA分子递送至生物系统如细胞的分子。在另一实施方案中，与化学修饰的siNA分子结合的缀合物分子是聚乙二醇、人血清白蛋白，或是可介导细胞摄取的细胞受体的配体。可与化学修饰的siNA分子结合的本发明涉及的特定缀合分子的描述于2003年7月10日公布的Vargeese等，美国专利申请No.20030130186及2004年6月10日公布的美国专利申请No.20040110296。可对所使用的缀合物的类型和本发明siNA分子缀合的程度评价改进了的药动学、生物利用度和/或siNA构建体的稳定性，同时保留siNA介导RNAi活性的能力。这样，本领域技术人员筛选使用各种缀合物修饰的siNA构建体，以确定siNA缀合物络合物是否具有改进的特性而同时保留介导RNAi的能力，例如在本领域公知的动物模型中。
siNA还含有连接siNA的有义区和siNA的反义区的核苷酸、非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接头。在一个实施方案中，核苷酸接头可为＞2个核苷酸长度，例如约3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长度。在另一实施方案中，所述核苷酸接头可为核酸适体。本发明使用的“适体”或“核酸适体”是指特异性结合靶分子的核酸分子，其中所述核酸分子在其天然装配中具有含有靶分子识别的序列的序列。可替代地，适体可为结合靶分子的核酸分子，其中所述靶分子天然情况下不结合核酸。靶分子可为任何感兴趣的分子。例如，所述适体可用于结合蛋白质的配体结合域，从而防止天然存在的配体与所述蛋白质相互作用。这是非限制性的例子，本领域技术人员应认识到使用本领域公知技术可容易产生其他实施方案。(参见，例如，Gold等，Annu.Rev.Biochem.，64：763(1995)；Brody和Gold，J.Biotechnol.，74：5(2000)；Sun，Curr.Opin.Mol.Ther.，2：100(2000)；Kusser，J.Biotechnol.，74：27(2000)；Hermann和Patel，Science 287：820(2000)；以及Jayasena，Clinical Chemistry，45：1628.(1999))。
非核苷酸接头可含有脱碱基核苷酸、聚醚、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其他聚合化合物(如，聚乙二醇，如具有2至100乙二醇单位的那些)。特定的例子包括下述描述的那些：Seela和Kaiser，Nucleic AcidsRes.，18：6353(1990)和Nucleic Acids Res.，15：3113(1987)；Cload和Schepartz，J.Am.Chem.Soc，113：6324(1991)；Richardson和Schepartz，J.Am.Chem.So，113：5109(1991)；Ma等，Nucleic Acids Res.，21：2585(1993)和Biochemistry 32：1751(1993)；Durand等，Nucleic Acids Res.，18：6353(1990)；McCurdy等，Nucleosides & Nucleotides，10：287(1991)；Jschke等，Tetrahedron Lett.，34：301(1993)；Ono等，Biochemistry，30：9914(1991)；Arnold等，国际PCT公开No.WO 89/02439；Usman等，国际PCT公开No.WO 95/06731；Dudycz等，国际专利公开WO 95/11910以及Ferentz和Verdine，J.Am.Chem.Soc.，113：4000(1991)。“非核苷酸”还表示可取代一个或多个核苷酸单位包括糖和/或磷酸酯取代基而掺入核酸链并允许其余碱基表现其酶活性的任何基团或化合物。所述基团或化合物可为脱碱基的，因为其不含有通常被识别的核苷酸碱基，例如在糖的C1位置的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
可化学修饰的本发明的siNA分子的合成包括：(a)siNA分子的两条互补链的合成；(b)在适于获得双链siNA分子的条件下将两条互补链退火在一起。在另一实施方案中，siNA分子的两条互补链的合成是通过固相寡核苷酸合成。在又一实施方案中，siNA分子的两条互补链的合成是通过固相串连寡核苷酸合成。
使用本领域已知的方案合成寡核苷酸(如某些修饰的寡核苷酸或缺少核糖核苷酸的寡核苷酸)，例如在下述文献中所描述的：Caruthers等，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等，国际PCT公开No.WO99/54459，Wincott等，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，美国专利No.6,001,311。RNA，包括本发明的某些siNA分子的合成遵循通常的程序，如在下述文献中所描述的，例如Usman等，1987，J.Am.Chem.Soc，109，7845；Scaringe等，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433；及Wincott等，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684 Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59。
用于本发明的递送核酸分子的补充或互补方法描述于例如，Akhtar等，Trends Cell Bio.，2，139(1992)；Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer等，Mol.Membr.Biol.，16：129-140(1999)；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol.，137：165-192(1999)；及Lee等，ACS Symp.Ser.，752：184-192(2000).Sullivan等，国际PCT公开No WO 94/02595，还描述了用于递送酶核酸分子的通用方法。这些方案可用于本发明涉及的实际任何核酸分子的补充或互补递送。
药物组合物
核酸分子和增强多核苷酸递送的多肽可通过多种本领域已知的方法给药于细胞，包括，但不限于含有siNA和增强多核苷酸递送的多肽的制剂单独给药，或还包括一种或多种另外的组分如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、助剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂、防腐剂等的制剂的给药。在某些实施方案中，siNA和/或增强多核苷酸递送的多肽可包裹在脂质体中，通过离子透入法或掺入其他载体如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米囊、生物粘附的微球或蛋白质性载体(参见，例如，O′Hare和Normand，国际PCT公开No.WO 00/53722)。可选地，核酸/肽/载体组合物可通过直接注射或通过使用输注泵进行局部递送。本发明核酸分子的直接注射，不管是皮下、肌内还是皮内均可使用标准注射针和注射器方法，或通过无注射针技术如Corny等，Clin.Cancer Res.，5：2330-2337(1999)和Barry等，国际PCT公开No.WO 99/31262描述的进行。
本发明的组合物可作为药物制剂有效使用。所述药物制剂可预防、调节患者疾病状态或其他不良状况的存在或严重性，或对其进行治疗(减轻一种或多种症状至可检测或可测定的程度)。
因此，在本发明的另外的实施方案中，本发明提供了组合物和方法，所述组合物和方法的特征是呈递或给予与增强多核苷酸递送的多肽组合、络合或缀合并任选与一种药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂、缓冲液等一起配制的一种或多种多核酸，通常是一种或多种siNA。
本发明通过提供调节与受治对象的特定疾病状态或其他不良状况有关的基因的表达的短干扰核酸(siNA)分子满足了另外的目的和优点。通常，siNA靶向作为受治对象疾病状态或不良状况有关的病因或致病因素而表达升高的基因。在该上下文中，所述siNA有效下调所述基因的表达至预防、缓解或减轻一种或多种相关的疾病症状严重度或复发的水平。但是，可选地，对于靶基因表达不一定升高的各种不同疾病模型，靶基因的下调通过降低基因表达产生治疗性结果(即，降低靶基因的所选mRNA和/或蛋白质产物)。可选地，本发明的siNA可靶向一种基因的低表达，这可导致通过靶基因的产物或活性负调节其表达的“下游”的基因的上调。
在典型的实施方案中，本发明的组合物和方法可用作治疗工具调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以治疗或预防类风湿性关节炎(RA)。在该上下文中，本发明还提供了通过使用小核酸分子的RNA干扰(RNAi)调节TNF-α的表达和活性的化合物、组合物和方法。在更详细的实施方案中，本发明提供了可有效调节TNF-α和/或TNF-α基因的表达以预防或治疗哺乳动物受治对象类风湿性关节炎的小核酸分子，例如短干扰核酸(siNA)，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(mRNA)及短发夹RNA(shRNA)分子。在这些和相关的治疗组合物和方法中，化学修饰的siNA的使用常改进修饰的siNA的特性(与天然siNA分子相比)，例如通过提供对体内核酸酶降解的抵抗力增加和/或通过改进的细胞摄取。如根据本发明公开内容可容易确定的，有用的siNA具有保留其RNAi活性的多种化学修饰。本发明的siNA分子因此提供了有用的制剂和方法用于多种治疗、诊断、靶标确认、基因组发现、基因工程及药物基因组应用。
本发明的siNA可以任何形式给药，例如经皮肤或局部注射(如，在银屑病斑处局部注射以治疗银屑病或注射至遭受银屑病性关节炎或类风湿性关节炎的患者的关节)。在更详细的实施方案中，本发明提供了用于给予治疗有效量的针对TNF-α的mRNA的siNA的制剂和方法，所述制剂和方法可有效下调TNF-αRNA并由此减轻或预防一种或多种TNF-α相关的炎性病症。本发明提供了靶向与动物受治对象的所选疾病状况相关的一种或多种不同基因的表达的可比的方法和组合物，其中所述基因包括其表达已知作为与所选疾病状况有关的病因或致病因素而异常增加的大量基因中的任何基因。
本发明的siNA/增强多核苷酸递送的多肽混合物可结合其他用于靶疾病状况的标准治疗进行给药，例如结合有效针对炎性疾病如RA或银屑病的治疗剂。本文中组合性有用和有效的制剂的例子包括非甾体抗炎药(NSAID)、甲氨喋呤、金化合物、D-青霉胺、抗疟药、柳氮磺吡啶、糖皮质激素及其他TNF-α中和剂如英夫利昔单抗和entracept。
带负电荷的本发明的多核苷酸(如RNA或DNA)可通过标准方法给药于患者，使用或不使用稳定剂、缓冲液等形成药物组合物。当需要使用脂质体递送机制时，可遵循脂质体形成的标准方案。本发明的组合物还可被配制并用作供口服给药的片剂、胶囊或酏剂，供直肠给药的栓剂，无菌溶液，供注射给药的悬浮液，以及本领域已知的其他组合物。
本发明还包括本文描述的药学上可接受的组合物的制剂。这些制剂包括上述化合物的盐，如酸加成盐，如氯化氢盐、溴化氢盐、乙酸盐及苯磺酸盐。
药理组合物或制剂是指以适于给药如全身给药至细胞或患者包括如人的剂型的组合物或制剂。合适的剂型部分取决于进入的途径，如口服、经皮肤或通过注射。这些剂型不应阻止组合物或制剂到达靶细胞(即带负电荷核酸为递送所需的细胞)。例如，注射入血流的药理组合物应可溶。其他因素为本领域已知，并包括如毒性的考虑因素。
“全身给药”是指药物遍布全身分布之后在体内的全身性吸收或累积。导致全身吸收的给药途径包括，但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内及肌内。这些给药途径的每一种将所需的带负电荷的聚合物如核酸暴露于可进入的疾病组织。已显示，药物进入循环的速率为分子量或大小的函数。包含本发明化合物的脂质体或其他药物载体可潜在将药物定位至如某些组织中，如网状内皮系统(RES)。可促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞的表面结合的脂质体制剂也是有用的。该方法可通过利用异常细胞如癌细胞对巨噬细胞和淋巴细胞免疫识别的特异性将增强了递送的药物提供至靶细胞。
“药学上可接受的制剂”是指允许本发明核酸分子以最适于其活性的身体定位有效分布的一种组合物或制剂。适于与本发明核酸分子制剂一起配制的制剂的非限制性例子包括：P-糖蛋白抑制剂(如Pluronic P85)，其可增强药物进入中枢神经系统(CNS)[Jolliet-Riant和Tillement，Fundam.Clin.Pharmacol.，13：16-26(1999)]；可生物降解的聚合物，如聚(DL-丙交酯共乙交酯)，大脑内植入后持续释放递送的微球(Emerich，D F et ah，CellTransplant，8：47-58(1999)](Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.)；及负载的纳米颗粒，如聚丁基氰基丙烯酸酯制成的那些，其可将药物穿过血脑屏障并改变神经元摄取机制而递送(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23：941-949，(1999)]。本发明核酸方法的其他非限制性例子包括下述文献描述的物质：Boado等，J.Pharm.ScL，87：1308-1315(1998)；Tyler等，FEBSLett.，421：280-284(1999)；Pardridge等，PNAS USA.，92：5592-5596(1995)；Boado，Adv.Drug Delivery Rev.，15：73-107(1995)；Aldrian-Herrada等，Nucleic Acids Res.，26：4910-4916(1998)；及Tyler等，PNAS USA，96：7053-7058(1999)。
本发明还包括制备用于贮存或给药的组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的所需化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂为药学领域熟知，并描述于，例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)。例如，可提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸、及对羟基苯甲酸酯。另外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
药学有效剂量是预防、抑制疾病状态的存在或对其进行治疗所需的剂量(缓解症状至某程度，优选所有症状)。药学有效剂量取决于疾病类型、所使用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物种类、所考虑的特定哺乳动物的体格特征、同时的给药方法、及医学领域技术人员认可的其他因素。通常，根据带负电荷的聚合物的效能给予0.1mg/kg至100mg/kg体重/天的活性成分。
水悬浮液在与适于水悬浮液制备的赋形剂的混合物中含有活性物质。这些赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶及阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可为天然存在的磷脂，例如卵磷脂、或烯基氧化物与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪族醇的缩合产物如十七乙烯氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的不完全酯的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，聚乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。水悬浮液还可含有一种或多种防腐剂，如乙基、或正丙基对羟苯酸盐，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
可通过将活性成分悬浮于植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油或矿物油如液体石蜡中配制油悬浮剂。所述油悬浮剂可含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可添加甜味剂和调味剂以提供适口的口服制剂。可通过添加抗氧化剂如抗坏血酸保护这些组合物。
适于通过添加水制备水悬浮液的分散粉剂和颗粒在与分散剂和湿润剂、悬浮剂及一种或多种防腐剂的混合物中提供了活性成分。合适的分散剂或湿润剂或悬浮剂可通过上述提到的那些来举例说明。还可提供其他辅料如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可为水包油乳剂形式。油相可为植物油或矿物油或其混合物。合适的乳化剂可为天然存在的胶，如阿拉伯胶或西黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或部分酯，例如去水山梨糖醇单油酸酯，及所述部分酯和环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。所述乳剂还可含有甜味剂和调味剂。
所述药物组合物可为无菌可注射的水悬浮液或油悬浮液。该悬浮液可使用上述的那些合适的分散剂或湿润剂及悬浮剂根据已知技术进行配制。无菌可注射制剂还可为在非毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，如作为在1，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受的载体和溶剂中可有水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。对此目的，可使用的任何温和的不挥发性油包括合成的甘油一酯和甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸可用于可注射制剂。
siNA还可以栓剂形式给药，如用于药物的直肠给药。这些组合物可通过将所述药物与在常温下为固体但在直肠温度为液体并因此在直肠溶解而释放所述药物的合适的非刺激性赋形剂混合而制备。这些物质包括可可脂和聚乙二醇。
可通过使用核酸酶抗性基团例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H修饰来广泛修饰siNA以增强稳定性。[参见综述Usman和Cedergren，TIBS 17：34(1992)；Usman等，Nucleic Acids Symp.Ser.31：163(1994)]。可通过凝胶电泳使用通常的方法纯化siNA构建体，或通过高压液相色谱和重悬于水来纯化siNA构建体。
带有修饰的化学合成核酸分子(碱基、糖和/或磷酸酯)可防止其被血清核糖核酸酶降解，这可增强其效能。参见，例如，Eckstein等，国际公布No.WO 92/07065；Perrault等，Nature 344：565(1990)；Pieken等，Science 253，314(1991)；Usman和Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334(1992)；Usman等，国际PCT公开No.WO 93/15187；及Rossi等，国际公布No.WO 91/03162；Sproat，美国专利No.5,334,711；Gold等，美国专利No.6,300,074。所有上述参考文献描述了可对本文所述核酸分子的碱基、磷酸酯和/或糖部分进行的各种化学修饰。
本领域中有一些例子描述可引入核酸分子的糖、碱基及磷酸酯修饰显著增强其核酸酶稳定性和功效例子。例如，通过使用核酸酶抗性基团修饰而修饰寡核苷酸以增强稳定性和/或增强生物活性，例如，2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H核苷酸修饰。参见综述Usman和Cedergren，，TIBS.17：34(1992)；Usman等，Nucleic Acids Symp.Ser.31：163(1994)；Burgin等，Biochemistry，35：14090(1996)。核酸分子的糖修饰广泛描述于下述文献中：参见，Eckstein等，国际公布PCT No.WO92/07065；Perrault等Nature，344，565-568(1990)；Pieken等，Science，253：314-317(1991)；Usmati和Cedergren，Trends in Biochem.ScL，17：334-339(1992)；Usman等，国际公布PCT No.WO 93/15187；Sproat，美国专利No.5,334,711和Beigelman等，1995，J.Biol.Chem.，270，25702；Beigelman等，国际PCT公开No.WO 97/26270；Beigelman等，美国专利No.5,716,824；Usman等，美国专利No.5,627,053；Woolf等，国际PCT公开No.WO 98/13526；Thompson等，Karpeisky等，Tetrahedron Lett.，39：1131(1998)；Earnshaw和Gait，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)，48：39-55(1998)；Verma和Eckstein，Annu.Rev.Biochem.，67：99-134(1998)；和Burlina等，Bioorg.Med.Chem.，5：1999-2010(1997)。这些公开描述了确定掺入核酸分子而不调节催化的糖、碱基和/或磷酸酯修饰等的定位。考虑这些教导，如本文所述可使用相似的修饰以修饰本发明的siNA核酸分子，只要siNA促进细胞中RNAi的能力不被显著抑制。
尽管使用磷硫酰键、二硫代磷酸酯键和/或5′-甲基膦酸酯键对寡核苷酸核苷酸间键的修饰改进了稳定性，但过度的修饰可引起一些毒性或活性减小。因此，当设计核酸分子时，核苷酸间键的量应被最小化。这些键的浓度的减小应降低毒性，导致功效增加及这些分子的特异性增加。
在一个实施方案中，本发明的特征是被修饰的siNA分子，磷酸酯骨架修饰包括一个或多个磷硫酰、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉、酰胺氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺、聚酰胺、磺酸酯、氨苯磺胺、氨苯磺胺酯、甲乙缩醛、硫甲乙缩醛和/或烷基甲硅烷基取代基。对于寡核苷酸骨架修饰，参见，Hunziker和Leumann，Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331-417(1995)，及Mesmaeker等，Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides，inCarbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS5 24-39(1994)。
递送核酸分子的方法描述于Akhtar等，Trends Cell Bio.，2：139(1992)；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，(1995)，Maurer等，Mol.Membr.Biol.，16：129-140(1999)；Hofland和Huang，Handb.Exp.Pharmacol.，137：165-192(1999)；和Lee等，ACS Symp.Ser.，752：184-192(2000)。Beigelman等，美国专利No.6,395,713和Sullivan等，PCT WO 94/02595还描述了递送核酸分子的通用方法。这些方案可用于递送实际上任何核酸分子的递送。核酸分子可通过本领域技术人员已知的多种方法给药于细胞，包括，但不限于，通过离子透入法包裹于脂质体，或通过掺入其他载体，如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见，例如，Gonzalez等，Bioconjugate Chem.，10：1068-1074(1999)；Wang等，国际PCT公开No.WO 03/47518和WO 03/46185)，聚(乳酸共羟乙酸)(PLGA)及PLCA微球(参见，例如美国专利No.6,447,796和美国专利申请公开No.美国2002130430)，可生物降解的纳米囊及生物粘附微球。或蛋白质载体(O′Hare和Normand，国际PCT公开No.WO 00/53722)。可选地，通过直接注射或通过使用输注泵局部递送核酸/载体组合物。本发明核酸分子的直接注射，无论是皮下、肌内还是皮内，均可使用标准注射针和注射器方法，或通过无注射针技术如描述于Conry等，Clin.Cancer Res.，5：2330-2337(1999)和Barry等，国际PCT公开No.WO 99/31262中的那些进行。本发明的分子可用作药物制剂。药物制剂可预防、调节受治对象疾病状态的存在或对其进行治疗(缓解症状至某程度，优选所有症状)。
在此说明书和所附权利要求中，单数形式的“一个”、“一种”及“该”包括复数形式，除非上下文另外明确指明。
实施例
实施例1含有与增强多核苷酸递送的多肽络合的siRNA的组合物的制备及其性质
为形成本发明的候选siRNA和增强多核苷酸递送的多肽的络合物，使足够量siRNA与预定量的增强多核苷酸递送的多肽组合，例如在Opti-MEM
Figure A20058003268400451
细胞培养基(Invitrogen)，以确定的比率，并在室温培育约10-30分钟。随后，使所选量如50μl的该混合物与靶细胞接触，并培育所述细胞预定的培育时间，在本实施例中为约2小时。所述siRNA/肽混合物可任选包括细胞培养基或其他添加物如胎牛血清。对于H3、H4及H2b，进行一系列实验使这些增强多核苷酸递送的多肽与siRNA以不同比例络合。通常，这以1∶0.01至1∶50的siRNA/组蛋白比例开始。向96孔微孔板的每微孔添加40pm siRNA。每孔含有50％融合的β-半乳糖苷酶细胞。转染率的典型最佳比例示于下述表2。
在9L/β-半乳糖苷酶细胞上使用常规siRNA或siRNA与上述鉴定的组蛋白进行转染。将siRNA设计成特异性使β-半乳糖苷酶mRNA表达下降，以对照的β-半乳糖苷酶百分数来表示其活性(使用无增强多核苷酸递送的多肽的lipofectamine转染对照细胞)。
使用常规方法，例如β-半乳糖苷酶测定或流式细胞计量术对siRNA递送进行检测和/或定量。
对于β-半乳糖苷酶测定，使用9L/LacZ细胞、细胞系组成性表达的β-半乳糖苷酶。9L/LacZ细胞是大鼠组成性表达LacZ的神经胶质肉瘤成纤维细胞，获自ATCC(美国典型培养物保藏中心)(#CRL-2200)。在具有添加物丙酮酸钠、非必需氨基酸及20％胎牛血清的Dulbecco氏改良的必需培养基(DMEM)中培养9L/LacZ细胞。在37℃及5％CO2并添加含100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素及0.25mg/ml两性霉素B(Fungizone)(Invitrogen)的混合物的条件下培养细胞。化学合成设计的针对β-半乳糖苷酶mRNA的siRNA双链，并使用递送剂评估降低表达的功效。
siRNA合成和制备
使用标准的2-氰乙基磷酰胺酸法在长链烷基胺控制的由5′-O-二甲基三苯甲基-2′-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3′-O-琥珀酰核糖核苷衍生的孔玻璃或适用的5′-O-二甲基三苯甲基-2′-脱氧-3′-O-琥珀酰胸腺嘧啶载体上合成寡核苷酸。使用ABI 3400 DNA/RNA合成仪以0.2或1-μmol水平合成所有寡核苷酸，使用浓缩NH4OH从固体载体裂解，并使用NH4OH∶EtOH的3∶1混合物在55℃脱保护。通过在65℃使用N-甲基吡咯烷酮/三乙胺/三乙胺三(氢氟化物)溶液(600μl/μmol)(按体积计6∶3∶4)培育碱基脱保护的RNA2.5小时获得2′-TBDMS保护基团的脱保护。从供应商直接购买相应的标准部件，A、U、C及G的5′-二甲氧三苯甲基-N-(tac)-2′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基-3′-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Proligo，Boulder CO)以及修饰的亚磷酰胺，5′DMTr-5-甲基-U-TOM-CE-亚磷酰胺，5′-DMTr-2′-OMe-Ac-C-CE亚磷酰胺，5′-DMTr-2′-OMe-G-CE亚磷酰胺，5′-DMTr-2′-OMe-U-CE亚磷酰胺，5′-DMTr-2′-OMe-A-CE亚磷酰胺(GlenResearch)。三乙胺-三羟氟化物、N-甲基吡咯烷酮及浓氢氧化铵购自Aldrich。于具有XterraTM柱的Waters 2690进行HPLC(高效液相)测定和纯化。有其他试剂购自Glen Research公司。将寡核苷酸纯化至RP-HPLC测定的97％纯度。用于小鼠注射的siRNA购自Qiagen，在以体内注射可接受的内毒素水平退火之后进行HPLC纯化。
转染操作
在操作的第一天，从T75烧瓶取出饱和的9L/LacZ培养物，分离细胞并将其稀释至10ml完全培养基(DMEM，1xPS，1xNa Pyruvate，1xNEAA)。将细胞进一步稀释至1∶15，并将100μl的该配制品分配至96孔培养板的微孔，转染的第二天通常产生约50％的细胞融合。孔的边缘空出，并充有250μl水，并将培养板非叠加放置于培养箱(5％CO2培养箱)中于37℃过夜培养。
第二天，于Opti-MEM 50μl/孔制备转染络合物。从培养板去除培养基，使用200μl PBS或Opti-MEM清洗微孔一次。吸干培养板并倒置使用组织(tissue)使其完全干燥。然后将转染混合物(50μl/孔)添加至每孔，并将250μl水添加至孔边缘防止干燥。然后在37℃(5％CO2培养箱)培养细胞至少3小时。去除转染混合物，并使用100μl完全培养基(DMEM，1xPS，1xNaPyruvate，1x NEAA)置换。将细胞培养确定的时间段，然后收获用于酶测定。
用于使β-半乳糖苷酶mRNA沉默的siRNA序列如下：
C.U.A.C.A.C.A.A.A.U.C.A.G.C.G.A.U.U.U.dT.dT(有义链)(SEQ IDNO：32)，
A.A.A.U.C.G.C.U.G.A.U.U.U.G.U.G.U.A.G.dT.dT(反义链)(SEQ IDNO：33)。
本实施例的数据示于表2。转染率与自细胞裂解物测定的β-半乳糖苷酶活性的量负相关。当转染时，检测β-半乳糖苷酶活性的降低表明转染成功。因此，在未转染的情况下，检测的β-半乳糖苷酶活性为100％，转染率为0％。当β-半乳糖苷酶活性降低，转染率增加。例如，在表2中，组蛋白H2B和siRNA导致62.03％的转染率，表明检测的β-半乳糖苷酶活性降低至37.97％。确定转染率的相同方法用于表3提供的数据。
 表2：9L/LacZ细胞中由增强多核苷酸递送的多肽介导的siRNA递送率
  转染混合物   转染率(％总细胞)   摩尔比例(siRNA∶肽)
  仅siRNA(40pmol/孔)   0.09
  阳离子脂质(Invitrogen)   84.32   未知
  组蛋白H2B   62.03   1∶10-15
  组蛋白H3   85.08   1∶10-20
  组蛋白H4   72.07   1∶4-8
  GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO：31)   50.86   1∶5-20
  WWETWKFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQ ID NO：27)   98.29   1∶0.5-4
  聚赖氨酸-色氨酸，4∶1，分子量20,000-50,000   71.92   1∶2-8
  聚鸟氨酸-色氨酸，4∶1，分子量20,000-50,000   74.16   1∶2-8
siRNA/肽/脂质
为评估添加阳离子脂质至siRNA/增强多核苷酸递送的多肽混合物、络合物或缀合物的作用，遵循上述的操作，除了遵循制造厂家的说明书以恒定浓度将lipofectamine(Invitrogen)添加至siRNA/多核苷酸递送制剂(0.2μl/100μl Opti-MEM)。
为制备含有GKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：28)、siRNA和LIPOFECTIN
Figure A20058003268400481
(Invitrogen)的混合物，首先在室温下将siRNA和肽一起混合在Opti-MEM细胞培养基中，之后将LIPOFECTIN添加至混合物中形成siRNA/肽/阳离子脂质组合物。
 为制备含有RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：29)、siRNA和LIPOFECTIN
Figure A20058003268400483
(Invitrogen)的混合物，首先在室温下将siRNA和肽一起混合在Opti-MEM细胞培养基中，之后将siRNA添加至该混合物中形成siRNA/肽/LIPOFECTIN
Figure A20058003268400484
组合物。
为使用GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：30)或GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ IDNO：31)制备siRNA/肽/阳离子脂质组合物，以何顺序将组分一起添加以产生siRNA/肽/阳离子脂质组合物是不重要的。
 为制备siRNA/二甲双胍/LIPOFECTIN
Figure A20058003268400485
，首先将siRNA和二甲双胍一起混合在Opti-MEM细胞培养基中，然后将LIPOFECTIN
Figure A20058003268400486
添加至混合物中。
 为制备siRNA/组蛋白H1/LIPOFECTIN
Figure A20058003268400487
组合物，首先将组蛋白H1和LIPOFECTIN
Figure A20058003268400491
一起添加至Opti-MEM细胞培养基，充分混合，然后添加siRNA，与组蛋白LIPOFECTIN
Figure A20058003268400492
混合物充分混合形成siRNA/组蛋白H1/LIPOFECTIN
Figure A20058003268400493
组合物。
表3：9L/LacZ细胞中使用和不使用阳离子脂质由增强多核苷酸递送的多肽介导的siRNA递送率
  转染混合物   使用脂质体的转染率(％总细胞)   不使用脂质体的转染率(％总细胞)   转染混合物中添加的siRNA∶肽比例
  仅siRNA   01.72   00.11
  Lipofectamine(无肽)   83.48   未知
  GKINLKALAALAKKIL(SEQID NO：28)   89.67   00.26   1∶5-20
  RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：29)   89.00   00.59   1；1-5
  GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：30)   89.99   54.58   1∶5
  GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO：31)   90.01   50.86   1∶5-10
  二甲双胍   93.10   05.15   1∶20
  组蛋白H1   93.39   00.14   1∶10-20
根据上述结果，显然典型的本发明的增强多核苷酸递送的多肽可显著增强siRNA的细胞摄取，同时任选的阳离子脂质体添加至某些siRNA/多肽混合物可显著改进siRNA递送效率。
 实施例2含有与TAT-HA增强多核苷酸递送的多肽缀合的siRNA的组合物的产生及性质
本实施例描述了共价缀合至siRNA双链的一条链的特异性肽的合成和摄取活性。这些缀合物有效地将siRNA递送至细胞质。
使用标准的固定相合成方法制备肽和RNA。
为形成缀合物，必须使用特定残基官能化肽和RNA分子以使得相互共价连接。对于肽，使用3-马来酰亚胺丙酸对N-末端进行官能化。对于RNA分子，反义链的5′末端或3′末端以标准程序使用1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫键。
肽-siRNA缀合物(SEQ ID NO 34和35)结构
Figure A20058003268400501
 在前一天将细胞铺板，使得在转染时具有50-80％的融合。对于络合物，
在Opti-MEM培养基(Invitrogen)中稀释siRNA和肽，然后混合，并允许在加入使用PBS清洗的细胞之前络合5-10分钟。siRNA的终浓度为各肽浓度(2-50μM)为500nM。将也于Opti-MEM
Figure A20058003268400503
培养基中稀释的缀合物以62.5nM至500nM的终浓度范围添加至细胞。在500nM浓度，我们还在添加至清洗过的细胞之前与20％FBS组合。在37℃、5％CO2条件下转染细胞3小时。使用PBS清洗细胞，使用胰蛋白酶处理，然后通过流式细胞计量术分析。通过Cy5荧光的强度测量siRNA摄取，并通过添加碘化丙锭评估细胞活力。
如图1所示，肽/siRNA缀合物较肽/siRNA络合物获得小鼠尾巴成纤维细胞中更大百分比的摄取。另外，肽/siRNA缀合物较肽/siRNA络合物获得了更高的平均荧光强度(MFI；图2)。因此，这些数据表明，在某些实施方案中，使增强多核苷酸递送的多肽和siRNA分子缀合是合乎需要的。
实施例39L/LacZ细胞中siRNA摄取的siRNA/肽络合物的筛选
本发明提供了本发明的合理设计的增强多核苷酸递送的多肽当与siRNA络合时的广泛和不同装配增强siRNA摄取的另外的证据。
如实施例2所述，使用9L/lacZ细胞测定摄取。使用PBS清洗细胞，使用胰蛋白酶处理细胞，并然后通过流式细胞计量术进行分析。通过FAM荧光的强度测量siRNA摄取，并通过添加碘化丙锭评估细胞活力。下述表4总结了各种合理设计的增强多核苷酸递送的多肽于9L/LacZ细胞中的细胞摄取百分数数据。该表中还包括所使用的肽和siRNA的浓度。
表4：9L/LacZ细胞中由合理设计的增强多核苷酸递送的多肽介导的siRNA摄取效率
Figure A20058003268400511
Figure A20058003268400521
Figure A20058003268400531
实施例4增强多核苷酸递送的多肽增强体外siRNA/递送体外多肽
本实施例描述了本发明的增强多核苷酸递送的多肽增强siRNA在Lacz细胞，小鼠原代成纤维细胞和人单核细胞中的摄取。用于在9L/Lacz细胞和小鼠成纤维细胞进行的实验的材料和方法通常与上述相同，除了对于小鼠实验，使用小鼠尾成纤维细胞代替9L/Lacz细胞。使用小鼠尾成纤维细胞(MTF)进行的转染结果总结于表5中，显示了与缀合至siRNA分子的标签一起使用的肽和siRNA浓度。使用MTF和9L/LacZ细胞进行的转染结果总结于表6。表6提供的数据比较了不同细胞类型中一些肽/siRNA络合物的转染效率。
表5：合理设计的增强多核苷酸递送的多肽介导的小鼠尾成纤维细胞(MTF)细胞的siRNA摄取效率
名称 序列 情况 ％摄取 siRNA
 PN250   NH2-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-酰胺(SEQ IDNO：35) 0.5gM siRNA/40μM肽 85.9  Cv5-eGFP
 PN73   NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：59) 0.5μM siRNA/5μM肽 94.5  Cy5-eGFP
 PEG-PN509   Peg-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺 0.5μM siRNA/25gM肽 91  Cv5-eGFP
  (SEQ ID NO：90)
  PN404   NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-酰胺(SEQ ID NO：91)   0.5μM siRNA/25μM肽   50.4   Cy5-eGFP
  PN361   NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：58)   0.5μM siRNA/50μM肽   65   Cy5-eGFP
  PN27   AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQC(SEQ ID NO：38)   0.5μM siRNA/5μM肽   60.7   Cy5-eGFP
  PN58   NH2-RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺(SEQ ID NO：53)   1μM siRNA/20μM肽   3.7   Cy5-eGFP
  PN158   NH2-RVIRWFQNKRCKDKK酰胺(SEQ ID NO：67)   0.5μM siRNA/50nM肽   86.2   Cy5-eGFP
  PN316   马来酰亚胺-RVIRWFQNKRSKDKK-酰胺(SEQ ID NO：92)   0.5μM siRNA/100μM肽   84.8   Cy5-eGFP
  PN289   马来酰亚胺-WRFKQqQqQqQqQq-酰胺(SEQ IDNO：76)   0.5μM siRNA/10μM肽   7   Cy5-eGFP
  PN28   NH2-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-酰胺(SEQ IDNO：39)   1μMsiRNA/8μM肽   80.5   Cy5-eGFP
  PN173   GRKKRRQRRRPPQC(SEQ IDNO：36)   0.5μM siRNA/130nM肽   94.8   Cy5-eGFP
  PN159   KLALKLALKALKAALKLA-酰胺(SEQ ID NO：13)   0.5μM siRNA/5μM肽   0   Cy5-eGFP
  PN161   NH2-GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺(SEQ ID NO：93)   0.5μM siRNA/10nM肽   0   Cy5-eGFP
表6：LacZ细胞和小鼠尾成纤维细胞中由合理设计的增强多核苷酸递送的多肽介导的siRNA摄取的效率
Figure A20058003268400541
为进一步表征增强多核苷酸递送的多肽转染培养物中细胞的能力，使用络合有各种浓度PN73、PN250、PN182、PN58及PN158的FITC标记的siRNA培养人单核细胞。除LacZ和小鼠成纤维细胞外，还使用人成纤维细胞，这是因为它们是类风湿性关节炎治疗的靶细胞类型。
从健康供者的新鲜人血样品分离单核细胞，通过FACS分析纯度高于95％。
使用实施例2的操作使用Cy5-或FAM缀合的siRNA和肽转染单核细胞，通过细胞内Cy5或FAM荧光强度测定siRNA摄取。使用碘化丙锭(摄取)或锚定蛋白V-PE(染色)测定细胞活力。
图3描述了各种不同的增强多核苷酸递送的多肽增强培养物中人单核细胞的siRNA摄取的能力。lipofectamine的转染用作对照。还评估了各种肽的细胞活力。结果显示增强多核苷酸递送的多肽PN73是用于类风湿性关节炎治疗的候选序列。数据显示了令人吃惊和意想不到的发现，即PN73肽增强了人单核细胞对siRNA的高效和低毒性的摄取，表明其可用于体内类风湿性关节炎的治疗。
实施例5肽-siRNA缀合物增强的siRNA递送
本实施例提供了筛选结果，用于评价siRNA/增强多核苷酸递送的多肽缀合物诱导或增强9L/LacZ培养物细胞系和小鼠尾原代成纤维细胞中的siRNA摄取的活性。使用9L/LacZ细胞进行的转染结果总结于表7中。使用MTF进行的转染结果总结于表8中。
表7：合理设计的与siRNA缀合的增强多核苷酸递送的多肽介导的LacZ细胞的siRNA摄取效率
  缀合物   肽   siRNA   肽/siRNA浓度   摄取％
  CoP267nfR137-1   YRFK(SEQ IDNO：97)   FAM-β-半乳糖苷酶   检测达2.0μM   0
  CoP267nfR138-1   WRFK(SEQ IDNO：98)   FAM-β-半乳糖苷酶   0.8μM   0
  CoP267nfR138-1   (WRFK)2(SEQ IDNO：99)   FAM-β-半乳糖苷酶   0.8μM   0
  CoP267nfR164-1   Dmt-r-FK   FAM-β-半乳糖苷酶   检测达1.0μM   0
  CoP267nfR165-1   (YRFK)3(SEQ IDNO：100)   FAM-β-半乳糖苷酶   检测达1.0μM   0
  CoP267nfR165-1   WRFKKSKRKV(SEQID NO：101)   FAM-β-半乳糖苷酶   检测达1.0μM   0
  CoP267nfR167-1   PN73   FAM-β-半乳糖苷酶   1.0μM   42.9
  CoP267nfR167-2   PN73   FAM-β-半乳糖苷酶   2.0μM   55.4
表8：合理设计的与siRNA缀合的增强多核苷酸递送的多肽介导的小鼠尾成纤维细胞的siRNA摄取效率
名称 序列 siRNA 浓度 ％摄取
 Cy5-dsCoP278nfR270  马来酰亚胺-RRRQRRKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG-酰胺(SEQ ID NO：102) Cy5-eGFP  0.5μM  96.3
 dsCoP277nfR317  马来酰亚胺-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVL-酰胺(SEQ IDNO：103) Cy5-eGFP  4μM  83.5
 dsCoP275nfR321  马来酰亚胺-AAVALLPAVLLALLAPRKKRRQRRRPPQ-酰胺(SEQ ID NO：37) Cy5-eGFP  4μM  52.1
 dsCoP285nfR322-1  马来酰亚胺-Dmt-r-FKQqQqQqQqQq-酰胺(SEQ ID NO：74) Cy5-eGFP  4μM  41.3
 dsCoP236nfR332  马来酰亚胺-RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺(SEQ ID NO：52) Cy5-eGFP  4μM  36.3
 dsCoP317nfR320  马来酰亚胺-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-酰胺(SEQ ID NO：104) Cy5-eGFP  2μM  29.6
 dsCoP316nfR347  马来酰亚胺-RVIRWFQNKRSKDKK-酰胺(SEQ ID NO：92) Cy5-eGFP  2μM  17.1
 dsCoP289nfR268  马来酰亚胺-WRFKQqQqQqQqQq-酰胺(SEQ ID NO：76) Cy5-eGFP  4μM  3.2
 dsCoP276nfR319  马来酰亚胺-RKKRRQRRRPPQCAAVALLPAVLLALLAP-酰胺(SEQ ID NO：105) Cy5-eGFP  2μM  3.6
 dsCoP298cfR248  NH2-WRFKC-酰胺(SEQ ID NO：106) Cy5-eGFP  4μM  4.1
 dsCoP280nfR362-1  马来酰亚胺-GRKKRRQRRRPPQ-酰胺(SEQ ID NO：43) Cy5-eGFP  4μM  1.8
 dsCoP458nfR363-1  马来酰亚胺-KLALKLALKALKAALKLA-酰胺(SEQ ID NO：107) Cy5-eGFP  4μM  10.8
前述数据表明，本发明的不同装配的siRNA/肽可高效介导siRNA递送至不同细胞类型。
实施例6与siRNA络合的增强多核苷酸递送的多肽增强siRNA基因表达降低
本实施例显示了本发明的siRNA/增强多核苷酸递送的多肽络合物有效使靶基因表达降低。在本研究中，检测到肽/siRNA络合物调节人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)的表达，所述hTNF-α当在人和其他哺乳动物受治对象中过表达时，与介导类风湿性关节炎的发生和进展有关。
如实施例4所描述分离人单核细胞并进行转染。对于mRNA检测，根据制造厂家的说明使用Genospectra(CA)的分支DNA技术。使用脂多糖(LPS)处理的人单核细胞(CD 14+)在大约2小时内诱导TNF-α特异性，2小时之后为TNF-α的峰水平。通过使用Lipofectamine 2000使用siRNA候选序列筛选siRNA使基因表达降低的活性，使用LPS处理细胞，并于大约16小时之后测量TNF-α mRNA水平。筛选各种siRNA序列(表9)使TNF-αmRNA表达降低的活性及于活化的人原代单核细胞中的蛋白质水平。
为对细胞中的mRNA水平进行定量，同时测量了管家基因(cypB)和靶基因(TNF-α)mRNA。使用cypB对TNF-α的读数进行标准化，获得相对的发光单位。为了对蛋白质水平进行定量，根据制造厂家的说明使用来自BD Bioscience的TNF-α ELISA。
表9：靶向TNF-α的siRNA的名称、靶序列及寡序列
名称  替代名      靶序列     寡序列                 SEQ ID NO：
N125  TNF-α-1    516-534    GCGUGGAGCUGAGAGAUAA    109
N115  TNF-α-2    430-448    GCCUGUAGCCCAUGUUGUA    110
N132  TNF-α-3    738-756    GGUAUGAGCCCAUCUAUCU    111
N108  TNF-α-4    360-378    CCAGGGACCUCUCUCUAAU    112
N138  TNF-α-5    811-829    GCCCGACUAUCUCGACUUU    113
N113  TNF-α-6    424-442    UGACAAGCCUGUAGCCCAU    114
N143  TNF-α-7    844-862    GGUCUACUUUGGGAUCAUU    115
N107  TNF-α-8    359-377    CCCAGGGACCUCUCUCUAA    116
N137  LC1         806-828    AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU117
N122  LC2         514-532    AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU  118
N130  LC3         673-691    AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG  119
N101  LC4         177-195    AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA  120
N140  LC5         820-838    AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU  121
N135  LC6         781-799    AAGGGUGACCGACUCAGCGCU  122
N128  LC7         636-654    AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC  123
N127  LC8         612-630    AACCCAUGUGCUCCUCACCCA  124
N118  LC9         472-490    AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC  125
N111  LC10        398-416    AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA  126
N110  LC11        363-381    AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG  127
N105  LC12        265-287    CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA128
N104  LC13        264-282    AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU  129
N120  LC14        495-513    AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA  130
N153  LC16        1535-1555  CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA  131
N136  LC17        787-807    CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA  132
N152  LC18        1327-1347  CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA  133
N114  LC19        428-448    AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA  134
N145  LC20        982-1002   UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA  135
N101  YC-1        177-195    CUGAAAGCAUGAUCCGGGA    136
N103  YC-2        251-269    AGGCGGUGCUUGUUCCUCA    137
N106  YC-3        300-318    CCACCACGCUCUUCUGCCU    138
N109  YC-4        362-380    AGGGACCUCUCUCUAAUCA    139
N113  YC-5        424-442    UGACAAGCCUGUAGCCCAU    140
N115  YC-6        430-448    GCCUGUAGCCCAUGUUGUA    141
N117  YC-7        435-453    UAGCCCAUGUUGUAGCAAA    142
N120  YC-8        495-513    CCAAUGCCCUCCUGGCCAA    143
N121  YC-9        510-528    CCAAUGGCGUGGAGCUGAG    144
N123  YC-10       515-533    GGCGUGGAGCUGAGAGAUA    145
N125  YC-11       516-534    GCGUGGAGCUGAGAGAUAA    146
N126  YC-12       558-576    GCCUGUACCUCAUCUACUC    147
N130  YC-13       673-691    CCUCCUCUCUGCCAUCAAG    148
N132  YC-14       738-756    GGUAUGAGCCCAUCUAUCU    149
N133  YC-15       772-790    GCUGGAGAAGGGUGACCGA    150
N134  YC-16       776-794    GAGAAGGGUGACCGACUCA    151
N136  YC-17       787-807    GCCCGACUAUCUCGACUUU    152
N141  YC-18       841-859    GCAGGUCUACUUUGGGAUC    153
N143 YC-19    844-862      GGUCUACUUUGGGAUCAUU    154
N144 YC-20    853-871      UGGGAUCAUUGCCCUGUGA    155
N146 YC-21    985-1003     GGUCGGAACCCAAGCUUAG    156
N147 YC-22    1179-1197    CCAGAAUGCUGCAGGACUU    157
N148 YC-23    1198-1216    GAGAAGACCUCACCUAGAA    158
N149 YC-24    1200-1218    GAAGACCUCACCUAGAAAU    159
N150 YC-25    1250-1268    CCAGAUGUUUCCAGACUUC    160
N151 YC-26    1312-1330    CUAUUUAUGUUUGCACUUG    161
N154 YC-27    1547-1565    UCUAAACAAUGCUGAUUUG    162
N155 YC-28    1568-1585    GACCAACUGUCACUCAUU     163
表10、11及12描述了与本发明的增强多核苷酸递送的多肽络合的特异性寡序列靶向及人单核细胞中的TNF-α基因并使其表达水平降低的有效性。
表10：PN73/siRNA络合物介导的TNF-α表达降低百分比
Figure A20058003268400601
表11：PN509/siRNA络合物介导的TNF-α表达降低的百分数
Figure A20058003268400611
表12：PN250/siRNA络合物介导的TNF-α表达降低的百分数
代表性的一组siRNA序列的活性范围为从80％mRNA表达降低活性至无可检测的活性。通常，TNF-α蛋白水平降低超过mRNA水平，如TNF-αmRNA(TNF-α-1)表达降低50％导致TNF-α蛋白水平降低75％。获得了表现抑制水平为30％至60％的所选siRNA的反应曲线。计算得出的IC50值为10p摩尔至200p摩尔的范围。尽管所评估的siRNA序列分布于整个TNF-α转录物，所鉴定的最有效的siRNA位于两个区域：编码区的中部和3′-UTR。
前述结果(表10、11及12)表明，使用本发明的新型siRNA/增强多核苷酸递送的多肽组合物可获得哺乳动物细胞中有效水平的TNF-α基因表达抑制。
实施例7与siRNA缀合的增强多核苷酸递送的多肽增强siRNA基因表达抑制
本实施例显示了本发明的肽-siRNA缀合物对靶基因表达的抑制。这些研究的材料和方法同上述那些。该实施例的结构示于表13。
表13：使用和不使用lipofectamine的肽/siRNA-介导的TNF-α基因表达抑制
Figure A20058003268400631
Figure A20058003268400641
结果显示本发明的增强多核苷酸递送的多肽与siRNA缀合的不同装配具有增强哺乳动物受治对象siRNA介导的TNF基因表达的功能。
实施例8siRNA基因表达抑制的时间过程
本实施例提供了与siRNA介导的基因表达抑制的时间过程相关的研究。为检测siRNA作用的持续时间，进行如上所述的siRNA转染操作，除了使用来自eGFP表达小鼠的成纤维细胞。该处使用的转染试剂是lipofectamine。由于过度生长，于第18天细胞重复转染细胞。在第一次转染后第19天进行第二次转染。于转染后第19天检测eGFP水平。使用“零乱”或无义siRNA(Qiagen)及GFPI siRNA(GFPI)和发夹siRNA(D#21)作为对照。使用“零乱”siRNA(Qiagen对照)对抑制活性进行标准化。
表14：lipofectamine介导的siRNA转染对EGFP基因表达抑制的时间过程
第一次转染之后的天数     1     3     5     7     9     11     13     15     17
 Qiagen   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
 GFPI   27.61   60.87   64.75   58.40   56.72   40.46   35.56   16.59   15.50
 D#21   28.22   61.11   66.91   62.86   57.36   54.71   42.96   24.66   9.88
第一次转染之后的天数     19     20     21     25     27
 Qiagen   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
 GFPI   59.60   37.10   57.38   66.94   59.63
 D#21   46.36   35.89   65.25   74.15   58.39
前述研究(表14)证明了siRNA抑制活性在第3天左右明显，并持续至第9天，之后在第17天左右靶基因表达回复至基线水平。在第18天第二次转染之后，出现的eGFP表达又一次降低表明该试剂可重复施用于细胞以产生重复的或持久的基因表达抑制。
实施例9延长哺乳动物细胞中siRNA抑制效应的多次给药方案
本实施例证明了多次给药方案有效延长本发明siRNA/增强多核苷酸递送的多肽组合物介导的哺乳动物细胞的基因表达抑制效应。这些研究使用的材料和方法同上所述，除了在指定时间进行重复的转染。“零乱”siRNA(Qiagen)用于并列对照。表15总结了使用肽/siRNA络合物的多次转染数据。TNF-α基因的抑制活性百分数表示总的基因表达百分数。
表15：使用肽/siRNA络合物多次转染之后的TNF-α基因表达抑制活性
第1次转染之后的天数     4     5     6     7     8     9     10     11     12
单次 74.69  61.87  62.57  55.47  41.41  39.42  27.21
在第5天第二次  66.69  69.78  68.27  64.18  63.86  64.37  56.52
在第6天第二次  64.21  65.78  67.74  64.12  58.64  53.96
在第7天第二次  63.03  62.50  69.94  62.63  58.07
前述结果表明当适时进行多次转染时(在此情况，第一次转染之后约第5至7天)，哺乳动物细胞的TNF-α基因表达抑制效应可维持或再次诱导。
实施例10增强多核苷酸递送的多肽的最佳合理设计
本实施例提供了用于本发明最佳增强多核苷酸递送的多肽的典型设计和数据。对组蛋白H2B衍生的增强多核苷酸递送的多肽进行了主题合理设计操作。
为更好理解这种和其他增强多核苷酸递送的多肽的功能结构活性关系，通过对C末端和N末端功能及PN73和其他化学部分表征进行基本的结构研究。
下文显示了人组蛋白2B(H2B)蛋白的氨基酸序列。PN73、PN360及PN361是H2B的肽片段，并且它们代表的H2B蛋白的部分在下述肽名称之后的括弧中表示。对下述列出的PN360和PN361与可见于PN73的相应的氨基酸序列进行了比对。PN73肽片段在H2B氨基酸序列中标有下划线，并表示H2B的13至48的氨基酸。其还可以通过H2B的12至48的氨基酸表示。PN360与PN73共有N末端，但缺少PN73的C末端，而PN361与PN73共有C末端，但缺少PN73的N末端。PN73缀合物中，PN73与siRNA单链(如有义链)共价连接。PN404是PN73的一个版本，其中所有赖氨酸被精氨酸取代，并且PN509是在N末端被聚乙二醇化的聚乙二醇化PN73衍生物(PEG分子量1k道尔顿)。
H2B(组蛋白2B)氨基酸序列
MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDSKKRKRSRKESYSVYVYKVLKV
HPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAV RL
LLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK(SEQ ID NO：164)
PN73(13-48)
NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-amide(SEQ ID NO：59)
PN360(13-35；PN73的N末端)
NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK-amide(SEQ ID NO：57)
PN361(24-48；PN73的C末端)
NH2-KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：58)
PN73(13-48)-siRNA(有义链)缀合物
siRNA-KGSKXAVTKAQKKTJGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO 59)
PN404(其中所有赖氨酸被精氨酸取代的PN73)
NH2-RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-酰胺(SEQ ID NO：91)
PN509(聚乙二醇化的PN73)
PEG-RGSREAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ-酰胺(SEQ ID NO：59)。
图5提供了前述PN73合理设计的衍生的增强多核苷酸递送的多肽在小鼠尾成纤维细胞的摄取效率和活力研究的结果。描述了小鼠尾成纤维细胞中修饰的PN73的活性改变。与PN404不同，PN509增加摄取但不增强毒性。尽管去除PN73的N末端的部分降低活性，但C末端的去除消除了活性。PN73和PN509均显示在原代细胞中比Lipofectamine(Invitrogen，加拿大)具有更高的活性。
实施例11乙酰化的增强多核苷酸递送的多肽增加siRNA的稳定性
本实施例的目的是确定是否典型的增强多核苷酸递送的多肽PN73的修饰会提供给所述肽增加的稳定性，并因此提高其转染活性。对血浆中未修饰的、N末端聚乙二醇化和N末端乙酰化形式的PN73进行了对比。对PN73的C末端进行了酰胺化。尺寸排阻层析结合紫外线检测器用于对在血浆中培育之前和之后的未修饰和修饰形式的PN73的稳定性进行表征。
在无血浆的情况中，在大约9分钟，未修饰的、聚乙二醇化和乙酰化形式的PN73显示不同的但重叠的紫外示踪。然而，在暴露于血浆4小时之后，未修饰的PN73和聚乙二醇化的PN73的特异性紫外示踪不再表现明显的衰减。相比之下，乙酰化的PN73的不同的紫外示踪仍表明，与未修饰的和聚乙二醇化的PN73形式相比，该修饰显著增加血浆中PN73的稳定性。
这些数据显示了令人吃惊和意想不到的发现，即通过PN73肽的N末端乙酰化可增强血浆中PN73的稳定性。乙酰化的PN73肽的基本结构如下所述：Ac-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQ ID NO：59)。
实施例14增强多核苷酸递送的多肽不引发干扰素反应
本实施例的目的是对使用lipofectamine和siRNA或典型的增强多核苷酸递送的多肽-PN73肽和siRNA转染的细胞的干扰素反应进行比较。通过ELISA(蛋白质)和bDNA(mRNA水平)测定干扰素反应。
传统上，通过脂质体介导的转染将siRNA分子递送至细胞内。然而，这通常导致递送效率低，体内炎症反应以及引起细胞生长抑制的干扰素基因表达上调。因此，靶基因表达水平有限降低，由此使siRNA成为无效的治疗方法和研究基因表达的工具。通过PN73对siRNA的递送克服了这个问题。
对lipofectamine和PN73在几种不同的siRNA的转染中的干扰素反应性进行了对比。使siRNA在1nM、10nM、100nM或200nM的浓度与lipofectamine或PN73络合。白介素-1β(IL-1β)作为分子标记物用于确定干扰素反应性，Qneg用作阴性对照。结果显示与100nM或200nM TNF-α9siRNA络合的lipofectamine引起IL-1βm RNA水平显著增加。另外，所有其他检测的siRNA引起IL-1β mRNA水平轻度增加。相比之下，与PN73络合的siRNA没有引起IL-1β mRNA水平的增加。
为进一步表征使用lipofectamine和PN73转染的细胞之间观察的干扰素反应性的不同，进行ELISA分析来测定下述分子标记的蛋白质表达水平：白介素-1β(IL-1β)、干扰素-α(INF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)、单核细胞炎性蛋白-1α、干扰素-γ(IFN-γ)，以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。表16总结了使用与siRNA络合的lipofectamine或使用siRNA络合的PN73转染的细胞的相对蛋白质表达水平。
表16：干扰素反应性的分子标记物的相对蛋白质表达水平
lipofectamine转染                                PN73转染
干扰素      IFN-1   LC17     LC20     TNF-α9    所有检测的siRNA
            siRNA   siRNA    siRNA    siRNA
反应标记物
IL-1β      ++      -        -        +          -
INF-α      背景    背景    背景     背景       背景
IL-6        ++      -        -        +          -
IL-8         -      -        -        -          -
IL-12      背景  背景    背景    背景    背景
MIP-1α    +++    -       -      ++       -
IFN-γ     背景  背景    背景    背景    背景
TNF-α     +      -       -      -        -
结果显示，不管使用何种转染试剂，siRNA LC20和LC 17均无干扰素反应。然而，使用lipofectamine的IFN-1或TNF-α9转染引起IL-1β、IL-6和MIP-1α的蛋白质表达水平增加。相比之下，所有检测的siRNA与PN73的转染没有引起任何所检测的干扰素反应标记物的蛋白质表达的可观察诱导。
这些来自ELISA分析的数据显示了令人吃惊的和意想不到的发现，PN73介导的siRNA转染不会引起干扰素反应。
实施例15与增强多核苷酸递送的多肽缀合的siRNA较与多核苷酸络合的siRNA提供了更大的抑制活性
本实施例的目的是对与增强典型多核苷酸递送的多肽PN73缀合或络合的siRNA LC13和LC20对人单核细胞的抑制活性进行比较。人单核细胞的分离和转染以及检测抑制活性的方法先前已讨论。Qneg表示随机的siRNA序列，其作用是在这些实验中作为阴性对照。将所观察到的Qneg抑制活性标准化至100％(100％基因表达水平)，LC20和LC13的活性表示为阴性对照的相对百分数。LC20和LC13为靶向人TNF-α基因的siRNA。检测到无PN73、在与PN73的络合物或与PN73的缀合物中的siRNA LC20和LC13的抑制活性超过0nM至2.5nM的浓度范围。在络合物和缀合物实验中，PN73保持在1∶1比例。
在无PN73的情况下，LC13和L20显示了很小的抑制活性(图6-C)。LC13和LC20当与PN73络合时，相对于Qneg对照，会引起TNF-α基因表达水平大约15％和30％减少(图6-B)。然而，当siRNA与PN73缀合时(图6-A)，对TNF-α的抑制活性降低至低于60％。与PN73/siRNA络合物比较，这显著增加了siRNA抑制活性。因此，这些数据显示了令人吃惊和意想不到的发现，即当siRNA与典型的增强多核苷酸递送的多肽缀合时，显著提高siRNA抑制活性。
实施例16典型的增强多核苷酸递送的多肽的缺失分析
本实施例的目的是测定PN73肽的最小长度，所述最小长度对PN73肽增强小分子和大分子递送至细胞内的能力是关键的。如表17所示，通过从所述肽的N末端一次使3个残基缺失制造10种截短形式的PN73。下述是PN73的基本结构和待检测转染活性的截短形式。该实施例中所有检测的肽使用C末端FITC(荧光素-5-异硫氰酸酯)标记物(即-GK[EPSILON]G-酰胺)。
表17
PN643或PN73(13-48) KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ
ID NO：59)
PN661(16-48)       KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVKVLKQ(SEQ
ID NO：165)
PN685PN685((19-48) VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID
NO：166)
PN660(22-48)       AQKKDGKKRKHSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：167)
PN735(25-48)       KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVL KQ(SEQ ID NO：168)
PN655(28-48)       KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：169)
PN654(31-48)       KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：170)
PN708(34-48)       RKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：171)
PN653(37-48)       SYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：172)
PN652(40-48)       VYVYKVLKQ(SEQ ID NO：173)
PN65(43-48)        YKVLKQ(SEQ ID NO：174)
实施例17体内siRNA介导的基因表达抑制活性
A.eGFP小鼠
20-25g体重的eGFP转基因小鼠购自Jackson实验室。对于siRNA注射，以5mg/kg的剂量按1∶5比例的siRNA/PN73使用siRNA。所有处理均通过尾静脉注射，一天一次，持续三天。在第4天采集组织。于R&R Rabbitary(Standwood，WA)实施实验方案，并且所述实验方案由实验动物管理与使用委员会(IACUC)批准。
将动物组织立即放置于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，并于冰上储存。对于从组织分离细胞，将样品组织放置于两片霜覆盖的玻璃载玻片之间，霜覆盖面面对组织。将组织涂在一起，碎化几次。然后，自载玻片冲洗碎化的组织至具有PBS的12孔培养板的微孔中。将1ml碎化的组织转移至含有1ml 2X胶原蛋白酶(I型用于肌肉，II型用于肝组织)的12孔培养板中；终浓度是100单位/ml。于37℃使用胶原蛋白酶溶液培育组织3小时；为去除碎片和结缔组织，通过细胞过滤网将消化的组织过滤至6孔培养板。将500ul细胞转移至标记的FACS管。通过流式细胞计量术测定分离细胞的荧光强度。
化学合成特异性针对eGFP的双链siRNA，于PBS缓冲液或盐缓冲液或葡萄糖缓冲液溶解siRNA。
按表1标明的各种剂量和持续时间静脉注射三组动物(仅特异性eGFPsiRNA，肽/eGFP siRNA络合物及对照的siRNA/肽络合物)。通过眶出血取处理小鼠的外周血，并在抗凝剂的存在下将其储存于冰上。通过基于聚蔗糖(Ficoll)的离心方法分离PBMC。通过流式细胞计量术测定细胞的eGFP荧光强度评价抑制活性。
EGFP转基因动物中肌肉细胞的eGFP蛋白的减少
使用eGFP转基因小鼠的siRNA与肽PN73的络合物(1∶5比例)处理eGFP转基因小鼠(5mg/kg，连续三天)。对于抑制活性的测定，使用如方法部分提到的胶原蛋白酶处理之后，从肌肉组织分离细胞。通过流式细胞计量术分析分离细胞的荧光强度。
与对照siRNA和仅GFP siRNA比较，在连续三天注射后，GFPsiRNA/PN509(聚乙二醇化的PN73)络合物显示了体内的有效EGFP抑制。
EGFP转基因动物肝细胞中eGFP蛋白和mRNA的减少
使用eGFP转基因小鼠的siRNA与肽PN73的络合物(1∶5比例)处理eGFP转基因小鼠(5mg/kg，连续三天)。对于抑制活性的测定，使用如方法部分提到的胶原蛋白酶处理之后，从肝组织分离细胞。通过流式细胞计量术分析分离细胞的荧光强度。
与对照siRNA/PN602和仅GFP siRNA比较，在连续三天注射后，GFPsiRNA/PN509(聚乙二醇化的PN73)络合物显示了体内的有效EGFP抑制。
eGFP mRNA的抑制总结于表18中。对蛋白质表达的抑制是相当的。
表18
Figure A20058003268400731
递送肽可在体内有效递送siRNA并抑制PBMC的eGFP(达50％)。与阴性对照比较，裸siRNA还显示抑制eGFP的某些活性，但效率小得多。
B.Taconic小鼠
对于人类TNF-α动物疾病模型，使用两种转基因动物模型。从PasteurHellenic Institute(雅典，希腊)获得tg197小鼠，并从Taconic公司(Germantown，纽约州)购买B6.SJL-Tg(TNF)N21小鼠。两种人TNF-α转基因小鼠模型的基因型均由供应者制备。对于tg197小鼠，将6周大的小鼠分成英夫利昔单抗、siRNA/PN73络合物和盐水三组处理组。基于TNF-α中和抗体的药物-英夫利昔单抗购自当地的药店(如类克)，并以10mg/kg的剂量使用，一周一次。按1∶5比例的siRNA/PN73以2mg/kg的剂量使用siRNA。所有处理均通过尾静脉注射，一周两次。于SkeleTech公司(Bothell，华盛顿州)实施实验方案，并且所述实验方案由实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准。相似的剂量方案用于B6.SJL-Tg(TNF)N21小鼠。临床评分基于下述先前描述的评分系统(2，3)：0(正常)，1(浮肿或爪或踝关节变形)，2(爪或踝关节变形)，或3(腕关节或踝关节强直)。所有四个爪的总分均每周评分两次，每只小鼠最大评分为12。
为测定TNF-α的水平，及进行转基因小鼠有关的实验分析，从通过眼眶出血收集的全血分离血浆样品。根据制造厂家的说明(R&D系统，Minneapolis，MN)通过ELISA以1∶2稀释测定hTNF-α的血浆水平。
bDNA分析(加拿大Fremont的Genospectra的Quantigene分析)按照制造厂家的说明进行。
使用siRNA/PN73络合物或英夫利昔单抗处理之后转基因小鼠的人TNF-α血浆蛋白质水平和RA评分的减小
使用针对TNF-α的英夫利昔单抗(10μg/kg，腹膜内注射)和siRNA与肽PN73的络合物(1∶5比例)(2mg/kg，静脉注射，一周两次)处理5周龄人TNF-α转基因小鼠。对于Hellenic转基因小鼠，使用下述标准确定RA评分(对处理盲知)：0，正常；1，浮肿或爪或踝关节变形；2，爪或踝关节变形；或3，腕关节或踝关节强直。
在三周的处理期间，LC20/PN73处理组显示了关节炎临床进展的显著抑制。
在使用siRNA/PN73络合物或英夫利昔单抗处理之后人TNF-α血浆蛋白质水平减小
对于Taconic小鼠，通过ELISA(R & D系统，Minneapolis，明尼苏达州)测定血浆中TNF-α的水平，并且处理时间安排与Hellenic转基因hTNF-α转基因小鼠相同。
C.Helenic小鼠
本实施例提供了体内实验数据，所述实验数据显示了本发明的siRNA/增强多核苷酸递送的多肽组合物介导全身递送和siRNA以治疗方式有效调节靶基因表达和改变细胞表型的功效。
5周龄的人TNF-α表达小鼠购自Hellenic Pasture Institute，Greece。通过静脉内(IV)一周2次给予小鼠(4只小鼠)300μl盐水，或一周一次给予小鼠(2只小鼠)类风湿性关节炎药类克(5mg/kg)，或一周两次给予小鼠(2只小鼠)以1∶5摩尔比与PN73混合的LC20 siRNA(2mg/kg)。在注射期间，收集用于ELISA检测(R&D系统，Cat#SSTA00C)的血浆样品，并且每周进行两次爪评分作为类风湿性关节炎疾病进展和治疗效果的可接受标准(表19)。
表19 ELISA测定的血浆中TNF-α蛋白质的量
周龄     7     8     9
类克     102.24     39.27     25.80
LC20/PN73     25.96     21.89     14.21
盐水     33.78     34.29     24.48
*这些数据以pg/ml表示实验小鼠的平均值。
前述结果显示肽/siRNA处理的小鼠循环血液中的TNF-α蛋白水平较类克或盐水(对照)处理小鼠相比减小。
使用爪评分-可接受的类风湿性关节炎疾病状况和治疗效果的表型标准，从上述小鼠受治对象获得了本发明的siRNA/增强多核苷酸递送的多肽组合物的体内效果的其他证据。由于起点的差异(对某些动物在较早起点进行评分)，对所有用于实验的动物调整其评分至0。根据下述评分标准，对每个爪给予0-3的评分，最高评分是12：0，正常；1，浮肿或爪或踝关节变形；2，爪或踝关节变形；3，腕关节或踝关节强直。
这些爪评分的结果在图4中图示提供。数据显示，增强多核苷酸递送的多肽PN73当被注射给动物时可递送治疗量的siRNA(如LC20、TNF-α2及TNF-α9(UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ ID NO.175))，如显示的在第8周延迟的RA进展。在第8周，根据爪评分标准，PN73/siRNA处理的小鼠与类克处理的小鼠相比具有更好的状况。当爪评分评估进行到处理后11周，PN73/LC20络合物获得了对类克处理的小鼠的可比爪评分评估。在1∶5比例的PN73肽/LC20 siRNA，2mg/kg LC20与较低剂量的检测的LC20相比获得了类风湿性关节炎进展的最大相对的可观察到的延迟。下列表20总结了几种siRNA的相对效果(在使用PN73和siRNA处理之后对5个不同组评估)。
表20：组总结
组标记    处理*                     siRNA的相对效果
TNF#1     LC20、类克、PBS           LC20与类克具有相同效果
TNF#4     LC20和LC13                总体的低爪评分
TNF#5     与PN73缀合的LC20          总体的低爪评分；缀合物活性比络合物低
TNF#6     LC20、YC12和LC17          总体的低爪评分；YC12和
                                    LC17不如LC20有效
TNF#7     LC20、TNF-α2及TNF-α9    于第8周LC20和TNF-α9较类克更有效；
                                    于第11周LC20具有与类克相同的效果
*在存在或不存在PN73的情况下，检测siRNA；类克是阳性处理对照；
PBS是阴性处理对照。
前述结果显示本发明的siRNA和增强多核苷酸递送的多肽的组合物提供了用于调节基因表达和治疗和管理疾病的具有前景的新型治疗工具。本发明的siRNA，例如靶向降解人TNF-α特异性mRNA的siRNA提供了较当前用于类风湿性关节炎的小分子、可溶性受体或抗体治疗更高的特异性、较低的免疫原性及较大的疾病改变。筛选了靶向hTNF-α并单次给药抑制30-85％的超过50种候选siRNA序列。对超过20种于电脑上研究的肽络合物和/或共价分子比较单核细胞的荧光RNA摄取，并发现其中一些较lipofectamine或胆固醇缀合的siRNA具有更好的摄取，IC50值＜10pM。在体外，肽-siRNA制剂有效抑制活化的人单核细胞中的TNF-αmRNA和蛋白质水平。
对一种典型的候选递送肽/siRNA制剂评价类风湿性关节炎的两个转基因动物模型的组成性表达的人TNF-α。与对照(其中爪和关节炎症持续至第10周)相比，于6周龄时通过静脉注射2mg/kg siRNA或英夫利昔单抗一周两次处理的动物，显示了类风湿性关节炎评分的稳定(爪和关节炎症)。在9周龄时，siRNA处理的动物显示了类风湿性关节炎评分的可比的减小，但较英夫利昔单抗处理的动物相比显著降低了血浆TNF-α蛋白质水平。
根据本文的公开内容，使用siRNA抑制靶基因(例如在病理状态如炎症中起重要作用的细胞因子如TNF-α)的表达，提供了缓解或预防哺乳动物受治对象的疾病如类风湿性关节炎有效治疗方法。用于本发明的方法和组合物的典型肽/siRNA组合物提供了与其减轻或消除靶基因表达如TNF-α表达非通过与靶基因的产物如TNF-α络合的能力有关的优点，如在抗体或可溶性受体的情况。
根据本发明的教导改进核酸的全身递送还提供了siRNA作为药物开发的另外的优点。在本上下文中，特异性的攻击包括穿过组织屏障递送至靶细胞或组织，并维持siRNA的稳定性，细胞内递送导致siRNA以有效的足够量穿过细胞膜至细胞。本发明的公开内容首次证明了含有靶向特异性基因表达如人TNF-α的新型肽/siRNA组合物的有效体内递送系统，其可减轻提示靶疾病的转基因动物的疾病活动，例如使用类风湿性关节的小鼠模型的研究。在相关的研究中，本发明的组合物和方法有效抑制类风湿性关节炎患者的活化的单核细胞中的TNF-α表达。这些结果表明RNAi途径通过对TNF途径的细胞内作用有效调节细胞表型的改变及疾病进展，并避免由于具有残留的免疫反应性的循环抗体/TNF-α复合物的毒性作用(此为目前用于类风湿性关节炎的抗体治疗的特征)。所有本文的实验均以具有最小的相关毒性而被实施，这样在这些实施例中所展示的siRNA和增强多核苷酸递送的多肽的剂量总是与细胞活力水平具有至少80-90％或更大的相关性。
D.小鼠脂多糖LPS反应
使用多种浓度的LPS通过腹膜内或静脉内注射处理正常(小鼠类型)小鼠。通过检测在LPS注射之后多次取样的血TNF-α水平确定LPS反应性。发现TNF-α的线性范围为通过LPS的腹膜内注射在10ng和100ng之间，通过静脉注射达25ng。最大的TNF-α诱导的平均时间为LPS注射后70分钟。根据这些结果，选择下述的剂量进行进一步的实验：25ng，腹膜内注射；10ng，静脉给药。
通过下述方法检测siRNA对TNF-α的LPS诱导作用：即使用(1)LC13/PN73、(2)仅LC13、(3)Qneg/PN73、(4)PN73、(5)仅缓冲液的2mg/kgsiRNA剂量注射，每次处理6只小鼠。在最后一次siRNA注射之后24小时进行LPS诱导，在LPS注射后90分钟收集0.2ug LPS和血。结果显示
LC13(样品1和2)较之阴性对照(样品3-5)可降低LPS诱导产生的循环TNF-α的量。
使用下述组合物的2mg/kg siRNA剂量使用第二种实验方法：(1)LC13/PN73；(2)Inm-2/PN73；(3)Inm-4/PN73；(4)Qneg/PN73；及(5)PBS(缓冲液对照)。三种研究的30只动物每次按下述时间安排进行给药：连续4天；连续8天；连续11天。在siRNA注射之后24小时进行LPS诱导，25ngLPS腹膜内注射。在LPS注射后70分钟取血。结果显示，在连续4天的实验中(n＝1检验)，与LC13、Inm-2及Qneg相比，Inm-4显示了最大的抑制活性。部分由于重复尾注射的技术问题，8天和11天的检测结果给出了可变的结果。
尽管为了清楚理解的目的，通过实例详细描述了前述发明，对技术人员来说显而易见的是，在通过说明而非限制提供的附属权利要求的范围内，可进行一些改变和修改。在本文中，在为描述的经济起见，在前述的公开内容中，已引用了多个公开和其他参考文献。为了所有目的，这些参考文献中的每一个均通过引用完整并入本文。然而，应该注意，在本申请递交日期之前，本文讨论的多个公开的公开内容各自单独并入本文，并且发明人保留根据早先的发明提早公开本发明的权利。
序列表
<110>崔坤元
陈力山
陈郁静
<120>使用双链核糖核酸治疗炎性疾病的方法
<130>04-17PCT
<150>11/121,566
<151>2005-05-04
<150>60/613,416
<151>2004-09-27
<150>60/656,572
<151>2005-02-25
<150>60/667,833
<151>2005-04-01
<160>163
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>1型人免疫缺陷病毒
<400>1
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
  1                 5
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物说明：穿透肽PTD
<400>2
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
  1                   5                     10                  15
<210>3
<211>34
<212>PRT
<213>1型疱疹病毒
<400>3
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
  1                  5                      10                  15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
               20                      25                      30
Val Asp
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>4
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                  15
<210>5
<211>16
<212>PRT
<213>人
<400>5
Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
  1                  5                      10                  15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人
<400>6
Val Thr Val Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly
  1                  5                     10                    15
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>1型人免疫缺陷病毒
<400>7
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
  1                 5                      10                    15
Ala
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>凯门鳄
<400>8
Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly
  1                 5                      10                    15
Ala
<210>9
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的hCT衍生的肽
<400>9
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
  1                  5                     10                    15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
                20
<210>10
<211>26
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物说明：运输肽
<400>10
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys
  1                 5                      10                     15
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
               20                      25
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物说明：寡聚肽
<400>11
Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Lys
  1                  5                      10                    15
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物说明：精氨酸肽
<400>12
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
  1                 5
<210>13
<211>18
<212>PRT
<213>未知生物
<220>
<223>未知生物说明：两亲模型肽
<400>13
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
  1                 5                     10                      15
Leu Ala
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>A型流感病毒
<400>14
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
  1                  5                      10                    15
<210>15
<211>16
<212>PRT
<213>1型人副流感病毒
<400>15
Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala
  1                   5                      10                   15
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>呼吸道合胞病毒
<400>16
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val
  1                 5                     10                        15
<210>17
<211>16
<212>PRT
<213>1型人免疫缺陷病毒
<400>17
Gly Val Phe Val Leu Gly Phe Leu Gly Phe Leu Ala Thr Ala Gly Ser
  1                  5                    10                        15
<210>18
<211>16
<212>PRT
<213>埃博拉病毒
<400>18
Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala
  1                   5                      10                     15
<210>19
<211>56
<212>PRT
<213>人
<400>19
Ala Cys Thr Cys Pro Tyr Cys Lys Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ser Gly
  1                  5                    10                        15
Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly
                   20                  25                       30
Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His
               35                  40                     45
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys
    50          55
<210>20
<211>54
<212>PRT
<213>人
<400>20
Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Asp Gly Glu Lys Arg Ser Gly Glu
  1                  5                    10                      15
Gln Gly Lys Lys Lys His Val Cys His Ile Pro Asp Cys Gly Lys Thr
               20                       25                    30
Phe Arg Lys Thr Ser Leu Leu Arg Ala His Val Arg Leu His Thr Gly
          35                       40                    45
Glu Arg Pro Phe Val Cys
     50
<210>21
<211>55
<212>PRT
<213>人
<400>21
Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Glu Gly Gly Gly Arg Gly Thr Asn
  1                  5                    10                      15
Leu Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Pro Gly Cys Gly Lys
              20                      25                      30
Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Ser
          35                      40                      45
Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys
      50                      55
<210>22
<211>56
<212>PRT
<213>人
<400>22
Ala Cys Ser Cys Pro Asn Cys Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Ser Asn
  1                  5                    10                      15
Glu Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Glu Gly Cys Gly
              20                      25                      30
Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His
          35                      40                      45
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Ile Cys
      50                     55
<210>23
<211>60
<212>PRT
<213>果蝇
<400>23
Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Thr Asn Glu Met Ser Gly Leu Pro Pro
  1                  5                   10                      15
Ile Val Gly Pro Asp Glu Arg Gly Arg Lys Gln His Ile Cys His Ile
                20                     25                       30
Pro Gly Cys Glu Arg Leu Tyr Gly Lys Ala Ser His Leu Lys Thr His
          35                     40                      45
Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Leu Cys
     50                      55                     60
<210>24
<211>58
<212>PRT
<213>果蝇
<400>24
Thr Cys Asp Cys Pro Asn Cys Gln Glu Ala Glu Arg Leu Gly Pro Ala
  1                 5                     10                     15
Gly Val His Leu Arg Lys Lys Asn Ile His Ser Cys His Ile Pro Gly
               20                      25                      30
Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg
          35                      40                     45
Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys
      50                     55
<210>25
<211>53
<212>PRT
<213>秀丽隐杆线虫
<400>25
Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Ala Ile Lys His Gly Asp Arg Gly
  1                 5                       10                   15
Ser Gln His Thr His Leu Cys Ser Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Tyr
               20                      25                      30
Lys Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Lys His Thr Gly Asp
          35                      40                      45
Arg Pro Phe Val Cys
      50
<210>26
<211>56
<212>PRT
<213>秀丽隐杆线虫
<400>26
Pro Gln Ile Ser Leu Lys Lys Lys Ile Phe Phe Phe Ile Phe Ser Asn
  1                   5                      10                   15
Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ser Arg Ile His Ile Cys His Leu Cys Asn
              20                       25                     30
Lys Thr Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Gly His
          35                       40                    45
Ala Gly Asn Lys Pro Phe Ala Cys
      50                     55
<210>27
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>27
Trp Trp Glu Thr Trp Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn
  1                  5                     10                      15
Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg
               20                      25                    30
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>28
Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
  1                  5                      10                     15
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>29
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
  1                   5                     10                      15
<210>30
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>30
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys
  1                  5                     10                     15
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys Lys Arg Arg
                   20                 25                     30
Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
           35
<210>31
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>31
Gly Glu Gln Ile Ala Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Ile Asp Ile Ile Leu
  1                  5                       10                  15
Lys Lys Lys Lys Ser Lys
               20
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子说明：合成的寡核苷酸
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>32
cuacacaaau cagcgauuut t                             21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子说明：合成的寡核苷酸
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>33
aaaucgcuga uuuguguagt t                             21
<210>34
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>34
gcaagcugac ccugaaguuc au                            22
<210>35
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>35
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp
  1                 5                     10                     15
Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly
               20                       25
<210>36
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>36
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys
  1                  5                    10
<210>37
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Ala
<400>37
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                    15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
               20                    25
<210>38
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>38
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                   15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys
               20                  25
<210>39
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>39
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Ala Ala Val
  1                  5                     10                   15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
               20                      25
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>BrAc-Gly
<400>40
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln
  1                  5                     10
<210>41
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>BrAc-Arg
<400>41
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp
  1                 5                     10                    15
Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly
               20                       25
<210>42
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>42
Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Tyr Gly Arg
  1                  5                    10                      15
Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly
              20                    25
<210>43
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Gly
<400>43
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
  1                 5                     10
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>44
Lys Leu Trp Lys Ala Trp Pro Lys Leu Trp Lys Lys Leu Trp Lys Pro
  1                  5                      10                     15
<210>45
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>45
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                    15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
               20
<210>46
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>46
Arg Leu Trp Arg Ala Leu Pro Arg Val Leu Arg Arg Leu Leu Arg Pro
  1                  5                     10                   15
<210>47
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>47
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                  15
Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val
               20                     25
<210>48
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Ala
<400>48
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                  15
Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val
                20                    25
<210>49
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>49
Ser Gly Ala Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val Ala Ala Val Ala
  1                  5                      10                   15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
               20                      25
<210>50
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>50
Leu Leu Glu Thr Leu Leu Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg
  1                 5                    10                      15
Asn Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg
              20                      25                     30
Arg
<210>51
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>51
Ala Ala Val Ala Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn Phe Ser Thr Arg Gln
  1                  5                      10                   15
Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg Arg
               20                     25
<210>52
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Arg
<400>52
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
  1                    5                    10                 15
<210>53
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>53
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
  1                   5                     10                  15
<210>54
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>54
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
  1                   5                     10                  15
Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly
               20                      25                      30
Phe Leu Gly
          35
<210>55
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰胺-Ser
<400>55
Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr
  1                  5                      10                  15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg
               20                      25                      30
Leu Leu Arg Lys Gly
         35
<210>56
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>56
Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys Thr
  1                  5                     10                     15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg
               20                      25                      30
Leu Leu Arg Lys Gly Cys
35
<210>57
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>57
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
  1                  5                      10                      15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys
               20
<210>58
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>58
Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser
  1                  5                     10                    15
Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
                20                     25
<210>59
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>59
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
  1                  5                      10                    15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
               20                      25                       30
Val Leu Lys Gln
           35
<210>60
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>BrAc-Gly
<400>60
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
  1                 5                      10                    15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
               20                      25
<210>61
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>BrAc-Lys
<400>61
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
  1                  5                     10                      15
Leu Ala
<210>62
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Ac-Lys
<400>62
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
  1                  5                      10                      15
Lys Lys Arg Lys Val
                20
<210>63
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>63
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Gly
  1                  5                      10                      15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
               20                      25
<210>64
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>BrAc-Arg
<400>64
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
  1                 5
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)
<223>D-Gln
<400>65
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
  1                 5                     10
<210>66
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(15)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(17)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(19)
<223>D-Gln
<400>66
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Gln Gln Gln Gln Gln Gln
  1                 5                     10                     15
Gln Gln Gln Gln
              20
<210>67
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>67
Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
  1                   5                     10                15
<210>68
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Ac-Leu
<400>68
Leu Gly Leu Leu Leu Arg His Leu Arg His His Ser Asn Leu Leu Ala
  1                 5                     10                       15
Asn Ile
<210>69
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>69
Gly Gln Met Ser Glu Ile Glu Ala Lys Val Arg Thr Val Lys Leu Ala
  1                  5                      10                    15
Arg Ser
<210>70
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>70
Lys Leu Trp Ser Ala Trp Pro Ser Leu Trp Ser Ser Leu Trp Lys Pro
  1                  5                       10                    15
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>71
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
  1                  5
<210>72
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>72
Ala Ala Arg Leu His Arg Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Ser Thr Glu
  1                  5                     10                    15
Met Arg Arg Arg Arg
              20
<210>73
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Gly
<400>73
Gly Leu Gly Ser Leu Leu Lys Lys Ala Gly Lys Lys Leu Lys Gln Pro
  1                  5                    10                        15
Lys Ser Lys Arg Lys Val
                20
<210>74
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Dmt-r-Phe
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(12)
<223>D-Gln
<400>74
Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
  1                 5                     10
<210>75
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Trp
<400>75
Trp Arg Phe Lys
  1
<210>76
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Trp
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(12)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(14)
<223>D-Gln
<400>76
Trp Arg Phe Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
  1                 5                      10
<210>77
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Tyr
<400>77
Tyr Arg Phe Lys
  1
<210>78
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Tyr
<400>78
Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys
  1                  5                      10
<210>79
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Trp
<400>79
Trp Arg Phe Lys Lys Ser Lys Arg Lys Val
  1                  5                      10
<210>80
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Trp
<400>80
Trp Arg Phe Lys Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala
  1                  5                      10                    15
Leu Leu Ala Pro
              20
<210>81
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>二甲基化的Tyr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>D-Arg
<400>81
Tyr Arg Phe Lys
  1
<210>82
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>D-Arg
<400>82
Tyr Arg Phe Lys
  1
<210>83
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>二甲基化的Tyr
<400>83
Tyr Arg Phe Lys
  1
<210>84
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>D-Arg
<400>84
Trp Arg Phe Lys
  1
<210>85
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>二甲基化的Tyr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)
<223>D-Arg
<400>85
Tyr Arg Trp Lys
  1
<210>86
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)
<223>D-Arg
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)
<223>二甲基化的Tyr
<400>86
Lys Phe Arg Tyr
  1
<210>87
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Trp
<400>87
Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys
  1                  5
<210>88
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Trp
<400>88
Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys
  1                  5                     10
<210>89
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>89
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Ala Ala Val Ala
  1                 5                       10                     15
Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
               20                      25
<210>90
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>Peg-Lys
<400>90
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
  1                  5                      10                   15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
               20                      25                      30
Val Leu Lys Gln
          35
<210>91
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>91
Arg Gly Ser Arg Arg Ala Val Thr Arg Ala Gln Arg Arg Asp Gly Arg
  1                  5                      10                  15
Arg Arg Arg Arg Ser Arg Arg Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Arg
              20                       25                       30
Val Leu Arg Gln
           35
<210>92
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Arg
<400>92
Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Asp Lys Lys
  1                   5                     10                   15
<210>93
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>93
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
  1                  5                     10                     15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
               20                      25
<210>94
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>94
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
  1                  5                      10                   15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
               20                      25
<210>95
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>95
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
   1                 5                       10                   15
Lys Lys Arg Lys Val
               20
<210>96
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>96
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
  1                 5                      10                      15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val Cys
              20                       25
<210>97
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>97
Tyr Arg Phe Lys
  1
<210>98
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>98
Trp Arg Phe Lys
  1
<210>99
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>99
Trp Arg Phe Lys Trp Arg Phe Lys
  1                  5
<210>100
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>100
Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys Tyr Arg Phe Lys
  1                  5                      10
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>101
Trp Arg Phe Lys Lys Ser Lys Arg Lys Val
  1                  5                      10
<210>102
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Arg
<400>102
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp
  1                 5                     10                      15
Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly
                20                      25
<210>103
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Lys
<400>103
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
  1                  5                      10                      15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
               20                      25                       30
Val Leu Lys Gln
          35
<210>104
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Lys
<400>104
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
  1                  5                      10                    15
Lys Lys Arg Lys Val
               20
<210>105
<211>29
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Arg
<400>105
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys Ala Ala Val
  1                 5                      10                    15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
              20                       25
<210>106
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<400>106
Trp Arg Phe Lys Cys
  1                 5
<210>107
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Lys
<400>107
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
  1                5                   10                    15
Leu Ala
<210>108
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成肽
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)
<223>马来酰亚胺-Gly
<400>108
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
  1                  5                     10                     15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
               20                      25
<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>109
gcgtggagct gagagataa                                                19
<210>110
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>110
gcctgtagcc catgttgta                                   19
<210>111
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>111
ggtatgagcc catctatct                                   19
<210>112
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>112
ccagggacct ctctctaat                                   19
<210>113
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>113
gcccgactat ctcgacttt                                   19
<210>114
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>114
tgacaagcct gtagcccat                                       19
<210>115
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>115
ggtctacttt gggatcatt                                       19
<210>116
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>116
cccagggacc tctctctaa                                       19
<210>117
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>117
aatcggcccg actatctcga ctt                                    23
<210>118
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>118
aauggcgugg agcugagaga u                                      21
<210>119
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>119
aaccuccucu cugccaucaa g                                      21
<210>120
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>120
aacugaaagc augauccggg a                                      21
<210>121
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>121
aaucucgacu uugccgaguc u                                          21
<210>122
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>122
aagggugacc gacucagcgc u                                          21
<210>123
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>123
aaucagccgc aucgccgucu c                                          21
<210>124
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>124
aacccaugug cuccucaccc a                                          21
<210>125
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>125
aagcuccagu ggcugaaccg c                                  21
<210>126
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>126
aagucagauc aucuucucga a                                  21
<210>127
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>127
aagggaccuc ucucuaauca g                                 21
<210>128
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>128
cctcagcctc ttctccttcc tga                                  23
<210>129
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>129
aauccucagc cucuucuccu u                                    21
<210>130
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>130
aaccaaugcc cuccuggcca a                                    21
<210>131
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>131
ctgattaagt tgtctaaaca a                                    21
<210>132
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>132
ccgactcagc gctgagatca a                                21
<210>133
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>133
cttgtgatta tttattattt a                               21
<210>134
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>134
aagcctgtag cccatgttgt a                              21
<210>135
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>135
tagggtcgga acccaagctt a                              21
<210>136
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>136
cugaaagcau gauccggga                                 19
<210>137
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>137
aggcggugcu uguuccuca                                 19
<210>138
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>138
ccaccacgcu cuucugccu                                 19
<210>139
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>139
agggaccucu cucuaauca                                           19
<210>140
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>140
ugacaagccu guagcccau                                           19
<210>141
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>141
gccuguagcc cauguugua                                           19
<210>142
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>142
uagcccaugu uguagcaaa                                           19
<210>143
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>143
ccaaugcccu ccuggccaa                               19
<210>144
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>144
ccaauggcgu ggagcugag                               19
<210>145
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>145
ggcguggagc ugagagaua                               19
<210>146
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>146
gcguggagcu gagagauaa                               19
<210>147
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>147
gccuguaccu caucuacuc                              19
<210>148
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>148
ccuccucucu gccaucaag                              19
<210>149
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>149
gguaugagcc caucuaucu                              19
<210>150
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>150
gcuggagaag ggugaccga                               19
<210>151
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>151
gagaagggug accgacuca                               19
<210>152
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>152
gcccgacuau cucgacuuu                               19
<210>153
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>153
gcaggucuac uuugggauc                               19
<210>154
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>154
ggucuacuuu gggaucauu                  19
<210>155
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>155
ugggaucauu gcccuguga                  19
<210>156
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>156
ggtcggaacc caagcttag                  19
<210>157
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>157
ccagaatgct gcaggactt                  19
<210>158
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>158
gagaagacct cacctagaa                     19
<210>159
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>159
gaagacctca cctagaaat                     19
<210>160
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>160
ccagatgttt ccagacttc                      19
<210>161
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>161
ctatttatgt ttgcacttg                             19
<210>162
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>162
tctaaacaat gctgatttg                             19
<210>163
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：合成的寡核苷酸
<400>163
gaccaactgt cactcatt                              18

Claims (18)

1.一种含有双链核糖核酸(dsRNA)的制剂用于制备一种通过抑制哺乳动物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的产生用于治疗哺乳动物炎性疾病的药剂的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述炎性疾病为全身性疾病。
3.根据权利要求1的用途，其中所述炎性疾病为类风湿性关节炎。
4.根据权利要求1的用途，其中所述制剂被给药于哺乳动物的循环。
5.根据权利要求4用途，其中所述制剂被静脉内给药。
6.根据权利要求4的用途，其中所述siRNA被递送至血白细胞。
7.根据权利要求6的用途，其中所述白细胞为单核细胞。
8.根据权利要求1的用途，其中所述制剂的给药减小哺乳动物循环中的TNF-α水平。
9.根据权利要求1的用途，其中所述哺乳动物是人。
10.根据权利要求1的用途，其中所述制剂还含有增强递送的肽。
11.根据权利要求10的用途，其中所述肽含有选自下述的氨基酸序列：
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：59)；
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：165)；
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：166)；
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：167)；
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：168)；
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：169)；
KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：170)；
RKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：171)；
SYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：172)；
VYVYKVLKQ(SEQ ID NO：173)；及
YKVLKQ(SEQ ID NO：174)。
12.根据权利要求1的用途，其中所述dsRNA含有选自下述的核糖核酸序列：
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO：109)；
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：110)；
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO：111)；
CCAGGGACCUCUCUCUAAU(SEQ ID NO：112)；
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO：113)；
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO：114)；
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO：115)；
CCCAGGGACCUCUCUCUAA(SEQ ID NO：116)；
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO：117)；
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO：118)；
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO：119)；
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO：120)；
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO：121)；
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO：122)；
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO：123)；
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO：123)；
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO：123)；
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO：124)；
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO：125)；
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO：126)；
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO：127)；
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO：128)；
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO：129)；
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO：130)；
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO：131)；
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：132)；
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：133)；
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：134)；
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：135)；
CUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO：136)；
AGGCGGUGCUUGUUCCUCA(SEQ ID NO：137)；
CCACCACGCUCUUCUGCCU(SEQ ID NO：138)；
AGGGACCUCUCUCUCUAAUCA(SEQ ID NO：139)；
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO：140)；
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：141)；
UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ ID NO：142)；
CCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO：143)；
CCAAUGGCGUGGAGCUGAG(SEQ ID NO：144)；
GGCGUGGAGCUGAGAGAUA(SEQ ID NO：145)；
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO：146)；
GCCUGUACCUCAUCUACUC(SEQ ID NO：147)；
CCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO：148)；
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO：149)；
GCUGGAGAAGGGUGACCGA(SEQ ID NO：150)；
GAGAAGGGUGACCGACUCA(SEQ ID NO：151)；
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO：152)；
GCAGGUCUACUUUGGGAUC(SEQ ID NO：153)；
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO：154)；
UGGGAUCAUUGCCCUGUGA(SEQ ID NO：155)；
GGUCGGAACCCAAGCUUAG(SEQ ID NO：156)；
CCAGAAUGCUGCAGGACUU(SEQ ID NO：157)；
GAGAAGACCUCACCUAGAA(SEQ ID NO：158)；
GAAGACCUCACCUAGAAAU(SEQ ID NO：159)；
CCAGAUGUUUCCAGACUUC(SEQ ID NO：160)；
CUAUUUAUGUUUGCACUUG(SEQ ID NO：161)；
UCUAAACAAUGCUGAUUUG(SEQ ID NO：162)；及
GACCAACUGUCACUCAUU(SEQ ID NO：163)。
13.根据权利要求7的用途，其中所述dsRNA含有选自下述的核糖核酸序列：
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO：117)；
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO：118)；
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO：119)；
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO：120)；
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO：121)；
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO：122)；
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO：123)；
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO：124)；
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO：125)；
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO：126)；
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO：127)；
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO：128)；
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO：129)；
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO：130)；
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO：131)；
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO：132)；
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO：133)；
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：134)；及
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：135)。
14.一种含有双链核糖核酸(dsRNA)的药物制剂，其中所述dsRNA能够抑制哺乳动物细胞中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。
15.根据权利要求14的制剂，其中所述制剂还含有增强递送的肽。
16.根据权利要求15的制剂，其中所述肽含有选自下述的氨基酸序列：
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：59)；
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：165)；
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：166)；
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：167)；
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：168)；
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：169)；
KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：170)；
RKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：171)；
SYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO：172)；
VYVYKVLKQ(SEQ ID NO：173)；及
YKVLKQ(SEQ ID NO：174)。
17.根据权利要求14的制剂，其中所述dsRNA含有选自下述的核糖核酸序列：
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO：109)；
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：110)；
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO：111)；
CCAGGGACCUCUCUCUAAU(SEQ ID NO：112)；
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO：113)；
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO：114)；
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO：115)；
CCCAGGGACCUCUCUCUAA(SEQ ID NO：116)；
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO：117)；
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO：118)；
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO：119)；
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO：120)；
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO：121)；
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO：122)；
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO：123)；
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO：123)；
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO：123)；
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO：124)；
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO：125)；
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO：126)；
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO：127)；
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO：128)；
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO：129)；
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO：130)；
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO：131)；
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：132)；
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：133)；
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：134)；
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：135)；
CUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO：136)；
AGGCGGUGCUUGUUCCUCA(SEQ ID NO：137)；
CCACCACGCUCUUCUGCCU(SEQ ID NO：138)；
AGGGACCUCUCUCUCUAAUCA(SEQ ID NO：139)；
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO：140)；
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：141)；
UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ ID NO：142)；
CCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO：143)；
CCAAUGGCGUGGAGCUGAG(SEQ ID NO：144)；
GGCGUGGAGCUGAGAGAUA(SEQ ID NO：145)；
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO：146)；
GCCUGUACCUCAUCUACUC(SEQ ID NO：147)；
CCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO：148)；
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO：149)；
GCUGGAGAAGGGUGACCGA(SEQ ID NO：150)；
GAGAAGGGUGACCGACUCA(SEQ ID NO：151)；
GCCCAGCUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO：152)；
GCAGGUCUACUUUGGGAUC(SEQ ID NO：153)；
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO：154)；
UGGGAUCAUUGCCCUGUGA(SEQ ID NO：155)；
GGUCGGAACCCAAGCUUAG(SEQ ID NO：156)；
CCAGAAUGCUGCAGGACUU(SEQ ID NO：157)；
GAGAAGACCUCACCUAGAA(SEQ ID NO：158)；
GAAGACCUCACCUAGAAAU(SEQ ID NO：159)；
CCAGAUGUUUCCAGACUUC(SEQ ID NO：160)；
CUAUUUAUGUUUGCACUUG(SEQ ID NO：161)；
UCUAAACAAUGCUGAUUUG(SEQ ID NO：162)；及
GACCAACUGUCACUCAUU(SEQ ID NO：163)。
18.根据权利要求17的制剂，其中所述dsRNA含有选自下述的核糖核酸序列：
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO：117)；
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO：118)；
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO：119)；
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO：120)；
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO：121)；
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO：122)；
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO：123)；
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO：124)；
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO：125)；
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO：126)；
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO：127)；
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO：128)；
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO：129)；
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO：130)；
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO：131)；
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO：132)；
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO：133)；
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO：134)；及
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO：135)。
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