CN102597239A

CN102597239A - 包含末端取代的sirna化合物

Info

Publication number: CN102597239A
Application number: CN201080049901XA
Authority: CN
Inventors: 莎伦·阿夫金-纳祖姆
Original assignee: Quark Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Quark Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2010-11-25
Publication date: 2012-07-18
Also published as: EP2504435B1; US9701960B2; DK2504435T3; AU2010324658A1; TW201124160A; ES2759003T3; IL218965A0; CA2776568A1; US10494631B2; US20150152412A1; US8796239B2; WO2011066475A1; US20120283309A1; US20180030441A1; NZ599237A; JP2013511990A; EP2504435A1; KR20120102630A

Abstract

本发明涉及下调靶标基因表达的经修饰的siRNA化合物、包含该化合物的药物组合物以及治疗和/或预防与所述基因相关的各种疾病或病况和/或与该疾病或病况相关的症状的发生或严重度的方法。

Description

包含末端取代的SIRNA化合物

相关申请

本申请要求2009年11月26日提交的美国临时申请No.61/264668、2010年1月17日提交的No.61/295721和2010年8月9日提交的No.61/372072的权益，所述专利以整体引用方式和出于所有目的并入本文。

发明领域

本发明涉及经修饰的siRNA化合物、包含其的药物组合物以及使用其抑制基因表达的方法。所述化合物和组合物展现有利的特性(包括敲低靶标基因表达的活性)，且用于治疗罹患在其中基因表达具有不利影响的疾病或病况和/或与此疾病或病况相关的症状或有患上该疾病或病况的风险的受试者。

发明背景

本发明受让人的PCT专利公布No.WO2008/104978及WO2009/044392中公开新的siRNA结构，所述专利以全文引用的方式并入本文中。

仍需要展现增强的敲低基因表达的活性、提高的稳定性和/或降低的脱靶效应的活性且有效的siRNA治疗剂。

发明概述

本文所公开的双链RNA(dsRNA)化合物具有可例如增强活性、提高稳定性、降低免疫原性、增强对RISC复合物的负载和/或使毒性最小的结构及修饰；siRNA的新修饰可有利地应用于用于阻止或削弱靶标基因表达的双链RNA。

本文提供用于下调基因表达的双链(双链体)寡核苷酸化合物。本发明在某种程度上基于如下意外的观测结果：包含有义链及互补反义链且在反义链的5’端核苷酸与靶标RNA的核苷酸之间具有错配的双链核酸分子显示有效下调靶标基因的活性。在优选实施方案中，dsRNA包含在反义链的位置1(5’端)上取代而替代胞苷或鸟嘌呤的腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或胸苷。

根据一方面，提供具有下述所列结构(A)的经修饰的双链核酸分子：

(A) 5’N¹-(N)x-Z 3’(反义链)

3’Z’-N²-(N’)y-z”5’(有义链)

其中N²、N及N’各自为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分；

其中(N)x及(N’)y各自为寡核苷酸，其中每个连续N或N’通过共价键与相邻N或N’连接；

其中x及y各自独立地为17至39的整数；

其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补，且(N)x与靶标RNA中的连续序列互补；

其中N¹与(N)x共价结合，且与靶标RNA错配或为与靶标RNA互补的DNA部分；

其中N¹选自由天然或经修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷组成的组的部分；

其中z”可存在或不存在，但若存在，则为共价连接于N²-(N’)y的5’端的加帽部分；及

其中Z及Z’各自独立地存在或不存在，但若存在，则独立地为共价连接于其所存在的所述链的3’端的1-5个连续核苷酸、连续非核苷酸部分或其组合。

在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在各种实施方案中，N²-(N’)y的序列与N¹-(N)x的序列互补。在一些实施方案中，(N)x包含与靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸实质上互补的反义序列。

在一些实施方案中，N¹和N²形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。在一些实施方案中，N¹与N²形成非沃森-克里克碱基对。在一些实施方案中，碱基对在核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间形成。

在一些实施方案中，x＝y＝18，x＝y＝19或x＝y＝20。在优选实施方案中，x＝y＝18。

在一些实施方案中，N¹与(N)x共价结合且与靶标RNA错配。在各种实施方案中，N¹与(N)x共价结合且为与靶标RNA互补的DNA部分。

在一些实施方案中，处于反义链的位置1的尿苷经选自腺苷、脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N¹取代。在各种实施方案中，N¹选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，处于反义链的位置1的鸟苷经选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N¹取代。在各种实施方案中，N¹选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，处于反义链的位置1的胞苷经选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N¹取代。在各种实施方案中，N¹选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，处于反义链的位置1的腺苷经选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N¹取代。在各种实施方案中，N¹选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，N¹与N²形成介于尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间的碱基对。在其它实施方案中，N¹与N²形成介于脱氧尿苷与腺苷之间的碱基对。

在一些实施方案中，双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。

下表提供N1及对应N2的实例。

在结构(A)的一些实施方案中，N¹包含尿苷或腺苷。在结构(A)的某些实施方案中，N²包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在结构(A)的一些实施方案中，N¹包含2’OMe糖修饰的核糖尿苷且N²包含腺苷或经修饰的腺苷。在结构(A)的一些实施方案中，N¹包含腺苷且N²包含核糖尿苷或经修饰的核糖尿苷。

在一些实施方案中，Z及Z’不存在。在其它实施方案中，Z或Z’中的一个存在。

在一些实施方案中，N及N’各自为未经修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，N或N’的至少一个包含经化学修饰的核糖核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分及脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’的至少一个包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在其它实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列实质上互补。

在一些实施方案中，(N)x包含与靶标mRNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶标mRNA中的约17至约39个连续核苷酸实质上互补的反义序列。在一些实施方案中，x＝y＝18。

根据某些优选实施方案，提供包含一个或多个经修饰的核苷酸的siRNA化合物，其中该经修饰的核苷酸在糖部分、碱基部分或核苷酸间键部分中具有修饰。

结构(A)基序用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义链及反义链)。在一些实施方案中，哺乳动物基因为人基因。

在一些实施方案中，具有结构(A)的经修饰的siRNA化合物在与对照化合物比较时展现有利的特性，包括增强的活性(例如IC50降低、敲低增强、残余mRNA减少)，其中反义寡核苷酸与靶标mRNA中的核苷酸序列完全互补(包括5’端核苷酸碱基配对，例如A-U、U-A、C-G、G-C)的siRNA化合物。在一些实施方案中，当与对照化合物比较时，活性增强至少5％、至少10％、至少20％、至少25％或更高。

在另一方面中，本发明提供一种产生由有义链及反义链组成的双链RNA分子的方法，其包括以下步骤：

a)选择靶标RNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含与靶标mRNA的连续17至25个核苷酸的序列的互补性的反义链，其中该反义链的5’端核苷酸经尿苷、经修饰的尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代，其限制条件为在反义链的5’端核苷酸与靶标mRNA的3’端核苷酸之间不产生rG:rU摆动碱基对(wobble)；

b)合成与反义链互补的具有17至25个核苷酸的有义链，其中该有义链的3’端核苷酸与引导链的5’端核苷酸形成沃森-克里克碱基对；及

c)使有义链与反义链退火，从而产生双链RNA分子。

根据一方面，本发明提供一种产生由有义链及反义链组成且在与未经修饰的双链RNA分子比较时展现增强的RNAi活性的双链RNA分子的方法，其包括以下步骤：

a)选择靶标RNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含与靶标mRNA的连续17至25个核苷酸的序列的互补性的有义链，其中该有义链的3’端核苷酸经腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代；

b)合成与有义链互补的具有17至25个核苷酸的反义链，其中反义链的5’端核苷酸包含核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷或经修饰的脱氧核糖尿苷且与过客链的3’端核苷酸形成碱基对；

c)使有义链与反义链退火；

从而产生具有增强的RNAi活性的双链RNA分子。

在一些实施方案中，经修饰的双链RNA分子与未经修饰的siRNA双链体(即与靶标mRNA完全匹配的双链体)比较时展现增强的RNAi活性。

根据另一方面，本发明提供一种产生由有义链及反义链组成且在与未经修饰的双链RNA分子比较时展现增强的RNAi活性的经修饰的双链RNA分子的方法，其包括以下步骤：

a)选择靶标细胞中靶标mRNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含靶标mRNA中的该连续17至25个核苷酸的序列的有义链，其中3’端核苷酸经腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代；

b)合成与有义链互补的具有17至25个核苷酸的反义链，其中5’端核苷酸包含核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷或经修饰的脱氧核糖尿苷且与有义链的3’端核苷酸形成碱基对；

c)将该有义链与该反义链退火；

从而产生具有增强的RNAi活性的双链RNA分子。

在一些实施方案中，步骤a)包括选择靶标细胞中靶标RNA中的连续17至25个核苷酸或17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸序列，其中3’端核苷酸不为腺苷。

在另一方面中，提供一种药物组合物，其包含抑制哺乳动物或非哺乳动物基因表达的有效量的结构(A)化合物及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，哺乳动物基因为人基因。在一些实施方案中，非哺乳动物基因与哺乳动物疾病，优选人疾病相关。

进一步提供用于在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病况的发生或严重度和/或降低该疾病或病况的风险或严重度的方法，其中该疾病或病况和/或与其相关的症状和/或风险为与哺乳动物或非哺乳动物基因表达相关。在优选实施方案中，受试者为人受试者。

在一些实施方案中，疾病或病况选自以下组：听力丧失、急性肾衰竭(ARF)、肾移植后移植肾功能延迟恢复(DGF)、青光眼、眼缺血性病况(包括前部缺血性视神经病变)、年龄相关的黄斑变性(AMD)、缺血性视神经病变(ION)、干眼综合症、急性呼吸窘迫综合症(ARDS)及其它急性肺及呼吸道损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、原发性移植失败、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、器官移植(尤其为肺移植)后肺部再植入反应和/或原发性移植物功能障碍(PGD)、器官移植(包括肺、肝、心脏、胰脏及肾移植)、肾毒性及神经毒性、脊髓损伤、脑损伤、神经退行性疾病或病况、褥疮、口腔粘膜炎、纤维变性病症(包括肝纤维化、肺纤维化)及癌症。此方法包括向需要该治疗的哺乳动物施用防治或治疗有效量的一种或多种抑制或降低至少一种该基因表达或活性的该化合物。

现描述的化合物、方法、材料及实例仅具有说明性而并非旨在限制；与本文所述的类似或等效的材料及方法均可用于实践或测试本发明。本发明的其它特征及优势将从下列详细描述及权利要求而显而易见。

附图简述

图1为如本文所提供的dsRNA分子的图解。在一个实施方案中，反义链的5’端G或C核苷酸经U、dU、rA、dA、rT、dT取代；或反义链的5’端U核苷酸经dU、rA、dA、rT、dT取代；或反义链的5’端A核苷酸经U、dU、dA、rT、dT取代。在一个实施方案中，反义链的5’端核苷酸与靶标mRNA错配。在另一实施方案中，反义链的5’端核苷酸为与靶标mRNA互补的脱氧核糖核苷酸。

图2-10显示在反义链的位置1上具有不同核苷酸的dsRNA分子且经修饰以在位置19(反义链的位置1)上个别包括四种核糖核苷酸的靶标的活性(％残余靶标剩余)的柱状图。

发明详述

本发明大体涉及下调各种基因表达的寡核苷酸化合物，尤其涉及小干扰RNA(siRNA)，特别涉及经修饰的siRNA化合物，以及将这些经修饰的siRNA化合物用于制备药物组合物及用于治疗罹患各种医学病况的受试者的用途。

该化合物及组合物展现有利的特性，包括有效的敲低靶标基因的活性，且用于治疗罹患在其中基因表达具有不利影响的疾病或病况和/或与该疾病或病况相关的症状或有患上该疾病或病况的风险的受试者。

因此，在某些方面中，提供用于下调基因表达的经修饰的siRNA化合物及包含其的药物组合物。

在另一方面中，本发明提供一种治疗罹患或易患微血管病症、眼部疾病或病症、听力损伤(包括听力丧失)、呼吸道(包括肺)病症、神经退行性疾病或病症、脊髓损伤、脑损伤、血管生成相关病况及细胞凋亡相关病况的受试者的方法，其包括向受试者施用包含至少一种靶向哺乳动物或非哺乳动物基因的本发明小干扰RNA的药物组合物，其中所述至少一种本发明小干扰RNA的量足以下调该基因表达。

在某些实施方案中，本发明的化合物在抑制靶标基因表达中有用，尤其用于治疗呼吸道病症、微血管病症或眼部病症。所治疗的特定疾病及病况为ARDS；COPD；ALI；肺气肿；糖尿病性神经病、肾病及视网膜病；DME及其它糖尿病性病况；青光眼；AMD；BMT视网膜病；缺血性病况，包括中风；OIS；神经退行性病症，例如帕金森氏症(Parkinson’s disorder)、阿尔茨海默病(Alzheimer′s disorder)、ALS；肾病：ARF、DGF、移植排斥；听力障碍；脊髓损伤；口腔粘膜炎；癌症、干眼综合症及褥疮。

定义

为方便起见，在本文中描述的说明书、实施例及权利要求中使用某些术语。

应注意，除非内容另外明确规定，否则如本文所用的单数形式包括复数形式。当马库什组或其它替代组描述本发明的方面或实施方案时，本领域的技术人员应了解，本发明也由此根据组成员的任何个别成员或子群进行描述。

“抑制剂”为能够降低(部分或完全)基因表达或基因产物的活性至足以实现所需生物或生理作用的程度的化合物。如本文所用的术语“抑制剂”是指siRNA抑制剂。“siRNA抑制剂”为能够降低基因表达或基因产物的活性至足以实现所需生物或生理作用的程度的化合物。如本文所用的术语“siRNA抑制剂”是指siRNA、shRNA、siNA、合成shRNA、miRNA的一个或多个。抑制也可指下调，或对于RNAi而言指沉默。

如本文所用的术语“抑制”是指降低基因表达或基因产物的活性至足以实现所需生物或生理作用的程度。抑制为完全或部分抑制。

如本文所用的术语“抑制”靶标基因意指抑制靶标基因的基因表达(转录或翻译)或基因产物的多肽活性。如本文所用的“基因产物”是指例如RNA转录物或多肽的基因产物。术语“RNA转录物”、“mRNA多核苷酸序列”、“mRNA序列”和“mRNA”可互换使用。

如本文所用的术语“多核苷酸”及“核酸”可互换使用且是指包含脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。应了解，该术语包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物作为等效物。贯穿本申请，mRNA序列阐述为表示对应基因。

“寡核苷酸”或“寡聚物”是指具有约2至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。每个DNA或RNA核苷酸可独立地为天然或合成和/或经修饰或未经修饰的DNA或RNA核苷酸。修饰包括寡核苷酸中糖部分、碱基部分和/或核苷酸间键的变化。本发明的化合物涵盖包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、核苷酸类似物、经修饰的核苷酸类似物、非常规部分及脱碱基部分及其组合的分子。

实质上互补是指与另一序列的互补性大于约84％。例如，在由19个碱基对组成的双链体区域中，一处错配产生94.7％互补性，两处错配产生约89.5％互补性且三处错配产生约84.2％互补性，致使双链体区域实质上互补。因此，实质上一致是指与另一序列的一致性大于约84％。

“核苷酸”意欲涵盖天然或合成的及经修饰或未经修饰的脱氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。核苷酸包括合成、天然存在及非天然存在的已知的核苷酸类似物。该类似物的实例包括(不限于)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸及肽核酸(PNA)。修饰包括寡核糖核苷酸中糖部分、碱基部分和/或核糖核苷酸间键的变化。如本文所用的术语“核糖核苷酸”涵盖天然与合成的、未经修饰与经修饰的核糖核苷酸以及合成、天然存在及非天然存在的核糖核苷酸类似物。修饰包括寡核苷酸中糖部分、碱基部分和/或核糖核苷酸间键的变化。

核苷酸选自天然存在或合成的经修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的经修饰的碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤及其它烷基腺嘌呤、5-卤尿嘧啶、5-卤胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶及6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、核糖-2-硫尿苷、核糖-4-硫尿苷、8-卤腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫醇烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤及其它经取代的腺嘌呤、8-卤鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤及其它经取代的鸟嘌呤、其它氮杂腺嘌呤及去氮腺嘌呤、其它氮杂鸟嘌呤及去氮鸟嘌呤、5-甲基核糖尿苷、5-三氟甲基尿嘧啶、5-甲基核糖胞嘧啶及5-三氟胞嘧啶。在一些实施方案中，寡聚物中的一个或多个核苷酸经肌苷取代。

在一些实施方案中，siRNA化合物进一步包含至少一种选自由具有糖修饰、碱基修饰或核苷酸间键修饰的核糖核苷酸组成的组的经修饰的核糖核苷酸，且可含有DNA及经修饰的核苷酸，例如LNA(锁核酸)、ENA(亚乙基桥连核酸)、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、磷酰羧酸或次膦基羧酸核苷酸(PACE核苷酸)或具有六碳糖的核苷酸。

经修饰的脱氧核糖核苷酸包括例如5’OMe DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)，其可用作5’端位置(位置编号1)上的核苷酸；PACE(脱氧核糖腺苷3’膦酰乙酸、脱氧核糖胞苷3’膦酰乙酸、脱氧核糖鸟苷3’膦酰乙酸、脱氧核糖胸苷3’膦酰乙酸)。

桥连核酸包括LNA(2’-O，4’-C-亚甲基桥连核酸腺苷3’单磷酸、2’-O，4’-C-亚甲基桥连核酸5-甲基-胞苷3’单磷酸、2’-O，4’-C-亚甲基桥连核酸鸟苷3’单磷酸、5-甲基-尿苷(或胸苷)3’单磷酸)；及ENA(2’-O，4’-C-亚乙基桥连核酸腺苷3’单磷酸、2’-O，4’-C-亚乙基桥连核酸5-甲基-胞苷3’单磷酸、2’-O，4’-C-亚乙基桥连核酸鸟苷3’单磷酸、5-甲基-尿苷(或胸苷)3’单磷酸)。

核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或修饰均可用于本发明，其限制条件是该类似物或修饰实质上不会不利地影响核苷酸/寡核苷酸的特性，例如功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键的修饰及其组合。

糖修饰包括糖残基的2’部分上的修饰且涵盖氨基、氟、烷氧基(例如甲氧基)、烷基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫代酸酯(thioate)、C1至C10低碳烷基、经取代的低碳烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；SOCH₃；SO₂CH₃；ONO₂；NO₂、N₃；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或经取代的甲硅烷基，尤其如欧洲专利EP 0 586 520 B1或EP 0 618 925 B1中所述。

在一个实施方案中，经修饰的siRNA化合物包含至少一个包含糖部分的2’修饰(“2’糖修饰”)的核糖核苷酸。在某些实施方案中，siRNA化合物包含任选处于替代位置上的2’O-烷基或2’-氟或2’O-烯丙基或任何其它2’修饰。其它稳定化修饰也有可能(例如末端修饰)。在一些实施方案中，优选2’O-烷基为2’O-甲基(甲氧基)糖修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸的主链经修饰且包含磷酸-D-核糖实体，且也可含有硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫代酸酯、2’-5’桥连主链(也可称作5’-2’)、PACE等。

如本文所用的术语“非配对核苷酸类似物”意指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物，该非碱基配对部分包括(但不限于)：6去氨基腺苷(水粉覃素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me Dc。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为核糖核苷酸。在其它实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为脱氧核糖核苷酸。另外，可制备具有一个或多个核苷酸的结构基本上改变的多核苷酸类似物，且优选适用作治疗或实验试剂。核苷酸类似物的实例为肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的磷酸脱氧核糖(或核糖)主链经与在肽中所发现相似的聚酰胺主链置换。PNA类似物已显示对酶降解具有抗性且在体内及体外稳定性增强。其它修饰包括聚合物主链、环状主链、非环状主链、硫代磷酸-D-核糖主链、三酯主链、硫代酸酯主链、2’-5’桥连主链、人工核酸、N-吗啉基核酸、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷及镜像核苷(例如β-L-脱氧核糖核苷替代β-D-脱氧核糖核苷)。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例公开于Elmen等人(NAR 2005，33(1)：439-447)中。

在一些实施方案中，本发明的化合物为用一种或多种倒置核苷酸(例如倒置胸苷或倒置腺苷)来合成(参见例如Takei等人，2002，JBC277(26)：23800-06)。

其它修饰包括3’端修饰，也称作加帽部分。该末端修饰选自核苷酸、经修饰的核苷酸、脂质、肽、糖及倒置脱碱基部分。该修饰是并入例如有义链和/或反义链的3’端上。

在本发明中有时称作“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”的更适当称作假核苷酸或非常规部分。核苷酸为核酸的单体单元，由核糖或脱氧核糖、磷酸及碱基(在DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；在RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。经修饰的核苷酸在糖、磷酸和/或碱基中的一个或多个中包含修饰。脱碱基假核苷酸缺乏碱基，因此在严格意义上不是核苷酸。

如本文所用的术语“加帽部分”包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱碱基核糖及脱碱基脱氧核糖部分的修饰，包括2’O烷基修饰；倒置脱碱基核糖及脱碱基脱氧核糖部分及其修饰；C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA及L-RNA；5’O-Me核苷酸；及核苷酸类似物，包括4’，5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；磷酸5’-氨基-烷酯；磷酸1，3-二氨基-2-丙酯、磷酸3-氨基丙酯；磷酸6-氨基己酯；磷酸12-氨基十二烷酯；磷酸羟基丙酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基核苷酸；非环状3’，4’-闭环核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5’-5’-倒置脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；及桥连或非桥连甲基磷酸酯及5’-巯基部分。

某些优选加帽部分为脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；倒置脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA及L-RNA。

“烃部分或其衍生物”是指直链或支链烷基部分以及本身或进一步包含官能基(包括醇、磷酸二酯、硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯)的部分，且还包括胺、羧酸、酯、酰胺、醛。“烃部分”与“烷基部分”可互换使用。

“末端官能基”包括卤素、醇、胺、竣酸、酯、酰胺、醛、酮、醚的基团。

如本文所述的术语“非常规部分”是指脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物及由2’-5’核苷酸间磷酸酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸；桥连核酸，包括锁核酸(LNA)及亚乙基桥连核酸(ENA)。

脱碱基脱氧核糖部分包括例如脱碱基脱氧核糖-3’-磷酸、1，2-二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸、1，4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸。

倒置脱碱基脱氧核糖部分包括倒置脱碱基脱氧核糖、3’，5’倒置脱碱基脱氧核糖5’-磷酸。

“镜像”核苷酸为手性与天然存在或通常使用的核苷酸的手性相反的核苷酸，即天然存在核苷酸(D-核苷酸)的镜像(L-核苷酸)，在镜像核糖核苷酸的情况下也称作L-RNA，及“镜像异构物(spiegelmer)”。核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸且可进一步包含至少一种糖、碱基和/或主链修饰。参见美国专利No.6,586,238。同样，美国专利No.6,602,858公开包含至少一种L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸(镜像dT)及L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像rG)；L-核糖尿苷-3’-磷酸(镜像dU)。

根据一方面，本发明提供包含未经修饰的核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸和/或非常规部分的抑制性经修饰的siRNA化合物。在一些实施方案中，经修饰的siRNA化合物包含至少一种选自由糖修饰、碱基修饰及核苷酸间键修饰组成的组的经修饰的核苷酸，且可含有经修饰的核苷酸，例如LNA(锁核酸)，包括ENA(亚乙基桥连核酸)、PNA(肽核酸)、阿拉伯糖苷、PACE(膦酰乙酸及其衍生物)或具有六碳糖的核苷酸，或选自以下的非常规部分：脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、经修饰或未经修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸及由2’-5’核苷酸间磷酸酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核糖核苷酸为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，siRNA在化合物的3’端上具有平端，即siRNA在由有义链或过客链的3’-端及反义链或引导链的5’-端界定的末端上具有平端。

在其它实施方案中，两条链中的至少一条在3’-端上具有含至少一个核苷酸的3’突出；该突出包含至少一个脱氧核糖核苷酸。两条链中的至少一条任选在3’-端上包含具有至少一个核苷酸的突出。该突出由约1至约5个核苷酸组成。

在各种实施方案中，突出独立地选自核苷酸、非核苷酸及其组合。在某些实施方案中，每个突出若存在则独立地选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、脱碱基脱氧核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、C3-氨基-Pi、C4-氨基-Pi、C5-氨基-Pi、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。

在一些实施方案中，Z和/或Z’各自独立地包括C2、C3、C4、C5或C6烷基部分，任选为C3[丙烷，-(CH₂)₃-]部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH)、丙二醇及丙二醇的磷酸二酯衍生物(“C3Pi”)。在优选实施方案中，Z和/或Z’各自包括两个烃部分，且在某些实例中，为C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。每个C3经由共价键(优选基于二氧磷基的键)与相邻C3共价偶联。在一些实施方案中，基于二氧磷基的键为硫代磷酸酯键、膦酰乙酸酯键或磷酸二酯键。

在特定实施方案中，x＝y＝19且Z包含C3-C3。在一些实施方案中，C3-C3突出经由共价键(例如磷酸二酯键)共价连接于(N)x或(N’)y的3’端。在一些实施方案中，第一C3与第二C3之间的键为磷酸二酯键。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出为C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出为C3Pi-C3Ps。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出为C3Pi-C3OH(OH为羟基)。在一些实施方案中，3’非核苷酸突出为C3Pi-C3OH。

在各种实施方案中，烷基部分包含烷基衍生物，该烷基衍生物包括包含末端羟基、末端氨基或末端磷酸酯基的C3烷基、C4烷基、C5烷基或C6烷基部分。在一些实施方案中，烷基部分为C3烷基或C3烷基衍生物部分。在一些实施方案中，C3烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。

C3烷基部分经由磷酸二酯键共价连接于(N’)y的3’端和/或(N)x的3’端。在一些实施方案中，烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯或硫代磷酸丙酯。

在一些实施方案中，Z及Z’各自独立地选自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其组合或其多者，尤其为2或3个共价连接的丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。

在一些实施方案中，Z及Z’各自独立地选自磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、丙基二氧磷基-丙醇；硫代磷酸丙基二氧磷基-丙酯；磷酸丙基二氧磷基-丙酯；(磷酸丙酯)₃、(磷酸丙酯)₂-丙醇、硫代磷酸(磷酸丙酯)₂-丙酯。Z或Z’中可包括任何偶联丙烷或丙醇的部分。

示例性3’端非核苷酸部分的结构如下：

在其它实施方案中，Z和/或Z’各自包含脱碱基部分与未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或烃部分与未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或脱碱基部分(脱氧核糖或核糖)与烃部分的组合。在该实施方案中Z和/或Z’各自包含C3Pi-rAb或C3Pi-dAb。

RNA双链体的长度为约18至约40个核糖核苷酸，优选19至23个核糖核苷酸。在一些实施方案中，每条链(寡聚物)的长度独立地选自由约18至约40个碱基组成的组，优选18至23个碱基且更优选19、20或21个核糖核苷酸。

在一些实施方案中，经修饰的siRNA化合物的反义链与靶标核酸之间的互补性为完全互补。在其它实施方案中，经修饰的siRNA化合物的反义链与靶标核酸实质上互补，即反义链与靶标核酸之间有一处、两处或至多三处错配。

在某些实施方案中，本发明经修饰的siRNA化合物的反义链与有义链之间的互补性为完全互补。在一些实施方案中，该两链实质上互补，即该反义链与有义链之间有一处、两处或至多三处错配。

本发明的siRNA化合物具有与反义链的5’-端共价结合且与靶标mRNA中的核苷酸错配的末端部分。在各种实施方案中，反义链的5’-端上的部分选自由以下组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、脱氧核糖胸苷、经修饰的脱氧核糖胸苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶、经修饰的脱氧核糖胞嘧啶、5-甲基核糖胞嘧啶、经修饰的5-甲基核糖胞嘧啶、5-甲基核糖尿苷、核糖-2-硫尿苷、核糖-4-硫尿苷、脱碱基核糖部分及脱碱基脱氧核糖部分。

在一些实施方案中，本发明经修饰的siRNA化合物在与包括5’-端核苷酸的反义链与靶标mRNA中的连续序列完全互补的siRNA化合物比较时展现增强的活性。

本发明的siRNA结构可有利地应用于用于抑制或削弱哺乳动物及非哺乳动物基因表达的双链RNA。

siRNA寡核苷酸

在一方面中，本发明提供具有下述所列结构(A)的化合物：

(A) 5’ N¹-(N)x -Z 3’(反义链)

3’Z’-N²-(N’)y-z”5’(有义链)

其中x及y各自独立地为17至39的整数；

其中z″可存在或不存在，但若存在，则为共价连接于N²-(N’)y的5’端的加帽部分；及

在一些实施方案中，N¹与(N)x共价结合且与靶标RNA错配。

在一些实施方案中，N¹与(N)x共价结合且为与靶标RNA互补的DNA部分。

在一些实施方案中，N¹与N²一起形成沃森-克里克碱基对。在其它实施方案中，N¹与N²一起形成非沃森-克里克碱基对。

在一些实施方案中，x＝y＝18。在其它实施方案中，x＝y＝19。在其它实施方案中，x＝y＝20。在优选实施方案中，x＝y＝18。

在一些实施方案中，N¹为经修饰的核糖胞嘧啶或经修饰的核糖尿苷。在N¹的某些实施方案中，经修饰的核糖胞嘧啶或经修饰的核糖尿苷选自包含5-甲基核糖胞嘧啶、经修饰的5-甲基核糖胞嘧啶、5-甲基核糖尿苷、核糖-2-硫尿苷及核糖-4-硫尿苷的组。

在某些实施方案中，N¹选自由以下组成的组：核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶、经修饰的脱氧核糖胞嘧啶、5-甲基核糖胞嘧啶及经修饰的5-甲基核糖胞嘧啶。在其它实施方案中，N¹选自由以下组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、5-甲基核糖尿苷、核糖-2-硫尿苷及核糖-4-硫尿苷。在一些实施方案中，N¹为脱氧核糖胸苷或经修饰的脱氧核糖胸苷。

在一些实施方案中，N²为经修饰的核糖核苷酸或未经修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，N²选自包含以下的组：核糖鸟嘌呤、经修饰的核糖鸟嘌呤、脱氧鸟嘌呤、经修饰的脱氧鸟嘌呤、核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷、经修饰的脱氧腺苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶及经修饰的脱氧核糖胞嘧啶。

在一些实施方案中，N2选自由以下组成的组：核糖鸟嘌呤、经修饰的核糖鸟嘌呤、脱氧鸟嘌呤、核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、腺苷、脱氧腺苷、核糖胞嘧啶及脱氧核糖胞嘧啶。在其它实施方案中，N²选自由以下组成的组：核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷、经修饰的脱氧腺苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶及经修饰的脱氧核糖胞嘧啶。在其它实施方案中，N2选自由以下组成的组：核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷、经修饰的脱氧腺苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶及经修饰的脱氧核糖胞嘧啶。

在某些实施方案中，N¹选自由以下组成的组：核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶、经修饰的脱氧核糖胞嘧啶、5-甲基核糖胞嘧啶及经修饰的5-甲基核糖胞嘧啶，且N²选自由以下组成的组：核糖鸟嘌呤、经修饰的核糖鸟嘌呤、脱氧鸟嘌呤、核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、腺苷、脱氧腺苷、核糖胞嘧啶及脱氧核糖胞嘧啶。

在一些实施方案中，N¹为选自由以下组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、5-甲基核糖尿苷、核糖-2-硫尿苷及核糖-4-硫尿苷，且N²选自由以下组成的组：核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷、经修饰的脱氧腺苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶及经修饰的脱氧核糖胞。

在某些实施方案中，N¹为脱氧核糖胸苷或经修饰的脱氧核糖胸苷，且N²选自由以下组成的组：核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷、经修饰的脱氧腺苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶及经修饰的脱氧核糖胞嘧啶。

在结构(A)的一些实施方案中，N¹包含2’OMe糖修饰的核糖尿苷或2’OMe糖修饰的核糖胞嘧啶。在结构(A)的某些实施方案中，N²包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在各种实施方案中，Z及Z’独立地选自核苷酸、非核苷酸及其组合。在某些实施方案中，Z及Z’各自若存在，则独立地选自核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、脱碱基脱氧核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、C3-氨基-Pi、C4-氨基-Pi、C5-氨基-Pi、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。在其它实施方案中，Z存在。在其它实施方案中，Z’存在。在其它实施方案中，Z与Z’都存在。在一些实施方案中，Z与Z’存在且相同。在其它实施方案中，Z与Z’存在且不同。在一些实施方案中，Z和Z’独立地为1、2、3、4或5个非核苷酸部分，或2、3、4或5个非核苷酸部分与核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z和/或Z’各自包含经由磷酸二酯键共价连接于siRNA链的3’端的2个非核苷酸部分。在一些实施方案中，Z及Z’存在且各自独立地包含一个或多个烷基部分和/或其衍生物。在一些实施方案中，N²包含核糖腺苷，且N¹包含尿苷(核糖尿苷)。

非核苷酸部分选自由以下组成的组：脱碱基部分、倒置脱碱基部分、烷基部分或其衍生物及无机磷酸盐。在一些实施方案中，非核苷酸部分为烷基部分或其衍生物。在一些实施方案中，烷基部分包含末端官能基，包括醇、末端胺、末端磷酸酯或末端硫代磷酸酯部分。

在一些实施方案中，Z存在且包含一个或多个选自由以下组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、倒置脱碱基部分、烃部分或其衍生物及无机磷酸盐。在一些实施方案中，Z存在且包含一个或多个烷基部分和/或其衍生物。

在其它实施方案中，Z’存在且包含一个或多个选自由以下组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、倒置脱碱基部分、烃部分及无机磷酸盐。在一些实施方案中，Z’存在且包含一个或多个烷基部分和/或其衍生物。

在其它实施方案中，x＝y＝18，且Z或Z’存在且独立地包含2个非核苷酸部分。

在其它实施方案中，x＝y＝18，且Z及Z’存在且各自独立地包含2个非核苷酸部分。

在一些实施方案中，Z及Z’各自包括脱碱基部分，例如脱碱基脱氧核糖部分(本文称作“dAb”)或脱碱基核糖部分(本文称作“rAb”)。在一些实施方案中，Z和/或Z’各自包含2个共价连接的脱碱基部分，且为例如dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb。每个部分经由共价键(优选基于二氧磷基的键)与相邻部分共价偶联。在一些实施方案中，基于二氧磷基的键为硫代磷酸酯键、膦酰乙酸酯键或磷酸二酯键。

在一些实施方案中，Z和/或Z’各自独立地包括烷基部分，任选为丙烷[(CH₂)₃]部分或其衍生物，包括丙醇(C3-OH)及丙二醇的磷酰基衍生物(“C3-3’Pi”)。在一些实施方案中，Z和/或Z’各自包括2个烃部分，且在某些实例中，为C3-C3。每个C3经由共价键(优选基于二氧磷基的键)与相邻C3共价偶联。在一些实施方案中，基于二氧磷基的键为硫代磷酸酯键、膦酰乙酸酯键或磷酸二酯键。

在特定实施方案中，x＝y＝18且Z包含C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。在特定实施方案中，x＝y＝18且Z包含C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。在一些实施方案中，C3-C3突出经由共价键(例如磷酸二酯键)共价连接于(N)x或(N’)y的3’端。在一些实施方案中，第一C3与第二C3之间的键为磷酸二酯键。

在各种实施方案中，烷基部分为包含末端羟基、末端氨基、末端磷酸酯基的C3烷基至C6烷基部分。在一些实施方案中，烷基部分为C3烷基部分。在一些实施方案中，C3烷基部分包含丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其组合。

在一些实施方案中，Z及Z’各自独立地选自丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯、其组合或其多者。

在其它实施方案中，Z和/或Z’各自包含脱碱基部分与未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或烃部分与未经修饰的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合或脱碱基部分(脱氧核糖或核糖)与烃部分的组合。在该实施方案中，Z和/或Z’各自包含C3-rAb或C3-dAb。

在优选实施方案中，x＝y＝18，Z’不存在，Z存在且包含2个彼此经由磷酸二酯键共价连接的烷基部分，N²包含核糖腺苷，且N¹包含尿苷。

在一些实施方案中，N及N’包含未经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，N或N’中的至少一个包含经化学修饰的核糖核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，非常规部分是选自由以下组成的组：镜像核苷酸、脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物、桥连核酸及由2’-5’核苷酸间磷酸酯键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在一些实施方案中，非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’中的至少一个在糖、碱基或连接子中的一处或多处经修饰。在某些实施方案中，N或N’中的至少一个为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在某些实施方案中，(N)x与(N’)y完全互补。在其它实施方案中，(N)x与(N’)y实质上互补。在某些实施方案中，(N)x与靶标序列完全互补。在其它实施方案中，(N)x与靶标序列实质上互补。根据某些优选实施方案，本发明提供包含一个或多个经修饰的核苷酸的经修饰的siRNA化合物，其中核经修饰的核苷酸在糖部分、碱基部分或核苷酸间键部分中具有修饰。

在结构(A)化合物的某些实施方案中，(N)x及(N’)y每一个中的交替核糖核苷酸为2’-OMe糖修饰的核糖核苷酸。在结构(A)的一些实施方案中，(N)x中，核苷酸未经修饰，或(N)x包含交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸；且N¹-(N)x的中间位置上的核糖核苷酸经修饰或未经修饰，优选未经修饰；其中(N’)y包含在末端或次末端位置上进一步包含一个经修饰的核苷酸的未经修饰的核糖核苷酸。

在特定实施方案中，x＝y＝18，N¹包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，且位于N¹-(N)x中间处的核糖核苷酸未经修饰。在一些实施方案中，处于(N’)y的5’及3’端中的任一个或两者上的至少一个核苷酸由2’-5’磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，N¹通过2’-5’磷酸二酯键连接在(N)x的5’端。在一些实施方案中，处于(N’)x的5’及3’端中的任一个或两者上的至少一个核苷酸由2’-5’磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，N²通过2’-5’磷酸二酯键连接在(N)y的3’端。在某些实施方案中，x＝y＝18；(N)x中，核苷酸在经修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸之间交替，每个经修饰的核糖核苷酸为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，且位于N¹-(N)x中间处的核糖核苷酸未经修饰；N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N)y的3’端，且(N’)y的3’端上的至少两个核苷酸由两个2’-5’磷酸二酯键连接。在其它优选实施方案中，x＝y＝18；(N)x中，核苷酸在经修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸之间交替，每个经修饰的核糖核苷酸为2’-OMe糖修饰的核糖核苷酸，且位于N¹-(N)x中间处的核糖核苷酸未经修饰；且(N’)y的5’端上的至少三个连续核苷酸由三个2’-5’磷酸二酯键连接。在另一实施方案中，位于N²-(N)y的中间位置上的核苷酸(即位置10上的核苷酸)为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在另一优选实施方案中，(N)x中，核苷酸在2’-OMe糖修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸之间交替，且(N’)y中，5’端上的四个连续核苷酸由三个2’-5’磷酸二酯键连接，且5’端核苷酸或5’端上的两个或三个连续核苷酸包含3’-OMe糖修饰。

在某些优选实施方案中，x＝y＝18，且(N’)y中，至少一个位置上的核苷酸包含镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸及由2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。

在某些实施方案中，x＝y＝18且(N’)y包含镜像核苷酸。在各种实施方案中，镜像核苷酸为L-DNA核苷酸。在某些实施方案中，L-DNA为L-脱氧核糖胞苷。在一些实施方案中，(N’)y在位置17上包含L-DNA。在其它实施方案中，(N’)y在位置16及17上包含L-DNA。在某些实施方案中，(N’)y在位置1以及在位置16与17中的一个或两者上包含L-DNA核苷酸。

在其它实施方案中，(N’)y在位置14上包含DNA，且在位置16与17中的一个或两者上包含L-DNA。在该结构中，位置1可进一步包含L-DNA或脱碱基非常规部分。

在其它实施方案中，其中x＝y＝20，上文所所述的(N’)y的修饰处于位置17、18、19、20上而非位置14、15、16、17上。例如，对于20聚体而言，位置16与17中的一个或两者上的修饰处于位置18或19中的一个或两者上。18聚体中的所有修饰同样用于20聚体及22聚体。

根据各种实施方案，在N²-(N’)y中，N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N)y的3’端，且在(N’)y中，3’端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个连续核糖核苷酸由2’-5’核苷酸间键连接。在一个实施方案中，N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N)y的3’端，且(N’)y的3’端上的三个连续核苷酸由三个2’-5’磷酸二酯键连接，其中形成2’-5’磷酸二酯键的一个或多个2’-5’核苷酸进一步包含3’-OMe糖修饰。在一些实施方案中，N²包含2’-OMe糖修饰。在其它实施方案中(N’)y的3’端核苷酸包含2’-OMe糖修饰。在某些实施方案中，x＝y＝18，且在(N’)y中，位置14、15、16、17及18上的两个或两个以上连续核苷酸包含由2’-5’核苷酸间键与相邻核苷酸连接的核苷酸。在各种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包含3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在一些实施方案中，(N’)y中位置16与17上的核苷酸由2’-5’核苷酸间键连接。在其它实施方案中，(N’)y中位置15-16、16-17或15-17上的核苷酸由2’-5’核苷酸间键连接。

在某些实施方案中，(N’)y在位置2上包含L-DNA且在位置15-16、16-17或15-17上包含2’-5’核苷酸间键。

在一个实施方案中，(N’)y的3’端核苷酸或3’端上的两个或三个连续核苷酸为L-脱氧核糖核苷酸。

在其它实施方案中，在N²-(N’)y中，N²为2’糖修饰的核苷酸，且在(N’)y中，(N’)y任一端上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个连续核糖核苷酸或5’及3’端中的每一端上的1至7个经修饰的核苷酸独立地为2’糖修饰的核苷酸。在一些实施方案中，2’糖修饰包含存在氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，2’糖修饰包含甲氧基部分(2’-OMe)。在一系列实施方案中，(N’)y的5’末端上的三、四或五个连续核苷酸包含2’-OMe修饰。在另一实施方案中，N²以及(N’)y的3’端上的两个连续核苷酸包含2’-OMe修饰。

在一些实施方案中，在(N’)y中5’及3’端中的任一个上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个连续核糖核苷酸或5’及3’端中的每一端上的1至7个经修饰的核苷酸独立地为双环核苷酸。在各种实施方案中，双环核苷酸为锁核酸(LNA)或LNA类，例如2’-O，4’-C-亚乙基桥连核酸(ENA)为LNA类。

在各种实施方案中，(N’)y在5’端上或在3’与5’端上包含经修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，(N’)y的5’上的至少两个核苷酸由P-乙氧基主链修饰连接。在一些实施方案中，(N’)y的3’上的N²由P-乙氧基主链修饰连接。在某些实施方案中，x＝y＝18且其中在(N)x中，核苷酸在经修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸之间交替，每个经修饰的核糖核苷酸为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，且位于N¹-(N)x的中间位置上的核糖核苷酸未经修饰；N1为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸，且(N’)y的3’端上的三个连续核苷酸由两个P-乙氧基主链修饰连接，或(N’)y的5’端上的四个连续核苷酸由三个P-乙氧基主链修饰连接。在另一实施方案中，(N’)y的3’上的N²由P-乙氧基主链修饰连接。

在一些实施方案中，在(N’)y中，5’及3’端中的每一端上的1、2、3、4、5、6或7个连续核糖核苷酸独立地为镜像；由2’-5’磷酸二酯键连接的核苷酸、2’糖修饰的核苷酸或双环核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的5’及3’端上的修饰相同。在一个实施方案中，(N’)y的5’端上的四个连续核苷酸由三个2’-5’磷酸二酯键连接，且(N’)y的3’端上的两个或三个连续核苷酸由两个2’-5’磷酸二酯键连接。在另一实施方案中，(N’)y的3’上的N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N’)y的3’端。在另一实施方案中，(N’)y的5’端上的修饰不同于(N’)y的3’端上的修饰。在特定实施方案中，(N’)y的5’末端上的经修饰的核苷酸为镜像核苷酸，且(N’)y的3’端上的经修饰的核苷酸由2’-5’磷酸二酯键连接。在另一特定实施方案中，(N’)y的5’端上的三个连续核苷酸为LNA核苷酸，且(N’)y的3’端上的两个连续核苷酸由两个2’-5’磷酸二酯键连接。在(N)x中，核苷酸在2’OMe糖修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸之间交替，且位于N¹-(N)x中间处的核糖核苷酸未经修饰。

在各种实施方案中，N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N’)y的3’端，且(N’)x的3’端上的两个或三个连续核苷酸由一个或两个2’-5’磷酸二酯键连接。在一些实施方案中，N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N’)y的3’端，且(N’)x的3’端上的两个或三个连续核苷酸由一个或两个2’-5’磷酸二酯键连接，且3’端上的一个或两个或三个连续核苷酸包含3’-OMe糖修饰。在另一实施方案中，N²包含3’-OMe糖修饰。

在另一实施方案中，本发明提供如下化合物，其中x＝y＝18且其中在(N)x中，核苷酸在经修饰的核糖核苷酸与未经修饰的核糖核苷酸之间交替，每个经修饰的核糖核苷酸为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸且位于N¹-(N)x中间处的核糖核苷酸未经修饰；(N’)y的3’端上的两个核苷酸由两个2’-5’磷酸二酯键连接，且(N’)y的5’端上的三个核苷酸为LNA，例如ENA。在另一实施方案中，N²由2’-5’磷酸二酯键连接在(N’)y的3’端上。

在另一实施方案中，(N’)y的5’端上的五个连续核苷酸包含2’OMe糖修饰，且(N’)y的3’端上的两个连续核苷酸为L-DNA。

在另一实施方案中，本发明提供如下化合物，其中x＝y＝18，其中(N)x由未经修饰的核糖核苷酸组成；(N’)y的3’端上的两个连续核苷酸由2’-5’磷酸二酯键连接，且(N’)y的5’端上的三个连续核苷酸为LNA，例如ENA。在另一实施方案中，N²由2’-5’磷酸二酯键连接于(N’)y的3’端。

根据其它实施方案，在(N’)y中，5’或3’端核苷酸或5’及3’端中任一端上的2、3、4、5或6个连续核苷酸或5’及3’端中的每一端上的1至4个核苷酸独立地为膦酰羧酸或膦基羧酸核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施方案中，PACE核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些优选实施方案中，在(N’)y中，5’及3’端中每一端上的1或2个连续核苷酸为PACE核苷酸。

在一些实施方案中，本发明经修饰的siRNA化合物的两链在3’及5’端处都未磷酸化。在其它实施方案中，有义链及反义链在3’端处磷酸化。在另一实施方案中，反义链在末端5’端位置处使用可裂解或不可裂解的磷酸酯基磷酸化。在另一实施方案中，反义链与有义链中的任一个或两者在3’端位置处使用可裂解或不可裂解的磷酸酯基磷酸化。

结构(A)用于针对哺乳动物或非哺乳动物基因的任何寡核苷酸对(有义链及反义链)。在一些实施方案中，哺乳动物基因为人基因。寡核苷酸序列对的实例提供于PCT专利公布No.WO 2006/023544、WO2007/084684、WO 2008/050329、WO 2007/141796、WO 2009/044392、WO 2008/106102、WO 2008/152636、WO 2009/001359、WO/2009/090639中，该专利公布转让给本发明的受让人且以全文引用的方式并入本文中。

除非另外指明，否则在本文所述的结构的优选实施方案中，每个连续N与N’之间的共价键为磷酸二酯键。除非另外指明，否则在本文所述的结构的优选实施方案中，N¹与(N)x之间及N²与(N’)y之间的共价键为磷酸二酯键。在一些实施方案中，至少一个共价键为硫代磷酸酯键。

对于所有上述结构，在一些实施方案中，(N)x的寡核苷酸序列与(N’)y的寡核苷酸序列完全互补。在其它实施方案中，反义链与有义链实质上互补。在某些实施方案中，(N)x与哺乳动物mRNA或微生物RNA或病毒RNA完全互补。在其它实施方案中，(N)x与哺乳动物mRNA或微生物RNA或病毒RNA实质上互补。

在一些实施方案中，具有结构(A)的经修饰的siRNA化合物在相较于N¹与靶标mRNA中的核苷酸互补的siRNA化合物时展现有利的特性，至少包括增强的活性。

本发明另外提供一种药物组合物，其包含有效抑制哺乳动物或非哺乳动物基因表达的量的本发明结构(A)化合物及药学上可接受的载体；以及其用于治疗本文所公开的疾病及病症中的任一个的用途。在一些实施方案中，哺乳动物基因为人基因。在一些实施方案中，非哺乳动物基因与哺乳动物疾病(优选人疾病)有关。

本发明另外涉及治疗或预防有需要的受试者的本文所公开的疾病或病状中的任一个的发生或严重度或降低本文所公开的疾病或病状的风险或严重度的方法，其中该疾病或病状和/或与其相关的症状或风险与哺乳动物或非哺乳动物基因表达相关。在优选实施方案中，受试者为人受试者。

siRNA合成

使用公用及专属算法，产生潜在siRNA的有义及反义序列，且siRNA的N¹和/或N²经取代以产生结构(A)的经修饰的siRNA化合物。

根据上述说明的siRNA分子基本上如本文所述来制备。本发明的经修饰的siRNA化合物为通过本领域中熟知用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何方法来合成。合成通常在市售合成器(尤其自Applied Biosystems得到)中进行。寡核苷酸合成例如描述于Beaucage及Iyer，Tetrahedron 1992；48：2223-2311；Beaucage及Iyer，Tetrahedron 1993；49：6123-6194；及Caruthers等人Methods Enzymol.1987；154：287-313中；硫代酸酯的合成尤其描述于Eckstein，Ann.Rev.Biochem.1985；54：367-402中，RNA分子的合成描述于Sproat，Humana Press 2005，Herdewijn P.编；Kap.2：17-31中，且各自下游方法尤其描述于Pingoud等人，IRL Press 1989，Oliver R.W.A.编；Kap.7：183-208中。

其它合成程序为本领域中所知，例如Usman等人，1987，J.Am.Chem.Soc.，109，7845；Scaringe等人，1990，NAR.，18，5433；Wincott等人，1995，NAR.23，2677-2684；及Wincott等人，1997，Methods Mol.Bio.，74，59中所述的程序可利用常见核酸保护基及偶联基，例如5’-端上的二甲氧基三苯甲基及3’-端上的氨基磷酸酯。必要时并入经修饰(例如2’-O-甲基化)的核苷酸及未经修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，单独合成本发明的寡核苷酸且在合成后例如通过连接(Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，国际专利公布No.WO 93/23569；Shabarova等人，1991，NAR 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等人，1997，Bioconjugate Chem.8，204)或通过在合成和/或脱除保护基后进行杂交而连接在一起。

化学合成的片段的重叠对可使用本领域中熟知的方法(例如参见美国专利No.6,121,426)连接。单独合成每条链，接着在管中彼此退火。接着，通过HPLC将双链siRNA与未退火的单链寡核苷酸(例如由于其中一个过量)分离。关于本发明的经修饰的siRNA化合物，可合成两个或两个以上该序列且将其连接在一起以用于本发明中。

本发明的siRNA化合物具有共价结合于反义链的5’-端上且与靶标mRNA中的核苷酸错配的末端部分。在各种实施方案中，反义链的5’-端上的部分选自由以下组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、经修饰的脱氧核糖尿苷、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、脱氧核糖胸苷、经修饰的脱氧核糖胸苷、核糖胞嘧啶、经修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶、经修饰的脱氧核糖胞嘧啶、5-甲基核糖胞嘧啶、经修饰的5-甲基核糖胞嘧啶、5-甲基核糖尿苷、核糖-2-硫尿苷、核糖-4-硫尿苷、脱碱基核糖部分及脱碱基脱氧核糖部分，且有义链的3’-端上的部分选自核糖核苷酸或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分。本发明的siRNA结构可有利地应用于用于抑制或削弱哺乳动物及非哺乳动物基因表达的双链RNA。

药物组合物

虽然本发明的化合物可以化学原料形式施用，但优选以药物组合物形式提供。因此，本发明提供一种药物组合物，其包含一种或多种本发明的经修饰的siRNA化合物以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含两种或更多种本发明的经修饰的siRNA化合物。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含有效抑制靶标基因的量的至少一种共价或非共价结合于一种或多种本发明化合物的本发明化合物以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，经修饰的siRNA化合物通过内源性细胞复合物细胞内加工，产生一种或多种本发明的寡核糖核苷酸。

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体及有效下调靶标基因在哺乳动物体内细胞中表达的量的一种或多种本发明的经修饰的siRNA化合物，该一种或多种化合物包含与靶标mRNA的序列实质上互补的序列。

在一些实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物为药物组合物中的主要活性组分。在其它实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物为含有两种或更多种siRNA的药物组合物中的活性组分之一，该药物组合物另外包含一种或多种靶向一种或多种靶标基因的siRNA化合物。

本发明也提供一种制备药物组合物的方法，其包括：

提供一种或多种本发明的经修饰的双链siRNA化合物；及将该化合物与药学上可接受的载体混合。

在优选实施方案中，将药学有效剂量的用于制备药物组合物的经修饰的siRNA化合物与载体混合。在一些实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物与类固醇或脂质或另一适合分子，例如胆固醇偶联。

RNA干扰

近来已公布大量与RNAi现象有关的PCT申请。这些公布包括：PCT公布WO 00/44895、PCT公布WO 00/49035、PCT公布WO00/63364、PCT公布WO 01/36641、PCT公布WO 01/36646、PCT公布WO 99/32619、PCT公布WO 00/44914、PCT公布WO 01/29058以及PCT公布WO 01/75164。

RNA干扰(RNAi)是基于dsRNA物质进入细胞质蛋白质复合物中的能力，其中dsRNA物质接着靶向至互补细胞RNA且将其特异性降解。RNA干扰反应特征在于含有siRNA的核酸内切酶复合物，通常称作RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其介导序列与siRNA双链体的反义链互补的单链RNA裂解。靶标RNA的裂解可发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir等人，Genes Dev.，2001，15(2)：188-200)。更详细而言，较长dsRNA由III型核糖核酸酶(DICER、DROSHA等；Bernstein等人，Nature，2001，409(6818)：363-6；Lee等人，Nature，2003，425(6956)：415-9)消化成短(17-29bp)dsRNA片段(也称作短抑制性RNA、“siRNA”)。RISC蛋白质复合物识别这些片段及互补mRNA。整个过程以核酸内切酶使靶标mRNA裂解而告终(McManus&Sharp，Nature Rev Genet，2002，3(10)：737-47；Paddison&Hannon，Curr Opin Mol Ther.2003，5(3)：217-24)。(关于这些术语及所提出的机制的额外信息，参见例如Bernstein等人，RNA 2001，7(11)：1509-21；Nishikura，Cell 2001，107(4)：415-8及PCT公布WO01/36646)。

已广泛报道对应于已知基因的siRNA的选择及合成；参见例如Ui-Tei等人，J Biomed Biotechnol.2006；2006：65052；Chalk等人，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.Mol Biol.；2004，252：457-69；Levenkova等人，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等人，Nuc.Acid Res.2004，32(3)：936-48。关于经修饰的siRNA的使用及产生的实例，参见Braasch等人，Biochem.，2003，42(26)：7967-75；Chiu 等人，RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公布WO2004/015107(Atugen)；WO 02/44321(Tuschl等人)及美国专利No5,898,031及6,107,094。

siRNA及RNA干扰

RNA干扰(RNAi)涉及双链(ds)RNA依赖性基因特异性转录后沉默的现象。一开始，研究此现象及以实验方式操作哺乳动物细胞的尝试由可响应于长dsRNA分子而被活化的活性非特异性抗病毒防御机制阻挠(Gil等人，Apoptosis，2000.5：107-114)。随后，发现具有21个核苷酸的RNA的合成双链体可在哺乳动物细胞中介导基因特异性RNAi而不刺激一般抗病毒防御机制(参见Elbashir等人，Nature 2001，411：494-498及Caplen等人，PNAS USA 2001，98：9742-9747)。因此，小干扰RNA(siRNA)成为试图了解基因功能的有效工具。

哺乳动物体内RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)(Fire等人，Nature 1998，391：806)或微RNA(miRNA)(Ambros，Nature 2004，431(7006)：350-355；Bartel，Cell 2004，116(2)：281-97)介导。植物中的相应过程常称作特异性转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默且在真菌中也称作压抑。

siRNA为一种双链RNA或经修饰的RNA分子，其下调或沉默(阻止)其内源性(细胞)对应物的基因/mRNA表达。下文详述RNA干扰的机制。

若干研究揭露siRNA治疗剂在体内对哺乳动物及人都有效。Bitko等人已显示针对呼吸道细胞融合性病毒(RSV)核衣壳N基因的特异性siRNA分子在经鼻内施用时有效地治疗小鼠(Nat.Med.2005，11(1)：50-55)。可参见所述siRNA治疗剂的近期评述(Barik等人，J.Mol.Med 2005，83：764-773；Dallas及Vlassov，Med.Sci.Monitor 2006，12(4)：RA67-74；Chakraborty，Current Drug Targets 2007，8(3)：469-82；Dykxhoorn等人，Gene Therapy 2006.13：541-552)。

Mucke(IDrugs 2007 10(1)：37-41)作出对当前用于治疗眼部疾病(例如年龄相关的黄斑变性(AMD)及青光眼)的包括针对各种靶标的siRNA的治疗剂的评述。

siRNA结构

已广泛报道对应于已知基因的siRNA的选择及合成(参见例如Ui-Tei等人，J Biomed Biotech.2006；2006：65052；Chalk等人，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.Mol Biol；2004，252：457-69；Levenkova等人，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等人，NAR.2004，32(3)：936-48；De Paula等人，RNA2007，13：431-56)。

关于经修饰的siRNA的使用及产生的实例，参见例如Braasch等人，Biochem.2003，42(26)：7967-75；Chiu等人，RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公布WO 2004/015107(atugen AG)以及WO 02/44321(Tuschl等人)。美国专利No.5,898,031和6,107,094描述经化学修饰的寡聚物。美国专利公布No.2005/0080246和2005/0042647分别涉及具有交替基序的寡聚化合物及具有经化学修饰的核苷间键的dsRNA化合物。

其它修饰已公开。纳入5’-磷酸酯部分显示含增强siRNA在果蝇(Drosophila)胚胎中的活性(Boutla等人，Curr.Biol.2001，11：1776-1780)且为siRNA在人Hela细胞中发挥功能所需(Schwarz等人，Mol.Cell，2002，10：537-48)。Amarzguioui等人(NAR，2003，31(2)：589-95)显示siRNA活性视2’-O-甲基修饰的定位而定。Holen等人(NAR.2003，31(9)：2401-07)报道具有少量2’-O-甲基修饰的核苷的siRNA与野生型相比具有良好活性，但活性随着2’-O-甲基修饰的核苷的数目增加而降低。Chiu及Rana(RNA.2003，9：1034-48)描述相对于未经修饰的siRNA，2’-O-甲基修饰的核苷并入有义链或反义链中(经完全修饰的链)会严重降低siRNA活性。据报道2’-O-甲基放置在反义链的5’-端上会严重限制活性，而放置在反义链的3’-端及有义链的两个末端上则可耐受(Czauderna等人，NAR.2003，31(11)：2705-16；WO2004/015107)。本发明的分子提供的优势在于其稳定且具有活性，且该分子用于制备用于治疗各种疾病的药物组合物。

本发明受让人的PCT专利公布No.WO 2008/1049783及WO2009/044392公开新的siRNA结构，该公布以全文引用的方式并入本文中。

本发明受让人的PCT公布No.WO 2008/050329及美国11/978,089涉及促细胞凋亡基因的抑制剂，且以全文引用的方式并入本文中。

PCT专利公布No.WO 2004/111191及WO 2005/001043涉及增强RNAi的方法。

本发明提供一种使靶标基因的表达比对照下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括使该靶标基因的mRNA转录物与一种或多种本发明化合物接触。

另外，本发明提供一种使靶标基因在哺乳动物体内的表达比对照下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括向哺乳动物施用一种或多种本发明化合物。在本发明的优选实施方案中，哺乳动物为人。

在各种实施方案中，结构(A)的双链核酸分子下调靶标基因的表达，其中靶标基因表达的下调选自包含以下的组：下调基因功能(其尤其例如通过用天然基因/多肽的已知相互作用物的酶检测或结合检测来检查)、下调基因的多肽产物(其尤其例如通过蛋白质印迹、ELISA或免疫沉淀来检查)及下调基因的mRNA表达(其尤其例如通过RNA印迹法、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来检查)。

递送

本发明的经修饰的siRNA化合物以化合物本身形式(即以裸siRNA形式)或以药学上可接受的盐形式施用，且单独或作为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂及媒介物组合施用。在一些实施方案中，本发明的siRNA分子通过直接施用与载体或稀释剂一起制备的裸分子来递送至靶标组织。

术语“裸siRNA”是指不含任何用以辅助、促进或帮助siRNA分子进入细胞中的递送工具(包括病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、脂质转染物或沉淀剂等)的siRNA分子。例如，PBS中的siRNA为“裸siRNA”。

药学上可接受的载体、溶例、稀释剂、赋形剂、佐剂及媒介物以及植入载体一般是指不与本发明的经修饰的活性siRNA化合物反应的惰性无毒固体或液体填充剂、稀释剂或囊封物质，且其包括脂质体及微球体。例如，本发明的siRNA化合物可与聚乙烯亚胺(PEI)、PEI衍生物(例如经油酸及硬脂酸修饰的分支PEI衍生物)、壳聚糖或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)一起配制。在例如脂质体、微球体或纳米球体及纳米粒子中配制组合物可增强稳定性且有益于吸收。

另外，组合物可包括人工载氧体，例如全氟化碳(PFC)，例如全氟溴辛烷(全氟溴烷)。

用于本发明中的递送系统的实例包括美国专利No.5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196和4,475,196。多种该植入物、递送系统及模组为本领域的技术人员所熟知。在本发明的一个特定实施方案中，选择局部制剂和经皮制剂。

因此，在一些实施方案中，本发明的siRNA分子是以脂质体制剂及脂质转染制剂等形式递送且可通过熟知本领域人员所熟知的方法来制备。该方法描述于例如美国专利No.5,593,972、5,589,466和5,580,859中，该专利以引用的方式并入本文中。

已研发特定旨在增强及改良siRNA递送至哺乳动物细胞中的递送系统(参见例如Shen等人，FEBS Let.539：111-114(2003)；Xia等人，Nat.Biotech.20：1006-1010(2002)；Reich等人，Mol.Vision 9：210-216(2003)；Sorensen等人，J.Mol.Biol.327：761-766(2003)；Lewis等人，Nat.Gen.32：107-108(2002)；及Simeoni等人NAR 31，11：2717-2724(2003))。siRNA最近成功用于抑制灵长类动物中的基因表达(关于细节，参见例如Tolentino等人，Retina 2004.24(1)：132-138)。

其它用于改良本发明化合物的递送的制剂可包括未经配制的化合物、与胆固醇共价结合的化合物及结合于靶标抗体的化合物(Song等人，Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs viacelL-surface receptors，Nat Biotechnol.2005.23(6)：709-17)。偶联胆固醇的siRNA(及其它偶联类固醇和脂质的siRNA)可用于递送(参见例如Soutschek等人，Nature.2004.432：173-177；及Lorenz等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2004.14：4975-4977。

裸siRNA或包含本发明的经化学修饰的siRNA的药物组合物为根据良好医疗实践，考虑个别患者的临床情况、待治疗的疾病、施用部位及方法、施用时程、患者年龄、性别、体重及其它为医药从业者所知的因素来施用及给药。

出于本文的目的，因此“治疗有效量”是通过如本领域中已知的考虑因素来决定。剂量须有效实现改善，包括(但不限于)提高存活率或更快地恢复，或改善或消除症状及其它如由本领域的技术人员选作适当量度的指示物。本发明的siRNA可以单次剂量或多次剂量施用。

一般而言，在单次施用或每日一次施用或每日两次或三次或更多次施用1-4周或更久的时段的方案中，用于人的化合物的有效剂量介于每日每公斤体重1ng至约20-100mg，优选每日每公斤体重约0.01mg至约2-10mg的范围内。

本发明的经修饰的siRNA化合物可通过任何已知施用途径施用。经修饰的siRNA化合物经口、皮下或肠胃外(包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、眼内、经眼、经耳、经鼓室及鼻内施用、气管内滴注及气管内吸入以及输注技术)施用。也使用化合物的植入物。

液体形式经制备以用于侵入式施用(例如注射)或用于表面或局部或非侵入式施用。术语注射包括皮下、经皮、静脉内、肌肉内、鞘内、眼内、经鼓室及其它本发明的施用途经。液体组合物包括含和不含有机共溶剂的水性溶液、水性或油性悬浮液、含可食用油的乳液以及类似药用媒介物。在特定实施方案中，施用包含静脉内施用。

在一些实施方案中，本发明的化合物经配制以用于非侵入式施用。在一些实施方案中，本发明的化合物配制成用于局部施用耳朵的滴耳剂。在一些实施方案中，本发明的化合物配制成用于局部施用眼睛表面的滴眼剂。其它关于施用本发明化合物的信息可见于Tolentino等人，Retina 2004.24：132-138；及Reich等人，Molecular Vision，2003.9：210-216中。另外，在某些实施方案中，用于治疗的本发明组合物为例如用于鼻内施用的气雾剂形式。在某些实施方案中用于治疗的本发明组合物为例如用于鼻内滴注的滴鼻剂形式。

本发明的治疗组合物优选通过吸入含有这些组合物/化合物的气溶胶或通过鼻内或气管内滴注该组合物来施用到肺中。关于肺部递送药物组合物的其它信息，参见Weiss等人，Human Gene Therapy 1999.10：2287-2293；Densmore等人，Molecular therapy 1999.1：180-188；Gautam等人，Molecular Therapy 2001.3：551-556；及Shahiwala和Misra，AAPS Pharm Sci Tech 2004.24；6(3)：E482-6。另外，siRNA的呼吸道制剂描述于美国专利申请公布No.2004/0063654中。siRNA的呼吸道制剂描述于美国专利申请No.2004/0063654中。

在某些实施方案中，口服组合物(例如片剂、混悬液、溶液)可有效地局部递送至口腔，例如用于治疗口腔粘膜炎的嗽口水的口服组合物。

在特定实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物经配制以用于静脉内施用来递送至肾中，以治疗肾病，例如急性肾衰竭(ARF)、移植肾功能延迟恢复(DGF)及糖尿病性视网膜病。应注意，将本发明的经修饰的siRNA化合物递送至肾近端小管中的靶标细胞尤其对治疗ARF及DGF有效。

将化合物递送至脑中可通过若干方法实现，尤其例如神经外科植入物、血脑屏障破坏、脂质介导的输送、载体介导的流入或流出、血浆蛋白质介导的输送、受体介导的转胞吞作用、吸收剂介导的转胞吞作用、血脑屏障处的神经肽输送以及基因工程改造靶向药物的“特洛伊木马”(Trojan horse)。上述方法例如“Brain Drug Targeting：the futureof brain drug development”，W.M.Pardridge，Cambridge UniversityPress，Cambridge，UK(2001)中所述来进行。

另外，在某些实施方案中，用于治疗的本发明组合物为例如用于鼻内施用的气雾剂形式。

已用乙酰胆碱酯酶抑制剂实现鼻内递送以治疗CNS疾病，例如加兰他敏及加兰他敏的各种盐及衍生物，例如美国专利申请No.2006003989及PCT申请公布No.WO 2004/002402和WO 2005/102275中所述。例如PCT申请No.WO 2007/107789中描述例如通过鼻内滴注滴鼻剂鼻内递送核酸来治疗CNS疾病。

治疗方法

在一方面中，本发明是涉及治疗罹患与靶标基因表达相关的病症的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明经修饰的siRNA化合物。在优选实施方案中，所治疗的受试者为温血动物，且尤其为哺乳动物，包括人。

“治疗受试者”是指向受试者施用有效改善与疾病相关的症状、减轻严重度或治疗疾病、减慢疾病发展、预防疾病发生或延迟疾病发作的治疗物质。“治疗”是指治疗性处理及防治性或预防性措施，其中目的在于预防病症、延迟病症发作或减轻病症症状。需要治疗的受试者包括已经历疾病或病况的受试者、有患疾病或病况的倾向的受试者以及有待预防疾病或病况的受试者。在疾病或病况发作之前、期间或之后施用本发明的化合物。

“治疗有效剂量”是指药物化合物或组合物有效实现受试者或其生理系统改善的量，该改善包括(但不限于)存活率提高、更快地恢复、症状改善或消除、病症发作延迟、疾病发展减慢及其它由本领域技术人员选作适当决定性量度的指示物。

“呼吸道病症”是指呼吸系统的病况、疾病或综合症，包括(但不限于)所有类型的肺部病症，尤其包括慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、慢性支气管炎、哮喘及肺癌。肺气肿及慢性支气管炎可作为COPD的一部分发生或独立发生。在各种实施方案中，本发明提供用于预防或治疗有需要的受试者的原发性移植失败、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、器官移植(尤其为肺移植)后肺再植入反应和/或原发性移植物功能障凝(PGD)的方法及组合物。

“微血管病症”是指任何影响微观毛细管及淋巴管的病状，尤其血管痉挛性疾病、血管炎疾病及淋巴阻塞性疾病。微血管病症的实例尤其包括：眼部病症，例如暂时性黑蒙(栓塞或继发性SLE)、apla综合症、Prot CS及ATIII缺乏症、因使用IV药物而引起的微血管病变、异常蛋白血症、颞动脉炎、缺血性视神经病变(ION)、前部缺血性视神经病变(AION)、视神经炎(原发或继发于自体免疫疾病)、青光眼、von Hippel Lindau综合症、角膜病、角膜移植排斥白内障、伊尔斯氏病(Eales′disease)、霜样树枝状视网膜血管炎、环扎术(encirclingbuckling operation)、葡萄膜炎(包括平坦部炎的葡萄膜炎)、脉络膜黑素瘤、脉络膜血管瘤、视神经发育不全；视网膜病况，例如视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病、HIV视网膜病、普尔夏视网膜病(Purtscher retinopathy)、全身性血管炎及自体免疫疾病的视网膜病、糖尿病性视网膜病、高血压性视网膜病、辐射性视网膜病、树枝状视网膜动脉或静脉阻塞、特发性视网膜血管炎、动脉瘤、视神经绸膜炎、视网膜栓塞、急性视网膜坏死、鸟枪弹样视网膜脉络膜病变、长期视网膜脱离；全身性病状，例如糖尿病、糖尿病性视网膜病(DR)、糖尿病相关的微血管病变(如本文详述)、高粘稠度综合症、主动脉弓综合症及眼部缺血综合症、颈动脉海绵窦瘘、多发性硬化症、全身性红斑性狼疮症、SS-A自体抗体的小动脉炎、急性多发性出血性血管炎、由感染所致的血管炎、由白塞病(Behcet′s disease)所致的血管炎、类肉瘤病、凝血障碍、神经病、肾病、肾微血管病及缺血性微血管病状。

微血管病症可包含新生血管性要素。术语“新生血管性病症”是指血管形成(新血管生成)对患者有害的病状。眼部新血管生成的实例包括：视网膜病(糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、慢性青光眼、视网膜脱离及镰状细胞性视网膜病)；虹膜红变；增生性玻璃体视网膜病；炎性疾病；慢性葡萄膜炎；肿瘤(视网膜母细胞瘤、假神经胶质瘤及黑素瘤)；福斯氏异色性虹膜睫状体炎(Fuchs′heterochromic iridocyclitis)；新生血管性青光眼；角膜新血管生成(虹膜发炎、移植及发育不全)；组合的玻璃体切除术及晶状体切除术后新血管生成；血管疾病(视网膜缺血、脉络膜血管功能不全、脉络膜血栓症及颈动脉缺血)；视神经新血管生成；及由眼睛刺穿或撞伤性眼部损伤所致的新血管生成。在各种实施方案中，使用本发明的化合物及药物组合物治疗所有这些新生血管性病况。

“眼部疾病”是指眼睛的病况、疾病或综合症，包括(但不限于)任何涉及脉络膜新血管生成(CNV)的病况、湿型和干型AMD、眼组织胞浆菌病综合症、血管样条纹、布鲁赫氏膜破裂、近视性变性、眼部肿瘤、视网膜退化性疾病及视网膜静脉阻塞(RVO)。在各种实施方案中，根据本发明的方法治疗本文所公开的病况，例如DR，其在本文所提供的定义下视作微血管病症及眼部疾病或两者。

更特定而言，本发明提供用于治疗罹患或易患以下疾病的受试者的方法及组合物：成人呼吸窘迫综合症(CARDS)；慢性阻塞性肺病(COPD)；急性肺损伤(ALI)；肺气肿；糖尿病性神经病、肾病及视网膜病；糖尿病性黄斑水肿(DME)及其他糖尿病性病况；青光眼；年龄相关的黄斑变性(AMD)；骨髓移植(BMT)视网膜病；缺血性病况；眼缺血性综合症(OIS)；肾病症；急性肾衰竭(ARF)、移植肾功能延迟恢复(DGF)、移植排斥；听力障碍(包括听力丧失)；脊髓损伤；口腔粘膜炎；干眼综合症及褥疮；由例如以下的缺血性或缺氧性病况所致的神经病症：高血压、高血压性大脑血管病、血管收缩或阻塞(如血栓或栓塞情况下出现)、血管瘤、恶血质、任何形式的心脏功能受损(包括心跳骤停或衰竭)、全身性低血压；中风、CNS疾病、病症及损伤，包括(不限于)癫痫症、脊髓损伤、脑损伤及神经退行性病症，包括(不限于)帕金森氏症、肌萎缩性侧索硬化(ALS、葛雷克氏症(Lou Gehrig′sDisease))、阿尔茨海默病、亨廷顿氏症及任何其它疾病诱发性痴呆(例如HIV相关的痴呆)。

本发明为关于用于治疗癌症的化合物、组合物及方法。术语“癌症”是指或描述通常特征为细胞生长失调的哺乳动物生理病况。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴恶性病。该癌症的其它实例包括肾癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞状细胞癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌、胃肠基质肿瘤(GIST))、胰腺癌、头颈癌、神经胶母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤(thecomas)、男性细胞瘤(arrhenoblastomas)、肝瘤、血液恶性病(包括非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)、多发性骨髓瘤及急性血液恶性病)、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食道癌、肝癌瘤、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、黑素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤、少枝胶质瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、胚胎性癌肉瘤(Wilm′s tumor)，以及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥散性NHL；高度免疫母细胞性NHL；高度淋巴母细胞性NHL；高度小型无裂细胞性NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；及瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性骨髓母细胞性白血病；及移植后淋巴组织增生病症(PTLD)，以及与母斑细胞病相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)及梅格斯氏综合症(Meigs′syndrome)。如本文所用的“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长及增殖(恶性或良性)及所有癌前及癌细胞及组织。

纤维变性病症包括肝纤维化、硬化、肺部纤维化(包括肺纤维化(包括ILF))、由任何病况(例如CKD，包括ESRD)引起的肾纤维化、腹膜纤维化、慢性肝损伤、原纤维生成、其它器官的纤维变性疾病、与所有可能类型的皮肤损伤(意外性及医源性(手术))相关的异常疤痕(瘢痕瘤)；硬皮病；心脏纤维化、青光眼滤过手术失败；及肠粘连。

另外，本发明提供一种使靶标基因的表达比对照下调至少20％、30％、40％或50％的方法，其包括使靶标mRNA与一种或多种本发明的经修饰的siRNA化合物接触。在各种实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物下调靶标基因，其中该下调选自包含以下的组：下调基因功能、下调多肽及下调mRNA表达。

本发明提供一种使靶标基因的表达比对照抑制至少20％、30％或40％，优选50％、60％或70％，更优选75％、80％或90％的方法，其包括使靶标基因的mRNA转录物与一种或多种本发明的经修饰的siRNA化合物接触。

在一个实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物抑制靶标基因多肽，其中该抑制选自包含以下的组：抑制功能(其尤其例如通过用天然基因/多肽的已知相互作用物的酶检测或结合检测来检查)、抑制靶标蛋白质(其尤其例如通过蛋白质印迹法、ELISA或免疫沉淀来检查)及抑制靶标mRNA表达(其尤其例如通过RNA印迹法、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交来检查)。

在其它实施方案中，本发明提供一种治疗罹患或易患任何伴有哺乳动物或非哺乳动物靶标基因水平升高的疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的本发明经修饰的siRNA化合物或组合物，从而治疗受试者。

本发明涉及下调哺乳动物靶标基因表达的化合物、尤其结构(A)的经修饰的RNA化合物的用途，其是用于治疗其中抑制哺乳动物靶标基因表达有益的下列疾病或病况：ARDS；COPD；ALI；肺气肿；糖尿病性神经病、肾病及视网膜病；DME及其它糖尿病性病况；青光眼；AMD；BMT视网膜病；缺血性病况，包括中风；OIS；神经退行性病症，例如帕金森氏症、阿尔茨海默病、ALS；肾病：ARF、DGF、移植排斥；听力障碍；脊髓损伤；口腔粘膜炎；癌症，包括造血性及实体肿瘤癌症、干眼综合症及褥疮。在另一实施方案中，本发明的化合物用于移植前器官储存和/或保存。

“暴露于毒性剂”意指毒性剂为哺乳动物获得或与哺乳动物接触。毒性剂可对神经系统具有毒性。暴露于毒性剂可通过直接施用，例如通过摄入或施用食物、药物或治疗剂(例如化学治疗剂)，通过意外污染，或通过环境暴露(例如空气或水暴露)而发生。

在其它实施方案中，本发明的经化学修饰的siRNA化合物及方法用于治疗或预防受试者的其它疾病及病况的发生或严重度。这些疾病及病况包括(但不限于)中风及中风样情况(例如大脑、肾脏、心脏衰竭)、神经元细胞死亡、在存在或不存在再灌注下的脑损伤、脊髓损伤、慢性退化性疾病，例如神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿氏症、多发性硬化症、脊髓延髓萎缩、朊病毒疾病及由创伤性脑损伤(TBI)引起的细胞凋亡。在另一实施方案中，本发明的化合物及方法针对提供神经保护和/或大脑保护。

靶标基因选自由以下组成的组(但不限于)：p53(TP53)、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2(胱天蛋白酶2)、NOX3、HRK；C1QBP、BNIP3、MAPK8；Rac1、GSK3B、CD38、STEAP4、BMP2a；GJA1、TYROBP、CTGF、SPP1、RTN4R、ANXA2、RHOA、DUOX1、SLC5A1、SLC2A2、AKR1B1、SORD、SLC2A1、MME、NRF2、SRM、REDD2(RTP801L)、REDD1(RTP801)、NOX4、MYC、PLK1、ESPL1、HTRA2、KEAP1、p66、ZNHIT1、LGALS3、CYBB(NOX2)、NOX1、NOXO1、ADRB1、HI95、ARF1、ASPP1、SOX9、FAS、FASLG、人MLL、AF9、CTSD、CAPNS1、CD80、CD86、HES1、HES5、CDKN1B、ID1、ID2、ID3、CDKN2A、胱天蛋白酶1、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶12、胱天蛋白酶14、Apaf-1、Nod1、Nod2、Ipaf、DEFCAP、RAIDD、RICK、Bcl10、ASC、TUCAN、ARC、CLARP、FADD、DEDD、DEDD2、TRADD、隐热蛋白(Cryopirin)、PYC1、热蛋白(Pyrin)、TRADD、UNC5a、UNC5b、UNC5c、ZUD、p84N5、LRDD、CDK1、CDK2、CDK4、CDK5、CDK9、PITSLREA、CHK2、LATS1、Prk、MAP4K1、MAP4K2、STK4、SLK、GSK3α、GSK3β、MEKK1、MAP3K5(Ask1)、MAP3K7、MAP3K8、MAP3K9、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K12、DRP-1、MKK6、p38、JNK3、DAPK1、DRAK1、DRAK2、IRAK、RIP、RIP3、RIP5、PKR、IRE1、MSK1、PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCε、PKη、PKCμ、PKCθ、PKCζ、CAMK2A、HIPK2、LKB1、BTK、c-Src、FYN、Lck、ABL2、ZAP70、TrkA、TrkC、MYLK、FGFR2、EphA2、AATYK、c-Met、RET、PRKAA2、PLA2G2A、SMPD1、SMPD2、SPP1、FAN、PLCG2、IP6K2、PTEN、SHIP、AIF、AMID、细胞色素C、Smac、HtrA2、TSAP6、DAP-1、FEM-、DAP-3、粒酶B、DIO-1、DAXX、CAD、CIDE-A、CIDE-B、Fsp27、Ape1、ERCC2、ERCC3、BAP31、Bit1、AES、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、HIP1、hSir2、PHAP1、GADD45b、GADD34、RAD21、MSH6、ADAR、MBD4、WW45、ATM、mTOR、TIP49、双泛素/FAT10、FAF1、p193、镰刀蛋白(Scythe)/BAT3、Amida、IGFBP-3、TDAG51、MCG10、PACT、p52/RAP、ALG2、ALG3、早老素-1(presenelin-1)、PSAP、AIP1/Alix、ES18、mda-7、p14ARF、ANT1、p33ING1、p33ING2、p53AIP1、p53DINP1、MGC35083、NRAGE、GRIM19、脂质运载蛋白2、生殖糖蛋白A、NADE、Porimin、STAG1、DAB2、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-9、SPRC、FLJ21908、WWOX、XK、DKK-1、Fzd1、Fzd2、SARP2、axin 1、RGS3、DVL1、NFkB2、IkBα、NF-ATC1、NF-ATC2、NF-ATC4、zf3/ZNF319、Egr1、Egr2、Egr3、Sp1、TIEG、WT1、Zac1、Icaros、ZNF148、ZK1/ZNF443、ZNF274、WIG1、HIVEP1、HIVEP3、Fliz1、ZPR9、GATA3、TR3、PPARG、CSMF、RXRa、RARa、RARb、RARg、T3Ra、Erβ、VDR、GR/GCCR、p53、p73α、p63(人[taα、taβ、taγ、daα、aβ、daγ]、53BP2、ASPP1、E2F1、E2F2、E2F3、HIF1α、TCF4、c-Myc、Max、Mad、MITF、Id2、Id3、Id4、c-Jun、c-Fos、ATF3、NF-IL6、CHOP、NRF1、c-Maf、Bach2、Msx2、Csx、Hoxa5、Ets-1、PU1/Spil、Ets-2、ELK1、TEL1、c-Myb、TBX5、IRF1、IRF3、IRF4、IRF9、AP-2α、FKHR、FOXO1A、FKHRL1、FOXO3a、AFX1、MLLT7、Tip60、BTG1、AUF1、HNRPD、TIA1、NDG1、PCBP4、MCG10、FXR2、TNFR2、LTbR、CD40、CD27、CD30、4-1BB、TNFRSF19、XEDAR、Fn14、OPG、DcR3、FAS、TNFR1、WSL-1、p75NTR、DR4、DR5、DR6、EDAR、TNFα、FAS配体、TRAIL、淋巴毒素α、淋巴毒素β、4-1BBL、RANKL、TL1、TWEAK、LIGHT、APRIL、IL-1-α、IL-1-β、IL-18、FGF8、IL-2、IL-21、IL-5、IL-4、IL-6、LIF、IL-12、IL-7、IL-10、IL-19、IL-24、IFNα、IFNβ、IFNγ、M-CSF、促乳素、TLR2、TLR3、TLR4、MyD88、TRIF、RIG-1、CD14、TCRα、CD3γ、CD8、CD4、CD7、CD19、CD28、CTLA4、SEMA3A、SEMA3B、HLA-A、HLA-B、HLA-L、HLA-Dmα、CD22、CD33、CALL、DCC、ICAM1、ICAM3、CD66a、PVR、CD47、CD2、Thy-1、SIRPa1、CD5、E-钙粘素、ITGAM、ITGAV、CD18、ITGB3、CD9、IgE Fc Rβ、CD82、CD81、PERP、CD24、CD69、KLRD1、半乳糖凝集素1、B4GALT1、C1qα、C5R1、MIP1α、MIP1β、RANTES、SDF1、XCL1、CCCKR5、OIAS/OAS1、INDO、MxA、IFI16、AIM2、iNOS、HB-EGF、HGF、MIF、TRAF3、TRAF4、TRAF6、PAR-4、IKKγ、FIP2、TXBP151、FLASH、TRF1、IEX-1S、Dok1、BLNK、CIN85、Bif-1、HEF1、Vav1、RasGRP1、POSH、Rac1、RhoA、RhoB、RhoC、ALG4、SPP1、TRIP、SIVA、TRABID、TSC-22、BRCA1、BARD1、53BP1、MDC1、Mdm4、Siah-1、Siah-2、RoRet、TRIM35、PML、RFWD1、DIP1、Socs1、PARC、USP7、CYLD、SERPINH1(HSP47)。其它使用的靶标基因为微生物起源的基因。

组合疗法

治疗本文所公开的疾病的方法包括由本文所公开的经修饰的双链核酸分子联合或组合施用另一抑制剂、改良经修饰的siRNA化合物的药理学特性的物质或其它已知有效治疗已罹患或易患任何上述疾病及病症的受试者的化合物，该疾病及病症包括微血管病症、眼部疾病及病况(例如黄斑变性)、听力损伤(包括听力丧失)、呼吸道病症、肾病、器官移植、神经退行性病症、脊髓损伤、脑损伤、血管生成相关病况及细胞凋亡相关病况。

本发明因此在另一方面中提供一种药物组合物，其包含本发明的治疗性经修饰的siRNA化合物与至少一种其它治疗活性剂的组合。“联合”或“组合”意指之前、同时或之后。因此，此类组合的个别组分从相同或分开的药物制剂依序或同时施用。

包含已知用于治疗微血管病症、眼部疾病及病况(例如黄斑变性)、听力损伤(包括听力丧失)、呼吸道病症、肾病、器官移植、神经退行性病症(例如脊髓损伤)、血管生成相关病况及细胞凋亡相关病况的治疗联合本文所述的经修饰的siRNA化合物及疗法的组合疗法视作本发明的一部分。

因此，在本发明的另一方面中，联合本发明的药物组合物施用另一种药学上有效的化合物。另外，使用本发明的经修饰的siRNA化合物来制备药物，该药物用作使用第二治疗活性化合物的辅助疗法来治疗该病况。与本发明的经化学修饰的siRNA化合物组合使用的已知第二治疗剂的适当剂量很容易由本领域的技术人员所了解。

在一些实施方案中，提出上文提及的组合以单一药物制剂形式使用。

包含任一种本发明的药物活性siRNA偶联物的药物组合物的施用是通过多种已知施用途径(包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或大脑内)的任一种进行，由熟练的从业人员决定。使用专门制剂，可经口或经由吸入或经由鼻内滴注施用组合物。在一些实施方案中，本发明的化合物经配制用于局部施用，包括配制成滴耳剂、滴眼剂、皮肤制剂、经皮制剂等。

“联合”意指另一种药学上有效的化合物在施用本发明的化合物或药物组合物之前、同时或之后施用。因此，上文所提及的此类组合的个别组分可从相同或分开的药物制剂依序或同时施用。如同本发明的经修饰的siRNA化合物的情况，第二治疗剂可通过任何适合途径，例如通过经口、经颊、吸入、舌下、直肠、阴道、经尿道、经鼻、经耳、经眼、表面、经由皮肤(即经皮)或肠胃外(包括静脉内、肌肉内、皮下及冠状动脉内)施用来施用。

在一些实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物及第二治疗剂由相同途径施用，其是以单个组合物或两种或更多种不同药物组合物形式提供。然而，在其它实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物与第二治疗剂的施用途径不同为可能或优选的。本领域的技术人员了解单独或联合施用每种治疗剂的最佳方式。

在各种实施方案中，本发明的经修饰的siRNA化合物为药物组合物中的主要活性组分。

在另一方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含两种或更多种用于治疗疾病及本文所提及的任何疾病及病况的siRNA分子。在一些实施方案中，将两种或更多种siRNA分子或包含所述分子的制剂以产生相等或有益活性的量混合成药物组合物。在某些实施方案中，两种或更多种siRNA分子共价或非共价结合，或通过长度为2-100个、优选2-50个或2-30个核苷酸的核酸连接子连接在一起。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物进一步包含一种或多种靶向一种或多种其它基因的其它siRNA分子。在一些实施方案中，同时抑制所述其它基因为治疗本文所公开的疾病提供累加或协同作用。

根据施用方式、施用时程及剂量进行本发明的治疗方案，从而改善患者自本文所公开的病况的不利影响中进行功能恢复，或延迟病症发作。

已以说明性方式描述本发明，且应了解，所使用的术语意欲具有描述措辞的性质而非限制性。

根据上述教导有可能对本发明进行修改及变化。因此，应了解在随附申请专利范围的范畴内，可以除如特定所述之外的方式实践本发明。

下文参考实施例详细说明本发明，但不应视作限于该实施例。

本文对任何文献的引用不意欲为承认该文献为相关先前技术，或视为本申请的任何申请专利范围的专利性的材料。任何关于任何文献的内容或日期的说明是基于由本发明申请者在申请时得到的信息，且不构成对该说明的正确性的承认。

实施例

在不进一步详细描述下，相信本领域的技术人员可使用先前描述最大程度地利用本发明。因此，下列优选特定实施方案仅视作说明性的，而不以任何方式限制所主张的本发明。

本文未特定描述的本领域中已知的标准分子生物学方案一般基本上遵循Sambrook等人，Molecular cloning：A laboratory manual，ColdSprings Harbor Laboratory，New-York(1989，1992)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1988)；及Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；及Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley&Sons，New York(1988)；及Watson等人，Recombinant DNA，ScientificAmerican Books，New York及Birren等人(编)Genome Analysis：ALaboratory Manual Series，第1-4卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1998)中所述，以及如美国专利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057(以引用的方式并入本文中)中所述的方法。聚合酶链式反应(PCR)一般如PCR Protocols：AGuide To Methods And Applications，Academic Press，San Diego，CA(1990)中所述来进行。原位(细胞内)PCR与流式细胞仪的组合可用于检测含有特定DNA及mRNA序列的细胞(Testoni等人，Blood 1996，87：3822)。进行RT-PCR的方法也为本领域所熟知。

实施例1.产生针对靶标基因的siRNA的序列及生成经修饰的siRNA化合物

使用专属算法及任何基因的已知序列，任选使用本文所公开的促细胞凋亡基因，产生多种潜在siRNA的t19聚体序列。除算法之外，通过对19聚体序列进行5’和/或3’延长产生一些23聚体寡聚物序列。使用此方法产生的反义链序列与靶标mRNA序列的一部分完全或实质上互补。在一些实施方案中，反义序列与相应mRNA序列的一部分完全互补。为产生本发明的经修饰的siRNA化合物，取代反义链(N)x的5’端位置(位置1；N¹)上的核苷酸，产生结构(A)的实施方案的双链核酸分子。在其它实施例中，取代反义链(N)x的5’端位置上的核苷酸及有义链(N’)y的3’端位置上的核苷酸，产生结构(A)的实施方案的双链核酸分子。

表A提供一些实施例中所用的化合物的有义链及反义链的核苷酸序列。表A1提供如所述产生以提供根据结构(A)的实施方案的经修饰的siRNA化合物的示例性双链核酸分子。本文所示的化合物不意欲具有限制性，且可使用任何靶标RNA来鉴别如本文所述的双链核酸分子。表A2提供产生以进行比较测试的经修饰的siRNA化合物。表A1及A2中的经修饰的siRNA化合物靶向TLR2(智人toll样受体2(TLR2)的mRNA，gi|68160956|ref|NM_003264.3|，SEQ ID NO：4)基因及CAPNS1(钙蛋白酶的小亚基1变体，gi|51599152|ref|NM_001749.2|；SEQ ID NO：1或钙蛋白酶的小亚基1变体2，gi|51599150|ref]NM_001003962.1|，SEQ ID NO：2)基因。其它化合物靶向人RhoA mRNA(ras同源物基因家族的成员A(RhoA)的mRNA，gi|50593005|ref|NM_001664.2|，SEQ ID NO：3)。哺乳动物靶标基因的mRNA序列可例如在NCBI网站[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]上获得。

表A

表A1：本发明的示例性TLR2双链分子

表A2：合成进行比较测试的化合物

下文表A3提供用于制备表A1及A2的siRNA寡核苷酸的经修饰的核苷酸/非常规部分的代码。

表A3：如本文各表中所用的经修饰的核苷酸/非常规部分的代码

代码	修饰
		dT	胸苷-3′-磷酸
A	2′-O-甲基腺苷-3′-磷酸
		C	2′-O-甲基胞苷-3′-磷酸
G	2′-O-甲基鸟苷-3′-磷酸
		U	2′-O-甲基尿苷-3′-磷酸
dB	倒置脱碱基脱氧核糖-3′-磷酸
		dU	脱氧核糖尿苷-3′-磷酸
LdC	L-脱氧核糖胞苷-3′-磷酸(对映体dC)
		C3	C3-OH
C3C3	C3Pi-C3OH

实施例2：体外测试经修饰的siRNA化合物

测试siRNA活性的方案

如下测试本发明的经修饰的siRNA化合物的活性：将每孔约1×10⁵个大鼠REF52(对于TLR2siRNA活性)或0.6×10⁵个人PC3细胞(对于CAPNS1siRNA活性)接种于6孔板中(30％-70％汇合)。孵育约24小时后，用dsRNA寡聚物(参见下表A4及A5)，使用Lipofectamine^TM2000(Invitrogene)，以1-40nM的最终浓度(对于TLR2dsRNA)以及以5-40nM的最终浓度(对于CAPNS1dsRNA)转染细胞。

表A4：TLR2_16siRNA化合物(SEQ ID NO：6及11)

表5A：CAPNS1_23siRNA化合物(SEQ ID NO：5及10)

使用REDD14-Cy3.5标记的寡聚物作为细胞转染效率的阳性对照。使用乱序(CNL)寡聚物(浓度与第1.2部分中所提及的浓度相同)作为siRNA活性的阴性对照。细胞转染24小时后，通过萤光显微法测试转染效率。

siRNA样品制备：对于每个转染孔，将3μl Lipofectamine 2000试剂在250μl无血清培养基中稀释，且在室温下孵育5分钟。

siRNA分子如下制备：

siRNA工作溶液：

REDD14-Cy3.5原液，1.5X10⁶nM(用PBS进行1∶150稀释以具有10μM的最终浓度)。

CNL原液，1.6X10⁶nM(用PBS进行1∶160稀释以具有10μM的最终浓度)。

靶标基因原液，100μM(用PBS进行1∶10稀释以具有10μM的最终浓度)。

在250DMEM培养基中，将TLR2、CAPNS1及CNL siRNA寡聚物的样品稀释至如上文所述(第1.2部分及第1.4部分)的最终浓度，且将REDD14-Cy3.5siRNA稀释至20nM，经计算每孔最终体积为2ml。将Lipofectamine^TM 2000与siRNA组合(1∶1体积)，轻轻混合样品且在室温下孵育20分钟。

转染：将Lipofectamine/siRNA复合物添加至细胞上(每孔500μl)，将培养板来回摇动(每孔最终体积为2ml)。在CO₂孵育箱中于37℃下孵育细胞。

通过qPCR定量mRNA水平：在细胞转染48个小时后，获得细胞且使用EZ-RNA^TM试剂盒[Biological Industries(#20-410-100)]分离RNA。进行cDNA合成且通过qPCR测量mRNA水平。相对于参考基因肽基脯氨酰基异构酶A(亲环素A，CycloA)的mRNA量归一化所测量的mRNA量。

siRNA活性结果：

TLR2_16siRNA活性：对TLR2_16siRNA转染后，表达内源基因的REF52细胞中大鼠TLR2的表达的qPCR分析(表A6中的数据显示REF52细胞中的残余(对照未转染细胞的百分比)大鼠TLR2表达)。

表A6

最具活性的化合物为TLR2_16_S938，其具有与靶标mRNA错配的反义链及完全互补的双链体。在TLR2_16_S938中，N¹＝U及N²＝A，且N¹与靶标mRNA中的C错配。

CAPNS1_23siRNA活性

对CAPNS1_23siRNA转染后，表达内源基因的人PC-3细胞中CAPNS1的表达的qPCR分析(表A7中的数据显示PC-3细胞中的残余(对照未转染的细胞的百分比)人CAPNS1表达)。

表A7

最具活性的化合物为CAPNS1_23_S938，其具有与靶标mRNA错配的反义链及完全互补的双链体。在CAPNS1_23_S938中，N¹＝U及N²＝A，且N¹与靶标mRNA中的C错配。

根据结构(A)的测试化合物的活性比反义链与靶标mRNA完全互补的对照化合物大至少10％。

双链RNA分子的中靶及脱靶测试

此研究的目的在于评定对照(未经修饰)及测试(经化学修饰)双链核酸分子的中靶活性和潜在脱靶活性。

siRNA分子的双链具有构型如关于靶标基因mRNA的有义链及反义链的序列。在细胞中，siRNA的称作引导链(GS)的反义链负载至RNA诱导的沉默复合物(RISC)中且用以将RNAi机制引导至靶标mRNA中的互补序列。称作过客链(PS)的有义链遭破坏。当GS与靶标mRNA之间存在准确互补性时，后者由RISC的RNaseH样切割酶活性裂解。

在一些情况下，siRNA分子可能下调转录物与3’-UTR中GS种子区域(位置2-8上的核苷酸[5’＞3’])互补的非预期基因。不希望受理论限制，此脱靶效应可能由类似于微型RNA(miRNA)的靶标沉默的机制介导。siRNA的另一类型脱靶活性可因有义链(PS)负载于RISC中而出现。合成siRNA的非预期脱靶效应可通过对siRNA双链体中的初始siRNA序列进行化学修饰来降低或消除。因此设计测试分子。

在“基于引导种子序列及过客链的活性检测”中，使用psiCHECK^TM(Promega)质粒构建体来评定测试分子的中靶活性(针对靶标mRNA的活性)与脱靶活性(针对除靶标mRNA以外的mRNA的活性)。测试分子及对照分子的活性是针对完整靶标序列(与测试分子的GS或PS的整个19-碱基序列完全互补的核苷酸序列)或种子靶标序列(与测试分子的GS或PS的核苷酸1-8[5’＞3’]互补的序列)来测试。

相较于未经修饰的对照siRNA，测试分子至少针对GS完整靶标位点具有活性。测试分子针对PS完整靶标位点无活性，而未经修饰的对照siRNA针对同一位点表达活性。两种siRNA针对GS种子靶标序列及PS种子靶标序列位点都无活性。

引导链(GS)是指双链RNA中能够进入RISC复合物中且引导靶标RNA沉默的反义链。

过客链(PS)是指双链RNA的有义链。

种子序列是指GS的核苷酸2-8(5’＞3’)且与脱靶识别相关。

CM(完全匹配)是指合成DNA片段的核苷酸序列与双链RNA分子的引导链完全互补。此DNA片段是克隆于报道基因的3’UTR中且用作RNA沉默的靶标。(Castanotto及Rossi(2009).Nature，22：426-33)。

SM(种子匹配)是指合成DNA片段的核苷酸序列与测试分子siRNA的引导链的核苷酸1-8(5’＞3’)(第1个核苷酸+种子)完全互补。此DNA片段为克隆于报道基因的3’UTR中且用作基于种子的“脱靶”沉默的靶标。

psiCHECK^TM系统能够通过监测靶标序列的表达水平的变化，对引起靶向及脱靶效应的GS(反义链)及PS(有义链)进行评估。制备四种基于psiCHECK^TM-2(Promega)的构建体来评估各测试分子GS及PS链的靶向活性及潜在脱靶活性。在每种构建体中，将测试分子PS或GS的完整靶标或种子靶标序列的一个拷贝或三个拷贝克隆至位于3’-UTR区域中海肾萤光素酶转译终止密码子下游的多克隆位点中。所得载体称作：

1-GS-CM(引导链，完全匹配)载体，其含有完整靶标序列(与测试分子的GS的整个19-碱基序列完全互补的核苷酸序列)的一个拷贝或三个拷贝；

2-PS-CM(过客链，完全匹配)载体，其含有完整靶标序列(与测试分子的PS的整个19-碱基序列完全互补的核苷酸序列)的一个拷贝或三个拷贝；

3-GS-SM(引导链，种子匹配)载体，其含有种子区域靶标序列(与测试分子的GS的核苷酸1-8互补的序列)的一个拷贝或三个拷贝；

4-PS-SM(过客链，种子匹配)载体，其含有种子区域靶标序列(与测试分子的PS的核苷酸1-8互补的序列)的一个拷贝或三个拷贝。

将位置19(反义链的位置1)上存在或不存在核苷酸取代的靶标序列克隆于海肾发光素酶报道基因的编码区域的下游。测试分子针对这些序列中的任一个的RNAi或种子介导的活性引起融合mRNA(GS)裂解及随后降解或引起翻译抑制(PS)。在两种情况下，均削弱蛋白质表达。

克隆测试分子GS及PS种子及完整靶标位点

将相关靶标的单个拷贝克隆于psiCHECK^TM-2(Promega)载体中报道mRNA海肾萤光素酶的3’UTR中。在载体中存在多个克隆位点。所用典型克隆位点为XhoI及NotI。使用标准分子生物学技术制备用于克隆的载体。化学合成CM及SM的每条链且通过加热至100℃进行退火，然后冷却至室温。使用标准分子生物学技术连接3小时。将连接的质粒转化至大肠杆菌DH5a细胞中。

通过菌落PCR，使用相关引物，针对质粒构建体的存在筛选所得菌落。自一个阳性菌落中纯化各质粒(载体)且验证其序列。

将载体转染至人Hela细胞中

每10cm培养皿接种约1.3-2×10⁶个人Hela细胞(ATCC，Cat#CCL-2)。接着在37℃±1℃、5％CO₂中孵育细胞24小时。接种1天后，以8mL制备的新鲜生长培养基置换生长培养基。如下使用Lipofectamine^TM2000试剂(Invitrogen)，用载体之一转染含细胞的各培养板：

在Eppendorf管中，将15μL Lipofectamine^TM 2000试剂在1000μLDMEM培养基中稀释且在室温(RT)下孵育5分钟。在第二Eppendorf管中，在1000μL DMEM培养基中稀释载体至15μg的最终浓度。将稀释的Lipofectamine^TM2000试剂与稀释的DNA载体样品轻轻混合且在室温下孵育20-40分钟。孵育后，将DNA/Lipofectamine^TM 2000添加(至2000μL最终体积)至细胞中。轻轻摇动培养板。在37℃±1℃及5％CO₂下孵育培养板5小时。孵育5小时后，将细胞以每孔5×10³个细胞的最终浓度(于80μL生长培养基中)再接种于96孔培养板中。16小时后，使用Lipofectamine^TM2000，用测试分子或对照分子转染细胞。如下所述，一式两份进行每种siRNA浓度的转染：

过量制备Lipofectamine^TM 2000以足够用于170个孔：将85μLLipofectamine^TM 2000与3400μL(3.4mL)DMEM培养基混合且在室温下孵育5分钟。

制备测试分子及对照分子工作溶液：通过稀释10μM储备液来制备各种浓度的工作溶液。在100μL DMEM转染培养基中制备此连续稀释液以产生处于0.0095nM至100nM范围内的最终转染浓度(0.0095nM、0.019nM、0.039nM、0.07nM、0.15nM、0.31nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5.0nM、20.0nM、100.0nM)。

将稀释的Lipofectamine 2000的100μL等分试样与100μL稀释的各测试分子或对照分子工作溶液(上述)轻轻混合且在室温下孵育混合物20-40分钟。孵育后，将20μL siRNA/Lipofectamine^TM 2000混合物添加至细胞顶部(用上述80μL细胞培养基预先孵育)。轻轻摇动培养板。在37℃±1℃及5％CO₂下孵育细胞48小时。

测定转染细胞中的海肾萤光素酶活性

psiCHECK^TM-2载体能够监测融合于海肾萤光素酶报道基因的靶标序列的表达的变化。将测试分子/对照分子靶标序列克隆至海肾萤光素酶的3’-非翻译区域(3’-UTR)中。测量海肾萤光素酶活性的降低，从而提供监测活性的便利方式。另外，psiCHECK^TM-2载体含有第二报道基因萤火虫萤光素酶，其在不同启动子下转录，用于对海肾萤光素酶表达进行归一化。

测试分子或对照分子转染48小时后，使用Dual-Luciferase

检测试剂盒(Promega)，根据制造商的程序，测量每种siRNA转染样品中海肾和萤火虫萤光素酶活性：

自细胞完全移除培养基，接着通过添加40微升/孔1×萤光素酶溶解溶液溶解细胞。接着冷冻(-80℃)培养板且在室温下融化。通过吸液若干次使细胞溶解产物悬浮，且将每种样品的12.5μL等分试样转移至各自96孔板中。将50μL萤光素酶底物(LARII)添加至每种提取物中，且通过吸光度、荧光及发光读取器(Perkin Elmer，Victor^TM 1240)测量萤火虫萤光素酶活性。将50μL Stop&Glo试剂添加至每种样品中且立即测量海肾萤光素酶活性。将每种样品的海肾萤光素酶活性值除以萤火虫萤光素酶活性值(归一化)。海肾萤光素酶活性最终表示为测试样品中的归一化活性值相对于自在不存在测试分子或对照分子下经相应psiCHECK^TM-2质粒转染的细胞所获得的归一化活性值的百分比。

IC50计算

测试分子及对照分子针对GS_CM位点的活性的IC50值是通过使用以各种最终siRNA浓度获得的活性结果构建剂量-反应曲线来确定。通过绘制海肾萤光素酶活性的相对归一化值相对于转染的siRNA浓度的对数的曲线来构建剂量反应曲线。通过将最佳S形曲线拟合测量的数据来计算曲线。S形拟合的方法称作3点曲线拟合。

其中：

Y为残余胱天蛋白酶2mRNA反应，

X为转染的siRNA浓度的对数，

Bot为底部平台期的Y值，

LogIC50为当Y处于底部平台期与顶部平台期之间的一半处时的X值，且希尔斜率为弯曲的斜率。

结果

为评估双链RNA分子链的每条链的潜在脱靶活性，使用psiCHECK(Promega)质粒构建体，利用“基于引导种子序列及过客链的活性测定”。对海肾活性的测量可提供监测双链RNA活性的便利方式。

测量靶标海肾萤光素酶蛋白活性

在蛋白质水平上，通过测量经各种分子浓度转染的细胞中海肾萤光素酶报道蛋白质的相对活性，来评定测试分子与对照分子针对四种靶标序列(GS-CM，引导链完全匹配；GS-SM，引导链种子匹配；PS-CM，过客链完全匹配；及PS-SM，过客链种子匹配)的活性。每种检测重复三次。通过构建浓度-反应曲线来确定测试分子针对GS-CM靶标位点的活性的IC50值。

测试分子与对照分子以剂量反应方式针对靶标GS-CM位点具有活性。

两种siRNA针对GS-SM及PS-SM位点无活性。

图2-10及下表2-10显示如由残余靶标所测量，靶向靶标序列的完全匹配物的双链分子的活性，该靶标序列在位置19(相当于反义链的位置1)上具有取代以并入以下中的一个：核糖核苷酸、腺苷(A或rA)、胞苷(C或rC)、鸟苷(G或rG)、核糖胸苷(rT，也为5’甲基尿苷)及尿苷(U或rU)；或脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)、胸苷(dT)及脱氧尿苷(dU)；或2’O甲基化腺苷(mA)、2’O甲基化胞苷(mC)、2’O甲基化鸟苷(mG)、2’O甲基化尿苷(mU)。“AS第1位置”是指反义链的位置1(5’端核苷酸)。

表2：TLR2_16siRNA(在双链上以交替2’-OMe为末端的平端)

表2中所示的数据呈现于图2中。反义链的位置1上的甲基化核苷酸显示降低的靶标敲低，与碱基配对无关。

表3未经C3-C3突出或dTdT突出修饰的TLR2_37siRNA

表3中的数据呈现于图3中。表3及图3显示AS第1位置上的2’OMe核糖核苷酸降低siRNA活性，与靶标的匹配位置上的核苷酸无关。

表4：未经C3-C3突出或dTdT突出修饰的TLR2_37siRNA

表4中的数据呈现于图4中。表4及图4显示：

1.当AS第1位置上的U(dU或dT)与靶标中的C错配或与靶标中的A匹配时观察到siRNA具有最高活性；

2.若siRNA的AS第1位置上的U(或dU或dT)与靶标中的U错配，则siRNA活性降低；

3.若AS第1位置上的U与靶标中的G摆动配对，则siRNA活性降低。

表5TLR2_37siRNA(未经dTdT突出修饰)-0.04nM

表5中的数据呈现于图5中。表5及图5显示：

1.AS第1位置上的U与靶标中的A匹配或与C错配所产生的结果比与U错配或与G摆动配对所产生的更好的结果。

2.AS第1位置上的G显示类似结果，其中匹配靶标位置上的所有可能核苷酸(错配物或摆动配对)均未提高活性。

表6：TLR2_46siRNA(未经C3-C3或dTdT突出修饰)

表6中的数据呈现于图6中。表6及图6显示U经mU的取代降低活性。

表7TLR2_46siRNA(未经dTdT突出修饰)

表7中的数据呈现于图7中。表7及图7显示不管匹配靶标位置的核苷酸类型如何，AS第1位置上的U均产生较佳KD(敲低基因表达)。所有情况意味着与siRNA与靶标之间在引导链第1位置上的互补性、或错配或摆动对无关。

表8RHOA_61siRNA(未经C3-C3或dTdT突出修饰)

表8中的数据呈现于图8中

表9RHOA_61siRNA(未经C3-C3或dTdT突出修饰)

表9中的数据呈现于图9中。表9及图9显示：

在AS第1位置上具有U的siRNA比在第1位置上具有G的siRNA更具活性，与靶标匹配位置中的核苷酸(匹配、错配、摆动)无关。结果未能通过摆动碱基配对加以说明，因为在siRNA中具有G及在靶标中具有U不等同于在siRNA中具有U及在靶标中具有G。

表10RhoA_61siRNA(未经dTdT突出修饰)

表10中的数据呈现于图10中。

实施例3：急性肾衰竭(ARF)模型系统

ARF是特征为在数天内出现肾功能迅速衰退的临床综合症。不受理论限制，急性肾损伤可为肾缺血-再灌注损伤(例如经历大型手术(例如大型心脏手术)的患者的肾缺血-再灌注损伤)的结果。ARF的主要特征为肾小球滤过率(GFR)急剧下降，导致含氮废物(尿素、肌酐)滞留。新近研究证实，肾组织的细胞凋亡在大多数人ARF病例中为显著的。细胞凋亡性细胞死亡的主要部位为远端肾单位。在缺血性损伤的初始阶段期间，肌动蛋白细胞骨架丧失完整性可导致上皮变平，丧失刷状缘，失去病灶性细胞接触，继而细胞自潜在底层脱离。

在缺血-再灌注诱发的ARF的动物模型中测试本发明化合物的治疗缺血再灌注损伤的功效。

实施例4：褥疮或压力性溃疡模型系统

包括糖尿病性溃疡的褥疮或压力性溃疡为在持续压力(通常来自床或轮椅)切断身体薄弱部分(尤其臀部、髋部及跟部上的皮肤)的循环时所形成的受损皮肤及组织区域。缺乏充足的血流可导致受影响组织缺血性坏死及溃疡。褥疮最常发生在感觉减弱或丧失或虚弱、消瘦、瘫痪或长期卧床不起的患者中。骶骨、坐骨、大转子、外踝及跟部上的组织尤其易受影响；其它部位也可能涉及到，视患者的情况而定。

尤其在如Reid等人，J Surg.Res.116：172-180，2004中所述的小鼠模型或如Mustoe等人，JCI，1991.87(2)：694-703；Ahn及Mustoe，AnnP1 Surg，1991.24(1)：17-23所述的兔模型中，测试本发明化合物治疗褥疮、溃疡及类似创伤的功效。

实施例5：慢性阻塞性肺病(COPD)模型系统

慢性阻塞性肺病(COPD)特征主要为肺气肿，肺气肿为末端细支气管远端的周围空气间隙遭到永久性破坏。肺气肿的特征也为炎性细胞(例如巨噬细胞及嗜中性粒细胞)在细支气管及肺泡结构中积聚。肺气肿及慢性支气管炎可作为COPD的一部分出现或独立出现。

尤其在例如如下所公开的动物模型的动物模型中，测试本发明化合物治疗COPD/肺气肿/慢性支气管炎的功效：

Starcher及Williams，1989.Lab.Animals，23：234-240；Peng等人，2004.；Am J Respir Crit Care Med，169：1245-1251；Jeyaseelan等人，2004.Infect，Immunol，72：7247-56。其它模型描述于转让给本申请的受让人的PCT专利公布WO 2006/023544(其为以引用的方式并入本申请中)中。

实施例6：脊髓损伤模型系统

脊髓损伤或脊髓病为一种导致感觉和/或活动性丧失的脊髓破坏。脊髓损伤的两种常见类型归因于创伤及疾病。创伤性损伤可尤其归因于车祸、跌倒、枪击、潜水事故，且可影响脊髓的疾病包括脊髓灰质炎、脊椎裂、肿瘤及弗里德希氏共济失调(Friedreich′s ataxia)。

将siRNA注射至脊髓挫伤处的脊髓及无损伤的大鼠体内的脊髓中。制备矢状冷冻切片且使用四个不同抗体组进行免疫染色以确定神经元、星形胶质细胞、寡树突神经胶质细胞和/或巨噬细胞/小神经胶质中是否进行吸收。神经元的标记物包括NeuN或GAP43；星形神经胶质及潜在神经干细胞的标记物包括GFAP、巢蛋白(nestin)或波形蛋白(vimentin)寡树突神经胶质的标记物包括NG2或APC；巨噬细胞/小神经胶质的标记物包括ED1或Iba-1(Hasegawa等人，2005.ExpNeurol 193：394-410)。

用两种不同剂量的siRNA(1μl、10μg/μl)注射大鼠且在处死前饲养1天及3天。结果指示，针对脊髓损伤靶标基因的siRNA促进运动神经元恢复。

实施例7：青光眼模型系统

在如以下所述的动物模型中，测试本发明化合物治疗或预防青光眼的功效：Pease等人，J.Glaucoma，2006，15(6)：512-9(Manometriccalibration and comparison of TonoLab and TonoPen tonometers in ratswith experimental glaucoma and in normal mice)。

实施例7A：缺血性视神经病变(ION)模型系统

使用视神经挤压伤方案，在成年Wistar大鼠中建立缺血性视神经病变动物模型。在离视神经挤压尚有七天时，通过将逆行示踪剂FluoroGold(2％，萤光染料，Englewood，CO)施用至上丘来选择性标记视网膜神经节细胞(RGC)。示踪剂通过沿RGC轴突逆向输送来输送，使所有RGC在注射萤光示踪剂后1周内完全及特异性标记。在逆行示踪7天后使动物经受视神经挤压伤。经由眶上途径暴露眼眶视神经，且通过用钳子在距筛板2mm处挤压10秒来横切视神经中的所有轴突。在视神经挤压时，使用玻璃微量吸液管，将单一剂量的每5μlPBS 20μg的经修饰的测试siRNA化合物微注射至视神经乳头前2mm的玻璃体中。

在视神经挤压后第7天，通过计数平铺的视网膜上经FluoroGold标记的RGC来确定RGC的存活率。在视神经挤压后第1周用4％三聚甲醛经贲门灌注实验动物。分割出两个视网膜，再固定30分钟且平铺于玻璃载片上，以用于神经节细胞层定量。在各视网膜中的16个不同区域中计数荧光RGC的数目，且相较于自完全未经受视神经挤压伤的大鼠获得的样品或自用PBS、对照siRNA或GFP siRNA注射且经受视神经挤压伤的大鼠获得的样品来确定RGC存活率的百分比。在吞噬垂死RGC后可具有并入的FluoroGold的小神经胶质细胞由其特征形态学而被区分且自定量分析排除。

利用另一视神经轴突切断术模型，其中通过横切靠近眼睛的视神经对整个RGC群体进行轴突切断术。(Cheng L等人，J.Neurosci.2002；22：3977-3986)。

实施例8：大鼠肺移植后缺血/再灌注损伤模型系统

在如以下所述的一种或多种实验动物模型中，测试本发明化合物治疗肺移植后缺血/再灌注损伤或缺氧性损伤的功效：Mizobuchi等人，2004.J.Heart Lung Transplant，23：889-93；Huang等人，1995.J.Heart Lung Transplant.14：S49；Matsumura等人，1995.Transplantation59：1509-1517；Wilkes等人，1999.Transplantation 67：890-896；Naka等人，1996.Circulation Research，79：773-783。

实施例9：急性呼吸窘迫综合症模型系统

尤其在Chen等人(J Biomed Sci.2003；10(6Pt 1)：588-92)所述的动物模型中，测试本发明化合物治疗急性呼吸窘迫综合症的功效。在此动物模型中测试靶向包括CYBA、HRK、BNIP3、MAPKB、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、SPP1及DUOX1的基因的经修饰的siRNA化合物。

实施例10：听力丧失病况模型系统

(i)卡铂诱发或顺铂诱发的耳蜗毛细胞死亡的南美栗鼠(Chinchilla)模型

通过将含特异性siRNA的盐水直接施用每种动物的左耳，对南美栗鼠进行预处理。将盐水给予每种动物的右耳作为安慰剂。在施用本发明的特异性经修饰的siRNA化合物后第2天，用卡铂(75mg/kg，腹膜内)或顺铂(经30分钟腹膜内输注13mg/kg)处理动物。在处死南美栗鼠(卡铂处理后两天)后，计算左耳(经siRNA处理)及右耳(经盐水处理)中内毛细胞(IHC)及外毛细胞(OHC)的死细胞的百分比。经计算，左耳(经siRNA处理)中内毛细胞(IHC)及外毛细胞(OHC)的死细胞的百分比低于右耳(经盐水处理)中。

(ii)声音诱发的耳蜗毛细胞死亡的南美栗鼠模型

在南美栗鼠中，在声音创伤模型中，研究特异性siRNA的活性。将动物暴露于105dB下集中于4kHz的杂音倍频程带2.5小时。用含30μg siRNA的约10μL盐水预处理(在声音创伤前48小时)暴露于杂音的南美栗鼠的左耳；用媒介物(盐水)预处理右耳。复合动作电位(CAP)为测量自耳蜗递送的神经活动的便利且可靠的电生理学方法。通过将电极放置于靠近耳蜗底部以检测在声音刺激(例如滴答声或猝发音)突然开始时产生的局部场电位来记录CAP。在声音创伤后第2.5周评定每个耳朵的功能状态。特定而言，在声音创伤后第2.5周测定自圆窗记录的复合动作电位的平均阈值，以确定经siRNA处理的耳朵的阈值是否低于(优于)未处理(盐水)的耳朵。另外，测定经siRNA处理的耳朵及对照耳朵中内毛细胞及外毛细胞丧失的量。

使用小鼠及大鼠的相似模型。在这些及其它听力丧失及听力再生动物模型中，测试靶向包括BNIP3、CAPNS、HES1、HES5、NOX3、ID1-3、HRK、ASPP2(TP53BP)、CASP2、RAC1、HTRA2、CDKN1B的基因的经修饰的siRNA化合物。

实施例11：骨关节炎(OA)动物模型

胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)：小鼠CIA描述于Trentham等人(1977.J.Exp.Med.146：857-868)中。佐剂诱发的关节炎(AA)：AA描述于Kong等人(1999.Nature，402：304-308)中。半月板切除术模型描述于Han等人(1999.Nagoya J Med Sci 62(3-4)：115-26)中。

除本领域中已知的体外模型之外，使用一种或多种上述模型评估不同siRNA抑制剂(例如针对SSP1的siRNA)对与OA相关的不同参数(例如软骨细胞增殖、终末分化及关节炎发展)的作用。在这些动物模型中，测试针对促细胞凋亡基因(尤其SSP1)的经修饰的siRNA化合物，显示经修饰的siRNA化合物治疗和/或预防OA，因此可用于治疗此病况。

实施例12：与移植相关的急性肾损伤的大鼠模型系统

热缺血-对测试大鼠进行左肾切除术，继而自体移植，造成45分钟的热移植肾保存时段。在自体移植后，对同一动物进行右肾切除术。在获得移植肾前(模拟供体处理)(“之前”)或在肾自体移植后(模拟接受者处理)或在获得前与移植后(组合的供体与接受者处理)(“之前-之后”)，经由股静脉，静脉内施用针对靶的经化学修饰的siRNA。

冷缺血-对供体动物进行左肾切除术，继而冷藏(冰上)所获得的肾5小时的时段。在此时段结束时，接受大鼠将进行双侧肾切除术，继而移植经冷藏的移植肾。总热缺血时间(包括手术程序)为约30分钟。在获得肾前(“之前”)，经由股静脉，向供体动物静脉内施用经化学修饰的siRNA，或在移植后15分钟(“之后15分钟”)或4小时(之后4小时)，经由股静脉，向接受动物静脉内施用经化学修饰的siRNA。

为评定本发明的经修饰的siRNA化合物改善移植后肾功能的功效，在移植后第1天、第2天及第7天测量热缺血模型与冷缺血模型的血清肌酐水平。

本领域的技术人员应了解或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明特定实施方案的等效物。该等效物意欲由下列申请专利范围所涵盖。

Claims

1.一种双链核酸分子，其具有下述所列结构(A)：

(A) 5’ N¹-(N)x-Z 3’(反义链)

3’Z’-N²-(N’)y-z”5’(有义链)

其中(N)x及(N’)y各自为寡核苷酸，其中每个连续N或N’通过共价键与所述相邻N或N’连接；

其中x及y各自独立地为17至39的整数；

其中N¹与(N)x共价结合，且与所述靶标RNA错配或为与所述靶标RNA互补的DNA核苷酸；

2.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列完全互补。

3.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中N²-(N’)y的所述序列与N¹-(N)x的所述序列互补。

4.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N)x包含与靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。

5.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N)x包含与靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸实质上互补的反义序列。

6.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中N¹和N²形成沃森-克里克碱基对。

7.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中N¹与N²形成非沃森-克里克碱基对。

8.如权利要求1至7中任一项所述的双链核酸分子，其中x＝y＝18，x＝y＝19或x＝y＝20。

9.如权利要求8所述的双链核酸分子，其中x＝y＝18。

10.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹与(N)x共价结合且与所述靶标RNA错配。

11.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹与(N)x共价结合且为与所述靶标RNA互补的DNA部分。

12.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹选自腺苷、脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为腺苷。

13.如权利要求12所述的双链核酸分子，其中N¹选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。

14.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为胸苷。

15.如权利要求14所述的双链核酸分子，其中N¹选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。

16.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为鸟苷。

17.如权利要求16所述的双链核酸分子，其中N¹选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。

18.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为尿苷。

19.如权利要求18所述的双链核酸分子，其中N¹选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。

20.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹与N²形成尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间的碱基对。

21.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N¹与N²形成介于脱氧尿苷与腺苷之间的碱基对。

22.如权利要求1至21中任一项所述的双链核酸分子，其中z”存在。

23.如权利要求1至22中任一项所述的双链核酸分子，其中Z及Z’不存在。

24.如权利要求1至22中任一项所述的双链核酸分子，其中Z或Z’中的一个存在。

25.如权利要求1至22中任一项所述的双链核酸分子，其中Z或Z’包含非核苷酸部分。

26.如权利要求1至25中任一项所述的双链核酸分子，其中N或N’中的至少一个包含经2′OMe糖修饰的核糖核苷酸。

27.如权利要求26所述的双链核酸分子，其中N包含单一交替的未经修饰的核糖核苷酸与2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

28.如权利要求1至27中任一项所述的双链核酸分子，其中N²包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

29.如权利要求1至28中任一项所述的双链核酸分子，其中所述双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。

30.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中x＝y＝18，Z’不存在，Z存在且包含两个彼此经由磷酸二酯键共价连接的烷基部分，N²包含腺苷且N¹包含尿苷。

31.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中x＝y＝18，Z’不存在，Z存在且包含两个彼此经由磷酸二酯键共价连接的烷基部分，N²包含尿苷或脱氧尿苷且N¹包含腺苷。

32.如权利要求1至31中任一项所述的双链核酸分子，其中所述靶标mRNA为哺乳动物基因的mRNA。

33.如权利要求32所述的双链核酸分子，其中所述靶标mRNA为人基因的mRNA。

34.如权利要求1至33中任一项所述的双链核酸分子，其用于治疗。

35.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1至34中任一项所述的双链核酸分子；及药学上可接受的载体。

36.一种用于治疗或预防有需要的受试者中疾病或病况的发生或严重度的方法，其包括以有效地预防或治疗或延迟疾病或病况的发生或严重度的量向所述受试者施用权利要求1至33中任一项所述的双链核酸分子或权利要求35所述的药物组合物，其中所述疾病或病况和/或与其相关的症状选自由以下组成的组：听力丧失；急性肾衰竭(ARF)；肾移植后移植肾功能延迟恢复(DGF)；青光眼；眼缺血性病况，包括非动脉炎性缺血性视神经病变(NAION)、前部缺血性视神经病变、年龄相关的黄斑变性(AMD)、缺血性视神经病变(ION)及干眼综合症；急性呼吸窘迫综合症(ARDS)及其它急性肺及呼吸道损伤；慢性阻塞性肺病(COPD)；原发性移植失败；缺血再灌注损伤；再灌注损伤；再灌注水肿；同种异体移植物功能障碍；器官移植、尤其肺移植后肺再植入反应和/或原发性移植物功能障碍(PGD)；器官移植，包括肺、肝、心脏、胰脏及肾移植；肾毒性及神经毒性；脊髓损伤；脑损伤；神经退行性疾病或病况；褥疮；口腔粘膜炎；纤维变性病症及癌症。

37.一种产生由有义链及反义链组成的双链siRNA分子的方法，其包括以下步骤：

a)选择靶标RNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含与所述靶标mRNA的连续17至25个核苷酸的序列的互补性的反义链，其中所述反义链的5’端核苷酸经尿苷、经修饰的尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代，其限制条件为rG:rU链寡核苷酸及所述靶标mRNA的3’端核苷酸。

b)合成与所述反义链互补的具有17至25个核苷酸的有义链，其中所述有义链的3’端核苷酸与所述反义链的5’端核苷酸形成沃森-克里克碱基对；及

c)使所述有义链与反义链退火；从而产生双链RNA分子。

38.一种产生由有义链及反义链组成且在与未经修饰的siRNA双链体比较时展现增强的RNAi活性的经修饰的siRNA双链体的方法，其包括以下步骤：

a)选择靶标RNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含与所述靶标mRNA的连续17至25个核苷酸的序列的互补性的反义链，其中所述3’端核苷酸经腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代；

b)合成与所述反义链互补的具有17至25个核苷酸的有义链，其中所述反义链的5’端核苷酸包含核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷或经修饰的脱氧核糖尿苷且与所述过客链的3’端核苷酸形成碱基对；

c)使有义链与反义链退火；

从而产生具有增强的RNAi活性的siRNA双链体。

39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述3’端核苷酸不为腺苷。