KR20120102630A - 말단 치환체를 포함하는 에스아이 알엔에이 화합물 - Google Patents

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쿠아크 파마수티칼스 인코퍼레이티드
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Abstract

본 발명은 표적 유전자 발현을 하향-제어하는 변형된 siRNA 화합물, 이러한 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 및 유전자와 연관된 다양한 질환이나 증상 및/또는 이러한 질환이나 증상과 연계된 증후군의 발현이나 심각성을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대한 것이다.

Description

말단 치환체를 포함하는 에스아이 알엔에이 화합물{siRNA compounds comprising terminal substitutions}
관련된 출원
본 출원은 2009년 11월 26일 출원된 미국 가출원 일련번호 61/264668호, 2010년 1월 17일 출원된 61/295721호와 2010년 8월 9일 출원된 61/372072호의 이익을 주장하고, 이들 출원의 전체 개시사항 및 모든 목적은 여기에 레퍼런스로 합체되어 진다.
본 발명은 변형된 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 화합물, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 유전자 발현의 저해를 위한 이들의 사용 방법에 대한 것이다. 이 화합물 및 조성물은 표적 유전자의 넉 다운(knock down) 활성을 포함하는 유익한 특성을 나타내고, 그리고 유전자 발현이 불리한 결과를 가지는 위축성 질환이나 증상 또는 이들 질환이나 증상과 관련된 증후군으로부터 고통을 당하거나 또는 그 위험에 놓인 대상의 치료에 유용하다.
본 발명의 양수인에 의한 것이며 그리고 그 전체로서 여기서 레퍼런스로 합체되어 지는 PCT 특허 공보 번호 WO 2008/104978 및 WO 2009/044392호는 신규한 siRNA 구조를 개시한다.
고양된 넉 다운 활성, 증가된 안정성 및 또는 감소된 오프 타겟 효과를 나타내는 활성적이고 그리고 유효한 siRNA 치료 제제에 대한 요구가 여전하다.
특허문헌 1: PCT 특허 공보 번호 WO 2008/104978호 특허문헌 2: PCT 특허 공보 번호 WO 2009/044392호
본 발명은 상기한 요구에 부응하기 위한 것이다.
여기에 개시된 이중사슬 RNA(double 스트랜드ed RNA; dsRNA) 화합물은, 예를 들어 활성을 증가할 수 있고, 안정성을 증가할 수 있고, 면역원성을 감소할 수 있고, RISC 복합체 안으로의 로딩을 고양할 수 있고, 및 또는 독성을 최소화할 수 있는 구조 및 변형을 가져; siRNA들의 새로운 변형은 표적 유전자 발현을 방지하거나 희석하는데 유용한 이중사슬 RNA에 유익하게 적용되어 진다.
여기서 제공된 것은 유전자 발현의 다운 레귤레이션에 유용한 이중사슬 (듀플렉스) 올리고뉴클레오티드 화합물이다. 본 개시사항은 전사 사슬 및 상보성 반전사 사슬을 포함하고 그리고 반전사 사슬의 5' 말단 뉴클레오티드와 표적 RNA의 뉴클레오티드와의 사이에 미스매치를 갖는 이중사슬 핵산 분자가 표적 유전자를 다운 레귤레이트하는데 강력한 활성을 보이는 기대하지 않은 관찰에 기초되어 진다. 바람직한 실시형태에 있어서 dsRNA는 시티딘 또는 구아닌의 위치에서보다 반전사 사슬의 위치 1(5' 말단)에서 치환된 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 티미딘을 포함한다.
일 측면에 따르면, 아래에 제시된 구조(A)를 가지는 변형된 이중사슬 핵산 분자들이 제공되어 진다:
(A) 5' N1-(N)x - Z 3' (반전사 사슬)
3' Z'-N2-(N')y -z" 5' (전사 사슬)
여기서, N2, N 및 N' 각각은 비변형된 또는 변형된 리보뉴클레오티드, 또는 비범한 부분이고;
여기서 (N)x 및 (N')y 각각은 각 연속적인 N 또는 N'이 공유결합에 의해 인접하는 N 또는 N'에 결합된 올리고뉴클레오티드이고;
여기서 x 및 y 각각은 독립적으로 17 내지 39 사이의 정수이고;
여기서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 상보성을 가지고 그리고 (N)x는 표적 RNA에서 컨시큐티브 시퀀스에 상보성을 가지고;
여기서 N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 미스매치되어 지거나 또는 표적 RNA에 대하여 상보성 DNA 부분이고;
여기서 N1은 천연 또는 변형된 우리딘, 디옥시리보우리딘, 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 아데노신 또는 디옥시아데노신으로 구성된 군으로부터 선택된 부분이고;
여기서 z"은 존재하거나 또는 부존재일 수 있지만, 만일 존재한다면, N2-(N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 부분이고; 그리고
여기서 Z 및 Z'의 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부존재일 수 있지만, 만일 존재한다면, 독립적으로 이것이 존재하는 스트랜드의 3' 말단에 공유결합적으로 부착된 1-5 컨시큐티브 뉴클레오티드, 컨시큐티브 비-뉴클레오티드 부분 또는 이들의 조합이다.
몇몇 실시형태에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 완전히 상보성이다. 다양한 실시형태에 있어서, N2-(N')y의 시퀀스는 N1-(N)x의 시퀀스에 상보성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, (N)x는 표적 RNA에서 약 17 내지 약 39의 컨시큐티브 뉴클레오티드에 완전히 상보성인 반전사를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, (N)x는 표적 RNA에서 약 17 내지 약 39의 컨시큐티브 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 반전사를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1 및 N2는 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 형성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, N1 및 N2는 비-왓슨-클릭 염기 쌍을 형성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 염기 쌍은 리보뉴클레오티드와 디옥시리보뉴클레오티드 사이에 형성되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, x =y=18, x =y=19 또는 x =y=20이다. 바람직한 실시형태에 있어서 x=y=18이다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 미스매치되어 진다. 다양한 실시형태에 있어서, N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 상보성인 DNA 부분이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 위치 1에서 우리딘은 아데노신, 디옥시아데노신, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택된 N1으로 치환되어 진다. 다양한 실시형태에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 위치 1의 구아노신은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택된 N1으로 치환되어 진다. 다양한 실시형태에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 위치 1의 시티딘은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택된 N1으로 치환되어 진다. 다양한 실시형태에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 위치 1의 아데노신은 디옥시아데노신, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택된 N1으로 치환되어 진다. 다양한 실시형태에 있어서, N1은 디옥시아데노신 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1 및 N2는 우리딘 또는 디옥시우리딘, 및 아데노신 또는 디옥시아데노신 사이에 염기 쌍을 형성한다. 다른 실시형태에 있어서, N1 및 N2는 디옥시우리딘 및 아데노신 사이에 염기 쌍을 형성한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 이중사슬 핵산 분자는 siRNA, siNA 또는 miRNA이다.
다음의 표는 Nl 및 상응하는 N2의 예를 제공한다.
Figure pct00001
구조 (A)의 몇몇 실시형태에 있어서, N1은 우리딘 또는 아데노신을 포함한다. 구조 (A)의 어떤 실시형태에 있어서, N2은 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 구조 (A)의 몇몇 실시형태에 있어서, N1은 2'OMe 당-변형된 리보우리딘을 포함하고 그리고 N2는 아데노신 또는 변형된 아데노신을 포함한다. 구조 (A)의 몇몇 실시형태에 있어서, N1은 아데노신을 포함하고 그리고 N2는 리보우리딘 또는 변형된 리보우리딘을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, Z 및 Z'는 존재하지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, Z 또는 Z'의 하나는 존재한다.
몇몇 실시형태에 있어서, N 및 N'의 각각은 비변형된 리보뉴클레오티드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N 또는 N'은 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드 또는 비범한 부분을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비범한 부분은 거울상 뉴클레오티드, 비염기성 리보스 부분 및 비염기성 디옥시리보스 부분으로부터 선택되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비범한 부분은 거울상 뉴클레오티드, 바람직하기로는 L-DNA 부분이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N 또는 N'은 2'OMe 당-변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 완전히 상보성이다. 다른 실시형태에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 실질적으로 상보성이다.
몇몇 실시형태에 있어서, (N)x는 표적 mRNA에서 약 17 내지 약 39 컨시큐티브 뉴클레오티드에 완전히 상보성인 반전사 시퀀스를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, (N)x는 표적 mRNA에서 약 17 내지 약 39 컨시큐티브 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 반전사 시퀀스를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, x=y=18이다.
어떤 바람직한 실시형태에 따르면, 변형된 뉴클레오티드가 당 부분에, 염기 부분에 또는 뉴클레오티드 간의 연결 부분에서 변형을 가지는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 화합물이 제공되어 진다.
구조 (A) 모티브는 포유류 또는 비-포유류 유전자에 올리고뉴클레오티드 쌍 (전사 및 반전사 사슬)으로 유용하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포유류 유전자는 사람 유전자이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 구조 (A)를 가지는 변형된 siRNA 화합물은 대조 화합물, 즉 반전사 올리고뉴클레오티드가 표적 mRNA 내에서 뉴클레오티드 시퀀스에 완전히 상보성(5' 말단 뉴클레오티드 염기쌍, 즉 A-U, U-A, C-G, G-C 포함)인 siRNA 화합물에 비교할 때, 고양된 활성(즉, 감소된 IC50, 증가된 넉 다운, 감소된 잔여 mRNA)를 포함하는 유익한 특성을 나타낸다. 몇몇 실시형태에 있어서, 이 활성은 대조 화합물과 비교할 때, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 또는 그 이상 증진되어 진다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 전사 사슬 및 반전사 사슬로 구성되는 이중사슬 RNA 분자를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 표적 RNA에서 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 선택하고, 그리고 rG:rU 워블이 표적 mRNA의 3 ' 말단 뉴클레오티드와 반전사 사슬의 5' 말단 뉴클레오티드 사이에 생성되지 않는 조건으로, 반전사 사슬의 5 ' 말단 뉴클레오티드가 우리딘, 변형된 우리딘, 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신 또는 변형된 디옥시아데노신으로 치환되어 진, 표적 mRNA의 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스에 상보성을 포함하는 반전사 사슬을 합성하는 단계;
b) 반전사 사슬에 상보성을 갖는 17 내지 25 뉴클레오티드의 전사 사슬을 합성하는 단계, 여기서 전사 사슬의 3' 말단 뉴클레오티드가 가이드 스트랜드의 5 ' 말단 뉴클레오티드와 왓슨-클릭 염기 쌍을 형성함; 및
c) 반전사 및 전사 사슬을 어닐링하는 단계; 이에 의해 이중사슬 RNA 분자를 생성한다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비변형된 이중사슬 RNA 분자에 비하여 고양된 RNAi 활성을 나타내는 전사 사슬 및 반전사 사슬로 구성되는 이중사슬 RNA 분자를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 표적 RNA에서 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 선택하고, 그리고 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신 또는 변형된 디옥시아데노신으로 치환되어 진, 표적 mRNA의 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 전사 사슬을 합성하는 단계;
b) 전사 사슬에 상보성을 갖는 17 내지 25 뉴클레오티드의 반전사 사슬을 합성하는 단계, 여기서 5' 말단 뉴클레오티드는 패신저 스트랜드의 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘 또는 변형된 디옥시리보우리딘 및 염기 쌍을 포함함; 및
c) 반전사에 전사 사슬을 어닐링하는 단계;
이에 의해 고양된 RNAi 활성을 갖는 이중사슬 RNA 분자를 생성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 이중사슬 RNA 분자는 비변형된 siRNA 듀플렉스, 즉 표적 mRNA에 완전 매치를 갖는 듀플렉스에 비교할 때, 고양된 RNAi 활성을 나타낸다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 비변형된 이중사슬 RNA 분자에 비하여 고양된 RNAi 활성을 나타내는 전사 사슬 및 반전사 사슬로 구성되는 변형된 이중사슬 RNA 분자를 생성하는 방법을 제공한다:
a) 표적 RNA에서 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 선택하고, 그리고 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신 또는 변형된 디옥시아데노신으로 치환되어 진, 표적 mRNA의 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 전사 사슬을 합성하는 단계;
b) 전사 사슬에 상보성을 갖는 17 내지 25 뉴클레오티드의 반전사 사슬을 합성하는 단계, 여기서 5' 말단 뉴클레오티드는 전사 사슬의 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘 또는 변형된 디옥시리보우리딘 및 염기 쌍을 포함함;
c) 반전사에 전사 사슬을 어닐링하는 단계;
이에 의해 고양된 RNAi 활성을 갖는 이중사슬 RNA 분자를 생성한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 단계 a)는 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신 이외의 것인 표적 세포 내 표적 RNA에서 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드, 또는 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드 시퀀스를 선택하는 것을 포함한다.
다른 측면에서는, 포유류 또는 비-포유류 유전자 발현을 저해하는데 유효한 양으로 구조 (A)에 따른 화합물; 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포유류 유전자는 인간 유전자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비-포유류 유전자는 포유류의 질환, 바람직하기로는 인간 질환에 포함되어 진다.
더욱이, 이를 필요로 하는 대상에서 질환이나 증상 및/또는 증후군 및/또는 이들과 관련된 위험이 포유류 또는 비-포유류 유전자의 발현과 연관되어 지는, 질환이나 증상의 발현 및 심각성을 치료 또는 예방하거나 및/또는 질환이나 증상의 위험 및 심각성을 감소하기 위한 방법이 제공되어 진다. 바람직한 실시형태에서 이 대상은 인간 대상이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 이 질환 또는 증상은 청력 손실, 민감성 신부전(ARF), 신장 이식 후 지연된 이식신장 기능(DGF), 녹내장, 전방 허혈성 시신경 신경 장해를 포함한 안구 허혈성 상태, 연령 관련 황반 변성(AMD), 허혈성 광학 신경 장해 (ION), 건조한 눈 증후군, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 급성 폐 및 호흡계 손상, 만성 폐색 폐 질환(COPD), 주요한 이식 장애, 국소 빈혈 재관류-상해, 장기 이식, 특히는 폐, 간, 심장, 취장, 및 신장 이식을 포함하는 장기 이식, 특히는 폐 이식에서 이식 후 재관류 상해, 재관류 부종, 타가이식 부전, 폐동맥 재이식 반응 및/또는 주요 이식 장애(PGD), 신독성 및 신경독성, 척수 손상, 뇌 손상, 신경퇴행성 질환이나 증상, 압력 염증, 간 섬유증과 폐 섬유증을 포함한 구강 점막성 섬유증상; 및 암의 군으로부터 선택되어 진다. 이러한 방법은 적어도 하나의 이런 유전자의 발현이나 활성을 저해하거나 또는 감소하는, 하나 또는 그 이상의 이런 화합물의 예방학적으로 또는 치료학적으로 유효한 양을 이런 치료를 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함한다.
다음에 기술되어 질 화합물, 방법, 물질 및 실시예는 단지 설명적인 것이고 그리고 제한하기 위한 것이 아니다; 여기에 기술된 것에 동등하거나 또는 유사한 물질 및 방법이 본 발명의 실행에서 또는 시험에서 사용되어 질 수 있다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1은 여기서 제공된 것으로 dsRNA 분자들의 다이어그램이다. 일 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 5 ' 말단 G 또는 C 뉴클레오티드는 U, dU, rA, dA, rT, dT로 치환되거나; 또는 반전사 사슬의 5' 말단 U 뉴클레오티드는 dU, rA, dA, rT, dT로 치환되거나; 또는 반전사 사슬의 5' 말단 A 뉴클레오티드는 U, dU, dA, rT, dT로 치환되어 진다. 일 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 5' 말단 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 미스매치되어 진다. 다른 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 5' 말단 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 상보성인 디옥시리보뉴클레오티드이다.
도 2 내지 10은 위치 19(AS의 위치 1)에서 네 개의 리보뉴클레오티드 를 개별적으로 포함하도록 변형된 표적에 반전사 사슬의 위치 1에 다른 뉴클레오티드를 갖는 dsRNA 분자들의 활성(잔존하는 잔여 표적 %)을 막대 그래프로 나타낸다.
본 발명은 일반적으로 다양한 유전자의 발현을 다운-레귤레이트하는 올리고뉴클레오티드 화합물, 특히는 짧은 간섭 RNA들(siRNA), 자세하게는 변형된 siRNA 화합물과, 다양한 의료적 증상으로부터 고통을 받는 대상의 치료에 그리고 약학적 조성물의 제조에 이들 변형된 siRNA 화합물의 사용에 대한 것이다.
이 화합물 및 조성물은 표적 유전자의 강력한 넉 다운 활성을 포함하는 유익한 특성을 나타내고, 그리고 유전자 발현이 불리한 결과를 가지는 위축성 질환이나 증상 또는 이들 질환이나 증상과 관련된 증후군으로부터 고통을 당하거나 또는 그 위험에 놓인 대상의 치료에 유용하다.
따라서, 일 측면에서, 변형된 siRNA 화합물 및 유전자 발현을 다운 레귤레이팅하는데 유용한 이것을 포함하는 약학적 조성물이 제공되어 진다.
다른 측면에서, 본 발명은 유전자의 발현을 다운 레귤레이트하기에 충분한 양으로 포유류 또는 비-포유류 유전자를 표적으로 하는 본 발명의 적어도 하나의 짧은 간섭 RNA를 포함하는 약학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 미세혈관이상, 눈 질환 또는 장애, 청각장애 (청력 손실 포함), 호흡계(폐 포함) 장애, 신경퇴화성 질환 또는 장애, 척수 손상, 뇌 부상, 신생혈관생성- 및 아토프시스-관련 증상에 민감한 또는 이로부터 고통을 당하는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
어떤 실시형태에 있어서, 대상 화합물은 그 중에서도 호흡계 질환, 미세혈관 질환이나 눈 질환의 치료를 위한 표적 유전자의 발현을 저해하는데 유용하다. 특히 치료되어 지는 질환 및 증상은 ARDS; COPD; ALI; 폐기종; 당뇨성 신경장애, 신장병 및 망막증; DME 및 기타 당뇨병성 증상; 녹내장; AMD; BMT 망막증; 스트로크를 포함하는 빈혈 증상; OIS; 파킨슨 병, 알쯔하이머 병, ALS과 같은 신경퇴행성 질환; 신 질환: ARF, DGF, 이식 거부; 청각 장애; 척수 손상; 구강 점막염; 암, 안구건조증 및 압통이다.
정의
편의를 위해 명세서, 실시예 및 특허청구범위에서 사용된 용어가 여기에서 기술되어 진다.
여기서 사용된 것으로, 단수 형태는 내용상으로 명확하게 그렇지 않은 것이 나타나지 않는다면 복수형을 포함한다. 본 발명의 일 측면 또는 실시형태가 마쿠쉬 군이나 다른 대체적인 그룹화의 관점으로 기술되어 지지만, 이 기술 분야의 통상인은 본 발명은 또한 이에 의해 이들 군의 구성분의 하부 그룹 또는 개개 구성분의 관점에서 기술되어 진다는 것을 인지할 것이다.
"저해제"는 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이런 유전자의 산물의 활성을 (부분적으로 또는 완전하게) 감소할 수 있는 화합물이다. 여기서 상용된 것으로서 용어 "저해제"는 siRNA 저해제에 대한 것이다. 이 "siRNA 저해제"는 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이런 유전자의 산물의 활성을 감소할 수 있는 화합물이다. 여기서 사용된 것으로 용어 "siRNA 저해제"는 하나 또는 그 이상의 siRNA, shRNA, siNA, 합성 shRNA; miRNA에 대한 것이다. 저해는 또한 RNAi에 대핸 다운-레귤레이션 또는 사일런싱에 대해 언급될 수 있다.
여기서 사용된 것으로 용어 "저해"는 원하는 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성하기에 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이런 유전자의 산물의 활성을 감소하는 것을 언급한다. 저해는 완전한 것이나 부분적인 것이다.
여기서 사용된 것으로, 용어 표적 유전자의 "저해"는 표적 유전자의 산물의 폴리펩티드 활성 또는 유전자 발현(전사 또는 복제)의 저해를 의미한다. 여기서 사용된 것으로 "유전자 산물"은 RNA 트랜스크립트 또는 폴리펩티드와 같은 유전자의 산물에 대해 언급한다. 용어 "RNA 트랜스크립트", "mRNA 폴리뉴클레오티드 시퀀스", "mRNA 시퀀스" 및 "mRNA"는 상호교환적으로 사용되어 진다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호 교환적으로 사용되어 질 수 있고, 그리고 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 뉴클레오티드 시퀀스를 언급한다. 이 용어는 동등물로서 뉴클레오티드 아날로그로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사화합물을 포함하는 것으로 이해되어 진다. 본 개시사항을 통하여, mRNA 시퀀스는 상당하는 유전자를 나타내는 것으로 제시되어 진다.
"올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 약 2부터 약 50 뉴클레오티드의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 시퀀스에 대해 언급한다. 각각의 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 독립적으로 천연 또는 합성일 수 있고, 및 또는 변형된 또는 비변형된 것일 수 있다. 변형은 올리고뉴클레오티드 내에 당 부분, 염기 부분 및 또는 뉴클레오티드 사이에 연결에서 변화를 포함한다. 본 발명의 화합물은 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 디옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사화합물, 변형된 뉴클레오티드 유사화합물, 비범 및 비염기성 부분 및 이들의 조합을 포함하는 분자를 포괄한다.
실질적으로 상보성은 다른 시퀀스에 약 84%보다 큰 상보성을 언급한다. 예를 들어, 19 염기 쌍으로 구성되는 듀플렉스 영역에서 하나의 미스매치는 94.7% 상보성을 초래하고, 두 개의 미스매치는 89.5% 상보성을 초래하고, 그리고 3 미스매치는 84.2% 상보성을 초래하여, 듀플렉스 영역에 실질적으로 상보성을 부여한다. 따라서 실질적으로 동등한은 다른 시퀀스에 약 84%보다 큰 동일성에 대해 언급한다.
"뉴클레오티드"는 천연 또는 합성 및 변형된 또는 비변형될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티를 포괄하는 것으로 의미되어 진다. 뉴클레오티드는 합성인, 천연적으로 발생하는 및 비-천연적으로 발생하는 것인 공지의 뉴클레오티드 유사화합물을 포함한다. 이러한 유사화합물의 예는, 제한 없이, 포스포로티오에이트류, 포스포라미디트류, 메틸 포스포네이트류, 키럴-메틸 포스페이트류, 2'-0-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩테드-핵산(PNAs)을 포함한다. 변형은 올리고리보뉴클레오티드 내에 당 부분, 염기 부분 및 또는 리보뉴클레오티드 사이에 연결에서 변화를 포함한다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "리보뉴클레오티드"는 합성인, 천연적으로 발생하는 및 비-천연적으로 발생하는 것인 천연 및 합성, 비변형된 및 변형된 리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드 유사화합물을 포괄한다. 변형은 올리고리보뉴클레오티드 내에 당 부분에 대해, 염기 부분에 대해 및/또는 리보뉴클레오티드 사이에 연결에서 변화를 포함한다.
뉴클레오티드는 천연적으로 발생하는 또는 합성적 변형된 염기로부터 선택되어 진다. 자연적으로 발생하는 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. 뉴클레오티드의 변형된 염기는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 2- 아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 기타 알킬 아데닌류, 5-할로우라실, 5-할로시토신, 6-아자시토신 및 6-아자티민, 슈도우라실, 디옥시슈도우라실, 4-티오우라실, 리보-2-티오우리딘, 리보-4-티오우리딘, 8-할로아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올아데닌, 8-티올알킬 아데닌류, 8-하이드록실 아데닌 및 기타 8-치환된 아데닌류, 8-할로구아닌류, 8-아미노구아닌, 8-티올구아닌, 8-티오알킬구아닌류, 8-하이드록실구아닌 및 기타 치환된 구아닌류, 기타 아자 및 디아지 아데닌류, 기타 아자 및 디아자 구아닌류, 5-메틸리보우리딘, 5-트리플루오로메틸 우라실, 5-메틸리보시토신, 및 5-트리플루오로시토신을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 올리고머 내의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드는 이노신으로 치환된다.
몇몇 실시형태에 있어서, siRNA 화합물은 더욱이 당 변형, 염기 변형 또는 뉴클레오티드 내 연결 변형을 갖는 리보뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 DNA 및 LNA (locked nucleic acid), ENA (ethylene-bridged nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), 아라비노시드, 포스포노카르복실레이트 또는 포스피노카르복실레이트 뉴클레오티드 (PACE 뉴클레오티드), 또는 6 탄소 당을 갖는 뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
변형된 디옥시리보뉴클레오티드는, 예를 들어 5' 말단 위치(위치 번호 1)에서 뉴클레오티드로 유용할 수 있는 5'OMe DNA (5-메틸-디옥시리보구아노신-3'-포스페이트); PACE (디옥시리보아데노신 3' 포스포노아세테이트, 디옥시리보시티딘 3' 포스포노아세테이트, 디옥시리보구아노신 3' 포스포노아세테이트, 디옥시리보티미딘 3' 포스포노아세테이트)을 포함한다.
가교 핵산은 LNA (2'-0, 4'-C-메틸렌 가교 핵산 아데노신 3' 모노포스페이트, 2'-0,4'-C-메틸렌 가교 핵산 5-메틸-시티딘 3' 모노포스페이트, 2'-0,4'-C-메틸렌 가교 핵산 구아노신 3' 모노포스페이트, 5-메틸-우리딘(또는 티미딘) 3' 모노포스페이트); 및 ENA (2'-0,4'-C-에틸렌 가교 핵산 아데노신 3' 모노포스페이트, 2'-0,4'-C-에틸렌 가교 핵산 5-메틸-시티딘 3' 모노포스페이트, 2'-0,4'-C-에틸렌 가교 핵산 구아노신 3' 모노포스페이트, 5-메틸-우리딘(또는 티미딘) 3' 모노포스페이트)을 포함한다.
뉴클레오티드 / 올리고뉴클레오티드의 모든 유사화합물 또는 이에 대한 변형은, 상기 유사화합물 또는 변형이 뉴클레오티드 / 올리고뉴클레오티드의 특성, 즉 작용에 실질적으로 역으로 영향을 미치지 않는다면 본 발명으로 채용되어 진다. 허용될 수 있는 변형은 당 부분의 변형, 염기 부분의 변형, 뉴클레오티드 내의 연결에서의 변형 및 이들의 조합을 포함한다.
당 변형은 당 잔기의 2' 부분 상에서의 변형을 포함하고 그리고, 유럽특허 EP 0 586 520 Bl 또는 EP 0 618 925 Bl에 기술된 바와 같이, 아미노, 플루오로, 알콕시(예를 들어, 메톡시), 알킬, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 이미다졸, 카르복실레이트, 티오에이트, C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아르알킬, OCF3, OCN, 0-, S-, 또는 N- 알킬; 0-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; S02CH3; ON02; N02, N3; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환된 실릴을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 변형된 siRNA 화합물은 당 부분 상에 2' 변형("2' 당 변형")을 포함하는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 실시형태에 있어서, siRNA 화합물은 2'0-알킬 또는 2'-플루오로 또는 2'O-알릴 또는 어떤 다른 2' 변형, 임의적으로 대한적인 위치에서 변형을 포함한다. 다른 안정화 변형이 또한 가능하다(예를 들어, 말단 변형). 몇몇 실시형태에 있어서, 바람직한 2'-알킬은 2'O-메틸 (메톡시) 당 변형이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 골격은 변형되어 지고 그리고 포스페이트-D-리보스 체를 포함하지만, 그러나 또한 티오포스페이트-D-리보스 체, 트리에스테르, 티오에이트, 2'-5' 가교 골격(또한 5'-2'으로 언급될 수 있음), PACE 등을 함유할 수 있다.
여기서 사용된 것으로, 용어 "비-쌍 뉴클레오티드 유사화합물"은, 여기에 한정되는 것은 아니지만: 6 데스 아미노 아데노신(네뷸라린), 4-Me-인돌, 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보 T, N3-Me dC, N3-Me-dT, Nl-Me-dG, Nl-Me-dA, N3-ethyl-dC, N3-Me dC를 포함하는 비-염기 쌍 부분을 포함하는 뉴클레오티드 유사화합물을 의미한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비-염기 쌍 뉴클레오티드 유사화합물은 리보뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 비-염기 쌍 뉴클레오티드 유사화합물 디옥시리보뉴클레오티드이다. 부가적으로, 폴리뉴클레오티드의 유사화합물이 제조되어 질 수 있는데 여기서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 구조는 치료적인 또는 실험적 시약으로서 기본적으로 개변되어 지고 그리고 양호하게 각색되어 진다. 뉴클레오티드 유사화합물의 예는 펩티드 핵산(PNA)으로 여기서 DNA (또는 RNA) 내에 디옥시리보스(또는 리보스) 포스페이트 골격은 펩티드에서 발견된 것에 유사한 폴리아미드 골격으로 대체되어 진다. PNA 유사화합물은 효소적 분해에 저항적이고 그리고 생체 내 및 생체 외에서 고양된 안정성을 가지는 것으로 나타났다. 다른 변형은 폴리머 골격, 환형 골격, 비환형 골격, 티오포스페이트-D-리보스 골격, 트리에스테르 골격, 티오에이트 골격, 2'-5' 가교 골격, 인공 핵산, 모르폴리노 핵산, 글리콜 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 아라비노시드, 및 거울상 뉴클레오시드(예를 들어, 베타-D-디옥시리보뉴클레오시드 대신에 베타-L-디옥시리보뉴클레오시드)를 포함한다. LNA 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 화합물의 예는 Elmen 등(NAR 2005, 33(l):439-447)에 개시되어 져 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 인버티드 뉴클레오티드, 예를 들어 인버티드 티미딘 또는 인버티드 아데노신으로 합성되어 진다(예를 들어, Takei, 등, 2002, JBC 277(26):23800-06).
다른 변형은 또한 캡핑 부분으로 알려진 3' 말단 변형을 포함한다. 이러한 말단 변형은 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 지질, 펩티드, 당 및 인버티드 비염기성 부분으로부터 선택되어 진다. 이런 변형은 예를 들어 전사 및/또는 반전사 사슬의 3' 말단에 합체되어 진다.
본 발명에서 때로 "비염기성 뉴클레오티드" 또는 "비염기성 뉴클레오티드 유사화합물"로 언급되어 지는 것은 보다 적절하기로는 슈도-뉴클레오티드 또는 비범한 부분으로 언급되어 진다. 뉴클레오티드는 리보스 또는 디옥시리보스 당, 포스페이트, 및 염기(DNA에서 아데닌, 구아닌, 티민, 또는 시토신; RNA에서 아데닌, 구아닌, 우라실, 또는 시토신)으로 구성되는 핵산의 단량체의 단위이다. 변형된 뉴클레오티드는 당, 포스페이트 및 또는 염기의 하나 또는 그 이상에서의 변형을 포함한다. 비염기성 슈도-뉴클레오티드는 염기를 결하고 그리고 따라서 엄격하게는 뉴클레오티드가 아니다.
여기서 사용된 것으로 용어 "캡핑 부분"은 비염기성 리보스 부분, 비염기성 디옥시리보스 부분, 2'O 알킬 변형을 포함하는 변형 비염기성 리보스 및 비염기성 디옥시리보스 부분; 인버티드 비염기성 리보스 및 비염기성 디옥시리보스 부분 및 이들의 변형; C6-이미노-Pi; L-DNA 및 L-RNA을 포함하는 거울상 뉴클레오티드; 5'O-Me 뉴클레오티드; 및 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사화합물; l-(P-D-에리스로퓨라노실)뉴클레오티드; 4'-티오뉴클레오티드, 카르복실릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; l,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 12-아미노도데실 포스페이트; 하이드록시프로필 포스페이트; 1,5-언하이드로헥시톨 뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 트레오-펜토퓨라노실 뉴클레오티드; 아크릴릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-인버티드 비염기성 부분; 1 ,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 및 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 및 5'-머캅토 부분을 포함한다.
어떤 바람직한 캡핑 부분은 비염기성 리보스 또는 비염기성 디옥시리보스 부분; 인버티드 비염기성 리보스 또는 비염기성 디옥시리보스 부분; C6-아미노-Pi; L-DNA 및 L-RNA를 포함하는 거울상 뉴클레오티드이다.
"탄화 수소 부분 또는 이들의 유도체"는 직쇄 또는 분지된 알킬 부분 그리고 이 부분들 그 자체나 알코올, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트를 포함하는 관능기를 더 함유하는 것을 언급하고 그리고 또한 아민, 카르복실 산, 에스테르, 아미드, 알데하이드를 포함한다. "탄화수소 부분" 및 "알킬 부분"은 상호 교환적으로 사용되어 진다.
"말단 관능기"는 할로겐, 아민, 카르복실, 에스테르, 아미드, 알데하이드, 케톤, 에스테르 기를 포함한다.
여기서 사용된 것으로 용어 "비범한 부분"은 비염기성 리보스 부분, 비염기성 디옥시리보스 부분, 디옥시리보뉴클레오티드, 변형된 디옥시리보뉴클레오티드, 거울상 뉴클레오티드, 비-염기 쌍 뉴클레오티드 유사화합물 및 2'-5' 인터뉴클레오티드 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 결합된 뉴클레오티드; 록키드 핵산 (LNA) 및 에틸렌 가교 핵산(ENA)을 포함하는 가교 핵산에 대해 언급한다.
비염기성 디옥시리보스 부분은 예를 들어 비염기성 디옥시리보스-3 '-포스페이트; 1,2-디디옥시-D-리보퓨라노스-3-포스페이트; 1 ,4-언하이드로-2-디옥시-D-리비톨-3-포스페이트를 포함한다.
인버티드 비염기성 디옥시리보스 부분은 인버티드 디옥시리보비염기성; 3 ',5' 인버티드 디옥시비염기성 5'-포스페이트를 포함한다.
"거울상" 뉴클레오티드는 자연적으로 발생하거나 또는 공통적으로 채용된 뉴클레오티드에 리버스드 키럴리티를 갖는 뉴클레오티드로, 예를 들어 자연적으로 발생한 (D-뉴클레오티드)의 거울상 (L-뉴클레오티드)로, 또한 거울상 리보뉴클레오티드 및 "스피겔머(spiegelmer)"의 경우에 L-RNA로 언급되어 진다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있고 그리고 적어도 하나의 당, 염기 및 또는 골격 변형을 더 포함할 수 있다. US 특허 제6,586,238호 참고. 또한, US 특허 제6,602,858호는 적어도 하나의 L-뉴클레오티드 치환체를 포함하는 핵산 촉매를 개시하고 있다. 거울상 뉴클레오티드 예를 들어 L-DNA (L-디옥시리보아데노신-3'-포스페이트 (거울상 dA); L-디옥시리보시티딘-3'-포스페이트 (거울상 dC); L-디옥시리보구아노신-3'-포스페이트 (거울상 dG); L-디옥시리보티미딘-3'-포스페이트 (거울상 dT) 및 L-RNA (L-리보아데노신-3'-포스페이트 (거울상 rA); L-리보시티딘-3'-포스페이트 (거울상 rC); L-리보구아노신-3'-포스페이트 (거울상 rG); L-리보우리딘-3'-포스페이트 (거울상 dU)를 포함한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 비변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 및/또는 비범한 부분을 포함하는 저해적 변형된 siRNA 화합물을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 siRNA 화합물은 당 변형, 염기 변형 및 인터뉴클레오티드 연결 변형으로 구성되는 군으로부터 선택되어 진 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 ENA (ethylene-bridged 핵산)을 포함하는 LNA (록키드 핵산)와 같은 변형된 뉴클레오티드; PNA (펩티드 핵산); 아라비노시드; PACE (포스포노아세테이트 및 이들의 유도체류), 또는 육탄당 또는 비염기성 리보스 부분, 비염기성 디옥시리보스 부분, 변형된 또는 비변형된 디옥시리보뉴클레오티드, 거울상 뉴클레오티드, 및 2'-5' 인터뉴클레오티드 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드로부터 선택된 비범한 부분을 갖는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 리보뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, siRNA는 화합물의 3' 말단에서 블런트되어 지는데, 예를 들어 siRNA는 전사 또는 패신저 스트랜드의 3'-말단 및 반전사 또는 가이드 스트랜드의 5 '-말단에 의해 한정된 말단 상에서 블런트로 종단되어 진다.
다른 실시형태에 있어서, 두 스트랜드의 적어도 하나는 3'-말단에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가지고; 상기 오버행은 적어도 하나의 디옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 적어도 하나의 스트랜드는 임의적으로 3'-말단에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함한다. 오버행은 약 1 내지 약 5 뉴클레오티드로 구성된다.
다양한 실시형태에 있어서, 오버행은 독립적으로 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드 및 이들의 조합으로부터 선택되어 진다. 어떤 실시형태에 있어서, 각 오버행은, 만일 존재한다면, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 비염기성 디옥시리보스 부분, 비염기성 디옥시리보스 부분, C3-아미노-Pi, C4-아미노-Pi, C5-아미노-Pi, C6-아미노-Pi, 거울상 뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 독립적으로 C2, C3, C4, C5 또는 C6 알킬 부분, 임의적으로 프로판올(C3-OH), 프로판디올, 및 프로판디올의 포스포디에스테르 유도체("C3Pi")를 포함하는 C3 [프로판, -(CH2)3-] 부분 또는 이들의 유도체를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 두 개의 탄화수소 부분을 포함하고, 그리고 몇몇 예에서는 C3Pi-C30H 또는 C3Pi-C3Pi이다. 각 C3은 공유 결합 바람직하기로는 인-기재 결합을 통해 인접한 C3에 공유적으로 컨쥬게이트되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인-기재 결합은 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트 또는 a 포스포디에스테르 결합이다.
특정한 실시형태에 있어서, x=y=19이고 그리고 Z은 C3-C3를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, C3-C3 오버행은 공유 연결, 예를 들어 포스포디에스테르 결합을 통해 (N)x 또는 (N')y의 3' 말단에 공유적으로 부착되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제일 C3 및 제이 C3 사이의 연결은 포스포디에스테르 결합이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C3Pi이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C3Ps이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C30H (OH는 수산기임)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 3' 비-뉴클레오티드 오버행은 C3Pi-C30H이다.
다양한 실시형태에 있어서, 알킬 부분은 말단 하이드록실, 말단 아미노, 또는 말단 포스페이트 기를 포함하는 C3 알킬, C4 알킬, C5 알킬 또는 C6 알킬 부분을 포함하는 알킬 유도체류를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬 부분은 C3 알킬 또는 C3 알킬 유도체 부분이다. 몇몇 실시형태에 있어서, C3 알킬 부분은 프로판올, 프로필포스페이트, 프로필포스포로티오에이트 또는 이들의 조합을 포함한다.
C3 알킬 부분은 포스포디에스테르 결합을 통해 (N')y의 3' 말단 및/또는 (N)x의 3' 말단에 공유적으로 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬 부분은 프로판올, 프로필 포스페이트 또는 프로필 포스포로티오에이트를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 Z'은 프로판올, 프로필 포스페이트 프로필 포스포로티오에이트, 이들의 조합 또는 특히 2 또는 3 공유적 결합으로 된 프로판올, 프로필 포스페이트, 프로필 포스포로티오에이트 또는 이들의 조합의 복합체로부터 독립적으로 선택되어 진다
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 Z'은
프로필 포스페이트, 프로필 포스포로티오에이트, 프로필 포스포-프로판올; 프로필 포스포-프로필 포스포로티오에이트; 프로필 포스포-프로필 포스페이트; (프로필 포스페이트)3, (프로필 포스페이트)2-프로판올, (프로필 포스페이트)2- 프로필 포스포로티오에이트로부터 독립적으로 선택되어 진다. 어떤 프로판 또는 프로판올 컨쥬게이트된 부분이 Z 또는 Z'에 포함되어 질 수 있다.
예시적인 3' 말단 비-뉴클레오티드 부분의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00002
부가적인 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 비염기성 부분 및 비변형된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 조합 또는 탄화수소 부분 및 비변형된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 조합 또는 비염기성 부분 (디옥시리보 또는 리보) 및 탄화수소 부분의 조합을 포함한다. 이런 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 C3Pi-rAb 또는 C3Pi-dAb를 포함한다.
RNA 듀플렉스의 길이는 약 18 내지 약 40 리보뉴클레오티드, 바람직하기로는 19 내지 23 리보뉴클레오티드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각 스트랜드 (올리고머)의 길이는 독립적으로 약 18 내지 약 40 염기, 바람직하기로는 18 내지 23 염기 그리고 보다 바람직하기로는 19, 20 또는 21 리보뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 표적 핵산 및 변형된 siRNA 화합물의 반전사 사슬 사이의 상보성은 완전하다. 다른 실시형태에 있어서, 표적 핵산 및 변형된 siRNA 화합물의 반전사 사슬은 실질적으로 상보성, 즉, 상기 반전사 사슬 및 표적 핵산 사이에 하나, 둘 또는 셋 이상의 미스매치가 있다.
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물의 반전사 사슬 및 전사 사슬 사이의 상보성은 완전하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 스트랜드는 실질적으로 상보성, 즉, 상기 반전사 사슬 및 상기 전사 사슬 사이에 하나, 둘 또는 셋 이상의 미스매치가 있다.
본 발명의 siRNAs 화합물은 표적 mRNA에서 뉴클레오티드에 미스매치된 반전사 사슬의 5'-말단에서 공유적으로 결합된 말단 부분을 가진다. 다양한 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 5'-말단에서의 부분은 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 슈도우라실, 디옥시슈도우라실, 디옥시리보티미딘, 변형된 디옥시리보티미딘, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신, 변형된 디옥시리보시토신, 5-메틸리보시토신, 변형된 5-메틸리보시토신, 5-메틸리보우리딘, 리보-2-티오우리딘, 리보-4-티오우리딘, 비염기성 리보스 부분 및 비염기성 디옥시리보스 부분으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 5'-말단 뉴클레오티드를 포함하는 반전사 사슬이 표적 mRNA 내의 컨시큐티브 시퀀스에 완전하게 상보성인 siRNA 화합물에 대비하여 증가된 활성을 보인다.
본 발명의 siRNA 구조는 포유류 및 비-포유류 유전자 발현을 저해하거나 희석하는데 유용한 이중사슬 RNA에 유익하게 적용되어 진다.
siRNA 올리고뉴클레오티드
일 측면에 있어서, 본 발명은 아래에 제시된 구조(A)를 가지는 화합물을 제공한다:
(A) 5' N1-(N)x - Z 3' (반전사 사슬)
3' Z'-N2-(N')y -z" 5' (전사 사슬)
여기서, N2, N 및 N' 각각은 비변형된 또는 변형된 리보뉴클레오티드, 또는 비범한 부분이고;
여기서 (N)x 및 (N')y 각각은 각 연속적인 N 또는 N'이 공유결합에 의해 인접하는 N 또는 N'에 결합된 올리고뉴클레오티드이고;
여기서 x 및 y 각각은 독립적으로 17 내지 39 사이의 정수이고;
여기서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 상보성을 가지고 그리고 (N)x는 표적 RNA에서 컨시큐티브 시퀀스에 상보성을 가지고;
여기서 N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 미스매치되어 지거나 또는 표적 RNA에 대하여 상보성 DNA 부분이고;
여기서 N1은 천연 또는 변형된 우리딘, 디옥시리보우리딘, 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 아데노신 또는 디옥시아데노신으로 구성된 군으로부터 선택된 부분이고;
여기서 z"은 존재하거나 또는 부존재일 수 있지만, 만일 존재한다면, N2-(N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 부분이고; 그리고
여기서 Z 및 Z'의 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부존재일 수 있지만, 만일 존재한다면, 독립적으로 이것이 존재하는 스트랜드의 3' 말단에 공유결합적으로 부착된 1-5 컨시큐티브 뉴클레오티드, 컨시큐티브 비-뉴클레오티드 부분 또는 이들의 조합이다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1은 (N)x에 공유적으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 미스매치되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1은 (N)x에 공유적으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 상보성인 DNA 부분이다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1 및 N2는 함께 왓슨-클릭 염기 쌍을 형성한다. 몇몇 실시형태에 있어서, N1 및 N2는 함께 비-왓슨-클릭 염기 쌍을 형성한다.
몇몇 실시형태에 있어서, x=y=18이다. 다른 실시형태에 있어서, x=y=19이다. 또 다른 실시형태에 있어서, x=y=20이다. 바람직한 실시형태에 있어서, x=y=18이다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1은 변형된 리보시토신 또는 변형된 리보우리딘이다. N1 변형된 리보시토신 또는 변형된 리보우리딘의 어떤 실시형태는 5-메틸리보시토신, 변형된 5-메틸리보시토신, 5-메틸리보우리딘, 리보-2-티오우리딘 및 리보-4-티오우리딘으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다.
어떤 실시형태에 있어서, N1은 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신, 변형된 디옥시리보시토신, 5-메틸리보시토신 및 변형된 5-메틸리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다. 다른 실시형태에 있어서, N1은 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 슈도우라실, 디옥시슈도우라실, 5-메틸리보우리딘, 리보-2-티오우리딘 및 리보 4-티오우리딘으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, N1은 디옥시리보티미딘 또는 변형된 디옥시리보티미딘이다.
몇몇 실시형태에 있어서, N2는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 비변형된 리보뉴클레오티드이다. 어떤 실시형태에 있어서, N2는 리보구아닌, 변형된 리보구아닌, 디옥시구아닌, 변형된 디옥시구아닌, 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신, 변형된 디옥시아데노신, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신 및 변형된 디옥시리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, N2는 리보구아닌, 변형된 리보구아닌, 디옥시구아닌, 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 아데노신, 디옥시아데노신, 리보시토신 및 디옥시리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다. 다른 실시형태에 있어서, N2는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신, 변형된 디옥시아데노신, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신 및 변형된 디옥시리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다. 여전히 다른 실시형태에 있어서, N2는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신, 변형된 디옥시아데노신, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신 및 변형된 디옥시리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다.
어떤 실시형태에 있어서, N1은 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신, 변형된 디옥시리보시토신, 5-메틸리보시토신 및 변형된 5-메틸리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 지고 그리고 N2는 리보구아닌, 변형된 리보구아닌, 디옥시구아닌, 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 아데노신, 디옥시아데노신, 리보시토신 및 디옥시리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, N1은 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 슈도우라실, 디옥시슈도우라실, 5 -메틸리보우리딘, 리보-2-티오우리딘 및 리보 4-티오우리딘으로 구성된 군으로부터 선택되어 지고, 그리고 N2는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신, 변형된 디옥시아데노신, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신 및 변형된 디옥시리보시토신으로 구성된 군으로부터 선택되어 진다.
어떤 실시형태에 있어서, N1은 디옥시리보티미딘 또는 변형된 디옥시리보티미딘이고, 그리고 N2는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신, 변형된 디옥시아데노신, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신 및 변형된 디옥시리보시토신로부터 선택되어 진다.
구조 (A)의 몇몇 실시형태에 있어서, N1은 2'OMe 당 변형된 리보우리딘 또는 2'OMe 당 변형된 리보시토신을 포함한다. 구조 (A)의 어떤 실시형태에 있어서, N2는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, Z 및 Z'은 부존재 한다. 다른 실시형태에 있어서, Z 또는 Z' 중의 하나는 존재한다.
다양한 실시형태에 있어서, Z 및 Z'은 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택되어 진다. 어떤 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 Z'은, 만일 존재한다면, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 비염기성 디옥시리보스 부분, 비염기성 디옥시리보스 부분, C3-아미노-Pi, C4-아미노-Pi, C5-아미노-Pi, C6-아미노-Pi, 거울상 뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z은 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, Z'은 존재한다. 부가적인 실시형태에 있어서, Z 및 Z' 양자는 존재한다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z 및 Z'은 존재하고 그리고 동일하다. 부가적 실시형태에 있어서, Z 및 Z'은 존재하고 그리고 다르다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z 및 Z'은 독립적으로 1, 2, 3, 4 또는 5 비-뉴클레오티드 부분 또는 2, 3, 4, 또는 5 비-뉴클레오티드 부분의 조합 및 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 또는 Z'은 포스포디에스테르 결합을 통해 siRNA 스트랜드의 3' 말단에 공유적으로 결합된 2 비-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z 및 Z'이 존재하고 그리고 각 하나는 하나 또는 그 이상의 알킬 부분 및 또는 이들의 유도체를 독립적으로 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, N2는 리보아데노신을 포함하고 그리고 N1은 우리딘 (리보우리딘)을 포함한다.
비-뉴클레오티드 부분은 비염기성 부분, 인버티드 비염기성 부분, 알킬 부분 또는 이들의 유도체 및 무기 포스페이트로 구성된 군으로부터 선택되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비-뉴클레오티드 부분은 알킬 부분 또는 이들의 유도체이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬 부분은 알코올, 말단 아민, 말단 포스페이트 또는 말단 포스포로티오에이트 부분을 포함하는 말단 관능기를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, Z는 존재하고 그리고 비염기성 부분, 인버티드 비염기성 부분, 탄화수소 부분 또는 이들의 유도체, 및 무기 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택되어 진 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z은 존재하고 그리고 하나 또는 그 이상의 알킬 부분 및 또는 이들의 유도체를 포함한다.
부가적인 실시형태에 있어서, Z'은 존재하고 그리고 비염기성 부분, 인버티드 비염기성 부분, 탄화수소 부분 및 무기 포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택되어 진 하나 또는 그 이상의 비-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, Z은 존재하고 그리고 하나 또는 그 이상의 알킬 부분 및 또는 이들의 유도체를 포함한다.
부가적인 실시형태에 있어서, x=y=18이고 그리고 Z 또는 Z'의 하나는 존재하고 그리고 독립적으로 두 비-뉴클레오티드 부분을 포함한다.
부가적인 실시형태에 있어서 x=y=18이고 그리고 Z 및 Z'은 존재하고 그리고 각각은 독립적으로 두 비-뉴클레오티드 부분을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 Z'은 비염기성 부분, 예를 들어 디옥시리보비염기성 부분 (여기서 "dAb"로 언급됨) 또는 리보비염기성 부분 (여기서 "rAb"로 언급됨)을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 두 개의 공유적으로 결합된 비염기성 부분을 포함하고 그리고, 예를 들어 dAb-dAb 또는 rAb-rAb 또는 dAb-rAb 또는 rAb-dAb이다. 각 부분은 공유 결합, 바람직하기로는 인-기재 결합을 통해 인접한 부분에 공유적으로 컨쥬게이트되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인-기재 결합은 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트 또는 포스포디에스테르 결합이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 독립적으로 알킬 부분, 임의적으로 프로판올(C3-OH) 및 프로판디올의 포스포 유도체("C3-3'Pi")를 포함하는 프로판[(CH2)3] 부분 또는 이들의 유도체를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 두 개의 탄화수소 부분을 포함하고, 그리고 몇몇 예에서 C3-C3이다. 각 C3은 공유 결합, 바람직하기로는 인-기재 결합을 통해 인접한 C3에 공유적으로 컨쥬게이트되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인-기재 결합은 포스포로티오에이트, 포스포노아세테이트 또는 a 포스포디에스테르 결합이다.
특정한 실시형태에 있어서, x=y=18이고 그리고 Z은 C3Pi-C30H 또는 C3Pi-C3Pi를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, x=y=18이고 그리고 Z은 C3Pi-C30H 또는 C3Pi-C3Pi를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, C3-C3 오버행은 공유 연결, 예를 들어 포스포디에스테르 연결을 통해 (N)x 또는 (N')y의 3' 말단에 공유적으로 부착되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제일 C3 및 제이 C3 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
다양한 실시형태에 있어서, 말단 하이드록실, 말단 아미노, 말단 포스페이트 기를 포함하는 알킬 부분은 C3 알킬 내지 C6 알킬 부분이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬 부분은 C3 알킬 부분이다. 몇몇 실시형태에 있어서, C3 알킬 부분은 프로판올, 프로필포스페이트, 프로필포스포로티오에이트 또는 이들의 조합을 포함한다.
C3 알킬 부분은 포스포디에스테르 결합을 통해 (N')y의 3' 말단 및 또는 (N)x의 3' 말단에 공유적으로 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬 부분은프로판올, 프로필 포스페이트 또는 프로필 포스포로티오에이트를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 Z'은 프로판올, 프로필 포스페이트, 프로필 포스포로티오에이트, 이들의 조합 또는 이들의 복합체로부터 독립적으로 선택되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및 Z'은 프로필 포스페이트, 프로필 포스포로티오에이트, 프로필 포스포-프로판올; 프로필 포스포-프로필 포스포로티오에이트; 프로필포스포-프로필 포스페이트; (프로필 포스페이트)3, (프로필 포스페이트)2-프로판올, (프로필 포스페이트)2-프로필 포스포로티오에이트로부터 독립적으로 선택되어 진다. 어떤 프로판 또는 프로판올 컨쥬게이트된 부분은 Z 또는 Z' 안에 포함되어 질 수 있다.
부가적인 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 비염기성 부분 및 비변형된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 조합 또는 탄화수소 부분 및 비변형된 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 조합 또는 비염기성 부분 (디옥시리보 또는 리보) 및 탄화수소 부분의 조합을 포함한다. 이런 실시형태에 있어서, 각각의 Z 및/또는 Z'은 C3-rAb 또는 C3-dAb를 포함한다.
바람직한 실시형태에 있어서, x=y=18이고, Z'은 부존재하고, Z은 존재하며 그리고 포스포디에스테르 결합을 통해 상호 공유적으로 연결된 두 개의 알킬 부분을 포함하고, N2는 리보아데노신을 포함하고 그리고 N1은 우리딘을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, N 및 N'은 비변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N 또는 N'은 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드 또는 비범한 부분을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비범한 부분은 거울상 뉴클레오티드, 비염기성 리보스 부분, 비염기성 디옥시리보스 부분, 디옥시리보뉴클레오티드, 변형된 디옥시리보뉴클레오티드, 거울상 뉴클레오티드, 비-염기 쌍 뉴클레오티드 유사화합물, 가교 핵산 및 2'-5' 인터뉴클레오티드 포스페이트 결합에 의해 인접한 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비범한 부분은 거울상 뉴클레오티드, 바람직하기로는 L-DNA 부분이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N 또는 N'은 하나 또는 그 이상의 당, 염기 또는 링커에서 변형된다. 어떤 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N 또는 N'은 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 실시형태에 있어서, (N)x 및 (N')y는 완전히 상보성이다. 다른 실시형태에 있어서, (N)x 및 (N')y은 실질적으로 상보성이다. 어떤 실시형태에 있어서 (N)x는 표적 시퀀스에 완전히 상보성이다. 다른 실시형태에 있어서, (N)x는 표적 시퀀스에 실질적으로 상보성이다. 어떤 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명은 변형된 뉴클레오티드가 당 부분에서, 염기 부분에서 또는 인터뉴클레오티드 연결 부분에서 변형을 가지는 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 siRNA 화합물을 제공한다.
구조 (A)에 따른 화합물의 어떤 실시형태에 있어서, 각 (N)x 및 (N')y에서의 교호하는 리보뉴클레오티드는 2'-OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드이다. 구조 (A)의 몇몇 실시형태에 있어서, (N)x에서 뉴클레오티드는 비변형되거나 또는 (N)x는 교호하는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고; 그리고 리보뉴클레오티드는 변형된 또는 비변형된 바람직하기로는 비변형된 N1-(N)x의 중간 위치에 위치되어 지고; 여기서 (N')y는 말단 또는 두 번째 마디 위치에서 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 비변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
특정한 실시형태에 있어서, x=y=18이고, N1은 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, (N)x는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고 그리고 N1-(N)x의 중간에 위치된 리보뉴클레오티드는 비변형된다. 몇몇 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 및 3' 말단의 하나 또는 양자에서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, N1은 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N)x의 5' 말단에 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, (N')x의 5' 및 3' 말단의 하나 또는 양자에서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N)y의 3' 말단에 연결되어 진다. 어떤 실시형태에 있어서 x=y=18이고; (N)x에서 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드 사이에서 교호하고, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 N1-(N)x의 중간에 위치된 리보뉴클레오티드이고; N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N)y의 3' 말단에 결합되고 그리고 (N')y의 3' 말단에서의 적어도 두 뉴클레오티드는 두 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의하여 결합되어 진다. 다른 바람직한 실시형태, x=y=18이고; (N)x에서 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드 사이에서 교호하고, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 N1-(N)x의 중간에 위치된 리보뉴클레오티드이고; 그리고 (N')y의 5' 말단에서의 적어도 세 컨시큐티브 뉴클레오티드는 세 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의하여 연결되어 진다. 부가적인 실시형태에 있어서, N2-(N)y의 중간 위치에 위치된 뉴클레오티드, 즉 위치 10에서의 뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드이다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, (N)x에서 뉴클레오티드는 2'-OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드 사이에서 교호하고, 그리고 (N')y에서 5' 말단에서의 네 컨시큐티브 뉴클레오티드는 세 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되고 그리고 5' 말단 뉴클레오티드 또는 5' 말단에서의 둘 또는 셋 컨시큐티브 뉴클레오티드는 3'-OMe 당 변형을 포함한다.
어떤 바람직한 실시형태에 있어서, x=y=18이고 그리고 (N')y에서 적어도 하나의 위치에서의 뉴클레오티드는 거울상 뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 및 2'-5' 인터뉴클레오티드 결합에 의해 인접한 뉴클레오티드에 결합한 뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 실시형태에 있어서, x=y=18이고 그리고 (N')y는 거울상 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 실시형태에 있어서, 거울상 뉴클레오티드는 L-DNA 뉴클레오티드이다. 어떤 실시형태에 있어서, L-DNA는 L-디옥시리보시티딘이다. 몇몇 실시형태에 있어서, (N')y는 위치 17에 L-DNA를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, (N')y는 위치 16 및 17에 L-DNA를 포함한다. 어떤 실시형태에 있어서, (N')y는 위치 1 및 위치 16 및 17의 하나 또는 양자에 L-DNA를 포함한다.
여전히 다른 실시형태에 있어서, (N')y는 위치 14에 DNA를 그리고 위치 16 및 17의 하나 또는 양자에 L-DNA를 포함한다. 이 구조에서, 위치 1은 L-DNA 또는 비염기성 비범한 부분을 더 포함할 수 있다.
x=y=20인 다른 실시형태에 있어서, 상기 언급된 (N')y에 대한 변형은 위치 14, 15, 16, 17 대신에 위치 17, 18, 19, 20이다. 예를 들어, 위치 16 및 17의 하나 또는 양자에의 변형은 20-mer에 대해서는 위치 18 및 19의 하나 또는 양자이다. 18-mer에서의 모든 변형은 20-및 22-mer에 유사하게 적용되어 진다.
다양한 실시형태에 따르면, N2-(N')y에서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N)y의 3' 말단에 연결되어 지고 그리고 (N')y 내 3' 말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 컨시큐티브 리보뉴클레오티드는 2'-5' 인터뉴클레오티드 연결에 의해 연결되어 진다. 일 실시형태에 있어서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 3' 말단에 연결되고 그리고 (N')y의 3' 말단에서의 세 컨시큐티브 뉴클레오티드는 세 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되고, 여기서 2'-5' 포스포디에스테르 결합을 형성하는 하나 또는 그 이상의 2'-5' 뉴클레오티드는 3'-OMe 당 변형을 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, N2는 2'-OMe 당 변형을 포함한다. 부가적인 실시형태에 있어서, (N')y의 3' 말단 뉴클레오티드는 2'-OMe 당 변형을 포함한다. 어떤 실시형태에 있어서, x=y=18이고 그리고 (N')y 내 위치 14, 15, 16, 17 및 18에서 둘 또는 그 이상의 컨시큐티브 뉴클레오티드는 2'-5' 인터뉴클레오티드 결합에 의해 인접한 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 실시형태에 있어서, 2 '-5' 인터뉴클레오티드 결합을 형성하는 뉴클레오티드는 3' 디옥시리보스 뉴클레오티드 또는 3' 메톡시 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, (N')y 내 위치 16 및 17에서의 뉴클레오티드는 2'-5' 인터뉴클레오티드 결합에 의해 연결되어 진다. 다른 실시형태에 있어서, (N')y 내 위치 15-16, 16-17, 또는 15-17에서의 뉴클레오티드는 2'-5' 인터뉴클레오티드 결합에 의해 연결되어 진다.
어떤 실시형태에 있어서, (N')y는 위치 2에 L-DNA 및 위치 15-16, 16-17, 또는 15-17에 2'-5' 인터뉴클레오티드 결합을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, (N')y의 3' 말단 뉴클레오티드 또는 3' 말단에서의 둘 또는 셋 컨시큐티브 뉴클레오티드는 L-디옥시리보뉴클레오티드이다.
다른 실시형태에 있어서, N2-(N')y 내, N2는 2' 당 변형된 뉴클레오티드이고 그리고 (N')y에서 5' 및 3' 말단 각각에서 어느 하나의 말단 또는 1 내지 7 변형된 뉴클레오티드에서의 (N')y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 컨시큐티브 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 실시형태에 있어서, 2' 당 변형은 메톡시 부분 (2'-OMe)을 포함한다. 일련의 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 말단에서의 셋, 넷 또는 다섯 컨시큐티브 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, N2 및 (N')y의 3' 말단에서의 둘 컨시큐티브 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, (N')y 내 5' 및 3' 말단 각각에서 어느 하나의 말단 또는 1 내지 7 변형된 뉴클레오티드에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 컨시큐티브 리보뉴클레오티드는 독립적으로 이환형 뉴클레오티드이다. 다양한 실시형태에 있어서, 이환형 뉴클레오티드는 록키드 핵산 (LNA) 또는 일종의 LNA이고, 즉 2'-0, 4'-C-에틸렌-가교 핵산 (ENA)은 LNA의 일종이다.
다양한 실시형태에 있어서, (N')y는 3' 및 5' 말단 양자에 또는 5' 말단에 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, (N')y의 5'에서의 적어도 두 개의 뉴클레오티드는 P-에톡시 골격 변형에 의해 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, (N')y의 3'에서의 N2는 P-에톡시 골격 변형에 의해 연결되어 진다. 어떤 실시형태에 있어서 x=y=18이고, 그리고 여기서 (N)x내 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드 사이에서 교호하고, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드이고 그리고 N1-(N)x의 중간 위치에 위치된 리보뉴클레오티드는 비변형되고; Nl은 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드이고 그리고 3' 말단에서의 세 컨시큐티브 뉴클레오티드는 P-에톡시 골격 변형에 의해 연결되어 지거나 또는 (N')y의 5' 말단에서의 네 컨시큐티브 뉴클레오티드는 세 P-에톡시 골격 변형에 의해 연결되어 진다. 부가적인 실시형태에 있어서, (N')y의 3'에서의 N2는 P-에톡시 골격 변형에 의해 연결되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, (N')y 내 5' 및 3' 말단 각각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 컨시큐티브 리보뉴클레오티드는 독립적으로 거울상 뉴클레오티드, 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드 또는 이환형 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 및 3' 말단에서의 변형은 동일하다. 일 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 말단에서의 네 컨시큐티브 뉴클레오티드는 세 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 지고, 그리고 (N')y의 3' 말단에서의 둘 또는 셋 컨시큐티브 뉴클레오티드는 둘 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 진다. 부가적인 실시형태에 있어서, (N')y의 3'에서의 N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N')y의 3' 말단에 연결되어 진다. 다른 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 말단에서의 변형은 (N')y의 3' 말단에서의 변형과는 다르다. 일 특정한 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 말단에서의 변형된 뉴클레오티드는 거울상 뉴클레오티드이고 그리고 (N')y의 3' 말단에서의 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 진다. 다른 특정한 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 말단에서의 세 컨시큐티브 뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오티드이고 그리고 (N')y의 3' 말단에서의 두 컨시큐티브 뉴클레오티드는 둘 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 진다. (N)x 내에서 뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드 사이에서 교호하고 그리고 N1-(N)x의 중간에 위치된 리보뉴클레오티드는 비변형되어 진다.
다양한 실시형태에 있어서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N')y의 3' 말단에서 연결되어 지고 그리고 (N')x의 3' 말단에서의 둘 또는 셋 컨시큐티브 뉴클레오티드는 하나 또는 두 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N')y의 3' 말단에서 연결되어 지고 그리고 (N')x의 3' 말단에서의 둘 또는 셋 컨시큐티브 뉴클레오티드는 하나 또는 두 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 지고 그리고 3' 말단에서의 하나 또는 둘 또는 세 컨시큐티브 뉴클레오티드는 3'-OMe 당 변형을 포함한다. 부가적인 실시형태에 있어서, N2는 3'-OMe 당 변형을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 x=y=18이고 그리고 여기서 (N)x 내 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드 및 비변형된 리보뉴클레오티드 사이에서 교호하고, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드이고 그리고 N1-(N)x의 중간에 위치된 리보뉴클레오티드는 비변형되어 지고; (N')y의 3' 말단에서의 두 뉴클레오티드는 두 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 지고, 그리고 (N')y의 5' 말단에서의 세 뉴클레오티드는 ENA와 같은 LNA인 화합물을 제공한다. 부가적인 실시형태에 있어서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N')y의 3' 말단에 연결되어 진다.
다른 실시형태에 있어서, (N')y의 5' 말단에서의 다섯 컨시큐티브 뉴클레오티드는 2'OMe 당 변형을 포함하고 그리고 (N')y의 3' 말단에서의 두 컨시큐티브 뉴클레오티드는 L-DNA이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 x=y=18이고 그리고 여기서 (N)x는 비변형된 리보뉴클레오티드로 구성되고; (N')y의 3' 말단에서의 두 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 연결되어 지고, 그리고 (N')y의 5' 말단에서의 세 뉴클레오티드는 ENA와 같은 LNA인 화합물을 제공한다. 부가적인 실시형태에 있어서, N2는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 (N')y의 3' 말단에 연결되어 진다.
다른 실시형태에 따르면, (N')y 내 5' 또는 3' 말단 뉴클레오티드, 또는 어나 하나의 말단에서 2, 3, 4, 5 또는 6 컨시큐티브 뉴클레오티드 또는 5' 및 3' 말단의 각각에서 1 내지 4 뉴클레오티드는 독립적으로 포스포노카르복실레이트 또는 포스피노카르복실레이트 뉴클레오티드(PACE 뉴클레오티드)이다. 몇몇 실시형태에 있어서, PACE 뉴클레오티드는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 몇몇 바람직한 실시형태에서, (N')y 내, 5' 및 3' 말단의 각각에서 1 또는 2 컨시큐티브 뉴클레오티드는 PACE 뉴클레오티드이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물의 어느 스트랜드도 3' 및 5' 말단에서 인산화되지 않는다. 다른 실시형태에 있어서, 전사 및 반전사 사슬은 3' 말단에서 인산화되어 진다. 여전히 다른 실시형태에 있어서, 반전사 사슬은 단리가능한 또는 비-단리가능한 포스페이트 기를 사용하여 5' 말단 위치에서 인산화되어 진다. 여전히 다른 실시형태에 있어서, 반전사 및 전사 사슬의 어느 하나 또는 양자는 단리가능한 또는 비-단리가능한 포스페이트 기를 사용하여 3' 말단 위치에서 인산화되어 진다.
구조 (A)는 포유류 또는 비-포유류 유전자에 대한 어떤 올리고뉴클레오티드 쌍(전사 및 반전사 사슬)으로 유용하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포유류 유전자는 인간 유전자이다. 올리고뉴클레오티드 시퀀스 쌍의 예는, 본 발명의 양수인에게 양수되어 지고 그리고 그의 전체로 여기에 레퍼런스로 합체되어 지는, PCT 특허공보 Nos. WO 2006/023544, WO 2007/084684, WO 2008/050329, WO 2007/141796, WO 2009/044392, WO 2008/106102, WO 2008/152636, WO 2009/001359, WO/2009/090639에 제공되어 진다.
달리 지시되지 않는다면, 여기서 기술된 구조의 바람직한 실시형태에 있어서, 각 컨시큐티브 N 및 N' 사이의 공유 결합은 포스포디에스테르 결합이다. 달리 지시되지 않는다면, 여기서 기술된 구조의 바람직한 실시형태에 있어서, N1 및 (N)x 사이 그리고 N2 및 (N')y 사이의 공유결합은 포스포디에스테르 결합이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 공유결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
상기 모든 구조에 대해, 몇몇 실시형태에 있어서, (N)x의 올리고뉴클레오티드 시퀀스는 (N')y의 올리고뉴클레오티드 시퀀스에 완전히 상보성이다. 다른 실시형태에 있어서, 반전사 및 전사 사슬은 실질적으로 상보성이다. 어떤 실시형태에 있어서 (N)x는 포유류의 mRNA 또는 미생물의 RNA 또는 바이러스의 RNA에 완전히 상보성이다. 다른 실시형태에 있어서, (N)x는 포유류의 mRNA 또는 미생물의 RNA 또는 바이러스의 RNA에 실질적으로 상보성이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 구조 (A)를 갖는 변형된 siRNA 화합물은 N1이 표적 mRNA 내의 뉴클레오티드에 상보성인 siRNA 화합물에 비교할 때 적어도 고양된 활성을 포함하는 유익한 특성을 나타낸다.
본 발명은 더욱이 포유류 또는 비-포유류의 유전자 발현을 저해하기에 유효한 본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약학적 조성물, 그리고 여기에 개시된 질병 및 질환의 어느 하나를 치료하기 위한 이들의 용도를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 포유류 유전자는 인간 유전자이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비-포유류의 유전자는 포유류의 질병, 바람직하기로는 인간 질병에 포함되어 진다.
본 발명은 더욱이 여기에 개시된 질병 또는 증상의 어느 하나의 발현이나 심각성을 치료하거나 방지하거나 또는 이들을 필요로 하는 대상에 여기에 개시된 질병 또는 증상의 위험이나 심각성을 감소하기 위한 방법에 대한 것으로, 여기서 질병 또는 증상 및/또는 이들과 관련된 증상이나 위험은 포유류 또는 비-포유류의 유전자의 발현과 연계되어 진다. 바람직한 실시형태에 있어서, 대상은 인간 대상이다.
siRNA 합성
공공의 그리고 사적 알고리즘을 사용하여, 포텐셜 siRNA의 전사 및 반전사 시퀀스가 생성되어 지고, 그리고 siRNA의 N1 및/또는 N2는 치환되어 구조 (A)에 따른 변형된 siRNA 화합물을 생성한다.
상기 명세에 따른 siRNA 분자는 필수적으로 여기서 개시된 것과 같이 제조되어 진다. 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 리보핵산 (또는 디옥시리보핵산) 올리고뉴클레오티드의 합성에 대해 이 기술분야에서 잘 알려진 어느 방법에 의해 합성되어 진다. 합성은 일반적으로 상업적으로 이용할 수 있는 신쎄사이저(그 중에서도 어플라이드 바이오스스템사로부터 이용할 수 있는 것)에서 수행되어 진다. 올리고뉴클레오티드 합성은 예를 들어 Beaucage 및 Iyer, Tetrahedron 1992; 48:2223-2311; Beaucage 및 Iyer, Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 그리고 Caruthers, 등의 Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313에 기술되어 져 있고; 이들 중 티오에이트의 합성은 Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402에 기술되어 져 있고, RNA 분자의 합성은 Sproat, Herdewijn P.에 의해 편집된 Humana Press 2005; Kap. 2: 17-31에 개시되어 져 있고, 그리고 이들 중 각 다운스트림 프로세스는 Pingoud 등의 Oliver R.W.A.에 의해 편집된 IRL Press 1989; Kap. 7: 183-208.에 기술되어 져 있다.
다른 합성적 과정이 이 기술 분야에 알려져 있는데, 예를 들어 Usman 등의 1987, J. Am. Chem. Soc, 109, 7845; Scaringe 등의 1990, NAR., 18, 5433; Wincott 등의 1995, NAR. 23, 2677-2684; 및 Wincott 등의 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59에 기술된 과정은 5'-말단에서의 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서 포스포르아미디트류와 같은 공통 핵산 보호 및 커플링 기의 사용을 할 수 있다. 변형된 (즉, 2'-O-메틸화) 뉴클레오티드 및 비변형된 뉴클레오티드가 바람직하게 합체되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 별도로 합성되어 지고 그리고, 예를 들어 결찰(Moore 등의 1992, Science 256, 9923; Draper 등의 국제 특허 공보 WO 93/23569; Shabarova 등, 1991, NAR 19, 4247; Bellon 등, 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon 등, 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204), 또는 합성에 따른 하이브리디제이션 및/또는 탈보호에 의해 포스트-합성적으로 함께 결합되어 진다.
화학적으로 합성된 분획의 오버랩핑 쌍은 이 기술에서 잘 알려진 방법(즉, US 특허번호 6,121,426호 참고)을 사용하여 결찰되어 질 수 있다. 스트랜드는 별도로 합성되어 지고 그리고 그런 다음 튜브 안에서 상호 어닐링되어 진다. 그런 다음 이중 사슬 siRNA는 HPLC에 의해 어닐링되지 않은(즉, 이들의 하나의 과잉 때문에) 단일 사슬 올리고뉴클레오티드로부터 분리되어 진다. 본 발명의 변형된 siRNA 화합물에 대한 관계에서, 둘 또는 그 이상의 이런 시퀀스가 본 발명에서의 사용을 위하여 합성되어 질 수 있고 그리고 함께 링커되어 질 수 있다.
본 발명의 siRNAs 화합물은 표적 mRNA 내의 뉴클레오티드에 미스매치되어 지는 반전사 사슬의 5'-말단에 공유적으로 결합된 말단 부분을 가진다. 다양한 실시형태에 있어서, 반전사 사슬의 5'-말단에서의 부분은 리보우리딘, 디옥시리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 변형된 디옥시리보우리딘, 슈도우라실, 디옥시슈도우라실, 디옥시리보티미딘, 변형된 디옥시리보티미딘, 리보시토신, 변형된 리보시토신, 디옥시리보시토신, 변형된 디옥시리보시토신, 5-메틸리보시토신, 변형된 5-메틸리보시토신, 5-메틸리보우리딘, 리보-2-티오우리딘, 리보-4-티오우리딘, 비염기성 리보스 부분 및 비염기성 디옥시리보스 부분으로 구성된 군으로부터 선택되어 지고 그리고 전사 사슬의 3'-말단에서의 부분은 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 비범한 부분으로부터 선택되어 진다. 본 발명의 siRNA 구조는 포유류 및 비-포유류의 유전자 발현을 저해하거나 희석하는데 유용한 이중사슬 RNA에 유익하게 적용되어 진다.
약학적 조성물
비록 본 발명의 화합물이 그 화합물 자체로 투여되어질 수도 있지만, 바람직하기로는 이들이 약학적 조성물로서 제공되어 진다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 변형된 siRNA 화합물 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 제공되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 약학적 조성물은 본 발명의 돌 또는 그 이상의 변형된 siRNA 화합물을 포함한다.
본 발명은 더욱이 표적 유전자를 저해하기에 유효한 양으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된 본 발명의 적어도 하나의 화합물 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 siRNA 화합물은 내인성 세포질 복합체에 의해 세포질 내적으로 처리되어 본 발명의 하나 또는 그 이상의 올리고리보뉴클레오티드를 생성한다.
본 발명은 더욱이 약학적으로 허용될 수 있는 담체 및 표적 유전자의 포유동물에서 세포의 발현을 하향 조절하기에 유효한 양으로 본 발명의 하나 또는 그 이상의 변형된 siRNA 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 이 화합물은 표적 mRNA의 시퀀스에 실질적으로 상보성인 시퀀스를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 변형된 siRNA 화합물은 약학적 조성물에서 주요 활성 구성분이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 변형된 siRNA 화합물은 둘 또는 그 이상의 siRNA를 함유하는 약학적 조성물의 활성 구성분의 하나이고, 상기 약학적 조성물은 더욱이 하나 또는 그 이상의 표적 유전자를 표적하는 하나 또는 그 이상의 siRNA 화합물로 구성되어 진다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 과정을 제공한다:
본 발명의 하나 또는 그 이상의 이중사슬 변형된 siRNA 화합물을 제공하는 것; 및 상기 화합물을 약학적으로 허용될 수 있는 담체와 혼합하는 것.
바람직한 실시형태에 있어서, 약학적 조성물의 제조에 사용된 변형된 siRNA 화합물은 약학적으로 유효한 복용량으로 담체와 혼합되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 스테로이드에, 또는 지질에, 또는 다른 적절한 분자, 즉 콜레스테롤에 컨쥬게이트되어 진다.
RNA 인터퍼런스
RNAi 현상에 관련하는 다수의 PCT 출원이 최근 들어 공개되어 졌다. 이들은: PCT 공개공보 WO 00/44895; PCT 공개공보 WO 00/49035; PCT 공개공보 WO 00/63364; PCT 공개공보 WO 01/36641; PCT 공개공보 WO 01/36646; PCT 공개공보 WO 99/32619; PCT 공개공보 WO 00/44914; PCT 공개공보 WO 01/29058; 및 PCT 공개공보 WO 01/75164를 포함한다.
RNA 인터퍼런스(RNAi)는 시토플라즘의 단백질 복합체를 도입하기 위해 dsRNA 종의 능력에 기초되어 지고, 여기서 이것은 그런 다음 상보성 세포질의 RNA를 표적으로 하여 이것을 특징적으로 분해한다. RNA 인터퍼런스 반응은 일반적으로 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)로 언급되어 지는 siRNA를 함유하는 내인성 복합체 특징을 가져, siRNA 듀플렉스의 반전사 사슬에 상보성인 시퀀스를 가지는 단일-사슬 RNA의 단리를 조정한다. 표적 RNA의 단리는 siRNA 듀플렉스의 반전사 사슬에 상보성인 영역의 중간에서 일어날 수 있다(Elbashir 등, Genes Dev., 2001, 15(2): 188-200). 보다 자세하게는, 긴 dsRNA들은 짧은(17-29 bp) dsRNA 분획(또한 짧은 저해적 RNAs, "siRNAs"로 언급됨)으로 타입 III RNAses(DICER, DROSHA, 등; Bernstein 등, Nature, 2001, 409(6818):363-6; Lee 등, Nature, 2003, 425(6956):415-9)에 의해 끊어질 수 있다. RISC 단백질 복합체는 이들 분획 및 상보성 mRNA를 인식한다. 전체의 과정은 표적 mRNA의 내인성 단리에 의해 완결되어 진다(McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3(10):737-47; Paddison & Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003, 5(3):217-24). (이들 용어 및 제안된 메카니즘에 대한 부가적인 정보에 대해서는, 예를 들어 Bernstein 등, RNA 2001, 7(11): 1509-21; Nishikura, Cell 2001, 107(4):415-8 및 PCT 공개공보 WO 01/36646 참고).
알려진 유전자에 상응하는 siRNA의 셀렉션 및 합성은 광범위하게 보고되어 져 있다; 예를 들어 Ui-Tei 등, J Biomed Biotechnol. 2006; 2006: 65052; Chalk 등, BBRC. 2004, 319(1): 264-74; Sioud & Leirdal, Met. Mol Biol; 2004, 252:457-69; Levenkova 등, Bioinform. 2004, 20(3):430-2; Ui-Tei 등, Nuc. Acid Res. 2004, 32(3):936-48 참고. 변형된 siRNA의 사용 및 생산의 예에 대해서는 Braasch 등, Biochem., 2003, 42(26):7967-75; Chiu 등, RNA, 2003, 9(9):1034-48; PCT 공개공보 WO 2004/015107 (Atugen); WO 02/44321 (Tuschl 등), 및 US 특허번호 5,898,031 및 6,107,094 참고.
siRNA 및 RNA 인터퍼런스
RNA 인터퍼런스(RNAi)는 이중-사슬(ds) RNA-의존성 유전자 특이적 후전사의 사일런싱을 포함하는 현상이다. 이들 현상을 연구하고 그리고 실험적으로 포유동물의 세포를 복제하기 위한 최초의 시도는 긴 dsRNA 분자에 대한 반응에서 활성화되어 진 활성, 비-특이적 항바이러스의 방어에 의해 좌절되어 졌다(Gil 등. Apoptosis, 2000. 5: 107-114). 이 후, 21 뉴클레오티드 RNA의 합성적인 듀플렉스가 유전적 항바이러스의 방어 메카니즘을 자극함이 없이 포유동물의 세포에서 유전자 특이적 RNAi를 조절할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Elbashir 등. Nature 2001, 411 :494-498 및 Caplen 등. PNAS USA 2001, 98:9742-9747 참고). 그 결과로서, 짧은 간섭 RNAs(siRNAs)가 유전 기능을 이해하기 위한 시도에 있어서 강력한 도구가 되었다.
포유동물에서 RNA 인터퍼런스(RNAi)는 짧은 간섭 RNAs(siRNAs)(Fire 등, Nature 1998, 391 :806) 또는 마이크로RNAs(miRNAs) (Ambros, Nature 2004, 431(7006):350-355; Barrel, Cell 2004, 116(2): 281-97)에 의해 조절되어 진다. 식물에서의 상응하는 프로세스는 일반적으로 특정한 후전사의 유전자 사일런싱(PTGS) 또는 RNA 사일런싱으로 언급되어 지고 그리고 또한 곰팡이에서 퀄링으로 언급되어 진다.
siRNA는 그의 내인성(세포질) 상대편의 유전자/mRNA의 발현을 하향-조절하거나 또는 사일런싱(방지)하는 이중-사슬 RNA 또는 변형된 RNA 분자이다. RNA 인터퍼런스의 메카니즘은 다음에 상세하게 설명된다.
몇몇 연구는 siRNA 치료적 제제가 포유동물 및 인간 양자에 있어서 생체 내에서 유효하다고 밝혔다. Bitko 등은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 뉴클레오캡시드 N 유전자에 대해 향하는 특정한 siRNA 분자가 이들이 코를 통해 투여되어 질 때 마우스를 치료하는데 효과적이다는 것을 밝혔다(Nat. Med. 2005, 1 l(l):50-55). siRNA 치료제를 검토하는 최근의 리뷰가 이용되어 질 수 있다(Barik, 등, J. Mol. Med 2005, 83:764-773; Dallas 및 Vlassov, Med. Sci. Monitor 2006, 12(4):RA67-74; Chakraborty, Current Drug Targets 2007, 8(3):469-82; Dykxhoorn 등, Gene Therapy 2006. 13:541-552).
Mucke (IDrugs 2007 10(1):37-41)는 안과의 질환, 예를 들어 연령 관련 시력 감퇴(AMD) 및 녹내장의 치료를 위해, 다양한 표적에 대한 siRNA를 포함하는 최근의 치료법의 리뷰를 제시했다.
siRNA 구조
공지된 유전자에 상응하는 siRNA의 셀렉션 및 합성은 광범위하게 보고되어 있다(예를 들어 Ui-Tei 등, J Biomed Biotech. 2006; 2006: 65052; Chalk 등, BBRC. 2004, 319(1): 264-74; Sioud & Leirdal, Met. Mol Biol; 2004, 252:457-69; Levenkova 등, Bioinform. 2004, 20(3):430-2; Ui-Tei 등, NAR. 2004, 32(3):936-48; De Paula 등, RNA 2007, 13:431-56 참고).
변형된 siRNA의 사용 및 생산의 예는, 예를 들어, Braasch 등, Biochem., 2003, 42(26):7967-75; Chiu 등, RNA, 2003, 9(9):1034-48; PCT 공개공보 WO 2004/015107 (atugen AG); WO 02/44321 (Tuschl 등)를 참고한다. US 특허번호 5,898,031 및 6,107,094는 화학적으로 변형된 올리고머를 개시한다. US 특허 공개공보 제2005/0080246 및 2005/0042647호는 각각 교호하는 부분을 갖는 올리고머 화합물 및 화학적으로 변형된 인터뉴클레오시드 연결을 갖는 dsRNA 화합물에 대한 것이다.
다른 변형이 개시되어 있다. 5'-포스페이트 부분의 함입은 초파리의 엠브리요에서 siRNA의 활성을 고양하는 것으로 나타났고 (Boutla, 등, Curr. Biol. 2001, 11 : 1776-1780) 그리고 인간의 헬라 셀에서 siRNA 기능을 위해 필요로 되어 진다(Schwarz 등, Mol. Cell, 2002, 10:537-48). Amarzguioui 등 (NAR, 2003, 31(2):589-95)은 siRNA 활성은 2'-0-메틸 변형의 위치화에 의존한다는 것을 밝혔다. Holen 등(NAR. 2003, 31(9):2401-07)은 적은 수의 2'-0-메틸 변형된 뉴클레오시드를 갖는 siRNA가 야생형에 비하여 양호한 활성을 제공하지만 이 활성은 2'-0-메틸 변형된 뉴클레오시드의 수가 증가함에 따라 감소된다는 것을 보고했다. Chiu 및 Rana (RNA. 2003, 9: 1034-48)은 전사 또는 반전사 사슬에서 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드의 합체(완전히 변형된 스트랜드)는 비변형된 siRNA에 비하여 siRNA 활성을 심각하게 감소하였다는 것을 기술하였다. 반전사의 3'-말단 및 전사 사슬의 양 말단에서의 배치가 내성인 반면, 반전사 사슬 상에 5'-말단에서 2'-0-메틸 기의 배치는 활성을 심각하게 제한한다고 보고되어 있다(Czauderna 등, NAR. 2003, 31(11):2705-16; WO 2004/015107). 본 발명의 분자는 이들이 안정하며 활성이고, 그리고 다양한 질병의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 유용하다는 이점을 제공한다.
본 발명의 양수인에 의한 것이며 그리고 그 전체로서 여기서 레퍼런스로 합체되어 지는 PCT 특허 공보 제WO 2008/104978 및 WO 2009/044392호는 신규한 siRNA 구조를 개시한다.
본 발명의 양수인에 대한 PCT 공개공보 제WO 2008/050329 및 US 시리얼 번호 11/978,089호는 프로-어팝토틱 유전자의 저해제에 대한 것으로, 그 전체로서 여기서 레퍼런스로 합체되어 진다.
PCT 특허 공개공보 제WO 2004/111191 및 WO 2005/001043호는 RNAi를 고양하기 위한 방법에 대한 것이다.
본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물과 표적 유전자의 mRNA 트랜스크립트를 접촉하는 것을 포함하는 방법으로, 대조군에 비하여 적어도 20%, 30%, 40%> 또는 50%>의 표적 유전자의 발현을 다운-레귤레이션하는 방법을 제공한다.
부가적으로, 본 발명은 포유동물에 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법으로, 대조군에 비하여 적어도 20%, 30%, 40% 또는 50%의 포유동물에 있어서 표적 유전자의 발현을 다운-레귤레이션하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 포유동물은 인간이다.
다양한 실시형태에 있어서, 구조 (A)의 이중사슬 핵산 분자는 표적 유전자의 발현을 다운-레귤레이션하며, 여기서 표적 유전자의 발현의 다운-레귤레이션은 유전자 작용(특히, 네이티브 유전자/폴리펩티드의 공지된 상호 작용자로, 예를 들어 바인딩 어세이 또는 효소학적 어세이에 의해 시험되어 짐)의 다운-레귤레이션, 유전자의 폴리펩티드 생산(특히, 예를 들어 위스턴 블럿팅, ELISA 또는 면역-침전법에 의해 시험됨)의 다운-레귤레이션 및 유전자의 mRNA 발현(특히, 예를 들어 노턴 블럿팅, 정량적 RT-PCR, 인-시투 하이브리디제이션 또는 마이크로어레이 하이브리디제이션에 의해 시험됨)의 다운-레귤레이션을 포함하는 군으로부터 선택되어 진다.
전달
본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 화합물 그 자체로(즉, 네이키드 siRNA로서) 또는 약학적으로 허용될 수 있는 염으로 투여되어 지고 그리고 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체, 용매, 희석제, 부형제, 어주번트 및 공액과 조합하여 활성 성분으로 투여되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 siRNA 분자는 담체 또는 희석제로 제조된 네이키드 분자의 직접적인 적용에 의해 표적 조직에 전달되어 진다.
용어 "네이키드 siRNA"는 바이러스 시퀀스, 바이러스 입자, 리포좀 제형, 리포펙틴 또는 침전 제제 등을 포함하는, 세포 안으로 도입을 보조, 증진 또는 용이하게 작용하는 어떤 전달 공액으로부터 유리하는 siRNA 분자에 대해 언급한다. 예를 들어, PBS 내에서 siRNA는 "네이키드 siRNA"이다.
약학적으로 허용될 수 있는 담체, 용매, 희석제, 부형제, 어주번트 및 공액뿐 아니라 임플란트 담체는 일반적으로 본 발명의 활성인 변형된 siRNA 화합물과 반응하지 않는 비활성, 비-독성 고체 또는 액체 필러, 희석제 또는 캡슐화 물질을 언급하고, 그리고 이들은 리포좀 및 마이크로스피어를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 siRNA 화합물은 폴리에틸렌이민(PEI) 유도체를 갖는 PEI로, 즉 키토산이나 폴리(락틱-코-글리콜 산)(PLGA)으로, 분지 PEI의 올리익 및 스테아르 산 변형 유도체로 제형되어 진다. 예를 들어 리포좀, 마이크로- 또는 나노-스피어 및 나노입자에서 조성물을 제형화는 안정성을 고양할 수 있고 그리고 흡수에 유익할 수 있다.
부가적으로, 조성물은 퍼플루오로카본(PFCs), 즉 퍼플루오로옥틸 브로마이드(퍼플루브론)과 같은 인공의 산소 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 유용한 전달 시스템의 예는 U.S. 특허번호 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; 및 4,475,196을 포함한다. 많은 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 이 기술분야에 통상인에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 하나의 특정한 실시형태에 있어서 국부적 및 피부를 통한 제형이 선택되어 진다.
따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 siRNA 분자는 리포좀 제형 및 리포펙틴 제형 등에서 전달되어 지고, 그리고 이 기술 분야의 통상인에게 잘 알려진 방법으로 제조되어 질 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 여기서 레퍼런스로 합체되어 지는 U.S. 특허번호 5,593,972, 5,589,466, 및 5,580,859호에 기술되어 있다.
포유류 세포 안으로 siRNA의 고양되고 개선된 전달을 특징적으로 목적으로 하는 전달 시스템이 개발되어 져 있다(예를 들어, Shen 등 FEBS Let. 539: 111-114 (2003), Xia 등, Nat. Biotech. 20: 1006-1010 (2002), Reich 등, Mol. Vision 9: 210-216 (2003), Sorensen 등, J. Mol. Biol. 327: 761-766 (2003), Lewis 등, Nat. Gen. 32: 107-108 (2002) 및 Simeoni 등, NAR 31, 11 : 2717-2724 (2003) 참고). siRNA는 최근 들어 영장류에서 유전자 발현의 저해를 위해 성공적으로 사용되어 졌다; (자세하게는, 예를 들어, Tolentino 등, Retina 2004. 24(1): 132-138 참고).
본 발명의 화합물의 개선된 전달을 위한 부가적인 제형은 비-제형화된 화합물, 콜레스테롤에 공유적으로 결합된 화합물, 및 항체를 표적하기 위해 결합된 화합물을 포함할 수 있다(Song 등, Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Biotechnol. 2005. 23(6):709-17). 콜레스테롤-컨쥬게이트된 siRNAs (및 다른 스테로이드 및 리피드 컨쥬게이트된 siRNAs)가 전달을 위해 사용되어 질 수 있다(예를 들어, Soutschek 등 Nature. 2004. 432: 173-177; 및 Lorenz 등. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. 14:4975-4977 참고).
본 발명의 화학적으로 변형된 siRNA를 포함하는 네이키드 siRNA 또는 약학적 조성물은 개개의 환자의 임상적 증상, 치료되어 지는 질병, 투여 위치 및 방법, 투여 스케쥴, 환자의 나이, 성별, 체중 및 기타 의사에게 알려진 다른 인자를 고려하여 양호한 의료적 관행에 따라 투여되고 복용되어 진다.
여기서 목적을 위한 "치료적으로 유효한 복용량"은 따라서 이 기술 분야에서 알려진 바와 같이 이러한 참작에 의해 결정되어 진다. 복용량은 반드시, 여기에 한정하는 것은 아니지만 개선된 생존율 또는 보다 빠른 회복을 포함하는 개선, 또는 이 기술 분야의 통상인에 의해 적절한 평가로서 선택되어 지는 것과 같은 증상 및 기타 인디케이터의 개선이나 제거를 달성하기에 유효하여야 한다. 본 발명의 siRNA는 단일 복용으로 또는 복합 복용으로 투여되어 질 수 있다.
일반적으로, 인간에 대한 화합물의 활성 복용량은, 단일 복용 또는 1-4주 또는 그 이상의 기간 동안 일일당 일 복용이나 일일당 두 번이나 세 번 또는 그 이상의 복용요법으로, 일일당 lng/kg 내지 약 20-100 mg/kg 체중, 바람직하기로는 약 0.01 mg 내지 약 2-10 mg/kg 체중의 범위로 된다.
본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 통상적인 어느 하나의 투여의 경로에 의해 투여되어 질 수 있다. 변형된 siRNA 화합물은 경구로, 피하로 또는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 안내, 안구, 귀, 경고실 및 비강내 투여를 포함하는 비경구로, 기관내 침적 및 기관내 흡입뿐만 아니라 흡수 기술로 투여되어 진다. 화합물의 이식이 또한 유용하다.
액체 형태는 침습적인 투여, 즉 주사 또는 국부적 또는 국소적 또는 비-침습적 투여를 위해 제조되어 진다. 용어 주사는 피하, 피부를 통해, 정맥 내, 근육 내, 척수강 내, 비강 내, 경고실을 통해 그리고 다른 비경구 투여의 경로를 포함한다. 액체 조성물은 유기성 공-용매, 수성 또는 오일성 현탁액, 식용 오일을 갖는 에멀젼뿐만 아니라 유사한 약학적 담체를 갖거나 갖지 않는 수성 용액을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 투여는 정맥 내 투여를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 비침습적인 투여를 위해 제제화되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 귀에 국부적인 투여를 위해 이어드롭으로 제제화되어 진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 눈의 표면에 국부적인 투여를 위해 아이 드롭으로 제제화되어 진다. 본 발명의 화합물의 투여에 대한 부가적인 정보는 Tolentino 등, Retina 2004. 24:132-138; 및 Reich 등, Molecular Vision, 2003. 9:210-216에서 찾을 수 있다. 부가하여, 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료에서의 사용을 위한 조성물은, 예를 들어 비강을 통한 투여를 위해 에어로졸로 형성되어 진다. 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료에서의 사용을 위한 조성물은, 예를 들어 비강을 통한 침적을 위해 비강 점액으로 형성되어 진다.
본 발명의 치료적 조성물은 바람직하기로는 이들 조성물/화합물을 함유하는 에어로졸의 흡입에 의해 또는 상기 조성물의 비강을 통한 또는 기관지 안으로 침적에 의해 투여되어 진다. 약학적 조성물의 폐로의 전달에 대한 부가적인 정보는 Weiss 등, Human Gene Therapy 1999. 10:2287-2293; Densmore 등, Molecular therapy 1999. 1 : 180-188; Gautam 등, Molecular Therapy 2001. 3:551-556; 및 Shahiwala & Misra, AAPS PharmSciTech 2004. 24;6(3):E482-6을 참고한다. 부가적으로, siRNA에 대한 호흡기 제형은 U.S. 특허출원 공개공보 2004/0063654에 기술되어 있다. siRNA에 대한 호흡기 제형은 U.S. 특허출원 공개공보 2004/0063654에 기술되어 있다.
어떤 실시형태에 있어서, 경구 조성물(타블렛, 현탁액, 용액과 같은 것)은 경구 점막의 치료를 위한 마우스워시에 적절한 경구 조성물과 같은 경구 강에 국부적인 전달을 위해 효과적일 수 있다.
특정한 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 신장 질환, 즉 급성 신부전증(ARF), 지연된 이식 기능(DGF) 및 당뇨병성 신질환의 치료를 위해 신장에 전달을 위한 정맥 내 투여를 위해 제제화되어 진다. 신장의 근위 다발 안의 표적 세포에 본 발명에 따른 변형된 siRNA 화합물의 전달은 특별하게 ARF 및 DGF의 치료에 효과적인 것으로 인지되어 진다.
뇌 안으로 화합물의 전달은, 특히 신경외과적 임플란트, 혈-뇌 배리어 파열, 지질 매개 전이, 담체 매개 유입 또는 유출, 플라즈마 단백질-매개 전이, 우용체-매개 트랜스시토시스, 흡수적-매개 트랜스시토시스, 뇌혈막에서 뉴로펩티드 전이 및 약물 표적화를 위한 유전학적 엔지니어링인 "트로이의 목마"와 같은 몇 가지의 방법에 의해 수행되어 진다. 상기 방법은 예를 들어, "Brain Drug Targeting : the future of brain drug development", W.M. Pardridge, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2001)에 기술된 바와 같이 수행되어 진다.
부가하여, 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료에서의 사용을 위한 조성물은, 예를 들어 비강 내로의 투여를 위해 에어로졸로 형성되어 진다.
CNS 질환의 치료를 위한 비강 내로의 전달은, 예를 들어 US 특허출원 공개공보 2006003989 및 PCT 출원 공개공보 WO 2004/002402 및 WO 2005/102275호에 기술된 바와 같이, 갈란타민 및 다양한 염 그리고 갈란타민의 유도체류와 같은 아세틸콜린에스테라제 저해제로 얻어진다. 예를 들어, 비강 점액의 비강 내로의 침적에 의한, CNS 질환의 치료를 위한 핵산의 비강 내로의 전달은, 예를 들어 PCT 출원 공개공보 WO 2007/107789에 기술되어 져 있다.
치료의 방법
일 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 변형된 siRNA 화합물의 치료학적으로 유효한 양을 대상에 투여하는 것을 포함하는 표적 유전자 발현과 연계된 질환으로 고통을 당하는 대상을 치료하기 위한 방법에 대한 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 치료되어 지는 대상은 온혈 동물이고 그리고 특히는 인간을 포함하는 포유류이다.
"대상을 치료하는 것"은 질병과 연계된 증상을 완화하기 위해, 질병을 치료하거나 심각성을 낮추기 위해, 질병의 진행을 늦추기 위해, 질병이 발생하는 것을 방지하기 위해 또는 질병의 발현을 지연하기 위해 유효한 치료적인 기질을 대상에 투여하는 것에 대해 언급한다. "치료"는 치료적 처리 및 예방적 또는 방지적 수단 양자에 대해 언급하는 것으로, 여기서 목적은 질환을 예방하고, 질환의 발생을 지연하고 또는 질환의 증상을 감소하기 위한 것이다. 치료가 필요한 이들은 이미 질병 또는 증상을 경험한 이들, 질병 또는 증상을을 가질 경향이 있는 이들 및 질병 또는 증상이 방지되어 져야 하는 이들을 포함한다. 본 발명의 화합물은 질병 또는 증상의 발현 전에, 발현 동안에 또는 그 후에 연속하여 투여되어 진다.
"치료적으로 유효한 복용량"은 여기에 한정하는 것은 아니지만, 개선된 생존율, 보다 빠른 회복, 증상의 개선 또는 제거, 질환의 지연된 발현, 이 기술 분야의 통상인에 의해 적절한 평가로서 선택되어 지는 것과 같은 질환 및 기타 인디케이터의 보다 늦은 진행을 포함하는 대상 또는 그의 생리학적 시스템에서의 개선을 달성하기에 유효한 약학적 화합물 또는 조성물의 양에 대해 언급한다.
"호흡기 질환"은 여기에 한정하는 것은 아니지만, 특히 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 폐기종, 만성기간지염, 천식를 포함하는 모든 종류의 폐질환 및 폐암을 포함하는 호흡계의 증상, 질환 또는 증후군에 대해 언급한다. 폐기종 및 만성기관지염은 독립적으로 또는 COPD의 일부로서 발생할 수 있다. 다양한 실시형태에 있어서, 본 발명은 주요한 이식 거부, 허혈성-환류 손상, 재관류 손상, 재관류 부종, 타가이식 부전, 장기 이식 특히는 폐이식 후 폐동맥 재이식 반응 및/또는 주요 이식 장애(PGD)를 예방하거나 치료하기 위해 이들을 필요로 하는 대상에 유효한 방법 및 조성물을 제공한다.
"미소혈관 질환"은 미세한 모세관 및 림프관에 영향을 미치는 증상, 특히 혈관경련성 질환, 혈관염성 질환 및 림프 페쇄성 질환에 대해 언급한다. 미소혈관 질환의 예는, 특히: 아마우로시스 푸각스(태아의 또는 이차적인 SLE), 알파 신드롬, Prot CS 및 ATIII 결핍, IV 약물 사용에 의해 유발된 미소혈관 병리, 단백이상혈, 간헐적 동맥염, 허혈성 시신경 신경 장해 (ION), 전방 허혈성 시신경 신경장애 (AION), 시신경염(일차적 또는 이차적인 자가면역 질환), 녹내장, 본 히펠 린다우 신드롬, 각막 질환, 각막 이식 거부 반응 백내장, 이글스 질병, 프로스트 브랜치 맥관염, 엔서클링 좌굴 작용, 평면부염을 포함하는 포도막염, 맥락막 흑색증, 맥락막 혈관종, 시신경 형성 부전과 같은 눈 질환; 망막 동맥 폐색, 망막 정맥 폐색, 조산의 망막 병증, 에이즈 망막 병증, 퍼쳐(Purtscher)의 망막 병증, 계의 혈관염 및 자가면역 질환의 망막 병증, 당뇨 망막 병증, 고혈압성 망막 병증, 방사선 망막 병증, 분기 망막 동맥 또는 정맥 폐색, 특발성 망막 혈관염, 동맥류, 시신경망막염, 망막 색전, 급성 망막 괴사, 버드샷 레티노코로이도패씨, 장기 망막 분리와 같은 망막 증상; 진상 당뇨병, 당뇨 망막 병증(DR), 당뇨병 관련 미소혈관 병증(여기서 상술된 바와 같음), 고점성 증후군, 대동맥 아치 증후군 및 안구 허혈성 증후군, 경동맥-해면 치루, 다중 경화증, 전신 홍반 루푸스, SS-A 자가 항체를 갖는 세동맥 경화증, 급성 다초점 출혈성 혈관염, 감염으로부터 유래한 혈관염, 벨리프스 질병으로부터 유래한 혈관염, 유육종증, 응혈협착증, 신경병증, 신병증, 신장의 미소혈관 질환 및 특히 허혈성 미소혈관 증상과 같은 계의 증상을 포함한다.
미소혈관 질환은 신생혈관의 요소를 포함할 수 있다. 용어 "신생혈관 질환"은 혈관의 형성(신혈관 형성)이 환자에 해로운 증상인 것에 대해 언급한다. 눈의 신혈관 형성의 예는: 망막 질환(당뇨 망막 병증, 당뇨 황반 부종, 만성 녹내장, 망막 분리, 및 시클 세포 망막 병증); 피부조홍 가려움증; 증식적 비트레오-망막 병증; 염증성 질환; 만성 포도막염; 신생염(망막아종, 위 신경교종, 흑색종); 이색성 홍채모양체염; 신혈관의 녹내장; 각막 신혈관 형성(염증성, 이식 및 전개성 홍체의 형성부전); 조합된 유리체절제 및 렌즈절제에 따른 신생혈관 형성; 혈관질환(망막 국소 빈혈, 맥락막 혈관 부족, 맥락막 혈전증 및 경동맥 동맥 국소 빈혈); 안 신경의 신생혈관 형성; 및 눈의 관통이나 손상성 안 상해에 기인한 신생혈관 형성을 포함한다. 다양한 실시형태에 있어서, 이들 모든 신생혈관의 증상은 본 발명의 화합물 및 약학적 조성물을 사용하여 치료되어 진다.
"눈 질환"은 여기에 한정하는 것은 아니지만, 맥락막의 신생혈관 형성 (CNV), 웨트 및 드라이 AMD, 안구 히스토플라스마증 증후군, 안기오드 스트리크, 브룬흐의 멤브레인에서 파열, 근시 변성, 안구 종양, 망막 퇴행성 질환 및 망막 정맥 폐쇄 (RVO)를 포함하는 눈의 증상, 질병 또는 증후군에 대해 언급한다. 다양한 실시형태에 있어서, 여기서 제시된 정의 하에서, 미소혈관의 질환 및 눈 질환의 하나, 또는 이들 양자에 대한, DR과 같이 여기에 개시된 증상은 본 발명의 방법에 따라 치료되어 진다.
보다 자세하게는, 본 발명은 성인 호흡장애 증후군(ARDS); 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD); 급성 폐손상 (ALI); 폐기종; 당뇨병성 신경장애, 신장병 및 망막증; 당뇨병성 황반 부종 (DME) 및 기타 당뇨병성 증상; 녹내장; 연령 관련 황반 변성(AMD); 골수 이식(BMT) 신병증; 허혈 증상; 안과 허혈 증후군 (OIS); 신장 질환: 급성 신부전(ARF), 지연된 이식 기능(DGF), 이식 거부; 청력 이상(청력 손실 포함); 척수손상; 구강 점막염증; 건조 눈 증후군 및 안압통; 고혈압, 고혈압적 뇌혈관 질환, 혈전이나 색전의 경우에 나타나는 것과 같은 혈관의 수축이나 폐쇄와 같은 허혈성 또는 저혈압 상태로부터 일어나는 신경성 질환, 혈관종, 혈액의 이혼화증, 심장 발작 또는 부전을 포함하는 면역기능이 제대로 발휘되지 못한 심장 작용의 어느 형태, 계의 고혈압; 스트로크, 여기에 제한됨이 없이 간질, 척수 손상, 뇌 손상을 포함하는 CNS의 질병, 질환 및 손상 및 여기에 제한됨이 없이 파킨슨 병, 근위축성측색경화증(ALS, Lou Gehrig's Disease), 알쯔하이머 병, 헌팅톤 질병 및 기타 치매 유발 질병(예를 들어, HIV-관련 치매와 같은 것)을 포함하는 신경퇴화성 질환으로부터 고통을 당하거나 이에 민감할 수 있는 대상을 치료하기에 유효한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 암의 치료에 유용한 화합물, 조성물 및 방법에 대한 것이다. 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비제어된 세포 조절에 의해 특징되어 지는 포유동물에서의 생리학적 증상을 언급하거나 기술한다. 암의 예는 여기에 한정하는 것은 아니지만, 상피성 암, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 악성 림프 암을 포함한다. 이런 암의 다른 예는 콩팥 또는 신장암, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 작은 세포 폐암, 비-작은 세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평상피암을 포함한 폐암, 편평 세포암(즉, 상피의 편평 세포암), 자궁 경부암, 난소암, 전립선암, 간암, 방광 암, 복막암, 간세포 암, 위장 암, 위장 기질 종양 (GIST), 췌장암을 포함하는 소화 또는 위의 암, 머리 및 목 암, 혈액암, 망막아종, 성상세포종, 포막종, 남화아세포종, 간종양, 비-홉킨스 림프종(NHL), 다발성 미엘로마 및 급성 혈액학의 악성종양을 포함하는 혈액학의 악성종양, 자궁 내막 또는 자궁 암종, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막 암종, 침샘 암종, 외음부 암, 갑상선 암, 식도 암종, 간장 암, 항문 암, 성기의 암종, 비인두 암종, 후두 암종, 카포시 사코마, 멜라노마, 피부 암종, 신경초종, 회돌기교종, 신경아세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요도관 암종, 갑상선 암종, 빌름스 종양뿐만 아니라 B-세포 림프종(저 등급/난포 비-홉킨스 림프종(NHL); 소형 임파구(SL) NHL; 중간 등급/난포 NHL; 중간 등급 확산 NHL; 높은 등급 면역아세포 NHL; 높은 등급 임파 아구 세포 NHL; 높은 등급 소형 비-단리 세포 NHL; 용적성 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발렌스트롬 마크로글로불린 혈증 포함); 만성 림프 백혈병(CLL); 급성 임파 아구 백혈병(ALL); 헤어리 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 백혈구증식 질환(PTLD), 뿐만 아니라 모반증, 부종(뇌 종양과 연계된 것과 같은 것) 및 메이그스 증후군과 연계된 비정상적 혈관 증식을 포함한다. 여기서 사용된 것으로 "종양"은 악성이건 또는 양성이건, 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포와 조직에 대해 언급한다.
섬유증 질환은 간 섬유증, 간경변, 허파 섬유증(ILF 포함)을 포함하는 폐 섬유증, 어떤 증상(즉, ESRD을 포함한 CKD)으로부터 유래한 신장 섬유증, 복막 섬유증, 만성 간장 손상, 원섬유형성, 다른 장기에서 섬유증 질환, 사고 및 의사 원인(수술)의 모든 가능한 종류의 피부 손상과 연계된 비정상의 흉터(켈로이드); 경피증, 심장섬유증, 녹내장 필터링 수술의 실패; 및 장협착을 포함한다.
부가적으로, 본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 변형된 siRNA 화합물과 표적 유전자를 접촉하는 것을 포함하는 방법으로, 대조군에 비하여 적어도 20%, 30%, 40%> 또는 50%>의 표적 유전자의 발현을 다운-레귤레이션하는 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 표적 유전자를 하향-제어하고 여기서 다운-레귤레이션은 유전자 작용의 다운-레귤레이션, 폴리펩티드의 다운-레귤레이션 및 mRNA 발현의 다운-레귤레이션을 포함하는 군으로부터 선택되어 진다.
본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 변형된 siRNA 화합물과 표적 유전자의 mRNA 트랜스크립트를 접촉하는 것을 포함하는 방법으로, 대조군에 비하여 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 바람직하기로는 50%, 60% 또는 70%, 보다 바람직하기로는 75%, 80% 또는 90%의 표적 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 표적 유전자 폴리펩티드를 저해하고, 여기서 저해는 기능의 저해(특히, 네이티브 유전자/폴리펩티드의 공지된 상호 작용자로, 예를 들어 효소학적 어세이 또는 바인딩 어세이에 의해 시험되어 짐), 표적 단백질의 저해(특히, 예를 들어 위스턴 블럿팅, ELISA 또는 면역-침전법에 의해 시험됨) 및 유전자의 mRNA 발현의 저해(특히, 예를 들어 노턴 블럿팅, 정량적 RT-PCR, 인-시투 하이브리디제이션 또는 마이크로어레이 하이브리디제이션에 의해 시험됨)를 포함하는 군으로부터 선택되어 진다.
부가적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 포유류 또는 비-포유류 표적 유전자의 증강된 준위에 의해 수반된 어떤 질환이나 질병에 민감한 또는 이로부터 고통을 당하는 대상을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 변형된 siRNA 화합물 또는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 대상에 투여하는 것을 포함하여 이에 의해 대상을 치료한다.
본 발명은 포유동물의 표적 유전자의 발현을 하향-제어하는, 특히 포유동물의 표적 유전자의 발현의 저해가 유익한 다음의 질병 또는 증상의 치료에 구조 (A)에 따른 변형된 RNA 화합물의 사용에 대한 것이다: ARDS; COPD; ALI; 폐기종; 당뇨병성 신경장애, 신장병 및 망막증; DME 및 기타 당뇨성 증상; 녹내장; AMD; BMT 망막증; 스트로크를 포함하는 허혈성 증상; OIS; 파킨슨 병, 알쯔하이머 병, ALS와 같은 신경퇴화성 질환; 신장 질환: ARF, DGF, 이식거부; 청각 장애; 척수 손상; 구강 점막염; 조혈 및 고체 종양 암, 안구건조증 및 압통을 포함하는 암. 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 이식 전에 장기 보관 및/또는 보전에 유용하다.
"독성 제제에 노출"은 독성 제제가 포유동물에 이용될 수 있게 되거나 또는 접촉하는 것을 의미한다. 독성 제제는 신경계에 독성일 수 있다. 독성 제제에 노출은 직접적인 투여, 즉 음식, 의약품 또는 치료적 제제, 즉 화학치료 요법제의 섭취 또는 투여에 의해, 우연한 오염에 의해, 환경적인 노출, 즉 공기 중의 또는 수성의 노출에 의해 일어날 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 화학적으로 변형된 siRNA 화합물 및 방법은 대상에서 다른 질병 및 증상의 발현이나 심각성을 치료하거나 예방하는데 유용하다. 이들 질환 및 증상은 여기에 제한되는 것은 아니지만, 스트로크 및 스트로크-형 상황(즉, 뇌, 신장, 심부전), 신경 세포사, 재환류가 있거나 없는 뇌 손상, 척수 손상, 만성 퇴행성 질환, 즉 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅톤 병을 포함하는 신경퇴행성 질환, 다발성 동맥경화증, 근위축증, 광우병 및 외인성 뇌손상(TBI)으로부터 유래하는 어팝토시스를 포함한다. 부가적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물 및 방법은 신경보호 및 또는 뇌보호를 제공하기 위한 것이다.
이에 제한됨이 없이, 표적 유전자는 p53 (TP53), TP53BP2, LRDD, CYBA, ATF3, CASP2 (카스파제 2), NOX3, HRK; C1QBP, BNIP3, MAPK8; Racl, GSK3B, CD38, STEAP4, BMP2a; GJA1, TYROBP, CTGF, SPP1 , RTN4R, ANXA2, RHOA, DUOX1, SLC5A1 , SLC2A2, AKR1B1, SORD, SLC2A1, MME, NRF2, SRM, REDD2 (RTP801L), REDDl (RTP801), NOX4, MYC, PLK1, ESPL1, HTRA2, KEAP1, p66, ZNHIT1, LGALS3, CYBB (NOX2), NOX1, NOXOl, ADRB1, HI 95, ARF1, ASPP1, SOX9, FAS, FASLG, 인간 MLL, AF9, CTSD, CAPNS1, CD80, CD86, HES1, HES5, CDK 1B, ID1, ID2, ID3, CDK 2A, 카스파제 1, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 12, 카스파제 14, Apaf-1, Nodi, Nod2, Ipaf, DEFCAP, RAIDD, RICK, BcllO, ASC, TUCAN, ARC, CLARP, FADD, DEDD, DEDD2, Cryopirin, PYCl, Pyrin, TRADD, UNC5a, UNC5b, UNC5c, ZUD, p84N5, LRDD, CDK1, CDK2, CDK4, CDK5, CDK9, PITSLRE A, CHK2, LATS1, Prk, MAP4K1, MAP4K2, STK4, SLK, GSK3alpha, GSK3beta, MEKK1, MAP3K5 (Askl), MAP3K7, MAP3K8, MAP3K9, MAP3K10, MAP3K11, MAP3K12, DRP-1, MKK6, p38, JNK3, DAPK1, DRAK1, DRAK2, IRAK, RIP, RIP3, RIP5, PKR, IREl, MSK1, PKCalpha, PKCbeta, PKCdelta, PKCepsilon, PKCeta, PKCmu, PKCtheta, PKCzeta, CAMK2A, HIPK2, LKB1, BTK, c-Src, FYN, Lck, ABL2, ZAP70, TrkA, TrkC, MYLK, FGFR2, EphA2, AATYK, c-Met, RET, PRKAA2, PLA2G2A, SMPD1, SMPD2, SPP1, FAN, PLCG2, IP6K2, PTEN, SHIP, AIF, AMID, Cytochrome c, Smac, HtrA2, TSAP6, DAP-1, FEM- , DAP-3, Granzyme B, DIO-1, DAXX, CAD, CIDE-A, CIDE-B, Fsp27, Apel, ERCC2, ERCC3, BAP31, Bitl, AES, Huntingtin, HIP1, hSir2, PHAP1, GADD45b, GADD34, RAD21, MSH6, ADAR, MBD4, WW45, ATM, mTOR, TIP49, diubiquitin/FATIO, FAF1, pi 93, Scythe/BAT3, Amida, IGFBP-3, TDAG51, MCG10, PACT, p52/RAP, ALG2, ALG3, presenelin-1, PSAP, AIPl/Alix, ES18, mda-7, pl4ARF, ANT1, p33INGl, p33ING2, p53AIPl, p53DINPl, MGC35083, NRAGE, GRIM19, 리포칼린 2, 글리코델린 A, NADE, 포리민, STAG1, DAB2, 갈렉틴-7, 갈렉틴-9, SPRC, FLJ21908, WWOX, XK, DK -1, Fzdl, Fzd2, SARP2, 아신 1, RGS3, DVL1, NFkB2, IkBalpha, NF-ATC1, NF-ATC2, NF-ATC4, zO/ZNF319, Egrl, Egr2, Egr3, Spl, TIEG, WT1, Zacl, Icaros, ZNF148, ZK1/ZNF443, ZNF274, WIG1, HIVEP1, HIVEP3, Flizl, ZPR9, GAT A3, TR3, PPARG, CSMF, RXRa, RARa, RARb, RARg, T3Ra, Erbeta, VDR, GR/GCCR, p53, p73alpha, p63(human [ta alpha, ta beta, ta gamma , da alpha, a beta, da gamma], 53BP2, ASPP1, E2F1, E2F2, E2F3, HIF1 alpha, TCF4, c-Myc, Max, Mad, MITF, Id2, Id3, Id4, c-Jun, c-Fos, ATF3, NF-IL6, CHOP, NRFl, c-Maf, Bach2, Msx2, Csx, Hoxa5, Ets-1, PUl/Spil, Ets-2, ELKl, TEL1, c-Myb, TBX5, IRF1, IRF3, IRF4, IRF9, AP-2 lpha, FKHR, FOXOIA, FKHRLl, FOX03a, AFX1, MLLT7, Tip60, BTG1, AUF1, HNRPD, TIA1, NDG1, PCBP4, MCG10, FXR2, TNFR2, LTbR, CD40, CD27, CD30, 4-1BB, TNFRSF19, XEDAR, Fnl4, OPG, DcR3, FAS, TNFR1, WSL-1, p75NTR, DR4, DR5, DR6, EDAR, TNF lpha, FAS 리간드, TRAIL, 림포톡신 alpha, 림포톡신 beta, 4-1BBL, RANKL, TL1, TWEAK, LIGHT, APRIL, IL-l-alpha, IL-l-beta, IL-18, FGF8, IL-2, IL-21, IL-5, IL-4, IL-6, LIF, IL-12, IL-7, IL-10, IL-19, IL-24, IFN alpha, IFN beta, IFN gamma, M-CSF, Prolactinm, TLR2, TLR3, TLR4, MyD88, TRIF, RIG-1, CD14, TCR alpha, CD3 gamma, CD8, CD4, CD7, CD 19, CD28, CTLA4, SEMA3A, SEMA3B, HLA-A, HLA-B, HLA-L, HLA-Dmalpha, CD22, CD33, CALL, DCC, ICAM1, ICAM3, CD66a, PVR, CD47, CD2, Thy-1, SIRPal, CD5, E-cadherin, ITGAM, ITGAV, CD18, ITGB3, CD9, IgE Fc R beta, CD82, CD81, PERP, CD24, CD69, KLRDl, 갈렉틴 1, B4GALT1, Clq alpha, C5R1, MlPlalpha, MlPlbeta, RANTES, SDF1, XCL1, CCCKR5, OIAS/OAS1, INDO, MxA, IFI16, AIM2, iNOS, HB-EGF, HGF, MIF, TRAF3, TRAF4, TRAF6, PAR-4, IKKGamma, FIP2, TXBP151, FLASH, TRF1 , IEX-1S, Dokl, BLNK, CIN85, Bif-1, HEF1, Vavl, RasGRPl, POSH, Racl, RhoA, RhoB, RhoC, ALG4, SPP1, TRIP, SIVA, TRABID, TSC-22, BRCA1, BARD1, 53BP1, MDC1, Mdm4, Siah-1, Siah-2, RoRet, TRIM35, PML, RFWD1, DIP1, Socsl, PARC, USP7, CYLD, SERPINH1 (HSP47)로 구성되는 군으로부터 선택되어 진다. 다른 유용한 표적 유전자는 미생물 유래의 유전자이다.
조합 치료법
여기에 개시된 질병을 치료하는 방법은 부가적인 저해제, 변형된 siRNA 화합물의 약리학적 특성을 개선하는 기질, 또는 미소혈관 질환, 안질환 및 증상(즉, 황반변성), 청력손상(청력상실 포함), 호흡기질환, 신장질환, 장기이식, 신경퇴화성 질환, 척수손상, 뇌손상, 안지오제네시스- 및 어팝토시스-관련 증상을 포함하는 위에서 언급된 질환 및 질병의 어느 것에 민감하거나 또는 이로부터 고통을 당하는 대상의 치료에 유효한 것으로 알려진 부가적인 화합물과 연계 또는 조합하여 여기에서 개시된 변형된 이중사슬 핵산 분자를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 따라서 또 다른 측면에서, 적어도 하나의 부가적인 치료학적으로 활성인 제제와 함께 본 발명의 치료적 변형된 siRNA 화합물의 조합을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. "연계하여" 또는 "조합하여"는 전에, 동시적으로 또는 연속하여로 의미되어 진다. 따라서, 이러한 조합의 개별 성분은 같은 또는 별개의 약학적 제형으로부터 연속적으로 또는 동시적으로 투여되어 진다.
여기에 기술된 변형된 siRNA 화합물 및 치료법과 연계하여, 미소혈관 질환, 안질환 및 증상(즉, 황반변성), 청력손상(청력상실 포함), 호흡기질환, 신장질환, 장기이식, 신경퇴화성 질환(즉, 척수손상), 안지오제네시스- 및 어팝토시스-관련 증상을 치료하기 위한 공지된 치료를 포함하는 조합 치료법은 본 발명의 일 부분인 것으로 여겨진다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 부가적인 약학적으로 유효한 화합물이 본 발명의 약학적 조성물과 연계하여 투여되어 진다. 부가하여, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 이러한 증상을 치료하기 위한 제이의 치료학적으로 활성인 화합물과 조합된 치료로 사용을 위한 치료제의 제조에 사용되어 진다. 본 발명의 화학적으로 변형된 siRNA 화합물과 조합하여 사용하기 위한 공지된 제이의 치료전 제제의 적절할 복용량은 이 기술분야의 통상인에 의해 용이하게 인식되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 상기에 언급된 조합은 단일 약학적 제형의 형태로 사용을 위해 제시되어 진다.
본 발명에 따른 약학적으로 활성인 siRNA 컨쥬게이트의 어느 하나를 포함하는 약학적 조성물의 투여는 숙련의에 의해 결정된 것으로, 정맥 내로, 동맥 내로, 피하로, 장관 내로 또는 뇌간 내로를 포함하는 많은 공지된 투여의 경로의 하나에 의해 수행되어 진다. 특정화된 제형을 사용하므로, 조성물을 경구로 또는 흡입을 통해 또는 비강 내로 침적을 통해 투여하는 것이 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 이어드롭, 점안액, 피부 제형, 피하 제형 등을 포함하는 국부적 투여를 위해 제제화되어 진다.
"연계하여"는 전에, 부가적인 약학적으로 유효한 화합물이 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물 투여에 대해 미리, 동시적으로 또는 연속하여 투여되어 지는 것으로 의미되어 진다. 상기에 언급된 이러한 조합의 개별 성분은, 따라서 같은 또는 별개의 약학적 제형으로부터 연속적으로 또는 동시적으로 투여되어 질 수 있다. 본 변형된 siRNA 화합물에 대한 경우와 같이, 제이 치료적 제제는 적절한 경로, 예를 들어, 구강, 볼, 흡입, 설하, 직장, 질, 요로관을 통해, 코로, 귀로, 눈에, 국부적으로, 경피를 통해(즉, 표피를 통해), 또는 비경구로(정맥 내로, 근육 내로, 피하로, 및 관상동맥 내로) 투여에 의해 투여되어 질 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물 및 제이 치료적 제제는 단일의 조성물로 제공되거나 또는 둘 또는 그 이상의 다른 약학적 조성물로 제공되어 동일한 경로에 의해 투여되어 질 수 있다. 그러나 , 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물 및 제이 치료적 제제에 대한 다른 투여의 경로가 가능하거나 또는 바람직하다. 이 기술분야의 통상인은 단독으로 또는 조합하여, 각 치료적 제제에 대한 최상의 투여 모드를 알고 있다.
다양한 실시형태에 있어서, 본 발명의 변형된 siRNA 화합물은 약학적 조성물에서 주요한 활성 성분이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 여기에서 언급된 질환 및 증상의 어느 것에 대해 그리고 질환의 치료를 위해 둘 또는 그 이상의 siRNA 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 둘 또는 그 이상의 siRNA 분자 또는 상기 분자를 포함하는 제형은 유익할 활성 이상을 발생하는 양으로 약학적 조성물에 혼합되어 진다. 어떤 실시형태에 있어서, 둘 또는 그 이상의 siRNA 분자는 2-100, 바람직하기로는 2-50 또는 2-30 뉴클레오티드의 범위로 되는 길이의 핵산 링커에 의해 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합되거나 함께 연결되어 진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 더욱이 하나 또는 그 이상의 부가적 유전자를 표적하는 하나 또는 그 이상의 부가적 siRNA 분자를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 부가적인 유전자의 동시적인 저해는 여기에 개시된 질병의 치료에 대해 부가적 또는 상승적인 효과를 제공한다.
본 발명에 따른 치료 요법은 투여 양식, 투여의 시기 및 복용의 관점에서 수행되어 져, 여기에 개시된 증상의 부작용으로부터 환자의 기능적 회복이 개선되어 지거나 또는 질병의 발현을 지연하기 위한 것이다.
본 발명은 설명적인 방식으로 기술되어 졌으며, 그리고 사용된 용어는 단어의 본질상 제한보다는 상세한 설명의 관점에서 되어진 것으로 이해되어 진다.
본 발명의 변형 및 다양성은 상기 기술의 관점에서 가능하다. 따라서 첨부된 청구범위의 범주 내에서 본 발명의 자세하게 기술된 바와 달리 실행되어 질 수 있다고 이해되어 진다.
본 발명은 실시예를 참고로 다음에 자세하게 설명되어 지지만, 여기에 제한되어 지도록 해석되어 지는 것은 아니다.
여기서 어떠한 문헌의 인용은 이러한 문헌이 적절한 종래 기술이거나 본 출원의 어떤 청부항의 특허성에 대한 재로로 여겨지는 허용으로 의도되지는 않는다. 문헌의 내용 또는 날짜에 대한 기술은 본 출원인이 출원 시에 이용할 수 있는 정보에 기초된 것이고 그리고 이러한 기술의 정확성에 대해서 승인은 구성하지 않는다.
실시예
부가적인 상세 없이도, 이 기술 분야의 통상인은 이전의 상세한 설명을 사용하여 그의 완전한 정도로 본 발명을 이용할 수 있을 것이라 믿어진다. 다음의 바람직한 특정한 실시형태는 따라서 단지 설명적인 것이고 그리고 어떠한 방식으로도 청구됨 발명을 제한하지 않는 것으로 해석되어 진다.
여기서 자세하게 기술되지 않은 이 기술분야에 알려진 표준 분자 생물학 프로토콜은 일반적으로 Sambrook 등, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New- York (1989, 1992), 그리고 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 및 Sons, Baltimore, Maryland (1988), 그리고 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 및 Sons, Baltimore, Maryland (1989) 그리고 Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), 그리고 Watson 등, Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 그리고 Birren 등 (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)에서의 것과, 그리고 레퍼런스로 여기에 합체되어 지는 US 특허번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057호에서 제시된 방법론을 필수적으로 따른다. 폴리머라제 사슬 반응(PCR)는 일반적으로 PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서와 같이 수행되어 진다. 유동 세포 분석법과 조합한 인 시투(세포 내) PCR은 특정 DNA 및 mRNA 시퀀스를 함유하는 세포의 검출에 유용하다(Testoni 등, Blood 1996, 87:3822). RT-PCR을 수행하는 방법은 또한 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.
실시예 1. 표적 유전자에 대한 siRNA 를 위한 시퀀스의 생성 및 변형된 siRNA 화합물의 생성
사적 알고리즘 및 공지된 시퀀스의 어떤 유전자, 임의적으로는 여기에 개시된 전-어팝토틱 유전자를 사용하여, tl9-mer 시퀀스의 많은 포텐셜 siRNA가 생성되어 진다. 알고리즘에 부가하여, 23-mer 올리고머 시퀀스가 19-mer 시퀀스의 5' 및/또는 3' 신장에 의해 생성되어 진다. 이 방법을 사용하여 생성된 반전사 사슬 시퀀스는 표적 mRNA 시퀀스의 섹션에 완전히 또는 실질적으로 상보성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 반전사 시퀀스는 상응하는 mRNA 시퀀스의 섹션에 완전히 상보성이다. 본 발명의 변형된 siRNA 화합물의 생성을 위해, 반전사 사슬 (N)x의 5 ' 말단 위치(위치 1; N1)에서의 뉴클레오티드가 치환되어 구조 (A)의 실시형태의 이중사슬 핵산 분자를 생성한다. 다른 실시예에서, 반전사 사슬 (N)x의 5' 말단 위치에서의 뉴클레오티드 및 전사 사슬 (N')y의 3' 말단 위치에서의 뉴클레오티드가 치환되어 구조 (A)의 실시형태의 이중사슬 핵산 분자를 생성한다.
표 A는 몇몇 실시예에서 사용된 화합물의 전사 및 반전사 사슬의 뉴클레오티드 시퀀스를 제공한다. 표 Al은 구조 (A)의 실시형태에 따른 변형된 siRNA 화합물을 제공하기 위해 기술된 바와 같이 생성되어 진 예시적인 이중사슬 핵산 분자를 제공한다. 여기에 개시된 화합물은 제한하기 위한 것으로 의도되지 않고, 그리고 어떤 표적 RNA는 여기서 기술된 바와 같이 이중사슬 핵산 분자를 동정하기 위해 사용되어 질 수 있다. 표 A2는 비교 시험을 위해 생성된 변형된 siRNA 화합물을 제공한다. 표 Al 및 A2에서의 변형된 siRNA 화합물은 TLR2(Homo sapiens toll-like receptor 2 (TLR2), mRNA, gi|68160956|ref|NM_003264.3|, SEQ ID NO:4) 유전자 및 CAPNS1(calpain, small subunit 1 variant gi|51599152|ref|NM_001749.2|; SEQ ID NO: l 또는 calpain, small subunit 1 variant 2 gi|51599150|ref] NM_001003962.11, SEQ ID NO:2) 유전자를 표적으로 한다. 부가적인 화합물은 인간 RhoA mRNA(ras homolog gene family, member A (RhoA), mRNA gi|50593005 |ref|NM_001664.21, SEQ ID NO:3)를 표적으로 한다. 포유동물의 표적 유전자의 mRNA 시퀀스는, 예를 들어 NCBI web site [http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/]에서 이용할 수 있다.
[표 A]
Figure pct00003
[표 Al]: 본 발명의 예시적인 TLR2 이중사슬 분자
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 A2]: 비교 시험을 위해 합성되어 진 화합물
Figure pct00006
아래의 표 A3은 표 Al 및 A2의 siRNA 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 이용되어 지는 변형된 뉴클레오티드/비범한 부분의 코드를 제공한다.
[표 A3]: 여기 표에서 사용된 것으로 변형된 뉴클레오티드/비범한 부분의 코드
Figure pct00007
실시예 2: 생체 외에서 변형된 siRNA 화합물의 시험
siRNA 활성을 시험하기 위한 프로토콜
본 발명에 따른 변형된 siRNA 화합물은 다음과 같이 활성에 대해 시험되어 진다: 약 lxlO5 랫트 REF52 (TLR2 siRNA 활성 용) 또는 0.6xl05 인간 PC3 세포 (CAPNS1 siRNA 활성 용)가 6 웰 플레이트에 웰 당 접종되어 졌다(30-70% 컨플루언트). 24시간 배양 후, 세포는 TLR2 dsRNA에 대해서는 l-40nM의 최종 농도에서 그리고 CAPNS1 dsRNA에 대해서는 5-40nM의 최종 농도에서 Lipofectamine™2000 (Invitrogene)을 사용하여 dsRNA oligos (아래 표 A4 및 A5 참고)로 트랜스펙트되어 졌다.
[표 A4]: TLR2 16 siRNA 화합물(SEQ ID NOS: 6 및 11)
Figure pct00008
[표 A5]: CAPNS1 23 siRNA 화합물(SEQ ID NOS: 5 및 10)
Figure pct00009
세포 트랜스텍션 효능성에 대한 양성 대조군으로, REDD14-Cy3.5 표지 올리고스가 사용되었다. siRNA 활성에 대한 음성 대조군으로 스크램블드 (CNL) 올리고스가 사용되었다(섹션 1.2에서 언급된 것과 같은 농도). 트랜스펙션 효능성은 세포 트랜스텍션 24시간 후 형광현미경에 의해 시험되어 졌다.
siRNA 샘플 제조: 각 트랜스펙트된 웰에 대해, 3μ1 Lipofectamine2000 시약이 250μ1 혈청 유리 배지에 희석되어 지고 그리고 5분 동안 RT에서 배양된다.
siRNA 분자는 다음과 같이 제조되어 진다:
siRNA 작업 용액:
REDD14-Cy3.5 스톡 1.5xl06nM (PBS로 10μΜ의 최종 농도를 가지도록 1:150으로 희석)
CNL 스톡 1.6xl06nM (PBS로 10μΜ의 최종 농도를 가지도록 1:160으로 희석)
표적 유전자 스톡 100μΜ (PBS로 10μΜ의 최종 농도를 가지도록 1:10으로 희석)
샘플은 250 DMEM 배지 내에서 20nM의 REDD14-Cy3.5 siRNA 및 상기 언급(섹션 1.2 및 1.4)된 바와 같이 TLR2, CAPNS1 및 CNL siRNA oligos에 대한 최종농도로 희석되고, 웰 당 2ml의 최종 부피로 계산되어 진다. Lipofectamine™ 2000이 siRNA와조합되고(1:1 부피), 샘플은 온화하게 혼합되어 지고 그리고 실온에서 20분 동안 배양되어 진다.
트랜스펙션: Lipofectamine/siRNA 복합체는 세포 상에 부가되고(월 당 500μ1), 플레이트는 전후로 싸인다(각 웰 당 2ml의 최종 부피). 세포는 C02 인큐베이터 내에서 37℃에서 배양되어 진다.
qPCR에 의한 mRNA 준위의 정량: 세포 트랜스펙션 48시간 후, 세포가 수확되고 그리고 RNA는 EZ-RNA™ 키트[Biological Industries (#20-410-100)]를 사용하여 분리되어 진다. cDNA 합성이 수행되어 지고 그리고 mRNA의 준위가 qPCR에 의하여 측정되어 진다. 측정된 mRNA 양은 레퍼런스 유전자인 펩티딜프로필 이소머라제 A (cyclophilin A; CycloA)의 mRNA 양에 대해 정상화되어 졌다.
siRNA 활성 결과:
TLR2_16 siRNA 활성: TLR2 16 siRNA 트랜스펙션에 따라, 내인성 유전자를 발현하는 REF52 세포 내 랫트 TLR2 발현의 qPCR 분석(표 A6에서의 데이터)은 REF52 세포 내 잔여(Ctrl-비-트랜스펙트된 세포의 %) 랫트 TLR2 발현을 입증한다.
[표 A6]
Figure pct00010
가장 활성인 화합물은 표적 mRNA에 AS 미스매치 및 완전하게 상보성 듀플렉스를 가지는 TLR2 16 S938이다. TLR2_16_S938에서, N1 = U이고 그리고 N2 =A이고 그리고 N1은 표적 mRNA 내 C에 미스매치된다.
CAPNS1_23 siRNA 활성
CAPNS1_23 siRNA 트랜스펙션에 따라, 내인성 유전자를 발현하는 인간 PC-3 세포 내 CAPNSl 발현의 qPCR 분석(표 A7에서의 데이터)은 PC-3 세포 내 잔여(Ctrl-비-트랜스펙트된 세포의 %) 인간 CAPNSl 발현을 입증한다.
[표 A7]
Figure pct00011
가장 활성인 화합물은 표적 mRNA에 AS 미스매치 및 완전하게 상보성 듀플렉스를 가지는 CAPNS1 23 S938이다. CAPNS1_23_S938에서, N1 = U이고 그리고 N2 =A이고 그리고 N1은 표적 mRNA 내 C에 미스매치된다.
구조 (A)에 따른 시험 화합물은, 반전사 사슬이 표적 mRNA에 완전하게 상보성인 대조 화합물보다 적어도 100% 이상 활성적이다.
이중사슬 RNA 분자의 온-표적 및 오프 -표적 시험
본 연구의 목적은 대조군 (비변형된) 및 시험 (화학적으로 변형된) 이중사슬 핵산 분자의 온-표적 활성 및 잠재적인 오프-표적 활성을 평가하기 위한 것이다.
siRNA 분자의 두 스트랜드는 표적 유전자 mRNA에 대해 전사 및 반전사인 형상을 갖는 시퀀스를 갖는다. 세포 내에, 가이드 스트랜드(GS)로 알려진 siRNA의 반전사 사슬은 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC) 안으로 적하되어 지고 그리고 표적 mRNA 내 상보성 시퀀스로 RNAi 머시너리를 가이드 하는 작용을 한다. 패신저 스트랜드(PS)로 알려진 전사 사슬은 파괴되어 진다. 정확한 상보성이 GS와 표적 mRNA 사이에 존재할 때, 후자는 RISC의 RNaseH-형 슬라이서 활성에 의해 단리되어 진다.
몇몇의 경우에, siRNA 분자는 그의 트랜스크립트가 3'-UTR 내 GS 시드 영역(위치 2-8 [5'>3']에서의 뉴클레오티드)에 상보성을 가지는 의도되지 않은 유전자를 다운-레귤레이트한다. 가설에 구속되지 않고, 이 오프-표적 효과는 마이크로RNAs (miRNAs)에 의한 표적 사일런싱의 것에 유사한 메카니즘에 의해 매개되어 진다. 또 다른 타입의 siRNA의 오프-표적 활성은 RISC 내로 전사 사슬 (PS)의 로딩에 기인하여 일어날 수 있다. 합성적 siRNAs의의 의도되지 않은 오프-표적 효과는 siRNA 듀플렉스 내의 초기 siRNA의 화학적 변형에 의해 감소되어 질 수 있거나 또는 없어질 수 있다. 따라서 시험 분자가 디자인되어 진다.
시험 분자는 psiCHECK™ (Promega) 플라스미드 컨스트럭트를 사용하여 "가이드-시드- 시퀀스 -및- 패신저 - 스트랜드 -기재 활성 어세이"에서 온-표적 활성 (표적 mRNA에 대한 활성) 및 오프-표적 활성 (표적 mRNA 이외의 mRNA에 대한 활성) 양자에 대해 분석되어 졌다. 시험 및 대조 분자의 활성은 완전 표적 시퀀스 (시험 분자의 GS 또는 PS의 어느 하나의 전 19-염기 시퀀스에 완전하게 상보성인 뉴클레오티드 시퀀스) 또는 시드-표적 시퀀스 (시험 분자의 GS 또는 PS의 어느 하나의 뉴클레오티드 1-8 [5'>3']에 대한 상보성인 시퀀스)의 어느 하나에 대해 시험되어 졌다.
시험 분자는 적어도 비-변형된 대조 siRNA 보다 GS 전체 표적 사이트에 대해 활성적이었다. 시험 분자는 PS 전체 표적 사이트에 대해 비활성이고, 반면 대조 비-변형된 siRNA는 동일한 사이트에 대해 활성을 입증하였다. 양 siRNA는 GS 시드-표적 시퀀스 및 PS 시드-표적 시퀀스 사이트에 대해 비활성이다.
가이드 스트랜드(GS)는 표적 RNA의 가이드 사일런싱 및 RISC 복합체를 도입할 수 있는 이중사슬 RNA의 반전사 사슬에 대해 언급한다.
패신저 스트랜드(PS)는 이중사슬 RNA의 전사 사슬에 대해 언급한다.
시드 시퀀스는 GS의 뉴클레오티드 2-8 (5'>3')에 대해 언급하는 것이고 그리고 오프-표적 인식에 관련된다.
CM(complete match)은 이중사슬 RNA 분자의 가이드 스트랜드에 완전하게 상보성인 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는 합성적 DNA 분획에 대해 언급한다. 이 DNA 분획은 수용체 유전자의 3'UTR 내에 클론되어 지고 그리고 RNA 사일런싱에 대하여 표적으로서 작용한다(Castanotto & Rossi (2009). Nature, 22:426-33).
SM(seed match)은 시험 분자 siRNA의 가이드 스트랜드의 뉴클레오티드 1-8 (5'>3')에 완전한 상보성을 갖는 뉴클레오티드 시퀀스를 가지는 합성적 DNA 분획에 대해 언급한다(1차 뉴클레오티드 + 시드). 이 DNA 분획은 수용체 유전자의 3'UTR 내에 클론되어 지고 그리고 시드-기재된 "오프-표적" 사일런싱에 대하여 표적으로서 작용한다.
psiCHECK™ 시스템은 이들의 표적 시퀀스의 발현 준위에서의 변화를 모니터링함에 의해, 표적 및 오프-표적 효과를 도출하는 GS (반전사) 및 PS (전사 사슬)의 평가를 가능하게 한다. 네 개의 psiCHECK™-2-기재(Promega) 컨스트럭트가 각 시험 분자 GS 및 PS 스트랜드의 표적 활성 및 잠재적인 오프-표적 활성의 평가를 위하여 제조되어 졌다. 각각의 컨스트럭트에 있어서, 시험 분자 PS 또는 GS의, 완전 표적 또는 시드-표적 시퀀스의 어느 하나의 일 카피 또는 셋 카피가 3'-UTR 영역 내 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 전사 정지 코돈의 다운스트림으로 위치된 다중 클로닝 사이트 안에 클론되어 진다. 얻어진 벡터는 다음과 같이 명명된다:
1- GS-CM ( g uide s trand, c omplete- m atch) 벡터로 완전 표적 시퀀스(시험 분자의 GS의 전 19-염기 시퀀스에 완전하게 상보성인 뉴클레오티드 시퀀스)의 일 카피 또는 세 카피를 함유;
2- PS-CM ( p assenger s trand, c omplete- ma tch) 벡터로 완전 표적 시퀀스(시험 분자의 PS의 전 19-염기 시퀀스에 완전하게 상보성인 뉴클레오티드 시퀀스)의 일 카피 또는 세 카피를 함유;
3- GS-SM ( g uide s trand, s eed- m atch) 벡터로 시드 영역 표적 시퀀스(시험 분자의 GS의 뉴클레오티드 1-8에 상보성인 시퀀스)의 일 카피 또는 세 카피를 함유;
4- PS-SM ( p assenger s trand, s eed- m atch) 벡터로 시드 영역 표적 시퀀스(시험 분자의 PS의 뉴클레오티드 1-8에 상보성인 시퀀스)의 일 카피 또는 세 카피를 함유;
위치 19 (AS의 위치 1)에서 뉴클레오티드 치환을 갖거나 또는 갖지 않는 표적 시퀀스는 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 레포터 유전자의 코드 영역에 다운스트림으로 클론되어 진다. 이들 어떤 시퀀스에 대한 시험 분자의 RNAi 또는 시드-매개 활성은 퓨젼 mRNA (GS)의 단리 및 연속적인 분해 또는 전사의 전해 (PS)의 어느 하나로 나타난다. 양 경우에 있어서 단백질 발현은 희석되어 졌다.
시험 분자 GS 및 PS 시드 및 전체 표적 사이트의 클로닝
관련 표적의 단일 카피가 psiCHECK™-2 (Promega) 벡터 내 레닐라 루시퍼라제인, 레포터 mRNA의 3 'UTR 내에 클론되어 졌다. 이 벡터에는 다중 클로닝 사이트가 있다. 사용될 수 있는 전형적인 클로닝 사이트는 XhoI 및 NotI이다. 벡터는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 클로닝을 위해 제조되어 졌다. CM 및 SM의 각 스트랜드는 화학적으로 합성되어 지고 그리고 100℃로 가열함에 의해 어닐링되어 지고 그리고 실온으로 냉각되어 진다. 결찰은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 3시간 동안 수행되어 졌다. 결찰된 플라스미드는 대장균 DH5a 세포 안으로 도입되어 졌다.
얻어진 콜로니들은 관련된 프라이머를 사용하여 콜로니-PCR에 의해 플라스미드 컨스트럭트의 존재에 대해 선별되어 졌다. 각 플라스미드(벡터)들은 하나의 양성 콜로니로부터 정제되어 지고 그리고 그 시퀀스는 확인되어 졌다.
인간 HeLa 세포 안으로 벡터의 트랜스펙션
10cm 디쉬 당 약 1.3-2×l06 인간 HeLa 세포(ATCC, Cat#CCL-2)가 접종되어 졌다. 세포는 그런 다음 37±1℃, 5% C02에서 24시간 동안 배양되어 졌다. 성장 배지는 접종 1일 후 제조된 8 mL 신선 성장 배지에 의해 대체되어 졌다. 각 세포-함유 플레이트는 다음과 같이 Lipofectamine™2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 벡터의 하나로 트랜스펙트되어 졌다:
에펜도르프 튜브 안에, 15μL의 Lipofectamine™2000 시약이 1000μL DMEM 배지 내에 희석되어 지고 그리고 실온에서(RT) 5분 동안 배양되어 졌다. 제이의 에펜도르프 튜브 안에, 벡터가 1000μL의 DMEM 배지 내에 15μg의 최종 농도에 도달하도록 희석되어 졌다. 희석된 Lipofectamine™2000 시약은 희석된 DNA 벡터 샘플과 온화하게 혼합되어 지고 그리고 RT에서 20 내지 40분 동안 배양되어 진다. 배양 후, DNA/Lipofectamine™2000은 세포에 부가(2000μL의 최종 부피에 도달하도록)되어 진다. 플레이트는 완만하게 싸여 진다. 플레이트는 37±1℃ 및 5% C02에서 5시간 동안 배양되어 졌다. 배양 5시간 후, 세포는 80μL 성장 배지 내 웰 당 5×l03 세포의 최종 농도로 96-웰 플레이트에 재이식되어 졌다. 16시간 후, 세포는 Lipofectamine™2000을 사용하여 시험 또는 대조 분자로 트랜스펙트되어 졌다. 각 siRNA이 복제 트랜스펙션 농도는 아래에 기술된 바와 같이 수행되어 졌다:
Lipofectamine™2000이 170 웰에 대해 충분하도록 과잉으로 제조되어 졌다: 85μL의 Lipofectamine™2000이 3400μL(3.4mL)의 DMEM와 혼합되어 지고 그리고 RT에서 5분 동안 배양되어 졌다.
시험 및 대조 분자 작업 용액의 제조: 다양한 농도에서의 작업 용액이 10μΜ 저장 용액을 희석함에 의해 제조되어 졌다. 이 일련의 희석은 100μL의 DMEM 트랜스펙션 배지 내에 0.0095 nM 내지 100 nM 사이의 범위로 되는 최종 트랜스펙션 농도(0.0095, 0.019, 0.039, 0.07, 0.15, 0.31, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0, 20.0, 100.0)의 생성을 위해 제조되어 진다.
희석된 Lipofectamine 2000의 100μL 당량이 100μL의 각 희석된 시험 분자 또는 대조 분자 작업 용액(상기)과 온화하게 혼합되어 지고 그리고 혼합물은 RT에서 20-40분 동안 배양되어 진다. 배양 후, 20μL의 siRNA/Lipofectamine™2000 혼합물이 세포(상기 80μL의 세포-배양 배지로 예비-배양된 것)의 상부에 부가되어 진다. 이 플레이트는 온화하게 싸여 진다. 세포는 37±1℃ 및 5% C02에서 48시간 동안 배양되어 졌다.
트랜스펙트된 세포 내에서 레닐라 루시퍼라제 활성의 결정
psiCHECK™-2 벡터는 레닐라 루시퍼라제 레포터 유전자에 융합된 표적 시퀀스의 발현에서의 변화의 모니터링을 가능하게 한다. 시험/대조 분자 표적 시퀀스는 레니라 루시퍼라제의 3'-비전사 영역(3'-UTR) 안으로 클론되어 진다. 따라서 레닐라 루시퍼라제 활성에서의 감소를 측정하는 것은 활성을 모니터링하는 편리한 방법을 제공한다. 부가하여, psiCHECK™-2 벡터는, 다른 프로모터 하에서 복제된, 레닐라 루시퍼라제 발현의 정상화를 가능하게 하는 제이 레포터 유전자인 파이어플라이(Firefly) 루시퍼라제를 함유한다.
시험 또는 대조 분자 트랜스펙션 48시간 후, 레닐라 및 파이어플라이 루시퍼라제 활성이 제조자의 절차에 따라 Dual-Luciferase® 어세이 키트(Promega)를 사용하여 각각의 siRNA 트랜스펙트된 샘플 안에서 측정되어 졌다:
배지가 세포로부터 완전하게 제거되어 지고 그리고 세포는 그런 다음 40μL/웰 1X 루시퍼라제 라이시스 용액의 부가에 의해 용혈되어 진다. 플레이트는 그런 다음 동결(-80℃)되어 지고, 그리고 실온에서 해동되어 진다. 세포 용혈물은 수회 피펫팅함에 의해 현탁되어 지고 그리고 각 샘플의 12.5μL 당량이 별개의 96-웰 플레이트로 이전되어 진다. 50μL의 루시퍼라제 기질(LARII)이 각 추출물에 부가되어 지고 그리고 파이어플라이 루시퍼라제 활성이 Absorbance, Fluorescence and Luminescence Reader(Perkin Elmer, Victor™ 1240)에 의하여 측정되어 진다. 50μL의 Stop&Glo 시약이 각 샘플에 부가되어 지고 그리고 레닐라 루시퍼라제 활성이 바로 평가되어 진다. 레닐라 루시퍼라제 활성 값은 각 샘플에 대한 파이어플라이 루시퍼라제 활성 값으로 나누어 진다(정상화). 레닐라 루시퍼라제 활성은 시험 또는 대조 분자의 부재인 상응하는 psiCHECK™-2 플라스미드로 트랜스펙트된 세포에서 얻어진 정상화된 값에 대해 시험 샘플에서의 정상화된 활성 값의 백분율로 최종적으로 표현되어 진다.
IC50 계산
GS CM 사이트에 대한 시험 및 대조 분자 활성의 IC50 값은 다양한 최종 siRNA 농도로 얻어진 활성 결과를 사용하여 복용량-반응 곡선을 구성함에 의해 결정되어 진다. 이 복용량 반응 곡선은 트랜스펙트된 siRNA 농도의 로그 대 레닐라 루시퍼라제 활성의 상대적인 정상화된 값을 플롯팅함에 의해 구성되어 진다. 이 곡선은 측정된 데이터에 대한 최상의 S자형 곡선을 적용함에 의해 계산되어 진다. 시그모이드 적용에 대한 방법은 3-점 곡선 적용으로 불린다.
Figure pct00012
여기서:
Y는 잔여 카스파제 2 mRNA 반응이고,
X는 트랜스펙트된 siRNA 농도의 로그이고,
Bot는 바닥 면에서의 Y 값이고,
LogIC50은 Y가 바닥 및 상단 면 사이의 중간 정도일 때 X 값이고 그리고 HillSlope는 곡선의 가파름이다.
결과
이중사슬 RNA 분자 스트랜드의 각 스트랜드의 잠재적인 오프-표적 활성의 측정을 위해, psiCHECK (Promega) 플라스미드 컨스트럭트를 사용하는 "가이드-시드-시퀀스-및- 패신저 - 스트랜드 -기재 활성 어세이"가 채용되었다. 레닐라 활성의 평가는 이중사슬 RNA 활성을 모니터링하는 편리한 방법을 제공한다.
표적 레닐라 루시퍼라제 단백질 활성의 평가
네 개의 표적 시퀀스(GS-CM, guide strand complete match; GS-SM, guide strand seed match; PS-CM, passenger strand complete match; 및 PS-SM, passenger strand seed match)에 대한 시험 및 대조 분자 양자의 활성이 분자의 다양한 농도로 트랜스펙트된 세포 내 레닐라 루시퍼라제 레포터 단백질의 상대적 활성을 측정함에 의해 단백질 준위에서 시금되어 졌다. 각 분석은 삼 회 반복되어 졌다. GS-CM 표적 사이트에 대한 시험 분자 활성의 IC50 값이 농도-반응 곡선의 구성에 의해 결정되어 졌다.
시험 및 대조 분자 양자는 복용량 반응에서 표적 GS-CM 사이트에 대해 활성이었다.
양 siRNA는 GS-SM 및 PS-SM 사이트에 대해 비활성이었다.
도 2-10 및 아래 표 2-10은 리보뉴클레오티드의 하나인, 아데노신 (A 또는 rA), 시티딘 (C 또는 rC), 구아노신 (G 또는 rG), 리보티미딘 (rT, 또한 5'메틸우리딘) 및 우리딘 (U 또는 rU); 또는 디옥시아데노신 (dA), 디옥시시티딘 (dC), 디옥시구아노신 (dG), 티미딘 (dT) 및 디옥시우리딘 (dU); 또는 2'O 메틸화 아데노신 (mA), 2'O 메틸화 시티딘 (mC), 2'O 메틸화 구아노신 (mG), 2'O 메틸화 우리딘 (mU)을 합체하도록 위치 19 (반전사의 위치 1과 동등)에 치환체를 갖는 표적 시퀀스의 완전 매치를 표적하는 이중사슬 분자에 대한 잔여 표적에 의해 측정된 것으로 활성을 나타낸다. "1st pos AS"는 반전사 사슬의 위치 1(5' 말단 뉴클레오티드)에 대해 언급한다.
[표 2]: TLR2 16 siRNA (양 스트랜드 상에 교호하는 2'-OMe로 마감된 블런트)
Figure pct00013
표 2에 나타난 데이터는 도 2에 제시되어 진다. 반전사 사슬의 위치 1에서 메틸화된 뉴클레오티드는 염기 쌍에 관계없이 감소된 표적 녹다운을 보였다.
[표 3] C3-C3 오버행 또는 dTdT 오버행으로 비변형된 TLR2 37 siRNA
Figure pct00014
표 3에서의 데이터는 도 3에 제시되어 진다. 표 3 및 도 3은 AS의 1st 위치 내 2'OMe 리보뉴클레오티드가 표적의 매칭 위치 내에 뉴클레오티드에 관계없이 siRNA 활성을 감소한다는 것을 보여준다
[표 4]: C3-C3 오버행 또는 dTdT 오버행으로 비변형된 TLR2 37 siRNA
Figure pct00015
표 4에서의 데이터는 도 4에 제시되어 진다. 표 4 및 도 4는 다음의 것을 나타낸다.
1. 가장 높은 활성을 갖는 siRNA는 AS의 1st 위치 내 U (dU 또는 dT)가 표적 내 C에 미스매치되어 지거나 또는 표적 내 A에 매치되어 질 때 관찰되어 진다.
2. 만일 siRNA의 AS의 1st 위치 내 U (또는 dU 또는 dT)가 표적 내 U에 미스매치되어 진다면, siRNA 활성은 감소되어 진다.
3. 만일 AS의 1st 위치 내 U가 표적 내 G와 워블-쌍으로 되어 진다면, siRNA 활성은 감소되어 진다.
[표 5] TLR2 37 siRNA (dTdT 오버행으로 비-변형됨) - 0.04nM
Figure pct00016
표 5에서의 데이터는 도 5에 제시되어 진다. 표 5 및 도 5는 다음의 것을 나타낸다.
1. AS의 1st 위치 내 U는 미스매치된 U 또는 워블-쌍으로 된 G로 보다 표적 내 그의 매치된 A 또는 미스매치된 C로 보다 양호한 결과를 만든다.
2. AS의 1st 위치 내 G는 매치하는 표적 위치 내에 모든 가능한 뉴클레오티드와 유사한 결과를 나타냈고 - 미스매치 또는 워블-쌍은 활성을 개선하지 않았다.
[표 6]: TLR2 46 siRNA (C3-C3 또는 dTdT 오버행으로 비변형됨)
Figure pct00017
표 6에서의 데이터는 도 6에 제시되어 진다. 표 6 및 도 6은 mU으로 U의 치환은 활성을 감소한다는 것을 나타낸다.
[표 7] TLR2 46 siRNA (dTdT 오버행으로 비변형됨)
Figure pct00018
표 7에서의 데이터는 도 7에 제시되어 진다. 표 7 및 도 7은 매칭하는 표적 위치의 뉴클레오티드 타입에 관계없이, AS의 1st 위치 내 U는 보다 양호한 KD (knock-down)를 생성한다는 것을 나타낸다. 모든 경우는 - 가이드 스트랜드의 1st 위치 내의 siRNA와 표적 사이의 상보성에 관계없이, 미스매치 또는 워블 쌍을 의미한다.
[표 8] RHOA 61 siRNA (비-변형됨/C3-C3 또는 dTdT 오버행)
Figure pct00019
표 8에서의 데이터는 도 9에 제시되어 진다.
[표 9] RHOA 61 siRNA (비-변형됨/C3-C3 또는 dTdT 오버행)
Figure pct00020
표 9에서의 데이터는 도 9에 제시되어 진다. 표 9 및 도 9는 AS의 1st 위치 내 U는 표적의 매칭 위치에서의 뉴클레오티드 에 관계없이(매치, 미스매치, 워블) 1st 위치 내에 G를 갖는 것보다 더욱 활성적이다는 것을 나타낸다. 이 결과는 표적 내에 U 및 siRNA 내에 G를 갖는 것이 표적 내에 G 및 siRNA 내에 U를 갖는 것과 동등하지 않기 때문에 워블 염기-쌍에 의해 설명되어 질 수 없다.
[표 10] RhoA_61 siRNA(dTdT 오버행으로 비변형됨)
Figure pct00021
표 10에서의 데이터는 도 10에 제시되어 진다.
실시예 3 : 급성 신부전( ARF )의 모델 시스템
ARF는 수일 내에 발생하는 신장 기능의 급속한 퇴화에 의해 특징되어 지는 임상적 증후군이다. 가설에 얽매임이 없이 급성 콩팥 손상은 주요한 심장 수술과 같은 주요한 수술을 한 환자에 있어서 신장의 허혈성-재환류 손상과 같은 신장의 허혈성-재환류 손상의 결과일 수 있다. ARF의 주요 특징은 질소성 소비(우레아, 크레아틴)의 보유로 유래하는 신사구체의 여과율(GFR)에서의 급격한 하락이다. 최근의 연구는 신장 조직에서의 어팝토시스가 대부분 인간 경우의 ARF에서 현저하다는 것을 지지한다. 어팝토틱 세포사의 주요한 사이트는 말초의 네프론이다. 허혈성 손상의 초기 상태 동안, 액틴 세포골격의 완전한 손실은 브러시 보더의 손실, 촛점 세포 콘택트의 손실 및 아래에 있는 하층으로부터 세포의 연속적인 탈리로 상피의 평탄화를 이끈다.
본 발명의 화합물은 허혈성-재환류-유도 ARF의 동물 모델에 있어서 허혈성 재환류 손상을 치료하는 유효성에 대해 시험되어 졌다.
실시예 4: 압통 또는 욕창의 모델 시스템
당뇨성 궤양을 포함하는 압통 또는 욕창은 지속된 압력(일반적으로, 침대 또는 휠체어로부터의 것)이 신체의 취약부, 특히는 엉덩이, 히프 및 힐 상의 피부에 순환을 차단할 때 전개하는 손상된 피부 및 조직의 영역이다. 적절한 혈액 흐름의 결핍은 감염된 조직의 허혈성 괴사 및 궤양화를 초래한다. 욕창은 감각이 감소되거나 없는 환자 또는 쇠약하거나, 수척하거나, 마비되거나 또는 장기간 침대생활을 한 환자에게 대부분 일어난다. 엉치뼈, 좌골, 대전자, 외복사뼈 및 힐 위의 조직은 특히 민감하고; 다른 사이트는 환자의 상환에 의존하여 포함되어 질 수 있다.
본 발명의 화합물은 압통, 욕창 및 유사한 상처, 그 중에서도 Reid 등, J Surg. Res. 116: 172-180, 2004에 기술된 마우스 모델 또는 Mustoe 등, JCI, 1991. 87(2):694-703; Ahn 및 Mustoe, Ann PI Surg, 1991. 24(1): 17-23에 기술된 래빗 모델을 치료하는 유효성에 대해 시험되어 졌다.
실시예 5: 만성 폐쇄성 폐질환( COPD )의 모델 시스템
만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)은 말단 모세기관지에 대해 말초인 주변의 공기 공간의 영원한 파손인 폐기종에 의해 주로 특징되어 진다. 폐기종은 또한 모세기관지 및 치조 구조 안에 매크로파지 및 뉴트로필과 같은 염증성 세포의 축적에 의해 특징되어 진다. 폐기종 및 만성기간지염은 COPD의 일부로서 또는 독립적으로 발생할 수 있다.
본 발명의 화합물은 COPD/ 폐기종/만성기간지염을 치료하기 위해, 그 중에서도 다음에서 기술된 것과 같은 동물 모델을 치료하는데 유효성에 대해 시험되어 졌다:
Starcher 및 Williams, 1989. Lab. Animals, 23:234-240; Peng, 등, 2004.; Am J Respir Crit Care Med, 169: 1245-1251; Jeyaseelan 등, 2004. Infect. Immunol, 72: 7247-56. 부가적인 모델은 본 출원인의 양수인에게 양수되어 지고, 여기서 이 출원에 레퍼런스로 합체되어 지는 PCT 특허 공개공보 WO 2006/023544호에 기술되어 진다.
실시예 6: 척수 손상의 모델 시스템
척수 손상, 또는 척수장애는 감각 및/또는 운동성의 상실을 초래하는 척수의 장애이다. 척수 손상의 두 가지 공통된 타입은 트라우마 및 질병에 기인되어 진다. 외상적 손상은 그 중에서도 자동차 사고, 낙상, 총격, 다이빙 사고에 기인될 수 있고, 그리고 척수에 영향을 미칠 수 있는 질병은 폴리오, 척추뼈 갈림증, 종양 및 프리드라이히 운동실조를 포함한다.
siRNA가 척수 좌상에 따른 척수 안으로 그리고 비손상된 랫트 안으로 주입되어 진다. 시상봉합의 크리요섹션이 생성되어 지고 그리고 네 개의 다른 군의 항체를 사용하여 면역 염색이 뉴런, 성상교세포, 희돌기교세포 및/또는 매크로파지/소교세포에서 섭취가 일어나는지를 결정하기 위해 수행되어 진다. 뉴런에 대한 마커는 NeuN, 또는 GAP43을 포함하고; 성상교세포 및 잠재적인 신경 줄기 세포에 대한 마커는 GFAP, 네스틴 또는 비멘틴을 포함하고; 희돌기교세포에 대한 마커는 NG2 또는 APC를 포함하고; 매크로파지/소교세포에 대한 마커는 EDI 또는 Iba-1을 포함한다(Hasegawa 등, 2005. Exp Neurol 193:394-410).
랫트는 siRNA의 두 가지 다른 복용량(1 μg/μl, 10 μg/μl)으로 주입되어 지고, 그리고 희생 전 1 및 3일 동안 방치된다. 결과는 척수 손상 표적 유전자에 대해 siRNA가 운동뉴런 회복을 증가한다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 녹내장의 모델 시스템
본 발명의 화합물이, 예를 들어 Pease 등, J. Glaucoma, 2006, 15(6):512-9에 의해 기술된 바와 같이 동물 모델에서 녹내장을 치료 또는 방지에서의 유효성에 대해 시험되었다(Manometric calibration and comparison of TonoLab and TonoPen tonometers in rats with experimental glaucoma and in normal mice).
실시예 7A: 허혈성 시신경증(ION)의 모델 시스템
허혈성 시신경증에 대한 동물 모델은 시신경 압궤손상의 프로토콜을 사용하여 성숙 위스타르 랫트에서 확립되어 졌다. 시신경 압궤 7일 전에, 망막 신경절 세포(RGC)가 상구에 역행하는 트레이서 플루오로골드(2%, 플루오로크롬, Englewood, CO)의 적용에 의해 선택적으로 표지되어 진다. 이 트레이서는 플루오르센트 트레이서의 주입 후 1주일 내에 모든 RGC의 완전하고 특정한 라벨링으로 되는 RGC 액손을 따라 역행적 전이에 의해 전이되어 졌다. 동물은 역행적 트레이싱 7일 후 시신경 압궤손상을 당했다. 오비탈 시신경은 눈구멍 위의 접근을 통해 노출되어 지고 그리고 시신경 내의 모든 액손은 사상판으로부터 2 mm에 10초 동안 핀셋으로 압궤함에 의해 갈라진다. 시험 변형된 siR A 화합물의 단일 복용량 20μg/PBS 5μ1가 시신경 압궤시에 글라스 마이크로피펫을 사용하여 시신경 유두의 전방 2 mm의 유리질체 안으로 마이크로 주사되어 진다.
RGC의 생존은 평판-도말된 망막 상에서 플루오로골드-표지 RGC를 계수함에 의해 시신경 압궤 7일 후에 결정되어 진다. 실험 동물은 시신경 압궤 1주일 후에 4% 파라포름알데히드로 심장을 통하여 확산되어 진다. 양 망막은 해부되어 지고 부가적 30분 동안 고정되어 지고 그리고 신경절 세포 층 정량을 위해 글라스 슬라이드 상에 평판 도말되어 진다. 다수의 형광 RGC가 각 망막의 16의 구별된 영역에서 계수되어 졌고 그리고 생존 RGC의 백분율이 전혀 시신경 압궤를 당하지 않은 랫트로부터 얻어진 샘플 또는 시신경 압궤와 함께 PBS, 대조 siRNA 또는 GFP siRNA가 주입된 랫트로부터 얻어진 샘플에 비교하여 결정되어 졌다. RGC 염색의 식균작용 후 플루오로골드가 합체되어 질 수 있는 소교세포는 이들의 특징적인 형태학으로 구별되어 지고 그리고 정량 분석에서 배제되어 졌다.
RGC의 전체 비율이 눈에 인접한 시신경을 횡절단함에 의해 분산되어 지는 시신경 축색말단의 다른 모델이 이용되어 졌다(Cheng L, 등. J. Neurosci. 2002;22:3977-3986).
실시예 8: 랫트에 폐 이식에 따른 허혈성/ 재환류 손상의 모델 시스템
본 발명의 화합물은, 예를 들어 Mizobuchi 등, 2004. J. Heart Lung Transplant, 23:889-93; Huang, 등, 1995. J. Heart Lung Transplant. 14: S49; Matsumura, 등, 1995. Transplantation 59: 1509-1517; Wilkes, 등, 1999. Transplantation 67:890-896; Naka, 등, 1996. Circulation Research, 79: 773-783에 기술된 바와 같이, 하나 또는 그 이상의 실험 동물 모델에서 폐 이식에 따른 허혈성/재환류 손상 또는 저산소증 손상을 치료하는 유효성에 대해 시험되어 졌다.
실시예 9: 급성 호흡장애 증후군의 모델 시스템
본 발명의 화합물은 그 중에서도 Chen 등(J Biomed Sci. 2003;10(6 Pt l):588-92에 의해 기술된 동물 모델에서 급성 호흡장애 증후군을 치료하는 유효성에 대해 시험되어 졌다. CYBA, HRK, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC 1 , GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, SPP1 , 및 DUOX1을 포함하는 유전자를 표적하는 변형된 siRNA 화합물이 이 동물 모델에서 시험되어 졌다.
실시예 10: 청력 손실 증상의 모델 시스템
(i) 카보플라틴-유도 또는 시스플라틴-유도 달팽이관 생모 세포 사의 친칠라 모델
친칠라는 각 동물의 좌측 귀에 식염수 내 특정 siRNA의 직접 투여에 의해 전-처리되어 졌다. 식염수는 플라시보로서 각 동물의 우측 귀에 제공되어 진다. 본 발명의 특정 변형된 siRNA 화합물의 투여 이일 후, 동물은 카보플라틴(75 mg/kg ip) 또는 시스플라틴(30분에 걸쳐 13mg/kg의 복막 내로 주입)으로 처리되어 진다. 친칠라의 희생 후(카보플라틴 처리 후 2 주일), 내 생모 세포(IHC) 및 외 생모 세포(OHC)의 세포사의 백분율(%)이 좌측 귀(siRNA 처리) 및 우측 귀(식염수 처리)에서 계산되어 졌다. 내 생모 세포(IHC) 및 외 생모 세포(OHC)의 세포사의 %는 우측 귀(식염수 처리)에서보다 좌측 귀(siRNA 처리)에서 낮은 것으로 계산되어 졌다.
(ii) 어쿠스틱-유도 달팽이관 생모 세포 사의 친칠라 모델
청각 외상 모델에서 특정 siRNA 활성은 친칠라에서 연구되었다. 이 동물은 105 dB에서 2.5시간 동안 4 kHz로 집중된 소음의 옥타브 밴드에 노출되어 진다. 소음-노출된 친칠라의 좌측 귀는 ~10μL의 식염수 내에 30μg의 siRNA로 전-처리(청각 외상 48시간 전)되어 지고; 우측 귀는 담체(식염수)로 전-처리되어 진다. 화합물 작용 포텐셜(CAP)은 달팽이관으로부터 전달된 신경의 활성을 측정하기 위한 편리하고 그리고 신뢰할 수 있는 전자생리학적 방법이다. CAP는 클릭 또는 정현파 버스트와 같은 소리 자극이 급격하게 일어날 때 발생되어 지는 국부 지역 포텐셜을 검출하기 위한 달팽이관의 기저 근처에 전극을 위치시킴에 의해 기록되어 진다. 각 귀의 기능적 상태는 청각 외상 2.5주 후에 평가되어 졌다. 특정하게는, 라운드 윈도우로부터 기록된 화합물 작용 포텐셜의 평균 임계치는 siRNA-처리 귀에서의 임계가 비처리(식염수) 귀에서보다 낮는지(양호한지)를 결정하기 위해 청각 외상 2.5주 후 결정되어 졌다. 부가하여, 내 및 외 생모 세포 손실의 준위는 siRNA-처리 및 대조 귀에서 결정되어 졌다.
유사한 모델이 마우스 및 랫트에서 사용되어 졌다. BNIP3, CAPNS, HES 1 , HES5, NOX3, ID1-3, HRK, ASPP2 (TP53BP), CASP2, RAC 1 , HTRA2, CDKN1B를 포함하는 유전자를 표적하는 변형된 siRNA 화합물이 이들 및 다른 동물 모델의 청력 손실 및 청력 재생에 대해서 시험되어 졌다.
실시예 11: 골관절염( OA )의 동물 모델
콜라겐 유도 관절염(CIA): 마우스에 CIA는 Trentham 등. (1977. J. Exp. Med. 146: 857-868)에 기술되어 져 있다. 어쥬번트-유도 관절염(AA):AA는 Kong 등, (1999. Nature, 402:304-308)에 기술되어 져 있다. 연골절제술 모델은 Han 등, (1999. Nagoya J Med Sci 62(3-4): 115-26)에 기술되어 져 있다.
연골세포 증식, 관절염의 말단 분화 및 전개와 같은 OA에 관련된 다른 변수 상에, SSPl에 대한 siRNA와 같이 다른 siRNA 저해제의 효과가, 이 기술분야에 공지된 생체외 모델에 부가하여 하나 또는 그 이상의 상기 모델을 사용하여 평가되어 졌다. 프로어팝토틱 유전자, 특히 SSPl에 대한 변형된 siRNA 화합물이, 변형된 siRNA 화합물이 OA를 치료 및/또는 예방하고 그리고 따라서 이들 증상을 치료하기 위해 사용되어 질 수 있는 것을 보여 주는 이들 동물 모델에서 시험되어 졌다.
실시예 12: 이식-연관 급성 신장 손상에 대한 랫트 모델 시스템
열허혈 - 시험 랫트에서 좌측 신장적출이 45분의 웜 신장 이식 보전 기간으로 되는 자가 이식에 이어 수행되어 졌다. 자가 이식에 이어, 우측 신장적출이 동일한 동물에 대해 수행되었다. 표적에 대한 화학적으로 변형된 siRNA가 신장 이식(모방 공여 처리)의 수확 전("pre"), 또는 신장 자가이식(모방 수증 처리) 후, 또는 이식 전 및 후 양자(조합된 공여 및 수증 처리)("pre-post")의 어느 하나로 대퇴정맥을 통해 정맥 내로 투여되어 진다.
냉허혈 - 좌측 신장적출이 5시간의 기간 동안 수확된 신장의 냉 보전(얼음 상)에 이어 공여 동물 상에서 수행되어 졌다. 이 기간의 종단에, 수증 랫트는 냉-보전 신장 접목의 이식에 이어 양방의 신장 적출이 된다. 전체 열허혈 시간(수술적 과정을 포함함)은 약 30분이다. 화학적으로 변형된 siRNA는 신장 수확에 앞서 공여 동물에("pre"), 또는 이식 후 15분("post 15 min") 또는 4시간(post 4 hrs)에 수증 동물의 어느 하나로 대퇴정맥을 통해 정맥 내로 투여되어 진다.
이식-후 신장 기능을 개선하는데 있어 본 발명의 변형된 siRNA 화합물의 유효성을 평가하기 위해, 혈청 크레아틴 준위가 열허혈 및 냉허혈 모델 양자에 있어서 이식-후 1, 2, 및 7일에 측정되어 진다.
이 기술 분야의 통상인은 단지 일상적 실험에 지나지 않는 것을 사용하여 여기서 기술된 본 발명의 특정한 실시형태의 동등물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 다음의 특허청구범위에 의해 포괄되어 지는 것으로 의도되어 진다.
<110> Quark Pharmaceuticals, Inc. AVKIN-NACHUM, Sharon <120> siRNA COMPOUNDS COMPRISING TERMINAL SUBSTITUTIONS <130> 213/PCT1 <150> 61/264,668 <151> 2009-11-26 <150> 61/295,721 <151> 2010-01-17 <150> 61/372,072 <151> 2010-08-09 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1492 <212> RNA <213> HOMO_SAPIENS <400> 1 cgggcgacag cagggccgcg gugcaguguc cgacccgaga guugcggccu gagucaccgg 60 ccccgcccuc cggagccgga cgcugcggga ggcccgggag cggcagugga accgacuccc 120 agaacuccgg acgugugcgg cgcagugagu cgcagccaug uuccugguua acucguucuu 180 gaagggcggc ggcggcggcg gcgggggagg cgggggccug ggugggggcc ugggaaaugu 240 gcuuggaggc cugaucagcg gggccggggg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 300 ugguggaggc ggcgguggcg guggaacggc caugcgcauc cuaggcggag ucaucagcgc 360 caucagcgag gcggcugcgc aguacaaccc ggagcccccg cccccacgca cacauuacuc 420 caacauugag gccaacgaga gugaggaggu ccggcaguuc cggagacucu uugcccagcu 480 ggcuggagau gacauggagg ucagcgccac agaacucaug aacauucuca auaagguugu 540 gacacgacac ccugaucuga agacugaugg uuuuggcauu gacacauguc gcagcauggu 600 ggccgugaug 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Claims (39)

  1. 아래에 제시된 구조(A)를 가지는 변형된 이중사슬 핵산 분자:
    (A) 5' N1-(N)x - Z 3' (반전사 사슬)
    3' Z'-N2-(N')y -z" 5' (전사 사슬)
    여기서, N2, N 및 N' 각각은 비변형된 또는 변형된 리보뉴클레오티드, 또는 비범한 부분이고;
    여기서 (N)x 및 (N')y 각각은 각 연속적인 N 또는 N'이 공유결합에 의해 인접하는 N 또는 N'에 결합된 올리고뉴클레오티드이고;
    여기서 x 및 y 각각은 독립적으로 17 내지 39 사이의 정수이고;
    여기서 (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 상보성을 가지고 그리고 (N)x는 표적 RNA에서 컨시큐티브 시퀀스에 상보성을 가지고;
    여기서 N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 미스매치되어 지거나 또는 표적 RNA에 대하여 상보성 DNA 뉴클레오티드이고;
    여기서 N1은 천연 또는 변형된 우리딘, 디옥시리보우리딘, 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 아데노신 또는 디옥시아데노신으로 구성된 군으로부터 선택된 부분이고;
    여기서 z"은 존재하거나 또는 부존재일 수 있지만, 만일 존재한다면, N2-(N')y의 5' 말단에 공유적으로 부착된 캡핑 부분이고; 그리고
    여기서 Z 및 Z'의 각각은 독립적으로 존재하거나 또는 부존재일 수 있지만, 만일 존재한다면, 독립적으로 이것이 존재하는 스트랜드의 3' 말단에 공유결합적으로 부착된 1-5 컨시큐티브 뉴클레오티드, 컨시큐티브 비-뉴클레오티드 부분 또는 이들의 조합임.
  2. 제 1항에 있어서, (N')y의 시퀀스는 (N)x의 시퀀스에 완전히 상보성인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  3. 제 1항에 있어서, N2-(N')y의 시퀀스는 N1-(N)x의 시퀀스에 상보성인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  4. 제 1항에 있어서, (N)x는 표적 RNA에서 약 17 내지 약 39의 컨시큐티브 뉴클레오티드에 완전히 상보성인 반전사를 포함함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  5. 제 1항에 있어서, (N)x는 표적 RNA에서 약 17 내지 약 39의 컨시큐티브 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 반전사를 포함함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  6. 제 1항에 있어서, N1 및 N2는 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 형성하는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  7. 제 1항에 있어서, N1 및 N2는 비-왓슨-클릭 염기 쌍을 형성하는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, x=y=18, x=y=19 또는 x=y=20인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  9. 제 1항에 있어서, x=y=18인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 미스매치되어 지는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1은 (N)x에 공유결합으로 결합되어 지고 그리고 표적 RNA에 상보성인 DNA 부분인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택되어 지고 그리고 여기서 표적 RNA에서 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드는 아데노신인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  13. 제 12항에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 지는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  14. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택되어 지고 그리고 여기서 표적 RNA에서 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드는 시티딘인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  15. 제 14항에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 지는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  16. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택되어 지고 그리고 여기서 표적 RNA에서 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드는 구아노신인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  17. 제 16항에 있어서, N1은 아데노신, 디옥시아데노신, 우리딘 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 지는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  18. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1은 디옥시아데노신, 디옥시우리딘, 리보티미딘 또는 디옥시티미딘으로부터 선택되어 지고 그리고 여기서 표적 RNA에서 뉴클레오티드와 쌍을 이루는 뉴클레오티드는 우리딘인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  19. 제 18항에 있어서, N1은 디옥시아데노신 또는 디옥시우리딘으로부터 선택되어 지는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  20. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1 및 N2는 우리딘 또는 디옥시우리딘, 및 아데노신 또는 디옥시아데노신 사이에 염기 쌍을 형성하는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  21. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, N1 및 N2는 디옥시우리딘 및 아데노신 사이에 염기 쌍을 형성하는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, z"은 존재함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, Z 및 Z'는 비 존재함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  24. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, Z 또는 Z' 중의 어느 하나는 존재함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  25. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, Z 또는 Z'은 비-뉴클레오티드 부분을 포함함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 N 또는 N'은 2'OMe 당-변형된 리보뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  27. 제 26항에 있어서, N은 단일 교호하는 비변형된 및 2'OMe 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, N2는 2'OMe 당-변형된 리보뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  29. 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 이중사슬 핵산 분자는 siRNA, siNA 또는 miRNA임을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  30. 제 1항에 있어서, x=y=18이고, Z'는 부존재하고, Z는 존재하고 그리고 포스포디에스테르 결합을 통해 상호 공유적으로 연결된 두 알킬 부분을 포함하고, N2는 아데노신을 포함하고 그리고 N1은 우리딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  31. 제 1항에 있어서, x=y=18이고, Z'는 부존재하고, Z는 존재하고 그리고 포스포디에스테르 결합을 통해 상호 공유적으로 연결된 두 알킬 부분을 포함하고, N2는 우리딘 또는 디옥시우리딘을 포함하고 그리고 N1은 아데노신을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA는 포유동물 유전자의 mRNA인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  33. 제 32항에 있어서, 표적 RNA는 인간 유전자의 mRNA인 것을 특징으로 하는 이중사슬 핵산 분자.
  34. 치료에 사용하기 위한 청구항 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 이중사슬 핵산 분자.
  35. 청구항 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 이중사슬 핵산 분자; 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  36. 질환이나 증상의 발현을 예방하거나 치료하거나 또는 지연하기에 유효한 양으로 청구항 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 이중사슬 핵산 분자 또는 청구항 제35항의 약학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 이들의 필요에 따라 대상에서 질환 또는 증상의 발현 또는 심각성을 치료하거나 예방하는 방법으로, 여기서 질환 또는 증상 및/또는 이들과 연계된 증후군은 청력 손실, 민감성 신부전(ARF), 신장 이식 후 지연된 이식신장 기능(DGF), 녹내장, 비-동맥 허혈성 시신경증 (NAION), 전방 허혈성 시신경 신경 장해를 포함한 안구 허혈성 상태, 연령 관련 황반 변성(AMD), 허혈성 광학 신경 장해 (ION), 건조한 눈 증후군, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 급성 폐 및 호흡계 손상, 만성 폐색 폐 질환(COPD), 주요한 이식 장애, 허혈성-재관류 상해, 장기 이식, 특히는 폐, 간, 심장, 취장, 및 신장 이식을 포함하는 장기 이식, 특히는 폐 이식에서 이식 후 재관류 상해, 재관류 부종, 타가이식 부전, 폐동맥 재이식 반응 및/또는 주요 이식 장애(PGD), 신독성 및 신경독성, 척수 손상, 뇌 손상, 신경퇴행성 질환이나 증상, 욕창, 구강 점막염, 섬유증 질환 및 암으로 구성된 군으로부터 선택되지는 방법.
  37. 다음의 단계를 포함하는 전사 사슬 및 반전사 사슬로 구성되는 이중사슬 RNA 분자를 생성하는 방법:
    a) 표적 RNA에서 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 선택하고, 그리고 rG:rU스트랜드 올리고뉴클레오티드 및 표적 mRNA의 3' 말단 뉴클레오티드 조건으로, 반전사 사슬의 5 ' 말단 뉴클레오티드가 우리딘, 변형된 우리딘, 리보티미딘, 디옥시리보티미딘, 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신 또는 변형된 디옥시아데노신으로 치환되어 진, 표적 mRNA의 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스에 상보성을 포함하는 반전사 사슬을 합성하는 단계;
    b) 반전사 사슬에 상보성을 갖는 17 내지 25 뉴클레오티드의 전사 사슬을 합성하는 단계, 여기서 전사 사슬의 3' 말단 뉴클레오티드가 반전사 사슬의 5' 말단 뉴클레오티드와 왓슨-클릭 염기 쌍을 형성함; 및
    c) 반전사 및 전사 사슬을 어닐링하는 단계; 이에 의해 이중사슬 RNA 분자가 생성되어 짐.
  38. 다음의 단계를 포함하는 비변형된 이중사슬 RNA 듀플렉스에 비하여 고양된 RNAi 활성을 나타내는 전사 사슬 및 반전사 사슬로 구성되는 변형된 siRNA 듀플렉스를 생성하는 방법:
    a) 표적 RNA에서 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 선택하고, 그리고 3' 말단 뉴클레오티드가 아데노신, 변형된 아데노신, 디옥시아데노신 또는 변형된 디옥시아데노신으로 치환되어 진 표적 mRNA의 컨시큐티브 17 내지 25 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 전사 사슬을 합성하는 단계;
    b) 전사 사슬에 상보성을 갖는 17 내지 25 뉴클레오티드의 반전사 사슬을 합성하는 단계, 여기서 5' 말단 뉴클레오티드는 패신저 스트랜드의 3' 말단 뉴클레오티드를 갖는 리보우리딘, 변형된 리보우리딘, 디옥시리보우리딘 또는 변형된 디옥시리보우리딘 및 염기 쌍을 포함함;
    c) 반전사에 전사 사슬을 어닐링하는 단계;
    이에 의해 고양된 RNAi 활성을 갖는 이중사슬 RNA 분자가 생성되어 짐.
  39. 제 37항 또는 제 38항에 있어서, 3' 말단 뉴클레오티드는 아데노신 이외의 것임을 특징으로 하는 방법.
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