KR101696704B1 - 오프-타겟을 막기 위해 변형된 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도 - Google Patents

오프-타겟을 막기 위해 변형된 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 간섭을 유도하는 핵산 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에서 5'말단과 3'말단 영역을 염기(base) 배열을 할 수 없는 형태인 스페이서로 치환하여 변형시킨 RNA 간섭을 유도하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 RNA 간섭현상으로 타겟 유전자의 발현을 억제할 때 발생하는 오프-타겟 효과를 막기 위한 새로운 변형 형태의 핵산 및 이를 이용한 타겟 유전자의 선택적 발현 억제 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 타겟 유전자의 발현을 억제하면서도, 오프-타겟 효과를 막아 타겟 선별성 및 특이성을 지닌 새로운 변형 형태로 RNA 간섭 유도 핵산을 제공함으로써, 종래 RNA 간섭 유도 핵산의 문제점인 오프-타겟에 의한 부정확성 및 부작용을 해소하여 걱정 없이 유전자 발현 억제 기법으로 연구 및 유전자 치료에 사용될 수 있다.

Description

오프-타겟을 막기 위해 변형된 RNA 간섭 유도 핵산 및 그 용도 {MODIFIED RNA INTERFERENCE INDUCING NUCLEOTIDES FOR BLOCKING OFF-TARGET EFFECTS AND THE USE THEREOF}
본 발명은 RNA 간섭을 유도하는 핵산 및 그 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에서 5'말단과 3'말단 영역에 스페이서(spacer)로 치환하는 변형을 포함시킨 RNA 간섭을 유도하는 핵산에 관한 것이다.
siRNA(small interfering RNA)는 RNA 간섭을 통하여 원하는 타겟 유전자의 발현을 억제하는 기술로 널리 사용되고 있으나, 피할 수 없는 단점으로 다른 유전자도 비특이적으로 저해 시키는 오프-타겟 현상이 일어나 이로 인하여 발생되는 잘못된 연구결과 및 치료 부작용이 크게 염려되고 있다. 이러한 오프-타겟 효과는 RNA간섭에서 가장 핵심적인 역활을 하는 아고너트(Argonaute) 단백질이 RNA 간섭을 유도하기 위해서 인위적으로 도입시킨 siRNA를 세포내에 존재하는 마이크로RNA와 동일하게 취급하여 일어난다. 그래서 이를 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과(miRNA-like off-target effect)라고 부르고 있다. 마이크로RNA는 발단 위치(seed region; 5'말단의 2번째부터 7번째까지)의 염기 배열(base pairing)을 통하여 주로 타겟 유전자를 인식하여 그 발현을 저해하며, siRNA도 또한 같은 위치인 발단 위치의 서열에 의존적으로 오프-타겟이 일어난다. 이러한 siRNA의 마이크로RNA 유사 오프-타겟 현상은 이미 여러 연구에서 보고되었으며 (Jackson, A.L., et al., Nat. Biotechnol., 21(6): 635, 2003; Jackson, A.L., et al.,Rna, 12(7): 1179, 2006; Birmingham et al., Nat. Methods, 3(3): 199, 2006; Lin et al., Nucleic Acids Res., 33(14): 4527, 2005; Anderson et al., RNA, 14(5): 853, 2008), 발단 부분의 서열에 따라 적으면 수백개에서 많으면 약 1500개 정도의 유전자의 발현에 영향을 미치며, siRNA를 이용한 표현형 스크리닝 과정에서는 양성 hit중에 30%까지의 표현형이 이러한 오프-타겟으로 나타날 정도로 그 부작용이 심각하다. 또한, 마이크로RNA의 경우에는 발단 부분과 표적과의 결합이 약하게 일어날 시에는 3'말단 부분에서의 보상 결합 (3'-compensatory pairing)을 통해서 표적 유전자를 저해하는 현상이 보고되었으며(Cell. 2009;136:215-233), 따라서 마이크로RNA 유사 오프-타겟 현상도 이러한 기작으로 나타날 것으로 생각된다.
또한, siRNA에 의해 매개되는 광범위한 오프-타겟 발현억제 효과를 볼 때, 의도된 타겟의 발현억제 효율은 유지시키면서 오프-타겟 발현억제만을 감소시킬 수 있도록 siRNA에 몇가지 임의의 화학적 또는 구조적 변경이 시도되었다. Dharmacon Research (Lafayette, CO)에 연구되어 사용되는 변형은 siRNA 상의 뉴클레오티드의 리보실 링의 2'위치에 메틸기(2'OMe)를 추가하여 오프-타겟 효과를 감소시키는 것으로, 특히 5'말단 2번째 위치의 2'OMe 변형은 의도된 타겟의 발현 억제에 대한 영향이 다소 약해지지만, 오프 타겟 효과의 수 및 정도를 모두 감소시키는데 효과적인 것으로 처음 발견되었다. 이후의 다른 형태의 변형으로는 LNA 변형이나 (Puri et al., Nucleic Acids Symp. Ser .2008), UNA 변형 (Bramsen et al., Nucleic Acids Res. 2010 ;38, 5761-73), 단일 뉴클레오티드 벌지(bulge)를 도입하는 (Mol Ther. 2011 Sep;19(9):1676-87) 구조도 개발되었다.
하지만 이러한 모든 화학적 변형은 오프-타겟이 일어나는 데 가장 주요한 염기 서열 자체에 변형이 가해자는 것이 아니라 뉴클레오티드 백본(backbone)에 가해지는 것이라 근본적인 염기배열에 영향을 미치지는 않는다. 이러한 이유로 인하여 오프-타겟 효과를 감소시킬 수는 있지만, 완전히 막지는 못하며, 또한 온-타겟(on-target) 억제효율도 감소시키는 문제점을 나타내고 있다.
이에 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 타겟 유전자 억제 효율이 높으면서도, 오프-타겟 효과는 완전히 차단할 수 있도록 변형시킨 RNA간섭 유도 핵산을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드 또는 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환되는 변형을 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 유전자 발현 억제용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내로 도입시키거나 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내로 도입시키거나 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, RNA 간섭을 유도하는 유전자의 가이드 가닥(guide strand) 또는 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드가 스페이서(spacer)로 치환되거나, 또는 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환되는 변형을 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산 이중가닥 중 변형의 대상이 되는 단일가닥은 단일가닥으로만 존재하여 RNA 간섭 현상을 일으키는 ss-siRNA(single strand siRNA)와 같이, 아고너트(Argonaute) 단백질에 결합할 수 있는 능력을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 스페이서는 뉴클레오티드 자리의 공간을 유지할 수 있는 화합물, 바람직하게는 유기화합물로서, 가장 바람직하게는 인산기 또는 황산기를 포함하는 탄화수소 사슬일 수 있으며, 상기 탄화수소 사슬은 적어도 탄소수 3개를 가지는 알킬기(C3 spacer)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 스페이서는 생체 염기와 결합하여 염기 배열을 할 수 없는 것일 수 있으며, 비염기 형태로서 디옥시리보 뉴클레오티드(Deoxyribo nucleotide)를 백본으로 하는 dSpacer 또는 리보 뉴클레오티드(Ribo nucleotide)를 백본으로 하는 rSpacer 분자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 치환으로 인한 타겟 유전자의 RNA와의 불일치 염기배열(mismatch base pairing) 또는 삽입으로 인한 융기(bulge) 생성을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, asiRNA, piRNA, 또는 endo-siRNA 등 간섭현상을 일으키는 모든 핵산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산은 miRNA(마이크로RNA)와 같이, 전체 서열과 상보적인 타겟 유전자가 생체에 존재하지 않는 경우에는 기능을 상실하는 것일 수 있으며, 이러한 경우에는 RNA간섭에 관련된 대조군으로 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산이 RNA 간섭으로 억제하고자 하는 타겟 유전자는 최광의(最廣意)에서 유전자를 나타내며, 바이러스를 포함한 모든 생물체에서 전사(transcription)되어 RNA로 매개되는 모든 코딩(coding) 및 논코딩(non-coding) 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 타겟 유전자의 발현을 억제하는 용도일 수 있으며, 상기 이중가닥은 인위적으로 조성된 형태 또는 생체에서 다시 변형된 것일 수 있다.
본 발명은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내로 도입시키거나, 또는 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공한다.
이에 더하여, 본 발명은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 가이드 가닥(guide strand) 또는 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 가이드 가닥(guide strand) 또는 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 RNA 간섭현상으로 타겟 유전자의 발현을 억제할 때 발생하는 오프-타겟 효과를 막기 위한 새로운 변형 형태의 핵산 및 이를 이용한 타겟 유전자의 선택적 발현 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 타겟 유전자의 발현을 억제하면서도, 오프-타겟 효과를 막아 표적 선별성 및 특이성을 지닌 새로운 변형 형태로 RNA 간섭 유도 핵산을 제공함으로써, 종래 RNA 간섭 유도 유전자들의 문제점인 오프-타겟에 의한 부정확성 및 부작용을 해소하여 걱정 없이 유전자 발현 억제 기법으로 연구 및 유전자 치료에 사용될 수 있는 특징이 있다.
도 1은 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 변형된 핵산의 유전자 발현 온-타겟 저해 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과 억제를 도식화해서 나타낸 것이다.
도 2는 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환 변형된 siRNA 분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)로 치환 변형된 siRNA 분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 삽입 변형된 siRNA 분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)로 삽입 변형된 siRNA 분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 5' 말단 기준 6번째 뉴크레오티드가 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환 변형된 형태(6pi)의 siRNA 분자 또는 miRNA 분자의 타겟 유전자 조절 기능에 미치는 영향 및 종래 5'말단 2번째 부분의 2'OMe 변형된 siRNA 분자와 효과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 세포 내에서 PCSK9 유전자 저해용 siRNA의 오프-타겟 효과 및 본 발명에 따라 6pi 변형 후 오프-타겟 효과를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 생체 내에서 PCSK9 유전자 저해용 siRNA의 오프-타겟 효과 및 본 발명에 따라 6pi 변형 후 오프-타겟 효과를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 종래의 불일치 염기배열(mismatch) 및 2'OMe 변형이 5'말단의 6번째 부분에 적용된 siRNA 형태와 5'말단 2번째 부분의 2'OMe 변형, 6번째 부분의 UNA 변형, siRNA 이중체에 2번 위치에 벌지가 도입된 형태의 siRNA 분자에 대해서 그 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 본 발명과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 RNA 간섭 유도 핵산의 단일가닥에서 5'말단의 6번째가 적어도 탄소수 3개를 가지는 알킬기인 탄화수소 사슬로 이루어진 스페이서로 변형되었을 때 유전자 발현 온-타겟 저해 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과 억제를 도식화해서 나타낸 것이다.
도 11은 5'말단의 6번째 위치가 알킬기로 이루어진 스페이서(C3 spacer)로 치환된 siRNA 분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 3'말단의 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환 변형된 siRNA분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로RNA 유사 오프-타겟 중 3'말단 보상 결합에 대한 효과를 평가한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드, 또는 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환되는 변형을 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명자들은 RNA 간섭이라 칭하는 짧은 RNA에 의해 유도되는 유전자 억제 현상을 이용하여 서열 특이적으로 관심 타겟 유전자의 발현을 효율적으로 억제 하면서도, 오프-타겟 효과는 완전히 막을 수 있는 방법을 찾기 위해 연구한 결과, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 어느 하나의 단일가닥에서 5'말단 영역에 스페이서 형태의 비염기 단일 뉴클레오티드를 비롯하여 염기가 없는 공유결합이 포함되도록 변형시킴으로써, 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 막으면서, 타겟 유전자를 효율적으로 억제하는 특이성을 가질 수 있음을 확인하고, 또한, 3' 말단 영역에 스페이서 형태의 비염기 단일 뉴클레오티드를 비롯하여 염기가 없는 공유결합 변형이 포함되도록 변형시킴으로써 3'말단 보상 결합에 의해 나타나는 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과를 막으면서, 타겟 유전자를 효율적으로 억제하는 특이성을 가질 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 일실시예에서는 5'말단으로부터 6번째 위치에서의 스페이서 변형이 오프-타겟이 없으면서도 가장 효율적인 표적 유전자 억제를 나타내는 것으로 확인하였다. 이것은, 본 연구자의 이전 연구인 마이크로RNA 인식 기작에 대한 새로운 모델인 전이핵형성모델(transitional nucleation model, Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 12;19(3):321-7)과 일치하며, 이에 따라 축(pivot)이라 불리우는 5'말단 6번째 위치의 염기배열이 마이크로RNA 유사 오프-타겟 인식의 핵심 요소임을 보여준다.
또한, 상기 비염기 뉴클레오티드 변형에서 확장하여 5'말단으로부터 6번째 위치의 뉴클레오티드를 스페이서(spacer)로 치환시켜 5번째 뉴클레오티드와 7번째 뉴클레오티드가 상기 스페이서와 공유결합한 형태일 때 오프-타겟이 없으면서도 가장 효율적인 표적 유전자 억제를 나타내는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 일실시예에서 5'말단으로부터 6번째 위치의 스페이서 변형은 모든 종류가 완전하게 오프-타겟 효과를 없애지만, 온-타겟 효과에 있어서는 스페이서 변형 중 가장 크기가 큰 리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer) 보다는 2' 위치의 산소원자가 없어서 크기가 상대적으로 작은 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)가 더 좋으며, 극단적으로는 가장 크기가 작은 스페이서 형태인 알킬기 스페이서(C3 Spacer)에서 온-타겟 억제 효과가 변형이 가해지지 않은 형태와 유사하게 나타남을 확인하였다. 이러한 5'말단 6번째에서 작은 크기의 스페이서가 우수한 온-타겟 효과를 나타내는 현상은, 종래 보고된 아고너트 단백질과 마이크로RNA의 구조(Schirle et al, Science 2012, 336, 1037-40) 및 전이핵형성모델로 비추어 볼 때, 마이크로RNA가 5’말단 6번째의 염기배열 이후에 표적을 억제하기 위해 구조적, 기능적 변화를 겪는다는 점에서 일치함을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 실제로 발단 부위로 표적을 인식하여 기능을 나타내는 마이크로RNA중 하나인 miR-124에 본 발명의 변형을 가한 결과, 마이크로RNA 타겟 저해를 막고, 그 기능인 신경세포 분화 유도능을 잃어버리는 것으로 나타난 반면, 종래 Dharmacon 社에서 개발한 오프-타겟 억제 변형인 2'OMe 변형을 가했을 때는 miR-124의 기능인 신경분화유도를 막지 못했으며, 유전체 수준의 전사 발현 조사에서도 그 억제 효과가 본 발명의 변형 방법에 비해 매우 미비함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 타겟 유전자로 레닐라 루시퍼라제 또는 PCSK9 유전자 저해용 siRNA들에 대해 본 발명에 따른 siRNA 변형을 적용하고, 온-타겟 효과 및 오프-타겟 효과를 조사한 결과, 우수한 효율로 가이드 가닥에 의한 오프-타겟 효과를 막고 타겟에 대한 선별능을 높이는 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 용도인 PCSK9에 대한 siRNA의 경우, 동물 모델인 생쥐를 대상으로 치료적 효능인 콜레스테롤 수치 저하가 비변형 형태의 siRNA만큼 효과적으로 이루어짐을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는, PCSK9 siRNA에 의해 나타나는 오프-타겟 현상으로 인간 간세포인 HepG2는 세포주기 정지를 보이고 생쥐 간 조직에서는 구리이온 대사이상으로 세포사멸을 일으키는 부작용이 일어나는 것을 발견하고, 이를 개선하기 위해서 본 발명에 따른 siRNA 변형을 가하고 상기와 같은 부작용 및 오프-타겟에 대한 효과를 확인한 결과, 부작용 및 오프-타겟 현상은 사라지고 원래 타겟인 PCSK9 저해 현상은 효과적으로 유지되는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 종래의 마이크로RNA 유사 오프-타겟 억제 방법으로 제시된 발단부분의 미스매치를 마이크로RNA중 하나인 miR-124의 5'말단으로부터 6번째에 도입했을 때, miR-124의 표적인식 형태인 발단 매치(seed match)에 의한 표적 유전자 저해는 억제하지만 미스매치 도입에 의해서 변형된 서열에 대한 새로운 발단 매치에 대해서는 여전히 표적으로 인식하여 억제하는 부작용이 존재함을 확인하였으며, 종래의 오프-타겟을 억제하기 위한 변형 방법인 2'OMe 변형을 5'말단으로부터 6번째에 도입했을 경우에도 여전히 상기와 같은 부작용이 존재함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 종래에 오프-타겟를 억제하는 변형 방법으로 제시된 5'말단으로부터 2번째 2'OMe 변형, 5'말단으로부터 7번째 UNA 변형, siRNA 이중가닥 구조에서 가이드 가닥의 5'말단으로부터 2번째에 단일 뉴클레오티드 벌지(bulge)가 형성되도록 변형을 가했을 때, 모두 경우 오프-타겟을 완벽하게 억제하지 못하지만, 본 발명의 경우 오프-타겟을 완벽하게 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 5'말단으로부터 6번째 위치의 뉴클레오티드를 스페이서로 치환시켜 5번째 뉴클레오티드와 7번째 뉴클레오티드가 상기 스페이서와 공유결합한 형태일 때 타겟 유전자의 발현을 억제하면서도, 오프-타겟 효과를 완전히 막는 것을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 siRNA의 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드를 염기가 없는 형태인 스페이서로 치환시켰을 때, 유전자 발현 억제 효과는 뛰어나면서, 마이크로RNA 유사 오프-타겟 중 3'말단 보상 결합에 의해서 일어나는 오프-타겟 효과를 완벽히 막는 것을 확인하였다.
상기로부터, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하는, RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에서 5'말단으로부터 6번째 위치의 뉴클레오티드가 스페이서로 치환되어 5번째와 7번째 뉴클레오티드가 상기 스페이서와 공유결합하고 있거나, 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 비염기 뉴클레오티드 또는 스페이서로 치환된 것을 특징으로 하는 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 제공할 수 있다.
상기에서 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 18 내지 23개로 구성되는 뉴클레오티드의 가이드 가닥(guide strand) 및 상기 가이드 가닥에 상보적인 운반자 가닥(passenger strand)으로 이루어진 이중가닥인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 이중가닥은 줄기-루프(stem-loop)의 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 핵산이 다이서(Dicer) 단백질에 의해 줄기부분이 가공되어 이중가닥 형태로 변형되는 것, 즉, shRNA가 가공되어 siRNA 형태를 이루는 것일 수 있으나, 이는 핵산 형태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되지 않는다. 또한, 최적의 오프-타겟 저해 효과를 나타내도록 하기 위하여 상기 핵산은 3'말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 갖거나, 치환으로 인한 표적 유전자의 RNA와의 불일치 염기배열(mismatch base pairing) 또는 삽입으로 인한 융기(bulge) 생성을 더 포함할 수 있다. 용어 '융기(bulge)'란 이중가닥의 핵산에 있어서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입으로 인하여 페어링(pairing)이 이루어지지 않고 벌어진 부분을 말하며, 불일치 염기배열이란 일반적으로 염기쌍 간에 왓슨-크릭 배열(Watson-Crick base pairing)이 되지 않는 경우를 의미 한다.
본 발명에서 용어 ‘가이드 가닥(guide strand; antisense strand)’이란 상기 이중가닥 중 표적을 저해할 용도로 서열이 정해진 단일가닥 부분으로, 실질적으로 아고너트 단백질에 주로 결합하여, 아고너트 복합체가 표적 유전자를 인식하도록 가이드를 해주는 역할을 하며, 관심 있는 타겟 유전자 mRNA에 실질적으로 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로, 이에 따라 안티센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 상보적일 수 있고, 용어 ‘운반자 가닥(passenger strand; sense strand)’이란 상기의 이중가닥 중 가이드 가닥과 이중가닥 구조를 이루어서, 가이드 가닥이 아고너트 단백질과 결합할 수 있도록 도와주는 운반자 역할을 하며, 표적 핵산과 실질적으로 또는 100% 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 이에 따라 센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본 발명에서 용어 ‘스페이서(spacer)’는 단일 뉴클레오티드 대신 그 공간을 유지시키기 위한 치환체일 수 있으며, 공간을 유지시킬 수 있는 형태라면 어느 하나에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 유기화합물일 수 있고, 보다 바람직하게는 인산기(-H2PO4) 또는 황산기(-H2PSO4)를 포함하는(연결된) 탄화수소 사슬일 수 있으며, 가장 바람직하게는 적어도 탄소수 3인 알킬기일 수 있다. 또한, 상기 스페이서는 비염기(abasic) 형태의 뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 비염기 뉴클레오티드 형태의 스페이서는 일반적으로 염기가 전혀 없는 형태의 단일 뉴클레오티드 유사체를 의미하는 것으로서, dSpacer, rSpacer를 포함하여 포괄적으로는 RNA를 비롯한 모든 다른 생체 염기와 결합할 수 없는 형태의 모든 변형을 의미한다.
상기에서 이중가닥 중 대상이 되는 단일가닥은 RNA 간섭 현상을 일으키는 아고너트(argonaute) 단백질에 결합할 수 있는 능력을 가진다.
상기에서 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환되고, 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환되는 변형이 함께 적용된 것일 수 있다.
이에 더하여, 본 발명은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물 및/또는 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 ‘조성물’은 타겟 유전자의 발현을 억제하면서 동시에 오프-타겟 효과를 저해하는 역할을 수행할 수 있는 용도로 사용가능한 조성물을 의미한다.
상기 ‘키트’는 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위하여 RNA 간섭을 유도하는 핵산 또는 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 조성물이 담긴 용기를 포함하는 구성을 가지며, 상기 용기는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있고, 이들은 부분적 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있으며, 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 본 발명의 일실시예로부터 타겟 유전자의 발현을 효과적으로 저해할 수 있음이 확인되었으므로, 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공할 수 있으며, 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 타겟 유전자는 내인성(endogeneous) 유전자이거나 삽입 유전자(transgene)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
나아가 본 발명에 따른 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 타겟 유전자의 발현을 효과적으로 저해하면서 동시에 오프-타겟 효과도 막을 수 있음이 실시예를 통해 확인되었으므로, 본 발명은 상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산의 가이드 가닥(guide strand) 또는 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하기 위한 방법으로, RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내로 도입시키는 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 RNA 간섭을 유도하는 핵산의 가이드 가닥(guide strand) 또는 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하기 위하여 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 용어 '오프-타겟 효과(Off-target effect)'란 siRNA는 가이드 가닥과 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 분해를 유도하여 해당 mRNA의 유전자 발현을 억제하는 효과를 얻기 위하여 사용하는 것임에 불구하고, siRNA의 운반자 가닥에 의해 타 mRNA의 분해가 발생하게 되는 경우 운반자 가닥에 의해 발생하는 이러한 예상치 못한 타 mRNA의 분해 내지 해당 유전자의 발현 억제 효과, 및 siRNA의 가이드 가닥이 잘못된 타겟과 페어링하여 타 mRNA의 분해가 발생하는 가이드 가닥에 의한 타 mRNA의 분해 내지 해당 유전자의 발현 억제효과를 모두 포함하는 의미이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환된 siRNA 분자의 타겟 유전자 발현 억제 효과 및 오프 - 타겟 효과 비교
본 발명자들은 도 1에 나타낸 도식화된 예와 같이, 아고너트 단백질에 결합하는 모든 RNA 간섭 유도 핵산의 5'발단 부분을 염기 배열을 할 수 없는 스페이서로 변형시킬 경우, 타겟 유전자 억제 효율(온-타겟 효과)이 높으면서도, 오프-타겟 효과는 완전히 차단할 수 있을 것임을 예측하고, 마이크로RNA 인식 기작에 대한 모델인 전이핵형성모델(Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 12;19(3):321-7)에 기반하여, 5'발단 중 특히 축(pivot)이라 불리우는 5'말단 6번째 위치의 염기배열에 주목하여 본 RNA간섭 유도 핵산을 발명하였다.
우선, 본 발명에 따른 변형된 siRNA 분자와 기존의 변형이 가해지지 않은 siRNA 분자에 의해 매개되는 온-타겟 및 오프-타겟 효과를 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 가이드 가닥(guide strand) 상의 발단위치(seed region)를 포함하는 5'말단부분(1번부터 11번까지)에 염기 배열을 할 수 없는 비염기(abasic) 형태의 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(Deoxynucleotide Spacer; dSpacer)로 치환(pi)한 RNA를 합성하고, 운반 가닥(passenger strand)은 변형이 가해지지 않은 형태로 합성하여, 기존의 구조인 19개의 완전 상보배열(perfect reverse complement)과 함께 3'말단에 2개의 dT(Deoxy Thymine Nucleotide)의 돌출부를 가지는 이중가닥을 생성할 수 있도록 제조하였다. 이러한 RNA는 ST Pharma 社, Trilink Technologies 社 또는 Bioneer 社를 통해 화학적으로 합성하고, HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 도 1의 왼쪽 패널(5'말단 6번째에 dSpacer로 치환한 예; 6pi)과 같이 제조되었다. 이때, 대조군(NT; non-targeting)으로는 예쁜 꼬마 선충(C.elegans)에만 발현하는 마이크로RNA(miRNA)인 cel-miR-67의 서열을 siRNA 형태로 합성한 것을 사용하였다.
상기 변형은 레닐라 루시퍼라제 (Promega 社의 psi-check2 벡터에 들어 있는 레닐라 루시퍼라제; RL)를 저해하도록 디자인된 siRNA(siRL)에 적용하였다. 즉, 상기에서 이중체로 제조된 75nM의 siRNA는 HeLa세포 (ATCC CCL-2)에 레닐라 루시퍼라제를 발현시키는 psi-check2 벡터와 함께 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 HeLa 세포에 전달(co-transfection)시켜서 그 효과를 조사하였다. psi-check2 벡터는 siRL의 온-타겟 효과를 측정할 시에는 그대로 사용하지만, 오프-타겟을 조사할 때는 psi-check2 벡터의 레닐라 루시퍼라제 유전자를 pRL-TK (promega) 벡터에 들어 있는 레닐라 루시퍼라제로 치환하여 온-타겟으로 작용하지 못하게 한 후, 3'UTR (3'untranslated region) 부분에 siRL의 발단 부분(5'말단 1번부터 8번까지)과 완전 상보적인 서열인 발단 사이트(seed sites; Seed) 또는 5번부터 6번 사이에 벌지가 형성되어서 마이크로RNA와 결합하는 핵형성 벌지 사이트(nucleation bulge sites; Nuc)를 2번 반복되도록 DNA를 합성해서 삽입하여 RL-Seed, RL-Nuc를 만들어 사용하였다. 또한, HeLa 세포는 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지 (Invitrogen)에서 배양하였으며, 항생제 없는 완전배지에서 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 24시간 후, Promega 社의 Dual-luciferase reporter asssay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하여 siRNA의 효과를 조사하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 promega 社의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 3번 이상의 반복 실험으로 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 온-타겟 효과를 75nM의 siRNA 농도에서 측정하였을 때 dSpacer를 5'말단 1번째부터 11번째 사이에 치환하게 되면 60%이하의 활성도(반딧불 루시퍼라제의 표준화 값 대비)를 보이는 것으로 나타났다. 특히, 2번, 4번, 5번, 6번째의 치환은 변형을 가하지 않은 경우보다는 못 미치지만, 30% 이하로 활성도가 감소하는 것을 보이면서 유의한 효과를 보였다. 그러나 마이크로RNA 유사 오프 타겟 효과에 대해서 기존의 알려진 마이크로RNA 결합 위치인 발단 사이트(RL-Seed) 및 핵형성 벌지 사이트(RL-Nuc)를 삽입한 루시퍼라제 리포터로 측정한 경우, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 2번부터 7번 사이에 dSpacer를 치환한 경우에만 오프-타겟 억제 효과가 사라졌다.
상기로부터, 염기 배열을 할 수 없는 비염기로 변형된 디옥시뉴클레오티드 스페이서인 dSpacer 치환은 5'말단 2번째부터 7번째 사이에서 치환하게 되면, 온-타겟 효과를 보이면서도 마이크로RNA 유사 오프-타겟이 사라지는 효과를 가짐을 알 수 있었다.
또한, 우수한 온-타겟 효과를 나타낸 2번 내지 7번 사이의 dSpacer 치환 siRNA의 효과를 좀 더 자세히 알아보기 위해, 여러 농도에서 온-타겟 저해 효과를 측정하고 IC50 (inhibitory concentration 50)를 살펴본 결과, 도 2c 및 2d에 나타낸 바와 같이, 5번과 6번에 치환된 경우 가장 효율이 우수하고, 특히, 오프-타겟이 사라진 변형 중에서 6번에 치환된 경우 최대 억제 효과(Imax)가 가장 우수한 것을 확인하였다.
상기 결과는 마이크로RNA 인식 기작에 대한 새로운 모델인 전이핵형성모델(transitional nucleation model)에 부합되며, 도 2e 및 2f에 나타낸 바와 같이, 5'말단 중 특히 축(pivot)이라 일컬어지는 5'말단 6번째 위치의 염기배열이 마이크로RNA의 표적인식에 결정적이라는 종래 보고(Nat Struct Mol Biol. 2012 Feb 12;19(3):321-7)와도 일치한다.
이에 더하여, 도 2g에 나타낸 바와 같이, 반대편의 운반자 가닥으로 인한 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과도 가이드 가닥의 5'말단 3번 또는 6번에 비염기 단일 디옥시 뉴클레오티드 치환으로 감소시킬 수 있으며, 완벽하게 막기 위해서는 운반자 가닥을 동일하게 5'말단 2번 내지 7번 사이의 뉴클레오티드를 비염기 변형된 단일 뉴클레오티드로 치환함으로써 얻어질 수 있다.
상기와 같이, 타겟 유전자에 대한 발현 억제 효과 및 오프-타겟 회피 효과 면에서 살펴보면, siRNA 분자의 가이드 가닥의 5'말단으로부터 2번째 내지 7번째 사이 위치를 염기 배열을 할 수 없는 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환한 siRNA 분자를 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 6번째 위치에 dSpacer 치환 변형(6pi)을 사용하는 것임을 알 수 있다.
리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)로 치환된 siRNA 분자의 타겟 유전자 발현 억제 효과 및 오프 - 타겟 효과 비교
상기 실시예 1에서 dSpacer를 이용하여 확인된 사실을 리보뉴클레오티드 백본의 유사 스페이서인 리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)에서 확인하기 위해서, 오프-타겟이 사라지는 것으로 나타났던 siRL의 5'말단 2번부터 7번까지의 위치 중 하나를 rSpacer로 치환(pi-r)한 후 온-타겟 효과를 상기 실시예 1에서 시행했던 동일한 방법으로 IC50를 측정하여 조사하였다.
그 결과, 도 3a 내지 3c에 나타낸 바와 같이, 5'말단 2번부터 7번 사이에 rSpacer로 치환된 경우 모두 비변형(WT) 대비 최소 54%이상의 최대저해 효과(Imax)를 보였다. 그 중 2번에 변형을 가한 2pi-r을 제외하고는 모두 6pi에 비해서는 모두 온-타겟 저해 효과가 낮은 것을 확인 할 수 있었다. 예외적으로, 2pi-r은 6pi에 비해서 우수한 온-타겟 효과를 보였으나, 실시예 1에서 시행한 방법으로 RL-seed를 사용하여 오프-타겟 효과를 측정한 결과, 도 3d에 나타난 바와 같이, 여전히 오프-타겟을 저해하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 75nM siRNA 농도에서 각각 변형의 오프-타겟 효과를 측정한 결과, 도 3e에 나타난 바와 같이, 2pi-r과 7pi-r을 제외한 모든 변형이 오프-타겟 효과를 막는 것을 관찰할 수 있었다.
상기로부터, 타겟 유전자에 대한 발현 억제 효과 및 오프-타겟 회피 효과 면에서 살펴보면, siRNA 분자의 가이드 가닥의 5'말단으로부터 3번째 내지 6번째 사이 위치를 리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)로 치환한 siRNA 분자를 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 상기 실시예 1과 같이 6번째 위치를 비염기 디옥시뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환한 변형(6pi)을 사용하는 것임을 알 수 있다.
디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)가 삽입된 siRNA 분자의 타겟 유전자 발현 억제 효과 및 오프 - 타겟 효과 비교
상기 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)가 siRNA의 발단 부분에 가지게 하는 서열 구조에는, 상기 실시예 1과 실시예 2에서와 같이 치환하게 되면, siRNA가 타겟 유전자의 RNA와 결합 시에 비염기 부분이 불일치 염기배열(mismatch base pairing)이 되는 경우가 존재한다. 더불어, 도 4a에 나타낸 것과 같이, dSpacer를 siRNA 발단 부분에 삽입하게 되면, 비염기 부분이 융기(bulge)가 생성되는 경우도 존재한다. 이에, dSpacer를 삽입한 경우에 나타나는 온-타겟 및 오프-타겟 효과의 변화를 조사해 보았다. 우선, 상기 실시예를 통해 오프-타겟이 사라지는 것을 확인한 siRL의 5'말단 2번부터 7번 사이에 dSpacer를 삽입(pi-I)한 후에 온-타겟 효과를 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 IC50를 측정하여 조사하였다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 5'말단 2번부터 7번 사이에 dSpacer가 삽입된 경우 모두 비변형(WT) 대비 최소 19%이상의 최대 저해 효과(Imax)를 보였다. 또한, 도 4c 및 4d에 나타낸 바와 같이, 그 중 2pi-I와 3pi-I를 제외하고는 모두 6pi에 비해서는 모두 온-타겟 저해 효과가 낮은 것을 확인 할 수 있었다. 예외적으로 2pi-I와 3pi-I는 6pi에 비해서 우수한 온-타겟 효과를 보였지만, 실시예 1에서 시행한 방법으로 RL-seed를 사용하여 오프-타겟 효과를 측정한 결과, 도 4e에 나타난 바와 같이, 여전히 오프-타겟을 저해하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 도 4f에 나타낸 바와 같이, 75nM siRNA 농도에서 각각의 변형에 따른 오프-타겟 효과를 측정하였을 때도 2pi-I, 3pi-I, 7pi-I를 제외한 모든 변형(4pi-I, 5pi-I, 6pi-I)이 오프-타겟 효과를 막는 것으로 관찰되었다.
상기로부터, 타겟 유전자에 대한 발현 억제(온-타겟) 효과 및 오프-타겟 회피 효과 면에서 살펴보면, siRNA 분자의 가이드 가닥의 5'말단으로부터 4번째 내지 6번째 사이 위치에 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)를 삽입한 siRNA 분자를 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 상기 실시예 1과 같이 6번째 위치를 dSpacer로 치환한 변형(6pi)을 사용하는 것임을 알 수 있다.
리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)가 삽입된 siRNA 분자의 타겟 유전자 발현 억제 효과 및 오프 - 타겟 효과 비교
리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)가 siRNA의 발단 부분에 삽입된 변형(pi-rI)의 온 타겟 효과를 알아보기 위해서, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 IC50를 측정하였다.
그 결과, 도 5a 내지 5c에 나타낸 바와 같이, 모든 발단 위치의 변형이 26% 이상의 Imax를 가지는 우수한 온-타겟 효과를 나타내었다. 특히, 2pi-rI와 3pi-rI는 6pi 보다 우수한 온-타겟 효과를 나타냈지만, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 오프-타겟 효과를 측정한 결과, 도 5d에 나타난 바와 같이, 여전히 오프-타겟을 저해하는 것을 확인 할 수 있었다. 또한, 75nM siRNA 농도에서 각각 변형에 따른 오프-타겟 효과를 측정했을 때도, 도 5e에 나타난 바와 같이, 2pi-rI, 3pi-rI, 7pi-rI를 제외한 모든 변형(4pi-rI, 5pi-rI, 6pi-rI)이 오프-타겟 효과를 막는 것으로 관찰되었다.
상기로부터, 타겟 유전자에 대한 발현 억제 효과 및 오프-타겟 회피 효과 면에서 살펴보면, siRNA 분자의 가이드 가닥의 5'말단으로부터 4번째 내지 6번째 사이 위치에 리보 뉴클레오티드 스페이서(rSpacer)를 삽입한 siRNA 분자를 사용하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 상기 실시예 1과 같이 6번째 위치를 dSpacer로 치환한 변형(6pi)을 사용하는 것임을 알 수 있다.
5' 말단 기준 6번째 뉴크레오티드가 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서( dSpacer )로 치환 변형된 형태(6 pi )의 마이크로 RNA 분자의 타겟 유전자 조절 기 능 상실 및 기존 2' OMe 변형과의 효과 비교
본 발명에 따른 스페이서로 치환된 siRNA 분자는 종래 구조의 siRNA 분자가 가지는 마이크로RNA 유사 오프-타겟을 억제함을 상기 실시예 1을 통해 확인했으므로, 이를 마이크로RNA에 적용하여 확인하고자 miR-124의 5'말단으로부터 6번째 위치에 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer) 치환을 가하고 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 인간의 miR-124-3p와 동일한 서열과 6번 위치에 dSpacer로 치환한 서열(6pi)을 합성한 후, miR-124-5p와 이중체로 제조하고, HeLa 세포에 miR-124의 발단 사이트(5'말단으로부터 1-8번째와의 완전 상보배열 서열)를 2개 포함한 psi-check2 벡터를 함께 트랜스펙션 시킨 다음, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 여러 농도의 마이크로RNA에서의 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 변형 형태인 6pi를 가지는 마이크로RNA (miR-124-6pi)는 기존의 타겟 인식 사이트인 발단 사이트를 저해하지 못하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 발단 사이트 이외에 최근 마이크로RNA의 타겟으로 인식된다고 알려진 핵형성 벌지 사이트(Nuc)도 6pi 변형으로 인해 마이크로RNA에 의한 저해 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다.
또한, miR-124-6pi가 실제로 비변형 형태인 miR-124에 의해서 발현이 영향을 받는 여러 유전자에 대한 저해를 회피 할 수 있는지 유전체 수준에서 검증하기 위해, miR-124가 발현하지 않는 세포인 HeLa 세포에 miR-124, miR-124-6pi, 대조군을 트랜스펙션 시켜서 각각 발현시킨 다음, 24시간 후에 전체 RNA를 RNAeasy(Qiagen) 키트로 추출하여, Otogenetics 社에서 제공하는 RNA-Seq 라는 유전자 서열분석에 기반한 유전자 발현 실험을 수행하였다. 상기 실험으로 얻어진 서열 데이터인 FASTAQ 파일은 TopHat, Cufflink, Cuffdiff 프로그램을 사용하여 순차적으로 분석한 다음, 원래의 HeLa 세포에서의 결과로 표준화하여 최종적으로 로그비(log2 ratio)로 나타냈으며, Cuffdiff에서 제공하는 통계분석에서 그 차이가 유의하다고 보고되는 값들만을 취해서 분석을 실시하였다.
그 결과. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 발현의 저해와 증가가 동일하게 나타나는 대조군에 비해, miR-124를 발현시킨 경우에는 유의하게 저해되는 유전자가 증가되었으나, 6pi 변형이 도입된 경우에는 저해를 보였던 유전자의 수가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 또한. 도 6c에 나타낸 바와 같이, 전체 유전자 별로 miR-124, miR-124-6pi에 따른 발현 변화를 히트맵(heat map) 형식으로 miR-124에 의해 저해되는 정도의 순서로 나열하여 살펴보았을 때, miR-124에 의존적으로 저해되었던 현저하게 많은 유전자가 miR-124-6pi에 의해서는 저해되지 않음을 확인하였다.
이에 더하여, 실제로 6pi 변형이 마이크로RNA의 타겟 mRNA와의 결합을 막아서 이러한 현상을 나타냈는지 확인하기 위하여, 마이크로RNA와 아고너트 복합체가 결합하는 타겟 mRNA의 위치를 유전체 수준에서 차세대서열분석으로 모두 찾아 낼 수 있는 Ago HITS-CLIP이라는 실험 결과와 비교 분석을 실시하였다. 즉, HeLa 세포에 miR-124를 트랜스펙션하여 Ago HITS-CLIP 분석을 시행하고 여기서 얻어진 서열을 분석하여 모든 mRNA에서의 결합 위치에 대한 지도를 작성한 후에, 원래의 HeLa 세포에 대조군을 발현시켜 얻어진 Ago HITS-CLIP 결과와 비교 분석하여, miR-124를 발현시켰을 때 생성되는 아고너트 결합 위치를 유전체 수준에서 정확히 파악할 수 있었다. 이러한 miR-124 결합 위치를 de novo Ago-miR-124 cluster라 명명하고, 이러한 결합 위치 중 miR-124의 발단 사이트를 가지고 있는 타겟 mRNA를 대상으로, miR-124 또는 miR-124-6pi를 HeLa 세포에 발현시킨 후에 RNA-seq를 통해 얻어진 mRNA 프로파일 결과를 저해되는 순서대로 누적비율(cumulative fraction)로 비교 분석하였다.
그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, miR-124가 결합한 타겟 mRNA의 경우에는 전체 mRNA에 발현에 비해서 통계적으로 유의하게 (KS test, P<0.01) 저해되는 현상을 나타냈으나, miR-124-6pi의 경우에는 유의하지 않았다. 이에, miR-124의 5'말단으로부터 6번째에 비염기 변형된 단일 디옥시뉴클레오티드를 치환한 변형(miR-124-6pi)은 기존에 miR-124가 결합하는 타겟 mRNA를 저해하지 못하는 것을 유전체 수준에서 확인할 수 있었다.
siRNA의 오프-타겟을 막기 위해 종래에는 Dharmacon 社에서 개발한 2'OMe변형을 사용해왔다. 이는 해당 가이드 가닥의 마이크로RNA 유사 오프-타겟 현상을 막기 위해서 경험적으로 5'말단으로부터 2번째 위치에 2'OMe 변형을 가하는 방법이다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 변형인 6pi와 2'OMe를 레닐라 루시퍼라제를 억제하는 siRNA에 적용하고 온-타겟 억제 효율을 여러 농도에서 평가하고, IC50를 상기 실시예 1에서 사용한 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이, 6pi 변형이 2'OMe 보다 우수한 억제 효율을 보일 뿐 아니라, 최대 억제 효과도 우수한 것으로 나타났다. 또한, 상기에서 RNA-Seq를 수행하고 히트맵을 작성하여 분석한 방법을 동일하게 사용하여 오프-타겟 효과를 유전체 수준에서 평가한 결과, 도 6f에 나타낸 바와 같이, 2'OMe 변형은 siRNA의 오프-타겟 억제 현상을 6pi만큼 억제하지 못하는 것으로 나타났다.
이에 더하여, 6pi와 2'OMe 변형이 마이크로RNA의 타겟현상을 막아서 그 생물학적 기능을 억제할 만큼 효율적인지를 평가하기 위하여, 신경세포의 분화를 촉진하는 기능을 가지는 것으로 알려진 miR-124에 적용하고, 적용된 마이크로RNA 분자를 N2a 세포(Neuro-2a, ATCC CCL-131)에 트랜스펙션한 다음 72시간 후 현미경으로 신경세포말단 구조를 형성하는지를 관찰하였다.
그 결과, 도 6g에 나타낸 바와 같이, 2'OMe 변형이 가해진 miR-124-2me는 여전히 신경세포말단 구조를 유도하는 능력을 가지고 있었으나, miR-124-6pi는 그 기능을 완전히 상실했다.
따라서, siRNA 오프-타겟 유전자에 대한 발현 억제 효과 면에서 살펴보면, 5'말단 6번째 위치를 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환한 변형인 6pi는 매우 우수하게 마이크로RNA 유사 오프-타겟에 대한 결합 및 억제 효과를 피하고, 이에 따른 생물학적 효과까지 완전히 차단하는 우수한 효과를 나타내는 반면, 종래의 2'OMe 변형은 온-타겟 효율이 6pi보다 우수하지 않으며, 오프-타겟을 다소 감소시키지만 완전히 차단하지 못하는 한계가 있음을 알 수 있다.
혈중 콜레스테롤 감소를 위해 개발된 siRNA 의 오프 - 타겟 효과 및 스페이서 변형 적용시의 개선 효과 비교
본 발명에 따른 변형을 실험용 목적에서 치료용 목적으로 확장할 수 있는 siRNA 서열에 적용하여 그 효과를 평가하고자, Alnylam 社에서 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추기 위해서 간 세포의 PCSK9 유전자를 RNA간섭 현상으로 저해하고자 개발한 siRNA인 PCS-A1(A1), PCS-A2(A2)(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Aug 19;105(33):11915-20)를 대상으로 실험을 수행하였다. A1의 경우도 실시예 1과 동일한 방법으로 루시퍼라제 활성도 측정으로 여러 위치에 비염기 변형의 온-타겟 효과를 비교해보았을 때, 도 7a에 나타낸 바와 같이, A1-6pi가 가장 우수한 타겟 유전자 억제 효율을 나타냈고, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 발단 서열에 의한 오프-타겟 효과도 완전히 억제하였다. A2의 경우에는 A1과 동일 서열을 지니나 면역반응을 일으키는 문제와 RNA의 안정화를 개선하기 위해서 여러 위치에 2'OMe 변형이 가해지는데, 이러한 A2 siRNA 분자에서도, 실시예 1과 동일한 방법으로 측정한 루시퍼라제 리포터 활성 측정에서, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 6pi 변형이 오프-타겟을 막는 것으로 나타났다. 또한, 도 7d에 나타낸 바와 같이, A2의 경우에는 6pi 변형이 가해져도 비변형 형태의 A2와 거의 유사한 수준의 온-타겟 억제 효율을 루시퍼라제 리포터를 이용한 IC50 측정에서 나타내었다.
PCSK9 유전자에 대한 siRNA가 모두 마이크로RNA 유사 오프-타겟이 나타나는 현상을 루시퍼라제 리포터 실험을 통해 관찰한 후 실제로 이러한 오프-타겟의 효과를 간세포에서 확인하기 위하여, 인간 간암세포주인 HepG2 (ATCC HB-8065)를 이용하여 추가적인 실험을 실시하였다. 먼저, PCSK9 유전자에 대한 siRNA로써 A2가 효과적으로 PCSK9 mRNA의 양을 줄이는지를 확인하기 위해 HepG2 세포에 50nM A2, A2-6pi siRNA 분자를 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen 社) 시약을 이용하여 해당 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고 24시간 후에 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen 社)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT (Invitrogen)로 역전사하고, SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems 社)로 qPCR을 수행하여 PCSK9의 mRNA을 측정하고 GAPDH mRNA 값으로 표준화하였다.
그 결과, 도 7d의 오른쪽 바 그래프에 나타난 바와 같이, A2, A2-6pi 둘 다 효과적으로 PCSK9를 저해하는 온-타겟 효과를 확인하였다.
이후 총 RNA로부터 NSR RNA-Seq (Nat Methods. 2009 Sep;6(9):647-9) 방법으로 라이브러리를 제작하고, 상기 라이브러리를 illumina 社의 HiSeq2000 서열분석기기로 분석하여, 전체 mRNA의 발현을 조사한 다음 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 히트맵 형식으로 유전체 수준에서 분석하였다.
그 결과, 도 7e에 나타낸 바와 같이, A2 의해서 저해되었던 오프-타겟 유전자들의 mRNA 양이 6pi 변형에 의해서 회복되는 것으로 나타났다.
또한, 이렇게 차이를 보이는 오프-타겟 유전자들의 기능을 DAVID 프로그램(Nature Protocol. 2009;4(1):44-57)을 이용하여 GO(gene ontology) 분석을 수행하였더니, 세포 주기에 관련하는 기능을 가진 많은 유전자들이 치명적으로 오프-타겟 효과로 저해되고 있음을 발견하였다. 이렇게 발견된 오프-타겟 효과를 확인하고자, HepG2에 해당 siRNA를 트랜스펙션 한 후, 24시간 동안 배지에 넣어주는 10% 혈청(FBS)을 제거하여 세포 주기를 동일하게 한 후에, 48시간 후에 Propodium Iodide를 이용한 세포주기 분석을 FACS 장비로 실시하였다.
그 결과, 도 7f에 나타낸 바와 같이, A2 siRNA분자를 발현하였을 경우 예상했던 바와 일치하게 세포주기의 이상이 나타났으며, 특히, G1/G2 세포주기 정지가 증가되는 현상이 관찰되었고, 이러한 현상은 6pi 변형을 도입했을 때에는 사라지는 것을 확인하였다.
상기로부터, PCSK9에 대한 siRNA는 예상치 못했던 오프-타겟 효과로 인간 간세포에서 세포주기가 정지되는 부작용을 나타내었고, 이러한 오프-타겟 부작용은 본 발명에 따른 6pi 변형을 도입함으로써 PCSK9에 대한 온-타겟 저해 효율은 유지하면서도 오프-타겟 부작용을 막을 수 있음을 확인하였다.
생쥐에서의 PCSK9 siRNA 의 생체 전달을 통한 오프 - 타겟 효과 및 스페이서 변형 적용시의 개선 효과 평가
상기 실시예 6에서 분석한 PCSK9에 대한 siRNA의 오프-타겟 효과를 생체 내에서 평가하기 위해, 생후 7주된 실험용 생쥐(C57/BL6)를 이용하여 siRNA를 간 조직에 전달한 후 평가를 수행하였다. siRNA의 간 조직 전달은 in vivo-jetPEI (polyplus 社)라는 전달물질을 사용하여, 제공되는 프로토콜에 따라 5mg/kg siRNA를 각각 5마리의 생쥐 꼬리 혈관에 주입(tail-vein injection)하여 전달하였으며, 48시간 후에 생쥐를 희생시키고 혈액과 간 조직을 추출한 후 실험을 실시하였다. 우선, 적출한 간 조직 일부에서 작은 크기의 RNA를 포함하는 (small RNAs) 총 RNA를 miRNeasy 키트 (Qiagen 社)를 사용하여 분리해내고, 여기에서 각각 전달된 siRNA, 그리고 타겟인 PCSK9 mRNA의 양을 qPCR을 통해 측정하였다. siRNA에 대한 측정은 프로토콜(Biotechniques. 2005 Oct;39(4):519-25)에 따라 Poly(A) Tailing Kit (Ambion 社)를 이용하여 수행하였으며, 먼저, RNA의 3'말단에 여러 아데노신을 부착시키고, 특정한 서열을 포함하는 oligo-dT로 Superscript III RT (invitrogen 社) 로 역전사를 시행한 후, oligo-dT에 붙여놓은 특정한 sequence를 인식하는 서열과 측정하고자 하는 siRNA와 동일한 서열을 가지는 DNA 프라이머를 한 쌍으로 해서 SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems 社)로 qPCR를 시행하였다. PCSK9 mRNA 측정은 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 수행하였다. 혈액 총 콜레스테롤 양은 Wako 社의 키트를 이용하여 ELISA 방법을 통해, 제공 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, A2 siRNA를 비롯하여 스페이서 변형을 가한 A2-6pi도 동일하게 간 조직에 전달되었고, PCSK9 mRNA를 저해했으며, 이로 인하여 혈중 총 콜레스테롤을 낮추는 효과를 보이는 것으로 나타났다.
또한, 각각의 siRNA 전달이 확인된 간 조직으로부터 얻어진 총 RNA를 이용하여, 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 RNA-Seq 분석을 수행하였다.
그리고 히트맵으로 표현하여 분석한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 6pi 변형을 사용했을 때의 오프-타겟이 유전체 상에서 줄어드는 것을 확인하였다.
이에 더하여, 실시예 6과 동일한 방법의 GO 분석을 통해 A2 siRNA 오프-타겟으로 저해된 유전자가 어떤 기능을 주로 가지고 있는지를 분석함으로써 이러한 유전자들이 간세포에서의 구리 이온 대사에 역할을 하는 유전자임을 발견하였으며, 이에 따라 예상되는 구리이온 대사 이상 현상을 NCTC clone 1469 (한국세포주은행) 라는 생쥐 간세포를 이용하여 확인해보았다. 즉, NCTC clone 1469에 lipofectamine 2000를 이용하여 대조군, A2, A2-6pi siRNA분자를 트랜스펙션하고 72시간 후에 구리 이온의 양을 QuantiChrom Copper Assay Kit (bio systems)를 사용하여 측정한 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, A2에서는 세포내 구리 이온이 증가하지만 A2-6pi는 증가하지 않다는 사실을 확인하였다. 간세포에서의 구리 이온의 증가는 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 동일하게 대조군, A2, A2-6pi를 NCTC clone 1469에 발현 시킨 후, 72시간 후에 Annexin V: FITC Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen 社) 를 사용하여, 제공 프로토콜에 따라 PI와 annexin V로 염색한 후 FACS로 세포사멸을 측정한 결과, 도 8d에 나타낸 바와 같이, A2의 경우에는 32μM CuSO4를 처리한 결과와 유사하게 세포사멸을 유도했지만, A2-6pi의 경우에는 세포사멸 유도 현상이 사라짐을 관찰하였다.
상기 결과를 통해, PCSK9에 대한 siRNA는 생쥐 생체 내에 주입되어 간세포에서 전달되었을 때 예상치 못했던 오프-타겟 효과로 인해 구리대사 유전자들이 저해되는 것으로 나타났고, 이에 따라 간세포 내의 구리가 증가되어 세포사멸을 유도하는 예상치 못한 부작용을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 생체 내에서도, 이러한 오프-타겟 부작용은 본 발명에 따른 6pi 변형을 도입함으로써 PCSK9에 대한 온-타겟 저해 효율은 유지하면서 오프-타겟 부작용을 우수하게 막을 수 있음을 알 수 있다.
디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환된 치환체와 종래의 오프 -타겟 효과 억제용 변형 치환체의 타겟 유전자 발현 억제 효과 및 오프 - 타겟 효과 비교
상기 실시예 1에서 타겟 유전자 발현 억제 효과와 함께 오프-타겟 효과를 막는 효과를 확인한 본 발명에 따른 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드를 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서(dSpacer)로 치환한 치환체와 종래의 오프-타겟 효과 억제용 변형 치환체의 성능을 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 IC50를 측정하여 비교하였다.
우선, 종래의 오프-타겟 효과를 감소시키기 위한 치환체로, 5'말단으로부터 2번째 내지 8번째 자리에 불일치 염기배열(mismatch)을 도입하는 방법을 적용하여 miR-124의 5'말단으로부터 6번째에 불일치 염기배열(mismatch)을 도입(miR-124-6mm)한 후 IC50를 측정하였다. 그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, miR-124-6mm의 경우 완벽한 상보결합 표적(perfect match target)에 대해서 변형을 가하지 않은 miR-124와 동일하게 우수한 억제 효과를 나타내지만 (둘 다 IC50=0.02nM), 도 9b에 나타낸 바와 같이, miR-124의 발단 결합 표적(seed target, 5'말단으로부터 2번째에서 8번째)에 대해서는 억제하지 못하는 것으로 나타났다.
하지만 미스매치의 도입은 변화된 뉴클레오티드 염기에 따라 새로운 서열을 발단 결합 표적으로 인식할 수 있으므로, 새롭게 다른 발단 매치 서열에 대해 오프-타겟 효과가 일어날 수 있다. 이에, miR-124의 5'말단으로부터 6번째에 미스매치를 도입 한 후에 새롭게 5'말단으로부터 2번째에서 8번째까지 연속된 염기쌍 배열로 인식할 수 있는 발단 결합 표적에 대하여 그 저해 효과를 IC50를 측정하여 조사하였다. 그 결과, 도 9c에 나타낸 바와 같이, 새롭게 5'말단으로부터 2번째에서 8번째까지 연속된 염기쌍 배열로 인식할 수 있는 발단 결합 표적을 변형이 가해지지 않은 miR-124와 동일하게 저해하는 것을 관찰하였다.
또한, 도 9c에 나타낸 바와 같이, IC50 측정 결과 종래의 2'OMe 변형을 miR-124의 5'말단으로부터 6번째 위치에 가했을 때에도 여전히 변형이 가해지지 않은 miR-124와 동일하게 siRNA의 경우 오프-타겟으로 작용할 수 있는 발단 결합 표적을 저해하는 것을 관찰하였다.
상기 결과를 통해, 종래의 미스매치 변형이 5'말단으로부터 6번째에 가해졌을 때, 기존의 발단 결합 표적에 대한 오프-타겟 효과를 막지만 미스매치 도입에 의해서 새롭게 나타나는 발단 결합 표적에 대해서는 여전히 오프-타겟 효과를 나타내는 한계가 있음을 알 수 있다. 또한, 종래의 2'OMe 변형의 경우 5'말단으로부터 6번째에 가해졌을 때에는 오프-타겟을 전혀 감소시키지 못하는 것을 알 수 있다.
다음으로, 5'말단으로부터 6번째 이외의 위치에 종래의 마이크로RNA 유사 오프-타겟을 막는데 효과적이라고 알려진 변형의 효과를 본 발명과 비교해서 알아보기 위해, 5'말단으로부터 2번째 2'OMe 변형(2me)과 5'말단으로부터 7번째 UNA 변형(7UNA)을 miR-124에 적용하여 상기 실시예 1에서 시행했던 동일한 방법으로 IC50를 측정하여 비교 조사하였다. 그 결과, 도 9e에 나타낸 바와 같이, 2me (IC50=0.9nM)과 7UNA (IC50=7.2nM) 모두 변형이 가해지지 않은 miR-124 대비 (IC50=0.7nM) 오프-타겟 효과를 다소 감소시켰지만, 5'말단 6번째에 비염기 디옥시뉴클레오티드를 치환한 본 발명에 따른 변형(6pi)은 완전한 오프-타겟 효과 제거 현상을 관찰하였다.
이에 더하여, 도 9f에 나타낸 바와 같이, 온-타겟 PCSK9 유전자를 억제하는 siRNA인 A2 서열에 7UNA를 가했을 때에도 오프-타겟 효과가 다소 감소했지만 완전히 사라지지는 않는다는 것을 알 수 있었다. 그리고 오프-타겟 효과를 막기 위해 siRNA 이중가닥 구조에서 가이드 가닥의 5'말단으로부터 2번째에 단일 뉴클레오티드 벌지(bulge)가 형성되도록 변형을 가하는 종래의 방법을 A2에 적용하여 그 효과를 살펴본 결과, 마찬가지로 오프-타겟 효과를 다소 감소시키지만 완전히 막지는 못한다는 것을 관찰하였다.
상기로부터, 기존의 오프-타겟 효과 억제 용도의 변형 방법들은 모두 오프-타겟을 다소 감소시키지만 완전히 없애지는 못하는 한계를 지니고 있지만, 본 발명은 오프-타겟 억제 효과를 완전히 막는다는 점을 알 수 있다.
5'말단으로부터 6번째 위치에 염기( base )가 없는 형태로, 5번째와 7번째 뉴클레오티드가 C3 공유결합으로 치환된 siRNA 분자의 타겟 유전자 발현 억제 효과 및 오프 - 타겟 효과 비교
상기 실시예 8에서 관찰된 바와 같이, 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드를 dSpacer로 치환한(6pi) siRNA는 완전하게 오프-타겟 효과를 제거한다는 점에서, 이는 6번째에 염기가 사라져 더 이상 이 부분을 통해서 오프-타겟과 염기 배열을 하지 못하기 때문인 것으로 예상할 수 있다. 따라서 이론적으로 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드에 염기가 존재하지 않는다면, 그 백본이 뉴클레오티드가 아닌 어떠한 변형이라도 그 변형이 단일 뉴클레오티드와 치환될 수 있는 동일한 크기의 스페이서 변형이라면 같은 오프-타겟 제거 효과를 보일 수 있을 것이다. 이에, 본 발명자들은 도 10에 나타낸 도식화된 예와 같이, 도 1의 5'말단으로부터 6번째 위치 dSpacer 치환에서 확장하여, 5'말단으로부터 6번째 위치에 염기(base)가 없는 형태로 골격을 유지하는 최소의 스페이서(spacer)로써 5번째와 7번째 뉴클레오티드가 공유결합하도록 설계하였다. 즉, 6번째 위치에 뉴클레오티드가 차지하는 공간을 유지할 수 있는 스페이서의 최소 크기로서 인산기와 탄소원자 3개(C3 spacer)로 이루어진 변형을 설계하였다. 뉴클레오티드 없이 C3 변형을 최소 기준으로, 염기가 없는 어떠한 형태의 공유결합 변형이든지 5' 말단으로부터 6번째 위치에 적용되면 비염기 뉴클레오티드 치환과 동일하게 온-타겟 억제 효율을 유지하면서 오프-타겟 효과는 완전히 제거하는 효과를 보일 것임을 예상하고 새로운 RNA간섭 유도 핵산을 발명하였다.
우선, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 염기(base)가 없는 형태로 공유결합 시키는 변형 중 가장 최소 형태인 C3 spacer를 선택하였으며, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 이를 miR-124의 5'말단으로부터 6번째 위치에 적용하여(miR-124-6c3) 5번째와 7번째 뉴클레오티드가 공유결합 할 수 있도록 변형한 후에, 온-타겟과 오프-타겟 효과를 알아보기 위해, 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 IC50를 측정하여 비교 조사하였다.
그 결과, 도 11c에 나타 낸 바와 같이, miR-124-6c3(IC50=0.01nM)는 miR-124의 5'말단으로부터 6번째에 dSpace를 치환한 miR-124-6pi(IC50=0.15nM)보다 우수하고, 변형이 되지 않은 miR-124(IC50=0.01nM)와는 동일하게, siRNA의 온-타겟에 해당하는 완전히 상보적인 표적(perfect match)을 효율적으로 저해하는 것을 관찰하였다.
또한, 도 11d에 나타 낸 바와 같이, siRNA의 오프-타겟 효과를 나타내는 발단 결합 표적에 대해서 C3가 miR-124의 5'말단으로부터 6번째에 적용되었을 때 그 유전자 억제 효과가 완전히 사라짐을 관찰하였다.
이에 더하여, 5'말단으로부터 6번째 C3 spacer 변형을 PCSK9 유전자 억제용 siRNA인 A2, MAPK14 유전자 억제용 siRNA인 siMAPK14-1 (Jackson, A.L., et al.,RNA, 12(7): 1179) 및 siRL에 적용하였을 때에도, 도 11e 내지 11j에 나타 낸 바와 같이, IC50 측정을 통해 모두 우수한 온-타겟 억제 효율을 보이면서 오프-타겟 효과를 완전히 막는다는 것을 확인하였다.
상기로부터, siRNA의 5'말단의 5번째와 7번째 뉴클레오티드가 6번째 위치에 염기(base)가 없는 형태로 공유결합이 되어 있는 변형은, C3 spacer의 경우에서 보이는 바와 같이, 그 백본이 뉴클레오티드가 아닌 어떠한 변형이라도 그것이 단일 뉴클레오티드와 치환될 수 있는 동일한 크기의 공유결합 변형이라면 6pi보다 우수하거나 동일하게 온-타겟 억제 효율은 유지하면서, 오프-타겟 억제 효과는 완전히 막는다는 점을 알 수 있다.
3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서로 치환된 siRNA 분자의 유전자 발현 억제 효과와 마이크로 RNA 유사 오프 - 타겟 중 3'말단 보상 결합에 대한 효과 및 온- 타겟 유전자 발현 억제 효과 평가
siRNA 사용시 나타나는 오프-타겟 효과는 마이크로RNA와 같이 주로 발단 위치의 염기 배열을 통하여 타겟 유전자를 인식하여 그 서열과 염기 배열 결합에 의존적으로 일어난다. 마이크로RNA가 생체에서 표적을 인식하는 경우에서, 이러한 발단 결합을 통한 표적 유전자 억제 현상은 발단 부분과 표적과의 결합이 약하게 일어날 시에는 3'말단 부분에서의 추가적인 염기배열을 형성한 3'말단 보상 결합 (3'-compensatory pairing)을 통해서 표적 유전자를 저해하는 현상이 보고되었다(Cell. 2009;136:215-233). 따라서 마이크로RNA 유사 오프-타겟 현상도 이러한 3'말단 보상 결합 기작으로 일부 나타나기 때문에 이것을 막는 방법이 필요하다.
종래의 siRNA는 3'말단으로부터 1번째와 2번째에 디옥시뉴클레오티드 티아민 (dT)을 일반적으로 가지며, 이는 주로 siRNA 이중 중합체에서 돌출(overhang) 구조로 나타난다. dT의 경우에도 RNA의 아데노신(A)과 염기 배열이 가능하기 때문에 이것이 3'말단 보상 결합에 참여하여 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과로 나타날 수 있다. 이에, 이러한 3'말단 보상 결합에 의한 오프-타겟 효과를 막기 위하여, 도 12a에 나타낸 바와 같이, 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드에 염기 배열을 할 수 없는 스페이서 치환 변형을 적용할 수 있다. 즉, 본 발명자들은 3'말단의 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 염기가 없는 스페이서 형태로 dSpacer 또는 C3 spacer 변형을 적용할 경우 기존의 siRNA 이중 구조는 유지하므로 온-타겟 억제 효율은 높으면서도, 3'말단 보상 결합에 의한 오프-타겟 효과는 제거할 수 있다는 점에 주목하고, 본 RNA간섭 유도 핵산을 발명하였다.
이를 위해, miR-124의 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드를 염기가 없는 스페이서 변형 형태로 치환한 후, 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 IC50를 측정하여 온-타겟 효과와 3'말단 보상 결합에 의한 오프-타겟 효과를 조사해 보았다. 그 결과, 도 12b 내지 12c에 나타낸 바와 같이, 변형이 되지 않은 miR-124의 경우 3'말단 보상 결합에 의한 표적을 저해하는 siRNA 오프-타겟 효과를 보였지만, 3'말단의 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 dSpacer 또는 C3 spacer로 치환된 경우에는 이러한 오프-타겟 효과가 완전히 사라지는 것을 관찰할 수 있었다.
이와 같이, siRNA 이중 중합체 구조인 miR-124의 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 염기가 없는 스페이서 변형 형태인 dSpacer (pi) 또는 C3 spacer로 치환된 경우(IC50=0.02nM), 도 12d 내지 12e에 나타낸 바와 같이, siRNA의 온-타겟에 해당하는 완전 상보 결합 표적에 대해서도 변형이 되지 않은 miR-124(IC50=0.02nM)와 동일한 온-타겟 억제 효과를 보였다. 또한, 3'말단으로부터 1번째와 2번째를 스페이서 형태의 dSpacer 또는 C3 spacer로 siRNA인 siMAPK14-1과 siRL에 적용하였을 때에도, 도 12f 내지 12h에 나타낸 바와 같이, 변형이 되지 않은 siRNA와 동일한 온-타겟 억제 효과를 관찰하였다.
상기 결과를 통해, 3' 말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 염기가 없는 공유결합 형태의 변형인 스페이서로 치환된 RNA간섭 유도 핵산은 타겟 유전자에 대한 발현 억제 효과는 유지하면서 3'말단 보상 결합에 의한 오프-타겟 효과를 회피하는 효과를 나타낼 수 있다는 것을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (18)

  1. RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 핵산의 이중가닥 중 하나 이상의 단일가닥에 있어서, 5'말단으로부터 6번째 뉴클레오티드 또는 3'말단으로부터 1번째와 2번째 뉴클레오티드가 스페이서(Spacer)로 치환되는 변형을 적어도 하나 이상 포함하여 오프-타겟 효과를 억제시키는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산으로서,
    상기 스페이서는 비염기 형태로 단일 뉴크레오티드와 동등하게 치환될 수 있는, 비염기 디옥시리보 뉴클레오티드 스페이서 (dSpacer), 비염기 리보뉴클레오티드 스페이서 (rSpacer) 및 탄소수 3인 알킬기로 이루어진 스페이서 (C3 Spacer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 이중가닥 중 변형의 대상이 되는 단일가닥은 RNA 간섭 현상을 일으키는 아고너트(argonaute) 단백질에 결합할 수 있는 능력을 가지는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 치환으로 인한 타겟 유전자의 RNA와의 불일치 염기배열(mismatch base pairing) 또는 삽입으로 인한 융기(bulge) 생성을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 및 asiRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 타겟 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산.
  8. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 유전자 발현 억제용 조성물.
  9. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 함유하는 유전자 발현 억제용 키트.
  10. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 인간 유래 세포 내로 도입 또는 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관(in vitro) 내, 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법.
  11. 삭제
  12. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 인간 유래 세포 내로 도입 또는 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관(in vitro) 내, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 가이드 가닥(guide strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법.
  13. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 인간 유래 세포 내로 도입 또는 발현시키는 단계를 포함하는, 시험관(in vitro) 내, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 인간을 제외한 포유동물의 세포 내로 도입 또는 발현시키는 단계를 포함하는, 세포 내 타겟 유전자의 발현 억제 방법.
  17. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 인간을 제외한 포유동물의 세포 내로 도입 또는 발현시키는 단계를 포함하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 가이드 가닥(guide strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법.
  18. 제1항의 RNA 간섭을 유도하는 핵산을 인간을 제외한 포유동물의 세포 내로 도입 또는 발현시키는 단계를 포함하는, RNA 간섭을 유도하는 핵산의 운반자 가닥(passenger strand)에 의한 오프-타겟 효과를 억제하는 방법.
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