JP2019030312A - オフターゲットを防ぐために変形したｒｎａ干渉を誘導する核酸、遺伝子発現抑制用組成物、遺伝子発現抑制用キット、細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法、オフターゲット効果を抑制する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ターゲット遺伝子の抑制効率は高めながらも、オフターゲット効果は遮断できるように変形させたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）誘導核酸の提供。【解決手段】ＲＮＡ干渉誘導核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端と３’末端の領域を塩基（ｂａｓｅ）のない形態に置換して変形させたＲＮＡ干渉を誘導する核酸。例えば、二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目のヌクレオチドがスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）に置換されたり、または３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換されたりする変形を少なくとも１つ以上含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸であり、前記スペーサは、ヌクレオチド位置の空間を維持することのできる化合物である。【選択図】図１０

Description

本発明は、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸およびその用途に関し、より詳細には、ＲＮＡ干渉誘導核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端と３’末端領域にスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）に置換する変形を含ませたＲＮＡ干渉を誘導する核酸に関する。

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって所望するターゲット遺伝子の発現を抑制する技術として広く使用されているが、不可避な短所として他の遺伝子も非特異的に阻害させるオフターゲット現象が起こり、これによって発生する誤った研究結果および治療副作用に関する心配が大きい。このようなオフターゲット効果は、ＲＮＡ干渉において最も核心的な役割をするアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）タンパク質が、ＲＮＡ干渉を誘導するために人為的に導入させたｓｉＲＮＡを細胞内に存在するマイクロＲＮＡと同じように扱うことによって起こる。このため、これをマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果（ｍｉＲＮＡ−ｌｉｋｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）と呼んでいる。マイクロＲＮＡは、シード位置（ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ；５’末端の２番目から７番目まで）の塩基対合（ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）によって主にターゲット遺伝子を認識してその発現を阻害し、ｓｉＲＮＡも同じ位置であるシード位置の配列に依存的にオフターゲットが起こる。このようなｓｉＲＮＡのマイクロＲＮＡ類似オフターゲット現象は、多くの研究によって既に報告されており（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１（６）：６３５，２００３；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｎａ，１２（７）：１１７９，２００６；Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３（３）：１９９，２００６；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３（１４）：４５２７，２００５；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，１４（５）：８５３，２００８）、シード部分の配列によっては少なければ数百から多ければ約１５００もの遺伝子の発現に影響を及ぼし、ｓｉＲＮＡを利用した表現型スクリーニング過程においては、陽性ｈｉｔのうち３０％までの表現型がこのようなオフターゲットとして現れるほどにその副作用が深刻である。また、マイクロＲＮＡの場合には、シード部分と標的との結合が弱く起こるときには、３’末端部分における補償結合（３’−ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｐａｉｒｉｎｇ）によって標的遺伝子を阻害する現象が報告されていることから（Ｃｅｌｌ．２００９；１３６：２１５−２３３）、マイクロＲＮＡ類似オフターゲット現象もこのようなメカニズムによって現れるものと考えられている。

また、ｓｉＲＮＡによって媒介される広範囲なオフターゲット発現抑制効果を考慮するとき、意図とするターゲットの発現抑制効率は維持させながら、オフターゲットの発現抑制だけを減少させることができるように、ｓｉＲＮＡにいくつかの化学的または構造的変更が任意的に試みられた。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）に研究されて使用される変形は、ｓｉＲＮＡ上のヌクレオチドのリボース環の２’位置にメチル基（２’ＯＭｅ）を追加してオフターゲット効果を減少させるものであって、特に５’末端の２番目位置の２’ＯＭｅ変形は、意図とするターゲットの発現抑制への影響は多少低めではあるが、オフターゲット効果の数および程度をすべて減少させるには効果的なものとして初めて発見された。以後の他の形態の変形としては、ＬＮＡ変形（Ｐｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２００８）や、ＵＮＡ変形（Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１０；３８，５７６１−７３）、単一ヌクレオチドバルジ（ｂｕｌｇｅ）を導入する（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｓｅｐ；１９（９）：１６７６−８７）構造も開発された。しかし、このようなすべての化学的変形は、オフターゲットが起こるのに最も重要となる塩基配列自体に変形が加えられるのではなく、ヌクレオチドバックボーン（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）に加えられるものであるため、根本的な塩基配列には影響を及ぼさない。このような理由により、オフターゲット効果を減少させることはできるが、完全に防ぐことはできず、さらにはオンターゲット（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）抑制効率も減少させてしまうという問題を抱えている。

これにより、本発明者は、従来技術の問題点を解決するために、ターゲット遺伝子の抑制効率は高めながらも、オフターゲット効果は完全に遮断できるように変形させたＲＮＡ干渉誘導核酸を開発することによって本発明を完成した。

したがって、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目のヌクレオチドまたは３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換される変形を少なくとも１つ以上含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む遺伝子発現抑制用組成物を提供することを他の目的とする。

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む遺伝子発現抑制用キットを提供することを他の目的とする。

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させたり、細胞内で発現させたりする段階を含む細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法を提供することを他の目的とする。

さらに、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させたり、細胞内で発現させたりする段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する遺伝子のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）またはパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制する方法を提供することをさらに他の目的とする。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題が上述した課題に制限されることはなく、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者によって明確に理解されるであろう。

上述のような本発明の目的を達成するために、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目のヌクレオチドがスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）に置換されたり、または３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換されたりする変形を少なくとも１つ以上含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を提供する。

本発明の一実施形態において、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸の二本鎖のうち変形の対象となる一本鎖は、一本鎖としてのみ存在し、ＲＮＡ干渉現象を引き起こすｓｓ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｓｉＲＮＡ）のように、アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）タンパク質に結合することのできる能力を持つものであってもよい。

本発明の他の実施形態において、前記スペーサは、ヌクレオチド位置の空間を維持することのできる化合物、好ましくは有機化合物であり、最も好ましくはリン酸基または硫酸基を含む炭化水素鎖であってもよく、前記炭化水素鎖は、少なくとも炭素数３個を有するアルキル基（Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ）であってもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記スペーサは、生体塩基と結合して塩基配列ができないものであってもよく、非塩基形態としては、デオキシリボヌクレオチド（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をバックボーンとするｄＳｐａｃｅｒまたはリボヌクレオチド（Ｒｉｂｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をバックボーンとするｒＳｐａｃｅｒ分子であってもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、置換によるターゲット遺伝子のＲＮＡとのミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）または挿入によるバルジ（ｂｕｌｇｅ）の生成をさらに含んでもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ａｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡなど、干渉現象を引き起こすすべての核酸であってもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記核酸は、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）のように、全体配列と相補的なターゲット遺伝子が生体に存在しない場合には機能を喪失するものであってもよく、このような場合には、ＲＮＡ干渉に関連する対象群として提供してもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記核酸がＲＮＡ干渉によって抑制しようとするターゲット遺伝子は、最も広い意味としては遺伝子を示し、ウイルスを含むすべての生物体で転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）され、ＲＮＡによって媒介されるすべてのコーディング（ｃｏｄｉｎｇ）およびノンコーディング（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）遺伝子であってもよい。

本発明のさらに他の実施形態において、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、ターゲット遺伝子の発現を抑制する用途であってもよく、前記二本鎖は、人為的に組成された形態または生体で再変形したものであってもよい。

本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む遺伝子発現抑制用組成物およびキットを提供する。

また、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させたり、細胞内で発現させたりする段階を含む細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法を提供する。

これに加え、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させる段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）またはパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制する方法を提供する。

さらに、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内で発現させる段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）またはパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制する方法を提供する。

本発明のＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、ＲＮＡ干渉現象によってターゲット遺伝子の発現を抑制するときに発生するオフターゲット効果を防ぐための新たな変形形態の核酸、およびこれを利用したターゲット遺伝子の選択的な発現抑制方法を提供することができる。

本発明に係るＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、ターゲット遺伝子の発現を抑制しながらオフターゲット効果も防ぎ、標的選別性および特異性を備えた新たな変形形態でＲＮＡ干渉誘導核酸を提供することにより、従来のＲＮＡ干渉誘導遺伝子の問題点であるオフターゲットによる不正確性および副作用を解消し、遺伝子発現抑制技法として研究および遺伝子治療に安心して使用することができるという特徴がある。

デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に変形された核酸の遺伝子発現オンターゲット阻害効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果抑制を図式化して示した図である。 デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。 リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）に置換変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。 デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に挿入変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。 リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）に挿入変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を示した図である。 ５’末端基準の６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換変形された形態（６ｐｉ）のｓｉＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子調節機能に及ぼす影響および従来の５’末端の２番目部分の２’ＯＭｅ変形されたｓｉＲＮＡ分子と効果を比較して示した図である。 細胞内でｓｉＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）のオフターゲット効果および本発明によって６ｐｉ変形後のオフターゲット効果を評価した結果を示した図である。 生体内でｓｉＲＮＡ（ＰＣＳＫ９）のオフターゲット効果および本発明によって６ｐｉ変形後のオフターゲット効果を評価した結果を示した図である。 従来のミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ）および２’ＯＭｅ変形が５’末端の６番目部分に適用されたｓｉＲＮＡ形態と、５’末端の２番目部分の２’ＯＭｅ変形、６番目部分のＵＮＡ変形、ｓｉＲＮＡ二重体に２番目の位置にバルジが導入された形態のｓｉＲＮＡ分子に対し、その遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を本発明と比較した結果を示した図である。 ＲＮＡ干渉誘導核酸の一本鎖において、５’末端の６番目が少なくとも炭素数３つを有するアルキル基である炭化水素鎖からなるスペーサに変形されたとき、遺伝子発現オンターゲット阻害効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果抑制を図式化して示した図である。 ５’末端の６番目の位置がアルキル基からなるスペーサ（Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ）に置換されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を評価した結果を示した図である。 ３’末端の１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換変形されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲットのうち３’末端補償結合に対する効果を評価した結果を示した図である。

本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目のヌクレオチドまたは３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換される変形を少なくとも１つ以上含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を提供することを特徴とする。

本発明者は、ＲＮＡ干渉と称される短いＲＮＡによって誘導される遺伝子抑制現象を利用して配列特異的に関心ターゲット遺伝子の発現を効率的に抑制しながらも、オフターゲット効果を完全に防ぐことのできる方法を発見するために研究を重ねた結果、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸の二本鎖のうちいずれか１つの一本鎖において、５’末端位置に、スペーサ形態の非塩基性の単一ヌクレオチドをはじめ塩基のない共有結合が含まれるように変形させることにより、マイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を防ぎながらも、ターゲット遺伝子を効率的に抑制する特異性を備えることを確認したした上に、３’末端領域に、スペーサ形態の非塩基性の単一ヌクレオチドをはじめ塩基のない共有結合変形が含まれるように変形させることにより、３’末端補償結合によって現われるマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果を防ぎながらも、ターゲット遺伝子を効率的に抑制する特異性を備えることを確認することにより、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の一実施形態では、５’末端から６番目の位置におけるスペーサ変形が、オフターゲットがない上に、最も効率的な標的遺伝子抑制を現わすものと確認した。これは、本研究者よりも以前の研究である、マイクロＲＮＡ認識メカニズムに対する新たなモデルである転移核型性モデル（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１９（３）：３２１−７）と一致し、これにより、軸（ｐｉｖｏｔ）と呼ばれる５’末端の６番目の位置の塩基配列が、マイクロＲＮＡ類似オフターゲット認識の核心要素であることを示した。

さらに、前記非塩基性ヌクレオチド変形から確張し、５’末端から６番目の位置のヌクレオチドをスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）に置換させて５番目のヌクレオチドと７番目のヌクレオチドが前記スペーサと共有結合した形態であるときには、オフターゲットがない上に、最も効率的な標的遺伝子抑制を現わすことを確認した。

すなわち、本発明の一実施形態において、５’末端から６番目の位置のスペーサ変形は、すべての種類がオフターゲット効果を完全になくすことができるが、オンターゲット効果においては、スペーサ変形のうち最もサイズが大きいリボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）よりは２’位置の酸素原子がないため、サイズが相対的に小さいデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）がより好ましく、極端的には、サイズが最も小さいスペーサ形態であるアルキル基スペーサ（Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ）でのオンターゲット抑制効果が、変形が加えられない形態と類似して現われることを確認した。このような５’末端の６番目において、小さなスペーサが優れたオンターゲット効果を現わす現象は、従来に報告されたアルゴノートタンパク質とマイクロＲＮＡの構造（Ｓｃｈｉｒｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２、３３６、１０３７−４０）および転移核型性モデルに照らし合わせてみるとき、マイクロＲＮＡが５’末端の６番目の塩基配列以後に標的を抑制するため、構造的および機能的変化を経るという点において一致することが分かった。

本発明の他の一実施形態では、実際に発端位置によって標的を認識して機能を現わすマイクロＲＮＡのうち１つであるｍｉＲ−１２４に本発明の変形を加えた結果、マイクロＲＮＡターゲットの阻害を防ぎ、その機能である神経細胞分化誘導能をなくすものと現われる反面、従来のＤｈａｒｍａｃｏｎ社で開発されたオフターゲット抑制変形である２’ＯＭｅ変形を加えたときには、ｍｉＲ−１２４の機能である神経分化誘導を防ぐことができず、誘電体水準の転写発現の調査においても、その抑制効果が本発明の変形方法に比べて極めて不備であることが確認された。

本発明のさらに他の一実施形態では、ターゲット遺伝子としてレニラルシフェラーゼまたはＰＣＳＫ９遺伝子阻害用ｓｉＲＮＡに対して本発明に係るｓｉＲＮＡ変形を適用し、オンターゲット効果およびオフターゲット効果を調査した結果、優れた効率でガイド鎖によるオフターゲット効果を防ぎ、ターゲットに対する選別能を高める効果を示すことが確認された。特に、血中コレステロール数値を低める用途であるＰＣＳＫ９に対するｓｉＲＮＡの場合、動物モデルであるマウスを対象としたとき、治療的効能であるコレステロール数値の低下が非変形形態のｓｉＲＮＡと同じくらい効果的になされることが確認された。

本発明のさらに他の一実施形態では、ＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡによって現われるオフターゲット現象により、人間の肝細胞であるＨｅｐＧ２では細胞周期の停止を示し、マウスの肝組職では銅イオンの代謝異常による細胞死滅を引き起こす副作用が生じることを発見したが、これを改善するために、本発明に係るｓｉＲＮＡ変形を加えて上述したような副作用およびオフターゲットに対する効果を確認した結果、副作用およびオフターゲット現象はなくなり、本来のターゲットであるＰＣＳＫ９の阻害現象は効果的に維持されることが確認された。

本発明のさらに他の一実施形態では、従来のマイクロＲＮＡ類似オフターゲット抑制方法として提示されたシード部分のミスマッチをマイクロＲＮＡのうち１つであるｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目に導入したとき、ｍｉＲ−１２４の標的認識形態であるシードマッチ（ｓｅｅｄ ｍａｔｃｈ）による標的遺伝子の阻害は抑制するが、ミスマッチの導入によって変形した配列に対する新たなシードマッチに対しては標的として認識して抑制する副作用が依然として存在することが確認され、従来のオフターゲットを抑制するための変形方法である２’ＯＭｅ変形を５’末端から６番目に導入した場合にも、上述したような副作用が依然として存在することが確認された。

本発明のさらに他の一実施形態では、従来にオフターゲットを抑制する変形方法として提示された５’末端から２番目の２’ＯＭｅ変形、５’末端から７番目のＵＮＡ変形、ｓｉＲＮＡ二本鎖構造においてガイド鎖の５’末端から２番目に単一ヌクレオチドバルジ（ｂｕｌｇｅ）が形成されるように変形を加えたとき、すべての場合においてオフターゲットを完全に抑制することはできないが、本発明の場合にはオフターゲットを完全に抑制できたことを確認した。

本発明のさらに他の一実施形態では、５’末端から６番目の位置のヌクレオチドをスペーサに置換させて５番目のヌクレオチドと７番目のヌクレオチドが前記スペーサと共有結合した形態であるときに、ターゲット遺伝子の発現を抑制しながらも、オフターゲット効果も完全に防ぐことができることを確認した。

本発明のさらに他の一実施形態では、ｓｉＲＮＡの３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドを塩基のない形態であるスペーサに置換させたときに、遺伝子発現抑制効果は優れながらも、マイクロＲＮＡ類似オフターゲットのうち３’末端の補償結合によって起こるオフターゲット効果も完全に防ぐことができることを確認した。

上述により、本発明は、ターゲット遺伝子の発現を抑制する、ＲＮＡ干渉誘導核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目の位置のヌクレオチドがスペーサに置換されて５番目と７番目のヌクレオチドが前記スペーサと共有結合していたり、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドが非塩基性ヌクレオチドまたはスペーサに置換されたりすることを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を提供する。

上述において、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、１８〜２３個で構成されるヌクレオチドのガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）、および前記ガイド鎖に相補的なパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）からなる二本鎖であることが好ましく、最も好ましくは２１個のヌクレオチドで構成されてもよいが、これに制限されることはない。ここで、前記二本鎖は、ステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）のヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造をもつ核酸が、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）タンパク質によって幹部分が加工されて二本鎖形態に変形するもの、すなわち、ｓｈＲＮＡが加工されてｓｉＲＮＡ形態をなすものであってもよいが、これは核酸形態によって異なってもよいため、これに限定されることはない。さらに、最適なオフターゲット阻害効果が現れるようにするために、前記核酸は、３’末端に２つのヌクレオチド突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有したり、置換による標的遺伝子のＲＮＡとのミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）または挿入によるバルジ（ｂｕｌｇｅ）生成をさらに含んだりしてもよい。用語「バルジ（ｂｕｌｇｅ）」とは、二本鎖の核酸において、１つ以上のヌクレオチドの導入によってペアリング（ｐａｉｒｉｎｇ）がなされず離れた部分を意味し、ミスマッチ塩基配列とは、一般的に、塩基対の間にワトソン・クリック型塩基配列（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）がなされない場合を意味する。

本発明において、用語「ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ；ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、前記二本鎖のうち標的を阻害する用途として配列が定められた一本鎖部分であって、実質的にアルゴノートタンパク質に主に結合し、アルゴノート複合体が標的遺伝子を認識するようにガイドをする役割をし、関心のあるターゲット遺伝子ｍＲＮＡに実質的にまたは１００％相補的な核酸配列をもつポリヌクレオチドであって、これによってアンチセンス鎖とも呼ばれているが、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡ、またはａｓｉＲＮＡなどの核酸配列と全体または一部が相補的であってもよい。また、用語「パッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ；ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）」とは、前記の二本鎖のうちガイド鎖と二本鎖の構造をなし、ガイド鎖がアルゴノートタンパク質と結合するようにサポートする運搬者の役割をし、標的核酸と実質的にまたは１００％等しい核酸配列をもつポリヌクレオチドであって、これによってセンス鎖とも呼ばれているが、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡ、またはａｓｉＲＮＡなどの核酸配列と全体または一部が等しいポリヌクレオチドを意味する。

本発明において、用語「スペーサ（ｓｐａｃｅｒ）」は、単一ヌクレオチドの代わりにその空間を維持させるための置換体であってもよく、空間を維持させることのできる形態であればいずれか１つに限定されるものではないが、好ましくは有機化合物であってもよく、より好ましくはリン酸基（−Ｈ２ＰＯ４）または硫酸基（−Ｈ２ＰＳＯ４）を含む（連結した）炭化水素鎖であってもよく、最も好ましくは少なくとも炭素数が３であるアルキル基であってもよい。また、前記スペーサは、非塩基形態のヌクレオチドを含むが、このような非塩基ヌクレオチド形態のスペーサとは、一般的に塩基がまったくない形態の単一ヌクレオチド類似体を意味するものであって、ｄＳｐａｃｅｒ、ｒＳｐａｃｅｒを含み、包括的には、ＲＮＡをはじめとするすべての他の生体塩基と結合することのできない形態のすべての変形を意味する。

上述において、二本鎖のうち対象となる一本鎖は、ＲＮＡ干渉現象を引き起こすアルゴノート（ａｒｇｏｎａｕｔｅ）タンパク質に結合することのできる能力を備える。

上述において、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、５’末端から６番目のヌクレオチドがスペーサに置換される上に、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換される変形が共に適用されたものであってもよい。

これに加え、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む遺伝子発現抑制用組成物および／またはキットを提供する。

本発明において、前記「組成物」とは、ターゲット遺伝子の発現を抑制すると同時に、オフターゲット効果を阻害する役割も実行することのできる用途として使用可能な組成物を意味する。

前記「キット」は、ターゲット遺伝子の発現を抑制するためにＲＮＡ干渉を誘導する核酸または前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む組成物が入った容器を含む構成を有し、前記容器は、瓶、筒（ｔｕｂ）、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、封筒（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、チューブ、アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）などのような形態を採択してもよく、これらは部分的または全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイル、ワックスなどによって形成されてもよい。前記容器は、最初には容器の一部であるか、または機械的、接着性、またはその他の手段によって容器に付着することのできる、完全または部分的に分離が可能な栓を装着してもよく、または注射針によって内容物に近づくことのできるストッパが装着されてもよい。前記キットは外部パッケージを含んでもよく、外部パッケージは構成要素の使用に関する使用説明書を含んでもよい。

これに加え、本発明に係るＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、本発明の一実施形態によってターゲット遺伝子の発現を効果的に阻害できることが確認されたため、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させる段階を含む細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法を提供するものであり、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内で発現させる段階を含む細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法を提供するものである。

本発明において、前記ターゲット遺伝子は、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓ）遺伝子であってもよいし、挿入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）であってもよいが、これに限定されることはない。

さらに、本発明に係るＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、ターゲット遺伝子の発現を効果的に阻害すると同時に、オフターゲット効果も防げることが実施形態によって確認されたため、本発明は、前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）またはパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制するための方法であって、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させる段階を含む方法を提供するものである。さらに、本発明は、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）またはパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制するためにＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内で発現させる段階を含む方法を提供するものである。

本発明において、用語「オフターゲット効果（Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔ）」とは、ｓｉＲＮＡは、ガイド鎖と相補的な配列をもつｍＲＮＡの分解を誘導し、該当となるｍＲＮＡの遺伝子発現を抑制する効果を得るために使用するものであるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡのパッセンジャ鎖によって他のｍＲＮＡの分解が発生するようになった場合、パッセンジャ鎖によって発生するこのような予想できない他のｍＲＮＡの分解ないし該当となる遺伝子の発現抑制効果、およびｓｉＲＮＡのガイド鎖が誤ったターゲットとペアリングすることで他のｍＲＮＡの分解が発生するガイド鎖による他のｍＲＮＡの分解ないし該当となる遺伝子の発現抑制効果をすべて含むことを意味する。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施形態を提示する。しかし、後述する実施形態は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、後述する実施形態によって本発明の内容が限定されることはない。

デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
本発明者は、図１の図式化された例のように、アルゴノートタンパク質に結合するすべてのＲＮＡ干渉誘導核酸の５’シード部分を塩基配列ができないスペーサに変形させた場合、ターゲット遺伝子抑制効率（オンターゲット効果）が高いながらも、オフターゲット効果は完全に遮断することができることを予測し、マイクロＲＮＡ認識メカニズムに対するモデルである転移核型性モデル（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２Ｆｅｂ１２；１９（３）：３２１−７）に基づき、５’シードのうち特に軸（ｐｉｖｏｔ）と呼ばれる５’末端の６番目の塩基配列に注目して本ＲＮＡ干渉誘導核酸を発明した。

先ず、本発明に係る変形されたｓｉＲＮＡ分子と既存の変形が加えられていないｓｉＲＮＡ分子によって媒介されるオンターゲットおよびオフターゲット効果を比べるために次のような実験を行った。先ず、ガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）上のシード位置（ｓｅｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）を含む５’末端部分（１番から１１番まで）に塩基配列ができないデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換（ｐｉ）したＲＮＡを合成し、パッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）は変形が加えられていない形態で合成し、既存の構造である１９個の完全相補配列（ｐｅｒｆｅｃｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と共に、３’末端に２個のｄＴ（Ｄｅｏｘｙ Ｔｈｙｍｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の突出部をもつ二本鎖を生成できるように製造した。このようなＲＮＡは、ＳＴ Ｐｈａｒｍａ社、Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、またはＢｉｏｎｅｅｒ社によって化学的に合成され、ＨＰＬＣによって分離し、前記の会社で提供した方法によってガイド鎖とパッセンジャ鎖の二重体（ｄｕｐｌｅｘ）として図１の左側パネル（５’末端の６番目に非塩基性ヌクレオチドに置換した例；６ｐｉ）のように製造された。ここで、対照群（ＮＴ；ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）としては、カエノラブディティス・エレガンス（ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）にだけ発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｃｅｌ−ｍｉＲ−６７の配列をｓｉＲＮＡ形態に合成したものを使用した。

前記変形は、レニラルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクトルに入っているレニラルシフェラーゼ；ＲＬ）を阻害するようにデザインされたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＬ）に適用した。すなわち、前記において二重体で製造された７５ｎＭのｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）にレニラルシフェラーゼを発現させるｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクトルと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用し、製造者のプロトコルにしたがってＨｅＬａ細胞に伝達（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させてその効果を調査した。ｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクトルは、ｓｉＲＬのオンターゲット効果を測定するときにはそのまま使用するが、オフターゲットを調査するときには、ｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクトルのレニラルシフェラーゼ遺伝子をｐＲＬ−ＴＫ（ｐｒｏｍｅｇａ）ベクトルに入っているレニラルシフェラーゼに置換してオンターゲットに作用できないようにした後、３’ＵＴＲ（３’ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）部分にｓｉＲＬのシード部分（５’末端の１番から８番まで）と完全相補的な配列であるシードサイト（ｓｅｅｄ ｓｉｔｅｓ；Ｓｅｅｄ）、または５番から６番の間にバルジが形成されてマイクロＲＮＡと結合する核型性バルジサイト（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｂｕｌｇｅ ｓｉｔｅｓ；Ｎｕｃ）が２度繰り返されるようにＤＮＡを合成して挿入することでＲＬ−Ｓｅｅｄ、ＲＬ−Ｎｕｃを生成して使用した。また、ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌステップトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改質Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し、抗生剤のない完全培地でトランスフェクションを行った。トランスフェクションを行った後、２４時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍを利用して製造社のプロトコルにしたがってルシフェラーゼの活性を測定してｓｉＲＮＡの効果を調査し、レニラルシフェラーゼ活性計測は、ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｌｏｍａｘ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを利用して最低３回以上の反復実験を行い、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）ルシフェラーゼの活性に基づいて標準化して計算した。

その結果、図２ａに示すように、オンターゲット効果を７５ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で測定したとき、ｄＳｐａｃｅｒを５’末端の１番目から１１番目の間に置換するようになれば、６０％以下の活性度（ホタルルシフェラーゼの標準化値と対比）を示すものと現れた。特に、２番目、４番目、５番目、６番目の置換は、変形を加えなかった場合には及ばなかったが、３０％以下に活性度が減少することを示しながらも有意な効果を示した。しかし、マイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果に対し、既存の周知のマイクロＲＮＡ結合位置であるシードサイト（ＲＬ−Ｓｅｅｄ）および核型性バルジサイト（ＲＬ−Ｎｕｃ）を挿入したルシフェラーゼリポータによって測定した場合は、図２ｂに示すように、２番から７番の間にｄＳｐａｃｅｒを置換した場合にのみ、オフターゲット抑制効果がなくなった。

上述により、塩基配列ができない非塩基に変形されたジオキシヌクレオチドスペーサであるｄＳｐａｃｅｒ置換は、５’末端の２番目から７番目の間で置換するようになれば、オンターゲット効果を示しながらも、マイクロＲＮＡ類似オフターゲットはなくなるという効果を示すことが分かった。

また、優れたオンターゲット効果を示した２番〜７番のうちのｄＳｐａｃｅｒ置換ｓｉＲＮＡの効果をさらに詳しく調べるために、多様な濃度でオンターゲット阻害効果を測定してＩＣ ５０（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０）を詳察した結果、図２ｃおよび図２ｄに示すように、５番と６番に置換された場合に効率が最も優れており、特に、オフターゲットがなくなった変形のうち６番に置換された場合に最大抑制効果（Ｉｍａｘ）が最も優れることが確認された。

前記結果は、マイクロＲＮＡ認識のメカニズムに対する新たなモデルである転移核型性モデル（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）に符合され、図２ｅおよび図２ｆに示すように、５’末端のうち特に軸（ｐｉｖｏｔ）と称されている５’末端の６番目の位置の塩基配列がマイクロＲＮＡの標的認識に決定的であるという従来の報告（Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｆｅｂ １２；１９（３）：３２１−７）とも一致している。

これに加え、図２ｇに示すように、反対側であるパッセンジャ鎖によるマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果も、ガイド鎖の５’末端の３番または６番に非塩基性単一ジオキシヌクレオチドの置換によって減少させることができ、完全に防ぐためには、パッセンジャ鎖も同じように５’末端の２番ないし７番の間のヌクレオチドを非塩基変形された単一ヌクレオチドに置換することによって得ることができる。

上述したように、ターゲット遺伝子に対する発現抑制効果およびオフターゲット回避効果面から詳察すると、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖の５’末端から２番目ないし７番目の間の位置に、塩基配列ができないデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換したｓｉＲＮＡ分子を使用することが好ましく、最も好ましくは、６番目の位置にｄＳｐａｃｅｒ置換変形（６ｐｉ）を使用することであることが分かった。

リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）に置換されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
前記実施形態１においてｄＳｐａｃｅｒを利用して確認された事実をリボヌクレオチドバックボーンの類似スペーサであるリボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）で確認するために、オフターゲットがなくなると現れたｓｉＲＬの５’末端の２番から７番までの位置のうち１つをｒＳｐａｃｅｒに置換（ｐｉ−ｒ）した後、前記実施形態１で施行したものと同じ方法によってＩＣ５０を測定してオンターゲット効果を調査した。

その結果、図３ａ〜図３ｃに示すように、５’末端の２番から７番の間にｒＳｐａｃｅｒによって置換された場合すべてにおいて、非変形（ＷＴ）と比べて最小５４％以上の最大阻害効果（Ｉｍａｘ）を現した。そのうち、２番に変形を加えた２ｐｉ−ｒを除くすべてにおいて、６ｐｉに比べてすべてオンターゲット阻害効果が低いことが確認された。例外として、２ｐｉ−ｒは６ｐｉに比べて優れたオンターゲット効果を現したが、実施形態１で施行した方法によってＲＬ−ｓｅｅｄを使用してオフターゲット効果を測定した結果、図３ｄに示すように、依然としてオフターゲットを阻害することが確認された。さらに、７５ｎＭ ｓｉＲＮＡ濃度で各変形のオフターゲット効果を測定した結果、図３ｅに示すように、２ｐｉ−ｒと７ｐｉ−ｒを除いたすべての変形がオフターゲット効果を防ぐことを観察することができた。

上述により、ターゲット遺伝子に対する発現抑制効果およびオフターゲット回避効果面から詳察すると、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖の５’末端から３番目ないし６番目の間の位置に、リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）に置換したｓｉＲＮＡ分子を使用することが好ましく、最も好ましくは、前記実施形態１のように、６番目の位置を非塩基性ジオキシヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換した変形（６ｐｉ）を使用することであることが分かった。

デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）が挿入されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
前記デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）がｓｉＲＮＡのシード部分に備えられるようにする配列構造には、前記実施例１と実施例２のように置換されるようになれば、ｓｉＲＮＡがターゲット遺伝子のＲＮＡと結合するときに非塩基部分がミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）するケースが存在する。さらに、図４ａに示すように、ｄＳｐａｃｅｒをｓｉＲＮＡシード部分に挿入するようになれば、非塩基部分にバルジ（ｂｕｌｇｅ）が生成されるケースも存在する。これにより、ｄＳｐａｃｅｒを挿入した場合に現われるオンターゲットおよびオフターゲット効果の変化を調査した。先ず、前記実施例によってオフターゲットがなくなることを確認したｓｉＲＬの５’末端の２番から７番の間にｄＳｐａｃｅｒを挿入（ｐｉ−Ｉ）した後、前記実施例１と同じ方法によってＩＣ５０を測定してオンターゲット効果を調査した。

その結果、図４ｂに示すように、５’末端の２番から７番の間にｄＳｐａｃｅｒが挿入された場合すべてにおいて、非変形（ＷＴ）に比べて最小１９％以上の最大阻害効果（Ｉｍａｘ）を現した。また、図４ｃおよび図４ｄに示すように、そのうち２ｐｉ−Ｉと３ｐｉ−Ｉを除いたすべてにおいて、６ｐｉに比べてすべてオンターゲット阻害効果が低いことが確認された。例外として、２ｐｉ−Ｉと３ｐｉ−Ｉは６ｐｉに比べて優れたオンターゲット効果を現したが、実施例１で施行した方法によってＲＬ−ｓｅｅｄを使用してオフターゲット効果を測定した結果、図４ｅに示すように、依然としてオフターゲットを阻害することが確認された。さらに、図４ｆに示すように、７５ｎＭ ｓｉＲＮＡ濃度でそれぞれの変形によるオフターゲット効果を測定したときにも、２ｐｉ−Ｉ、３ｐｉ−Ｉ、７ｐｉ−Ｉを除いたすべての変形（４ｐｉ−Ｉ、５ｐｉ−Ｉ、６ｐｉ−Ｉ）がオフターゲット効果を防ぐと観察された。

上述により、ターゲット遺伝子に対する発現抑制（オンターゲット）効果およびオフターゲット回避効果面から詳察すると、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖の５’末端から４番目ないし６番目の間の位置にデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）を挿入したｓｉＲＮＡ分子を使用することが好ましく、最も好ましくは、前記実施例１のように、６番目の位置をｄＳｐａｃｅｒに置換した変形（６ｐｉ）を使用することであることが分かった。

リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）が挿入されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
リボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）がｓｉＲＮＡのシード部分に挿入された変形（ｐｉ−ｒＩ）のオンターゲット効果を調べるために、前記実施例３と同じ方法によってＩＣ５０を測定した。

その結果、図５ａ〜図５ｃに示すように、すべてのシード位置の変形が２６％以上のＩｍａｘを有する優れたオンターゲット効果を現した。特に、２ｐｉ−ｒＩと３ｐｉ−ｒＩは６ｐｉよりも優れたオンターゲット効果を現したが、実施例１と同じ方法によってオフターゲット効果を測定した結果、図５ｄに示すように、依然としてオフターゲットを阻害することが確認された。さらに、７５ｎＭ ｓｉＲＮＡ濃度でそれぞれの変形によるオフターゲット効果を測定したときにも、図５ｅに示すように、２ｐｉ−ｒＩ、３ｐｉ−ｒＩ、７ｐｉ−ｒＩを除いたすべての変形（４ｐｉ−ｒＩ、５ｐｉ−ｒＩ、６ｐｉ−ｒＩ）がオフターゲット効果を防ぐと観察された。

上述により、ターゲット遺伝子に対する発現抑制効果およびオフターゲット回避効果面から詳察すると、ｓｉＲＮＡ分子のガイド鎖の５’末端から４番目ないし６番目の間の位置にリボヌクレオチドスペーサ（ｒＳｐａｃｅｒ）を挿入したｓｉＲＮＡ分子を使用することが好ましく、最も好ましくは、前記実施例１のように６番目の位置をｄＳｐａｃｅｒに置換した変形（６ｐｉ）を使用することであることが分かった。

５’末端基準の６番目のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換変形された形態（６ｐｉ）のマイクロＲＮＡ分子のターゲット遺伝子調節機能の喪失および既存の２’ＯＭｅ変形との効果の比較
本発明に係るスペーサに置換されたｓｉＲＮＡ分子は、従来構造のｓｉＲＮＡ分子が有するマイクロＲＮＡ類似オフターゲットを抑制することを前記実施例１によって確認したため、これをマイクロＲＮＡに適用して確認しようと、ｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目の位置にデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）置換を加えて次のような実験を行った。先ず、人間のｍｉＲ−１２４−３ｐと同じ配列と６番の位置にｄＳｐａｃｅｒによって置換した配列（６ｐｉ）とを合成した後、ｍｉＲ−１２４−５ｐと二重体として製造し、ＨｅＬａ細胞にｍｉＲ−１２４のシードサイト（５’末端から１〜８番目との完全相補配列）を２つ含んだｐｓｉ−ｃｈｅｃｋ２ベクトルを共にトランスフェクションさせた後、前記実施例１と同じ方法によって多様な濃度のマイクロＲＮＡにおけるルシフェラーゼ活性を測定した。

その結果、図６ａに示すように、本発明に係る変形形態である６ｐｉを有するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４−６ｐｉ）は、既存のターゲット認識サイトであるシードサイトを阻害することができないことを確認することができた。さらに、シードサイトの他にも、マイクロＲＮＡのターゲットとして認識されると最近になって知られるようになった核型性バルジサイト（Ｎｕｃ）も、６ｐｉ変形によってマイクロＲＮＡによる阻害影響を受けないことを確認することができた。

また、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉが、実際に非変形形態であるｍｉＲ−１２４によって発現に影響を受ける多様な遺伝子に対する阻害を回避することができるのかを誘電体水準で検証するために、ｍｉＲ−１２４が発現しない細胞であるＨｅＬａ細胞にｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉ、対象群をトランスフェクションさせてそれぞれ発現させた後、２４時間後に全体ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）キットによって抽出し、Ｏｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ社で提供するＲＮＡ−Ｓｅｑという遺伝子配列分析に基づいて遺伝子発現実験を行った。この実験で得られた配列データであるＦＡＳＴＡＱファイルは、ＴｏｐＨａｔ、Ｃｕｆｆｌｉｎｋ、Ｃｕｆｆｄｉｆｆプログラムを使用して順に分析した後、本来のＨｅＬａ細胞における結果に基づいて標準化し、最終的にはログ比（ｌｏｇ２ ｒａｔｉｏ）で示し、Ｃｕｆｆｄｉｆｆで提供する統計分析においてその差が類義すると報告された値のみを採択して分析を行った。

その結果、図６ｂに示すように、発現の阻害と増加が同じように現われる対象群に比べ、ｍｉＲ−１２４を発現させた場合には類義するように阻害される遺伝子が増加したが、６ｐｉ変形が導入された場合には、阻害を現した遺伝子数が著しく減少することが確認された。また、図６ｃに示すように、全体遺伝子別にｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉによる発現変化をヒートマップ（ｈｅａｔ ｍａｐ）形式によってｍｉＲ−１２４に基づいて阻害される程度の順に並べて詳察したとき、ｍｉＲ−１２４に依存的に阻害されていた著しく多くの遺伝子が、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉによっては阻害されないことが確認された。

これに加え、実際に６ｐｉ変形がマイクロＲＮＡのターゲットｍＲＮＡとの結合を防いでこのような現象を現わしたのかを確認するために、マイクロＲＮＡとアルゴノート複合体とが結合するターゲットｍＲＮＡの位置を誘電体水準で次世代配列分析によってすべて見つけ出すことができるＡｇｏ ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰという実験結果と比較分析を実施した。すなわち、ＨｅＬａ細胞にｍｉＲ−１２４をトランスフェクションしてＡｇｏ ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ分析を施行し、ここで得られた配列を分析してすべてのｍＲＮＡにおける結合位置の地図を作成した後、本来のＨｅＬａ細胞に対象群を発現させて得られたＡｇｏ
ＨＩＴＳ−ＣＬＩＰ結果と比較分析することで、ｍｉＲ−１２４を発現させたときに生成されるアルゴノート結合位置を誘電体水準で正確に把握することができた。このようなｍｉＲ−１２４結合位置をｄｅ ｎｏｖｏ Ａｇｏ−ｍｉＲ−１２４ ｃｌｕｓｔｅｒと名付け、このような結合位置のうちｍｉＲ−１２４のシードサイトを有しているターゲットｍＲＮＡを対象に、ｍｉＲ−１２４またはｍｉＲ−１２４−６ｐｉをＨｅＬａ細胞に発現させた後、ＲＮＡ−ｓｅｑによって得られたｍＲＮＡプロファイル結果を阻害される順に累積分布確率（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）によって比較分析した。

その結果、図６ｄに示すように、ｍｉＲ−１２４が結合したターゲットｍＲＮＡの場合には、全体ｍＲＮＡによる発現に比べて統計的に類義するように（ＫＳ ｔｅｓｔ、Ｐ＜０．０１）阻害される現象を現したが、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉの場合には類義しなかった。これにより、ｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目に非塩基変形された単一ジオキシヌクレオチドを置換した変形（ｍｉＲ−１２４−６ｐｉ）は、既存にｍｉＲ−１２４が結合するターゲットｍＲＮＡを阻害することができないことを誘電体水準で確認することができた。

ｓｉＲＮＡのオフターゲットを防ぐために、従来にはＤｈａｒｍａｃｏｎ社で開発された２’ＯＭｅ変形が使用されてきた。これは、該当のガイド鎖のマイクロＲＮＡ類似オフターゲット現象を防ぐために経験的に５’末端から２番目の位置に２’ＯＭｅ変形を加える方法である。本発明者は、本発明に係る変形である６ｐｉと２’ＯＭｅを、レニラルシフェラーゼを抑制するｓｉＲＮＡに適用してオンターゲット抑制効率を多様な濃度で評価し、ＩＣ５０を前記実施例１で使用した同じ方法によって測定した。

その結果、図６ｅに示すように、６ｐｉ変形が２’ＯＭｅよりも優れた抑制効率を現しただけでなく、最大抑制効果にも優れていることを示した。さらに、上述においてＲＮＡ−Ｓｅｑを実行してヒートマップを作成して分析した方法を同じように使用してオフターゲット効果を誘電体水準で評価した結果、図６ｆに示すように、２’ＯＭｅ変形は、ｓｉＲＮＡのオフターゲット抑制現象を６ｐｉほど抑制することができないことを現した。

これに加え、６ｐｉと２’ＯＭｅ変形がマイクロＲＮＡのターゲット現象を防ぎ、その生物学的機能を抑制するほどに効率的であるかを評価するために、神経細胞の分化を促進する機能を備えることで周知のｍｉＲ−１２４に適用し、適用されたマイクロＲＮＡ分子をＮ２ａ細胞（Ｎｅｕｒｏ−２ａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１３１）にトランスフェクションした後、７２時間後に顕微鏡で神経細胞末端構造を形成するかを観察した。

その結果、図６ｇに示すように、２’ＯＭｅ変形が加えられたｍｉＲ−１２４−２ｍｅは依然として神経細胞末端構造を誘導する能力を備えていたが、ｍｉＲ−１２４−６ｐｉはその機能を完全に喪失していた。

したがって、ｓｉＲＮＡオフターゲット遺伝子に対する発現抑制効果面から詳察すると、５’末端の６番目の位置をデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換した変形である６ｐｉは、極めて優れてマイクロＲＮＡ類似オフターゲットに対する結合および抑制効果を避け、これによる生物学的効果まで完全に遮断するという優れた効果を現した反面、従来の２’ＯＭｅ変形は、オンターゲット効率が６ｐｉよりも優れておらず、オフターゲットは少し減少させることができたものの、完全に遮断することができないという限界があることが分かった。

血中コレステロール減少のために開発されたｓｉＲＮＡのオフターゲット効果およびスペーサ変形適用時の改善効果の比較
本発明に係る変形を実験用の目的から治療用の目的に確張することのできるｓｉＲＮＡ配列に適用してその効果を評価しようと、Ａｌｎｙｌａｍ社によって血中コレステロール数値を低めるために肝細胞のＰＣＳＫ９遺伝子をＲＮＡ干渉現象によって阻害しようと開発されたｓｉＲＮＡであるＰＣＳ−Ａ１（Ａ１）、ＰＣＳ−Ａ２（Ａ２）（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８ Ａｕｇ １９；１０５（３３）：１１９１５−２０）を対象にして実験を行った。Ａ１の場合も、実施例１と同じ方法であるルシフェラーゼ活性度測定によって多様な位置に非塩基変形のオンターゲット効果を比較したとき、図７ａに示すように、Ａ１−６ｐｉが最も優れたターゲット遺伝子抑制効率を現したし、図７ｂに示すように、シード序列によるオフターゲット効果も完全に抑制した。Ａ２の場合には、Ａ１と同じ配列を備えるが、免疫反応を引き起こすという問題とＲＮＡの安定化を改善するために、多様な位置に２’ＯＭｅ変形が加えられるが、このようなＡ２ ｓｉＲＮＡ分子でも、実施例１と同じ方法によって測定したルシフェラーゼリポータ活性測定において、図７ｃに示すように、６ｐｉ変形がオフターゲットを防ぐと現われた。さらに、図７ｄに示すように、Ａ２の場合には、６ｐｉ変形が加えられても、非変形形態のＡ２とほぼ類似する水準のオンターゲット抑制効率を、ルシフェラーゼリポータを利用したＩＣ５０測定において現わした。

ＰＣＳＫ９遺伝子に対するｓｉＲＮＡがすべてマイクロＲＮＡ類似オフターゲットを現す現象を、ルシフェラーゼリポータ実験を観察した後、実際にこのようなオフターゲットの効果を肝細胞で確認するために、人間の肝臓癌細胞株であるＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５）を利用して追加の実験を実施した。先ず、ＰＣＳＫ９遺伝子に対するｓｉＲＮＡによってＡ２が効果的にＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの量を減らすのかを確認するために、ＨｅｐＧ２細胞にＡ２、Ａ２−６ｐｉｓｉＲＮＡ分子をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）試薬を利用して該当のプロトコルにしたがってトランスフェクションし、２４時間後にすべてのＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）によって抽出し、該当のプロトコルによってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって逆転写し、ＳＹＢＲ○Ｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によってｑＰＣＲを実行してＰＣＳＫ９のｍＲＮＡを測定し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ値によって標準化した。

その結果、図７ｄの右側のグラフに示すように、Ａ２、Ａ２−６ｐｉの両者とも効果的にＰＣＳＫ９を阻害するというオンターゲット効果を確認した。

この後、すべてのＲＮＡからＮＳＲ ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｓｅｐ；６（９）：６４７−９）方法によってライブラリを製作し、前記ライブラリをｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑ２０００序列分析機器によって分析して全体ｍＲＮＡの発現を調査した後、前記実施例２と同じ方法によってヒートマップ形式によって誘電体水準で分析した。

その結果、図７ｅに示すように、Ａ２よって阻害されたオフターゲット遺伝子のｍＲＮＡの量は、６ｐｉ変形によって回復すると示された。

さらに、このような差を示したオフターゲット遺伝子の機能を、ＤＡＶＩＤプログラム（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（１）：４４−５７）を利用してＧＯ（ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ）分析を行ったところ、細胞周期に関する機能を備えた多くの遺伝子が致命的にオフターゲット効果によって阻害されることを発見した。このように発見されたオフターゲット効果を確認しようと、ＨｅｐＧ２に該当のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、２４時間に渡って培地に入れられる１０％血清（ＦＢＳ）を取り除いて細胞周期を同じようにした後、４８時間後にＰｒｏｐｏｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅを利用した細胞周期分析をＦＡＣＳ装備によって実施した。

その結果、図７ｆに示すように、Ａ２ ｓｉＲＮＡ分子を発現した場合、予想と一致するように細胞周期の異常が現われ、特に、Ｇ１／Ｇ２細胞周期停止が増加するという現象が観察された。このような現象は、６ｐｉ変形を導入したときにはなくなることが確認された。

上述により、ＰＣＳＫ９に対するｓｉＲＮＡは、予想もしなかったオフターゲット効果により、人間の肝細胞では細胞周期が停止するという副作用を示し、このようなオフターゲット副作用は、本発明に係る６ｐｉ変形を導入することにより、ＰＣＳＫ９に対するオンターゲット阻害効率は維持しながらも、オフターゲット副作用を防ぐ可能性があることが確認された。

マウスにおけるＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの生体伝達によるオフターゲット効果およびスペーサ変形適用時の改善効果の評価
前記実施例６で分析したＰＣＳＫ９に対するｓｉＲＮＡのオフターゲット効果を生体内で評価するために、生後７週の実験用マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）を利用してｓｉＲＮＡを肝組職に伝達した後に評価を行った。ｓｉＲＮＡの肝組職伝達は、ｉｎｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）という伝達物質を使用し、提供されるプロトコルにしたがって５ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡをそれぞれ５匹のマウスの尻尾の血管に注入（ｔａｉｌ−ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して伝達し、４８時間後にマウスを犠牲にして血液と肝組職を抽出した後に実験を行った。先ず、摘出した肝組職の一部にある小さなサイズのＲＮＡを含む（ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ）すべてのＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して分離した後、ここでそれぞれ伝達されたｓｉＲＮＡ、そしてターゲットであるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの量をｑＰＣＲによって測定した。ｓｉＲＮＡに対する測定は、プロトコル（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００５ Ｏｃｔ；３９（４）：５１９−２５）にしたがってＰｏｌｙ（Ａ）Ｔａｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を利用して行った。先ず、ＲＮＡの３’末端に多様のアデノシンを付着させ、特定の配列を含むｏｌｉｇｏ−ｄＴによってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に逆転写を施行した後、ｏｌｉｇｏ−ｄＴに付けておいた特定のｓｅｑｕｅｎｃｅを認識する序列と測定しようとするｓｉＲＮＡと同じ序列を備えたＤＮＡプリマとを一対にし、ＳＹＢＲ○Ｒ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によってｑＰＣＲを施行した。ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡ測定は、前記実施例６と同じ方法によって実行した。血液中の総コレステロールの量は、Ｗａｋｏ社のキットを利用してＥＬＩＳＡ方法により、提供プロトコルにしたがって測定した。

その結果、図８ａに示すように、Ａ２ ｓｉＲＮＡをはじめとしてスペーサ変形を加えたＡ２−６ｐｉも同じように肝組職に伝達され、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡを阻害したし、これによって血中の総コレステロールを低める効果を示した。

さらに、それぞれのｓｉＲＮＡ伝達が確認された肝組織から得られたすべてのＲＮＡを利用し、前記実施例５と同じ方法によってＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を行った。

そして、ヒートマップで表現して分析した結果、図８ｂに示すように、６ｐｉ変形を使用したときのオフターゲットが誘電体上から減ることが確認された。

これに加え、ＧＯ分析によってＡ２ ｓｉＲＮＡオフターゲットによって阻害された遺伝子が主にどのような機能を備えているのかを分析することにより、このような遺伝子が肝細胞における銅イオン代謝の役割をする遺伝子であることを発見し、これによって予想される銅イオン代謝の異常現象を、ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ １４６９（韓国細胞株銀行）というマウス肝細胞を利用して確認してみた。すなわち、ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ １４６９にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を利用して対照群、Ａ２、Ａ２−６ｐｉ ｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクションし、７２時間後に銅イオンの量をＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ Ｃｏｐｐｅｒ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した結果、図８ｃに示すように、Ａ２では細胞内の銅イオンが増加するが、Ａ２−６ｐｉでは増加しないという事実が確認された。肝細胞における銅イオンの増加は細胞死滅を誘導するものと知られているため、同じように対照群、Ａ２、Ａ２−６ｐｉをＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ １４６９に発現させた後、７２時間後にＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ：ＦＩＴＣ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＫｉｔＩＩ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を使用し、提供プロトコルにしたがってＰＩとａｎｎｅｘｉｎ Ｖによって染色した後、ＦＡＣＳによって細胞死滅を測定した結果、図８ｄに示すように、Ａ２の場合には３２ｕＭ
ＣｕＳＯ４を処理した結果と類似するように細胞死滅を誘導したが、Ａ２−６ｐｉの場合には細胞死滅の誘導現象がなくなることが観察された。

前記結果により、ＰＣＳＫ９に対するｓｉＲＮＡは、マウスの生体内に注入されて肝細胞に伝達されたとき、予想もしなかったオフターゲット効果によって銅代謝遺伝子が阻害されると現れ、これによって肝細胞内の銅が増加して細胞死滅を誘導するという予想もしなかった副作用が現れることが分かった。しかし、生体内でも、このようなオフターゲット副作用は、本発明に係る６ｐｉ変形を導入することにより、ＰＣＳＫ９に対するオンターゲット阻害効率は維持しながらも、オフターゲット副作用の防止に優れた可能性があることが分かった。

デオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換された置換体と従来のオフターゲット効果抑制用変形置換体のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
前記実施例１において、ターゲット遺伝子発現抑制効果と共にオフターゲット効果を防ぐ効果を確認した、本発明に係る５’末端から６番目のヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドスペーサ（ｄＳｐａｃｅｒ）に置換した置換体と従来のオフターゲット効果抑制用変形置換体の性能を、前記実施例１と同じ方法によってＩＣ５０を測定して比較した。

先ず、従来のオフターゲット効果を減少させるための置換体として、５’末端から２番目ないし８番目にミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を導入する方法を適用し、ｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目にミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を導入（ｍｉＲ−１２４−６ｍｍ）した後、ＩＣ５０を測定した。その結果、図９ａに示すように、ｍｉＲ−１２４−６ｍｍの場合、完全な相補結合標的（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ ｔａｒｇｅｔ）に対して変形が加えられていないｍｉＲ−１２４と同じように優れた抑制効果を現したが（両者ともＩＣ５０＝０．０２ｎＭ）、図９ｂに示すように、ｍｉＲ−１２４のシード結合標的（ｓｅｅｄ ｔａｒｇｅｔ、５’末端から２番目から８番目）に対しては抑制することができないものと現われた。

しかし、ミスマッチの導入は、変化したヌクレオチド塩基に応じて新たな序列をシード結合標的として認識することができるため、新たに他のシードマッチ序列に対してオフターゲット効果が起こる場合がある。これにより、ｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目にミスマッチを導入した後、新たに５’末端から２番目から８番目まで連続した塩基配列として認識することができるシード結合標的に対し、その阻害効果をＩＣ５０を測定して調査した。その結果、図９ｃに示すように、新たに５’末端から２番目から８番目まで連続した塩基配列として認識することができるシード結合標的を、変形が加えられていないｍｉＲ−１２４と同じように阻害することを観察した。

また、図９ｃに示すように、ＩＣ５０測定結果、従来の２’ＯＭｅ変形をｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目の位置に加えたときにも、依然として変形が加えられていないｍｉＲ−１２４と同じように、ｓｉＲＮＡの場合にはオフターゲットとして作用することのあるシード結合標的を阻害することが観察された。

このような結果により、従来のミスマッチ変形が５’末端から６番目に加えられたとき、既存のシード結合標的に対するオフターゲット効果は防ぐものの、ミスマッチ導入によって新たに現われたシード結合標的に対しては、依然としてオフターゲット効果を現わすという限界があることが分かった。さらに、従来の２’ＯＭｅ変形の場合、５’末端から６番目に加えられたときには、オフターゲットをまったく減少させることができないことが分かった。

次に、５’末端から６番目以外の位置に、従来のマイクロＲＮＡ類似オフターゲットを防ぐのに効果的であると知られている変形の効果を本発明と比較して調べるために、５’末端から２番目の２’ＯＭｅ変形（２ｍｅ）と５’末端から７番目のＵＮＡ変形（７ＵＮＡ）をｍｉＲ−１２４に適用し、前記実施例１で施行した同じ方法によってＩＣ５０を測定して比較調査した。その結果、図９ｅに示すように、２ｍｅ（ＩＣ５０＝０．９ｎＭ）と７ＵＮＡ（ＩＣ５０＝７．２ｎＭ）すべて、変形が加えられていないｍｉＲ−１２４と対比（ＩＣ５０＝０．７ｎＭ）してオフターゲット効果は少し減少させたが、５’末端の６番目に非塩基性ジオキシヌクレオチドを置換した本発明に係る変形（６ｐｉ）では、完全なオフターゲット効果の除去現象を観察した。

これに加え、図９ｆに示すように、オンターゲットＰＣＳＫ９遺伝子を抑制するｓｉＲＮＡであるＡ２序列に７ＵＮＡを加えたときにもオフターゲット効果は少し減少したが、完全にはなくならないということが分かった。さらに、オフターゲット効果を防ぐために、ｓｉＲＮＡ二本鎖構造でガイド鎖の５’末端から２番目に単一ヌクレオチドバルジ（ｂｕｌｇｅ）が形成されるように変形を加える従来の方法をＡ２に適用させてその効果を詳察した結果、同じようにオフターゲット効果は少し減少させたが、完全に防ぐことはできないということが観察された。

上述により、既存のオフターゲット効果抑制用途の変形方法はすべて、オフターゲットは少し減少させるが完全になくすことはできないという限界がある反面、本発明は、オフターゲット抑制効果を完全に防ぐことができるという点を知ることができた。

５’末端から６番目の位置に塩基（ｂａｓｅ）がない形態で、５番目と７番目のヌクレオチドがＣ３共有結合に置換されたｓｉＲＮＡ分子のターゲット遺伝子発現抑制効果およびオフターゲット効果の比較
前記実施例８で観察されたように、５’末端から６番目のヌクレオチドをｄＳｐａｃｅｒに置換した（６ｐｉ）ｓｉＲＮＡは完全にオフターゲット効果を取り除くという点において、これは６番目に塩基がなくなり、これ以上この部分を通じてオフターゲットと塩基配列ができなくなるためであると予想することができる。したがって、理論的には、５’末端から６番目のヌクレオチドに塩基が存在しなければ、そのバックボーンがヌクレオチドではない他の変形であっても、その変形が単一ヌクレオチドと置換される同じ大きさのスペーサ変形であれば、同じオフターゲット除去効果を示すようになるであろう。これにより、本発明者は、図１０に示した図式化した例のように、図１の５’末端から６番目の位置をｄＳｐａｃｅｒ置換で確張し、５’末端から６番目の位置に塩基（ｂａｓｅ）がない形態で骨格を維持する最小のスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）として５番目と７番目のヌクレオチドが共有結合するように設計した。すなわち、６番目の位置に、ヌクレオチドが占める空間を維持することのできるスペーサの最小の大きさでリン酸基と炭素原子３個（Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ）からなる変形を設計した。ヌクレオチドなくＣ３変形を最小基準とし、塩基のないあらゆる形態の共有結合変形であっても５’末端から６番目の位置に適用されるようになれば、非塩基性ヌクレオチド置換と同じように、オンターゲット抑制効率を維持しながらも、オフターゲット効果は完全に取り除くことができるという効果を現すものと予想しながら、新たなＲＮＡ干渉誘導核酸を発明した。

先ず、図１１ａに示すように、塩基（ｂａｓｅ）がない形態で共有結合させる変形のうちから最小形態であるＣ３ ｓｐａｃｅｒを選択し、図１１ｂに示すように、これをｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目の位置に適用させて（ｍｉＲ−１２４−６ｃ３）５番目と７番目のヌクレオチドが共有結合できるように変形した後、オンターゲットとオフターゲット効果を調べるために、前記実施例８と同じ方法によってＩＣ５０を測定して比較調査した。

その結果、図１１ｃに示すように、ｍｉＲ−１２４−６ｃ３（ＩＣ５０＝０．０１ｎＭ）は、ｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目にｄＳｐａｃｅを置換したｍｉＲ−１２４−６ｐｉ（ＩＣ５０＝０．１５ｎＭ）よりも優れており、変形していないｍｉＲ−１２４（ＩＣ５０＝０．０１ｎＭ）とは同じように、ｓｉＲＮＡのオンターゲットに該当する完全に相補的な標的（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）を効率的に阻害することが観察された。

さらに、図１１ｄに示すように、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果を示すシード結合標的に対してＣ３がｍｉＲ−１２４の５’末端から６番目に適用されたとき、その遺伝子抑制効果が完全になくなることが観察された。

これに加え、５’末端から６番目のＣ３ ｓｐａｃｅｒ変形をＰＣＳＫ９遺伝子抑制用ｓｉＲＮＡであるＡ２、ＭＡＰＫ１４遺伝子抑制用ｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡＰＫ１４−１（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｎａ，１２（７）：１１７９）、およびｓｉＲＬに適用したときにも、図１１ｅないし図１１ｊに示すように、ＩＣ５０測定によってすべて優れたオンターゲット抑制効率を示しながら、オフターゲット効果も完全に防ぐことができるということが確認された。

上述により、ｓｉＲＮＡの５’末端の５番目と７番目のヌクレオチドが、６番目の位置に塩基（ｂａｓｅ）がない形態で共有結合している変形は、Ｃ３ ｓｐａｃｅｒの場合で示されるように、そのバックボーンがヌクレオチドではない他の変形であっても、それが単一ヌクレオチドと置換可能な同じ大きさの共有結合変形であれば、６ｐｉよりも優れるか同じようにオンターゲット抑制効率は維持しながら、オフターゲット抑制効果も完全に防ぐことができるという点を知ることができた。

３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサに置換されたｓｉＲＮＡ分子の遺伝子発現抑制効果とマイクロＲＮＡ類似オフターゲットのうち、３’末端補償結合に対する効果およびオンターゲット遺伝子発現抑制効果の評価
ｓｉＲＮＡを使用するときに現われるオフターゲット効果は、マイクロＲＮＡのように主にシード位置の塩基配列によってターゲット遺伝子を認識し、その配列と塩基配列結合に依存的に引き起こる。マイクロＲＮＡが生体で標的を認識する場合において、このようなシード結合による標的遺伝子抑制現象は、シード部分と標的との結合が弱く起こるときには、３’末端部分における追加的な塩基配列を形成した３’末端補償結合（３’−ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｐａｉｒｉｎｇ）によって標的遺伝子が阻害されるという現象が報告された（Ｃｅｌｌ．２００９；１３６：２１５−２３３）。したがって、マイクロＲＮＡ類似オフターゲット現象の一部も、このような３’末端補償結合のメカニズムによって現われるため、これを防ぐ方法が必要となる。

従来のｓｉＲＮＡは、３’末端から１番目と２番目にジオキシヌクレオチドチアミン（ｄＴ）を一般的に備えるが、これは主にｓｉＲＮＡ二重重合体から突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）構造として現われる。ｄＴの場合にも、ＲＮＡのアデノシン（Ａ）と塩基配列が可能であるため、これが３’末端補償結合に参加することによってマイクロＲＮＡ類似オフターゲット効果として現われるようになる。これにより、このような３’末端補償結合によるオフターゲット効果を防ぐためには、図１２ａに示すように、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドに塩基配列ができないスペーサ置換変形を適用してもよい。すなわち、本発明者は、３’末端の１番目と２番目のヌクレオチドが塩基のないスペーサ形態としてｄＳｐａｃｅｒまたはＣ３ ｓｐａｃｅｒ変形を適用する場合、既存のｓｉＲＮＡ二重構造は維持することから、オンターゲット抑制効率は高いながらも、３’末端補償結合によるオフターゲット効果は取り除くことができるという点に注目し、本ＲＮＡ干渉誘導核酸を発明した。

このため、ｍｉＲ−１２４の３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドを塩基のないスペーサ変形形態に置換した後、前記実施例８と同じ方法によってＩＣ５０を測定することで、オンターゲット効果と３’末端補償結合によるオフターゲット効果を調査した。その結果、図１２ｂないし図１２ｃに示すように、変形していないｍｉＲ−１２４の場合には、３’末端補償結合によって標的を阻害するｓｉＲＮＡオフターゲット効果を示したが、３’末端の１番目と２番目のヌクレオチドがｄＳｐａｃｅｒまたはＣ３ ｓｐａｃｅｒに置換された場合には、このようなオフターゲット効果が完全になくなるということを観察することができた。

このように、ｓｉＲＮＡ二重重合体構造であるｍｉＲ−１２４の３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドが、塩基のないスペーサ変形形態であるｄＳｐａｃｅｒ（ｐｉ）またはＣ３ ｓｐａｃｅｒに置換された場合（ＩＣ５０＝０．０２ｎＭ）は、図１２ｄないし図１２ｅに示すように、ｓｉＲＮＡのオンターゲットに該当する完全相補結合標的に対しても、変形していないｍｉＲ−１２４（ＩＣ５０＝０．０２ｎＭ）と同じオンターゲット抑制効果を現した。さらに、３’末端から１番目と２番目をスペーサ形態のｐｉまたはＣ３としてｓｉＲＮＡであるｓｉＭＡＰＫ１４−１とｓｉＲＬに適用したときにも、図１２ｆないし図１２ｈに示すように、変形していないｓｉＲＮＡと同じオンターゲット抑制効果が観察された。

このような結果により、３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドが塩基のない共有結合形態の変形であるスペーサに置換されたＲＮＡ干渉誘導核酸は、ターゲット遺伝子に対する発現抑制効果は維持しながらも、３’末端補償結合によるオフターゲット効果を回避する効果も現すことができることが分かった。

上述した本発明の説明は例示に過ぎず、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても、異なる具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。したがって、上述した実施形態は、すべての面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解されなければならない。

Claims (15)

1. ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導する核酸の二本鎖のうち１つ以上の一本鎖において、５’末端から６番目のヌクレオチドまたは３’末端から１番目と２番目のヌクレオチドがスペーサ（Ｓｐａｃｅｒ）に置換される変形を少なくとも１つ以上含むことを特徴とする、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
2. 前記二本鎖のうち変形の対象となる一本鎖は、ＲＮＡ干渉現象を引き起こすアルゴノート（ａｒｇｏｎａｕｔｅ）タンパク質に結合することができる能力を備えることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
3. 前記スペーサは、リン酸基または硫酸基を含む炭化水素鎖であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
4. 前記スペーサは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および炭素数が３であるアルキル基からなる群から選択されるバックボーンであり、塩基配列ができないことを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
5. 前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、置換によるターゲット遺伝子のＲＮＡとのミスマッチ塩基配列（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）または挿入によるバルジ（ｂｕｌｇｅ）生成をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
6. 前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤｓｉＲＮＡ、ｌｓｉＲＮＡ、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｅｎｄｏ−ｓｉＲＮＡ、およびａｓｉＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
7. 前記ＲＮＡ干渉を誘導する核酸は、ターゲット遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸。
8. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む、遺伝子発現抑制用組成物。
9. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を含む、遺伝子発現抑制用キット。
10. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させる段階を含む、細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法。
11. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内で発現させる段階を含む、細胞内ターゲット遺伝子の発現抑制方法。
12. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させる段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制する方法。
13. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内に導入させる段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制する方法。
14. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内で発現させる段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のガイド鎖（ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果
    を抑制する方法。
15. 請求項１に記載のＲＮＡ干渉を誘導する核酸を細胞内で発現させる段階を含む、ＲＮＡ干渉を誘導する核酸のパッセンジャ鎖（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｓｔｒａｎｄ）によるオフターゲット効果を抑制する方法。