KR102193874B1 - 마이크로rna를 억제하는 변형 핵산 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 마이크로RNA의 발단 지역에 상보적으로 결합하는 최소 6개의 염기 배열로 이루어진 마이크로RNA 표적 사이트를 2개 이상 연속적으로 배열하여 마이크로RNA와 강하게 결합할 수 있고, 마이크로RNA 표적 사이트의 사이에 비염기 스페이서(abasic spacer)를 도입하여, 효율적으로 마이크로RNA를 저해할 뿐만 아니라 변형 핵산에 도입된 서열이 의도치 않게 다른 마이크로RNA와 결합하는 것을 막을 수 있는 효과가 있으며, 정규적인 표적 뿐만 아니라 마이크로RNA의 비정규 표적 인식 형태인 융기 표적(nucleation bulge site) 및 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 배열 사이트도 사용 가능하여, 마이크로RNA의 비정규 표적 인식에 의해 일어나는 생물학적 기능만을 선택적으로 저해할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산 및 이의 용도{Modified nucleic acids suppressing microRNA and use thereof}
본 발명은 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산 및 이의 용도에 관한 것으로, 마이크로RNA 에 상보적으로 결합하여 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
RNA 간섭(RNA interference)은 전사후 단계에서 유전자의 발현을 억제하는 현상으로 이를 일으키는 RNA 소재를 세포안으로 도입함으로써 인위적으로 유전자 억제를 유도하여 원하는 타겟 유전자를 저해하는 기술로 널리 사용하고 있다. 이러한 RNA 간섭 현상은 실제로 세포 안에서는 마이크로RNA(miRNA)라 불리우는 ~21개의 염기로 구성된 작은 RNA에 의해서 일어나며, 마이크로RNA는 특히 5' 말단에 위치하는 발단 지역 (seed region, positions 1-8)의 염기 배열을 통해 수백개의 타겟 유전자를 mRNA에서 인식하고 그 발현을 억제하여 생물학적인 기능을 나타낸다.
구체적으로, 자연적으로 존재하는 RNA간섭 유도 핵산인 마이크로RNA는 아고너트 단백질과 복합체를 이룬 후 상보적인 염기배열을 통해 표적과 결합 하는데, 이 때 동물에서 발견되는 마이크로RNA의 경우, 마이크로RNA의 발단 지역(seed region)이라고 불리우는 5’말단 기준 1번째부터 8번째 사이, 가장 중요하게는 5'말단 기준 2번째에서 7번째 사이에서 최소한 6개 이상의 연속적인 염기배열을 표적 mRNA 와 이루게 되면, 그 표적 mRNA의 발현을 억제한다. 상기와 같은 형태의 염기배열이 가장 많이 일어나기에 이러한 표적들은 마이크로RNA의 정규표적(canonical target)이라 정의하며, 이러한 형태의 상보적 염기 배열은 마이크로RNA의 정규적인 생물학적 기능에 있어 매우 중요하다. 하지만 최근에는 마이크로RNA 표적을 실험적으로 시퀀싱할 수 있는 Ago HITS-CLIP과 같은 기술로 인하여, 발단 지역과 같은 정규 표적 인식이 아닌 이러한 규칙에 벗어나는 비정규 표적(noncanonical target)도 많이 있음을 알게 되었다.
마이크로RNA는 표적 mRNA를 인식하여 그 유전자의 발현을 저해함으로써 생물학적 기능을 나타내므로, 마이크로RNA 발단 지역과 상보적으로 배열할 수 있는 염기서열은 마이크로RNA에 표적 mRNA와 경쟁하면서 붙게 되어 마이크로RNA에 의해 유도되는 생물학적 기능을 저해하는 기작으로 응용될 수 있다. 특히 마이크로RNA 중 질병을 유발시키는 기능을 나타내는 경우에는 이를 특이적으로 억제함으로써 치료제로 활용될 수 있다. 이러한 마이크로RNA의 저해제는 일반적으로 마이크로RNA의 전체 서열에 거의 완벽하게 상보적인 서열을 포함하여 마이크로RNA에 특이적으로 염기배열 하여 그 기능을 억제하는 형태로 많이 사용하고 있다. 하지만 이러한 형태는 특정 마이크로RNA를 억제할 수는 있으나, 마이크로RNA가 인식하는 정규적인 표적과 비정규적인 표적을 구별하여 억제할 수는 없으며, 이에 따라 약물로 사용할 경우 생물학적으로 필요한 마이크로RNA의 기능도 모두 억제하는 부작용이 있을 수 있다.
Ebert MS et al, Nat Methods. 2007 Sep;4(9): 721-6
본 발명자들은 연구 끝에, 실제로 마이크로RNA에서 표적을 인식하는 부분은 5’말단 기준 1번째부터 8번째 사이의 발단 지역, 가장 중요하게는 5'말단 기준 2번째부터 7번째 사이의 염기만을 사용하므로, 이러한 발단 지역에 상보적인 서열만을 가지고 있어도 충분히 마이크로RNA와 결합이 가능함을 확인하였다. 이렇게 8개 핵산 정도의 짧은 염기만을 발단 지역에 연속적으로 상보적인 서열로 가지고 있으면, 마이크로RNA의 정규표적 인식만을 경쟁적으로 저해할 수 있을 뿐 아니라, 실제로 이런 짧은 마이크로RNA 결합 사이트가 여러 번 반복해서 동일 분자에 존재하게 되면, 마이크로RNA와 염기배열에 있어서 전체 염기가 상보적인 것 보다 훨씬 강하게 결합할 수 있음을 확인하였다. 실제로 많은 마이크로RNA의 표적 mRNA에서 이러한 짧은 발단 표적 사이트 여러 개가 3’UTR에 연쇄적으로 존재하는 것이 Ago HITS-CLIP 실험에서 관찰되었다.
따라서, 상술한 확인 내용을 토대로 하여, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 마이크로RNA의 표적 인식 규칙에 따라 마이크로RNA와 결합하는 마이크로RNA 표적 사이트로 인식될 수 있는 짧은 염기 서열을 2개 이상 포함하는 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음과 같은 특징을 갖는 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 제공한다.
본 발명은 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산에 있어서,
상기 변형 핵산은 적어도 6개 이상의 뉴크레오티드로 구성된 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고,
상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은
1) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열;
2) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 5번째와 6번째 염기 사이에 융기(bulge)를 포함하는 서열; 또는
3) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열을 상보적으로 포함하는 서열; 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있으며,
상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열 간의 사이에는 적어도 1개 이상의 염기가 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환되는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열;
2) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 5번째와 6번째 염기 사이에 융기(bulge)를 포함하는 서열; 또는
3) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열을 상보적으로 포함하는 서열; 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 서열을 연속으로 배열하는 단계; 및
상기 연속으로 배열한 염기서열간의 사이에 적어도 1개 이상의 염기를 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환하여 연결하는 단계; 를 포함하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 시험관 내(in vitro) 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 마이크로RNA를 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miRNA-1일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 5'-ACAUUCCA-3' (anti-miR-1-seed site; 서열번호 1) 또는 5'- AAAUUCCA-3' (anti-miR-1-7G:A seed site; 서열번호 2) 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 상기 5'-ACAUUCCA-3' 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고, 상기 서열의 전후로 비염기 스페이서(abasic spacer)를 적어도 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 상기 5'- AAAUUCCA-3' 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고, 상기 서열의 전후로 비염기 스페이서(abasic spacer)를 적어도 하나 이상 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은 마이크로RNA의 발단 지역(seed region)에 상보적인 뉴클레오티드를 6 내지 8개 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 발단 지역(seed region)은 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 8번째 사이의 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 비염기 스페이서(abasic spacer)는 염기를 포함하지 않는 비염기 리보핵산 스페이서(rSpacer, rSp), 비염기 핵산 스페이서 (dSpacer), C3 spacer 및 C6 spacer로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 염기가 없는 모든 스페이서 변형의 한 가지일 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 마이크로RNA의 발단 지역에 상보적으로 결합하는 최소 6개의 염기 배열로 이루어진 마이크로RNA 표적 사이트를 2개 이상 연속적으로 배열하여 마이크로RNA와 강하게 결합할 수 있으며, 마이크로RNA 표적 사이트의 사이에 비염기 스페이서(abasic spacer)를 도입하여, 효율적으로 마이크로RNA를 저해할 뿐만 아니라 변형 핵산에 도입된 서열의 경계 부분에서 만들어지는 염기 서열로 의도치 않게 다른 마이크로RNA나 RNA결합 단백질과 결합하여 경쟁적으로 저해하는 것을 막을 수 있는 효과가 있다.
또한, 정규적인 표적 뿐만 아니라 마이크로RNA의 비정규 표적 인식 형태인 융기 표적(nucleation bulge site) 및 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 배열 사이트도 사용 가능하여, 마이크로RNA의 비정규 표적 인식에 의해 일어나는 생물학적 기능만을 선택적으로 저해할 수 있을 것으로 기대된다.
도1은 본 발명에 따른 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산인 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 작용 기작을 도식화해서 나타낸 도면이다.
도2a는 miR-1 및 miR-1의 정규 발단 표적 싸이트(miR-1 seed site)를 나타내며 이를 포함하는 루시퍼라제 리포터(Luc-miR-1-seed)를 표시한 도면이고, 도 2b는 루시퍼라제 리포터를 이용한 miR-1의 정규 발단 표적 효율을 측정한 결과를 나타낸 도면이고, 도 2c는 miR-1의 정규 발단 표적 싸이트를 2개 포함하는 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제 (anti-miR-1-seed(2x))와 대조군(anti-NT(2x))을 나타낸 도면이고, 도 2d는 본 발명에 따른 도 2c의 anti-miR-1-seed(2x) 및 anti-NT(2x)를 miR-1에 적용하였을 때 miR-1의 활성 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도3a 내지 3c는 본 발명에 따른 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제가 심장근육모세포주인 H9c2 세포에서 miR-1의 정규적인 발단(seed) 표적 사이트를 억제하는 효과를 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도4a 및 4b는 마이크로RNA가 발단 지역을 통해 비전형적으로 워블 염기 배열(G:A wobble)을 형성하여 표적 mRNA에 결합 할 수 있다는 사실을 마이크로RNA의 표적 결합 서열인 Ago HITS-CLIP 데이터 분석을 통해 찾아낸 결과를 나타낸 것이고, 4c는 miR-124에 대한 정규 발단 배열 싸이트(canonical seed sites)와 5'말단 기준 4번째 G (4G:A site) 또는 5번째 G를 통한 비정규 G:A 워블 배열 발단 싸이트 (5G:A site) 를 예시로 나타낸 도면이다.
도 5a는 심근경색 환자의 심장 조직에서 수행한 Ago HITS-CLIP 데이터 분석을 간략하게 도식화한 것이고, 도 5b는 miR-1이 발단 지역을 통해 비전형적으로 워블 염기 배열(G:A wobble)을 형성하여 표적 mRNA에 결합 할 수 있음을 확인하여 나타낸 것이며, 도 5c는 miR-1에서 서열 변이가 해당 G:A site에서 일어남을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도6a 내지 6d는 도 5에서 발견한 miR-1의 비전형적 G:A 워블 발단 표적 사이트를 통해 miR-1이 표적 유전자를 억제할 수 있음을 해당 형광 단백질 리포터 분석을 수행하여 심장근육모세포주인 H9c2 세포에서 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도7a 및 7b는 마이크로RNA의 비정규 표적 인식 방식인 융기(bulge) 염기 배열에 대해서 루시퍼라제 리포터 실험을 실시하여 마이크로RNA의 비정규적인 융기(bulge) 염기 배열을 통한 마이크로RNA의 표적 유전자 발현 억제를 miR-124에서 확인하고, 이를 통한 억제제 개발이 가능할 수 있다는 사실을 제시하고자 나타낸 도면이다.
도8a 내지 8c는 miR-1이 발단 서열에서 G:A 워블 배열 표적 억제를 통해 miR-1에서의 기능과는 다르게 심비대증을 유도시킬 수 있음을 1차 심근세포 (primary rat cardiomyocyte)에서 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a는 miR-1의 비정규 G;A 워블 배열 표적 인식만을 저해하기 위한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제 (anti-miR-1-7G:A(2x))를 나타낸 것이고, 도 9b는 miR-1의 비정규 G;A 워블 발단 표적 사이트(miR-1-7 G:A site) 및 이를 포함하는 루시퍼라제 리포터 유전자를 나타낸 것이고, 도 9c는 anti-miR-1-7G:A(2x)가 G:A 워블 배열 표적 유전자를 저해하는 miR-1:G7U에 대해서 저해 효과를 보이는 지를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a는 도 9에서의 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(anti-miR-1-7G:A(2x))가 심장근육모세포주(H9c2)의 세포에 존재하는 miR-1의 비정규 G:A 워블 배열을 억제할 수 있다는 것을 루시퍼라제 리포터 실험으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 10b 및 10c는 이에 따른 생물학적인 효과로써 anti-miR-1-7G:A(2x)에 의해서 심장근육모세포(H9c2)의 크기가 작아지는 현상을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a는 9개의 miR-1의 비정규 G:A 워블 싸이트를 가지고 있는 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(anti-miR-1-7G;A(9x))를 나타낸 것이고, 도 11b는 anti-miR-1-7G;A(9x)를 적용하여 비정규 G:A 워블 싸이트에 의한 유전자 억제 현상을 막을 수 있다는 것을 루시퍼라제 리포터 실험으로 보인 결과를 나타낸 것이고, 도 11c는 이로 인하여 H9c2세포에서 PE 약물에 의한 심근비대 유도 현상이 억제됨을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12a는 miR-1의 비정규 G:A 워블 싸이트 사이에 비염기 스페이스 변형을 가지고 있는 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(anti-miR-1-7G;A(9x))와 비염기 스페이스 변형이 없는 대조군(anti-miR-1-7G;A(9x) NS)의 서열을 나타낸 것이고, 도 12b는 해당 타겟 싸이트 사이에 연결된 접한 부위의 서열에 결합하는 마이크로RNA의 경우에는 의도하지 않게 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제가 이를 억제하는 부작용이 나타나지만, 타겟 싸이트 사이에 비염기 스페이스 변형이 있을 경우에는 그러하지 못한 경우를 나타낸 것이고, 도 12c는 도 12b를 루시퍼라제 리포터 실험으로 증명한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 기존의 마이크로RNA 저해제에서 저해 효과를 높이고자 경쟁적으로 마이크로RNA에 결합할 수 있는 서열을 여러개 배열하게 되는데, 이때 도입된 다중 서열 경계에서 새롭게 생성되는 염기서열의 상보성에 따라 의도하지 않게 다른 마이크로RNA와 결합할 수 있는 부작용이 나타날 수 있다.이에 해당 서열의 배열의 다중성은 계속 증가시킬 수 있으면서도, 경계 서열에 의해 일어나는 부작용을 해결할 수 있는 마이크로RNA 저해제의 개발을 위해 노력한 결과, 마이크로RNA의 발단지역에 상보적인 서열을 가진 마이크로RNA 표적 사이트를 2개 이상 연속으로 포함하고, 마이크로 RNA 표적 사이트 사이에 염기가 없어 염기배열을 하지 못하는 비염기 스페이서(abasic spacer)를 도입한 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 발명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산에 있어서,
상기 변형 핵산은 적어도 6개 이상의 뉴크레오티드로 구성된 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고,
상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은
1) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열;
2) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 5번째와 6번째 염기 사이에 융기(bulge)를 포함하는 서열; 또는
3) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열을 상보적으로 포함하는 서열; 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있으며,
상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열 간의 사이에는 적어도 1개 이상의 염기가 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환되는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 5'-ACAUUCCA-3' 또는 5'- AAAUUCCA-3' 서열을 포함할 수 있으나, 상기 1) 내지 3) 중 어느 하나에 해당하는 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 포함하는 경우라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 상기 5'-ACAUUCCA-3' 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고, 상기 서열의 전후로 비염기 스페이서(abasic spacer)를 적어도 하나 이상 포함하는 변형 핵산을 포함할 수 있으며, 5'- AAAUUCCA-3' 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고, 상기 서열의 전후로 비염기 스페이서(abasic spacer)를 적어도 하나 이상 포함하는 변행 핵산을 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 상기 마이크로RNA의 종류에는 제한이 없으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 마이크로RNA는 miRNA-1일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은 적어도 6개 이상의 뉴클레오티드를 포함하며, 바람직하게 21개 이하의 뉴클레오티드를 포함하고, 가장 바람직하게는 뉴클레오티드를 6 내지 8개 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
마이크로RNA는 실제로 5' 말단에서 1번째부터 8번째 사이의 적어도 6개 이상의 염기 배열 만을 인식하므로, 상기 1번째부터 8번째 사이의 염기 서열에 상보적인 서열만을 가지고 있어도 충분히 마이크로RNA와 결합이 가능하며, 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열이 6 내지 8개의 뉴클레오티드를 포함할 경우, 마이크로RNA의 정규표적 인식만을 경쟁적으로 저해할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함할 수 있고, 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 연속으로 2개 이상 많이 포함할수록 좋을 수 있으며, 예컨대 100개 이하를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은 2개 내지 70개, 2개 내지 50개, 2개 내지 30개, 2개 내지 9개, 9개 내지 30개, 9개 내지 50개, 9개 내지 70개를 연속으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 1개만 포함하는 경우에 비해 2개 연속으로 포함할 경우, 마이크로RNA와 훨씬 강하게 결합할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산이 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 2번 연속으로 포함하는 경우에 비해 9번 연속으로 포함할 경우 더욱 증가된 저해 효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 4-2 참조).
상기 '연속(으로 포함)'은 마이크로RNA 표적 사이트 서열들이 변형 핵산의 단일 가닥에 선형으로 포함됨을 의미하고, 마이크로RNA 표적 사이트 서열 간에 이격하여 포함될 수도 있다.
본 발명에 있어서 상기 연속으로 배열한 마이크로RNA 표적 사이트 서열간의 사이에 적어도 1개 이상의 염기를 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환하여 연결할 수 있고, 바람직하게 1개 이상 많이 치환할수록 바람직하며, 예컨대 10개 이하의 염기를 비염기 스페이서로 치환할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
마이크로RNA의 경우 5' 말단에서 1번째부터 8번째 사이의 6개 내지 8개의 염기 배열만 맞을 경우에도 충분히 결합할 수 있으므로, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산에 도입된 서열이 의도하지 않은 다른 마이크로RNA와 우연히 염기 배열하여 작용할 수 있는데, 상기 비염기 스페이서로 마이크로RNA 표적 사이트 서열 사이에 1개의 염기를 치환할 경우, 마이크로RNA 표적 사이트 서열이 합해져서 새로운 사이트(site)를 만들지 못하도록 하여, 마이크로RNA 표적 사이트에 도입된 서열이 의도치 않게 다른 마이크로RNA와 결합하는 것을 막을 수 있다.
본 발명에서 용어 비염기 스페이서(abasic spacer)는 단일 뉴클레오티드 대신 그 공간을 유지시키기 위한 치환체일 수 있으며, 공간을 유지시킬 수 있는 형태로 이웃하는 뉴크레오티드를 연결시킬 수 있는 것으로 어느 하나에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 유기화합물일 수 있고, 보다 바람직하게는 인산기(-H2PO4) 또는 황산기(-H2PSO4)를 포함하는(연결된) 탄화수소 사슬일 수 있으며, 가장 바람직하게는 적어도 탄소수 3인 알킬기(C3 spacer) 또는 6인 알킬기(C6 spacer)일 수 있다. 또한, 상기 비염기 스페이서는 비염기(abasic) 형태의 뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 비염기 뉴클레오티드 형태의 스페이서는 일반적으로 염기가 전혀 없는 형태의 단일 뉴클레오티드 유사체를 의미하는 것으로서, 비염기 디옥시리보핵산 스페이서(dSpacer), 비염기 리보핵산 스페이서(rSpacer)를 포함하여 포괄적으로는 RNA를 비롯한 모든 다른 생체 염기와 결합할 수 없는 형태의 모든 변형을 의미한다. 본 발명의 구체적 실시예에 따르면, 상기 비염기 스페이서는 리보 뉴클레오티드(Ribo nucleotide)를 백본으로 하는 rSpacer 분자일 수 있다.
본 발명에 있어서, 마이크로RNA 표적 사이트 서열은 마이크로RNA의 발단지역의 염기 서열에 상보적이다.
본 발명에 있어서, 상기 발단 지역(seed region)은 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 8번째 사이의 서열을 의미한다.
본 발명에 따른 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 마이크로RNA의 정규 표적(canonical target) 뿐만 아니라 비정규 표적 인식(non-canonical target recognition) 형태인 융기 표적(nucleation bulge site) 및 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열 사이트도 사용 가능하다.
이 때, 상기 비정규 표적 인식은 마이크로RNA가 표적 mRNA와 결합할 때 마이크로RNA의 발단 지역(seed region)과 정확히 상보관계가 아니더라도 마이크로RNA의 표적으로 인식하는 경우를 말한다.
본 발명에 있어서 상기 융기 표적은 마이크로RNA의 5' 말단에서 5번째 및 6번째 염기에 상보적인 염기 사이에 염기가 융기 모양으로 밀려난 것을 말하는 것으로, 마이크로RNA의 5' 말단에서 5번째까지의 염기와는 모두 상보 관계를 가지고 6번째 염기가 인식하는(마이크로RNA의 5'말단에서 6번째의 염기와 배열되는) 유전자는 상기 마이크로RNA의 5'말단에서 5번째 염기와 상보 관계를 갖는 염기와 바로 연속되는 염기가 아니라, 바로 연속되는 염기는 융기 모양으로 밀어내고, 그 다음에 마이크로RNA와 상보 관계를 갖는 염기가 마이크로RNA의 5'말단에서 6번째의 염기가 인식하는 염기가 되는 경우를 말한다.
본 발명에 있어서 상기 G:A 또는 G:U 워블 염기 배열은 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자의 염기가 A:U, G:C, C:G, U:A의 상보 관계의 배열 외에도 G:A 또는 G:U의 염기 배열을 가지는 것을 말한다.
예컨대, 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자가 G:A의 워블 관계에 있을 때, 특정 마이크로RNA의 염기 : 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자의 염기의 배열은 G:A이며, 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자가 G:U의 워블 관계에 있을 때, 특정 마이크로RNA의 염기 : 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자의 염기의 배열은 G:U이다.
또한, 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자가 G:A의 워블 관계에 있을 때, 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자: 특정 마이크로RNA의 염기 : 특정 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산의 염기는 A:G:A일 수 있고, 마이크로RNA와 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자가 G:U의 워블 관계에 있을 때, 상기 특정 마이크로RNA가 인식하는 표적 유전자 : 특정 마이크로RNA의 염기 : 특정 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산의 염기는 U:G:U일 수 있다.
본 발명에 있어서, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 anti-sense RNA, LNA, PNA, UNA, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, asiRNA, piRNA, 또는 endo-siRNA 등의 핵산 및 핵산 유도체일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 1) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열;
2) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 5번째와 6번째 염기 사이에 융기(bulge)를 포함하는 서열; 또는
3) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열을 상보적으로 포함하는 서열; 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 서열을 연속으로 배열하는 단계; 및
상기 연속으로 배열한 염기서열간의 사이에 적어도 1개 이상의 염기를 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환하여 연결하는 단계; 를 포함하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산의 제조방법을 제공한다.
상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산의 제조방법에 대해서는 상기에서 설명한 내용들과 반복되는 내용이므로 자세한 설명을 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 시험관 내(in vitro) 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 마이크로RNA를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "세포"의 종류는 척추동물, 예컨대 인간을 비롯한 포유동물(인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 소 등), 조류(닭, 타조 등), 양서류(개구리 등), 및 어류, 또는 무척추동물, 예컨대 곤충류(누에, 나방, 초파리 등), 식물, 효모와 같은 미생물 등이 포함되며, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 "도입"은 세포에 핵산을 주입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 것을 말하며, 세포에 핵산을 도입시키는 방법에 있어서는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 인산칼슘을 이용한 형질감염(Graham, FL 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염(Capecchi, MR, Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염(Wong, TK 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법(Neumann E등, EMBO J, 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌(Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 이뤄질 수 있다. 바람직하게, 트랜스펙션에 의할 수 있다. 트랜스펙션 효율은 세포의 종류 뿐만 아니라 세포 배양조건, 트랜스펙션 시약 등에 따라 많은 차이가 날 수 있다
또한, 본 발명은 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 포함하는 유전자 전달 시스템을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "유전자 전달(gene transfer)"은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가질 수 있다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가질 수 있다. 또한, 본 발명에서 유전자 전달 시스템은 다양한 형태로 제작할 수 있으며, 예컨대 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, 플라스미드, 바이러스 벡터 및 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태 등으로 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 포함하는 심근 비대 현상 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 심근 세포에서 심근 비대를 유도하였을 때, miR-1의 정규적인 표적 인식에 의해 심근 세포의 크기가 감소하였으며, G:A 워블 배열을 통한 비정규적 표적 인식에 의해서는 심근 비대를 유도한 세포와 유사한 수준으로 커진 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명에 따른 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 마이크로RNA에 상보적으로 결합하여 마이크로RNA가 표적 mRNA와 결합하는 것을 경쟁적으로 저해할 수 있으며, 상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산인 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 작용 기작은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 마이크로RNA가 발단 서열에서 G:A 워블 배열을 통해 표적 유전자를 억제할 수 있음을 확인하였으며, 루시페라제 리포터에 의한 마이크로RNA의 비정규적인 융기(bulge) 염기 배열 표적 억제를 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 마이크로RNA가 발단 서열에서 G:A 워블 배열 표적 억제를 통해 다른 생물학적 기능을 나타낼 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제에 의한 마이크로RNA의 비정규적 G:A 워블 결합 기능 억제 효과를 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 연쇄 표적 마이크로 RNA 저해제에서 스페이서 변형 도입을 통해 표적 사이트 사이의 연결 서열에 의한 부작용 제거 효과를 확인하였다(실시예 5 참조).
이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 실험예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1. 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제에 의한 마이크로RNA의 정규적 발단 결합 기능 억제 효과 확인
1-1. 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 제조 방법
도 1에 나타낸 예로, 아고너트 단백질에 결합된 마이크로RNA의 염기서열 중 5’말단 기준 1번째부터 8번째까지의 염기서열인 5’-UAAGGCACG-3’가 해당 마이크로RNA(miR-124에 대한 예시)의 발단 염기 서열로서 마이크로RNA는 이를 사용하여 표적 mRNA에 상보적으로 결합한다. 이 때, 마이크로RNA 발단과 상보적으로 배열할 수 있는 8개의 짧은 표적 염기 서열을 2개 이상 도입하여 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산인 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(Tamdem-target miRNA inhibitor)를 제조하면, 마이크로RNA 발단(5’-UAAGGCACG-3’)과 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 5’-UGCCUU-3’ 서열이 완전 상보적으로 배열하게 되고, 이에 따라 실제 표적 mRNA 염기와의 배열이 상대적으로 억제되어 마이크로RNA의 정규 표적 억제 기능이 저해된다. 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 보다 강력하고 효율적인 염기배열을 위해 해당 염기서열(5’-UGCCUU-3’)을 2번 이상 연속적으로 배열하며, 이는 마이크로RNA 발단과 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제 사이에 한번 이상의 염기 배열 결합을 가능하게 한다. 또한 연쇄적으로 배열한 염기서열 (5’-UGCCUU-3’)을 비염기 스페이서로 연결함으로서 해당 염기서열의 경계에서 새롭게 생성되는 연속된 서열로 인한 오프 타겟 저해 효과를 원천적으로 막을 수 있다.
1-2. miR -1의 정규 발단 표적 싸이트에 대한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제 효과 확인
상기 실시예 1-1 에서 나타낸 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 효과를 확인하기 위해, 이를 miR-1에 대해서 적용하였으며, 이 때 miR-1의 표적 유전자 저해 효능을 실험적으로 확인하기 위해서 루시퍼라제 리포터 실험(Luciferase reporter assay)을 수행하였다. 이를 위해 도2a에 나타낸 바와 같이, miR-1의 정규 발단 표적 사이트 (miR-1 seed site)로서 최소 기준인miR-1의 5'말단 기준 2번째부터 8번째까지 연속적으로 상보적인 서열을 포함한 표적 싸이트 서열을 루시퍼라제 리포터 유전자의 3'UTR에 5개 연속적으로 배치하여 루시퍼라제 리포터 벡터(psi-check2, Promega사)를 제작하였다 (Luc-miR-1-seed).
그런 다음, 상기 루시퍼라제 리포터 벡터를 이용하여 miR-1의 농도 변화에 따른 정규적 표적 발단 싸이트(seed site)를 가지고 있는 유전자의 저해능과 함께, 상기에서 제작한 루시퍼라제 리포터 벡터의 작용능을 측정하기 위해서, 여러 농도 (0, 0.01, 0.1, 0.5, 2.5, 15nM)의 miR-1을 세포에 도입시킨 후 루시퍼라제의 활성으로 IC50 (inhibitory concentration 50)을 측정하였다. 해당 농도의 miR-1은 상기 방법으로 제작된 루시퍼라제 리포터 벡터와 함께 HeLa세포(ATCC CCL-2)에 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포에 전달 (co-transfection)시켜 그 효과를 조사하였다. 이 때의 miR-1은 가이드 가닥 (guide strand), 운반 가닥 (passenger strand)의 두개의 핵산서열로 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작한 후, HPLC로 분리하고, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 이중체(duplex)로 제조하여 사용하였다. HeLa 세포는 10 % FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지(Invitrogen)에서 배양하였으며, 트랜스펙션 수행시 항생제 없는 완전배지에서 세포를 배양하였다. 이렇게 트랜스펙션을 수행한 24시간 후, Promega사의 Dual-luciferase reporter assay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하였으며, 이 때 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 promega사의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 3번 이상 반복 실험하였고, 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다.
그 결과, 도2b에 나타난 바와 같이 miR-1의 IC50 값은 2.2nM인 것을 알 수 있었으며, 제작한 루시퍼라제 벡터를 사용하여 miR-1에 의한 표적 유전자의 저해 능력을 정확하게 측정할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 실시예 1-1 에서 나타낸 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 효과를 확인하기 위해서, 이 후 miR-1의 정규 표적인 발단 표적 사이트를 저해하기 위한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제인 anti-miR-1-seed(2x) 를 도2c에 나타낸 서열로 Bioneer사에서 화학적으로 합성한 후, HPLC로 분리하여 제작하였다. 이 때의 염기 서열 및 조성은 다음과 같다 (anti-miR-1-seed(2x): 5’p-dTdT (rSP) ACAUUCCA (rSP) ACAUUCCA (rSP)dTdT-3’, 서열번호 3). 구체적으로, miR-1의 염기서열(5’p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3‘, 서열번호 4) 중, 정규적인 표적을 인식하는 발단 지역 염기서열은 5’-UGGAAUGU-3’이므로, 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 miR-1 발단 지역 염기 서열과 완전 상보적으로 배열하는 염기서열(5’-ACAUUCCA-3’)을 두 번 반복하는 배열을 가지고, 이러한 정규적 표적 서열 사이는 염기를 포함하지 않는 비염기(abasic) 리보핵산인 rSpacer (rSP)로 연결하여, 두 표적 서열이 이웃하면서 그 경계선에서 연속적으로 새로 생길 수 있는 잠재적인 표적 사이트의 생성을 막아, 이로 인한 오프-타겟을 막았다.
상기 방법으로 만든 miR-1 발단 (seed) 표적을 대상으로 한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제 (anti-miR-1-seed)의 서열은 도2c에 나타내었다. 또한, 상기 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 5’말단과 3’말단 끝이 exonuclease의 공격을 받아 세포내에서 분해되는 것을 막기 위해, 양쪽 끝의 2개의 핵산은 디옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide)로 티민(thymine)을 합성하여(dT) 붙였다. 동시에 대조군(control)으로는 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67(NT; non-targeting: 5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA -3', 서열번호 5)의 정규 발단 표적 사이트를 사용하여 동일하게 대조군으로써 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제 (anti-NT (2x)) 를 다음과 같은 서열로 고안하였다 (anti-NT (2x): 5’p-dTdT (rSP) GGUUGUGA (rSP) GGUUGUGA (rSP) dTdT-3’, 서열번호 6). 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제도 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작한 후, HPLC로 분리하여 사용하였다.
또한, 도 2b에 나타낸 IC50 실험을 통해 40%의 표적 유전자 발현 억제를 보이는 1 nM 농도의 miR-1과, 50 nM 농도의 저해제 (anti-miR-1-seed (2x) 또는 anti-NT (2x))를 함께 HeLa세포 (ATCC CCL-2)에 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포에 전달 (co-transfection)시켜 anti-miR-1-seed (2x)의 miR-1의 정규 발단 표적 억제를 저해하는 효과를 조사하였다.
그 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 1 nM 의 miR-1 이 트랜스펙션 되어 관찰된 루시퍼라제 활성값은 miR-1이 트랜스펙션되지 않은 값을 바탕으로 계산된 상대적 루시퍼라제 활성 퍼센트값이 56.58 +/- 4.27로, IC50에서 예상한 바와 유사한 ~ 50% 수준의 루시퍼라제 활성을 보였다. 동일 농도의 miR-1이 50 nM의 anti-NT (2x) 와 함께 도입된 실험군의 상대적 루시퍼라제 활성 퍼센트값은 54.07 +/- 3.89로, miR-1이 조절한 루시퍼라제 활성값과 유의적으로 다르지 않았으며, 따라서 anti-NT (2x)가 주는 저해효과를 관찰할 수 없었다. 반면에 miR-1 과 anti-miR-1-seed (2x) 가 동시에 도입된 실험군의 상대적 루시퍼라제 활성 퍼센트값은 96.43 +/- 8.44로, miR-1이 조절한 루시퍼라제 활성값이 완전히 회복되는 효과를 확인하였으며, 이는 통계적으로 유의 (p= 1.0 x 10-8) 함을 관찰하였다. 상기로부터, anti-miR-1-seed(2x)가 miR-1에 의해서 유도되는 정규 발단 표적 유전자의 저해를 특이적으로 완전히 막을 수 있음을 확인할 수 있었다.
1- 3. 심근세포에서 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제에 의한 miR -1의 심근 세포 수축 기능의 억제 효과 확인
상기 실시예 1-1의 방법으로 제조하고 실시예 1-2에서 마이크로RNA의 저해제로서의 효과를 확인한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제가 마이크로RNA의 생물학적 기능을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해서, 이를 miR-1의 정규 발단 결합 사이트에 적용하였다. 우선 심근세포에서의miR-1을 확인하기 위해, 심장근육모세포주(H9c2)를 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입한 후, miR-1을 도입하고, miR-1의 심근세포에서의 알려진 기능인 세포 크기 축소가 유도되는 지를 관찰하였다. 이 때, 상기 H9c2 세포는 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지(Invitrogen)에서 배양하였으며, 상기 miR-1은 마이크로RNA의 데이터베이스인 miRBase(www.mirbase.org)에 나타난 사람의 miR-1 서열(MIMAT0000416)대로 이중가닥을 Bioneer 사를 통해 화학적으로 합성하고, HPLC로 분리하였다. 또한, 대조군(control)으로는 예쁜 꼬마선충(C.elegans)의 마이크로RNA인 cel-miR-67(MIMAT0000039)의 서열과 동일하게 합성하여 사용하였다. 이후, 합성된 이중가닥의 마이크로RNA는 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체 (duplex)로 제조하였으며, 마이크로RNA의H9c2세포 도입은 RNAiMAX 시약(Invitrogen 사)을 사용하여, 50nM의 마이크로RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 트랜스팩션(transfection)시켜서 그 효과를 48시간 뒤에 조사하였다.
그 결과, 도 3a의 왼쪽 도면에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 miR-1 이 도입된 H9c2세포의 크기가 작아진 것을 관찰하였다. 또한, 이를 정량적으로 이미지J 프로그램 (NIH)을 통해 100개 이상의 세포에서 분석한 결과, 도 3a의 오른쪽 도면에 나타낸 바와 같이 miR-1 이중체가 들어간 세포들의 크기가 대조군 세포에 비교하여, 약 60% 수준으로 작아진 것을 관찰하였다.
또한, 상기에서 miR-1이 심근세포의 크기를 작게 한다는 기능을 H9c2 세포에서 확인한 후, 상기 실시예 1-2에서와 동일하게 miR-1의 발단 지역에 상보적으로 배열할 수 있는 염기 서열 2개를 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(anti-miR-1-seed(2x))로 제작하였고(도 2c), 이를 심장근육모세포주(H9c2)에 트랜스펙션하여 miR-1의 기능을 억제할 수 있는 지 확인하는 실험을 진행하였다.
상기에 기술된 방법과 동일한 실험 방법으로 anti-miR-1-seed(2x)와miR-1을 동시에 각각 25nM의 농도로 함께 트랜스팩션하여 H9c2에 도입하였을 경우, 도 3b및 3c에 나타낸 바와 같이 대조군(control; NT)과 miR-1을 함께 도입한 경우에는 여전히 miR-1이 유도하는 세포 크기 감소를 관찰할 수 있었지만, anti-miR-1-seed(2x)의 경우에는 이러한 효과가 억제됨을 확인하였다.
상기로부터 anti-miR-1-seed(2x)가 miR-1의 기능인 심근세포의 크기를 줄이는 기능을 저해하는 현상이 관찰되었으며, 이로부터 발단 지역으로 인식하는 8개의 염기로 구성된 정규 결합 사이트를 활용하여, 이를 2개 이상 연쇄적으로 배열하였을 때, 마이크로RNA의 정규 표적 억제 기능을 효과적으로 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 마이크로RNA의 발단 지역에서 워블 (wobble) 염기 배열을 허용하는 비정규 표적 사이트의 발견 및 검증
2-1. Ago HITS-CLIP 분석을 통한 대뇌 피질에서 발현되는 마이크로RNA의 비정규 G:A 워블 배열 싸이트 발견
마이크로RNA의 표적을 전사체 수준에서 분석할 수 있는 방법으로는 Ago HITS-CLIP이라는 실험 방법이 개발되어 널리 사용되고 있는데, Ago HITS CLIP 실험은 세포나 조직 샘플에 UV를 조사하여 세포 내에서 RNA와 아고너트 단백질 사이에 공유결합을 유도하고, 이렇게 생성된 RNA-아고너트 복합체를 아고너트를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 면역침강법으로 분리한 다음, 분리된 RNA를 차세대염기서열 (Next-generation sequencing)로 분석하는 방법이다. 이렇게 얻어진 염기서열 데이터는 생물정보학적 분석을 통해서 마이크로RNA의 표적mRNA를 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 그 결합 위치와 서열도 정확하게 분석할 수 있다. Ago HITS-CLIP은 최초로 생쥐의 대뇌피질 조직에 적용되어 뇌 조직에서의 마이크로RNA의 표적에 대한 지도를 작성하였고, 그 이후 지금까지 여러 조직에 해당 방법이 적용되었다. 이러한 여러 Ago HITS-CLIP 분석을 통해 여러 조직에서의 마이크로RNA 결합 위치가 밝혀지게 되었고, 특히 이러한 표적 서열에서 마이크로RNA의 발단 결합과는 유사하지만, 표적 mRNA의 서열에서 다른 형태의 비정규적 결합 표적이 많이 존재한다는 것을 알게 되었다.
밝혀진 비정규적 결합 법칙 중 일부는 기존의 알려진 염기배열 이외에 G:U 염기배열을 통한 워블(wobble)로 존재한다는 것이 관찰되었다. 워블 염기배열은 기존의 염기배열과는 다르게 특정 RNA에서 발견되며, 잘 알려진 G:U 워블은 마이크로RNA의 비정규 표적에서도 배열할 수 있음이 제시되었다. 하지만 이에 비해 결합이 약하며 자주 관찰 되지 않은 G:A 워블의 경우는 특정 RNA에서 염기배열을 형성할 수 있지만 그 외에는 전혀 조사가 되지 않았다. 하지만 마이크로RNA의 발단 서열 같은 경우에는 염기배열의 자유에너지(free energy)가 구조적으로 아고너트 단백질에 의해 안정화되기 때문에 일반적으로 약한 G:A 염기배열이 상대적으로 중요할 수 있다.
이에, 먼저 G:A를 포함한 워블(wobble) 염기배열이 사람 뇌 조직에서의 마이크로RNA 표적에 존재하는지를 확인하기 위해서 사후 뇌 조직의 회백질(gray matter)에 Ago HITS-CLIP을 수행한 데이터를 분석하였다. 이 때의 분석은 Ago HITS-CLIP을 개발했을 때의 방법에 따라 아고너트-마이크로RNA와 함께 결합했던 RNA 서열을 시퀀싱된 FASTQ 파일에서 Bowtie2 프로그램으로 인간 유전체 서열에 배열하여 수행하였다. 또한, 동시에 해당 시퀀싱 결과를 인간 마이크로RNA서열에 배열하여, 해당 뇌 조직에서 아고너트 단백질과 자주 결합하고 있는20 종류의 마이크로RNA(top20 miRNA)도 분석하였다. 최종적으로 상기 방법으로 파악한 top20 miRNA에 대하여 해당 발단(seed) 서열인 5’말단으로부터 2번째부터 8번째까지의 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 정규 표적(canonical target) 사이트를 살펴보았다. 이 때, 도 4a에 나타낸 바와 같이 마이크로RNA 결합위치에 상당히 많은 수의 정규 발단 표적 사이트가 발견됨을 관찰하였다 (중앙값 1292.5사이트, 오차범위+/- 706.62). 이 후, 이러한 마이크로RNA의 발단 염기 서열에서 G:U 또는 G:A 워블 염기배열로 결합할 수 있는 비정규적 표적 사이트가 존재하는 지를 Ago HITS-CLIP 데이터에서 살펴보았다. 이 때 분석에 대한 대조군(Control)으로 마이크로RNA 발단(seed) 염기 서열과 동일한 염기 서열로 인해 염기의 상보적 배열이 불가능한 표적 서열을 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 G:A 워블이 허용된 표적(중앙값 1119.5 사이트, 오차범위+/- 526.48) 과 G:U 워블이 허용된 표적(중앙값 995사이트, 오차범위+/- 523.22) 사이트 모두 대조군(중앙값 891사이트, 오차범위+/- 410.71)에 비해 높은 분포를 보였으며, 특히 G:A 워블이 존재하는 마이크로RNA 표적 사이트는 G:U 워블보다 약 1.1배 더 많이 존재함을 나타내었다.
또한, 뇌조직에서 특이적으로 발현되는 miR-124는 발단 지역에 2개의 G를 5’말단으로부터 4번째와 5번째에 가지고 있어서, 이를 통한 G:U 및 G:A 워블 염기배열을 할 수 있다. 따라서, 이러한 특정 위치의G에 의한 G:A 및 G:U 워블 염기배열을 구별하여 분석해본 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 miR-124의 정규 발단 표적 사이트(Seed site)가 가장 많이 발견되었다 (1,992개). 하지만, 이와 견줄 수 있을 정도로 4번째가 G:U 워블(1,800개)을 이루는 것(4G:A site)을 발견하였으며, 그 다음으로는 G:A 워블(1,542개)을 이루는 것을 관찰하였다. 또한, 5번째의 G도 G:U 워블(1,427개)과 G:A 워블(1,196개)을 이루는 표적 사이트(5G:A site)가 많이 보였으며, 이렇게 조사한 모든 사이트는 대조군의 개수(647개) 보다 모두 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. miR-124에 대한 Seed site, 4G:A site, 5G:A site 의 서열과 염기 배열은 도 4c에 나타내었다. 따라서, 마이크로RNA는 발단지역의 염기서열을 통한 표적 mRNA를 인식할 때, 발단지역을 통한 정규적인 염기배열 뿐만 아니라 비정규적으로 G:U 또는 G:A 워블 염기배열을 허용하며, 이러한 결합을 통해서 표적 mRNA와 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이러한 G:A 워블 염기를 통한 마이크로RNA의 표적 인식은 보고된 바가 없는 새로운 결과이며, 상기에서 관찰한 바와 같이 여러 마이크로RNA에서 비정규적인 표적으로 인식된다는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 심근 경색 환자의 심장조직에서의 Ago HITS-CLIP 분석 결과 miR -1의 비정규 G:A 워블 배열 싸이트 발견
상기 실시예 2-1에서, 사람의 뇌조직에서 얻어진 Ago HITS-CLIP 데이터를 마이크로RNA의 발단지역과 표적mRNA간에 G:A 워블 염기 결합을 분석하여 이들이 비정규 표적으로 존재함을 밝힌 바 있다. 이와 유사하게 심근 경색 환자 (Cardiomyopathy) 6명의 심장 조직에서 얻어진 Ago HITS-CLIP 데이터 (도 5a) 를 분석하여 G:A를 포함한 워블 (wobble) 염기배열이 마이크로RNA 표적에 존재하는지를 살펴보았다. 이 때, 아고너트-마이크로RNA와 함께 결합했던 RNA 서열 시퀀싱 결과를 인간 마이크로RNA서열에 배열하여, 해당 심장 조직에서 아고너트 단백질과 자주 결합하고 있는 마이크로RNA 중 심장-근 조직에서 특이적으로 발현되는 miR-1에 집중하여 해당 발단 지역의 G:A 워블 염기배열을 중심으로 분석을 진행하였다. 특히, miR-1의 발단 지역에는3개의 G를 5’말단으로부터 2번째, 3번째와 7번째에 가지고 있어서 이 3개의 G 염기가 A 와 배열되어 아고너트와 함께 표적 유전자의 mRNA에 결합할 수 있다.
따라서, 이러한 특정 위치의G에 의한 G:A워블 염기배열을 구별하여 분석해본 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 2번의 G:A 워블이 27개 , 3번의 G:A 워블이 19개, 7번의 G:A 워블이 26개 분석 되었으며 이렇게 조사한 모든 싸이트는 대조군의 개수 (9개) 보다 많이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이 때 이전 보고와 동일하게 miR-1의 정규 발단 표적 사이트가 가장 많이 발견되었다(128개). 따라서, 심근 세포에서 가장 많이 발현되는 miR-1은 발단지역의 염기서열을 통한 표적 mRNA를 인식할 때, 발단지역을 통한 정규적인 염기배열 뿐만 아니라 비정규적으로G:A 워블 염기배열을 허용하며, 이러한 결합을 통해서 표적 mRNA와 결합할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
상기의 실시예를 통하여 마이크로RNA가 비정규적으로 G:A 워블 싸이트와 결합하여 표적 유전자 발현을 저해한다는 사실을 확인하였다. 이렇게 기존의 마이크로RNA 발단 서열에 있는 G를 통해서 워블 배열로 표적 mRNA의 A와 결합하는 것이 마이크로RNA의 기능을 바꾼다면, 이러한 기작이 질병에서 마이크로RNA의 서열 변이를 통해 나타날 수 있다고 예상되어, 심근경색 환자의 심장 조직에서 Ago HITS-CLIP을 수행한 결과에서 아고너트와 결합한 마이크로RNA의 서열을 분석하여, miR-1의 G서열이 T로 바뀐 경우가 있는지를 확인해 보았다. miR-1의 발단 지역에서 miR-1의 5’ 말단기준 20번까지의 염기 중에서의 모든 변이를 분석해본 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 miR-1의 5'말단 기준 2번째, 3번째, 7번째, 12번째, 15번째의 G가 T로 변한 경우가 있음을 관찰하였다. 특히 발단 지역의 2번째, 3번째, 7번째의 G가 다른 변이보다 높은 빈도로 T로 바뀌어 시퀀싱되어 있는 것은 해당 위치의 G가 표적 유전자 mRNA를 인식할 때, 기존의 miR-1의 서열이 비정규적으로 G:A 워블 배열을 통해 표적 mRNA와 배열되는 것에서 확장되어 심근 경색 질병에서는 아예 G가 U로 변이되어 기존의 비정규 G;A 워블 배열을 기존의 정규 발단 표적 사이트로 바꾸는 것임을 알 수 있었다.
2-3. 심근세포의 miR - 1발단 서열에서의 G:A 워블 배열을 통한 표적 유전자의 발현 억제 확인
상기 실시예 2-1과 2-2에서 마이크로RNA가 비정규적으로 발단지역에서 G:A 워블 배열을 허용하여 표적 mRNA와 결합할 수 있다는 사실을 발견한 후, 이러한 결합이 실제로 표적 유전자의 억제를 일으킬 수 있는지를 세포수준에서 확인하는 리포터 실험을 진행하였다. 이 때, 확인 실험은 심장근육모세포주인 H9c2와 같이 근육계 세포에서 많이 발현되는 것으로 알려지고 실시예 2-2에서 확인한 miR-1을 대상으로 진행하였으며, 특히 miR-1의 5’말단으로부터 7번째에 존재하는 G에 주목하여, 이를 통한 G:A 워블 염기배열을 대상으로 수행하였다. 마이크로RNA에 의한 유전자 억제는 보다 정밀하게 개별 세포 수준에서 측정하기 위해서 형광 단백질 발현 리포터 시스템을 구축하여 사용하였다. 형광 단백질 발현 리포터 시스템은 두가지 색의 형광단백질이 하나의 벡터에 발현되게 구성되었으며, 이때 SV40 프로모터에는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP)이 발현되게 하고, 그 3'UTR (3'untranslated region) 부분에 마이크로 RNA의 표적 사이트를 여러 개 연속적으로 배열하여, 녹색 형광 단백질의 세기를 통해 마이크로RNA에 의한 유전자 억제 효과를 측정할 수 있도록 하였으며, 동시에 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein: RFP)은 Tk 프로모터에 의해 발현되도록 하여 그 세기 정도로 녹색 형광 신호를 표준화하여 사용하였다 (도 6a).
상기와 같이 구축된 형광 단백질 발현 리포터 벡터에 miR-1의 5’말단으로부터 2번째부터 8번째까지 염기에 대해서 상보적이면서, 7번째 염기인 G에 대해서는 G:A 워블로 염기배열하는 비정규 표적 사이트(7G:A-site)(5'p-AAAUUCCA-3', 서열번호 2) 를 삽입하여 리포터를 제작한 후 (GFP-7G:A site), 이것이 miR-1에 의해서 억제되는지를 실험을 통해 확인하였다. 이 때 실험은, 500ng GFP-7G:A site 리포터 벡터와 25nM의 miR-1을lipofectamine 2000(Invitrogen 사) 시약을 이용하여 회사에서 제공하는 프로토콜에 따라 심장근육모세포주인 H9c2에 동시에 도입(co-transfection)하였고, 24시간 후 유세포분석기 (Life Technologu사의 Attune NxT)를 통해 각각의 형광 신호를 측정하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 miR-1의 발현에 의해서 miR-1의 7G:A 사이트가 매우 효율적으로 억제되는 것을 대조군 핵산(cont; NT)을 도입한 세포와 비교하여 확인하였다. 즉, 심장근육모세포주인 H9c2 에서 두가지 형광 단백질의 발현 정도에 따라 네부분 (Q5-1, Q5-2, Q5-3, Q5-4)으로 분석한 결과 miR-1이 도입된 세포의 경우, 대조군 핵산이 도입된 경우보다 103 세기의 적색 형광 단백질과 103 세기의 녹색 형광 단백질을 보이는 세포의 분포가 59.51% (control: Q5-3)에서 41.80 % (miR-1: Q5-3)로 감소된 것을 관찰하였다.
상기로부터 GFP-7G:A site 리포터 벡터는 miR-1의 도입 없이도 H9c2 세포에서 어느 정도 억제되고 있는 것이 대조군에서 관찰되었다. 이것은 H9c2 세포내에서 이미 발현되고 있는 miR-1에 의해서 리포터 표적 mRNA와의 G:A 워블 염기 배열을 통해 억제되는 것으로 예상할 수 있다. 상기 내용을 확인하기 위해서 H9c2 세포 내의 miR-1의 발현을 억제할 수 있는 miRIDIAN microRNA Hairpin inhibitor (miR-1 inhibitor)를 Dharmacon사로부터 구입하여 50nM 농도로 세포에 트랜스펙션 시켜 사용하였다.
그 결과, 대조군에 비해 miR-1 inhibitor를 도입한 경우, 103 세기의 적색 형광 단백질과 103 세기의 녹색 형광 단백질을 보이는 세포의 분포가 81.56% (miR-1 inhibitor: Q5-3) 로 증가하는 것으로 보아, 세포내에 존재하는 miR-1이 miR-1의 7G:A 사이트를 통해 유전자 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
또한, 형광 단백질 발현 리포터에 마이크로RNA 표적 사이트를 넣지 않은 대조군(GFP-no site)과 miR-1의 7G:A 사이트가 들어간 리포터인 GFP-7G:A site를 H9c2 세포에 도입하여 그 활성을 비교하여 확인하였으며, 양성 대조군으로는 miR-1을 함께 도입한 경우와 정량적으로 비교하여 확인하였다. 이 때의 분석은 유세포분석기에서 측정한 적색 형광 단백질(RFP) 값을 구간별로 나누고, 이때의 녹색 형광 단백질(GFP) 값을 평균을 내어 로그 비율로 변환하였으며, 대조군인 GFP-no site의 녹색 형광 단백질 수치를 1로 두고(relative log GFP) 상대적으로 계산하였다.
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 mR-1 과 7번 G 염기에 대해, G:A 워블(wobble) 을 통해 상보적으로 염기 배열되는 사이트가 있는 경우(GFP-7G:A site), 특히 1.5~2.5값의 적색 형광 단백질의 발현(log RFP) 이 보이는 구간에서, G:A 워블(wobble) 을 통한 녹색 형광 단백질의 발현(relative log GFP)이 1보다 12.5% 정도 낮아지는 것을 확인하였다. 이러한 억제는 양성 대조군에서는 특히 1.5~2.5 구간의 적색 형광 단백질의 발현 (log RFP)에서 40%~25% 정도 녹색 형광 단백질의 발현 (relative log GFP) 이 억제되는 패턴과 동일하게 나타나는 점을 관찰하였다.
상기에서 관찰한 결과가 해당 형광 단백질 리포터에서 사용한 서로 다른 프로모터의 세기와 두가지 다른 형광단백질이 가지는 형광 활성도의 차이에 의해서 영향을 받지 않음을 확인하기 위해서, 두개의 형광 단백질을 서로 바꿔져 있는 형광 단백질 리포터인 p.UTA.3.0을 Addgene(plasmid # 82447)으로부터 구입하여 사용하였다. 이때 리포터 실험은 p.UTA.3.0 벡터에서 SV40 프로모터에 의해 조절되는 적색 형광 단백질(red fluorescent protein: RFP)의 3’ UTR 부분에 miR-1-7G:A 서열을 5번 반복하여 삽입한 후 리포터 벡터(RFP-7G:A site)를 제작하여 진행하였으며, 이때 적색 형광 단백질 발현 수치는 Tk 프로모터로 발현되는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 값을 세포내에 도입된 정도를 반영한 표준화로 사용하여 변형하여 사용하였다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 상기와 동일하게 miR-1의 7G:A 사이트가 H9c2에서 발현되는 miR-1에 의해서 억제되는 것을 miRNA 표적 위치가 없는 리포터 (RFP-no site)의 대조군과 miR-1의 7G:A site가 들어간 리포터(RFP-7G:A site)의 결과를 비교하여 확인하였으며, 동시에 도 6d에 나타낸 바와 같이 양성 대조군이 miR-1과의 co-transfection 에서도 상기 도 6b에 나타낸 결과와 같이 miR-1-7G:A 싸이트를 억제하는 현상을 관찰하였다.
상기로부터, Ago HITS-CLIP 분석을 통해 발견한 마이크로RNA의 비정규 표적이 실제로 마이크로RNA의 발단 서열에서 G:A 워블 배열을 통해 결합할 수 있을 뿐 아니라, 해당 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 이러한 점으로 미루어 볼 때, G:A 워블 배열을 통한 표적 사이트를 이용하여 마이크로RNA와 충분히 결합할 수 있으며, 이러한 결합이 경쟁적으로 이루어져 마이크로RNA를 억제할 수 있다면, G:A 워블을 통한 비정규적 표적 억제에 의한 마이크로RNA의 생물학적 기능만을 저해할 수 있음을 유추할 수 있었다.
2-4. 루시페라제 리포터에 의한 마이크로RNA의 비정규적인 융기(bulge) 염기 배열 표적의 발현 억제 확인
마이크로RNA는 발단 지역의 연속적인 염기배열을 통한 정규적인 표적 인식 이외에 비정규적으로 표적을 인식하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 특히 마이크로RNA의 발단 지역과 표적 mRNA가 배열되었을 때, 마이크로RNA의 5’말단으로부터 5번째와 6번째 사이에서 표적mRNA가 융기를 이루는 형태가 존재한다는 것이 보고되었다. 특히 이러한 융기 표적이 miR-124에서 발견되었을 때, 5번과 6번째 사이에 G가 융기를 이루는 것으로 확인되었으나, 이러한 표적이 기존에 알려진 발단 배열을 통한 정규 표적에 비해서 얼마만큼 표적 유전자의 발현을 억제하는지는 알려져 있지 않았다.
상기와 같이 융기를 형성하는 염기배열과 마이크로RNA가 기능적으로 활성화 될 수 있는 정도로 결합할 수 있는지를 확인하기 위해서, 루시퍼라제 리포터를 사용하여 조사하였다. 이 때 사용한 정규 표적 발단 사이트(seed site)는 도 7a의 상단 도면에 나타낸 바와 같이 miRNA-124(5'- UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA-3', 서열번호 7)의 발단 서열중 5’말단으로부터 2-7번째의 염기 서열인 5’-AAGGCAC-3’에 완벽하게 상보적인 5`-GUGCCUU-3’(miR-124-seed site, 서열번호 8)이며, 루시퍼라제 리포터 벡터(psi-check2,Promega사)에 있는 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'UTR (3'untranslated region) 부분에 2번 연속 배열로 삽입하였다. 또한, 도 7a의 하단 도면에 나타낸 바와 같이 5’말단 기준 6번째 염기와 상보적으로 배열할 수 있는 염기서열이 발단 사이트 표적의 5번과 6번 사이에 융기 (bulge)로 존재하는 경우인 융기 사이트는 miR-124에서 5`-GUGGCCUU-3’(miR-124-bulge site, 서열번호 9)의 염기 서열을 가지게 되고, 따라서 이를 동일하게 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'UTR 부분에 2번 연속 배열하여 리포터 벡터를 제작하였다.
상기 방법으로 제작된 루시퍼라제 리포터 벡터는 여러 농도(0.02, 0.1, 0.5, 2.5, 15nM)의 miR-124와 함께 HeLa세포(ATCC CCL-2)에 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포에 전달(co-transfection)시켜서 그 효과를 조사하였다. 이 때의 miR-124는 가이드 가닥(guide strand), 운반 가닥(passenger strand)의 두개의 핵산서열로 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작한 후, HPLC로 분리하고, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 이중체(duplex)로 제조하여 사용하였다. HeLa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지(Invitrogen)에서 배양하였으며, 트랜스펙션 수행시는 항생제 없는 완전배지에서 세포를 배양하였다. 이렇게 트랜스펙션을 수행한 24시간 후, Promega사의 Dual-luciferase reporter assay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하여 miR-124의 효과를 조사하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 promega사의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 3번 이상의 반복 실험하였고, 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다. 이렇게 miR-124의 여러 농도에서 융기 표적의 저해 효과를 측정하고, IC50(inhibitory concentration 50)를 miR-124의 정규적인 발단 사이트와 비교하여 살펴본 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 융기 표적은 0.8nM, 발단 표적은 0.4nM로 비록 융기 표적을 통한 유전자 발현 억제 효율이 발단 표적보다 2배정도 낮지만, 여전히 miR-124는 융기 표적과 같은 비정규 표적도 잘 억제하는 것을 관찰할 수 있었다.
상기로부터 Ago HITS-CLIP 분석을 통해 비정규 표적으로 이전에 보고된 융기 표적 사이트는 마이크로RNA와 결합 할 수 있을 뿐 아니라, 이를 가지고 있는 유전자의 발현을 효율적으로 억제한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 이러한 점으로 미루어 볼 때, 융기 표적을 이용하여 마이크로RNA와 충분히 결합할 수 있으며, 이러한 결합이 경쟁적으로 이루어져 마이크로RNA를 억제할 수 있다면, 융기 표적 억제를 통한 마이크로RNA의 생물학적 기능만을 저해할 수 있음을 유추할 수 있었다.
실시예 3. 마이크로RNA의 발단 서열에서 G:A 워블 배열 표적 억제를 통한 다른 생물학적 기능 조절 가능성 확인
3-1. 실험 재료 및 방법
상기 실시예 2에서, 사람의 뇌조직 및 심근경색 환자의 심장조직에서 얻어진 Ago HITS-CLIP 데이터를 마이크로RNA의 발단지역과 표적mRNA간에 G:A 워블 염기 결합을 분석하여 이들이 비정규 표적으로 존재함을 밝혔으며, 추가적인 리포터 실험을 통해 이러한 비정규 표적 사이트가 마이크로RNA에 의한 유전자 억제 효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인하였다. 이러한 비정규적인 유전자 억제 현상은 G:A 워블 염기 배열이 마이크로RNA의 비정규 표적으로 작용하여, 생물학적 기능을 조절할 수도 있다는 가능성을 제시하며, 따라서 이러한 가능성을 확인하고자 상기 실시예에서 살펴본 심근세포 마이크로RNA인 miR-1을 중심으로 실험을 진행하였다. 비정규적인 G:A 워블 표적이 특정한 생물학적 기능을 가지고 있는지를 조사하기 위해서는, miR-1이 정규적인 표적은 인식하지 않고, 비정규적인G:A 워블 배열 표적 사이트만을 인식하게 하여야 하므로, miR-1의 발단 지역에 있는 G가 C가 아닌 A와 염기 배열하도록 해당 G를 U로 치환하여 제작한 후 실험에 사용하였다. 본 실험에서는 보다 생리학적으로 심장과 유사한 조건으로 수행하기 위해서 랫트(rat)의 심장 조직으로부터 1차 심근세포 (primary rat neonatal cardiomyocyte culture)를 배양하여 수행하였다. 이 때, 심근세포의 배양은 생후 1일차 랫트(rat neonate)의 심장조직에서 효소 반응을 통해 심근 세포를 분리하고(Cellutron 사의 neomyt kit), 심근세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 5% HS(horse serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지(Invitrogen)와 M199(WellGene) 배지를 4:1 로 섞어 준비한 배지에 brdU를 첨가하여, 심장 조직에 존재하는 세포주기를 갖는 다른 세포들과 구별하여 배양하였다.
3-2. miR -1에 의한 심근세포 크기 감소 확인
상기로부터 얻어진 1차 배양 심근세포에서 심근비대현상이 유도되는 지를 우선적으로 확인하였다. 심근세포는 세포주기를 멈추고, 심근 세포의 크기를 증가시킬 수 있는 특징을 가지고 있는데, 이를 심근 비대 현상이라고 한다. 심근 비대 현상은 심근 세포의 기능 저하를 보완하는 역할을 해왔으며, 심장질병의 병리 중간 단계로도 알려져 있으며, 세포 형태학적 관찰 및 유전자 발현 프로파일 변화가 잘 알려진 심장 질병 모델 시스템이다. 심근 비대증의 세포 모델에서는 페닐에프린(PE)과 같은 아드레날린 수용체 작용제(agonist)를 심근 세포에 처리해주면 심근 비대증을 유도할 수 있다.
따라서, 배양한 심근 세포에 100uM의 페닐에프린을 처리하여 심근 비대를 유도 하였고, 이에 따라 도 8a에 나타낸 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군(rCMC)과 비교하여 심근 세포의 크기가 증가하는 것을 형태학적으로 확인하였다(+PE). 또한, 상기 실시예1에서와 같이 miR-1이 심장근육모세포주인 H9c2에서 발현되었을 경우 세포의 크기를 줄이는 현상이 나타나며, 동일한 현상으로 배양한 1차 심근세포에 miR-1을 도입하였을 때도 심근 세포의 크기가 감소하는 것을 관찰하였다. 이는 잘 알려진 심근 비대현상과 miR-1 의 심근세포에서의 심근세포 위축 기능과 일치한다.
3-3. miR -1 치환체를 이용하여 마이크로RNA의 발단 서열에서 G:A 워블 배열 표적 억제를 통해 나타나는 다른 생물학적 기능 가능성 확인
miR-1은 발단지역에 3개의 G를 포함하고 있으며, 이에 따라 정규적인 표적은 인식하지 않고, 비정규적인G:A 워블 배열 표적 사이트만을 인식하게 하기 위해서, 이러한 G를 U로 치환한 miR-1을 디자인 하였으며, 이를 G가 있는 위치에 따라 5’말단 기준 2번째 위치(miR-1-G2U), 3번째 위치(miR-1-G3U), 7번째 위치(miR-1-G7U)에 적용하여 miR-1치환체를 합성하였다. 이 때, 사용한 miR-1의 치환 염기 서열은 다음과 같으며 (miR-1-G2U: 5’p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’(서열번호 10); miR-1-G3U: 5’p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’(서열번호 11); miR-1-G7U: 5’p-UGGAAUUUAAAGAAGUAUGUAU-3’(서열번호 12)), 이는 가이드 가닥으로 합성되었고, 상기 치환된 miR-1의 5' 말단으로부터 2, 3, 7번째 염기에 대해서는 완전 상보적이지 않으나 가이드 가닥과 이중체를 형성하는 운반자 가닥(hsa-miR-1-5p; miRBase accession 번호: MIMAT0031892, 5'-ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAU-3', 서열번호 13)은 miRBase에 기록된 인간의 miR-1 염기서열을 디자인하여 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작 후, HPLC로 분리, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체 (duplex)로 제조하여 사용하였다. 해당 마이크로RNA의 1차 심근세포주로의 도입(transfection)은 RNAimax(Invitrogen 사) 시약을 이용하여 50nM 농도로 수행 하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이 miR-1-G2U 또는 miR-1-G3U 또는 miR-1-G7U 를 1차 심근세포배양에 도입하였을 때 심근 세포의 형태가 심근 비대를 유도한 세포(+PE)와 유사한 수준으로 커진 것을 관찰 할 수 있었다. 이 때 각각의 세포 크기를 정량적으로 분석하기 위해서, 100개 이상의 세포가 이미지J 프로그램 (NIH)을 통해 정량화 되었으며, 도 8b에 나타낸 바와 같이 miR-1의 G:A 워블 배열 사이트만을 인식하게 합성한 miR-1 치환체(miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U) 모두 대조군(NT) 핵산을 도입했을 때와 비교해서 약 1.5~1.8 배 정도 그 크기가 커진 것으로 분석되었다. 이는 페닐에프린(PE) 약물이 유도하는 심근세포비대증 모델의 심근 세포 크기와 비슷한 수준이며, miR-1 자체는 심근세포 형태상으로는 세포 크기를 감소시키는 효과를 보임으로써, 그 정규적인 표적 억제효과가 G:A 워블을 통한 표적 억제와는 세포 형태학상 다른 기능을 나타내는 것을 관찰하였다. 또한, 추가적으로 본 실시예에서 관찰한 심근비대 현상을 분자적 수준에서 확인하기 위해서 마커로 그 발현이 증가하는 것으로 알려진 ANP(atrial natriuretic peptide) 유전자의 발현을 qPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction) 실험을 통해 GAPDH와 비교하여 상대적인 값으로 측정해 보았다. 이때의 실험은 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT(Invitrogen)로 역전사하고, SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 qPCR을 수행하여 해당 프라이머로 ANP의 mRNA를 증폭하고 그 양을 측정하였다.
그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이 miR-1의 G:A 워블 배열 사이트만을 인식하게 합성한 miR-1 치환체 (miR-1-G2U, miR-1-G3U, miR-1-G7U)를 심근세포에 도입했을 경우에는 모두ANP 발현양을 대조군(NT)에 비해 1.2~1.5 배 정도 유의하게 증가시킨 것을 4번의 실험을 통해 확인할 수 있었다. 이러한 ANP 발현 증가는 페닐에프린(PE) 약물을 처리한 심근 세포 실험군이 대조군에 비해 크기가 약 2배 정도 증가한 것 보다는 적지만, 원래의 miR-1이 도입되었을 때 도리어 ANP 발현이 유의하게 감소하는 현상과는 반대되는 것으로, 이를 통해 miR-1은 G:A 워블 배열 사이트를 통해 완전히 다른 생물학적 기능을 나타낸다고 볼 수 있다.
상기로부터 마이크로RNA 발단 지역에서 G:A 워블 배열을 통해 억제하는 비정규 표적은 기존의 정규적인 표적 인식과는 생물학적으로 다른 기능을 나타낼 수 있다는 점을 최종적으로 알 수 있었다. 이러한 발견은 마이크로RNA의 정규적인 표적을 통한 기능과 비정규적 표적을 통한 기능이 서로 다르다는 것을 나타내며, 이러한 점으로 미루어 볼 때, 마이크로RNA의 G:A 워블 표적만을 억제할 수 있다면 G:A 워블 표적에 의해서 일어나는 생물학적 기능만을 선택적으로 제어할 수 있을 것으로 예측되었다.
실시예 4. 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제에 의한 마이크로RNA의 비정규적 G:A 워블 결합 기능 억제 효과 확인
4-1. miR -1의 비정규 G:A 발단 결합 싸이트에 대한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(2x) 효과 확인
상기 실시예1에서 miR-1의 정규 표적인 발단 표적 사이트를 저해하기 위해서 제작한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제인 anti-miR-1-seed (2x) (5'p-dTdT (rSP) ACAUUCCA (rSP) ACAUUCCA (rSP)dTdT-3')는 miR-1의 기능인 심근세포의 크기를 줄이는 기능을 저해하는 현상을 보였다. 따라서, 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 마이크로RNA와 결합할 수 있는 서열이면 모두 적용이 가능하고, 이에 따라 상기 실시예 2 및 3에서 확인한 마이크로RNA의 비정규 표적 서열에 대해서도 사용이 가능하다. 따라서, 상기 실시예 2 및 3에서 확인한 G:A 워블 사이트의 생물학적 기능만을 억제하고자, 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제를 miR-1에 적용하였다.
먼저, 도9a에 나타낸 서열과 같이, miR-1 발단 서열에서 5’말단으로부터 7번째 G가 U로 치환된 서열에 상보적인 서열 2개를 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제에 도입하였다(anti-miR-1-7G:A(2x)). 즉, 상기 실시예 3의 miR-1-G7U 에 대한 발단 서열과 상보적으로 염기 배열할 수 있는 5’-AAAUUCCA-3’을 연속적으로 배열하고, 그 배열된 서열 사이에는 상기 실시예1에서와 같이 비염기 핵산인 rSpacer로 구성하여, 연속적으로 배열된 서열의 경계선 상의 새로운 사이트 생성으로 인한 오프타겟 효과를 막도록 디자인하였다.
이 때 miR-1의 비정규 G:A워블 발단 표적 유전자에 대한 저해 효능을 실험적으로 확인하기 위해서 상기 실시예 1-2에서와 같이 루시퍼라제 리포터 실험(Luciferase reporter assay)을 수행하였다. 이를 위해서 도9b에 나타낸 것과 같이, miR-1의 비정규 G;A 워블 발단 표적 사이트 (miR-1-7 G:A site)를 루시퍼라제 리포터 유전자의 3'UTR에 5개 연속적으로 배치하였다 (Luc-miR-1-7G:A site).
miR-1의 비정규 G:A 워블 발단 표적 사이트를 통해 확실하게 유전자를 억제시킨 후 이를 해당 연쇄 표적 miR-1 G:A 워블 싸이트 저해제 (anti-miR-1-7G:A(2x)가 억제하는지를 확인하기 위해서, miR-1의 5'말단 7번째 G를 U로 치환한 miR-1:G7U를 Bioneer사에서 상기 실시예와 동일한 방법으로 합성하여 5nM 사용하고, 이와 함께 50 nM 농도의 저해제 (anti-miR-1-7G:A (2x), 서열번호 14)를 함께 HeLa세포 (ATCC CCL-2)에 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포에 전달 (co-transfection)시켜서 anti-miR-1-7G:A(2x)가 miR-1의 비정규 G:A 워블 발단 표적 억제를 저해하는 효과를 나타내는지 조사하였다.
그 결과, 도 9c에 나타낸 바와 같이 miR-1:G7U 이 트랜스펙션 되어 관찰된 루시퍼라제 활성값은 miR-1:G7U이 트랜스펙션되지 않은 값을 바탕으로 계산된 상대적 루시퍼라제 활성 퍼센트값의 88%로 저해되는 것을 확인하였으며, 이때 miR-1 과 anti-miR-1-7G:A (2x) 가 동시에 도입된 실험군의 상대적 루시퍼라제 활성 퍼센트값은 95%로, miR-1:7GU에 의해서 발현이 억제된 루시퍼라제 활성값이 원래 저해되지 않은 값으로 유사하게 회복되는 효과를 확인하였으며, 이는 통계적으로 유의 (p= 0.027) 함을 관찰하였다.
4-2. miR -1의 비정규 G:A 발단 결합 싸이트에 의한 생물학적 기능을 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(2x)가 억제할 수 있음을 확인
상기 실시예에서 miR-1의 7번 G:A 워블 표적 조절 기능을 특이적으로 저해하는 anti-miR-1-7G:A (2x)의 기능을 miR-1-G7U 치환 염기를 외부에서 트랜스펙션 시킨 HeLa세포(ATCC CCL-2) 에서 루시퍼라제 리포터 활성 조사를 통해 확인한 바 있다. 따라서, 심근모세포에서 자연적으로 존재하는 miR-1의 7번 G:A 워블 표적 조절 기능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1 실험에서 사용한 miR-1-7G:A 사이트가 포함된 루시퍼라제 리포터 벡터인 Luc-miR-1-7G;A site 와 50 nM 의 anti-miR-1-7G:A (2x) 또는 대조군인 anti-NT (2x) 를 트랜스펙션 시켜 상기 실시예 4-1과 같이 루시퍼라제 활성을 조사하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이 miR-1-7G:A 사이트를 포함하는 루시퍼라제 활성값을 miR-1-7G:A 사이트를 포함하지 않는 루시퍼라제 리포터 활성값(Luc-no site)으로 표준화하여 계산한 상대적 활성 퍼센트 값은 86.28 +/- 2.59 로, 이는 심근모세포에 자연적으로 존재하는 miR-1 의 7번 G:A 워블 표적 조절 기능을 측정한 값에 해당된다. 이 때, anti-miR-1-7G:A를 트랜스펙션한 실험군의 루시퍼라제 상대 활성 퍼센트 값은 89.96 +/- 2.13 으로, 통계적으로 유의하게 miR-1-G7U의 활성이 저해됨을 관찰하였다.
심장근육모세포주인 H9c2 세포는 그 세포 자체에 자연적으로 miR-1을 발현하고 있으며, 이러한 miR-1은 7번째 G염기를 통한 G:A 워블 배열로 표적 유전자를 억제할 수 있음을 보였다. 또한, 상기 실시예 3-3에서는 miR-1의 7번째 염기가 A와 배열하게 하기 위해서 7번째 G를 U로 치환한 miR-1-G7U가 그 발현을 통해 심근세포의 크기를 커지게 한다는 사실도 관찰하였다. 따라서, H9c2세포에 존재하는 miR-1의 7번째 G를 통한 G:A 워블 배열 표적을 본 발명에 따른 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산으로 억제할 수 있다면, 심근 세포가 작아지는 현상을 보일 것이라 예측하였고, 이를 확인하기 위해서 H9c2 세포에 대조군(control; anti-NT(2x))과 anti-miR-1-7G:A(2x)를 상기 실시예에서 실험했던 방법과 동일하게 트랜스팩션하고 그 효과를 확인한 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이 H9c2 세포의 크기를 작아지게 하는 것을 관찰하였다.
또한, 추가적으로 H9c2 세포의 크기는 100개 이상 이미지J 프로그램 (NIH) 을 사용하여 정량적으로 분석하였고, 그 결과 도 10c에 나타낸 바와 같이 anti-miR-1-7G:A(2x)가 도입된 세포의 크기는 대조군(control; anti-NT(2x))과 비교하여 약 40% 정도 감소한다는 사실을 확인하였다. 이러한 점으로 볼 때, anti-miR-1-7G:A(2x)는 miR-1의 7번째 G염기를 통한 G:A 워블 표적 인식 기작을 경쟁적으로 억제하여, 그 해당 기능을 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
상기와 같이 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 기존에 알려진 마이크로RNA의 정규적인 발단 표적 인식을 막을 뿐만 아니라, G:A 워블 배열과 같은 비정규 표적에도 적용하여 마이크로RNA의 특정 기능을 효과적으로 저해할 수 있음을 알 수 있었다.
4-3. miR -1의 비정규 G:A 발단 결합 싸이트에 의한 생물학적 기능을 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(9x)가 억제할 수 있음을 확인
상기 실시예에서 사용한 miR-1의 비정규 G:A 발단 결합 싸이트에 대한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(anti-miR-1-7G:A(2x))는 특이적으로 저해하려는 miR-1의 비정규 G:A 발단 결합 싸이트가2번 반복된 형태를 가지고 있다. 이에 확장하여, 도 11a에 나타낸 바와 같이 해당 싸이트의 반복 형태를 9번으로 증가시킨 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제(anti-miR-1-7G:A(9x))를 고안하고, 이의 저해 효과를 확인하는 루시퍼라제 리포터 실험을 진행하였다(도 11b).
anti-miR-1-7G:A(9x)는 다음과 같은 서열로 Trilink사에서 화학적으로 합성 제작한 후 HPLC로 분리하여 사용하였다 (anti-miR-1-7G:A (9x): 5’-p-NN(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)NN-3’, 서열번호 15). 실험에 대조군으로 사용된 control inhibitor도 동일하게 NT 의 표적 사이트가 9번 반복되도록 다음과 같은 염기 서열로 Trilink사에서 화학적으로 합성 제작한 후 HPLC로 분리하여 사용하였다 (anti-NT (9x): 5’-p-NN(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)GGUUGUGA(rSP)NN-3’, 서열번호 16). 이때, miR-1-7G:A 사이트가 포함된 루시퍼라제 리포터 벡터 Luc-miR-1-7G:A site와 25 또는 50nM 의 anti-miR-1-7G:A (9x) 또는 대조군인 anti-NT (9x)를 5nM의 miR-1:G7U와 함께 도9b의 실험과 동일하게 HeLa세포(ATCC CCL-2)에 Lipofectamine 3000 시약 (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 세포에 트랜스펙션시켜 루시퍼라제 활성을 조사하였다.
그 결과, 도 11b에 나타낸 바와 같이, miR-1-G7U와 anti-NT(9x)가 함께 트랜스펙션된 실험군의 루시퍼라제 활성값을 miR-1-G7U 가 트랜스펙션 되지 않은 루시퍼라제 리포터 활성값으로 표준화하여 계산한 상대적 활성 퍼센트 값이 74.57 +/- 6.36인 것을 관찰하여, 해당 마이크로RNA에 의한 유전자 억제 효과를 확인하였으며, 이 때 anti-miR-1-7G:A (9x)를 함께 도입한 실험군에서는 상대적 활성 퍼센트 값은 87.23 +/- 5,68으로 25 nM 의 anti-miR-1-7G:A (9x)가 통계적으로 유의하게miR-1-G7U의 활성을 저해함을 관찰하였다 (P=0.05). 또한 anti-miR-1-7G:A (9x)의 양을 50nM으로 증가 시켰을 때는 상대적인 루시퍼라제 리포터의 활성 퍼센트 값이 107.15 +/- 9.58 으로 완벽하게 miR-1-G7U에 의한 표적 유전자 억제를 저해함을 통계적으로 유의하게 관찰하였다 (P=0.0008).
따라서, 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제의 저해 효과는 저해 효과를 타겟하는 염기 서열의 반복이 2번일때부터 그 저해 효과를 확인할 수 있지만, 9번 반복시 더욱 증가된 저해 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
anti-miR-1-7G:A (9x) 가 효과적으로 miR-1의 7번 G:A 워블 배열 표적에 대한 억제를 저해하는 것을 루시퍼라제 리포터를 통해 확인한 다음, anti-miR-1-7G:A (9x)가 miR-1의 7번 G:A 워블 발단 표적을 억제함으로써 나타나는 심근세포 비대 효과에 대해서도 효과적으로 억제할 수 있는 지를 확인해보았다. 이 때 실험에는 심근모세포주인 H9c2를 사용하였고, anti-miR-1-7G:A (9x)에 의한 세포 크기의 변화를 트랜스펙션 후 시간차(0, 24, 48, 및 60시간)를 두고 Lumascope 400 (Etaluma사)을 사용하여 동일 세포에서 진행하였다. 해당 실험에서 anti-miR-1-7G:A 의 도입은 트랜스펙션과 동시에 FBS를 제거하고 , 100 uM 농도의 alpha-adrenergic agonist 인 PE (Phenylephine, Sigma) 를 처리하여 60시간까지 배양하며 관찰하였다.
그 결과, 도 11c에 나타낸 바와 같이 PE처리에 의해서 유도되는 심근모세포주의 세포 크기의 증가가 대조군 (control; anti-NT(9x))에서 관찰되는데 비해, anti-miR-1-7G:A (9x) 가 트랜스펙션된 실험군에서는 심근모세포주의 비대가 전혀 관찰되지 않았다.
상기와 같이, 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 저해하고자 하는 마이크로RNA의 표적 개수가 증가할수록 저해 효과가 증가하며, 이러한 저해 능력은 해당 마이크로RNA의 생물학적 기능을 억제할 수 있을 정도로 강력하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 연쇄 표적 마이크로 RNA 저해제에서 스페이서 변형 도입을 통해 표적 사이트 사이의 연결 서열에 의한 부작용 제거 확인
상기 실시예에서 제작한 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 억제하고자 하는 마이크로RNA의 표적 싸이트를 2번이상 연속하게 배열되도록 디자인 되었다. 따라서, 표적 사이트 사이의 연결 서열에 의해서 의도치 않게 다른 마이크로RNA 또는 다른 RNA 결합 단백질과 결합하여, 이를 저해하게 되는 부작용이 발생할 수도 있다. 이러한 경우를 miR-1의 7번째 G를 통한 비정규G:A 발단 표적을 억제하는 저해제 (anti-miR-1-7G:A(9X)) 서열에서 예를 들어 보면, anti-miR-1-7G:A (9x)) 염기 서열은 도 12a에 나타낸 것과 같이 반복되는 표적 사이트 사이에 비염기 변형으로 rSpacer가 들어가 있으며, 해당 서열은 다음과 같다 (5'-p-NN(rSP)A AAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)AAAUUCCA(rSP)NN-3'). 이에 반해, anti-miR-1-7G:A(9x)-NS는 동일한 염기 서열을 가지나 반복되는 표적 사이트 서열 사이에 비염기가 포함되어 있지 않으며, 그 염기 서열은 다음과 같다 (5'-NNAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCAAAAUUCCANN-3', 서열번호 17).
이때, 도 12a와 같이 연속 배열시 상보 결합할 수 있는 염기 서열은 오직 5'-AAAUUCCA-3' 이지만, 비염기 변형이 없는 anti-miR-1-7G:A(9x)-NS의 경우에는 원래의 표적 사이트인 5'-AAAUUCCA-3' 뿐 아니라 각 각의 사이트가 접합하는 7개의 부위를 통해 다음과 같이 마이크로RNA와 결합할 수 있는 서열이 의도하지 않게 생성되며, 그 염기 서열은 다음과 같다 (5'-AAUUCCAA-3', 5'-AUUCCAAA-3', 5'-UUCCAAAA-3', 5'-UCCAAAAU-3', 5'-CCAAAAUU-3', 5'-CAAAAUUC-3', 5'-AAAAUUCC-3'). 따라서 본 발명의 실시예에서 사용한 모든 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 표적 사이트 사이에 비염기 변형인 rSpacer로 변형되어 있는데, 이것은 도 12b에서 나타낸 것과 같이 표적 사이트 사이의 연결 서열에 의해서 발생하는 새로운 서열 자체가 우연히 다른 마이크로RNA(miR-junction)의 표적 사이트가 되거나, 다른 RNA 결합 단백질의 결합 사이트가 되는 것을 막아주기 위함이다.
이에 본 발명의 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제가 비염기 변형을 통해 상기에 열거한 부작용 효과를 막는지를 확인하기 위해서 루시퍼라제 리포터 실험을 상기 실시예와 동일한 방법으로 진행하였다. 이를 확인하기 위해 표적 사이트 사이의 연결 서열을 인식하는 마이크로RNA인 miR-junction을 도12b에 나타난 서열로 합성하여 사용하였다. 이는 표적 사이트 사이의 연결 서열에 완전 상보적인 염기가 5'말단 기준 1-8번째에 존재하며, 이후 9번부터 21번 까지는 Cel-miR-67-3p의 서열을 포함한다 (miR-junction : 5'-AAAUUUUG CCUAGAAAGAGUA -3', 서열번호 18). 이를 이중 중합체로 만들어 실험하기 위해 운반자 가닥 (miR-junction-passenger: 5'-TACTCTTTCTAGGCAAAATTT-3')과 함께 Bioneer사에서 화학적으로 합성 제작한 후, HPLC로 분리하여 사용하였다. 또한 해당 miR-juntion의 억제 효과를 측정하기 위해서, miR-junction의 1-8번에 대한 상보 염기 서열인 표적 사이트(5'-CAAAATT-3')가 5번 반복되게 루시퍼라제 리포터 벡터를 제작하여 상기 실시예와 동일한 방법으로 사용하였다.
miR-1 junction에 의한 억제 효과를 루시퍼라제 리포터 실험으로 살펴 본 결과, 도 12c에 나타낸 바와 같이 5nM의miR-1 junction 발현에 의해 ~12% 억제되었던 유전자 억제 효과가 표적 사이트 사이에 스페이서 변형을 가지고 있는 anti-miR-1-7G:A (9X)의 경우에는 해당 표적 사이트가 rSpacer에 의해서 나눠져 있어 전혀 통계적으로 유의하게 억제하지 못하는 반면(P=0.23)에 스페이서 변형을 가지고 있지 않은 anti-miR-1-7G:A(9X)-NS의 경우에는 miR-1 junction에 의한 유전자 억제를 통계적으로 유의(P=0.01)하게 저해하는 것으로 나타났다.
상기와 같이, 연쇄 표적 마이크로RNA 저해제는 저해하고자 하는 마이크로RNA의 표적 싸이트 사이에 비염기 변형을 포함함으로서, 사이트 사이의 연결 서열에 의한 부작용을 제거 할 수 있음을 확인 할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (11)

  1. 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산에 있어서,
    상기 변형 핵산은 적어도 7개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 마이크로RNA 표적 사이트 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고,
    상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은
    1) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열;
    2) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 5번째와 6번째 염기 사이에 융기(bulge)를 포함하는 서열; 또는
    3) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열을 상보적으로 포함하는 서열; 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나일 수 있으며,
    상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열 간의 사이에는 적어도 1개 이상의 염기가 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환되는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-1인 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 5'-ACAUUCCA-3' 또는 5'- AAAUUCCA-3' 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 상기 5'-ACAUUCCA-3' 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고, 상기 서열의 전후로 비염기 스페이서(abasic spacer)를 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산은 상기 5'- AAAUUCCA-3' 서열을 적어도 2개 이상 연속으로 포함하고, 상기 서열의 전후로 비염기 스페이서(abasic spacer)를 적어도 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로RNA 표적 사이트 서열은 마이크로RNA의 발단지역(seed region)에 상보적인 뉴클레오티드를 7 내지 8개 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 발단지역(seed region)은 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 8번째 사이의 서열인 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 비염기 스페이서(abasic spacer)는 염기를 포함하지 않는 비염기 리보핵산 스페이서(rSpacer, rSp), 비염기 핵산 스페이서 (dSpacer), C3 spacer, 및 C6 spacer로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산.
  9. 1) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열;
    2) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 5번째와 6번째 염기 사이에 융기(bulge)를 포함하는 서열; 또는
    3) 마이크로RNA의 5' 말단으로부터 2번째부터 7번째까지 또는 3번째부터 8번째까지의 염기에 상보적인 서열이면서 G:A 또는 G:U 워블(wobble) 염기 배열을 상보적으로 포함하는 서열; 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 서열을 연속으로 배열하는 단계; 및
    상기 연속으로 배열한 염기서열간의 사이에 적어도 1개 이상의 염기를 비염기 스페이서(abasic spacer)로 치환하여 연결하는 단계; 를 포함하는, 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산의 제조방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 시험관 내(in vitro) 세포에 도입시키는 단계를 포함하는 마이크로RNA를 억제하는 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 마이크로RNA를 억제하는 변형 핵산을 포함하는 유전자 전달용 조성물.
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