JP2010518880A - Rtp801のインヒビター及びその疾患の治療における使用 - Google Patents

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Abstract

要約
本発明は、RTP801の遺伝子および/またはタンパク質の阻害に基づく、微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸性の状態, および聴覚障害を治療するための新規の分子, 組成物, 方法および使用を提供する。

Description

本出願は、2007年2月26日に出願された米国特許仮出願60/903737号の優先権を主張するものであり、この仮出願は本明細書に参照によってその全体が援用される。
[発明の分野]
本発明は、RTP801遺伝子を阻害する新規の siRNA 分子に及び全てのタイプの呼吸障害(肺の障害を含む), 眼の疾患および状態, 微小血管の障害, 血管形成-およびアポトーシス-関連状態,および聴覚障害(hearing impairments)を治療するための係る分子の使用に関する。
[発明の背景]
RTP801
遺伝子 RTP801は、本発明の権利者によって初めて報告された。米国特許第6455674, 6555667,および6740738号は、全て本発明の権利者のものであり、それ自体はRTP801のポリヌクレオチドおよびポリペプチド,および該ポリペプチドに対する抗体を開示し、請求するものである。RTP801は、成長因子(例えば、VEGF)に非依存性の低酸素誘導性の病因を制御しえる低酸素誘導性因子-1(HIF-1)に関するユニークな遺伝子標的である。その上、本発明の権利者は、RTP801との組合せ療法に使用できるRTP801L(RTP801 Likeに対する)と称される類似遺伝子も発見した(以下を参照されたい)。RTP801Lに関する更なる情報に関して、本願に参照によってその全体が援用される、本発明の権利者のPCT公開番号WO07/141796を参照されたい。
次の特許および特許出願によって、背景情報の状況が与えられる。
WO 2001070979は、卵巣癌細胞で過剰発現される核酸マーカーに関する。
US出願2003108871は、処理されたヒト C3A 肝臓細胞培養に異なって発現される幾つかのcDNAsを含んでいる組成物に関する。
US出願2002119463は、前立腺癌を治療および診断するための有用な新しい組成物を開示し、該組成物は前立腺癌で異なって発現されるヒト cDNAsを含んでいる。
WO 2004018999は、子宮頚癌(cervical cancer)を評価する, 特徴付ける(characterizing), モニターする, 予防する及び治療するための方法を開示する。
EP 1394274は、被験者からの生物学的サンプルにおける標識遺伝子の発現レベルを健常被験者からのサンプルにおける前記遺伝子の発現レベルと比較することによって、気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患を治療する方法に関する。
WO 2002101075は、ヒトの子宮頚癌を検出する, 特徴付ける, 予防する及び治療するための有用な単離された核酸分子に関する。
WO 2003010205は、創傷の治癒(wound healing), 網膜症, 虚血, 炎症, 微小血管障害(microvasculopathy), 骨の治癒(bone healing)および 皮膚炎症の治療のための血管形成(angiogenesis)の阻害に関する。
WO 2002046465は、低酸素制御性の状態(hypoxia- regulated conditions)を治療するために疾患に関与する遺伝子を同定することに関する。
また、次の文献は、背景情報を与える〔Shoshani, et al. Mol. Cel. Biol., Apr. 2002, p. 2283-2293; Brafman, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004 Oct; 45 (10): 3796-805; Ellisen, et al. Molecular Cell, Vol. 10, 995-1005, November, 2002; Richard et al. J Biol. Chem. 2000, Sep1; 275(35): 26765-71〕。
siRNAs および RNA 干渉
RNA 干渉 (RNAi)は、二本鎖(ds)のRNA依存的で遺伝子特異的な転写後のサイレンシングが関与している現象である。この現象を研究するための及び哺乳類細胞を実験的に操作するための初期の試みは、長い dsRNA 分子に応答して活性化した活性で非特異的な抗ウイルス性の防衛機能により挫折した(Gil et al., Apoptosis, 2000. 5:107-114)。後に、21 ヌクレオチド RNAsの合成の二重鎖が一般的な抗ウイルス性の防御機構を刺激することなく、哺乳類細胞において遺伝子特異的なRNAiを媒介できることが発見された(Elbashir et al. Nature 2001, 411:494-498 および Caplen et al. PNAS 2001, 98:9742-9747)。結果として、短い二本鎖のRNAsである低分子干渉RNAs (siRNAs)は、遺伝子発現を阻害し、遺伝子機能を理解するために広く使用されてきた。
RNA 干渉 (RNAi)は、低分子干渉RNAs (siRNAs) (Fire et al, Nature 1998, 391:806)またはmicroRNAs (miRNAs) (Ambros V. Nature 2004, 431:350-355); および Bartel DP. Cell. 2004 116(2):281-97)で媒介される。対応するプロセスは、一般に植物において観察される場合に特異的な転写後の遺伝子サイレンシングと、真菌において観察される場合にクエリング(quelling)と称される。
siRNAは、内因性または外因性の遺伝子/mRNAの発現をダウンレギュレートまたはサイレンス(即ち、完全または部分的に阻害する)する二本鎖のRNAである。RNA干渉は特異的なタンパク質複合体に入る特定のdsRNA種の能力に基づいており、これらが次に相補的な細胞のRNAsを標的とし、特異的にそれらをデグラデーションする。従って、RNA干渉応答は、一般にsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有している一本鎖のRNAの切断を媒介するRNA-誘導性サイレンシング複合体(RISC)と称されるsiRNAを含んでいるエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的RNAの切断は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こりえる(Elbashir, et al., Genes Dev., 2001, 15:188)。より詳細には、より長いdsRNAsは、短い(17-29 bp) dsRNA断片(短い阻害性のRNAsまたは「siRNAs」とも称される)へとIII型のRNAsesにより消化される(DICER, DROSHA, など(Bernstein et al., Nature, 2001, 409:363-6 および Lee et al., Nature, 2003, 425:415-9を参照されたい)。RISC タンパク質複合体は、これらの断片および相補的なmRNAを認識する。全体のプロセスは、標的mRNAのエンドヌクレアーゼ切断によって完結する〔McManus and Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3:737-47; Paddison and Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003, 5(3): 217-24〕。〔これらの用語および提案された機構における付加的な情報に関して、例えば、Bernstein, et al., RNA. 2001, 7(11):1509-21; Nishikura, Cell. 2001, 107(4):415-8 および PCT公開公報WO 01/36646を参照されたい〕。
研究によって、インビボでsiRNAが哺乳類 および ヒトの両方で効果的であることが明らかとされた。具体的には、Bitko等は、呼吸器合胞体ウイルス (RSV) ヌクレオカプシド N 遺伝子に対する特異的なsiRNAsが、鼻内に投与された場合にマウスの治療に効果的であることを示した〔Bitko et al., Nat. Med. 2005, 11(1):50-55〕。siRNAsの治療上の適用の総説に関して、Barik (Mol. Med 2005, 83: 764-773), Chakraborty (Current Drug Targets 2007 8(3):469-82) および Dykxhoorn, et al (Gene Therapy 2006, 13, 541-552)を参照されたい。加えて、老化性の黄斑変性症 (AMD)を治療するためにVEGFR1 レセプターを標的とする短いsiRNAsでの臨床研究が、ヒトの患者で実施されてきた。研究において、このような硝子体内(眼内)注射によって投与されたsiRNAは、試験した14患者で効果的で安全であることが見いだされた〔Kaiser, Am J Ophthalmol. 2006 142(4):660-8〕。
[発明の概要]
本発明は、微小血管の障害(microvascular disorders), 黄斑変性症(macular degeneration), 呼吸障害(respiratory disorders), 脊髄の傷害または疾患(spinal cord injury or disease), 聴覚損失(hearing loss)および他の疾患および状態を治療するための新規の方法および組成物を提供する。
一態様において、RTP801を阻害し、様々な疾患および徴候(indications)を治療するために使用できる新規の分子が提供される。
別の態様において、本発明は微小血管の障害, 黄斑変性症または呼吸障害を患っている患者を治療する方法を提供し、該方法は患者にRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与することを含む。
本発明の別の態様はCOPDを患っている患者を治療するための方法に関し、該方法は患者に治療上効果的な量のRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与することを含む。一態様において、前記インヒビターは、siRNA 分子, アンチセンス 分子, 抗体 (例えば、中和抗体), ドミナントネガティブペプチドまたはリボザイムである。
本発明の別の態様は黄斑変性症を患っている患者を治療するための方法に関し、該方法は患者に治療上効果的な量のRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与することを含む。一態様において、前記インヒビターは、siRNA 分子, アンチセンス 分子, 抗体 (例えば、中和抗体), ドミナントネガティブペプチドまたはリボザイムである。
本発明の別の態様は微小血管の障害を患っている患者を治療するための方法に関し、該方法は患者に治療上効果的な量のRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与することを含む。一態様において、前記インヒビターは、siRNA 分子, アンチセンス 分子, 抗体 (例えば、中和抗体), ドミナントネガティブペプチドまたはリボザイムである。特定の好適な態様において、前記801 インヒビターは、siRNA 化合物である。
本発明の付加的な態様において、呼吸障害を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製のための治療上効果的な量のRTP801インヒビターの使用を提供する。一態様において、呼吸障害はCOPDであり、前記インヒビターは好ましくはsiRNAである。
本発明の付加的な態様において、黄斑変性症を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製のための治療的に効果的な用量のRTP801インヒビターの使用を提供する。一態様において、黄斑変性症はAMDであり、前記インヒビターは好ましくはsiRNAである。
本発明の付加的な態様において、微小血管の障害を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製のための治療上効果的な量のRTP801インヒビターの使用を提供する。一態様において、微小血管の障害は糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)であり、前記インヒビターは好ましくはsiRNAである。
本発明は、一般に聴覚障害(またはバランス欠陥), 特に内耳の有毛細胞の細胞死と関連する聴覚障害の発生(incidence)または重症化(severity)を治療する又は予防するための方法および組成物に関する。前記方法および組成物には、係る治療を必要とする哺乳類にRTP801 遺伝子の発現をダウンレギュレートする予防上または治療上効果的な量の一または二以上の化合物〔特に新規の低分子干渉RNAs(siRNAs)〕を投与することが関与する。
より具体的には、本発明は、聴覚障害または内耳の有毛細胞の細胞死と関連する他の耳の病状(oto-pathologies)を患っている患者を治療するための方法および組成物を提供する。かかる耳の病状は、音響性外傷(acoustic trauma), 機械的な外傷(mechanical trauma),または耳毒誘発性の聴覚損失(ototoxin-induced hearing loss)の結果であってもよい。本発明の方法は、患者にRTP801 遺伝子の発現をダウンレギュレートする一または二以上の化合物(特にRTP801を阻害するsiRNAs)を、典型的には治療上の有効量の薬学的組成物として、患者を治療するため投与することを含む。
一態様において、本発明は、耳毒性の聴覚を弱める副作用を有している薬学的な薬の投与を必要とする治療にRTP801を阻害する治療上効果的な量の一または二以上のsiRNA分子を組み合わせて、薬学的な薬によって誘導される耳毒性(ototoxicity)を治療または予防する、改善された組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、内耳のアポトーシス性の組織障害を誘導する耳毒性で聴覚を弱める薬の投与の前に, 引き続いて,または実質的に同時に何れかの適切なインターバルで投与できる。同様に、この治療は、音響性外傷(acoustic trauma)の原因である状態の前または同時の予防的処置として有効である。
従って、RTP801を阻害する治療上効果的な量の一または二以上のsiRNA分子を哺乳類に投与するための耳毒性で聴覚を弱める薬学的な薬と組み合わせて含んでいる改善された組成物を提供することが本発明の課題である。薬の組み合わせは別々に投与しえる; RTP801を阻害するsiRNA 分子が局所的に投与され、耳毒性で聴覚を弱める薬学的な薬が全身性に投与される。siRNA分子は、耳毒性薬の前, 同時または引き続き投与されえる。前記組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含むことができる。薬学的組成物は、耳毒性の医薬品単独よりも低い耳毒性を有する(好ましくは、典型的に使用されるものよりも高用量の耳毒性の医薬品を有する)。係る改善された組成物の例には、シスプラチンまたは他の耳毒性の新生物因子(neoplastic agent)またはアミノグリコシド系抗生物質をRTP801を阻害する治療上効果的な量の一または二以上のsiRNA分子と組み合わせて含む。
さらに、本発明は、利尿薬が必要である場合における本発明の組成物の使用に関する。本発明は、長らく要望されてきた当該技術への解決策を提供するものであり、現在特定の利尿薬(より普及し、通常使用されるループ利尿剤)と関連して存在する耳毒性の影響を、それらの利尿効果を犠牲にすることなく治療できる治療および医薬を提供する。
さらに、本発明は、キニーネまたはキニーネ様化合物が必要である場合における本発明の組成物の使用に関する。本発明は、長らく要望されてきた当該技術への解決策を提供するものであり、現在特定のキニーネと関連して存在する耳毒性の影響を、それらの効果を犠牲にすることなく治療できる治療および医薬を提供する。
さらに、本発明は、褥瘡の発生または重症化を治療する又は予防するための方法および組成物に関する。前記方法および組成物には、係る治療を必要とする哺乳類にRTP801 遺伝子の発現をダウンレギュレートする予防的にまたは治療上効果的な量の一または二以上の化合物〔特に新規の低分子干渉RNAs(siRNAs)〕を投与することが関与する。
さらに、本発明は、本願の明細書等に記載されるとおり、任意の虚血または虚血再灌流の傷害または状態の治療のための方法および組成物に関する。前記方法および組成物には、係る治療を必要とする哺乳類にRTP801 遺伝子の発現をダウンレギュレートする予防的にまたは治療上効果的な量の一または二以上の化合物〔特に新規の低分子干渉RNAs(siRNAs)〕を投与することが関与する。
上記のとおり、本発明は、RTP801のインヒビターを提供する。様々な態様において、前記インヒビターは、siRNA, shRNA, アプタマー, アンチセンス分子, miRNA, リボザイム,および抗体からなる群から選択される。現在の好適な態様において、前記インヒビターは、siRNAである。様々な態様において、前記siRNAは、糖残基に化学修飾を有している一または二以上のリボヌクレオチドを含む。
従って、一側面において、本発明は、RTP801の発現を阻害する新規の二本鎖オリゴリボヌクレオチドを提供する。また、本発明は、前記オリゴリボヌクレオチドを発現する能力のある一または二以上の係るオリゴリボヌクレオチドまたはベクターを含んでいる薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする被験者における様々な疾患または状態の発生または重症化を治療する又は予防するための方法に関し、それと関連する疾患または状態および/または症候は聴覚損失, 急性腎不全 (ARF), 緑内障, 急性呼吸窮迫症候群(ARDS;acute respiratory distress syndrome)および他の急性の肺および呼吸器の傷害, 肺移植に続く虚血-再潅流傷害, 肺, 肝臓, 心臓, 膵臓,および腎移植を含む臓器移植, 腎および神経の毒性, 脊髄損傷(spinal cord injury), 褥瘡, 老化性の黄斑変性症(AMD), ドライアイ症候群, 口腔粘膜炎(oral mucositis)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)からなる群から選択される。かかる方法には、係る治療を必要とする哺乳類にRTP801の発現または活性を阻害するまたは減少させる予防的にまたは治療上効果的な量の一または二以上の係る化合物を投与することが関与する。
一側面において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x - Z 3' (アンチセンス鎖)
3' Z'-(N')y 5' (センス鎖)
式中のN および N'の各々は、その糖残基が修飾または無修飾であってもよいヌクレオチドであり;
式中の(N)x および (N')yの各々は、各々の連続的(consecutive)な NまたはN'が次の NまたはN'と共有結合で結合されたオリゴヌクレオチドであり;
式中のx および yの各々は、18 および 40の間の整数であり;
式中のZ および Z'の各々は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合にはそれが存在する鎖の3' 末端に共有結合性に付着する1-5の連続的なヌクレオチドであり;
式中の(N')yの配列は、RTP801のmRNA内に存在する。
幾つかの態様において、各々の連続的な NまたはN'を結合している共有結合は、リン酸ジエステル結合である。様々な態様において、全ての共有結合性の結合は、リン酸ジエステル結合である。
様々な態様において、前記化合物は、x = yであり、x および yの各々は19, 20, 21, 22または23であるリボヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、 x = y =23である。他の態様において、 x = y =19である。
幾つかの態様において、前記化合物は、ブラントエンドである(例えば、Z および Z'の両方が非存在である)。代替的な態様において、前記化合物は、少なくとも一つの ZまたはZ' が存在する少なくとも一つの 3' オーバーハングを含む。Z および Z'は、独立に一または二以上の共有結合性に連結された修飾または非修飾のヌクレオチド〔例えば、逆位のdTまたはdA; dT, LNA, ミラーヌクレオチド(mirror nucleotide)など〕を具備できる。幾つかの態様において、Z および Z'の各々は、独立にdT および dTdTから選択される。
幾つかの態様において、NまたはN'は、糖残基に修飾を具備する。他の態様において、(N)x および/または (N')yは、糖残基において修飾された少なくとも一つのリボヌクレオチドを具備する。幾つかの態様において、少なくとも一つの(N)x および (N')yは、糖残基の2' ポジションで修飾を有しているリボヌクレオチドを具備する。幾つかの態様において、2' ポジションにおける修飾は、アミノ, フルオロ, アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の態様において、2'の修飾は、メトキシ部分を含む。現在の好適な修飾は、糖残基の2' メトキシ(2'-O-メチル; 2'-O-Me; 2'-O-CH3)である。
幾つかの態様において、前記化合物は、アンチセンス および センス鎖の一方または両方において修飾された交代性リボヌクレオチド(modified alternating ribonucleotides)を含む(すなわち、少なくとも一つの(N)x および (N')y は、修飾された交代性リボヌクレオチドを含む)。特定の態様において、前記化合物は、アンチセンス および センス鎖に修飾された交代性リボヌクレオチドを含む。他の態様において、前記化合物は、アンチセンス鎖のみに修飾された交代性リボヌクレオチドを含む。特定の態様において、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチドは修飾されていない(例えば、19-mer 鎖におけるポジション 10または23-mer 鎖におけるポジション12におけるリボヌクレオチド)。
付加的な態様において、前記化合物は交代性ポジション(alternating positions)に修飾されたリボヌクレオチドを含み、(N)xの5' および 3'末端で各々のNが糖残基において修飾され、(N')yの5' および 3' 末端で各々のN'が糖残基において無修飾である。幾つかの態様において、(N)xまたは(N')yのどちらも3' および 5' 末端でリン酸化されない。他の態様において、(N)x および (N')yの何れか一方または両方が3'末端でリン酸化される。
特定の態様において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x - Z 3' (アンチセンス鎖)
3' Z'-(N')y 5' (センス鎖)
式中のN および N'の各々は、その糖残基が修飾または無修飾であってもよいリボヌクレオチドであり;
式中の(N)x および (N')yの各々は、各々の連続的な NまたはN'が次の NまたはN'と共有結合で結合されたオリゴマーであり;
式中のx および yの各々は、19 および 40の間の整数であり;
式中のZ および Z'の各々は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合にはそれが存在する鎖の3' 末端に共有結合性に付着する1-5の連続的なヌクレオチドであり;
式中の(N)x および (N')yの配列は、配列番号 3-70の何れか一つに記載される。
特定の態様において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x 3' アンチセンス鎖
3' (N')y 5' センス鎖
式中のN および N'の各々は、その糖残基が修飾または無修飾であってもよいヌクレオチドであり;
式中でx=y =19であり、(N)x および (N')yの配列は完全に相補的である;
式中の(N)x および (N')yにおける交代性リボヌクレオチドは修飾されてリボヌクレオチドの糖残基に2'-O-メチル修飾を生じ;(N)xの5' および 3' 末端でのリボヌクレオチドは修飾され;
式中の(N')yの5' および 3' 末端でのリボヌクレオチドは、無修飾であり;
式中の(N)x および (N')yは、3' および 5' 末端でリン酸化または非リン酸化(non-phosphorylated)され;
式中のN および N'の各々は、表 Aに記載されるオリゴマーの群から選択される。
特定の態様において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x 3' アンチセンス鎖
3' (N')y 5' センス鎖
式中でx=y =23であり、(N)x および (N')yの配列は完全に相補的である;
式中の(N)x および (N')yにおける交代性リボヌクレオチドは修飾されてリボヌクレオチドの糖残基に2'-O-メチル修飾を生じ;(N)xの5' および 3' 末端でのリボヌクレオチドは修飾され;
式中の(N')yの5' および 3' 末端でのリボヌクレオチドは、無修飾であり;
式中の(N)x および (N')yは、3' および 5' 末端でリン酸化または非リン酸化され;
式中のN および N'の各々は、表 Aに記載されるオリゴマーの群から選択される。
第二の側面において、本発明は、ヒト RTP801 遺伝子発現を阻害するために効果的な量の本発明の一または二以上の化合物および薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物を提供する。
別の側面において、本発明は、RTP801の発現と関連する疾患または障害と関連する疾患または障害または症候のための治療を必要とする被験者を治療するための方法に関し、該方法は前記被験者にRTP801の発現を減少させる又は阻害する量のsiRNAを投与することを含む。
より具体的には、本発明は、急性腎不全 (ARF), 聴覚損失(hearing loss), 緑内障, 急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および他の急性の肺および呼吸器の傷害, 肺, 腎臓, 骨髄, 心臓, 膵臓, 角膜または肝臓移植を含む臓器移植における傷害(例えば、虚血-再灌流傷害), 腎毒性, 脊髄損傷, 褥瘡, ドライアイ症候群, 口腔の粘膜炎および慢性閉塞性肺疾患 (COPD)を患っている被験者の治療に有用な方法および組成物を提供する。
本発明の方法は、RTP801の発現を減少, 阻害またはダウンレギュレートさせる一または二以上の阻害性の化合物(特に患者を治療するための治療的に有効量のsiRNA)を被験者に投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における聴覚損失, 急性腎不全, 緑内障, 急性の呼吸困難症候群, 急性の肺傷害, 臓器移植拒絶, 虚血-再潅流傷害, 腎毒性, 神経毒性, 脊髄損傷, 褥瘡, 骨関節炎, ドライアイ症候群および慢性閉塞性肺疾患(COPD)から選択される疾患または状態を治療する方法を提供し、該方法は被験者に疾患または状態を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における急性腎不全を治療する方法を提供し、該方法は被験者に急性腎不全を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における脊髄損傷を治療する方法を提供し、該方法は被験者に脊髄損傷を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における聴覚損失を治療する方法を提供し、該方法は被験者に聴覚損失を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における慢性閉塞性肺疾患, 急性の呼吸困難症候群および急性の肺傷害から選択される疾患または状態を治療する方法を提供し、該方法は被験者に前記疾患または状態を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、臓器移植のレシピエントまたは臓器移植のドナーである被験者を治療する方法を提供し、該方法は前記被験者に移植の拒絶を予防するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における緑内障を治療する方法を提供し、該方法は被験者に緑内障を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における口腔粘膜炎を治療する方法を提供し、該方法は被験者に口腔粘膜炎を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者におけるドライアイ症候群を治療する方法を提供し、該方法は被験者に前記症候群を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における褥瘡を治療する方法を提供し、該方法は被験者に褥瘡を治療するために効果的な量でRTP801の発現を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することを含む。
一態様において、本発明は、必要とする被験者における聴覚損失, 急性腎不全, 緑内障, 急性の呼吸困難症候群, 急性の肺傷害, 臓器移植拒絶, 虚血-再潅流傷害, 腎毒性, 神経毒性, 脊髄損傷, 褥瘡, 骨関節炎, および慢性閉塞性肺疾患(COPD)から選択される疾患または状態を治療する方法を提供し、該方法は被験者に疾患または状態を治療するために効果的な量でRTP801のポリペプチドを阻害する抗体を投与することを含む。
一態様において、本発明は、RTP801のポリペプチドを阻害するために効果的な量のRTP801のポリペプチドを阻害する抗体および薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物を提供する。
一態様において、本発明は、聴覚損失, 急性腎不全, 緑内障, 急性の呼吸困難症候群, 急性の肺傷害, 臓器移植拒絶, 虚血-再潅流傷害, 腎毒性, 神経毒性, 脊髄損傷, 褥瘡, 骨関節炎, および慢性閉塞性肺疾患(COPD)から選択される疾患または状態を罹患している被験者を治療する組成物の調製のためのオリゴヌクレオチドの治療的な有効量の使用であって、前記オリゴヌクレオチドはRTP801 遺伝子の発現を阻害する使用に関する。
また、本発明は、聴覚損失, 急性腎不全, 緑内障, 急性の呼吸困難症候群, 急性の肺傷害, 臓器移植拒絶, 虚血-再潅流傷害, 腎毒性, 神経毒性, 脊髄損傷, 褥瘡, 骨関節炎, および慢性閉塞性肺疾患(COPD)から選択される疾患または状態の治療に有用な医薬の調製のための801 siRNA化合物の使用であって、前記オリゴヌクレオチドはRTP801 遺伝子の発現を阻害する使用を提供する。
[発明の詳細な説明]
本発明(その態様の幾つかにおいて)は、とりわけ、眼疾患, 呼吸障害, 微小血管の障害, 聴覚障害および虚血状態を治療するためのRTP801 遺伝子またはポリペプチドの阻害に関する。本願の明細書等に記載されるとおり、本発明に使用される好適なインヒビターは生物学的な分子である。
理論に縛られることなく、本発明の発明者は、RTP801が微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸性の障害を含んでいる様々な病的状態に関与し、前記疾患または障害の何れかを治療するためにRTP801を阻害することが有益であろうことを見出した。RTP801を阻害する方法, 分子および組成物が本願の明細書等で詳細に議論され、前記分子および/または組成物の何れかが前記状態の何れかを患っている患者の治療に有利に使用しえる。
本発明は、インビボでRTP801 遺伝子の発現を阻害するための方法および組成物を提供する。通常、前記方法には、特定のmRNAを標的とし、それらにハイブダイズする低分子干渉RNAs (すなわち、siRNAs)などのオリゴリボヌクレオチド,または細胞においてsiRNAsを産生できる核酸物質を、RNA干渉機構で標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするために十分な量で投与することを含む。特に、対象の方法は、呼吸障害, 微小血管の障害, 眼障害および聴覚障害の治療においてRTP801 遺伝子の発現を阻害するために使用できる。
本発明は、一般にRTP801の発現をダウンレギュレートする化合物〔特に、新規の低分子干渉RNAs(siRNAs)〕に, および様々な疾患および医学的な状態の治療におけるこれらの新規のsiRNAsの使用に関する。治療される特定の疾患および状態は、聴覚損失, 急性腎不全 (ARF), 緑内障, 急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および急性の肺および呼吸器の傷害, 肺移植, 臓器移植(肺, 肝臓, 心臓, 骨髄, 膵臓, 角膜および腎移植を含む)に続く虚血-再潅流傷害, 脊髄損傷, 褥瘡, 老化性の黄斑変性症(AMD), ドライアイ症候群, 口の粘膜炎および慢性閉塞性肺疾患 (COPD)である。他の徴候には、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物, アミノグリコシド, ループ利尿薬, ヒドロキノン及びそのアナログにより誘発される毒性などの化学誘発性の腎毒性および化学誘発性の神経毒性が含まれる。
本発明に使用される好適な siRNAのリストは、表 A(配列番号3ないし70)に提供される。また、21-または23-merのsiRNA配列は、本願の明細書等に開示される19-mer 配列の5' および/または 3'の伸展によって作出できる。係る伸展は、好ましくは対応する mRNA 配列に相補的である。以前のPCTの公開番号WO06/023544 および WO07/084684に開示されるsiRNAs 化合物は、本願の明細書等に開示される新規の使用および治療の方法に使用しえる。
RTP801を阻害する方法, 分子および組成物が本願の明細書等で詳細に議論され、前記分子および/または組成物の何れかが前記状態の何れかを患っている被験者の治療に有利に使用しえる。
本発明の側面または態様がMarkush群または代替的な他のグルーピングで記載される場合、当業者は本発明がその群の任意の個々のメンバーまたはサブグループの用語で記載されることを認識する。
「インヒビター」は、遺伝子の発現を又は係る遺伝子の産物の活性を所望の生物学的または生理的な効果を達成するために十分な程度まで阻害する能力のある化合物である。本願の明細書等に使用される「インヒビター(inhibitor)」の用語は、siRNA, shRNA, アプタマー, アンチセンス 分子, miRNA および リボザイム, 同様に 抗体を含んでいる、一または二以上のオリゴヌクレオチドインヒビターを意味する。前記オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されてもよい。インヒビターは、完全な又は部分的な阻害を生じえる。
本願の明細書等に使用される「阻害(inhibit)」の用語は、遺伝子の発現を又は係る遺伝子の産物の活性を所望の生物学的または生理的な効果を達成するために十分な程度まで減少させることを意味する。阻害は、完全または部分的であってもよい。
本願の明細書等に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」の用語は、互換的(interchangeably)に使用されてもよく、デオキシリボ核酸 (DNA), および リボ核酸 (RNA)を含んでいるヌクレオチド配列を意味する。前記用語は、均等物として、ヌクレオチドのアナログから作出されるRNAまたはDNAの何れかのアナログを含むと理解される。
「オリゴヌクレオチド」は、約 2 ないし約 50 ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチド および/または リボヌクレオチドを含んでいる化合物を意味する。各々のDNAまたはRNA ヌクレオチドは、独立に天然または合成および/または修飾または無修飾であってもよい。修飾には、糖部分, 塩基部分および/またはオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド間の連結に対する変化が含まれる。本発明は、インビボでRTP801 遺伝子の発現を阻害するための方法および組成物を提供する。通常、前記方法には、細胞中でsiRNAを産生でき、RTP801 遺伝子から転写されたmRNAを標的とするオリゴリボヌクレオチド〔特に低分子干渉RNAs(即ち、siRNAs)〕または核酸物質を、RNA干渉機構で標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするために十分な量で投与することを含む。特に、対象の方法は、疾患を治療するためにRTP801遺伝子の発現の阻害に使用できる。
本発明に基づいて、RTP801 遺伝子のsiRNA 分子またはインヒビターは、様々な病状を治療するための薬として使用される。
siRNAオリゴリボヌクレオチド
表 Aは、対応するsiRNA化合物を調製するため有用なセンスおよび対応しているアンチセンスオリゴマーの核酸配列を含む。
既知の遺伝子に対応するsiRNAの選択 および 合成は、報告されている(例えば Ui-Tei et al., J Biomed Biotechnol. 2006; 65052; Chalk et al., BBRC. 2004, 319(1):264-74; Sioud and Leirdal, Met. Mol Biol.; 2004, 252:457-69; Levenkova et al., Bioinform. 2004, 20(3):430-2; Ui-Tei et al., NAR 2004, 32(3):936-48を参照されたい)。修飾型のsiRNAの使用および産生の例に関して、Braasch et al., Biochem., 2003, 42(26):7967-75; Chiu et al., RNA, 2003, 9(9):1034-48; PCTの国際公開番号WO 2004/015107 (atugen); WO02/44321 (Tuschl et al), および米国特許第5,898,031および6,107,094号を参照されたい。
いくつかのグループは、細胞内でsiRNAを産生する能力のあるDNAベースのベクターの開発を記載している。その方法には、一般に細胞内でsiRNAを形成するために効率的にプロセスされる短いヘアピンRNAsの転写が関与する〔Paddison et al. PNAS USA 2002, 99:1443-1448; Paddison et al. Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui et al. PNAS USA 2002, 8:5515-5520; および Brummelkamp et al. Science 2002, 296:550-553〕。これらの報告は、多数の内因性および外因性に発現される遺伝子を特異的にターゲティングする能力のあるsiRNAsを産生する方法を記載している。
本発明は、本発明によるRTP801の発現をダウンレギュレートする二本鎖オリゴリボヌクレオチド(例えば、siRNAs)を提供する。本発明のsiRNAは、センス鎖がRTP801 遺伝子のmRNA 配列から由来し、アンチセンス鎖がセンス鎖に相補的である二重鎖のオリゴリボヌクレオチドである。通常、標的mRNA配列からのある程度の偏りは、siRNA 活性を損なうことなく許容される〔例えば、Czauderna et al., 2003, NAR 31(11), 2705-2716を参照されたい〕。本発明のsiRNAは、mRNAを破壊する又は破壊しない転写後レベルでの遺伝子発現を阻害する。理論に縛られることなく、siRNAは、特異的な切断およびデグラデーションのためにmRNAを標的としえる及び/又は標的としたメッセージからの翻訳を阻害しえる。
本願の明細書等に使用される「リボヌクレオチド(ribonucleotide)」の用語は、天然および合成, 無修飾および修飾されたリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分, 塩基部分および/またはオリゴヌクレオチドにおけるリボヌクレオチド間の連結に対する変化が含まれる。本願の明細書等に使用される「デオキシリボヌクレオチド(deoxyribonucleotide)」の用語は、天然および合成, 無修飾および修飾されたデオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分, 塩基部分および/またはオリゴヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチド間の連結に対する変化が含まれる。
幾つかの態様において、本発明によるオリゴリボヌクレオチドは、修飾型のsiRNAを含む。様々な態様において、前記siRNAは、第一の鎖および第二の鎖を含んでいるRNA二重鎖であって、前記第一の鎖は約 18〜約 40の連続的なヌクレオチドの標的核酸に少なくとも部分的に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、前記第二の鎖は第一の鎖に少なくとも部分的に相補的なリボヌクレオチド配列を含み、前記第一の鎖および/または前記第二の鎖は前記糖部分の2'-ポジションに修飾を有している複数の群の修飾されたリボヌクレオチドを含み、各々の鎖内で各群の修飾されたリボヌクレオチドは一方または両方の側で一群のフランキングリボヌクレオチドにより隣接(flanked)され、前記一群のフランキングリボヌクレオチドを形成している各リボヌクレオチドは、無修飾のリボヌクレオチドまたは前記複数の群の修飾されたリボヌクレオチドの修飾と異なる修飾を有しているリボヌクレオチドから選択される。
一態様において、前記群の修飾されたリボヌクレオチドおよび/または前記群のフランキングリボヌクレオチドは、1ないし12の整数からなる群から選択される幾つかのリボヌクレオチドを含む。従って、前記群は、一つのヌクレオチド, 二つのヌクレオチド, 三つのヌクレオチド, 四つのヌクレオチド, 五つのヌクレオチド, 六つのヌクレオチド, 七つのヌクレオチド, 八つのヌクレオチド, 九つのヌクレオチド, 十のヌクレオチド, 十一のヌクレオチドまたは十二のヌクレオチドを含む。
前記複数の群の修飾されたヌクレオチドおよびフランキングヌクレオチドは、少なくとも一つの鎖においてあるパターンに組織化されてもよい。幾つかの態様において、第一および第二の鎖は、修飾ヌクレオチドのパターンを含む。別の態様において、一つの鎖のみが、修飾ヌクレオチドのパターンを含む。様々な態様において、前記第一の鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、前記第二の鎖の修飾ヌクレオチドのパターンと比較して同一である。
他の態様において、前記第一の鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、前記第二の鎖の修飾ヌクレオチドのパターンと比較して一または二以上のヌクレオチドがシフトされる。
幾つかの好適な態様において、アンチセンス鎖における中央のリボヌクレオチドは、無修飾のヌクレオチドである。例えば、19-オリゴマーアンチセンス鎖において、リボヌクレオチド番号10は、無修飾である; 21-オリゴマー アンチセンス鎖において、リボヌクレオチド番号11 は、無修飾である; および23-オリゴマーアンチセンス鎖において、リボヌクレオチド番号12 は、無修飾である。siRNAの修飾または修飾のパターンが存在する場合には、これが許容されるように計画されなければならない。
糖残基の2' 部分における修飾には、とりわけ、欧州特許EP 0 586 520 B1 またはEP 0 618 925 B1に記載されるとおり、アミノ, フルオロ, アルコキシ 例えば、メトキシ , アルキル, アミノ, フルオロ, クロロ, ブロモ, CN, CF, イミダゾール, カルボキシレート, チオアート, C1 〜C10 の低級アルキル, 置換された低級アルキル, アルカリルまたはアラルキル, OCF3, OCN, O-, S-,またはN-アルキル; O-, S,またはN-アルケニル; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; ヘテロシクロアルキル; ヘテロシクロアルカリル; アミノアルキルアミノ; ポリアルキルアミノまたは置換されたシリルが含まれる。
幾つかの態様において、siRNAは、一方または両方の端(ends)でブラントエンドにされる。より具体的には、siRNAは、第一の鎖の5'-末端および第二の鎖の3'-末端により規定される端で、または第一の鎖の3'-末端および第二の鎖の5'-末端により規定される端でブラントエンドにされてもよい。他の態様において、二つの鎖の少なくとも一つは、5'-末端で最低一つのヌクレオチドのオーバーハングを有してもよい。任意で、少なくとも一つの前記鎖は、3'-末端で最低一つのヌクレオチドのオーバーハングを有してもよい。前記オーバーハングは、約 1〜約 5の連続的なヌクレオチドからなってもよい。オーバーハングのヌクレオチドは、修飾または無修飾のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであってもよい。
RNA二重鎖の長さは、約 18 〜 約 40 リボヌクレオチド, 好ましくは 19, 21または23 リボヌクレオチドである。さらに、各々の鎖の長さは、独立に約 15 〜約 40 塩基, 好ましくは 18 〜23 塩基および より好ましくは 19, 21または23 リボヌクレオチドからなる群から選択される長さを有してもよい。
さらに、前記第一の鎖および前記標的核酸の間の相補性は、完全(perfect)なものであってもよい。幾つかの態様において、前記鎖は、実質的に相補的である(即ち、前記第一の鎖および前記標的核酸の間で一, 二または三までのミスマッチを有している)。実質的に相補性は、別の配列に対して約 84%より大きい相補性を意味する。例えば、19 塩基対からなる二重の領域において、一つのミスマッチは94.7% 相補性であり, 二つのミスマッチは約 89.5% 相補性であり、3つのミスマッチは約 84.2% 相補性であり, 二重鎖の領域は実質的に相補性である。従って、実質的に同一(substantially identical)は、別の配列に対して約 84%より大きい同一性(identity)を意味する。
特定の態様において、第一の鎖および第二の鎖は、各々が少なくとも一つの群の修飾されたリボヌクレオチドおよび少なくとも一つの群のフランキングリボヌクレオチドを含み、各々の群の修飾されたリボヌクレオチドは少なくとも一つのリボヌクレオチドを含み、各々の群のフランキングリボヌクレオチドは少なくとも一つのリボヌクレオチドを含み、第一の鎖の各々の群の修飾されたリボヌクレオチドは第二の鎖におけるフランキングリボヌクレオチドの群と整列され、5'の最も末端のリボヌクレオチドは修飾されたリボヌクレオチドの群から選択され、第二の鎖の3'の最も末端のリボヌクレオチドはフランキングリボヌクレオチドの群から選択される。幾つかの態様において、各群の修飾されたリボヌクレオチドは単一(a single)のリボヌクレオチドからなり、各群のフランキングリボヌクレオチドは単一のヌクレオチドからなる。
なお他の態様において、第一の鎖においてフランキングリボヌクレオチドの群を形成しているリボヌクレオチドは修飾されたリボヌクレオチドの群を形成しているリボヌクレオチドに対し3' 方向に配置された無修飾リボヌクレオチドであり、第二の鎖において修飾されたリボヌクレオチドの群を形成しているリボヌクレオチドはフランキングリボヌクレオチドの群を形成しているリボヌクレオチドに対し5' 方向に配置された修飾されたリボヌクレオチドである。幾つかの態様において、siRNAの第一の鎖は五〜約二十, 八〜十二, 好ましくは九〜十二群の修飾されたリボヌクレオチドを含み、第二の鎖は七〜十一, 好ましくは八〜十一群の修飾されたリボヌクレオチドを含む。
第一の鎖および第二の鎖は、とりわけ, ポリエチレングリコールなどの非核酸ポリマーで構成されえるループ構造によって連結されてもよい。代わりに、前記ループ構造は、修飾および非修飾のリボヌクレオチドおよび修飾および非修飾のデオキシリボヌクレオチドを含む核酸で構成されえる。
さらに、siRNAの第一の鎖の5'-末端は第二の鎖の3'-末端に連結されてもよく、または第一の鎖の3'-末端は第二の鎖の5'-末端に連結されてもよく、前記連結は核酸リンカーまたは非核酸リンカーを介している。特定の態様において、核酸リンカーは、約 2〜100核酸(好ましくは、約 2〜約 30 核酸)の間の長さを有する。
様々な態様において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x - Z 3' (アンチセンス鎖)
3' Z'-(N')y 5' (センス鎖)
式中の各々のNおよびN'は、糖残基において修飾または無修飾であってもよいリボヌクレオチドであり;各々の(N)xおよび(N')yは、各々の連続的なNまたはN'が次の NまたはN'に共有結合で結合されたオリゴマーであり;
式中のx および yの各々は、18 および 40の間の整数であり;
式中のZ および Z'の各々は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合にはそれが存在する鎖の3' 末端に共有結合性に付着する1-5の連続的なヌクレオチドであり;
式中の(N')yの配列は、配列番号1に記載のmRNAにおける約 18〜約 40の連続的な リボヌクレオチドと実質的な同一性を有しているセンス配列を含む。
幾つかの態様において、前記化合物は、リン酸ジエステル結合を含む。
様々な態様において、前記化合物は、x = yでxが18, 19, 20, 21, 22 および 23からなる群から選択される整数であるリボヌクレオチドを含む。特定の態様において、x = y =19またはx = y =23である。
幾つかの態様において、前記化合物は、ブラントエンドである(例えば、Z および Z'が両方非存在である)。代替的な態様において、前記化合物は、少なくとも一つの ZまたはZ' が存在する少なくとも一つの 3' オーバーハングを含む。以下に記載されるとおり、Z および Z'は、独立に一または二以上の共有結合性に連結された修飾または非修飾のヌクレオチド〔例えば、逆位(inverted)のdTまたはdA; dT, LNA(locked nucleic acids), ミラーヌクレオチド(mirror nucleotide)など〕を具備できる。幾つかの態様において、Z および Z'の各々は、独立にdT および dTdTから選択される。
幾つかの態様において、前記化合物は、糖残基が無修飾の一または二以上のリボヌクレオチドを含む。他の態様において、前記化合物は、糖残基が修飾された少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、前記化合物は、糖残基の2' ポジションに修飾を含む。糖残基の2' ポジションにおける修飾は、アミノ, フルオロ, アルコキシ および アルキル部分を含む。特定の好適な態様において、アルコキシ修飾は、糖残基の2' ポジションでのメトキシ部分(2'-O-メチル; 2'-O-Me; 2'-O-CH3)である。
幾つかの態様において、前記化合物は、一方または両方のアンチセンス および センス鎖に修飾された交代性リボヌクレオチドを含む。特定の態様において、前記化合物は、アンチセンス および センス鎖に修飾された交代性リボヌクレオチドを含む。幾つかの好適な態様において、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチドは、修飾されない(例えば、19-merの鎖におけるポジション 10のリボヌクレオチド)。
様々な態様において、前記化合物は、表 Aに表されるアンチセンス配列(配列番号37〜70)を含む。他の態様において、本発明は、表 Aに表されるアンチセンス配列(配列番号37〜70)を含んでいる哺乳類の発現ベクターを提供する。
特定の態様において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x 3' アンチセンス鎖
3' (N')y 5' センス鎖
式中で各々のx およびy =19であり、(N)x および (N')yは完全に相補的であり;
式中の(N)xおよび(N')yにおける交代性リボヌクレオチドが修飾されてリボヌクレオチドの糖残基において2'-O-メチル修飾を生じ;
式中の各々の(N)xの5' および 3' 末端でのNは、修飾され;
式中の各々の(N')yの5' および 3' 末端でのN'は、無修飾(unmodified)であり;
式中の (N)x および (N')yの各々は、表 Aに記載されるオリゴマー(配列番号3-70)の群から選択される。
(N)x および(N')yは、3' および 5' 末端でリン酸化または非リン酸化されてもよい。
本発明の特定の態様において、交代性リボヌクレオチドは、化合物のアンチセンス およびセンス鎖の両方で糖残基の2' ポジションで修飾される。特に、例示されるsiRNAは、2'-O-メチル(Me)基がアンチセンス鎖の一, 三, 五, 七, 九, 十一, 十三, 十五, 十七 および 十九のヌクレオチドに存在し、全く同じ修飾(すなわち、2'-O-Me基)がセンス鎖の二, 四, 六, 八, 十, 十二, 十四, 十六および十八ヌクレオチドに存在するように修飾される。その上、これらの特定のsiRNA化合物もブラントエンドにされることが注意される。
特定の態様において、本発明は、次の構造を有している化合物を提供する:
5' (N)x 3' アンチセンス鎖
3' (N')y 5' センス鎖
式中で各々のx およびy =23であり、(N)x および (N')yは完全に相補的であり;
式中の(N)xおよび(N')yにおける交代性リボヌクレオチドが修飾されてリボヌクレオチドの糖残基において2'-O-メチル修飾を生じ;
式中の各々の(N)xの5' および 3' 末端でのNは、修飾され;
式中の各々の(N')yの5' および 3' 末端でのN'は、無修飾(unmodified)であり;
式中の (N)x および (N')yの各々は、表 Aに記載されるオリゴマー(配列番号3-70)の群から選択される。
(N)x および(N')yは、3' および 5' 末端でリン酸化または非リン酸化されてもよい。本発明の特定の態様において、交代性リボヌクレオチドは、化合物のアンチセンスおよびセンス鎖の両方で修飾される。特に、例示されるsiRNAは、2'-O-メチル(2'-OMe)基がアンチセンス鎖(N)xの一, 三, 五, 七, 九, 十一, 十三, 十五, 十七, 十九, 二十一 および 二十三ヌクレオチドに存在し、全く同じ修飾(すなわち、2'-OMe基)がセンス鎖(N')yの二, 四, 六, 八, 十, 十二, 十四, 十六, 十八, 二十および二十二ヌクレオチドに存在するように修飾される。その上、これらの特定のsiRNA化合物もブラントエンドにされることが注意される。
前記化合物のアンチセンスおよびセンス鎖の一方または両方で修飾された交代性リボヌクレオチドを有している本発明の化合物の特定の態様において;19-mersおよび23-mersに関して、アンチセンス鎖の5'および3' 末端でのリボヌクレオチドは糖残基において修飾され、センス鎖の5'および3' 末端でのリボヌクレオチドは糖残基において無修飾である。21-mersに関して、センス鎖の5' および 3' 末端でのリボヌクレオチドは糖残基において修飾され、アンチセンス鎖の5' および 3' 末端でのリボヌクレオチドは糖残基において無修飾である。上述したように、アンチセンス鎖の中央のヌクレオチドが無修飾であることが好適である。
さらに、本発明は、表 Aに記載される核酸配列(配列番号37-70)そのアンチセンス鎖またはホモログを含んでいるsiRNA(ここで、一方の鎖または両方の鎖における1, 2,または3のヌクレオチドが置換され、少なくとも一つの塩基対ミスマッチが提供される)を提供する。各鎖における置換されたヌクレオチドは、好ましくは一方の鎖または両方の鎖の末端領域にある。
本発明の一つの好適な態様によると、siRNAのアンチセンス および センス鎖は、3'-末端でのみリン酸化され、5'-末端でリン酸化されない。本発明の別の好適な態様によると、アンチセンス および センス鎖は、非リン酸化される。本発明のなお別の好適な態様によると、センス鎖における最も5'のリボヌクレオチドが修飾されて、インビボでの5'-リン酸化の可能性が無効(abolish)にされる。
幾つかの態様において、(N)xまたは(N')yのどちらも3' および 5' 末端でリン酸化されない。他の態様において、(N)x および (N')yの何れか一方または両方が3'末端でリン酸化される。リン酸化された及び非リン酸化のsiRNAは、インビボで類似する活性 および 安定性を有する。
本発明は、さらに細胞において未修飾形態で上述のオリゴリボヌクレオチドを発現する能力があり、その後に適切な修飾がなされるベクターを提供する。好適な態様において、細胞は哺乳類細胞(好ましくはヒト細胞)である。
特に、本発明は、一つの鎖が5'から3'に配列番号3-70の何れか一つに記載の配列を有している連続的なヌクレオチド,又は各末端領域における二つまでのリボヌクレオチドが変更されたそのホモログを含むオリゴリボヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明による核酸は、表 A中のポリヌクレオチド(配列番号3-70)の何れか一つの少なくとも 14の連続するヌクレオチド(より好ましくは、上記の第一の鎖 および 第二の鎖から構成される二本鎖構造の任意の端で14の連続するヌクレオチド塩基対)を具備する。
所与の潜在的な長さの本発明による核酸(特に、このような本発明による核酸を形成している個々の鎖)を仮定すると、各側に対してRTP801遺伝子のコード配列と相対的に幾つかのシフトが可能であり、係るシフトが両方の方向性で1, 2, 3, 4, 5 および 6 ヌクレオチドまで可能であり、生成された二本鎖の核酸分子は本発明の範囲内であることが当業者に理解される。
薬学的組成物
本発明の化合物が原末(raw chemical)として投与される可能性があるが、それらが薬学的組成物として存在することが好ましい。従って、本発明は、一または二以上の本発明の化合物;および薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物を提供する。この組成物は、二または三以上の異なるsiRNAsの混合物を含んでいてもよい。
さらに、本発明は、RTP801を阻害するために効果的な量の一または二以上の本発明の化合物に共有結合性または非共有結合性に結合する少なくとも一つの本発明の化合物;および薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物を提供する。前記化合物は、細胞内で内因性の細胞の複合体でプロセスされ、一または二以上の本発明のオリゴリボヌクレオチドを産生する。
さらに、本発明は、薬学的に許容される担体および一または二以上の本発明の化合物を本発明のヒトRTP801遺伝子の細胞における発現を阻害するために効果的な量で含んでいる薬学的組成物を提供し、前記化合物はRTP801 mRNAの配列と実質的に相補的な配列を含んでいる。
実質的に相補的は、別の配列に対して約 84%より大きい相補性を意味する。例えば、19 塩基対からなる二重の領域において、一つのミスマッチは94.7% 相補性であり, 二つのミスマッチは約 89.5% 相補性であり、3つのミスマッチは約 84.2% 相補性であり, 二重鎖の領域は実質的に相補性である。従って、実質的に同一(substantially identical)は、別の配列に対して約 84%より大きい同一性(identity)を意味する。
さらに、本発明は、RTP801 遺伝子の発現を対照と比較して少なくとも 20%, 好ましくは 30%, なおより好ましくは 40%または50%まで阻害する方法であって、本発明のRTP801 遺伝子のmRNA 転写物を一または二以上の本発明の化合物と接触させることを含む方法を提供する。
一態様において、前記オリゴリボヌクレオチドは、本発明のRTP801 遺伝子を阻害し、その阻害は遺伝子機能の阻害, ポリペプチドの阻害およびmRNA 発現の阻害を含んでいる群から選択される。
一態様において、前記化合物はRTP801 ポリペプチドを阻害し、その阻害は機能の阻害〔とりわけ、酵素アッセイまたは本来(native)の遺伝子 / ポリペプチドの既知のインタラクター(interactor)との結合実験で検査されえる〕, タンパク質の阻害(とりわけ、ウエスタンブロッティング, ELISAまたは免疫沈降法で検査されえる)およびmRNA 発現の阻害(とりわけ、ノーザンブロット法, 定量的な RT-PCR, インサイチューハイブリッド形成法またはマイクロアレイハイブリッド形成法で検査されえる)を含んでいる群から選択される。
付加的な態様において、本発明は、RTP801 遺伝子のレベルの上昇を伴う疾患を患っている被験者を治療する方法であって、前記被験者に本発明の化合物を治療上の有効量で投与することを含み、これによって前記被験者を治療する方法を提供する。
送達
本発明のsiRNA 分子は、担体または希釈剤で調製された裸分子(naked molecules)の直接の適用によって標的組織に送達されえる。
「裸のsiRNA(naked siRNA)」の用語は、ウイルス性の配列, ウイルス性の粒子, リポソーム製剤, リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む細胞への進入を補助, 促進(promote)または増進(facilitate)するよう作用する任意の送達ビヒクルからフリーであるsiRNA 分子を意味する。例えば、PBS中のsiRNAは、「裸のsiRNA」である。
さらに、本願の明細書等に開示される任意の疾患および状態を治療するための任意の裸のsiRNA, オリゴヌクレオチド, 裸のsiRNAsの組み合わせまたは裸のsiRNA および 付加的な分子の組み合わせの投与は、本発明の範囲内である。
しかしながら、幾つかの態様において、本発明のsiRNA 分子は、リポソーム製剤およびリポフェクチン製剤などにおいて送達され、当業者に周知の方法で調製できる。このような方法は、例えば、米国特許第5,593,972, 5,589,466, および5,580,859号(これらは本願の明細書等に参照によって援用される)に記載される。
哺乳類細胞へのsiRNAの送達を特異的に増強および改善することを目的とする送達システムが開発されている〔例えば, Shen et al., FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003. 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 および Simeoni et al., NAR 2003, 31,11: 2717-2724を参照されたい〕。最近、siRNAは、霊長類における遺伝子発現の阻害のために首尾よく使用されている(例えば, Tolentino et al., Retina 24(4):660を参照されたい)。
一般に、薬学的に許容される担体, 溶媒, 希釈剤, 賦形剤, アジュバントおよびビヒクル、同様に、インプラント(implant)の担体は、本発明の活性成分と反応しない不活性な, 非毒性の固形または液体の充填剤, 希釈剤または封入物質(encapsulating material)を意味し、これらにはリポソーム および ミクロスフェアが含まれる。本発明に有用な送達システムの例には、米国特許第5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; および 4,475,196が含まれる。多くの他の係るインプラント, 送達システム, およびモジュール(modules)は、当業者に周知である。本発明の一つの特定の態様において、局所性および経皮性の製剤を選択してもよい。本発明のsiRNAsまたは薬学的組成物は、個々の被験者の臨床状態, 治療される疾患, 投与の部位および方法, 投与のスケジュール, 患者の齢, 性, 体重および医療従事者に知られる他の要素を考慮し、良好な医療プラックティスで投与され、用量が設定される。
本願の明細書等における目的のための「治療上効果的な量(therapeutically effective dose)」は、当該技術分野において既知の判断に基づいて決定される。用量は、生存率の改善または急速な回復,または症候および当業者による適切な基準として選択される他のインジケーターの改善または除去を含むが、これらに限定されない改善を達成するために効果的でなければならない。
通常、ヒトのための化合物の活性用量(active dose)は、1 ng/kgないし約 20〜100 mg/kg 体重/日, 好ましくは約 0.01 mgないし約 2〜10 mg/kg 体重/日, 一用量/日または二または三またはそれ以上の回数/日の療法の範囲を1〜4 週又はそれ以上の期間である。本発明の化合物は、投与の従来経路のいずれかで投与できる。化合物が前記化合物として又は薬学的に許容される塩として投与できること及び単独で又は薬学的に許容される 担体, 溶媒, 希釈剤, 賦形剤, アジュバント および ビヒクルと組み合わせた活性成分として投与できることに注意すべきである。化合物は、経口的に, 皮下に又は非経口的に投与でき、これには静脈内, 動脈内, 筋肉内, 腹腔内, および鼻腔内の投与、同様にクモ膜下腔内および輸液技術が含まれる。化合物のインプラントも有用である。液体の形態は注射のために調製でき、この用語には皮下, 経皮, 静脈内, 筋肉内, クモ膜下腔内, および他のペアレンタル経路(parental routes)の投与が含まれる。液体組成物には、水溶液(有機物の共溶媒の存在下および非存在下), 水性または油性の懸濁剤, 食用油とのエマルジョン剤, 同様に類似する薬学的ビヒクルが含まれる。特定の態様において、投与には、静脈内投与が含まれる。別の態様において、投与には、局所またはローカルの投与が含まれる。加えて、特定の態様において、本発明の新規の治療に使用するための組成物は、エアロゾル(例えば、鼻腔内投与用)として形成しえる。特定の態様において、経口の組成物(例えば、錠剤, 懸濁剤, 液剤)は、口腔への局所性の送達に効果的であり、例えば、口の粘膜炎の治療のための口内洗浄剤に適切な経口組成物である。
特定の態様において、投与には、静脈内投与が含まれる。別の態様において、投与には、特に局所性または全身性の作用のための眼または鼻部への局所的またはローカルの投与が含まれる。
加えて、特定の態様において、眼またはCNSの障害の治療に使用する組成物は、鼻腔内の投与に製剤化されてもよい。
幾つかの態様において、化合物は、眼の障害の治療に有用である。化合物は、標的細胞への局所性または全身性の送達のために、点眼液, ゲルまたは軟膏の形態などで、眼に直接的に投与できる。従って、化合物は、局所的な眼の製剤に導入される。化合物は、眼科学的に許容される保存剤, 界面活性剤, 粘性エンハンサー(viscosity enhancers), 浸透エンハンサー(penetration enhancers), 緩衝剤, 塩化ナトリウム, および水と混合されて、水性, 無菌の眼の懸濁液または溶液を形成してもよい。眼の溶液の製剤は、化合物を生理的に許容される等張性で水性の緩衝剤に溶解することによって調製しえる。無菌で等張性の溶液に使用するための好適な添加物には、塩化ベンザルコニウム, チメロサール, クロロブタノール, 塩化ナトリウム, ホウ酸およびその混合物が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、塩化ベンザルコニウムまたはチメロサールは、抗菌保存剤として添加される。
眼の製剤には、溶解度(例えば、界面活性剤),または粘性(例えば、ヒドロキシメチルセルロース, ヒドロキシエチルセルロース, ヒドロキシプロピルメチルセルロース, メチルセルロース, ポリビニルピロリドンなど)を増加させる因子を含ませて、結膜嚢における製剤の保持を改善しえる。ゲル化剤も使用でき、これにはゲラン(gellan)およびキサンタンガムが含まれるが、これらに限定されない。様々な態様において、眼軟膏が好適である。無菌の眼軟膏の製剤は、活性成分を適切なビヒクル、例えば、ミネラル油, 液体ラノリン,または白色ワセリンおよび任意で保存剤と混合させることによって調製しえる。局所製剤には、約 0.001重量%〜約 10重量%の活性化合物と製剤の残りに担体および局所性の薬学的成分として当該技術分野において既知の他の物質が含まれえる。
化合物(特に、本発明のsiRNA化合物)を含んでいる点眼液は、眼の様々な細胞および組織に発現される遺伝子のターゲティングに有用である。従って、本発明の化合物を含んでいる点眼液は、加齢性の黄斑変性症, 糖尿病性網膜症, 緑内障の治療に有用である。
さらに、本発明の化合物は、硝子体内注射, 網膜下注射(sub-retinal injection)または両側注射(bilateral injection)などで眼に局所的にまたは注射の形態で投与できる。
本発明の化合物の投与における更なる情報は、Tolentino等〔Tolentino et al., Retina 24 (2004) 132-138; Reich et al., Molecular vision 9 (2003) 210-216〕に見つけることができる。
別の態様において、化合物は、標的細胞への局所性または全身性の送達のために、点鼻剤(nose drops), 点鼻スプレー(nasal spray), エアロゾル, ゲルまたは軟膏の形態などで、鼻道(nasal passage)に直接的に投与できる。本発明の化合物を含んでいる製剤の鼻腔内投与は、加齢性の黄斑変性症, 糖尿病性網膜症の治療に有用である。
前記化合物の付加的な全身性の製剤も、眼球またはCNSの障害を治療するために使用しえる。このような全身性製剤は、経口, 経皮, 皮下, 静脈内, 筋肉内, および鼻腔内を含む種々の経路で投与することができる。
幾つかの態様において、本発明の化合物は、内耳の障害の治療に有用である。内耳への前記化合物の投与は、中耳内の送達, 全身投与または鼻腔内の投与を介して成立する。
本発明の治療上の組成物は、好ましくはこれらの組成物 / 化合物を含んでいるエアロゾルの吸入で又は前記組成物の鼻腔内または気管内の滴下で肺に投与される。リポソーム中に組成物を製剤化することは、吸収に利点があるだろう。さらに、前記組成物は、PFC 液体(例えば、ペルフルブロン)を含んでもよい。また、前記組成物は、本発明の化合物の複合体としてポリエチレンイミン(PEI)と製剤化しえる。
薬学的組成物の肺の送達における更なる情報に関して、文献〔Weiss et al., Human gene therapy 10:2287-2293 (1999); Densmore et al., Molecular therapy 1:180-188 (1999); Gautam et al., Molecular therapy 3:551-556 (2001); および Shahiwala & Misra, AAPS PharmSciTech 5 (2004)〕を参照されたい。さらに、siRNAに関する呼吸器製剤は、Davis等の米国特許第2004/0063654号に記載される。
付加的な投与様式(特に、聴覚障害に関連する)は、Tanaka等〔Tanaka et al. (Hear Res. 2003 Mar;177(1-2):21-31〕などに開示されたように蝸牛の正円窓膜におけるRTP801インヒビターの局所的な送達である。耳への投与の付加的な投与様式は、トランス鼓室注射(trans-tympanic injection)によるものである。
褥瘡または他の傷の治療において、薬学的組成物の投与は、好ましくはダメージをうけた領域への局所的適用によるものであるが、前記組成物は全身性にも投与しえる。
本発明の化合物の送達を改善するための付加的な製剤は、非製剤化化合物, コレステロールに共有結合性に結合する化合物, およびターゲティング抗体に結合する化合物(Song et al., Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors, Nat Biotechnol. 2005 Jun;23(6):709-17)を含むことができる。
治療の方法
別の側面において、本発明は、RTP801の異常な発現と関連する疾患または障害の治療を必要とする被験者を治療するための方法に関し、該方法は前記被験者にRTP801の発現を減少させる又は阻害する量のインヒビターを投与することを含む。
好適な態様において、治療される被験者は、温血動物であり、特にヒトを含む哺乳類である。
本発明の方法は、RTP801遺伝子の発現をダウンレギュレートさせる一または二以上の阻害性の化合物(特に被験者を治療するための治療的に有効量のsiRNA)を被験者に投与することを含む。
様々な態様において、前記インヒビターは、siRNA, shRNA, アプタマー, アンチセンス分子, miRNA, リボザイム,および抗体からなる群から選択される。現在の好適な態様において、前記インヒビターは、siRNAである。
「治療(treatment)」の用語は、治療上の治療および予防的(prophylactic)または予防的(preventative)な手段の両方を意味し、この場合の課題は上記でリストされたような障害を予防または鈍化(低下)させることである。治療が必要なものには、疾患または状態を既に経験しているもの, 疾患または状態を有する傾向にあるもの, および疾患または状態が予防されるものが含まれる。本発明の化合物は、疾患または状態またはそれと関連する症候の開始の前, 間または引き続いて投与されてもよい。治療が予防の目的のためである場合、本発明は疾患または障害の開始を遅延させる又は疾患または障害の発生を避ける(averting)ための方法に関する。
本発明は、RTP801の阻害が有益である次に記載する疾患または状態の治療においてRTP801の発現をダウンレギュレートする化合物の使用に関する〔特に新規の低分子干渉RNAs(siRNAs)に関する〕: 聴覚損失, 急性腎不全 (ARF), 緑内障, 急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および急性の肺および呼吸器の傷害, 肺移植, 臓器移植(肺, 肝臓, 心臓, 骨髄, 膵臓, 角膜および腎移植を含む)に続く虚血-再潅流傷害, 脊髄損傷, 褥瘡, 老化性の黄斑変性症(AMD), ドライアイ症候群, 口の粘膜炎および慢性閉塞性肺疾患 (COPD)である。他の徴候には、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物, アミノグリコシド, ループ利尿薬, ヒドロキノン及びそのアナログにより誘発される毒性などの化学誘発性の腎毒性および化学誘発性の神経毒性が含まれる。
RTP801遺伝子を阻害する方法, 分子および組成物が本願の明細書等で詳細に議論され、前記分子および/または組成物の何れかが前記状態の何れかを患っている被験者の治療に有利に使用しえる。RTP801に対するsiRNAの調製において有用な好適なオリゴマー配列は、表 Aにリストされた配列番号3-70に記載される。
本発明の方法には、RTP801の発現をダウンレギュレートする治療上効果的な量の一または二以上の化合物、特に本発明の新規のsiRNAs, 本願の明細書等に記載されるRTP801の小分子インヒビターまたはRTP801に対する抗体を投与することを含む。
幾つかの好適な態様において、本発明の方法は、聴覚損失の様々な状態に適用される。理論に縛られることなく、聴覚損失は、アポトーシスの内耳有毛細胞のダメージまたは欠損で生じる可能性があり、そのダメージまたは欠損は感染, 機械的な傷害, 大きな音, 加齢(老人性難聴),または化学誘発の耳毒性によって生じる。耳毒には、抗悪性腫瘍薬剤, サリチラート, キニーネ, およびアミノグリコシド系抗生物質, 食物または医薬における夾雑物, および環境のまたは産業的な汚染物を含む治療上の薬物が含まれる。典型的には、治療が行われて特に治療上の薬物の投与から生じる又は生じることが予想される耳毒性を予防する又は減少させる。好ましくは、治療上効果的な組成物は、耳毒性の影響を予防する又は減少させるための暴露後に即座に与えられる。より好ましくは、治療は、耳毒性の医薬の又は耳毒への暴露の前または同時に組成物の投与によって予防的に提供される。
本発明において「耳毒(ototoxin)」は、その化学的な作用で聴覚に関する神経系の音レセプターコンポーネントの活性を傷害し、損傷し、または阻害し、これによって次々に聴覚(および/または バランス)を損傷させる物質を意味する。本発明において、耳毒性には、内耳の有毛細胞への有害な影響が含まれる。聴覚障害を生じる耳毒性因子には、抗悪性腫瘍薬、例えば、ビンクリスチン, ビンブラスチン, シスプラチンおよびシスプラチン様化合物, タキソールおよびタキソール様化合物, ジデオキシ化合物、例えば、ジデオキシイノシン; アルコール; 金属; 職業上または環境上の曝露に関与する産業上の毒物; 食物または医薬の夾雑物;およびビタミンまたは治療上の薬物の過剰摂取(例えば、抗生物質、例えば、ペニシリンまたはクロラムフェニコール),および次に記載する物質の大量投与、ビタミン A, D,またはB6, サリチラート, キニン(quinines), ループ利尿薬,およびホスホジエステラーゼ5型(PDE5)インヒビター、例えば、クエン酸シルデナフィル〔Viagra(登録商標)〕が含まれるが、これらに限定されない。
「耳毒性因子への曝露(exposure to an ototoxic agent)」は、耳毒性因子が哺乳類で利用可能となること又は哺乳類と接触させることを意味する。耳毒性因子への曝露は、食物, 医薬,または治療薬(例えば、化学療法剤)の摂取または投与などの直接の投与によって又は偶発的な混入によって又は環境的な曝露(例えば、空気または水の曝露)によって起こりえる。
聴覚の損失または損傷は、音響性外傷, ウイルス性の内リンパ内耳炎(viral endolymphatic labyrinthitis), メニエール病などの内耳の有毛細胞が関与している終末器官の傷害による可能性がある。聴覚障害には耳鳴が含まれ、これは聴覚刺激の非存在下での音の認識であり、間欠的または連続的である可能性があり、感音性欠損(sensorineural loss)と診断される。聴覚損失は、細菌またはウイルスの感染、例えば、耳ヘルペス, 次に記載のものから生じる化膿性迷路炎(purulent labyrinthitis)、急性中耳炎, 化膿性髄膜炎, 慢性中耳炎, 次に記載のものを含む突発難聴、ウイルス性の突発難聴、例えば、おたふく風邪, はしか, インフルエンザ, 水疱瘡, 単核球症(mononucleosis)および アデノウイルスを含むウイルスによるウイルス性内リンパ内耳炎(viral endolymphatic labyrinthitis)による可能性がある。聴覚損失は、先天性のものであってもよく、例えば、風疹, 出生の間の無酸素, 出産の間の外傷が原因となる内耳への出血, 母親に投与された耳毒性の薬物, 胎児性赤芽球症, およびワールデンブルグ症候群およびフルラー症候群を含む遺伝状態により生じるものである。
聴覚損失は、ノイズ誘発性(noise-induced)のものであってもよく、一般に内耳にダメージを与える85デシベル(db)以上の騒音が原因となる。本発明の特定の側面において、聴覚損失は、内耳(特に、内耳の有毛細胞)の聴覚部分(auditory portion)に影響する耳毒性薬によって生じる。本明細書中に参照によって援用されるものは、メルクマニュアル〔The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 14th Edition, (1982), Merck Sharp & Dome Research Laboratories, N.J.〕の196, 197, 198および199章並びに聴覚およびバランス欠陥(balance impairments)の記載および診断に関連する207および210章を含んでいる最近の16版における対応する章である。
哺乳類を治療するための方法および組成物を提供し、治療が必要な哺乳類に本発明の組成物を投与することにより、聴覚障害, 障害または不均衡(好ましくは、耳毒誘発性の聴覚状態)を予防, 減少,または治療することが本発明の課題である。本発明の一つの態様は、耳毒性が治療上効果的な量の耳毒性の薬学的な薬物の投与で生じる聴力障害または損傷を治療するための方法である。典型的な耳毒性の薬物は、抗悪性腫瘍薬, および 抗生物質などの化学療法剤である。他の可能な候補には、ループ利尿薬, キニーネまたはキニーネ様化合物, および サリチル酸塩(salicylate)またはサリチル酸塩様化合物(salicylate-like compounds)が含まれる。
本発明の方法および組成物は、耳毒性の化合物が抗生物質(好ましくは、アミノグリコシド系抗生物質)である場合に特に効果的である。耳毒性のアミノグリコシド系抗生物質には、ネオマイシン, パロモマイシン, リボスタマイシン, リビドマイシン, カナマイシン, アミカシン, トブラマイシン, バイオマイシン, ゲンタマイシン, シソマイシン, ネチルマイシン, ストレプトマイシン, ジベカシン, フォルチマイシン(fortimicin), および ジヒドロストレプトマイシン,又はその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。特定の抗生物質には、ネオマイシン B, カナマイシン A, カナマイシン B, ゲンタマイシン C1, ゲンタマイシン C1a, および ゲンタマイシン C2が含まれる。
本発明の方法および組成物は、耳毒性の化合物が抗悪性腫瘍薬(例えば、ビンクリスチン, ビンブラスチン, シスプラチンおよびシスプラチン様化合物および タキソールおよびタキソール様化合物)である場合にも効果的である。
本発明の方法および組成物は、音響性外傷または機械的な外傷(好ましくは、内耳の有毛細胞の欠損を導く聴覚性のまたは機械的な外傷)の治療にも効果的である。本発明で処理される音響性外傷は、極度に大きな音への単回の暴露,または毎日85デシベル以上の大きな音への長期の曝露によって生じる可能性がある。本発明で処理される機械的な内耳の外傷は、例えば、内耳に挿入する電気的な装置の作業の後の内耳の外傷である。本発明の組成物は、作業と関連する内耳の有毛細胞へのダメージを予防するまたは最小化する。
幾つかの態様において、本発明の組成物は、耳毒と共投与される。例えば、改善法は、アミノグリコシド系抗生物質の投与によって哺乳類の感染を治療するために提供され、その改善にはRTP801の発現をダウンレギュレートする治療上効果的な量の一または二以上の化合物(特に、新規のsiRNA 化合物)を、係る治療を必要とする被験者に投与して、抗生物質と関連する耳毒誘発性の聴覚障害を減少または予防することを含む。RTP801の発現をダウンレギュレートする化合物、特に新規のsiRNA化合物は、好ましくは内耳内に局所的に投与される。
なお別の態様において、化学療法的な化合物の投与により哺乳類における癌を治療するための改善法が提供され、その改善には本発明の組成物の治療上効果的な量を、係る治療を必要とする被験者に投与して、化学療法薬と関連する耳毒誘発性の聴覚障害を減少または予防することを含む。耳毒誘発性の聴覚障害を減少または予防する化合物、例えば、新規のsiRNA化合物は、特に、好ましくは内耳内に局所的に投与される。
別の態様において、治療の方法は、耳毒性の副作用を治療するための化学療法剤の投与から生じる聴覚損失の治療に適用される。本発明の方法にしたがう耳毒性の化学療法剤には、抗悪性腫瘍薬(シスプラチンまたはシスプラチン様化合物, タキソールまたはタキソール様化合物を含む),および耳毒誘発性の聴覚障害を生じると信じられている他の化学療法剤、例えば、ビンクリスチン, 血液学的な悪性腫瘍(hematological malignancies)および肉腫を治療するための抗悪性腫瘍薬が含まれるが、これらに限定されない。シスプラチン様化合物には、とりわけ、カルボプラチン〔Paraplatin (登録商標)〕, テトラプラチン, オキサリプラチン, アロプラチン(aroplatin)およびトランスプラチン(transplatin)が含まれる。
別の態様において、本発明の方法は、耳毒性の副作用を治療するために、典型的にはマラリアの治療に使用されるキニーネ及びその合成置換体(synthetic substitutes)の投与から生じる聴覚障害に適用される。
別の態様において、本発明の方法は、耳毒性の副作用を治療するための利尿薬の投与から生じる聴覚障害に適用される。利尿薬(特に「ループ」利尿薬、即ち、ヘンレ係蹄で主に作用するもの)は、候補の耳毒である。例(本発明の方法を限定しない)には、フロセミド, エタクリル酸, および水銀剤(mercurials)が含まれる。利尿薬は、典型的には浮腫を予防または除くために使用される。利尿薬は、高血圧症, 高カルシウム血症, 特発性高カルシウム尿症, および腎性尿崩症などの非浮腫状態(nonedematous states)にも使用される。
別の好適な態様において、本発明の化合物は、急性腎不全、特に外科施術後の患者における虚血が原因の急性腎不全, および化学療法治療(例えば、シスプラチン投与)が原因の急性腎不全または敗血症関連性の急性腎不全を治療するために使用される。本発明の化合物の好適な使用は、大きな心臓外科または血管外科を経験している高リスクの患者における急性腎不全の予防に関する。高リスクで急性腎不全を発症する患者は、Cleveland ClinicのアルゴリズムまたはUS Academic Hospitals (QMMI)により及びVeterans' Administration (CICSS)により開発されたものなどの様々なスコアリング法を用いて同定できる。本発明の化合物の他の好適な使用は、腎臓移植患者における虚血性の急性腎不全の予防に関する又は化学療法を受けている患者における毒性の急性腎不全の予防に関する。
別の好適な態様において、本発明の化合物は、緑内障を治療するために使用される。緑内障の主なタイプは、原発性開放隅角緑内障(POAG), 閉塞隅角緑内障(angle closure glaucoma), 正常眼圧緑内障(normal tension glaucoma)および小児緑内障(pediatric glaucoma)である。これらは眼内圧(IOP)または眼の内側の圧力の増加でマークされる。視覚神経のダメージが正常なIOPであるにもかかわらず生じた場合、これは正常眼圧緑内障(normal tension glaucoma)と称される。続発性緑内障(Secondary glaucoma)は、別の疾患が眼圧の増加を生じ又は寄与し、視覚神経ダメージ(optic nerve damage)および失明(vision loss)に至る任意のケースを意味する。
別の好適な態様において、本発明の化合物は、利尿薬, β-ブロッカー, 血管拡張因子, ACEインヒビター, シクロスポリン, アミノグリコシド系抗生物質(例えば、ゲンタマイシン), アンホテリシン B, シスプラチン, 放射線造影剤(radiocontrast media), 免疫グロブリン, マンニトール, NSAIDs (例えば、アスピリン, イブプロフェン, ジクロフェナク), シクロホスファミド, メトトレキセート, アシクロビル, ポリエチレングリコール, β-ラクタム抗生物質, バンコマイシン, リファンピシン, スルホンアミド, シプロフロキサシン, ラニチジン, シメチジン, フロセミド, チアジド系化合物, フェニトイン, ペニシラミン, リチウム塩, フッ化物, デメクロサイクリン, フォスカーネット, アリストロキン酸などの腎毒素によって生じるダメージを治療する又は予防するために使用される。
別の好適な態様において、本発明の化合物は、脊髄損傷、特に交通事故, 落下(falls), スポーツ傷害(sports injuries), 産業災害(industrial accidents), 銃創による脊髄外傷(spinal cord trauma), 脊髄の衰え(例えば、関節リウマチまたは骨粗鬆症からの)による又は脊髄を保護している脊柱管が通常の加齢により非常に狭くなる(脊髄狭窄)場合の脊髄外傷によって生じるダメージ、脊髄が引かれる、横に押される、または圧縮されるさいに生じる直接のダメージ, 脊髄の内側または脊髄の外側(しかし、脊柱管内)の出血, 液体の蓄積(fluid accumulation), および腫脹につづく脊髄へのダメージを治療する又は予防するために使用される。また、本発明の化合物は、ポリオまたは二分脊髄(spina bifida)などの疾患が原因の脊髄損傷によって生じるダメージを治療する又は予防するために使用される。
他の態様において、本発明の化合物および方法は、急性の肺傷害、特に虚血/再潅流傷害または酸化ストレスから生じる状態の発生または重症化を治療する又は予防するために有用である。例えば、コロナウイルスの感染またはエンドトキシンによる急性呼吸窮迫症候群(ARDS), 重症急性呼吸器症候群(SARS;severe acute respiratory syndrome), 肺移植および他の急性の肺傷害と関連する虚血再潅流傷害。
他の態様において、本発明の化合物および方法は、肺, 肝臓, 心臓, 骨 膵臓, 腸, 皮膚, 血管, 心臓弁, 骨および腎臓の移植を含む臓器移植につづくダメージを治療する又は予防するために有用である。
「臓器移植(organ transplant)」の用語は、とりわけ, 肺, 腎臓, 心臓, 皮膚, 静脈, 骨, 軟骨, 肝臓の移植を含む任意の一または二以上の臓器の移植を包括的に意味する。異種移植を特定の状況において企図できるが、同種移植が通常好ましい。自家移植は、骨髄, 皮膚, 骨, 軟骨 および/または 血管の移植に考慮できる。
本発明のsiRNA化合物は、特に灌流傷害を軽減させること, 治療すること又は予防することを含む臓器移植の有害な影響を経験している被験者の治療に有用である。
臓器移植に関して、ドナーまたはレシピエントまたは両方は、本発明の化合物または組成物で治療しえる。従って、本発明は、臓器ドナーまたは臓器レシピエントを治療する方法に関し、該方法は臓器ドナーまたは臓器レシピエントに治療上効果的な量の本発明の化合物を投与する工程を含む。
さらに、本発明は、臓器を保存するための方法に関し、該方法は臓器を効果的な量の本発明の化合物で接触させることを含む。また、本発明は、手術の間の及び/又は被験者からの臓器の除去につづく臓器の傷害(特に、再潅流傷害)を減少または予防するための方法を提供し、該方法は臓器を本発明の化合物を含む臓器保存溶液に配置(placing)することを含む。
他の態様において、本発明の化合物および方法は、患者における他の疾患および状態の発生または重症化を治療する又は予防するために有用である。これらの疾患および状態には、発作および発作様の状況(例えば、大脳, 腎臓, 心臓の不全), ニューロンの細胞死, 再灌流の有り無しでの脳傷害, 慢性の変性疾患、例えば、神経変性疾患、アルツハイマー病, ハンチントン病, パーキンソン病, 多発性硬化症, 筋萎縮性側索硬化症, 脊髄延髄萎縮症(spinobulbar atrophy), プリオン病, および外傷性の脳傷害(TBI;traumatic brain injury)によるアポトーシスが含まれる。
本発明の化合物および方法は、神経保護を提供すること, または脳保護を提供すること, または自己免疫疾患および移植拒絶と関連する細胞傷害性T細胞およびナチュラルキラー細胞のアポトーシスを予防および/または治療すること, 心臓細胞の細胞死(心不全, 心筋症, 心臓のウイルスの感染または細菌の感染, 心筋虚血, 心筋梗塞,および心筋虚血, 冠動脈バイパス移植を含む)を予防すること,化学療法またはHIV治療の結果としてなどのミトコンドリアの薬物毒性を予防および/または治療すること,ウイルスの感染または細菌の感染の間の細胞死を予防すること,または炎症または炎症性の疾患, 炎症性の腸疾患, 敗血症および敗血症ショックを予防および/または治療すること,または濾胞から卵母細胞の段階, 卵母細胞から成熟卵の段階および精子の細胞死を予防すること(例えば、卵巣組織を凍結および移植する方法, 人工授精),または化学療法後の哺乳類(特に、ヒト哺乳類)における受胎能を温存すること,または黄斑変性症を予防および/または治療すること,または急性肝炎, 慢性活性肝炎(chronic active hepatitis), B型肝炎,およびC型肝炎を予防および/または治療すること,または脱毛症〔例えば、男性型脱毛症(male-pattern baldness)による脱毛症,または放射線, 化学療法または情動ストレスによる脱毛症)を予防すること,または皮膚ダメージを治療または軽減させること〔この皮膚ダメージは高レベルの放射線, 熱, 化学物質, 日光(sun),または火傷(burns)への暴露および自己免疫疾患による可能性がある〕,または骨髄異形成症候群(MDS)における骨髄細胞の細胞死を予防すること, 膵炎を治療すること, 関節リウマチ, 乾癬, 糸球体腎炎, アテローム性動脈硬化症,および移植片対宿主病 (GVHD)を治療すること,または網膜周皮細胞(retinal pericyte)のアポトーシス, 虚血から生じる網膜ダメージ, 糖尿病性網膜症を治療すること,またはアポトーシス細胞死の増加と関連する任意の病的状態を治療することに関する。
また、本発明は薬学的組成物を調製するための方法を提供し、該薬学的組成物は以下のものを含む:
一または二以上の二本鎖の本発明の化合物を提供すること;および
前記化合物を薬学的に許容される担体と混合すること。
また、本発明は、一または二以上の本発明の化合物を薬学的に許容される担体と混合することを含む薬学的組成物を調製する方法を提供する。
好適な態様において、薬学的組成物の調製に使用される化合物は、担体と薬学的な有効量で混合される。特定の態様において、本発明の化合物は、ステロイドまたは脂質または別の適切な分子(例えば、コレステロール)と抱合(conjugated)される。
治療される状態
慢性閉塞性肺疾患(COPD)
慢性閉塞性肺疾患 (COPD)は、千六百万以上のアメリカ人を冒しており、合衆国において四番目に大きな死亡原因である。タバコの喫煙は多くの消耗性の疾患の発生の原因であるが、他の環境因子を除外しない(Petty TL. 2003. Clin. Cornerstone, 5-10)。
肺気腫は、COPDの主要な徴候である。末梢の空隙, 遠位から末端の細気管支の恒久的な破壊が気腫の特徴である(Tuder,et al . Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003.)。気腫(Emphysema)は、細気管支および肺胞構造における炎症細胞(例えば、マクロファージおよび好中球)の蓄積によって特徴付けられる(Petty, 2003)。
気腫の病因は、複雑で多因子性である。ヒトにおいて、炎症細胞によって産生されるプロテアーゼのインヒビター(例えば、アルファ1-アンチトリプシン)の欠乏がプロテアーゼ/アンチプロテアーゼ不均衡に寄与することが示されており、これによってタバコ煙(CS;cigarette-smoke)誘発性の気腫において肺胞の細胞外基質の破壊が是認される(Eriksson, S. 1964. Acta Med Scand 175:197-205. Joos, L., Pare, P.D., and Sandford, A.J. 2002. Swiss Med Wkly 132:27-37)。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMPs)は、マクロファージメタロエラスターゼノックアウトマウスのCSの慢性吸入で生じる気腫に対する抵抗性により示されたとおり、実験的な気腫において中心的な役割を担っている(Hautamaki, et al: Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science 277:2002-2004)。そのうえ、トランスジェニックマウスにおけるインターロイキン-13の肺の過剰発現によって、MMP-およびカテプシン-依存的な気腫が生じる(Zheng, T., et al 2000. . J Clin Invest 106:1081-1093)。酸化ストレスおよびアポトーシスは、相互に作用し、血管内皮成長因子のブロック(blocade)による気腫を生じる。Am J Respir Cell Mol Biol, 29:88-97; 2003.; Yokohori N, Aoshiba K, Nagai A, Chest. 2004 Feb;125(2):626-32.; Aoshiba K, Yokohori N, Nagai A.,. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 May;28(5):555-62.)。吸入されたタバコ煙からの活性酸素種(ROS)および炎症細胞により内因性に形成されたものの両方は、肺内のオキシダント負荷の増加に寄与する。
COPDの病因に関連する付加的な病原性因子は、気腫の患者の肺におけるVEGF および VEGFRIIの発現において観察される減少である(Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Carlyne D. Cool, David A. Lynch, Sonia C. Flores, and Norbert F. Voelkel.. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001)。そのうえ、化学的なVEGFRインヒビターを用いるVEGFシグナル伝達の阻害によって、肺胞中隔内皮(alveolar septal endothelial)および上皮細胞のアポトーシスが導かれ、これはおそらく肺胞内の両方のタイプの細胞の密接な構造的/機能的な結合の破壊によるものである〔Yasunori Kasahara, Rubin M. Tuder, Laimute Taraseviciene-Stewart, Timothy D. Le Cras, Steven Abman, Peter K. Hirth, Johannes Waltenberger, and Norbert F. Voelkel.. J. Clin. Invest. 106:1311-1319 (2000).; Voelkel NF, Cool CD.. Eur Respir J Suppl. 2003 Nov;46:28s-32s〕。
黄斑変性症
USにおける65齢以上の個体における最高矯正視力(best-corrected vision)の減少の最も一般的な原因は、老化性の黄斑変性症 (AMD)として知られる網膜障害(retinal disorder)である。AMDが進行するにつれて、鮮明な中心視覚が欠損し、この事項によってこの疾患は特徴付けられる。AMDによって影響される眼の領域は、主に光受容器細胞から構成される黄斑(網膜の中心部の小さい領域)である。いわゆる「ドライ」AMD(AMD患者の約 85% - 90%と計算される)には、眼の色素分布, 光受容器の欠損および細胞の全体の萎縮による網膜機能の減少における変化が関与する。いわゆる「ウェット(wet)」AMDは、網膜下間隙(sub-retinal space)において血餅(clots)または傷(scars)を生じる異常な脈絡叢管(choroidal vessels)の増殖が関与する。このように神経網膜下の異常な脈絡叢の新生血管ネットワーク(脈絡叢の新生血管形成, CNV)の形成が理由でウェットAMDが開始する。新しく形成された血管は、漏出性が過剰である。これによって網膜下液および血液の蓄積が導かれ、視力が失われる。最終的に、関与する領域において機能的な網膜は、全損(total loss)し、脈絡膜および網膜の形態が関係している大きい円板状の傷として存在する。ドライAMDの患者は質の低下した視覚を保持する可能性があるが、ウェットAMDはしばしば失明にいたる。Hamdi & Kenney, Frontiers in Bioscience, e305-314, May 2003)。CNVはウェットAMDのみならず、眼球のヒストプラスマ症候群, 網膜色素線条(angiod streaks), Bruch's膜の破裂, 近視性変性, 眼球の腫瘍および幾つかの網膜変性疾患などの他の眼科の病理にも生じる。
VEGF および VEGF-R1 (Flt-1)を阻害するsiRNA 分子(それぞれ、AMDの治療に関する)は、臨床試験中である(Acuity PharmaceuticalsおよびSirna Therapeutics)
微小血管の障害
微小血管障害は、微視的毛細管(microscopic capillaries)およびリンパ管に主に影響する広範なグループから構成され、直接の外科的な介入の適用範囲外である。微小血管疾患は、血管攣縮性, 血管炎(vasculitis)およびリンパ性の閉塞へと広範にグループ分けできる。さらに、既知の血管の状態の多くは、微小血管のエレメントを有する。
血管攣縮性の疾患: 血管攣縮性の疾患は、未知の理由のために末梢の血管収縮反射が過敏である比較的に共通の状態の一群である。これによって、不適切な血管狭窄および組織の虚血を生じ、さらに組織の欠損にまで至る。血管攣縮性の症候は、通常温度または振動機構の使用に関するが、他の状態に対する二次的なものであってもよい。
血管炎疾患(Vasculitic Disease): 血管炎疾患は、微小循環における主な炎症性プロセスが関与するものである。血管炎は、通常、自己免疫または結合組織障害の一種であり外科療法は一般に 受け入れられないが、症候が重篤な場合には免疫抑制薬治療が必要とされる。
リンパ閉塞疾患(Lymphatic Occlusive Disease): 下肢または上肢の慢性腫脹(lymphoedema)は、末梢リンパの閉塞の結果である。これは多数の原因を有し、幾つかは遺伝性、幾つかは獲得性の相対的に稀な状態である。治療の主要なものは、正確に適合した圧迫性の外衣および間欠性の圧迫装置の使用である。
糖尿病と関連する微小血管の病状
糖尿病は、失明の主な原因であり、手足の切断(amputations)およびインポテンツの一番の原因であり、最も頻繁に生じる慢性の幼児疾患の一つである。糖尿病は、合衆国における終末期の腎疾患の主な原因であり、他の腎臓の疾患と比べて31%の罹患率である。糖尿病は、最も頻繁に腎移植が適応され、全ての移植手術の22%と計算される。
通常、糖尿病合併症は、微小血管または大血管の疾患として広く分類できる。微小血管の合併症には、神経障害(神経ダメージ), 腎症(腎臓疾患) および 視覚 障害(例えば、網膜症, 緑内障, 白内障 および角膜の疾患)が含まれる。網膜, 糸球体, および神経の脈管(vasa nervorum)において、類似する病態生理学的な特性により糖尿病特異的な微小血管の疾患が特徴づけられる。
更なる情報に関して、Larsen〔Larsen: Williams Textbook of Endocrinology, 10th ed., Copyright {C} 2003 Elsevier〕を参照されたい。
微小血管の合併症は、顕性糖尿病(overt diabetes)のみならず、耐糖能異常(IGT;Impaired Glucose Tolerance)によっても生じる。IGTの微小血管の合併症: 神経障害, 網膜症, および 腎臓の尿中微量蛋白
糖尿病性神経障害
糖尿病性神経障害は、真性糖尿病と関連する神経障害(末梢神経のダメージ)である。これらの状態は、通常神経を供給する小さい血管(神経血管)が関与している糖尿病性の微小血管傷害から生じる。糖尿病性神経障害と関連する可能性がある相対的に共通の状態は、第三神経麻痺(third nerve palsy); モノニューロパチー; 多発性モノニューロパチー; 糖尿病筋萎縮; 有痛性ポリニューロパチー(painful polyneuropathy); 自律神経性ニューロパシー; および胸腹部のニューロパシーおよび最も共通の形態の主に足および脚に影響する末梢神経障害(peripheral neuropathy)を含む。糖尿病性神経障害の発生に関与する四つの因子が存在する〔つまり、微小血管疾患, 高度に糖化された最終産物(advanced glycated end products), プロテインキナーゼC, およびポリオール経路〕。
糖尿病性神経障害における微小血管疾患
神経障害は、2型糖尿病を伴う患者の半分以上に生じる糖尿病の共通の合併症である。神経伝導の研究は、神経障害が既に糖尿病との診断の時点で10-18%の患者に存在していることを実証しており、末梢神経の傷害が疾患の早期段階で中等度の糖血症の調節不全を伴い発生することを示唆している。神経障害が糖尿病の早期の臨床徴候であるとの概念は>40 年前に提案され、殆どの研究がIGTおよび神経障害の間の関連性を報告している。IGTおよび関連する神経障害を伴う殆どの患者は、顕著な神経障害性の痛みを伴う対称性の遠位知覚多発性神経障害(distal sensory polyneuropathy)を有する。IGT 神経障害 (Robinson Singleton,Perspectives in Diabetes, in Diabetes December 1, 2003)は、痛みを含む感覚性の症候および自律神経性の機能不全も生じる早期の糖尿病性神経障害と表現型が類似する。早期の糖尿病性神経障害を伴う669の患者の調査において、>60%に感覚性の症候、40%近くにインポテンツ、および33%に他の自律神経性の関与が存在するが、運動性の関与の証拠はわずか12%に存在する。これらの臨床所見は、痛み(pain), 温度, および自律神経性のシグナルを送る小さい無髄神経線維の顕著な早期の関与を示唆する。皮膚のバイオプシーからの無髄の表皮内の神経線維の直接の定量化によって、IGT および 早期の糖尿病と関連する神経障害を有する患者における類似する線維欠損および変化した形態が示されている。
糖尿病における神経ダメージは、運動性, 感覚性, および自律神経性の線維に影響する。運動性の神経障害は、筋肉の虚弱, 萎縮症(atrophy), および不全麻痺(paresis)を生じる。感覚性の神経障害によって、痛み, 圧力, および熱から防御する感覚が欠損する。痛みが存在しないことによって、潰瘍形成, 気のつかない外傷, およびシャルコー神経性関節症(Charcot neuroarthropathy)を含む多くの足の無感覚の問題が導かれる。
感覚運動の多発神経障害
長い神経線維は、短いものよりも程度が大きく影響される。というのも、神経伝導速度が神経の長さに比率して遅くなるからである。この症候群において、感覚の低下および反射の欠損が、最初に足指に両側性に生じ上向きに進展する。これは、しびれ感(numbness), 感覚の欠損(sensory loss), 感覚不全(dysesthesia)および夜間の痛み(nighttime pain)が手袋・靴下状分布(glove-stocking distribution)するとして記載される。その痛みは、灼熱感があり, 突き刺す感覚で, 疼痛(achy)または鈍痛(dull)と感じられる。ピンおよび針で刺すような感覚は、共通する。固有受容性感覚(すなわち、肢がそこの空間にあるという感覚)の欠損は、早期に影響される。これらの患者は、異物(破片のような)上で足踏みしていること又は合わない靴(ill-fitting shoe)への無感覚感(callous)の進展を感じることができない。結果的に、彼等は、切断に至る可能性がある足(feet)および脚(legs)における潰瘍および感染を発生するリスクがある。同様に、これらの患者は、膝, 足首または足を複数骨折し、シャルコー関節を発生する可能性がある。運動機能の欠損によって、槌状足指症と称される足趾の背屈拘縮(dorsiflexion contractures)が生じる。これらの拘縮は、足のみならず手にも生じる。
自律神経性の神経障害
自律神経系は、心臓, GI管(GI tract)および泌尿器系に働く神経から構成される。自律神経性の神経障害は、任意のこれらの器官系に影響する可能性がある。糖尿病における最も一般に認識された自律神経性の機能不全は、患者が起立するさいの起立性低血圧または失神(fainting)などの不愉快な感覚である。糖尿病性自律神経性の神経障害の場合、このような症状は血液を絶えず十分に脳に流れるよう保持するために心拍数および血管緊張(vascular tone)を適切に調整する心臓および動脈の不全による。通常、この症状は、洞(sinus)の呼吸での変異(すなわち、正常な呼吸で認められる心拍数における通常の変化)の欠損を伴う。これらの二つの所見が存在する場合、心臓の自律神経性の神経障害が存在する。
GI管の徴候には、遅延性の胃内容排出(delayed gastric emptying), 胃不全麻痺(gastroparesis), 悪心(nausea), 膨満(bloating), および下痢(diarrhea)が含まれる。多くの糖尿病患者は糖尿病の経口薬を摂取するので、これらの薬の吸収は遅延性の胃内容排出で非常に影響される。これによって、次の場合に血糖症が導かれる〔つまり、経口の糖尿病剤が食事の前に摂取され、何時間(または時々何日も)も吸収されない場合、正常または低い血糖が既に存在する場合〕。小腸での緩やかな移動は細菌の過成長を生じ、高血糖の存在で悪化する。これによって、膨満, ガス および 下痢が生じる。
泌尿器の症候には、尿の頻度(frequency), 切迫(urgency), 失調(incontinence)および保持(retention)が含まれる。また、甘い尿を保持することが理由で尿路感染が頻繁である。尿の貯留(Urinary retention)によって、膀胱の憩室, 結石, 逆流性腎症(diverticula)を生じる可能性がある。
脳神経障害
脳神経が影響される場合、動眼(3rd)ニューロパチーが最も多く見られる。動眼神経は、眼を動かす全ての筋肉を制御する〔但し、外直筋(lateral rectus)および上斜筋(superior oblique muscles)を除く〕。また、それは瞳孔を収縮する及び眼瞼を開くために機能する。糖尿病性の第三神経麻痺の開始は、通常急激で前面または眼窩周囲の痛みで始まり、次に複視(diplopia)となる。第三神経で支配される全ての動眼筋が、影響される可能性がある(但し、瞳孔サイズを制御するものを除く)。眼の外直筋(眼を側方に動かす)を支配する外転神経である第六神経も通常影響されるが、滑車神経(眼を下向きに動かす上斜筋を神経支配する)である第四神経の関与はまれ(unusual)である。胸部または腰部の脊髄神経のモノニューロパシーが起こり、心筋梗塞, 胆嚢炎または虫垂炎に似た有痛性の症候群が誘導される。糖尿病は、絞扼性神経障害(例えば、手根管症候群)の発生率が高い。
糖尿病性肢虚血(Diabetic Limb Ischemia)および糖尿病性足部潰瘍(Diabetic foot ulcers)
糖尿病および圧力によって、微小血管循環が障害され、下肢の皮膚に変化が誘発され、次々に潰瘍の形成および引き続く感染が誘発される可能性がある。微小血管の変化によって、肢の筋肉の微小血管障害、同様に、末梢性の虚血を発生する素因(predisposition)および虚血イベントへの血管形成代償性応答の減少が誘発される。微小血管の病状によって、末梢血管疾患(PVD;Peripheral Vascular Disease)または末梢動脈疾患(PAD;Peripheral Arterial Disease)または下肢動脈疾患(LEAD;Lower Extremity Arterial Disease) ― MACRO血管合併症 ― アテローム性動脈硬化症が原因の脚における動脈の狭小化が悪化する。PVDは、糖尿病の早期に発生し、重篤で広範性(widespread)であり、しばしば脚, 目, および腎臓に影響する併発性(intercurrent)の微小循環の問題を伴う。
足の潰瘍および壊疽は、頻繁にPADに合併する状態である。感覚の損傷を伴う同時発生的な末梢神経障害は、足を外傷, 潰瘍形成, および 感染に感受性にする。糖尿病におけるPADの進行は、末梢神経障害および足および下肢の痛みおよび外傷への非感受性のような同時罹患によって悪化する。循環の損傷および感覚の損傷によって、潰瘍形成および感染が起こる。骨髄炎および壊疽への進行は、切断術を必要とする可能性がある。糖尿病を伴う人物は非糖尿病の人物より25倍にまで下肢切断を経験する可能性が高く、足の潰瘍および引き続く肢欠損(limb loss)を予防する必要性が強調される。
更なる情報に関して、Larsen〔American Journal of Surgery, Volume 187 Number 5 Suppl 1 May 1, 2004, Copyright (C) 2004 Elsevier〕を参照されたい。
糖尿病における冠血管微小血管の機能不全
糖尿病における組織病理学および微小循環の機能不全の間の相関は、古い実験研究から及び剖検から周知であり、剖検では基底膜の肥厚, 血管周囲の線維症, 脈管の希薄化(vascular rarefication), および毛細管性出血が頻繁に見つけられる。最近の文献が病状および眼球の微小血管の機能不全の間の相関を実証したにもかかわらず、これらのデータをインビボで確認することはなお困難である(Am J Physiol 2003;285)。しかしながら、多くの臨床研究は、顕性糖尿病(overt diabetes)のみならず、代謝性の制御の損傷も冠血管の微小循環に影響する可能性を指摘している(Hypert Res 2002;25:893)。Sambuceti等〔Sambuceti et al (Circulation 2001;104:1129)〕は、梗塞が関連している動脈の再開通が成功した後の患者における微小血管の機能不全の持続を示しており、これらの患者における心血管の罹病率(morbidity)および死亡率の増加が説明できる。大規模な急性再灌流研究から罹病率および死亡率が動脈と関連する梗塞を再開通することと無関係であるが、TIMI flow+/- 心筋内微細血管陰影(myocardial blush)に依存的であるとの山のような証拠がある(Stone 2002; Feldmann Circulation 2003)。Herrmannは、とりわけ、冠血管微小循環の統合性がこれに関連しておそらく最も重要な臨床および予後の因子であることを指摘している(Circulation 2001)。保護の装置(protection devices)は中立的に影響するだろうから(TIMI flow, ST解像度,またはMACEに関する関連性のある変化なし)、微小循環の機能的な損傷が予後の主要な決定要因であることが指摘されるだろう。冠血管微小血管の機能不全が非閉塞性CADの主な原因であるとの多くの証拠が存在する。冠血管内皮の機能不全は、これらの患者における強い予後の予知因子である。
糖尿病性腎症(糖尿病を有する患者における腎臓の機能不全)
糖尿病性腎症は、ミクロアルブミン尿症(微小血管疾患の影響), タンパク尿およびESRDを含む。糖尿病は腎不全の最も一般的な原因であり、新しいケースの40 パーセント以上と計算される。薬物および食物で糖尿病を制御できる場合でさえ、疾患は腎症および腎不全に至る可能性がある。糖尿病を有する大抵の人々は、腎不全を生じるのに十分重篤な腎症(nephropathy)を発生しない。合衆国の約1千6百万の人々は糖尿病を有し、約 100,000の人々は糖尿病の結果として腎不全を有する。
糖尿病性網膜症
糖尿病の状態において、高血糖は、網膜血流の減少, 網膜透過性亢進, 光受容器神経伝導の遅延, および網膜ニューロンの細胞死を導く。短期間の糖尿病において、ニューロン細胞死が網膜の内側核層内で同定された。具体的には、アポトーシスが、グリア細胞(例えば、ミュラー細胞およびアストロサイト)に局在し、STZ-誘発性の糖尿病性ラットモデルにおける糖尿病の1 月以内に生じることが示された。これらのイベントの原因は、ジアシルグリセロール/PKC経路の活性化, 酸化ストレス, および非酵素的なグリコシル化を含む複数の要因のものである。これらのイベントの組み合わせによって、網膜が低酸素になり、糖尿病性網膜症の発生が導かれる。糖尿病性網膜における網膜虚血と早期の変化の間をつなぐものは、成長因子(例えば、VEGF)の低酸素症誘発性の産生である。低酸素応答の支配的な制御因子は、低酸素症誘導性因子-1 (HIF-1)と同定されており、細胞の増殖および血管形成を制御する遺伝子を制御する。以前の研究は、HIF-1 ユビキチン結合の阻害によって低酸素症応答性エレメント(HRE)およびVEGF mRNAの産生の関連性が導かれることを実証した。
糖尿病性網膜症は、慢性高血糖が原因の網膜脈管構造の進行性の機能不全と規定される。糖尿病性網膜症の鍵となる特性には、毛細血管瘤(microaneurysms), 網膜の出血, 網膜の脂質浸出物, 綿状白斑点(cotton-wool spots), 毛細管の非潅流(capillary nonperfusion), 黄斑浮腫(macular edema)および新生血管形成が含まれる。関連する特性には、硝子体出血, 網膜剥離, 新生血管緑内障(neovascular glaucoma), 早発の白内障および脳神経麻痺(cranial nerve palsies)が含まれる。
糖尿病性の黄斑浮腫(DME)
DMEは、糖尿病性網膜症の合併症である(網膜の血管に影響する疾患)。糖尿病性網膜症は、網膜の肥厚および浮腫, 出血, 血流の妨害, 血管からの流体の過剰な漏出および, 最終的な段階において、異常な血管成長を含む網膜に複数の異常を生じる。この血管成長によって、大出血および重篤な網膜のダメージが導かれる可能性がある。糖尿病性網膜症の血管漏出によって、黄斑に腫脹を生じる場合、それはDMEと称される。DMEの主要な症状は、中心視(central vision)の欠損である。DMEと関連するリスク因子には、制御が不十分な血糖レベル, 高い血圧, 液体の貯留を生じる異常な腎機能, 高コレステロールレベルおよび他の一般的な全身性の因子が含まれる。
世界保健機構によると、糖尿病性網膜症は、労働年齢の成人における失明の主因であり、糖尿病における失明の主因である。アメリカ糖尿病協会(The American Diabetes Association)は、合衆国に約 1千8百万の糖尿病が存在し、約 百三十万の新しく糖尿病と診断されるケースが毎年合衆国に存在することを報告している。米国失明防止協会(Prevent Blindness America)および国立眼研究所(National Eye Institute)は、合衆国でDMEを有する約 500,000を含む18以上の年齢の5百30万をこえる糖尿病性網膜症の人々が存在すると見積った。CDCは、毎年DMEの約 75,000 新しいケースが合衆国に存在すると推定した。
付加的な神経障害
糖尿病に加えて、神経障害の共通の原因は、帯状疱疹感染, 慢性または急性の外傷(手術を含む)および様々な神経毒である。神経障害性の痛みは、末梢神経における癌の直接の結果(例えば、腫瘍による圧迫)として及び多くの化学療法薬物の副作用として癌において共通している。
微小血管の疾患: 血管性および神経性の疾患は、密接に関係し、絡み合った関係にある。血管は正常な神経機能に依存し、神経は適切な血流に依存する。微小血管系における最初の病理学的な変化は、血管狭窄である。疾患が進行するにつれて、ニューロンの機能不全は、毛細管基底膜肥厚および内皮過形成などの血管異常の発生と密接に関連し、これにより酸素分圧(oxygen tension)の減少および低酸素症に影響する。血管拡張因子(例えば、アンギオテンシン変換酵素インヒビター, α1-アンタゴニスト)によって、ニューロン血流に実質的(substantial)な改善が導かれる可能性があり、神経伝導速度にも対応する改善を伴う可能性がある。
臨床上の症状
神経障害は、全ての末梢神経、痛ファイバー(pain fiber), 運動ニューロン, 自律神経に影響する。従って、必然的に全ての臓器および系に影響しえる。というのも、全てが神経支配されているからである。器官系および影響されたメンバーに基づく別の幾つかの症候群が存在するが、これらは排他的(exclusive)なものではない。患者は、感覚運動性および自律神経性の神経障害または任意の他の組み合わせを有する可能性がある。
神経障害の代謝性の原因の理解において進歩があるにもかかわらず、これらの病理学的なプロセスを中断する目的の治療は副作用があり、有効性も欠乏していることで制限される。従って、治療は、症候性(symptomatic)のものであり、根底にある問題に対処するものではない。感覚運動の神経障害が原因の痛みに対する薬剤には、三環系抗うつ薬(TCAs), セロトニン再取り込みインヒビター(SSRIs)および抗てんかん薬(AEDs)が含まれる。これらの薬剤は、糖尿病性神経障害を導く病理学的なプロセスを逆転させず、疾病の厳しい経過(relentless course)を変化させない。従って、これらの状態をよりよく治療する及び/又は症候を軽減できる薬学的組成物をえることは有用である。
付加的な網膜症
網膜の微小血管障害(AIDS網膜症)
網膜の微小血管障害は、AIDS患者の100%に認められる。この障害は網膜内の出血, 毛細血管瘤, Roth斑, 綿状白斑点(神経線維層の微小梗塞)および血管周囲の被覆によって特徴付けられる。網膜症の病因は未知であるが、循環する免疫複合体, 細胞毒性物質の局所性の放出, 異常な血液レオロジ, および内皮細胞のHIV感染によると考えられてきた。AIDS網膜症は現在では一般的なので、糖尿病または高血圧症がないがHIVのリスクがある患者に綿状白斑点が存在することによって、医師はウイルス試験を考慮することを促されるだろう。AIDS網膜症に関する特異療法は存在しないが、それが継続的に存在することによって医師にHIV治療および患者コンプライアンスの有効性を再検討することを促すだろう。
骨髄移植(BMT)網膜症
骨髄移植の網膜症は、最初1983に報告された。その網膜症は典型的に六月内に発生するが、BMT後の62 月ほど遅く生じる可能性がある。糖尿病 および 高血圧症などのリスクファクターによって、虚血性の微小血管障害が高まりBMT網膜症の発生が促進される可能性がある。BMT網膜症の発生の年齢、性別または人種の偏向性(predilection)は知られていない。患者は、視力の減少および/または視野の欠乏を呈する。後側セグメント(Posterior segment)の所見は、典型的には両側性および対称性である。臨床の症状には、複数の綿状白斑点, 末梢血管拡張, 毛細血管瘤, 黄斑浮腫, 硬い浸出物(hard exudates)および網膜の出血が含まれる。蛍光眼底血管造影(Fluorescein angiography)によって、毛細管の非潅流およびドロップアウト(dropout), 網膜内の微小血管の異常, 毛細血管瘤および黄斑浮腫が実証される。BMT網膜症の正確な病因は解明されていないが、幾つかの因子〔シクロスポリン毒性, 放射線全身照射 (TBI), および化学療法剤〕で影響されると思われる。シクロスポリンは、移植片対宿主免疫応答を抑制する強力な免疫調節薬であり、内皮細胞傷害および神経性の副作用を誘発し、結果として、BMT網膜症の原因であると示唆された。しかしながら、BMT網膜症はシクロスポリンを使用しなくとも発生し、シクロスポリンが自己の又は同系の骨髄レシピエントにおいてBMT網膜症の原因であることは示されていない。従って、シクロスポリンは、BMT網膜症の唯一(sole)の原因であると思われない。また、放射線全身照射 (TBI)は、BMT 網膜症の原因と思われてきた。放射は網膜の微小血管系を傷害し、虚血性の血管症を誘発する。
虚血性の状態
虚血性傷害は、酸素欠乏での細胞障害の最も一般的な臨床上の発現である。虚血性の傷害を研究するための最も有用なモデルには、器官の動脈(例えば、冠動脈)の一端の完全な閉塞および動脈で供給される領域における組織(例えば、心筋)の検査が関与する。複合的な病的な変化が、虚血の間に多様な細胞系で発生する。特定のポイント(持続時間に関して、異なるタイプの細胞の間で変化する)まで、傷害は修復を受け入れられる可能性があり、酸素および代謝性の基質が血流の再開によって利用可能とされる場合に影響をうけた細胞は回復しえる。虚血の持続時間が更に延びると、細胞構造は進行中の傷害機構の絶え間ない進展のために継続的に悪化する。時間と共に、細胞のエネルギー機構(ミトコンドリアの酸化的な原動力および解糖系)は、修復できないほどダメージをうけ、血流の再開(再灌流)はダメージをうけた細胞を救出できない。たとえ細胞のエネルギー機構が無傷(intact)で残ったとしても、ゲノムまたは細胞膜への回復の見込みがないダメージによって、再灌流と無関係に転帰が致死的なものとなることは確かである。通常、この不可逆的な傷害は、ネクローシスとして現れるが、アポトーシスも作用しえる。特定の環境条件で、以前に虚血にされたが死んでいない細胞で血流が回復された場合、傷害はしばしば逆説的に悪化(exacerbated)し、加速的にペースで進行する(これが再潅流傷害である)。
再潅流傷害は、様々な条件で発生する可能性があり、血管形成術, 心臓手術または血栓溶解; 臓器移植; 形成外科の結果として; 重篤な筋区画症候群の間; 切断した四肢の再付着の間; 多臓器不全症候群の結果として; 脳における発作または脳外傷の結果として; 慢性創傷(例えば、褥瘡, 静脈の潰瘍および糖尿病性の潰瘍)に関連する; 骨格筋の虚血または四肢の移植の間; 腸間膜の虚血または急性の虚血性の腸疾患の結果として; 肺性高血圧, 低酸素血症,および非心臓性の肺水腫を導く下胴部(lower torso)の虚血の結果としての呼吸不全; 腎移植, 大きな手術, 外傷,および敗血性、同様に、出血性ショックの後に観察される急性腎臓不全; 敗血症; 急性緑内障, 糖尿病性網膜症, 高血圧性網膜症,および網膜の血管閉塞などの幾つかの眼球疾患における視覚の欠損を導く急性の血管閉塞の結果として発生する網膜の虚血; 蝸牛の虚血; 頭部および首部(head and neck)の欠陥の微小血管の手術におけるフラップ不全(flap failure); レイノー現象(Raynaud's phenomenon)および硬皮症における関連する指の虚血傷害; 脊髄損傷; 血管の手術; 外傷性の横紋筋融解症(crush症候群);およびミオグロビン尿症が含まれるが、これに限定されない医療の間に発生する。
さらに、虚血/再灌流は、高血圧症, 高血圧性の大脳の血管疾患, 動脈瘤の破裂, 血栓または塞栓のケースにおいて生じるような血管の狭窄または閉塞, 血管腫, 血液悪液質(blood dyscrasias), 心臓の停止または不全を含む任意の形態の易感染性の心機能, 全身性の低血圧, 心停止, 心原性ショック, 敗血症ショック, 脊髄外傷, 頭部外傷, 発作, 腫瘍からの出血; および発作, パーキンソン病, てんかん, うつ病, ALS, アルツハイマー病, ハンチントン病および任意の他の疾患誘発性の痴呆(例えば、HIV誘発性痴呆)などの疾患の状態に関与しえる。
さらに、虚血エピソードは、中枢神経系への機械的な傷害〔例えば、頭部または脊椎(spine)への打撃から生じる〕が原因である可能性がある。外傷は、組織傷害(例えば、摩耗, 切開, 挫傷, 穿刺, 圧迫, など)が関与し、例えば、頭部, 首,または脊柱の任意の部位または付属物への外来の物体の外傷性の接触から生じる可能性がある。他の形態の外傷性の傷害は、液体の不適切な蓄積(例えば、正常な脳脊髄液または硝子体液の産生の遮断または機能不全, ターンオーバー,または体積の制御,または硬膜下のまたは頭蓋内の血腫または浮腫)でのCNS組織の狭窄または圧迫から生じる可能性がある。同様に、外傷性の狭窄または圧迫は、異常な組織(例えば、転移性または原発性の腫瘍)の塊(mass)の存在から生じる可能性がある。
結論として, COPD, 黄斑変性症 微小血管の疾患および耳毒性の状態の予防のための療法および/または治療の現行の様式は、不満足であるので、この目的のための新規の化合物を開発する必要がある。また、薬物の有効性を犠牲にすることなく、特定の薬物および状態と、特にシスプラチン化学療法学および特定の抗生物質と、現在関連する耳毒性の影響を治療できる療法および医薬を開発する必要性がある。さらに、内耳内の音響性外傷または機械的な外傷と関連する耳毒性の影響を治療できる療法および医薬を開発する必要性がある。さらにまた、褥瘡, 虚血および虚血再灌流関連の状態の治療のための療法および医薬を開発する必要性がある。また、上記で本願の明細書等に開示された全ての疾患および徴候、同様に本願の明細書等に記載された他の疾患および状態(例えば、MI)は、本発明の新規の化合物で治療されえる。
発作後痴呆
約 25%の人々は発作の後に痴呆を有し、多くの他のものは続く5〜10 年で痴呆を発症する。加えて、多くの個体は、高度の脳機能(例えば、計画する技能および情報を処理する速度)が微妙(subtle)に損傷し、引き続いて痴呆を発症するリスクが非常に高い。このプロセスにおける脳の深部での非常に小さい発作(微小血管の疾患と称される)は、発作後痴呆に特異的な脳萎縮症として同定されたパターンへと至るプロセスに必須であるとおもわれる。
眼球の急性冠動脈症候群
眼球の急性冠動脈症候群(OIS;ocular ischemic syndrome)を患っている患者は、一般に50代ないし80代の年齢範囲の高齢者である。男性は、一般に女性よりも二倍影響をうける。患者は、まれに無症候(asymptomatic)である。視覚の減少は90 パーセントのケースで呈され、40 パーセントの患者は付随する眼の痛みを有する。また、一過性の虚血性発作(transient ischemic attacks)または一過性黒内症が付随するか又は以前にその病歴が存在する可能性がある。また、患者は、それを呈するさいに有意な既知の又は未知の全身性の疾患を有する。最も一般的に遭遇する全身性の疾患は、高血圧症, 糖尿病, 虚血性心疾患, 発作, および末梢血管疾患である。患者は、程度は低いが、巨細胞性動脈炎 (GCA;giant cell arteritis)の結果としてのOISを呈する。
片側性(Unilateral)の所見は、80 パーセントのケースで存在する。共通の所見には、高度な片側性の白内障, 前側セグメントの炎症, 無症候性の前房反応(anterior chamber reaction), 黄斑浮腫, 拡張するが非蛇行状の網膜静脈, 中間周辺部(mid-peripheral)の点状および斑状の出血, 綿状白斑点, 滲出, およびディスクおよび網膜の新生血管形成が含まれえる。また、自発性の動脈脈動, 眼内圧の上昇, および虹彩の新生血管形成および隅角(angle)の新生血管緑内障(NVG;neovascular glaucoma)が存在する。患者は前側セグメントの新生血管形成を呈する可能性があり、眼球の低張は毛様体への動脈性の灌流が低いことが原因で起こる可能性がある。時折、可視性の網膜塞栓(ホレンホースト斑)が存在する。
OISの所見は、総頚動脈の二分枝での内頚動脈のアテローム性の潰瘍形成および狭窄で生じる。内部動脈狭窄を伴う患者の五 パーセントは、OISを発生する。しかしながら、OISは、狭窄の度合が90 パーセントを超えた場合にのみ発生する。頚動脈の狭窄は、眼への潅流圧を減少し、前述の虚血性の現象を生じる。一旦狭窄が90 パーセントに達したら、網膜中心動脈(CRA)における潅流圧は僅か50 パーセントに低下する。しばしば、動脈圧の減少は、CRAの自発性の脈動として現れる。所見は可変的であり、任意の又は全ての上記の所見を含む可能性がある。
OISを有する患者は、評価すべき顕著な全身性の疾患を有する。心臓死は、OISを有する患者の死亡率の主因であり、五年死亡率は40 パーセントである。
腎臓の微小血管疾患
腎臓には、全身性および腎臓の微小血管系に影響する幾つかの別の臨床病理学的な状態が関与する。これらの状態のある種のものは、溶血性の尿毒症性症候群(HUS;hemolytic-uremic syndrome)および血栓性血小板減少性紫斑病(TTP;thrombotic thrombocytopenic purpura)などの内皮細胞への一次傷害により特徴付けられる。HUSおよびTTPは、細小血管症性溶血性貧血および可変性の器官損傷により特徴付けられる密接に関係する疾患である。伝統的に、HUSの診断は、腎不全が子供に共通するような症候群の主な特性である場合になされる。成人では、神経性の損傷が頻繁に優位であり、そこで、その症候群はTTPと称される。血栓性の微小血管障害は両方の症候群において根底にある病的な傷害であり、HUSまたはTTPの何れかを有する患者における臨床および検査の所見は、多く重複する。このことから幾人かの研究者に、二つの症候群が単一の疾病が連続したものと考えることを促した。病因: 実験データは、内皮細胞の傷害がHUS/TTPの病因における一次のイベントであることを強く示唆する。内皮のダメージによって、局所性の血管内凝固, フィブリン沈着, および血小板活性化および凝集を含むイベントのカスケードが刺激される。最終的には、HUS/TTP症候群の異なる形態に共通する血栓の微小血管障害の組織病理学的な所見を呈する。HUS/TTPが無処置で残された場合、死亡率は90%に近づく。支持療法(透析, 降圧薬, 輸血, および神経性の合併症の管理を含む)は、HUS/TTPを有する患者の生存を改善するために寄与する。適切な体液平衡および腸管安静(bowel rest)は、下痢と関連する典型的なHUSの治療に重要である。
放射線腎炎: 2500 radを超える腎臓照射の長期の結果は、五つの臨床症候群に分けられる:
(i) 急性の放射線腎炎は、6〜13 月の潜伏期後に患者の約 40%に発生する。それは終末期の腎臓に進行するケースの殆どにおいて高血圧症, タンパク尿, 浮腫, および進行性の腎臓の不全の急激な開始によって臨床的に特徴付けられる。
(ii) 逆に、慢性放射線腎炎は、初期の傷害後18 月 および 14 年の間で変化する潜伏期を有する。これは開始のさいに潜行性であり、高血圧症, タンパク尿, および腎機能を徐々に失うことで特徴付けられる。
(iii) 第三の症候群は、照射への曝露後5 〜19 年で正常な腎機能の良性のタンパク尿として現れる
(iv) 第四群の患者は、2 〜5 年後に良性の高血圧症のみを呈し、可変的なタンパク尿を有する可能性がある。遅発型の悪性高血圧症は、慢性放射線腎炎または良性の高血圧症の何れかを有する患者における照射後の18 月 〜11 年で生じる。影響をうけた腎臓を除去することによって、高血圧症が逆転される。腎臓の動脈への照射誘発性のダメージと引き続く腎血管性高血圧が、報告されている。
(v) 急性の放射線腎炎と類似する腎不全の症候群は、全身照射(TBI)で処理された骨髄移植 (BMT) 患者で観察された。
照射によって内皮の機能不全が生じるが、早期照射後フェーズ(early postradiation phase)において血管平滑筋細胞は害されない。照射は直接的にDNAにダメージを与え、これらの細胞および糸球体の毛細管(capillaries)および細管(tubules)における基底膜の露出部(denudement)の再生の減少が導かれる。他の腎臓疾患において、腎臓の微小血管系は、全身性硬化症(強皮症)などの自己免疫性障害にかかわる。全身性硬化症における腎臓の関与は、緩徐に進行する慢性腎疾患または強皮症腎臓の急性発症 (SRC;scleroderma renal crisis)(悪性高血圧症および急性の高窒素血症で特徴付けられる)として現れる。SRCが腎臓におけるレイノー様現象で生じることが仮定されている。重篤な血管攣縮によって、皮質虚血(cortical ischemia)およびレニン および アンギオテンシン IIの産生の増強が導かれ、腎臓の血管狭窄が永続化される。ホルモン変化(妊娠), 物理的および情動性のストレス,または冷温によって、レイノー様の血管攣縮が誘発される可能性がある。
また、腎臓の微小循環は、鎌形赤血球疾患において影響される可能性がある。直血管(vasa recta)に沿って酸素の逆流伝達の結果としての腎髄質の深部管(deep vessels)における低酸素分圧のために、腎臓はこの疾患に特に感受性である。また、小さな腎臓の動脈および細動脈は、大きい管の壁から取り除かれたコレステロール含有物質からの血栓塞栓症の病変部位である可能性がある。
グループとしてとらえると、腎臓の微小血管系の一過性または永続的な閉塞を生じる疾患は、一様に、糸球体の灌流の中断を生じ、そのため糸球体濾過速度が中断し、全身のホメオスタシスに重大な脅威をおよぼす。
急性腎不全(ARF)
ARFは、微小血管のまたは大血管の疾患(主要な腎動脈の閉塞または重篤な腹腔の大動脈の疾患)によって生じる可能性がある。古典的な微小血管の疾患は、しばしば微小血管症性の溶血および急性腎不全(糸球体係蹄の血栓症または閉塞のため生じる)に伴って存在し、しばしば付随的な血小板減少症に伴って存在する。これらの疾患の典型的な例には、以下のものが含まれる:
a) 血栓性血小板減少性紫斑病; 血栓性血小板減少性紫斑病における古典的な五つのものには、発熱, 神経性の変化(neurologic changes), 腎不全, 細小血管症性溶血性貧血および血小板減少症が含まれる。
b) 溶血性尿毒症症候群; 溶血性尿毒症症候群は、血栓性血小板減少性紫斑病と類似するが、神経性の変化を伴って存在しない。
c) HELLP症候群 (溶血, 肝臓酵素の上昇および低血小板)。HELLP症候群は、トランスアミナーゼが上昇した妊婦で生じる溶血性尿毒症症候群の一つのタイプである。
急性腎不全は、全ての医学的な設定において存在する可能性があるが、主に病院でおこる。その状態は5 パーセントの入院患者で生じ、約 0.5 パーセントの入院患者は透析を必要とする。過去 40 年以上、急性腎不全の生存率は、改善していない。その主な理由は、影響をうけた患者が老齢で合併状態(comorbid conditions)にあるからである。感染は急性腎不全を有する患者における死亡の75 パーセントと計算され、心臓呼吸器合併症(cardio-respiratory complications)は二番目の死因である。腎不全の重症度に依存して、死亡率は、7 パーセントから80 パーセントの範囲である可能性がある。急性腎不全は、腎前性(Prerenal), 内因性(intrinsic)および腎後性(postrenal)のARFの三つのカテゴリーに分けられる。内因性のARFは、管疾患(tubular disease), 糸球体疾患(glomerular disease), 脈管性疾患(微小血管を含む)および間質性の疾患(interstitial disease)の四つのカテゴリーに細分される。
進行性の腎疾患
進行性の腎疾患が微小血管系の進行性の欠損で特徴付けられるとの証拠が存在する。微小血管系の欠損は、直接的に糸球体および尿細管間質性の瘢痕の発生と関連する。この機構は、部分的に内皮の増殖応答の減少によって媒介される。そして、毛細管修復において、この損傷は、腎臓における血管新生(血管内皮の成長因子)および抗血管新生(トロンボスポンジン 1)因子の両方の局所性の発現の変化によって媒介される。血管新生の成長因子のバランスにおける変化は、マクロファージ関連サイトカイン(インターロイキン-1β) および 血管作動性メディエータ(vasoactive mediators)の両方によって媒介される。最終的に、血管形成および/または毛細管修復の刺激が腎機能を安定化し、進行を緩やかにしえること及びこの利点が独立にBPまたはタンパク尿に影響を生じることについての魅力的な証拠が存在する。
更なる情報に関して、文献〔Brenner & Rector's The Kidney, 7th ed., Copyright (C) 2004 Elsevier: Chapter 33 - Microvascular diseases of the kidney およびTiwari andVikrant Journal of Indian Academy of Clinical Medicine Vol.5, No.1 Review Article- Sepsis and the Kidney〕を参照されたい。
腎臓移植
遅延性の移植片機能
遅延性の移植片機能(DGF;Delayed graft function)は、腎移植の手術直後の期間での最も一般的な合併症であり、不良な移植片の転帰をとる〔Moreso et al. 1999. Nephrol. Dial. Transplant. 14(4):930-35〕。DGFの発生率 および 定義が移植センターで変動するにもかかわらず、結果は不変である(つまり、長期の入院, 付加的な浸潤性に関する処置, および患者および健康管理の付加的なコスト)。
急性の移植拒絶
移植片拒絶は、移植片破壊の開始に依存して三つのサブセットに分類されてきた: 超急性拒絶は、非常に早期の移植片破壊(通常、最初の48 時間内)に適用される用語である。急性拒絶は、移植の数日、日から月または年単位の後の開始を呈し、体液性および/または細胞性の機構が関与しえる。慢性拒絶反応は、慢性アロ反応性(chronic alloreactive)の免疫応答に関する。
聴覚障害
化学誘発性の耳毒性
聴覚細胞(auditory cells)およびラセン状神経節ニューロン(spiral ganglion neurons)における様々な耳毒性の治療上の薬物の毒性効果は、しばしば治療上の有用性の限定要因である。主な耳毒性の薬物には、広く使用される化学療法剤シスプラチン及びそのアナログ, 一般に使用されるアミノグリコシド系抗生物質, 例えば、グラム陰性細菌で生じる感染の治療のためのゲンタマイシン, キニーネ及びそのアナログ, サリチル酸塩及びそのアナログ,およびループ利尿薬が含まれる。
例えば、抗菌性アミノグリコシド(例えば、ゲンタマイシン, ストレプトマイシン, カナマイシン, トブラマイシン, など)は、重大な毒性(特に、耳毒性および腎毒性)を有することが知られており、これによって係る抗菌剤の有用性が減少する〔Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6th ed., A. Goodman Gilman et al., eds; Macmillan Publishing Co., Inc., New York, pp. 1169-71 (1980)を参照されたい〕。明らかに、耳毒性は、抗生物質投与の用量を制限する副作用である。1 グラム/日を1 週以上を受けている患者の4〜15%は、緩やかに悪化し、治療が継続する場合に完全に永続的な難聴を生じる可能性がある測定可能な聴覚損失を発生する。
また、耳毒性は、精巣, 卵巣, 膀胱, および頭頸部の癌を含む種々のヒトの癌に効果的であることが証明されているシスプラチン(プラチナ配位複合体)に関する用量を制限する副作用である。シスプラチン〔Platinol(登録商標)〕は、聴覚および前庭系(auditory and vestibular systems)にダメージを与える。アスピリンなどのサリチラート(Salicylates)は、抗炎症性, 鎮痛性, 抗発熱性および抗血栓性の効果のために最も一般的に使用される治療上の薬物である。残念ながら、それらも耳毒性の副作用を有する。しばしば、それらは耳鳴(「ringing in the ears」)および一時的な聴覚損失を生じる可能性がある。そのうえ、薬が高用量で長期に使用される場合、聴覚障害が持続的および不可逆的となる可能性がある。
従って、内耳組織(特に、内耳の有毛細胞)が関与している内耳障害および聴覚障害の発生および/または重症化を予防, 減少,または治療する手段の必要性が存在する。特に注目されるものは、シスプラチン及びそのアナログ, アミノグリコシド系抗生物質, サリチル酸塩及びそのアナログ,またはループ利尿薬を含む耳毒性の治療上の薬物の望まれない副作用として生じる状態である。加えて、高度(さらに効果的な)なこれらの耳毒性誘発性薬物での投薬が許容され、他方で同時にこれらの薬物により生じる耳毒性の影響を予防する又は減少させる方法の必要性が存在する。必要とされるものは、内耳組織のダメージ, 欠損,または変性, 特に耳毒誘発性および特に内耳の有毛細胞が関与するものに関連する聴覚障害の予防的または治療的な処理のための安全, 効果的, および長期の手段を提供する方法である。加えて、内耳外傷(音響性外傷)から生じるダメージおよび難聴を治療するための方法および組成物が必要とされる。
理論に縛られることなく、シスプラチン薬物および耳毒性(同様に音響性外傷)を誘発する他の薬物(例えば、アミノグリコシド系抗生物質)が内耳組織(特に内耳の有毛細胞)におけるプログラム細胞死またはアポトーシスを介する耳毒性の影響を誘発しえることが信じられている〔Zhang et al., Neuroscience 120 (2003) 191-205; Wang et al., J. Neuroscience 23((24):8596-8607〕。哺乳類において、聴覚の有毛細胞は、胚の発生の間でのみ産生され、出生後に失われた場合に再生されないので、有毛細胞の欠損によって著明で不可逆的な難聴を生じる。残念ながら現在、蝸牛(cochlea)を治療する及びこの状態を逆転させる効果的な療法は存在しない。従って、聴覚性の有毛細胞の細胞死を予防する効果的な療法は、治療上の価値が高いだろう。
老人性難聴
別のタイプの聴覚損失は、老人性難聴であり、これは大抵の個体で加齢にしたがいしだいに発生する聴覚損失である。65 および 75 年の年齢の間の約 30-35 パーセントの成人および75 及びそれ以上のものの40-50 パーセントの人々は、聴覚損失を経験する。従って、内耳組織(特に、内耳の有毛細胞)が関与している内耳障害および聴覚障害の発生および/または重症化を予防, 減少,または治療する手段が必要である。
音響性外傷
音響性外傷(Acoustic trauma)は、大きなノイズへの長期の曝露によって生じる聴覚損失の一つのタイプである。理論に縛られることを望まないが、大きなノイズへの曝露は、蝸牛の有毛細胞を感受性が低いものにしてしまう。重篤な曝露で、傷害は、隣接する支持細胞の欠損からコルチ器官の完全な破壊に進行する可能性がある。感覚細胞の死によって、進行性のWallerian変性および主な聴神経線維の欠損が生じる可能性がある。
特に注目されるものは、シスプラチン及びそのアナログ, アミノグリコシド系抗生物質, サリチル酸塩及びそのアナログ,またはループ利尿薬を含む療法上の薬物の副作用として生じる有害な状態である。従って、高度(さらに効果的な)な投薬が許容され、他方でこれらの薬物により生じる耳毒性の影響を予防する又は減少させる治療方法の必要性が存在する。従って、内耳組織のダメージ, 欠損,または変性, 特に耳毒誘発性および特に内耳の有毛細胞が関与するものに関連する聴覚障害の予防的または治療的な処理のための安全, 効果的, および長期の手段を提供する組成物および方法が必要である。哺乳類において、聴覚の有毛細胞は、胚の発生の間でのみ産生され、出生後に失われた場合に再生されないので、有毛細胞の欠損によって著明で不可逆的な難聴を生じる。残念ながら現在、蝸牛(cochlea)を治療する及びこの状態を逆転させる効果的な療法は存在しない。従って、聴覚性の有毛細胞の細胞死を予防する効果的な療法は、治療上の価値が高いだろう。
緑内障
緑内障は、世界における失明の主因の一つである。緑内障は、世界中で約 6千680万の人々に影響する。少なくとも 12,000のアメリカ人は、毎年この疾患で盲目となる〔Kahn and Milton, Am J Epidemiol. 1980, 111(6):769-76〕。緑内障は、主に眼内圧(IOP;intraocular pressure)の上昇による視覚神経乳頭部(optic nerve head)におけるアクソンの変性で特徴付けられる。緑内障の最も一般的な形態の一つは、原発性開放隅角緑内障(POAG;primary open-angle glaucoma)として知られ、小柱網 (TM;trabecular meshwork)において流出する眼房水の抵抗性の増加から生じ、IOP上昇および最終的な視覚神経ダメージを生じる。Mucke (IDrugs 2007, 10(1):37-41)は、眼球の疾患〔例えば、老化性の黄斑変性症(AMD) および 緑内障〕の治療の様々な標的に対するsiRNAを含む現行の薬物療法学を論評している。
急性呼吸窮迫症候群
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、呼吸窮迫症候群(RDS;respiratory distress syndrome)または成人呼吸窮迫症候群(幼児呼吸窮迫症候群 IRDSと対照的に)としても知られており、肺に対する様々な形態の傷害に対する重大な反応である。これは最も重要な障害であり、透過性増加の肺水腫を生じる。
ARDSは、種々の直接的および間接的な傷害で生じる重篤な肺疾患である。炎症, 低酸素血症および頻繁に複数の臓器の不全を生じる炎症性メディエータの随伴性の全身性放出でのガス交換の損傷を生じる肺実質(lung parenchyma)の炎症により特徴づけられる。この状態は、生命を脅し、しばしば致死的であり、通例人工呼吸および集中治療室への入室が必要とされる。それほど重篤ではない形態は、急性の肺傷害(ALI;acute lung injury)と称される。
急性肺移植拒絶
急性の同型異種片拒絶には、免疫抑制薬が進歩したにもかかわらず肺移植における重要な問題が残されている。拒絶(および究極的には早期の罹病率および死亡率)は、虚血再灌流(I/R)傷害および低酸素傷害から生じる可能性がある。
脊髄損傷
脊髄損傷または骨髄障害(myelopathy)は、感覚(sensation)および/または運動(mobility)の欠損を生じる脊髄の障害である。二つの最も一般的なタイプの脊髄損傷は、外傷 および 疾患による。外傷性の傷害は、しばしば自動車事故, 落下, 発砲, ダイビング事故などが原因である。脊髄に影響する可能性がある疾患には、ポリオ, 二分脊髄, 腫瘍, および フリートライヒ失調症が含まれる。
口の粘膜炎
口の粘膜炎(口内炎とも称される)は、化学療法および放射線療法の計画の共通の及び消耗性の副作用であり、口および咽頭の紅斑(erythema)および有痛性の潰瘍性の傷害として現れる。日常的な活動(例えば、摂食, 飲水, 嚥下, および会話)は、重篤な口の粘膜炎を有する被験者では困難または不可能である可能性がある。対症療法には、鎮痛薬および局所的リンス(topical rinses)の投与が含まれる。
ドライアイ症候群
ドライアイ症候群は、通常、目を潤滑にする涙のフィルムの産生の減少から生じる共通の問題である。ドライアイを有する大抵の患者は不快感を経験し、失明はしない。しかし、重篤なケースにおいて、角膜がダメージをうける又は感染される可能性がある。ウェッティングドロップス(人工的な涙)を治療に使用でき、潤滑軟膏(lubricating ointments)で重篤なケースの対象を助けることが可能である。
上記の疾患および障害を処置するための効果的な療法は、治療上の価値が高いだろう。
褥瘡
褥瘡または圧迫潰瘍(pressure ulcers)は、持続的な圧力(通常、ベッドまたは車椅子からの圧力)が体の脆弱な部分〔特に、殿部(buttocks), 臀部(hips)および踵(heels)の皮膚〕への循環を遮断する場合に発生する皮膚 および 組織がダメージをうけた領域である。適切な血流が欠乏することによって、患部組織の虚血性壊死 および 潰瘍形成が生じる。褥瘡は、感覚が減少または欠除した、または衰弱した、痩せ衰えた、麻痺した、または寝たきりの患者において最もよく起こる。仙骨(sacrum), 坐骨(ischia), 大転子(greater trochanters), 外踝(external malleoli)および踵における組織は特に感受性である; 患者の位置に依存して他の部位も関与する可能性がある。
褥瘡は通常は非常に緩徐に治癒する傷であり、特にこのような場合において、改善および急速な治癒は当然の成り行きとして患者に重要である。さらにまた、このような傷を患っている患者の治療にかかるコストは、治癒が改善し、急速に治癒する場合に著明に減少する。
任意の上記の状態は、PCT公開番号WO06/023544 および WO07/084684に開示された何れかのsiRNAsを含む化合物によって治療できる。
修飾
ヌクレオチドの修飾またはアナログは、ヌクレオチドの治療上の特性を改善するために導入できる。改善された特性には、ヌクレアーゼ抵抗性の増加および/または細胞膜を浸透する能力の増加が含まれる。
従って、本発明は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの機能に実質的に影響しない本発明のオリゴヌクレオチドの全てのアナログまたは修飾を含む。好適な態様において、係る修飾は、前記ヌクレオチドの塩基部分に、前記ヌクレオチド糖部分に、および/または前記ヌクレオチドのリン酸部分に関連する。
一態様において、修飾はリン酸部分の修飾であり、修飾されたリン酸部分はホスホチオエート(phosphothioate)を含んでいる群から選択される。
本発明の化合物は、リボヌクレイック(またはデオキシリボヌクレイック)オリゴヌクレオチドの合成の当該技術分野において周知の任意の方法で合成できる。係る合成は、とりわけ、Beaucage およびIyer〔Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1992; 48:2223-2311; Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194〕およびCaruthers等〔Caruthers, et. al., Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313〕に記載される; チオアートの合成は、とりわけ、Eckstein〔Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402〕に記載される; RNA分子の合成は、Sproat〔Sproat, in Humana Press 2005 edited by Herdewijn P.; Kap. 2: 17-31〕に記載される;および それぞれの下流の処理は、とりわけ、Pingoud等〔Pingoud et. al., in IRL Press 1989 edited by Oliver R.W.A.; Kap. 7: 183-208〕に記載される。
他の合成の処置は、当該技術分野において既知であり、例えば、文献〔Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, NAR., 18, 5433; Wincott et al., 1995, NAR. 23, 2677-2684; およびWincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59〕に記載の処置であり、5'端でのジメトキシトリチルおよび3'端でのホスホラミダイトなどの一般的な核酸の保護およびカップリング基を利用しえる。修飾された(例えば、2'-O-メチル化)ヌクレオチドおよび無修飾ヌクレオチドは、所望により導入される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、別々に合成でき、合成後に、ライゲーション (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper など, 国際特許公開番号 WO 93/23569; Shabarova et al., 1991, NAR 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & ヌクレオチドs, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204)又は合成および/または脱保護の後のハイブリダイゼーションなどによって結合できる。
商業的に利用可能な機械(とりわけ, アプライドバイオシステムから利用可能である)を使用できる; オリゴヌクレオチドは、本願の明細書等に開示される配列にしたがって調製される。化学的に合成した断片のオーバーラップペアを、当該技術分野において周知の方法を用いて連結できる(例えば、米国特許第 6,121,426を参照されたい)。前記鎖は、別々に合成され、チューブ中で互いにアニールされる。次に、二本鎖のsiRNAsは、アニールしなかった一本鎖のオリゴヌクレオチド(例えば、そのうちの一方の過剰が理由で)からHPLCで分離される。本発明のsiRNAsまたはsiRNA 断片に関して、二または三以上の係る配列を合成し、本発明で使用するために共に連結できる。
また、本発明の化合物は、米国特許公開第US 2004/0019001(McSwiggen)などに記載のとおりタンデム合成法(tandem synthesis methodology)で合成でき、両方のsiRNA鎖は切断可能なリンカーで分けられた単一の近接するオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成され、これは引き続いて切断されて、siRNA二重鎖とハイブリダイズし、siRNA二重鎖の精製を許容する分離したsiRNA 断片または鎖が提供される。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
さらに、本発明は、本願の明細書等に記載した任意の疾患および状態の治療のための二または三以上の siRNA 分子を含んでいる薬学的組成物を提供し、前記二つの分子は同等(equal)の又は別の有益な活性を産生する量で薬学的組成物中に共に物理的に混合されてもよい,または共有結合性または非共有結合性に結合されてもよい,または2-100, 好ましくは 2-50または2-30 ヌクレオチドの範囲の長さの核酸リンカーで共に結合されてもよい。一態様において、siRNA 分子は本願の明細書等に記載される二本鎖の核酸構造から構成され、二つのsiRNA 配列は表 Aに記載の核酸から選択される。本発明のsiRNAsに関連して使用できるタンデムのsiRNA分子およびタンデム構造の更なる情報に関して、本発明の権利者のPCT公開番号WO07/091269(この文献は、参照によってその全体が本明細書中に援用される)を参照されたい。
従って、siRNA 分子は、共有結合性に若しくは非共有結合性に結合されてもよい又はリンカーで結合されてタンデム型のsiRNA化合物を形成してもよい。係る二つのsiRNA配列を含んでいるタンデム型のsiRNA化合物は、典型的には38-150ヌクレオチドの長さ, より好ましくは 38または40-60 ヌクレオチドの長さ, 及びそれ以上(従って、二を超えるsiRNA 配列がタンデム型の分子に含められる場合)の長さである。内部の細胞プロセシングを介して産生されたsiRNAをコード化する二または三以上の長い配列から構成される長いタンデム型の化合物(例えば、長いdsRNAs)も、二または三以上のshRNAsをコード化しているタンデム型の分子であるとして予見(envisaged)される。係るタンデム型の分子も、本発明の一部であると考えられる。本発明の二または三以上のsiRNAs 配列を含んでいるタンデム型の化合物が予見される。
RTP801を標的とするsiRNA分子は、薬学的組成物における主な活性成分であってもよく、または二または三以上のsiRNAs(または二または三以上のsiRNAsをコード化する又は内因性に産生する分子、その分子の混合物または二または三以上のsiRNAsをコード化する一または二以上のタンデム型の分子)を含んでいる薬学的組成物の一つの活性成分であってもよく、前記薬学的組成物はさらにRTP801または別の遺伝子(例えば、VEGF)を標的とする一または二以上の付加的なsiRNA分子から構成されている(以下を参照されたい)。前記付加的な遺伝子の同時の阻害は、本願の明細書等に開示された疾患の治療のための相加または相乗効果を有するだろう。
さらに、本願の明細書等に開示されたsiRNAまたは係るsiRNAを含んでいる又はコード化している任意の核酸分子は、本願の明細書等に開示された疾患の治療のためのターゲティングの増強を達成するために、標的細胞に発現した細胞表面のインターナライズ可能な分子(internalizable molecules)に対する抗体(アプタマー分子を含む)に(共有結合性にまたは非共有結合性に)連結または結合できる。例えば、抗Fas抗体(好ましくは、中和抗体)は、任意のRTP801 siRNAと(共有結合性にまたは非共有結合性に)組み合わせてもよい。別の例において、リガンド/抗体の様に作用できるアプタマーを、任意のRTP801 siRNAと(共有結合性にまたは非共有結合性に)組み合わせてもよい。
本発明の化合物は、直接的に又はウイルス性または非ウイルス性のベクターで送達できる。直接的に送達される場合、配列は一般にヌクレアーゼ耐性とされる。代わりに、配列は、発現カセットまたは構築物において配列が本願の明細書等で以下に議論されるとおり細胞で発現されるように導入できる。一般に、構築物は、配列が標的とした細胞において発現されることを許容するための適切な制御配列またはプロモーターを含む。本発明の化合物の送達に任意で使用されるベクターは、商業的に利用可能であり、当業者に知られた方法で本発明の化合物を送達する目的で修飾しえる。
一または二以上のステムおよびループ構造(ここで、ステム領域は、本発明のオリゴヌクレオチドの配列を含む)を含んでいる長いオリゴヌクレオチド(典型的には、25-500 ヌクレオチドの長さ)は担体(好ましくは、薬学的に許容される担体)において送達されてもよいこと、細胞内で内因性の細胞複合体(例えば、上記のDROSHAおよびDICER)でプロセスされて本発明のオリゴヌクレオチドである一または二以上の小さい二本鎖オリゴヌクレオチド(siRNAs)が産生されてもよいことが予見される。このオリゴヌクレオチドは、タンデム型のshRNA構築物と称してもよい。この長いオリゴヌクレオチドは、各々のステム領域がRTP801 遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスsiRNA配列を含む一または二以上の ステムおよびループ構造を含んでいる一本鎖オリゴヌクレオチドであることが予見される。特に、このオリゴヌクレオチドが表 Aに示されるセンス および アンチセンス siRNA配列(配列番号3-70)を含むことが予見される。
ヌクレオチド / オリゴヌクレオチドの全てのアナログまたは修飾が本発明に使用しえる(但し、前記アナログまたは修飾は、ヌクレオチド / オリゴヌクレオチの機能に実質的に影響しない)。ヌクレオチドは、天然の又は合成の修飾塩基から選択できる。天然の塩基には、アデニン, グアニン, シトシン, チミン および ウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾塩基には、イノシン, キサンチン, ヒポキサンチン, 2- アミノアデニン, 6-メチル, 2-プロピルおよび他のアルキル アデニン, 5-ハロウラシル, 5-ハロシトシン, 6-アザシトシンおよび6-アザチミン, シュードウラシル, 4-チオウラシル, 8-ハロアデニン, 8-アミノアデニン, 8-チオール アデニン, 8-チオールアルキル アデニン, 8-ヒドロキシル アデニンおよび他の8-置換されたアデニン, 8-ハログアニン, 8-アミノグアニン, 8-チオールグアニン, 8-チオアルキルグアニン, 8-ヒドロキシルグアニンおよび他の置換されたグアニン, 他のアザおよびデアザアデニン, 他のアザおよびデアザグアニン, 5-トリフルオロメチルウラシルおよび5-トリフルオロシトシンが含まれる。幾つかの態様において、オリゴマーにおける一または二以上の ヌクレオチドは、イノシンで置換される。
加えて、ポリヌクレオチドのアナログを調製でき、アナログは一または二以上のヌクレオチドの構造が基本的に変更され、治療または実験の試薬としてより良く適合される。ヌクレオチドアナログの例は、DNA(またはRNA)におけるデオキシリボース(またはリボース)リン酸バックボーンがペプチドに見つけられるものと類似するポリアミドバックボーンで置換されるペプチド核酸(PNA)である。PNAアナログは、酵素デグラデーションに耐性であり、インビボおよびインビトロでの安定性が延長することが示された。オリゴヌクレオチドになしえる他の修飾には、ポリマーバックボーン, 環状バックボーン, 非環式のバックボーン, チオホスフェイト-D-リボース バックボーン, トリエステルバックボーン, チオアートバックボーン, 2'-5'架橋バックボーン, 人工的な核酸, モルホリノ核酸, ロック核酸(LNA;locked nucleic acid), グリコール 核酸(GNA), トレオース核酸(TNA), アラビノシド, およびミラーヌクレオシド (例えば、ベータ-D-デオキシヌクレオシドの代わりのベータ-L-デオキシヌクレオシド)が含まれる。LNAヌクレオチドを含んでいるsiRNA 化合物の例は、Elmen等〔Elmen et al., (NAR 2005, 33(1):439-447)〕に開示される。
本発明の化合物は、一または二以上の逆位のヌクレオチド、例えば、逆位のチミジンまたは逆位のアデニンを用いて合成できる〔例えば Takei, et al., 2002, JBC 277(26):23800-06を参照されたい〕。
「ミラー」ヌクレオチドは、天然の又は一般に使用されるヌクレオチドに対して逆のキラリティー(reversed chirality)を有するヌクレオチドである〔天然の(D-ヌクレオチド)の鏡像(L-ヌクレオチド)〕。ヌクレオチドはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであってもよく、さらに少なくとも一つの糖, 塩基および/またはバックボーンの修飾を含んでいてもよい。米国特許第 6,602,858は、少なくとも一つの L-ヌクレオチド置換を含んでいる核酸触媒(nucleic acid catalysts)を開示する。
本発明のインヒビターは好ましくはsiRNA 分子であるが、RTP801を阻害するため及び本願の明細書等に記載される疾患および状態を治療するため本発明の方法に使用されることが企図される他のインヒビターは、とりわけ、抗体, 好ましくは中和抗体又はその断片, 単鎖抗体, アンチセンスオリゴヌクレオチド, アンチセンスDNAまたはRNA分子, リボザイム, タンパク質, ポリペプチドおよびペプチド、ペプチドミメティックスおよびドミナントネガティブ,および全て上記のものを発現している発現ベクターである。付加的なインヒビターは、一般に2000 ダルトン未満(より好ましくは 1000 ダルトン未満, なおより好ましくは 500 ダルトン未満)の分子量を有する小さい 化学分子であってもよい。これらのインヒビターは、以下の通り作用しえる: 小さい分子は発現および/または活性に影響しえる;抗体は活性に影響しえる;全ての種類のアンチセンスはRT801遺伝子発現に影響しえる;およびドミナントネガティブなポリペプチド および ペプチドミメティックスは活性に影響しえる;発現ベクターはとりわけアンチセンスまたはドミナントネガティブ ポリペプチドまたは抗体の送達に使用しえる。
抗体
「抗体」の用語は、とりわけ、IgG, IgM, IgD, IgA, および IgE 抗体を意味する。その規定には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が含まれる。この用語は、抗体全体(whole antibodies)または抗原結合性ドメインを含んでいる抗体の断片を意味し、例えば、Fc部分, 単鎖抗体, ミニ抗体(miniantibodies), 本質的に可変部のみからなる断片, 抗体の抗原結合性ドメイン, などである。また、「抗体」の用語は、cDNAワクチン接種で得られるポリヌクレオチド配列に対する抗体を意味してもよい。その用語は、その抗原またはレセプターと選択的に結合する能力を保持する抗体断片を包含し、とりわけ以下の通り例示される:
(1) Fab, 抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含む断片であり、抗体全体を酵素パパインで消化し、軽鎖および重鎖の一部を作出して、産生することができる;
(2) (Fab')2, 抗体全体を酵素ペプシンで処理し、引き続く還元なしで得ることができる抗体の断片;F(ab'2)は二つのジスルフィド結合で共に結合される二つのFab断片の二量体である;
(3) Fv, 軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含んでおり、二つの鎖として発現される遺伝子改変した断片と規定される;および
(4) 単鎖抗体(SCA), 適切なポリペプチドリンカーで連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を遺伝的に融合させた単一の鎖状分子として含んでいる遺伝子改変分子と規定される。
アンチセンス分子
「アンチセンス」(AS)または「アンチセンス断片」の用語は、阻害性のアンチセンス活性を有しているポリヌクレオチド断片(デオキシリボヌクレオチド, リボヌクレオチドまたは両方の混合物のいずれかを含んでいる)を意味し、前記活性は対応する遺伝子の内因性ゲノムのコピーの発現における減少を生じる。ASポリヌクレオチドは、十分な連続する長さおよび標的遺伝子の配列内に存在する配列と相同性を有し、ASと前記遺伝子とのハイブリダイゼーションを認可する連続的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。多くの総説が、アンチセンス(AS)技術及びその莫大な治療上のポテンシャルの主な側面をカバーする〔Aboul-Fadl, Curr Med Chem. 2005.12(19):2193-214; Crooke, Curr Mol Med. 2004. 4(5):465-87; Crooke, Annu Rev Med. 2004;55:61-95; Vacek et al., Cell Mol Life Sci. 2003. 60(5):825-33; Cho-Chung, Arch Pharm Res. 2003. 26(3):183-91〕。この技術の化学的な(Crooke, 1995; Uhlmann et al, 1990), 細胞の(Wagner, 1994. Nature. 24;372(6504):333-5) および治療上の(Hanania, et al, 1995; Scanlon, et al, 1995; Gewirtz, 1993)側面に関して更なる総説がある。特異的な遺伝子の発現におけるアンチセンスの介入は、合成のASオリゴヌクレオチド配列によっても達成しえる〔例えば、Zhang et al., Curr Cancer Drug Targets. 2005 5(1):43-9.を参照されたい〕。
ASオリゴヌクレオチド配列はDNAの短い配列であってもよく、典型的には15-30 merであるが7 mer程度の小さいものであってもよく〔Wagner et al, 1996 Nat Biotechnol. 14(7):840-4〕、所望の標的 mRNAを補完(complement)し、RNA:AS二重鎖を形成するために設計される。この二重鎖の形成は、関連性のあるmRNAのプロセシング, スプライシング, 輸送または翻訳を阻止できる。そのうえ、特定のAS ヌクレオチド配列は、標的 mRNAとハイブリダイズする場合に細胞のRNase H活性を誘発でき、mRNAのデグラデーションを生じる〔Calabretta et al, 1996 Semin Oncol. 23(1):78-87〕。その場合、RNase Hは、二重鎖のRNAコンポーネントを切断し、潜在的にASを放出し、さらに標的 RNAの付加的な分子とハイブリダイズできる。付加的な作用様式は、ASとゲノムのDNAとの相互作用から生じ、転写的に不活性である三重ヘリックスを形成する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列標的セグメントは、配列が相補的な鋳型とのオリゴヌクレオチド二重鎖形成に重要な特性に関連する適切なエネルギーを呈し、自己二量体化(self-dimerization)または自己相補性(self-complementation)が低ポテンシャルを示すように選択される〔Anazodo et al., 1996 BBRC. 229(1):305-9〕。例えば、コンピュータプログラムオリゴ(Primer Analysis Software, Version 3.4)を使用してアンチセンス配列の融解温度, 自由エネルギー特性を決定し、自己二量体形成および自己相補性特性の可能性を見積ことができる。プログラムによって、これらの二つのパラメータ(潜在的な自己二量体形成および自己相補性)の定性的な見積の決定が許容され、「可能性なし(no potential)」または「多少の可能性(some potential)」または「基本的に完全な可能性(essentially complete potential)」の指標が提供される。このプログラムを用いて、標的セグメントは、一般にこれらのパラメータにおいて可能性なしの見積を有するものが選択される。しかしながら、カテゴリーの一つに「多少の可能性」を有するものをセグメントに使用できる。パラメータのバランスを、当該技術分野において既知のように選択に使用しえる。さらに、オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、アナログ置換が機能に実質的に影響しないように選択される。
ホスホロチオネートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常は動物において効果的で十分な薬力学的な半減期を示す濃度で有意な毒性を示さず(Agarwal et al., 1996)、またヌクレアーゼ耐性である。細胞の発生と関連する機能喪失(loss-of-function)表現型を誘発するアンチセンスは、インテグリン (Galileo et al., Neuron. 1992 9(6):1117-31.) および N-myc タンパク質 (Rosolen et al., 1990 Prog Clin Biol Res. 366:29-36)を含む種々の異なる遺伝子に関して示された。分裂促進的で血管新生の特性を有している塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、飽和的(saturable)で特異的な様式で神経膠腫細胞における成長の80%を抑制する〔Morrison, JBC 1991 266(2):728-34〕。疎水性であることでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン脂質膜と相互作用する(Akhter et al., NAR.. 1991, 19:5551-5559)。細胞の原形質膜との相互作用につづき、それらは活発に(または受動的に)生細胞に輸送され(Loke et al., PNAS 1989, 86(10):3474-8)、これは特異的なレセプターが関与することが予測される飽和性の機構(saturable mechanism)でなされる(Yakubov et al., PNAS, 1989 86(17):6454-58)。
リボザイム
「リボザイム」は、RNA触媒能力を有するRNA分子(総説に関して、Cech Biochem Soc Trans. 2002 Nov;30(Pt 6):1162-6を参照されたい)であり、標的RNAにおける特異的な部位を切断する。本発明に基づいて、mRNAを切断するリボザイムは、インヒビターとして利用しえる。これはアンチセンス治療が化学量論的なことから制限される場合に必要である可能性がある(Sarver et al., 1990, Gene Regulation and Aids, pp. 305-325)。リボザイムは、骨髄疾患と関連する遺伝子を標的とするものとして使用できる可能性がある。リボザイムで切断されるRNA分子の数は、化学量論で予測される数より大きい(Hampel and Tritz, Biochem. 1989, 28(12):4929-33; Uhlenbeck, Nature. 1987 328(6131):596-600)。
リボザイムは、RNAのリン酸ジエステル結合切断を触媒する。幾つかのリボザイム構造ファミリーが同定され、グループI イントロン, RNase P, 肝炎デルタウイルスリボザイム, ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイム〔最初にタバコ輪紋ウイルスサテライト RNA (sTRSV)の陰性鎖から由来した〕(Sullivan, 1994; 米国特許第 5,225,347)が含まれる。後者の二つのファミリーは、リボザイムがローリングサイクル複製の間に作製されたオリゴマーからモノマーを分離すると信じられているウイロイドおよびウイルソイドから由来する(Symons, 1989 および 1992)。ハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムモチーフは、遺伝子治療のためのmRNAsのトランス切断に最も一般に適用される(Sullivan, 1994)。通常、リボザイムは、約 30-100 ヌクレオチドの長さを有する。リボザイムの送達は、AS断片および/またはsiRNA分子のものと類似する。
RTP801の不活性化化合物のスクリーニング
幾つかの本発明の化合物および組成物は、RTP801の活性を調節する化合物(特に、RTP801のレベルの上昇を伴う障害を調節する化合物)を同定する及び単離するためのスクリーニングアッセイに使用できる。スクリーニングされる化合物は、とりわけ、小さい化学分子およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの物質を含む。
例えば、付加的な化合物がRTP801の阻害に関して本発明のオリゴヌクレオチドと競合する場合,または付加的な化合物が前記阻害をレスキューする場合、RTP801における本発明の化合物の活性またはRTP801に対する本発明の化合物の結合は、付加的な化合物とRTP801ポリペプチドとの相互作用を決定するために使用できる。阻害または活性化は、とりわけ、RTP801ポリペプチドの活性の産物またはRTP801ポリペプチドからの結合化合物の置き換えを放射性または蛍光競合アッセイでアッセイするなどの様々な手段で試験できる。
RTP801を利用するスクリーニング系および本発明のsiRNAsが使用できるスクリーニング系における更なる情報に関して、本発明の権利者のPCT出願番号PCT/US2007/011266 および PCT/IL 2007/000774(これらは参照によってその全体が本明細書中に援用される)を参照されたい。
一態様において、本発明は、微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄損傷または他の創傷から選択される状態を患っている患者を治療するための方法を提供し、該方法は患者を治療するために患者に治療上効果的な量のRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与することを含む。本発明は、さらに微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄損傷または他の創傷を患っている患者を治療する方法を提供し、該方法は患者に回復を促進するために十分な量および期間でRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与することを含む。眼疾患は、とりわけ、老化性の黄斑変性症 (AMD)などの黄斑変性症であってもよい。微小血管の障害は、とりわけ、糖尿病性網膜症または急性腎不全であってもよい。呼吸障害は、とりわけ、慢性閉塞性肺疾患 (COPD), 気腫, 慢性気管支炎, 喘息 および 肺癌であってもよい。聴力障害は、とりわけ、音響性外傷またはシスプラチン誘発性の難聴であってもよい。RTP801インヒビターは、ポリヌクレオチド, アンチセンス断片, RTP801 遺伝子 mRNAを標的とするRNA分子、例えば、リボザイムまたはsiRNAs(例えば、表 AのsiRNAsおよび特に表 Aの番号102, 103および106にリストされたsiRNA),またはそれらを含んでいる発現ベクター; ポリペプチド、例えば、ドミナントネガティブ, 抗体〔例えば、図 2 (配列番号2)に配列が記載される、連続的なアミノ酸を含むポリペプチド内に存在するエピトープに特異的に結合する抗体〕, または, 一部の例では, 酵素などの化合物が含まれるが、これらに限定されない多様な分子から選択されえる。さらに、RTP801インヒビターは、例えば、小さい分子, 例えば, 低分子量(例えば、分子量2000 ダルトン未満)の化学的分子などの化学的インヒビターであってもよい。特定のRTP801 インヒビターが、以下に記載される。
本発明は、さらに黄斑変性症, COPD, 糖尿病性網膜症または音響性外傷誘発性難聴を患っている患者を治療するための方法を提供し、該方法は患者を治療するためにRTP801 遺伝子から転写されるmRNAと特異的にハイブリダイズする及びRTP801遺伝子の発現をダウンレギュレートするポリヌクレオチドを含んでいる治療上効果的な量のRTP801インヒビターを含んでいる薬学的組成物を患者に投与することを含む。ポリヌクレオチドは、表 Aに記載される任意の配列(配列番号 3-70)と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含んでいるsiRNAおよび特に番号102, 103および106としてリストされるsiRNAであってもよい。
さらに、本発明の付加的な態様は、微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄損傷または他の創傷を患っている患者を治療する方法に関し、該方法は患者を治療するための用量および期間でsiRNA 分子(任意で、表 Aに詳細に記載されるsiRNA 分子)を含んでいる治療上効果的な量のRTP801 インヒビターを含んでいる薬学的組成物を患者に投与することを含む。
微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄損傷または他の創傷を患っている患者を治療するための付加的な方法が提供され、該方法は患者を治療するための用量および期間でRTP801 遺伝子 mRNAを標的とする治療上効果的な量のRNA分子を含んでいる薬学的組成物を患者に投与することを含む。RNA分子は、表 Aに詳細に記載されるsiRNA分子および特にsiRNA番号102, 103および106などのsiRNA 分子,またはリボザイムであってもよい。
さらに、本発明は、微小血管の障害, 眼疾患, 呼吸障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄損傷または他の創傷または本願の明細書等に開示された任意の状態を患っている患者を治療する方法に関し、該方法は患者を治療するための用量および期間で治療上効果的な量のRTP801 遺伝子 mRNAを標的とするsiRNA 分子(任意で、表 Aに詳細に記載されるsiRNA 分子)を含んでいる薬学的組成物を患者に投与することを含む。さらに、眼疾患は老化性の黄斑変性症 (AMD)などの黄斑変性症であってもよい;微小血管の障害は糖尿病性網膜症または急性腎不全であってもよい;呼吸障害はCOPDであってもよい、治療されるCOPDの状況には気腫, 慢性気管支炎,またはその両方が含まれてもよいが、これらに限定されない;および聴力障害は音響性外傷誘発性難聴であってもよい。
本発明は、さらにRTP801 発現の阻害が有益な聴覚障害の治療における本願の明細書等で開示された新規のsiRNAsの使用に関する。一態様において、本発明は、聴覚(またはバランス)損傷を有している又はその傾向がある哺乳類を治療する又はRTP801 発現の阻害が有益な状態の予防において哺乳類を治療するための方法を構成する。本発明のこの態様の方法は、内耳の細胞障害, 欠損,または変性(特に音響性外傷または耳毒性因子で生じる)からの結果であろう聴覚(またはバランス)損傷の出現または重症化を予防する又は減少させるだろう。この態様において、本発明の方法は、RTP801遺伝子の発現をダウンレギュレートする治療上効果的な量の一または二以上の化合物(特に本発明の新規のsiRNAs)を投与することを含む。
RTP801に対するsiRNA 化合物は、霊長類および他の哺乳類におけるCOPD, AMD, ARF, 微小血管の障害 および 難聴の治療に本発明の権利者により首尾よく使用されている。更なる情報および これらの状態を研究する及び治療するための動物モデルに関して、PCT公開番号WO06/023544A2 および PCT特許公開番号WO07/084684(参照によってその全体が本明細書中に援用される)を参照されたい。
別の態様において、本発明の方法は、褥瘡の発生または重症化の治療又は予防に適用される。前記方法および組成物には、係る治療を必要とする哺乳類にRTP801 遺伝子の発現をダウンレギュレートする予防上または治療上効果的な量の一または二以上の化合物〔特に新規の低分子干渉RNAs(siRNAs)〕を投与することが関与する。褥瘡の発生または重症化を治療する又は予防する化合物(特に、新規のsiRNAs)は、好ましくはダメージをうけた領域内で局所的に投与される。本発明の方法および組成物は、持続的な圧力(通常、ベッドまたは車椅子からの圧力)が体の脆弱な部分への循環を遮断する場合に発生する褥瘡または圧迫潰瘍の治療および予防に効果的である。本発明の方法および組成物は、感覚が減退(diminished)または欠除した患者において、または衰弱した、痩せ衰えた、麻痺した、または寝たきりの者に効果的である。本発明の組成物は、前記組成物を用いて褥瘡の治癒(healing)を改善することに効果的である。本発明の組成物は、任意の治癒が開始される前または寧ろ特定の糜爛(specific sore)が形成される前(予防的処置)の段階を含む治癒プロセスにおいて任意の特定の段階で使用しえる。
本発明で治療される傷の他の種類には、i) 全身の傷、例えば、外科的な, 外傷性の, 感染性の, 虚血性の, 温熱性(thermal)の, 化学的なおよび水胞性の傷; ii) 口腔に特異的な傷、例えば、特に抽出後の傷(post-extraction wounds), 歯内(endodontic)の傷、特に、細菌性の, ウイルス性のまたは自己免疫性の起源の, 機械的な, 化学的な, 温熱性の, 感染性のおよび苔癬状の傷のシスト(cysts)および膿(abscesses), 潰瘍および病変の治療に関連するもの; 疱疹潰瘍(herpes ulcers), アフタ性口内炎(stomatitis aphthosa), 急性壊死性の潰瘍性歯肉炎および口腔灼熱症候群(burning mouth syndrome)は特定の例である;およびiii) 皮膚の傷、例えば、新生物, 火傷(例えば、化学的な, 温熱性の), 傷害(細菌性の, ウイルス性の, 自己免疫性の), 咬傷および外科的な切傷が含まれる。
また、本発明の方法および組成物は、とりわけ、褥瘡, 静脈性潰瘍, および糖尿病性潰瘍を含んでいる任意の慢性創傷(chronic wounds)の治療および予防に効果的である。全てのこれらの慢性創傷のタイプにおける、根底にある促進するイベント(underlying precipitating event)は、虚血の期間と続く再灌流の期間である。これらの虚血再灌流イベントは通常反復性であり、虚血再灌流の有害な効果が増強され、最終的に潰瘍形成を生じるために十分であることが意味される。褥瘡および糖尿病性の足の潰瘍に関して、虚血イベントは組織灌流を阻止するために十分な圧力を長期間うけたことによるものであり、圧力が最終的に解消する場合に再潅流傷害が生じる。本発明の組成物は、慢性創傷において虚血再灌流で生じるダメージを抑えることに効果的である。
また、本発明の組成物は、虚血再灌流に関連する他の状態で効果的であり、例えば、臓器移植, 腸および結腸のアナスタモス(anastamoses), 大血管の手術, 縫合が剥がれた四肢(stitching detached limbs), バルーン血管形成または任意の心臓外科, 発作または脳 外傷, 肢 移植, 肺性高血圧, 低酸素血症, および 非心臓性の肺水腫, 急性腎不全, 急性緑内障, 糖尿病性網膜症, 高血圧性網膜症, 網膜血管閉塞, 蝸牛の虚血, 微小血管の外科 および強皮症における虚血性傷害であるが、これらに限定されない。
本発明の方法および組成物は、音響性外傷または機械的な外傷(好ましくは、内耳の有毛細胞の欠損を導く聴覚性のまたは機械的な外傷)の治療にも効果的である。本発明で治療される音響性外傷は、極度に大きな音への単回の暴露,または毎日約85デシベル以上の大きな音への長期の曝露によって生じる可能性がある。本発明で処理される機械的な内耳の外傷は、例えば、内耳に挿入する電気的な装置の作業の後の内耳の外傷である。本発明の組成物は、作業と関連する内耳の有毛細胞へのダメージを予防するまたは最小化する。耳毒誘発性の聴覚障害を減少または予防する化合物(特に、新規のsiRNAs)は、好ましくは内耳内(任意で、トランス鼓室注射で)に局所的に投与される。
さらに、本発明の化合物は、虚血(任意で、虚血再灌流)が関与する任意の状態を治療するため使用できる。虚血または虚血再灌流を含む係る状態は、血管形成術, 心臓手術または血栓溶解; 臓器移植; 形成外科の結果として; 重篤な筋区画症候群の間; 切断した四肢の再付着の間; 多臓器不全症候群の結果として; 脳における発作または脳外傷の結果として; 慢性創傷(例えば、褥瘡, 静脈の潰瘍および糖尿病性の潰瘍)に関連する; 骨格筋の虚血または四肢の移植の間; 腸間膜の虚血または急性の虚血性の腸疾患の結果として; 肺性高血圧, 低酸素血症,および非心臓性の肺水腫を導く下胴部(lower torso)の虚血の結果としての呼吸不全; 腎移植, 大きな手術, 外傷,および敗血性、同様に、出血性ショックの後に観察される急性腎臓不全; 敗血症; 急性緑内障, 糖尿病性網膜症, 高血圧性網膜症,および網膜の血管閉塞などの幾つかの眼球疾患における視覚の欠損を導く急性の血管閉塞の結果として発生する網膜の虚血; 蝸牛の虚血; 頭部および首部(head and neck)の欠陥の微小血管の手術におけるフラップ不全(flap failure); レイノー現象(Raynaud's phenomenon)および硬皮症における関連する指の虚血傷害; 脊髄損傷; 血管の手術; 外傷性の横紋筋融解症(crush症候群);およびミオグロビン尿症から生じる。さらに、虚血/再灌流は、高血圧症, 高血圧性の大脳の血管疾患, 動脈瘤の破裂, 血栓または塞栓のケースにおいて生じるような血管の狭窄または閉塞, 血管腫, 血液悪液質(blood dyscrasias), 心臓の停止または不全を含む任意の形態の易感染性の心機能, 全身性の低血圧, 心停止, 心原性ショック, 敗血症ショック, 脊髄外傷, 頭部外傷, 発作, 腫瘍からの出血; および発作, パーキンソン病, てんかん, うつ病(depression), ALS, アルツハイマー病, ハンチントン病および任意の他の疾患誘発性の痴呆(例えば、HIV誘発性痴呆)などの疾患の状態に関与しえる。さらに、虚血エピソードは、中枢神経系への機械的な傷害〔例えば、頭部または脊椎(spine)への打撃から生じる〕が原因である可能性がある。外傷には、組織傷害(例えば、摩耗, 切開, 挫傷, 穿刺, 圧迫, など)が関与し、例えば、頭部, 首,または脊柱の任意の部位または付属物への外来の物体の外傷性の接触から生じる可能性がある。他の形態の外傷性の傷害は、液体の不適切な蓄積(例えば、正常な脳脊髄液または硝子体液の産生の遮断または機能不全, ターンオーバー,または容積の制限(volume regulation),または硬膜下のまたは頭蓋内の血腫または浮腫)でのCNS組織の狭窄または圧迫から生じる可能性がある。同様に、外傷性の狭窄または圧迫は、異常な組織(例えば、転移性または原発性の腫瘍)の塊(mass)の存在から生じる可能性がある。
本願の明細書等に開示され、本発明に含まれる疾患を治療する方法は、付加的なRTP801インヒビター, 以下に詳細に記載される活性成分の薬理学的な特性を改善する物質,または治療される疾患(例えば、とりわけ、黄斑変性症, COPD, ARF, DR, シスプラチンまたは音響性外傷誘発性難聴)の治療に効果的であることが知られている付加的な化合物と併せてRTP801インヒビターを投与することを含んでもよい。「と併せて(in conjunction with)」は、前, 同時または引き続きを意味する。例示的な結合治療(conjoined therapies)を、以下に記載する。
別の態様において、本発明は、上記で詳細に記載されたような、黄斑変性症, COPD, ARF, DR, シスプラチンまたは音響性外傷誘発性難聴または任意の他の眼疾患, 微小血管性または呼吸性の状態または聴力障害を患っている患者における回復を促進するための医薬の調製における治療上効果的な量のRTP801インヒビターの使用,および前記の疾患および状態を治療するための医薬の調製における治療上効果的な量のRTP801インヒビターの使用を提供する。この態様において、RTP801 インヒビターは、図 1に記載される配列(配列番号 1)に対するアンチセンス配列を含む配列を有している連続的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。さらに、RTP801 インヒビターは、図 1に記載される配列(配列番号 1)に対するアンチセンス配列である配列を有しているポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってもよい。前記使用によるRTP801インヒビターは、配列(配列番号2)が図 2に記載される連続的なアミノ酸を含むポリペプチド内に存在するエピトープに特異的に結合する中和抗体などの抗体であってもよい。さらに、RTP801 インヒビターは、RTP801 遺伝子 mRNAを標的とするRNA分子、任意でsiRNA、任意で表 Aに記載される任意の配列(配列番号 3-70)と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含んでいるsiRNAおよび特にsiRNA番号102, 103および106,またはリボザイムであってもよい。
従って、本願の明細書等に開示された情報にしたがって、本願の明細書等に開示された任意の方法で、本願の明細書等に開示された任意の使用において、および本願の明細書等に開示された任意の薬学的組成物において使用された、RTP801 インヒビターは、siRNA, siRNAを含んでいるベクター, siRNAを発現するベクターおよび内因性にsiRNAにプロセスされる任意の分子からなる群から選択されてもよい。本願の明細書等に開示されたとおり、前記siRNAは、好ましくは、表 Aに記載される任意の配列(配列番号 3-70)と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含んでいるsiRNAおよび特にsiRNA番号102, 103および106である。
「呼吸障害」は、とりわけ、慢性閉塞性肺疾患 (COPD), 気腫, 慢性気管支炎, 喘息 および 肺癌を含んでいる全てのタイプの肺の障害を含むが、これらに限定されない呼吸器系の状態, 疾患または症候群を意味する。気腫 および 慢性気管支炎は、COPDの一部として、または独立に生じえる。
「微小血管障害(Microvascular disorder)」は、微視的毛細管およびリンパ管に影響する任意の状態, 特に血管攣縮性の疾患, 血管炎疾患およびリンパ閉塞疾患を意味する。微小血管の障害の例には、とりわけ、眼障害、例えば、一過性黒内症(塞栓性またはSLEに対して二次性), apla症候群, Prot CSおよびATIII欠乏, IV 薬の使用で生じる微小血管の病理, タンパク異常血症, 側頭動脈炎, 前部虚血性視神経症, 視神経炎(自己免疫疾患に対して一次性または二次性), 緑内障, フォンヒッペル・リンダウ症候群(von hippel lindau syndrome), 角膜疾患, 角膜の移植拒絶の白内障, イールズ病(Eales' disease), 樹氷状血管炎(frosted branch angiitis), 輪状締結バックリング手術(encircling buckling operation), 扁平部炎をを含むブドウ膜炎, 脈絡叢のメラノーマ, 脈絡叢の血管腫, 視覚神経形成不全; 網膜の病状、例えば、網膜動脈閉塞, 網膜静脈閉塞, 未熟網膜症, HIV 網膜症, Purtscher網膜症, 全身性血管炎および自己免疫疾患の網膜症, 糖尿病性網膜症, 高血圧性の網膜症, 放射線網膜症, 網膜動脈分枝閉塞または網膜静脈分枝閉塞, 特発性の網膜血管炎, 動脈瘤, 視神経網膜炎, 網膜の塞栓形成, 急性の網膜ネクローシス, バードショット網脈絡膜症(birdshot retinochoroidopathy), 長期にわたる網膜剥離; 全身性の病状、例えば、真性糖尿病, 糖尿病性網膜症 (DR), 糖尿病関連の微小血管の病状(本願の明細書等に詳細に記載される), 過粘稠度症候群, 大動脈弓症候群(aortic arch syndromes)および眼球の急性冠動脈症候群(ocular ischemic syndromes), 頸動脈海綿静脈洞瘻(carotid-cavernous fistula), 多発性硬化症, 全身性エリテマトーデス, SS-A自己抗体を伴う細動脈炎, 急性多病巣性出血性血管炎(acute multifocal hemorrhagic vasculitis), 感染から生じる血管炎, ベーチェット病から生じる血管炎, サルコイドーシス, 凝固障害, 神経障害, 腎症(nephropathies), 腎臓の微小血管の疾患,および虚血性の微小血管の病状が含まれる。
微小血管の障害は、新生血管の要素を含んでいてもよい。「新生血管の障害(neovascular disorder)」の用語は、血管の形成(新生血管形成)が患者に有害である状態を意味する。眼球の新生血管形成の例には、網膜疾患 (糖尿病性網膜症, 糖尿病性 黄斑浮腫, 慢性 緑内障, 網膜剥離,および鎌形赤血球網膜症); ルベオーシス虹彩炎; 増殖性硝子体網膜症(proliferative vitreo-retinopathy); 炎症性の疾患; 慢性ブドウ膜炎; 新生物(網膜芽細胞腫, 偽性神経膠腫およびメラノーマ); フックス虹彩毛様体炎(Fuchs' heterochromic iridocyclitis); 新生血管の緑内障; 角膜の新生血管形成(炎症性, 移植および虹彩の発生の発育不全); 硝子体切除および水晶体切除術の混合手術後の新生血管形成; 血管性疾患(網膜虚血, 脈絡叢の血管性不全, 脈絡叢の血栓症および頚動脈虚血); 視覚神経の新生血管形成;および眼の浸透による新生血管形成または挫傷性の眼外傷(contusive ocular injury)が含まれる。全てのこれらの新生血管の状態は、本発明の化合物および薬学的組成物を用いて治療しえる。
「眼疾患(Eye disease)」は、脈絡叢の新生血管形成 (CNV), ウェットおよびドライAMD, 眼球のヒストプラスマ症候群,網膜色素線条, Bruch's膜の破裂, 近視性変性, 眼球の腫瘍, 網膜の変性疾患および網膜静脈閉塞(RVO)に関与している任意の状態を含むが、これに限定されない眼の状態, 疾患または症候群を意味する。本発明の方法により治療しえる本願の明細書等に開示された幾つかの状態(例えば、DR)は、本願の明細書等に記載された規定にしたがって微小血管の障害および眼疾患,またはその両方と考えられる。
本発明に関連する聴覚障害は、音響性外傷, ウイルス性の内リンパ内耳炎(viral endolymphatic labyrinthitis), メニエール病などの内耳の有毛細胞が関与している終末器官の病変によるものであってもよい。聴覚障害には耳鳴が含まれ、これは聴覚刺激の非存在下での音の認識であり、間欠的または連続的である可能性があり、感音性欠損(sensorineural loss)と診断される。聴覚損失は、細菌またはウイルスの感染、例えば、耳ヘルペス, 次に記載のものから生じる化膿性迷路炎(purulent labyrinthitis)、急性中耳炎, 化膿性髄膜炎, 慢性中耳炎, 次に記載のものを含む突発難聴、ウイルス性の突発難聴、例えば、おたふく風邪, はしか, インフルエンザ, 水疱瘡, 単核球症(mononucleosis)および アデノウイルスを含むウイルスによるウイルス性内リンパ内耳炎(viral endolymphatic labyrinthitis)による可能性がある。聴覚損失は、先天性のものであってもよく、例えば、風疹, 出生の間の無酸素, 出産の間の外傷が原因となる内耳への出血, 母親に投与された耳毒性の薬物, 胎児性赤芽球症, およびワールデンブルグ症候群およびフルラー症候群を含む遺伝状態により生じるものである。聴覚損失は、ノイズ誘発性(noise-induced)のものであってもよく、一般に内耳にダメージを与える約85デシベル(db)以上の騒音が原因となる。好ましくは、聴覚損失は、音響性外傷または内耳(特に、内耳の有毛細胞)の聴覚部分(auditory portion)に影響する耳毒性薬によって生じる。本明細書中に参照によって援用されるものは、メルクマニュアル〔The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 14th Edition, (1982), Merck Sharp & Dome Research Laboratories, N.J.〕の196, 197, 198および199章並びに聴覚およびバランス欠陥(balance impairments)の記載および診断に関連する207および210章を含んでいる最近の16版における対応する章である。
本発明において治療または予防される聴覚の障害または損傷(またはバランス欠陥)は、好ましくは、理論に縛られることなく、内耳の有毛細胞に対する耳毒または外傷誘発性のアポトーシスのダメージである。治療が必要なものには、聴覚障害を既に経験しているもの, 聴覚障害を有する傾向にあるもの, および聴覚障害が予防されるものが含まれる。理論に縛られることなく、聴覚障害は、アポトーシスの内耳有毛細胞のダメージまたは欠損で生じる可能性があり、そのダメージまたは欠損は感染, 機械的な傷害, 大きな音, 加齢,または化学物質誘発性の耳毒性によって生じる。耳毒には、抗悪性腫瘍薬剤, サリチラート, キニーネ, およびアミノグリコシド系抗生物質を含む治療上の薬物, 食物または医薬における夾雑物, および環境のまたは産業的な汚染物が含まれる。典型的には、治療が行われて特に治療上の薬物の投与または音響性外傷誘発性の環境への曝露から生じる又は生じることが予想される耳毒性または音響性外傷を予防する又は減少させる。好ましくは、治療上効果的な組成物は、暴露後に即座に与えられて、耳毒性の影響または外傷性の影響が予防される又は減少される。より好ましくは、治療は、耳毒性の医薬の又は耳毒への又は音響性外傷誘発性の環境への暴露の前または同時に組成物の投与によって予防的に提供される。聴覚障害は、化学療法によって誘発される可能性がある。
「RTP801 遺伝子」は、図 1に示されるRTP801 コード配列 オープンリーディングフレーム(配列番号1),又は任意のその相同的な配列(好ましくは、少なくとも 70% 同一性, より好ましくは 80% 同一性, なおより好ましくは 90%または95% 同一性を有している)を意味する。これは本願の明細書等に記載される変異(mutations), 変更(alterations)または修飾(modifications)をうけている配列番号1から由来する任意の配列を包含する。従って、好適な態様において、RTP801は、配列番号1による核酸配列でコード化される。本発明による核酸は、たんにそれぞれRTP801をコードしている核酸の一部に相補的および同一であるもの、好ましくは第一のストレッチおよび第一の鎖が典型的に本発明による核酸より短いものも本発明の範囲内である。RTP801のアミノ酸配列に基づいて、係るアミノ酸配列をコードしている任意の核酸配列が遺伝暗号に基づいて当業者によって知覚されえることが理解される。しかしながら、本発明による核酸の想定された作用様式によって、RTP801をコードしている核酸(好ましくは、そのmRNA)がそれぞれRTP801の発現が減少する生物体, 組織 および/または細胞に存在するものであることが最も好適である。
「RTP801 ポリペプチド」は、RTP801 遺伝子のポリペプチドを意味し、本発明の目的のために、任意の生物体(任意で、人間)から由来する「RTP779」, 「REDD1」, 「Ddit4」, 「FLJ20500」, 「Dig2」,および「PRF1」の用語, 生物活性を保持しているそのスプライスバリアントおよび断片,およびそのホモログ, 好ましくはそれに少なくとも 70%, より好ましくは少なくとも 80%, なおより好ましくは少なくとも 90%または95% 相同性を有しているものを含むことが理解される。加えて、この用語は、とりわけ、結果として生じるポリペプチドおよび天然のRTP801の間で少しのアミノ酸の差を生じるだろう点突然変異, 置換, 欠失 および挿入などのRTP801 コード配列における軽微な変更から生じるポリペプチドを包含することが理解される。当該技術分野において周知(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), updated in 1995 and 1998)の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でRTP801 コード配列またはゲノム配列と結合する核酸配列でコード化されるポリペプチドは、この用語によって包含される。化学的に修飾されたRTP801または化学的に修飾されたRTP801の断片は、生物活性が保持される限り前記用語に含まれる。好ましくは、RTP801は、配列番号2によるアミノ酸配列を有する又は含む。本発明による核酸は、本発明の様々な態様に適用できる生物体の様々な組織の間および一つの種または異なる種の間の異なる生物体の間でアミノ酸配列に差があるだろうことが理解される。しかしながら、本願の明細書等に提供される技術的な教示に基づいて、それぞれの配列を任意の本発明による核酸を設計する場合に考慮できる。RTP801の特定の断片には、図 2に示される配列のアミノ酸 1〜50, 51〜100,101〜150, 151〜200 および 201〜232が含まれる。更なるRTP801の特定の断片には、図 2に示される配列のポジション25〜74, 75〜124, 125〜174, 175〜224 および 225〜232でのアミノ酸が含まれる。
本願の明細書等に使用されるRTP801は、特にWO 99/09046に記載されるタンパク質である。RTP801と称されるRTP801は、Shoshani T等(Shoshani et al., 2002, Mol Cell Biol, 22, 2283-93)によってHIF-1αの転写標的と記載された。さらに、Ellisen等(Ellisen et al., Mol Cell, 10, 995-1005)の研究によって、RTP801がp53-依存性DNAダメージ応答遺伝子および上皮分化にかかわるp63-依存性遺伝子として同定された。また、RTP801は、p53ファミリーメンバーp63の組織特異的パターンとよく似ており、TP 63と類似して又はTP 63に加えて効果的であり、インビトロ分化のインヒビターであり、活性酸素種の制御にかかわる。その問題と別に、RTP801は、低酸素症応答性転写制御因子 低酸素症誘導性因子1(HIF-1)に応答性であり、典型的には虚血性発作の動物モデルにおいてインビトロおよびインビボの両方で低酸素症の間にアップレギュレートされる。RTP801は活性酸素種 (ROS) および ROSレベルの制御に機能すると思われ、酸化ストレスに対してへの減少した双方の感受性は異所性発現RTP801に続いて両方増加する(Ellisen et al. 2002, supra; Soshani et al. 2002, supra)。好ましくは、RTP801は、好ましくは少なくとも一つの特性(好ましくは二または三以上および最も好ましくは各々および任意のこれらの特性)を呈する生物学的に活性なRTP801 タンパク質である。
理論に縛られることなく、ストレス誘導性のタンパク質(低酸素症, 酸化的ストレス, 温度ストレス, ERストレスに応答する)であるRTP801は、エネルギー不均衡への細胞応答の微細な調律に作用している因子である。このような状況から、細胞がストレス状態(例えば、正常な細胞の死を伴う疾患)からレスキューされるべきである又はRTP801 発現における変化によるストレス状態に適応する細胞(例えば、癌細胞)が殺傷されるべきである任意の疾患の治療に適切な標的である。後者のケースにおいて、RTP801は癌細胞の生存因子として認識され、そのインヒビターは単独療法として又は感作薬物(sensitising drugs)と化学療法または放射線治療との併用療法として癌を治療しえる。
「アミノ酸」の用語は、20の天然のアミノ酸の何れか一つ, 化学的に修飾されたアミノ酸(以下を参照されたい),または合成アミノ酸からなる分子を意味する。
「ポリペプチド」の用語は、二または三以上のアミノ酸残基から構成される分子を意味する。その用語には、ペプチド(peptides), ポリペプチド(polypeptides), タンパク質(proteins)およびペプチドミメティックス(peptidomimetics)が含まれる。
「ペプチドミメティック(peptidomimetic)」は、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣する能力のある非ペプチド性の構造エレメントを含んでいる化合物である。酵素的に切れやすいペプチド結合などの幾つかの古典的なペプチドの特性は、通常はペプチドミメティックに存在しない。
「ドミナントネガティブペプチド(dominant negative peptide)」は、タンパク質の一部をコード化するcDNA 断片によってコード化されるポリペプチドを意味する〔Herskowitz, Nature. 1987 Sep 17-23;329(6136):219-22. Review; Roninson et al., Cornelius P. Rhoads Memorial Award Lecture. Cancer Res. 1995 Sep 15;55(18):4023を参照されたい〕。このペプチドは、これが由来したタンパク質と異なる機能を有しえる。それは完全なタンパク質と相互作用でき、その活性を阻害できる又はそれは他のタンパク質と相互作用でき、完全長(親)タンパク質との応答において、その活性を阻害できる。ドミナントネガティブは、ペプチドが天然の親タンパク質に勝り、その活性を阻害して、細胞に死に対する抵抗性または感作(sensitization)または任意の所望の細胞の表現型などに異なる特性を与えることを意味する。治療上の介入に関して、ペプチド自身を、薬学的組成物の活性成分として送達しえる。或いは、cDNAを、既知の方法を利用することで細胞に送達できる。
ペプチドおよびポリペプチドの調製
ポリペプチドは、幾つかの方法を介して産生されえる、例えば:
1) 合成的:
合成のポリペプチドは、商業的に利用可能な機械を用いて, RTP801の既知の配列又はその一部を用いて作出できる。
2) 組換え法:
RTP801 ポリペプチド その断片を作出するための好適な方法は、RTP801 遺伝子のcDNAを含んでいるポリヌクレオチドを発現ベクターにクローン化し、コード化されたポリペプチドを発現させるために前記ベクターを保持している細胞を培養し、生じるポリペプチドを精製することであり、全ては当該技術分野において既知の方法〔例えば、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual." CSHL Press (1996). (加えて、Bibl Haematol. 1965;23:1165-74 Appl Microbiol. 1967 Jul;15(4):851-6; Can J Biochem. 1968 May;46(5):441-4; Biochemistry. 1968 Jul;7(7):2574-80; Arch Biochem Biophys. 1968 Sep 10;126(3):746-72; Biochem Biophys Res Commun. 1970 Feb 20;38(4):825-30も参照されたい)に記載された方法〕を用いて行われた。
発現ベクターは、異種性の物質の転写を制御するためのプロモーターを含むことができる、また選択的な転写を許容する構成的または誘導性のプロモーターであってもよい。必要な転写レベルを得るために必要とされるエンハンサーは、任意で含めることができる。また、発現ビヒクル(expression vehicle)は、選択遺伝子を含むことができる。
ベクターは、細胞または組織に種々の当該技術分野において既知の方法の何れかで導入できる。かかる方法は、一般に文献〔Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988) および Gilboa et al. (1986)〕の記載中に見つけることができる。
3) 天然の供給源からの精製:
RTP801 ポリペプチド,またはその天然の断片は、当業者に既知の多くの方法を用いて天然の供給源(例えば、組織)から精製できる。
タンパク質の精製は、Marshak等〔Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual." CSHL Press (1996)〕などに記載のように当該技術分野において知られているとおり行われる。
「RTP801の生物学的な効果(biological effect of RTP801)」または「RTP801の生物学的な活性(RTP801 biological activity)」は、直接的な又は間接的な障害におけるRTP801の効果を意味する。理論に縛られることなく、呼吸障害には、低酸素または過酸素の状態で誘導される肺胞細胞のアポトーシスにおけるRTP801の効果が含まれる。間接的な影響には、アポトーシスを生じるシグナル伝達カスケードにかかわる幾つかの分子の一つへのRTP801の結合又は該分子の一つに影響を有しているRTP801が含まれるが、これらに限定されない。
「アポトーシス」は、幾つかの細胞機構の活性化から生じる生理的なタイプの細胞死(即ち、細胞の機構で制御される死)を意味する。アポトーシスは、例えば、細胞死を導びく外部の誘発因子(例えば、サイトカインまたは抗-FAS抗体)による又は内部シグナルによる細胞機構の活性化の結果であってもよい。「プログラム細胞死(programmed cell death)」の用語は、「アポトーシス」と互換的(interchangeably)に使用されてもよい。
「アポトーシス関連疾患(Apoptosis-related disease)」は、病因が全体的または部分的にアポトーシスのプロセスに関連する疾患を意味する。前記疾患は、アポトーシスのプロセスの機能不全(例えば、癌または自己免疫疾患)またはアポトーシスのプロセスの過敏(例えば、特定の神経変性疾患において)で生じるものであってもよい。RTP801が関与する多くの疾患は、アポトーシス関連疾患である。例えば、アポトーシスは、光受容器および色素上皮の細胞〔主に網膜の中心(黄斑)領域〕の緩徐な萎縮が生じるドライAMDにおいて重要な機構である。また、神経網膜アポトーシスは、糖尿病性網膜症における重要な機構である。
「発現ベクター」は、外来細胞(foreign cell)において異種性のDNA断片を取込み、発現する能力を有するベクターを意味する。多くの原核生物性および真核生物性の発現ベクターが知られている及び/又は商業的に利用可能である。適切な発現ベクターの選択は、当該技術分野における当業者の知識の範囲内である。
抗RTP801抗体の調製
RTP801又はそれから由来する断片に結合する抗体は、免疫抗原として小さいポリペプチドを含んでいる無傷(intact)のポリペプチドまたは断片を用いて調製されてもよい。例えば、RTP801のNまたはC末端または任意の他の適切なドメインに特異的に結合する抗体を産生することが望ましいであろう。動物を免疫するために使用されるポリペプチドは、必要に応じて、翻訳されたcDNAまたは化学合成から由来するものであってもよく、担体タンパク質と抱合(conjugated)されてもよい。このようなポリペプチドに化学的に連結(coupled)される一般に使用される担体には、キーホールリンペットヘモシニアン (KLH), チログロブリン, ウシ血清アルブミン (BSA) および テタヌストキソイドが含まれる。連結されたポリペプチドは、動物を免疫するために使用される。
必要に応じて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、例えば、抗体を産生させたポリペプチドまたはペプチドが結合されたマトリックスに結合し、溶出されることによってさらに精製できる。当業者は、ポリクローナル同様にモノクローナル抗体の精製および/または濃度に関する免疫学で一般的な様々な技術を知っている(Coligan et al, Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994)。
断片を含む全てのタイプの抗体を作出するための方法は、当該技術分野において知られている〔例えば Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)を参照されたい〕。適切なアジュバントに免疫原を調製する全ての必要な工程, 抗体結合を決定すること, 抗体の単離, モノクローナル抗体を得るための方法, およびモノクローナル抗体のヒト化を含む免疫の方法は、全て当業者に知られている。
抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。抗体は、CDR移植〔EP239,400: PCT公開WO.91/09967; 米国特許第5,225,539;5,530,101; および 5,585,089, veneeringまたはresurfacing(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)〕, およびchain shuffling(米国特許第5,565,332)を含む当該技術分野において既知の種々の技術を用いてヒト化できる。
規定されるモノクローナル抗体には、一つの種から由来する抗体(例えば、マウス, ウサギ, ヤギ, ラット, ヒト, など)同様に二つ(またはそれ以上)の種から由来する抗体(例えば、キメラおよびヒト化の抗体)が含まれる。
完全なヒト抗体(Completely human antibodies)は、ヒト患者の治療に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から由来する抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を含む当該技術分野において既知の種々の方法で作出できる。米国特許第4,444,887 および 4,716,111; および PCT公開番号WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, および WO 91/10741も参照されたい(これらの文献の各々は、本明細書中にその全体が参照によって援用される)。
ヒト化抗体, ヒト抗体および抗体断片を含む全てのタイプの抗体に関する付加的な情報には、WO 01/05998(これは本明細書中にその全体が参照によって援用される)に見つけることができる。
中和抗体は、上記で議論された方法と、おそらく活性を中和するためのスクリーニングする付加的な工程とで調製できる(例えば、生存アッセイ)。
RTP801に対する抗体は、米国特許第 6740738号(これは本明細書中にその全体が参照によって援用される)に詳細に記載される。
「化学物質(chemical compound)」, 「小分子(small molecule)」, 「化学分子(chemical molecule)」 「小さい化学分子(small chemical molecule)」および「小さい化学物質(small chemical compound)」の用語は、本願の明細書等で互換的に使用されてもよく、合成的に産生されえる又は天然の供給源から得られえる任意の特定のタイプの化学的部分(chemical moieties)を意味し、通常 2000 ダルトン未満, 1000 ダルトン未満または更に600 ダルトン未満の分子量を有すると理解される。
また、本発明は、二本鎖の構造を含んでいる機能的な核酸, 医薬の製造のためのその使用, 係る機能的な核酸を含んでいる薬学的組成物および患者の治療のための方法に関する。
低酸素症は、かなり多数の疾患(例えば、発作, 気腫および利用可能な酸素が最適値未満であることと関連する梗塞および低酸素症状態に対する組織ダメージ反応)の病理学的機序において鍵となる要素と認識されている。成長が速い組織(腫瘍を含む)において、酸素が最適値未満であることは、望まれない新生血管形成で補われる。従って、少なくとも癌疾患の場合において、脈管構造の成長は望まれない。
このような観点において、血管形成および脈管成長の阻害は、それぞれ熱心に研究される対象である。今日、既に幾つかの化合物では、望まれない血管形成および脈管性成長を阻害するものが利用可能である。幾つかの重要な化合物は、VEGFおよびVEGFレセプターを阻害するものである。双方のケースにおいて、VEGFの影響は、ジェネンテックのアバスチン(登録商標)(VEGFに特異的なモノクローン性のAB) (Ferrara N.; Endocr Rev. 2004 Aug;25(4):581-611)などのVEGFに対する抗体などを用いてVEGF自体をブロックすること,または対応するレセプター(即ち、VEGFレセプター)(Traxler P; Cancer Res.2004 Jul 15;64(14):4931-41;またはStadler WM et al., Clin Cancer Res. 2004 May 15;10(10):3365-70)をブロックすることの何れかで避けられる。
しかしながら、血管形成および脈管構造の成長は動物およびヒトにおける非常に基礎的で重要なプロセスであるので、この種類の化合物の効果は血管形成および脈管性成長が実際に望まれない特定の部位に集中されなければならず、このことにからこの種類の治療アプローチとの関連において適切な標的化または重要な事物の送達がなされる。
それぞれ脈管構造および血管形成の望まれない成長が関与している疾患の治療のための更なる手段を提供することが本発明の課題である。
本発明の付加的な側面によって、本願の明細書等で言及される任意の疾患および状態を治療するため上記の構造(A)の化合物を含んでいる薬学的組成物が提供される。
さらに、本側面は、本願の明細書等に記載した任意の疾患および状態の治療のための二または三以上の上記の構造(A)の化合物を含んでいる薬学的組成物を提供し、前記二つの化合物は同等(equal)の又は別の有益な活性を産生する量で薬学的組成物中に共に物理的に混合されてもよい,または共有結合性または非共有結合性に結合されてもよい,または2〜100, 好ましくは 2〜50または2〜30 ヌクレオチドの範囲の長さの核酸リンカーで共に結合されてもよい。従って、係るsiRNA分子は本願の明細書等に記載される二本鎖の核酸構造から構成され、表 Aから及び好ましくはID番号102, 103および106から選択される二つのsiRNA配列は共有結合性に若しくは非共有結合性に結合される又はリンカーで結合されてタンデム型のsiRNA分子を形成する。さらに、表 AのsiRNAsは、本発明の権利者のWO 06/023544A2またはPCT/US2007/01468(参照によってその全体が本明細書中に援用される)に開示された任意のsiRNAの任意のアンチセンス鎖に共有結合性に若しくは非共有結合性に結合されてもよい。係る二つのsiRNA配列を含んでいるタンデム型のsiRNA分子は、典型的には38〜150ヌクレオチドの長さ, より好ましくは 38または40〜60 ヌクレオチドの長さ, 及びそれ以上(従って、二を超えるsiRNA 配列がタンデム型の分子に含められる場合)の長さであろう。内部の細胞プロセシングを介して産生されるsiRNAをコード化する二または三以上の長い配列から構成される長いタンデム型の分子(例えば、長いdsRNAs)も、二または三以上のshRNAsをコード化しているタンデム型の分子であるとして予見(envisaged)される。係るタンデム型の分子も、本発明の一部であると考えられ、それらに関連している更なる情報が以下に記載される。
前記の組み合わせ又はタンデム型構造は、毒性および/または各々のsiRNAの標的をはずした影響(off-target effects)が最小化され、他方で有効性が増加するとの利点を有する。
本願の明細書等に開示される本発明による核酸のうち、内部参照番号102, 103 および106 (表 Aを参照されたい)を有するものが特に好適である。それと関連して、ヒトおよび動物モデル(例えば、ラットおよび/またはマウス)の両方で使用できる本発明による核酸が特に有用であることに注意すべきである。これらの特定の本発明による核酸の驚くべき利点は、それらがヒトおよび動物モデルの両方で効果的であるとの事実にあり、動物モデルにおいて得られた検査結果が直ちに動物モデルからヒトに移されること、特に本発明による核酸が、例えば、(a)種(特に、動物モデル試験に使用される種および最終的に好適な生物体としての人間または患者)の間で異なる配列を含むよう設計された場合において、別途必要となるだろうヒト配列への何らかの変更をなす必要がないことを意味する。さらに、これらの核酸が例にも記載される修飾パターンを有することが好適である。
しかしながら、配列番号3〜70による配列の何れもさらなる本発明の核酸にほんの一部として含まれることも本発明の範囲内である。好ましくは、さらなる本発明による核酸は、配列番号3〜70の少なくとも 14の連続するヌクレオチド(より好ましくは、前述の表に要約される第一のストレッチおよび第二のストレッチから構成される二本鎖構造の任意の端で14の連続するヌクレオチド塩基対)を具備する。所与の潜在的な長さの本発明による核酸(特に、このような本発明による核酸を形成している個々のストレッチ)を仮定すると、各側に対してRTP801のコード配列と相対的に幾つかのシフトが可能であり、係るシフトが両方の方向性で1, 2, 3, 4, 5 および 6 ヌクレオチドまで可能であり、生成された二本鎖の核酸分子は本発明の範囲内であることが当業者に理解される。
RTP801に関するsiRNAは、RTP801の既知の配列(配列番号1)に基づいて上記の当該技術分野において既知の方法を用いて作出でき、上記の様々な修飾で安定としえる。更なる情報に関して、例3を参照されたい。
さらに、本願の明細書等に記載される本発明の方法に関連して、付加的なRNA分子を前記方法とともに使用してもよい。例えば、本発明の阻害性のRNA分子は、好ましくは表 Aに詳細に記載される配列に存在する少なくとも 7〜10の連続的なヌクレオチドのストレッチを含んでいる一本鎖オリゴリボヌクレオチドを含み、該オリゴリボヌクレオチドは二本鎖領域、特に細胞内複合体によって認識されるコンホメーションを形成する[および/または含む]能力があり、該オリゴリボヌクレオチドのそれらの対応する内因性遺伝子, および係るRNA分子をコード化しているDNA分子の阻害を発揮する能力のある小さなRNA分子へのデグラデーションが導かれる。対応する内因性遺伝子(endogenous gene)は好ましくは801遺伝子であり、さらにVEGF遺伝子および/またはVEGF-R1遺伝子であってもよい。また、本発明は、担体(好ましくは、薬学的に許容される担体)において上記の一本鎖オリゴリボヌクレオチドを含んでいる組成物を提供する。
さらに、本発明は、全ての本願の明細書等に開示される状態(特に、脈絡叢の新生血管形成が関与する状態)のための併用療法を提供する。前記併用療法において、RTP801 および VEGFR遺伝子の両方は、治療される疾患の症候を寛解させるために阻害される。これらの遺伝子は、一または二以上のsiRNAsまたは抗体またはアプタマーの組み合わせで阻害されえる。従って、本発明は、RTP801 インヒビターおよびVEGFまたはVEGFR-1 インヒビター, RTP801 インヒビター、好ましくはsiRNA, より好ましくは表 Aに詳細に記載されるsiRNA 分子および特に, siRNA Nos: 102, 103および106,およびVEGF/ VEGFR-1 インヒビター、任意で抗体またはアプタマーを含んでいる新規薬学的組成物を提供する。医薬の調製における前記化合物の組み合わせの使用(即ち、RTP801 siRNA および VEGF 抗体または本願の明細書等に開示される任意の他の組み合わせの例)も、本発明の一部である。
従って、RTP801 siRNA(例えば、表 Aに詳細に記載されるsiRNA分子および特にsiRNA番号102, 103および106)は、VEGFまたはVEGF レセプター 1 (VEGFR1)を標的とする薬剤と併せて投与されてもよい。現在、係る薬剤は、市場に存在しているか又は様々な承認段階にあり、異なる機構で作用する。抗体 および 抗体断片〔例えば、ranibizumab (Lucentis, Genentech)〕は、放出されたVEGFに付着し、VEGFと活性型レセプターとの結合を阻害する。リガンド/抗体 (Macugen, Eyetech/Pfizer, 最近ウェットAMDに関してFDAが認可した)のように作用しえるアプタマーも可能である。Macugenは、細胞外のVEGFに結合してその活性をブロックする。これらの薬物は、硝子体内注射(intravitreal injection)で局所的に投与される。抗-VEGF siRNAベースの化合物(例えば、VEGFのAcuity's Cand5インヒビターまたはVEGFR-1のSIRNA's 027 インヒビター)も、利用可能である。さらに、全身性に投与される小分子アミノステロールのSqualamine(Genaera)は、内皮細胞におけるVEGF および 他の成長因子シグナル伝達の阻害を含む、血管新生プロセスの複数の様相に干渉すると報告されている。
RTP801 インヒビター(好ましくは、siRNA)の結合投与および任意の上記VEGF / VEGFR-1阻害剤は相乗効果を有し、前記組み合わせ治療は、単独治療の選択肢における用量と無関係に、これらの個々の組成物のいずれかで治療するよりも効果的である。
RTP801iは、異なる作用機序を有しており、VEGF-VEGFR インヒビターと潜在的に相乗的である。RTP801のKO マウスの研究は、眼におけるVEGF mRNAの発現がWT マウスと同じ高さであるとの事実にもかかわらず、KO マウスにおける保護表現型(protective phenotype)が持続することを指摘している。我々の付加的な予備データは、RTP801の阻害が網膜の病状の治療におけるVEGF-VEGFR 調節軸(VEGF-VEGFR regulatory axis)の阻害と相乗的であってもよいことを指摘している。本発明の発明者は、適切な実験において次の事項を見出した。その事項とは、AMDのモデルにおいてRTP801に対するsiRNAの投与(以下の例 2を参照されたい)が、RTP801自身のダウンレギュレートのみならず、結果として、抗血管新生および神経保護因子PEDFのアップレギュレーションを同様にMCP1(マクロファージ化学誘引物質 タンパク質)の発現のダウンレギュレートをも誘導することである。従って、RTP801の阻害によって、同時に抗血管新生, 神経保護および抗炎症性の効果が与えられる。
本願の明細書等に開示されるとおり、アプタマーは、本発明において本願の明細書等に開示される新規siRNAsと組み合わせて使用しえる。例えば、アプタマーを、本願の明細書等に開示されるsiRNAsの何れか一つと、本願の明細書等に開示される状態の何れか一つの治療のための併用療法に使用できる。係る併用療法に使用する新規の薬学的組成物(これも本発明の一部である)は、アプタマーに共有結合性または非共有結合性に付着した本発明のsiRNAを含んでいてもよい。アプタマーは、標的タンパク質に結合するRNAまたはDNAの単一鎖または二本鎖のオリゴ核酸であり、一般に非特異的な効果を示さない。アプタマーは、本願の明細書等に開示される及び/又は当該技術分野における当業者に知られている任意の核酸修飾に基づき安定性または他の所望の質に関して修飾できる。アプタマーへの修飾を、分子のどこにでも(例えば、5'または3' 末端,または任意の内部に規定された修飾部位)導入できる。例えば、RNA アプタマーは、2'-フルオロまたは2'-アミノ修飾されたピリミジンで安定化できる。アプタマーは、必要に応じて、レポーター分子またはリンカー化学物質に連結できる、またビーズまたは他の固体の支持体に付着できる(例えば、5'または3'アミノ, チオールエステルまたはビオチン基)。チオアプタマーは、特定のヌクレオシド間ホスホリル部位にイオウ修飾を含むアプタマーであり、安定性, ヌクレアーゼ抵抗性, 標的親和性および/または選択性が増強する。チオアプタマーの例には、ホスホロモノチオエート(S-ODN)およびホスホロジチオエート (S2-ODN) オリゴデオキシ チオアプタマーが含まれる。アプタマーおよびチオアプタマーの更なる情報に関して、米国特許第5,218,088 および 6,423,493号を参照されたい。
本発明において、本願の明細書等に開示される任意のsiRNA分子,または内因性の細胞複合体(例えば、DICER - 上記を参照されたい)でプロセスされて本願の明細書等に開示されるsiRNAを形成する任意の長い二本鎖のRNA分子(典型的には、25〜500 ヌクレオチドの長さ),または本願の明細書等に開示されるsiRNA分子を具備する分子は、本願の明細書等に開示される疾患または障害の治療に使用できることが理解される。
本発明の分子および組成物で治療できる付加的な障害には、全てのタイプの脈絡叢の新生血管形成(CNV)を含み、これはウェットAMDのみならず、眼球のヒストプラスマ症候群, 網膜色素線条(angiod streaks), Bruch's膜の破裂, 近視性変性, 眼球の腫瘍および幾つかの網膜変性疾患などの他の眼科の病理にも生じる。
本発明の付加的な側面は、アポトーシス関連疾患を治療する方法を提供する。非制御的で病的な細胞成長と関連する疾患または障害(例えば、癌, 乾癬, 自己免疫疾患)の治療のための方法, とりわけ, 虚血および適切な血流の欠乏と関連する疾患〔例えば、心筋梗塞 (MI) および 発作〕を治療するための方法が提供される。「癌」または「腫瘍」は、異常な細胞の非制御性に成長する塊を意味する。これらの用語には、良性または悪性の原発性腫瘍と同様に体の他の部位に伝播する二次性腫瘍,または転移の両方が含まれる。癌型の疾患の例は、とりわけ、癌腫(例えば、: 乳房, 結腸および肺), 白血病、例えば、B細胞白血病, リンパ腫、例えば、B-細胞リンパ腫, 芽細胞腫、例えば、神経芽細胞腫およびメラノーマである。
また、本発明は、担体(好ましくは、薬学的に許容される担体)において一または二以上の本発明の化合物を含んでいる組成物を提供する。この組成物は、異なる遺伝子に関して二または三以上のsiRNAsまたは同じ遺伝子に関して異なるsiRNAsの混合物を含んでいてもよい。RTP801 遺伝子に関するsiRNAおよびVEGF 遺伝子 および/または VEGF-R1 遺伝子に関するsiRNAを含んでいる組成物が予見される。
別の本発明の化合物は、一または二以上の本発明の化合物(構造 A)に共有結合性または非共有結合性に結合する上記の本発明の化合物 (構造 A)を含む。この化合物は、担体(好ましくは、薬学的に許容される担体)において送達されてもよく、細胞内で内因性の細胞複合体でプロセスされ、一または二以上の本発明のsiRNAsを産生されてもよい。別の本発明の化合物は、別の遺伝子(特に、VEGF遺伝子 および/または VEGF-R1 遺伝子)に対するsiRNAに共有結合性または非共有結合性に結合する上記の本発明の化合物 (構造 A)を含む。
また、本発明は新規の化学物質(chemical entity)を含み、これは上記のVEGF / VEGFR-1阻害剤の何れかに共有結合性にまたは非共有結合性に化学的に結合するRTP801インヒビター(好ましくは、siRNA)である。予見される特定の化学物質は、VEGFまたはVEGF レセプター-1に対する抗体に共有結合性に結合するsiRNA RTP801 インヒビターである。予見される付加的な化学物質は、本願の明細書等に開示されるRTP801 siRNAに共有結合性に結合したVEGF レセプター1を標的とする修飾または無修飾のDNAアプタマーである。理論に縛られることなく、係る薬学的組成物のアプタマー部分は、VEGFレセプター1に結合するだろう、そして細胞にインターナライズし、そこで分子のsiRNA 部分が細胞におけるRTP801 発現を阻害するだろう。従って、係る医薬は、選択性の増加およびターゲティングの利点、同様に、本願の明細書等に開示される併用療法の付加的な利点を有するだろう。係る新規の化学物質の製造方法は、当業者に知られている。
また、本発明はタンデム型の二本鎖構造を含み、これは二または三以上のsiRNA 配列を含み、これは細胞内でプロセスされて二または三以上の異なるsiRNAsを形成し、第一のものは801を阻害し、第二のものはVEGF / VEGFR-1を阻害する。別の側面において、本発明はタンデム型の二本鎖構造を含み、これは二または三以上のsiRNA 配列を含み、これは細胞内でデグラデーションされて二または三以上の異なるsiRNAsを形成し、双方が801を阻害する。
特に、一または二以上のステムおよびループ構造(ここで、ステム領域は、本発明のオリゴヌクレオチドの配列を含む)を含んでいる長いオリゴヌクレオチド(典型的には、約80〜500 ヌクレオチドの長さ)は担体(好ましくは、薬学的に許容される担体)において送達されてもよいこと、細胞内で内因性の細胞複合体(例えば、上記のDROSHAおよびDICER)でプロセスされて本発明のオリゴヌクレオチドである一または二以上の小さい二本鎖オリゴヌクレオチド(siRNAs)が産生されてもよいことが予見される。このオリゴヌクレオチドは、タンデム型のshRNA構築物と称してもよい。この長いオリゴヌクレオチドは、各々のステム領域が801遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスsiRNA配列を含む一または二以上の ステムおよびループ構造を含んでいる一本鎖オリゴヌクレオチドであることが予見される。特に、このオリゴヌクレオチドが表 Aに示されるセンス および アンチセンス siRNA配列を含むことが予見される。代わりに、タンデム型のshRNA 構築物は、801 遺伝子のセンスおよび対応する アンチセンス siRNA 配列並びに追加的に異なる遺伝子(例えば、VEGFまたはVEGF-R1)のセンスおよび対応する アンチセンス siRNA 配列を含んでいてもよい。
本願の明細書等に記載されたとおり、RTP801に対するsiRNA分子は、薬学的組成物における主な活性成分であってもよく、または二または三以上のsiRNAs(または二または三以上のsiRNAsをコード化する又は内因性に産生する分子、その分子の混合物または二または三以上のsiRNAsをコード化する一または二以上のタンデム型の分子)を含んでいる薬学的組成物の一つの活性成分であってもよく、前記薬学的組成物はさらに一または二以上の付加的な遺伝子を標的とする一または二以上の付加的なsiRNA分子から構成されている。RTP801および前記付加的な遺伝子の同時の阻害は、以下の記載による本願の明細書等に開示された疾患の治療のための相加または相乗効果を有するだろう:
急性腎不全 (ARF)および他の微小血管障害, 同様に聴覚障害および褥瘡: ARFの治療のための薬学的組成物は、次の化合物の組み合わせから構成されてもよい:
1) RTP801 siRNAおよびp53 siRNAダイマー;
2) RTP801およびFas siRNA ダイマー;
3) RTP801およびBax siRNA ダイマー;
4) RTP801およびFas siRNA ダイマー;
5) RTP801およびBax siRNA ダイマー;
6) RTP801およびNoxa siRNA ダイマー;
7) RTP801およびPuma siRNA ダイマー;
8) RTP801 (REDD1)およびRTP801L (REDD2) siRNA ダイマー;
9) RTP801siRNA, Fas siRNAおよび任意のRTP801L siRNA p53 siRNA, Bax siRNA, Noxa siRNAまたはPuma siRNAでトリマーまたはポリマー(即ち、三または四以上のsiRNAsをコード化するタンデム型の分子)。
さらに、ARF, 聴覚 障害, 褥瘡および本願の明細書等に開示される任意の他の 疾患または状態の組み合わせ療法のための付加的な薬学的組成物は二つのsiRNAsを含んでもよく、ここで第一のsiRNAがRTP801 siRNA(好ましくは、表 Aから選択される)であり、第二のsiRNA(第一のsiRNAと共有結合性にまたは非共有結合性に結合または第一のsiRNAと混合できる)が以下の群から選択される遺伝子を標的とするsiRNAである:
腫瘍タンパク質 p53 結合タンパク質, 2 (TP53BP2);
ロイシン-リッチリピートおよびデスドメイン含有(LRDD);
チトクロム b-245, アルファポリペプチド (CYBA);
活性化転写制御因子 3 (ATF3);
カスパーゼ 2, アポトーシス関連システイン ペプチダーゼ (neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 2) (CASP2);
NADPH 酸化酵素 3 (NOX3);
harakiri, BCL2 相互作用タンパク質 (HRK);
補体コンポーネント 1, q 小成分結合タンパク質 (C1QBP);
BCL2/アデノウイルス E1B 19kDa 相互作用タンパク質 3 (BNIP3);
マイトジェン活性化タンパク質 キナーゼ8 (MAPK8);
マイトジェン活性化タンパク質 キナーゼ14 (MAPK14);
ras-関連C3 ボツリヌス毒素 基質 1 (rho ファミリー, 低分子量GTP結合タンパク結合タンパク質 Rac1);
グリコーゲンシンターゼ キナーゼ3 ベータ (GSK3B);
プリン受容体 P2X, リガンド-ゲート イオンチャネル, 7 (P2RX7);
一過性レセプター 推定上のカチオン チャンネル, サブファミリー M, メンバー2 (TRPM2); ポリ (ADP-リボース) グリコヒドロラーゼ(PARG);
CD38 分子(CD38); STEAP ファミリーメンバー 4 (STEAP4);
骨形成 タンパク質2 - BMP2;
ギャップジャンクション タンパク質, アルファ1, 43kDa (コネキシン43) (GJA1);
TYRO タンパク質 チロシンキナーゼ結合タンパク質(TYROBP);
結合組織成長因子 (CTGF);
分泌型リン酸化タンパク質 1 (オステオポンチン, 骨シアロタンパク質 I, early T-lymphocyte activation 1) (SPP1);
reticulon 4 レセプター (RTN4R);
アネキシンA2 (ANXA2); ras ホモログ 遺伝子 ファミリー, メンバーA (RHOA);および
デュアルオキシダーゼ 1 (DUOX1)。
黄斑変性症 (MD), 糖尿病性網膜症 (DR), 脊髄損傷: MD, DR および脊髄損傷の治療のための薬学的組成物は、次の化合物の組み合わせから構成されてもよい:
1) RTP801 siRNAとVEGF siRNA, VEGF-R1 siRNA, VEGF R2 siRNA, PKCbeta siRNA, MCP1 siRNA, eNOS siRNA, KLF2 siRNA, RTP801L siRNA のいずれかの組み合わせ(物理的な混合またはタンデム型の分子内のいずれか);
2) RTP801 siRNAと上記 リストの二または三以上のsiRNAsの組み合わせ(物理的な混合または三つのsiRNAsをコード化しているタンデム型の分子内,又はその組み合わせ)。
COPD および 呼吸障害: 呼吸障害の治療のための薬学的組成物は、次の化合物の組み合わせから構成されてもよい: RTP801 siRNAとエラスターゼ, マトリックス メタロプロテアーゼ, ホスホリパーゼ, カスパーゼ, スフィンゴミエリナーゼ, および セラミド シンターゼの遺伝子のうちの一または二以上に対するsiRNAの組み合わせ。
さらに、RTP801 siRNAまたはRTP801 siRNAを含んでいる又はコード化している任意の核酸分子は、以下にしたがって本願の明細書等に開示された疾患の治療のターゲティングの増強を達成するために、抗体またはアプタマーに(共有結合性にまたは非-共有結合性に)連結できる:
ARF: 抗-Fas 抗体(好ましくは、中和抗体)。
黄斑変性症, 糖尿病性網膜症, 脊髄損傷: 抗-Fas 抗体またはアプタマー, 抗-MCP1抗体またはアプタマー, 抗-VEGFR1 および 抗-VEGFR2 抗体またはアプタマー。前記抗体は、好ましくは中和抗体であるべきである。
係る組み合わせ療法に使用できるRTP801 および siRNA 配列との組み合わせにおいて標的とされる遺伝子における更なる情報に関して、本発明の権利者のPCT公開番号WO06/023544 および WO07/084684 および PCT出願番号PCT/IL 2007/001278(これらは参照によってその全体が本明細書中に援用される)を参照されたい。
本願の明細書等に開示されるsiRNA配列を含むアンチセンスDNA分子などの任意の分子(適切な核酸修飾を有する)は、特に望ましく、本願の明細書等に開示される全ての使用および方法に関して対応するsiRNAsと同じ能力(same capacity)で使用されてもよい。
また、本発明は、障害(例えば、本願の明細書等に開示される障害)を患っている患者を治療する方法であって、前記患者に上記組成物または化合物を前記患者を治療するための治療上効果的な量で投与することを含んでいる方法を含む。
加えて、ポリヌクレオチドのアナログを調製でき、アナログは前記ヌクレオチドの構造が基本的に変更され、治療または実験の試薬としてより良く適合される。ヌクレオチドアナログの例は、DNA(またはRNA)におけるデオキシリボース(またはリボース)リン酸バックボーンがペプチドに見つけられるものと類似するポリアミドバックボーンで置換されるペプチド核酸(PNA)である。PNAアナログは、酵素によるデグラデーションに耐性であり、インビボおよびインビトロでの寿命が延長することが示された。さらに、PNAsは、DNA分子より相補DNA配列に強く結合することが示された。この観察は、PNA鎖 および DNA鎖の間の電荷反発(charge repulsion)の欠乏に起因する。オリゴヌクレオチドになしえる他の修飾には、ポリマーバックボーン(polymer backbones), 環状バックボーン(cyclic backbones),または非環式バックボーン(acyclic backbones)が含まれる。
本発明に使用するポリペプチドは、治療上の活性を改善するために修飾(任意で、化学的に修飾される)されてもよい。ポリペプチドを意味する場合、「化学的に修飾された」は、少なくとも一つのそのアミノ酸残基が天然のプロセス(例えば、プロセシングまたは他の翻訳後修飾)で又は当該技術分野において周知の化学修飾技術で修飾されたポリペプチドを意味する。多数の既知の修飾のなかで、典型的であるが独占的ではない例には、アセチル化, アシル化, アミド化, ADP-リボシル化, グリコシル化, GPIアンカー形成, 脂質または脂質誘導体の共有結合性の付着, メチル化, ミリストイル化, ペジレーション(pegylation), プレニル化, リン酸化, ユビキチン化,または任意の類似プロセスが含まれる。
さらなる可能なポリペプチド修飾(例えば、核酸配列の変化から生じる)には、以下に記載のものが含まれる:
「保存性の置換(Conservative substitution)」は、一つのクラスにおけるアミノ酸を同じクラスのアミノ酸で置換することを意味する。該クラスは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の特性および天然で見つけられる相同的なポリペプチドにおける高い置換頻度で規定される(例えば、標準のDayhoff頻度交換マトリックスまたはBLOSUMマトリックスで決定される)。アミノ酸側鎖の六つの一般的なクラスが分類されており、これにはクラスI (Cys); クラスII (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); クラスIII (Asn, Asp, Gln, Glu); クラスIV (His, Arg, Lys); クラスV (Ile, Leu, Val, Met); およびクラスVI (Phe, Tyr, Trp)が含まれる。例えば、Aspの別のクラス III 残基(例えば、Asn, Gln,またはGlu)への置換は、保存性の置換である。
「非保存性の置換(Non-conservative substitution)」は、一つのクラスのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸で置換することを意味する〔例えば、Ala(クラスII残基)のクラスIII残基(例えば、Asp, Asn, Glu,またはGln)での置換〕。
「欠失(Deletion)」は、それぞれ一または二以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が非存在となるヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化である。
「挿入(Insertion)」または「付加(addition)」は、それぞれ天然の配列と比べて一または二以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加を生じるヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化である。
「置換(Substitution)」は、それぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸での一または二以上の ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換である。アミノ酸配列に関して、置換は保存性または非保存性であってもよい。
本発明の付加的な態様において、RTP801 ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、被験者における黄斑変性症を診断または検出するために使用してもよい。検出法は、典型的に被験者から由来するサンプルにおけるRTP801 mRNAまたはRTP801 ポリペプチドをアッセイすることを具備する。
「検出(Detection)」は、疾患の検出の方法を意味する。この用語は、疾患の素因(predisposition)の検出または疾患の重症度の検出を意味しえる。
本発明に「ホモログ(homolog)/相同性(homology)」は、少なくとも 約70%, 好ましくは 少なくとも 約75% 相同性, 有利には 少なくとも 約80% 相同性, より有利には 少なくとも 約90% 相同性, さらに より有利には 少なくとも 約95%, 例えば, 少なくとも 約97%, 約98%, 約99%またはさらに約100% 相同性を意味する。また、本発明は、これらのポリヌクレオチド および ポリペプチドが本願の明細書等と同じ様式で又は上述のポリヌクレオチド および ポリペプチドに使用できることも包含する。
代わりに又はさらに、配列に関して「相同性」は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のポジションの数を二つの配列のより短いものにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数で除した数を意味し、二つの配列のアラインメントはWilburおよびLipmanのアルゴリズム〔Wilbur and Lipman algorithm ((1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726)〕と一致して決定できる; 一例を挙げると、20 ヌクレオチドのウィンドウサイズ, 4 ヌクレオチドのワード長, および4のギャップペナルティーを用いて, 配列データのコンピュータ補助的な分析 および 解釈(アラインメントを含む)を商業的に利用可能なプログラム (例えば、Intelligenetics (TM) Suite, Intelligenetics Inc., CA)を用いて都合良く行うことができる。RNA配列が類似する,またはDNA配列にある程度の配列同一性または相同性を有すると言われる場合、DNA配列におけるチミジン (T)は、RNA配列におけるウラシル (U)と等しいと考えられる。本発明の範囲内のRNA 配列は、DNA 配列におけるチミジン (T)をウラシル (U)で置換することによってDNA配列又はその相補配列から由来できる。
さらに又は代わりに、アミノ酸配列の類似度または相同性を、決定できる〔一例を挙げると,BlastPプログラム (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402) および NCBIで利用可能なものを用いて〕。次の文献によって、二つのポリペプチドのアミノ酸残基の相対的な同一性または相同性を比較するためのアルゴリズムが提供され、さらに又は代わりに、上述の記載に関連して、これらの文献における教示は、パーセント相同性を決定するために使用できる〔Smith et al., (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489; Smith et al., (1983) Nucl. Acids Res. 11:2205-2220; Devereux et al., (1984) Nucl. Acids Res. 12:387-395; Feng et al., (1987) J. Molec. Evol. 25:351-360; Higgins et al., (1989) CABIOS 5:151-153; および Thompson et al., (1994) Nucl. Acids Res. 22:4673-4680〕。
二つのアミノ酸またはヌクレオチド配列に関して「少なくともX%ホモロジーを有している(Having at least X% homolgy)」は、配列が最適に整列されたときに二つの配列において同一である残基のパーセンテージを意味する。従って、90%のアミノ酸配列同一性は、二または三以上の至適に整列されたポリペプチド配列におけるアミノ酸の90%が同一であることを意味する。
本発明の付加的な態様は、活性成分として治療上効果的な量のRTP801 インヒビターおよび薬学的に許容される担体を含んでいる薬学的組成物に関する。前記インヒビターは、生物学的なインヒビター, 有機分子, 化学分子, などであってもよい。前記該薬学的組成物は、図 1に記載される配列(配列番号 1)に対するアンチセンス配列である配列を有している連続的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであるRTP801 インヒビターを含んでいてもよい。さらに、RTP801 インヒビターは、これらのポリヌクレオチドを含んでいるベクターであってもよい。さらに、RTP801 インヒビターは、図 2に記載される4〜25アミノ酸(配列番号2)を含んでいるエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体,またはsiRNA 分子(任意で、表 Aに示されるもの及び特にsiRNA Nos: 102, 103および106)またはリボザイムなどのRTP801 遺伝子 mRNAを標的とするRNA分子であってもよい。
薬学的組成物の活性成分には、本発明の実施に必要とされるヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチド又は適切な配列を標的として同じ効果を有することが示されたその断片および/またはリボザイムを含むことができる。本発明に開示される活性成分の組み合わせを使用できる(アンチセンス配列の組み合わせが含まれる)。
本発明の付加的な態様において、脊髄の傷害または疾患を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製のための治療的に効果的な用量のRTP801インヒビターの使用を提供する。一態様において、前記インヒビターは、好ましくはsiRNAである。別の態様において、前記インヒビターは、好ましくは本願の明細書等に示される構造 Aである。
本発明は、説明の様式で記載されており、使用される用語が制限ではなく記載の用語の性質(nature)にあることを意図している。
明らかに、本発明の多くの修飾および変形が、上記の教示に照らして可能である。従って、本願に添付される特許請求の範囲の範囲内で、具体的に記載された以外でも本発明を実施し得る。
本出願の全体において、様々な文献(米国特許を含む)が著者名および出版年および特許番号により参照される。これら文献および特許および特許出願の開示の全体は、当該発明が属する技術の状況をより完全に記載するために、本明細書に参照されて本出願に援用される。
本明細書への任意の文書の引用は、係る文書が関連する従来技術である,または本出願の任意の請求項の特許性に重要であると考えられるとの承認を意図していない。任意の文書の内容または日付に関する任意の陳述は、提出日に出願人に利用可能な情報に基づいており、係る陳述の正確性に関する承認を構成しない。
図 1は、RTP801 遺伝子のコード配列(配列番号1)の詳細を示す; 図 2は、RTP801 ポリペプチドのアミノ酸配列(配列番号2)の詳細を示す。
[例]
さらなる説明がなくても、前述の記載を使用して当業者が最も完全な範囲まで本発明を利用できると考えられる。以下の好適な特定の態様は、単に説明であると解釈され、本発明を限定するものではない。
本願の明細書等に具体的に記載されない当該技術分野において既知の標準の分子生物学プロトコールは、広く調査され、基本的には文献〔Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New-York (1989, 1992), および Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988)〕からえられる。
本願の明細書等に具体的に記載されない当該技術分野において既知の標準の有機物合成プロトコールは、広く調査され、基本的には〔Organic syntheses: Vol.1- 79, editors vary, J. Wiley, New York, (1941 - 2003); Gewert et al., Organic synthesis workbook, Wiley-VCH, Weinheim (2000); Smith & March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience; 5th edition (2001)〕からえられる。
本願の明細書等に具体的に記載されない当該技術分野において既知の標準の医薬品化学の方法は、広く調査され、基本的には様々な著者および編集者によるPergamon Pressによって出版されたシリーズ「Comprehensive Medicinal Chemistry」からえられる。
明細書, 特許請求の範囲および/または図面に開示された本発明の特徴は、別々及びその任意の組み合わせの両方ともが、本発明のその多様な形態に具現化するための材料であるだろう。
例1
一般的な材料および方法
細胞培養
第一の細胞株〔即ち、HeLa細胞 (American Type Culture Collection)〕を、以下に記載のとおり培養した〔HeLa細胞をCzauderna F等〔Czauderna F et al. (Czauderna, F., Fechtner, M., Aygun, H., Arnold, W., Klippel, A., Giese, K. & Kaufmann, J. (2003). Nucleic Acids Res, 31, 670-82)に記載のとおり培養した〕。
第二の細胞株はヒトケラチノサイト細胞株であり、この細胞は次のとおり培養された:即ち、ヒトケラチノサイトを、10% FCSを含んでいるダルベッコの修正イーグルメディウム(DMEM)で37℃で培養した。
マウス細胞株は、B16V (American Type Culture Collection)であり、10% FCSを含んでいるダルベッコの修正イーグルメディウム(DMEM)で37℃で培養した。培養条件は、文献〔Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1997 May; 19(4):231-9〕に記載されたとおりであった。
各ケースにおいて、細胞を、本願の明細書等に記載の実験に供試し、約 50,000細胞/ウェルの密度で、本発明による二本鎖核酸を20 nMで添加し、前記二本鎖核酸を1 μg/mlの脂質(proprietary lipid)で複合化(complexed)した。
低酸素症様状態の誘導
細胞を、低酸素症様状態を誘導するためにCoCl2で次のとおり処理した:即ち、siRNA トランスフェクションを10-cm プレート (30〜50% コンフルエント)でCzauderna等〔Czauderna et al., 2003; Kretschmer et al., 2003〕に記載のとおり行なった。要約すると、siRNAを、完全培地中の細胞に無血清培地にGB および 脂質の事前に形成された10x 濃縮された複合体を添加してトランスフェクションした。全体のトランスフェクション 容量は、10 mlであった。特に明記しない限り、最終的な脂質濃度は1.0 μg/mlであり; 最終的な siRNA 濃度は20 nMである。低酸素応答の誘導は、CoCl2 (100μM)を溶解の24h前に直接に組織培養培地に添加することで行った。
細胞抽出物の調製および免疫ブロッティング
細胞抽出物の調製および免疫ブロッティング分析を、基本的に文献〔Klippel et al. ( (1998). Mol Cell Biol, 18, 5699-711; Klippel, (1996). Mol Cell Biol, 16, 4117-27)〕に記載のとおり行なった。全長RTP801に対するポリクローナル抗体を、ウサギをpET19-b 発現ベクターから組換え型のRTP801 タンパク質を産生している細菌(Merck Biosciences GmbH, Schwalbach, Germany)で免疫して産生した。マウスのモノクローン性の抗-p110a および 抗-p85 抗体は、Klippel等(上記)によって記載されている。
例2
実験のモデル, 方法および結果
黄斑変性症
本発明の化合物は、脈絡叢の新生血管形成(CNV; Choroidal neovascularization)の動物モデルにしたがって試験された。ウェットAMDのこの特徴は、モデル動物においてレーザー処理で誘発された。
A) マウスモデル
脈絡叢の新生血管形成(CNV)の誘導
ウェットAMDの特徴である脈絡膜の新生血管形成(CNV)は、薬処理群への割当がかくされた単一の個体で、0日に、各マウスの両眼で、レーザー光凝固(532 nm, 200 mW, 100 ms, 75 μm) (OcuLight GL, Iridex, Mountain View, CA)で惹起して行なった。レーザースポットは、スリットランプ送達系およびコンタクトレンズとしてカバースリップを用いて視神経の周囲に標準様式で適用された。評価に関して、眼を摘出し、4% パラホルムアルデヒドで30 min、4゜Cで固定した。感覚神経の網膜を、分離し、視覚神経から切断した。残っているRPE-脈絡膜-強膜複合体を、Immu-Mount (Vectashield Mounting Medium, ベクター)にフラットマウント(flat mounted)し、カバーグラスで覆った。フラットマウントを、レーザー共焦点顕微鏡(TCS SP, Leica, Germany)でスキャンニングして検査した。血管は、青色アルゴンレーザーで励起して視覚化された。水平方向での光学検査の切片(1 μm ステップ)は、RPE-脈絡膜-強膜複合体の表面から取得された。傷害と連結している周囲の脈絡叢の脈管ネットワークが同定できる最深部の焦平面(focal plane)は、傷害の傷害床(floor of the lesion)であると判断できる。レーザー処理領域における任意の血管およびこの参照の平面の表面がCNVと判断される。各切片のイメージは、デジタル情報として保存された。CNV関連の蛍光の領域は、ライカ TCS SP ソフトウェアを用いるコンピュータイメージ分析で測定された。各水平方向での切片における全蛍光領域の合計は、CNVの容積の指標として使用される。本願の明細書等に開示されるsiRNAは、この動物モデルで試験された。この試験でこれらの siRNAsが、AMDを治療および/または予防して、この状態を治療するために使用しえることが示された。
B) 霊長類モデル
CNV誘導
2〜6歳の年齢の雄性カニクイザルサル(カニクイザル)が、研究に使用された。脈絡叢の新生血管形成 (CNV)は、投与前に両眼の黄斑周囲のレーザー治療で誘発させた。傷害は、黄斑にレーザー[OcuLight GL (532 nm) Laser Photo-coagulator with an IRIS Medical(登録商標) Portable Slit Lamp Adaptor]で配置された。おおよそのレーザーのパラメータは、スポットサイズ: 50〜100 μm 直径; レーザーパワー: 300〜700 ミリワット; 照射時間: 0.1 セカンドである。レーザー治療後すぐに、動物の両眼は、単回の硝子体内注射に供試された。左眼は、最終容量50 ul中で350 ugのRTP801に対する合成の安定化siRNAを投与し、他方で反対側の眼は50 ulのPBS (ビヒクル)を受けた。サルは、通常CNV 誘導後の6日に安楽死させた。彼等の眼は、摘出され、後側極が平らにされた(flattened)。中心窩領域が、摘出され、脈絡膜および神経網膜(neuroretina)に分離され、これがRNA抽出およびRTP801 発現のリアルタイムPCR評価に後に使用するために液体窒素中で別々に凍結された。フルオレッセイン血管造影は、事前に試験され、CNV 誘導の1, 2, および 3週の終りに行なった。写真は、眼底カメラ (TRC-50EX Retina Camera)を用いて撮影された。イメージは、TOPCON IMAGEnet(TM)システムを用いてえられた。フルオレッセイン色素(10% フルオレッセイン ナトリウム, 約 0.1 mL/kg)は、血管のアクセスポートを介して注射された。CNV傷害と関連する新生血管形成を評価し、フルオレッセインの漏出をモニターするために、動脈フェーズ, 早期動静脈フェーズおよび幾つかの後期動静脈フェーズを含む色素注射後の幾つかの時点で写真をとった。フルオレッセイン血管像の解釈 および 分析は、二人の眼科医により独立に行なわれた。本願の明細書等に開示されるsiRNAは、この動物モデルで試験された。この試験でこれらの siRNAsが、AMDを治療および/または予防して、この状態を治療するために使用しえることが示された。
COPDおよび気腫
本発明の化合物は、次の動物モデルで試験された:
タバコ煙誘発性気腫モデル: タバコ煙への慢性的な暴露によって、幾つかの動物(例えば、とりわけ, マウス, モルモット)において気腫を生じる。
気腫の誘発因子としての肺プロテアーゼ活性。
気腫のVEGFR阻害モデル。
げっ歯類におけるヒト 好中球 / 膵臓エラスターゼの気管支への点滴注入。
MMP (マトリックス メタロプロテアーゼ)誘発性の気腫。
炎症誘発性の気腫。
さらに、気腫モデルは、遺伝的な手段 (例えば、TSK 変異を保持しているマウス)を介して発生させてもよい。また、気腫動物は、既知の気腫に対する感受性のモディファイヤー(例えば, とりわけ, 肺の傷害, 肺胞の発育不全, 過酸素症, 糖質コルチコイドの治療および栄養)によって発生させてもよい。本願の明細書等に開示されるsiRNA化合物は、これらの化合物が気腫, 慢性気管支炎 および COPDを治療および/または予防することを示すこれらの動物モデルにおいて試験された。
タバコ喫煙(CS)への暴露
曝露は、(7 h/日, 7 日間/週)で行なわれ、2R4F 参照タバコ (2.45 mg ニコチン /シガレット; Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY, USA)を燃やして、喫煙機械(モデル TE-10, Teague Enterprises, Davis, CA, USA)を用いて行なわれた。各々のくすぶっているシガレット(smoldering cigarette)は、2 sでふかし, 1分ごとに全体で八 回ふかし(流速 1.05 L/min)、35 cm3の標準的なふかし(a standard puff)が提供された。喫煙機械を調整して、副流煙 (89%)および主流煙 (11%)の混合物を、一回に五つのシガレットを燃やして産生した。チャンバー雰囲気は、全体の懸濁粒子および一酸化炭素に関してモニターされ、それぞれ90 mg/m3 および 350 ppmの濃度を有する。マウスをCSに暴露した又はRTP801発現プラスミッドを滴下した後、そのマウスは、ハロタンで麻酔され、肺は以前に記載したとおり25 cmの定圧で0.5%の低融点アガロースで膨張された。膨張させた肺は、10% の緩衝ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された。切片(5 μm)は、ヘマトキシリン および エオシンで染色された。平均肺胞直径、肺胞長(alveolar length)および平均直線切片(mean linear intercepts)は、Image Pro Plus software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)でのコンピュータ補助形態計測で決定された。各群における肺の切片が暗号化され、ニコン E800 顕微鏡, 20X レンズで、代表的なイメージ(15 /肺切片)がスライドのアイデンティティーをかくして検査者に提供された。
気管支肺胞洗浄(BAL;Bronchoalveolar lavage)および表現型決定
CSへの暴露またはRTP801発現プラスミドの滴下に続いて、マウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔した。マウスの肺から集めたBAL液体は遠心(500 , g 、4゜C)され、細胞ペレットがリン酸緩衝塩類溶液に再懸濁された。洗浄液中の全細胞数が決定され、2 x 104の細胞がスライドガラスに遠心され (Shandon Southern Products, Pittsburgh, PA, USA)、ライトギムザ染色で染色された。細胞数の差の計数は、標準的な細胞学的な技術にしたがって300細胞で行なわれた。
肺における肺胞のアポトーシス細胞集団の同定。
肺中でアポトーシスを経験している異なる肺胞細胞タイプを同定するために、活性カスパーゼ 3の免疫組織化学的な染色を室空気(RA;room air)で同様にCSに暴露されたマウスからの肺切片で行なった。肺中のアポトーシスII型上皮細胞を同定するために、活性カスパーゼ 3 標識化後に肺切片を抗-マウスサーファクタントプロテインC (SpC) 抗体でインキュベーションし、次に抗-ウサギテキサスレッド抗体でインキュベーションした。アポトーシス内皮細胞は、切片を抗-マウス CD 31 抗体およびビオチン化ウサギ抗-マウス二次抗体でインキュベーションすることで同定された。肺の切片は、PBSでリンスされ、次にストレプトアビジン-テキサスレッド抱合複合体でインキュベーションされた。肺中のアポトーシスマクロファージは、切片を最初にラット抗-マウスMac-3抗体で次に抗-ラットテキサスレッド抗体でインキュベーションされて同定された。最終的に, DAPIが、全ての肺の切片に適用され、5 分間インキュベーションされ、洗浄され、Vectashield HardSetマウンティングメディアでマウントされた。DAPI および フルオレッセインは、それぞれ330〜380 nm および 465〜495 nmで視覚化された。肺のイメージは、ニコン E800 顕微鏡, 40X レンズで取得された。
活性カスパーゼ3の免疫組織化学的な局在化
活性カスパーゼ3アッセイの免疫組織化学的な染色は、抗活性カスパーゼ3 抗体を用いて行なわれた。そして、活性カスパーゼ3-陽性細胞は、Image Pro Plusプログラムを用いたマクロで計数された。計数を、本願の明細書等で肺胞長と称される肺胞のプロファイルの和で標準化し、μmで表す。肺胞長は平均直線切片と逆比例し〔即ち、肺胞中隔(alveolar septa)が破壊されるので〕、平均直線切片は全肺胞長とともに増加する(即ち、全肺胞中隔長が減少する)。
カスパーゼ 3 活性アッセイ
カスパーゼ-3/7 活性は、製造者の説明書にしたがった蛍光定量的アッセイを用いて肺組織抽出物中で測定された。スナップ凍結(Snap-frozen)した肺組織(n = 3 / 群)は、緩衝液でホモジナイズされ、次に超音波処理され、遠心分離(800 x g)された。核および細胞の破片を除去した後に、上清(300 μg タンパク質)はpro-蛍光基質で室温で1hでインキュベーションされた。そして、蛍光強度はTyphoon phosphoimager (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ, USA)を利用して測定された。結果は、特異的なカスパーゼ-3 基質切断の比率で表され、総タンパク質濃度(total protein concentration)で標準化したカスパーゼ 3 酵素活性の単位で表された。活性型組換えカスパーゼ 3を、アッセイ 標準 (0〜4 U)として利用した。基質なしの組織ライセート(アッセイ緩衝液のみ)およびカスパーゼ 3 インヒビターを伴うライセートを、陰性対照として利用した。
8-オキソ-dGの免疫組織化学的な局在化
8-オキソ-dGの免疫組織化学的な局在化および定量に関して、CSに暴露した又はRTP801発現プラスミドを注入したマウスからの肺の切片は、抗-8-オキソ-dG 抗体でインキュベーションされ、InnoGenexTM Iso-IHC DAB キットでマウス抗体を用いて染色された。8-オキソ-dG-陽性の細胞は、マクロ(Image Pro Plusを用いて)で計数され。そして、その計数を、記載のとおり肺胞長で標準化した。
プラスミドDNAのマウス肺への注入
RTP801発現ベクター及び対照ベクターのプラスミドDNAは、エンドトキシンフリーのDNA単離キットを用いて調製された。気管枝内注入に関して、50 ugのプラスミド DNAが80 ulの無菌パーフルオロカーボンにおいて送達された。パーフルオロカーボンの酸素保持特性はこれらの容積で許容され、気管内に注入された場合にその物理化学的な特性によって非常に効率的な遠位肺(distal lung)への送達が許容される。マウスは短期吸入のハロタンへの曝露で麻酔され、舌を優しく鉗子で引張り、気管に刃のない(blunt)血管カテーテルを介して舌の基部で適用したパーフルオロカーボン溶液を注入された。
siRNAのマウス肺への注入。
マウスは、ケタミン/キシラジン (115/22 mg/kg)の腹膜内注射で麻酔された。50μgのsiRNAが、50μl容量の0.9% NaCl中で五回の連続的な10 μl部分を送達することによって鼻内に注入された。鼻腔内滴下の終了時に、マウスの頭部を真っ直ぐに1 分間保持して、全ての注入した溶液が内側に流れることを保証した。
更なる情報に関して文献〔Rangasamy et al., Submitted to Journal of Clinincal Investigation get ref; Kasahara, et al., Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 737-744, 2001; Kasahara, et al., . J. Clin. Invest. 106:1311-1319 (2000)〕; およびトピックに関する総説(Tuder, et al., Pulmonary Pharmacology & Therpaeutics 2002)を参照されたい。
微小血管の障害
本発明の化合物は、以下に記載のとおり、ある範囲の微小血管の障害の動物モデルで試験された。本願の明細書等に開示されるsiRNA化合物は、これらの化合物が微小血管の障害による疾患を治療および/または予防することを示すこれらの動物モデルにおいて試験された。
糖尿病性網膜症
RTP801は、インビトロでニューロン細胞のアポトーシスおよび活性酸素種の産生を促進する。本発明の発明者は、未熟網膜症(ROP)のモデルに供試したRTP801 ノックアウト(KO)マウスにおいて、VEGFが上昇しているにもかかわらず、病的な新生血管形成NVが低酸素状態で減少したこと、他方でこの遺伝子の欠乏が生理的な新生児の網膜NVに影響しなかったことも発見した。そのうえ、このモデルにおいて、RTP801の欠損は、低酸素のニューロンアポトーシスおよび過酸素症の血管閉塞に対して防御的である。
実験1
糖尿病が、STZの腹腔内注射で8wk齢のRTP801のKOおよびC57/129sv 野生型(WT)同腹仔のマウスで誘発された。4 週後のERG(単一の白色閃光, 1.4x10^4 ftc, 5 ms)は、暗順応の1 時間後に左眼から得られた。RVPは、エバンスブルーブルーアルブミン浸透技術(Evans-blue albumin permeation technique)を用いて両眼で評価された。
実験2
糖尿病は、適合する遺伝的な背景を有しているRTP801ノックアウトおよび対照野生型マウスで誘発された。加えて、糖尿病をC57Bl6マウスでも誘発でき、引き続いてマウスは抗-RTP801および対照siRNAsの硝子体内注射に使用された。糖尿病誘発に関して、マウスは、ストレプトゾトシン (STZ 90 mg/kg/d で一晩の絶食後に2 日間)で注射された。動物の生理は、血糖, 体重, および ヘマトクリットの変化に関する試験でモニターされた。ビヒクル注射したマウスは、対照として貢献する。動物は、1ug のREDD14 抗-RTP801 siRNAまたは1ug の抗-GFP 対照siRNAの硝子体内注射で治療された。siRNAを、0日(最初のSTZ注射が行なわれたとき)およびSTZ注射後14日の試験の過程で二回注射した。網膜血管での漏出は、糖尿病の4週間後の動物でエバンスブルー(EB)色素技術を用いて測定された。マウスは、エバンスブルー(EB)測定の24時間前に右頚静脈に移植されたカテーテルを有する。各動物の両眼での網膜透過性の測定は、標準のエバンスブループロトコールにしたがって行なわれた。
本願の明細書等に開示されるsiRNA 化合物は、これらの化合物が糖尿病性網膜症を治療することを示すこの動物モデルで試験された。
未熟網膜症
未熟網膜症(Retinopathy of prematurity)は、検査動物を低酸素および過酸素の状態に暴露することによって誘発され、引続いて網膜における影響が試験された。結果はRTP801 KO マウスが未熟網膜症から保護されたことを示し、RTP801阻害の保護作用が確認された。
心筋梗塞
心筋梗塞は、短期および長期の両方でマウスで左前側下行性動脈(Left Anterior Descending artery)を結紮することで誘発された。結果: 血液において梗塞後24 hrsでのTnT および CPK-MB分画レベルおよびRTP801 KO マウスにおける梗塞後28日での良好な心エコー(駆出率容量)の減少。
微小血管の虚血状態
虚血状態を評価するための動物モデルには、次に記載するものが含まれる:
1. 閉鎖頭部外傷 (CHI;Closed Head Injury) : 実験的なTBIによって、行動の欠陥の度合および程度と関連する神経学的および神経代謝的なカスケードに寄与する一連のイベントが生じる。CHIは麻酔下で誘導され、重りを前頭面中部(midcoronal plane)の左半球を被覆している暴露された頭蓋に対して既定の高さから自由落下させる(Chen et al, J. Neurotrauma 13, 557, 1996)。
2. 一過性の中大脳動脈閉塞(MCAO) : 90〜120 分間の一過性の限局的な虚血が、成体の雄性SD系ラット, 300〜370 grで行なわれた。利用した方法は、腔内縫合MCAO〔Longa et al., Stroke, 30, 84, 1989, および Dogan et al., J. Neurochem. 72, 765, 1999〕である。要約すると、ハロタン麻酔下で、ポリ-L-リジンでコートされた3-0-ナイロン縫合材を、外頚動脈の空孔をとおして右内頚動脈(ICA)に挿入した。ナイロン糸は、ICAから右のMCA起点に差し込んだ(20〜23 mm)。90〜120 分間後に、糸をぬき、動物を縫合し、回復させた。
3. 永続的な中大脳動脈閉塞(MCAO) : 閉塞は永続的なものであり、MCAの電気凝固で誘導される片側性のものである。両方の方法によって、脳皮質の同側の限局的な脳虚血が導かれ、反対側が無傷(対照)のまま残される。左のMCAは、Tamura A等(Tamura A.et al., J Cereb Blood Flow Metab. 1981; 1:53-60)に記載のとおり、側頭部の骨切除開頭術を介して暴露された。MCAおよびそのレンズ核線条体の分枝は、嗅索の近位ないし内側の境界で微小二極性凝固(microbipolar coagulation)で閉塞された。傷は縫合され、動物は26゜C〜28゜Cに温められた部屋の彼等のケージにもどされた。動物の体温は、自動サーモスタットで常に維持された。
本願の明細書等に開示されるsiRNA 化合物は、これらの化合物が微小血管の虚血状態を治療することを示すこの動物モデルで試験された。
急性腎不全(ARF)
ARFを治療するための活性siRNA の試験は、敗血症-誘発性ARFまたは虚血-再灌流-誘発性ARFを用いて行なってもよい。
敗血症誘発性のARF
敗血症-誘発性ARFの二つの予測的な動物モデルは、Miyaji等(Miyaji T, Hu X, Yuen PS, Muramatsu Y, Iyer S, Hewitt SM, Star RA, 2003, Kidney Int. Nov;64(5):1620-31)に記載される。これらの二つのモデルは、マウス(好ましくは、老齢マウス)におけるリポ多糖投与および盲腸結紮穿孔(cecal ligation puncture)である。本願の明細書等に開示されるsiRNA化合物は、これらの化合物が敗血症誘発性ARFを治療および/または予防することを示すこれらの動物モデルにおいて試験された。
虚血-再灌流-誘発性ARF
この予測的な動物モデルは、Kelly等〔Kelly et al.,2003, J Am Soc Nephrol.;14(1):128-38〕によって記載された。
虚血-再潅流傷害は、ラットで45 分間の両側性の腎臓動脈クランプおよびクランプの開放に続いて24 時間の再灌流を許容させて誘発させた。250 μgのRTP801 siRNAまたはGFP siRNA (陰性対照)は、頚静脈にクランプの2 hrs 前から30 分後まで注射された。付加的な250μgのsiRNAが、尾静脈を介してクランプの4 および 8 hrs 後に与えられた。GFPに対するsiRNAを陰性対照とした。ARFの進行は、手術の前および24 hrs後に血清クレアチニンレベルの測定でモニターされた。実験の終了時に、ラットは大腿部に留置したラインを介して温かいPBSに続いて4% パラホルムアルデヒドを灌流された。左の腎臓が摘出され、引き続く組織学的な分析のために4% パラホルムアルデヒドに保存された。急性腎不全は、血清クレアチニンレベルのベースラインからの急性の上昇として定義される。少なくとも 0.5 mg /dLまたは44.2 μmol /Lの血清クレアチニンの増加は、急性腎不全の指標と考えられる。血清クレアチニンは、手術前のゼロ時間に及びARF 手術の24 時間後に測定される。本願の明細書等に開示されるsiRNA 化合物は、これらの化合物が治療および/または予防することを示すこの動物モデルで試験された。
虚血-再灌流-誘発性ARF
難聴
シスプラチン誘発性の耳毒性
シスプラチン誘発性の耳毒性は、蝸牛および前庭器官の培養において誘発された。出生後の3〜4日のラットは、Zhang等〔Zhang et al., Neuroscience 120 (2003) 191-205〕に詳細に記載されたとおり蝸牛および前庭器官の培養を調製するために使用された。蝸牛は慎重に切開され、ラセン神経節, コルチ器官および中央回転体(middle turn)を含んでいる蝸牛組織が、Zhang等に記載されたとおり器官培養(organotypic cultures)を調製するために摘出された。培養物は、処理前のコンディショニングのためにCO2インキュベーターに24h配置された。コンディショニング後、培養物は、シスプラチン単独で1, 5または10 μg/mlを48h処理された。RTP801 siRNAの保護作用を研究するために、蝸牛のエクスプラント(5蝸牛/群)は、リポフェクタミンの有り無しで、10 μg/mlのシスプラチンおよび様々な濃度のRTP801 siRNAで48h処理された。無処置の対照培養およびRTP801 siRNAで48h処理する培養は、平行して行った。実験の終わりに、培養物は、10% ホルマリンで固定され、FITC抱合型ファロイジンで染色された。0.25 mm 長の蝸牛における内側有毛細胞および外側有毛細胞の数が計数され、有毛細胞の平均数が各処置に対して決定された。本願の明細書等に開示されるsiRNA化合物は、これらの化合物がシスプラチン誘発性の耳毒性を治療および/または予防することを示すこの動物モデルにおいて試験された。
ゲンタマイシン誘発性の耳毒性
チンチラは、硫酸ゲンタマイシン単独で5 日(125〜300 mg/kg, 筋肉内)またはRTP801 siRNAとの組み合わせで処理された。siRNA 分子は、ゲンタマイシンへの曝露の二日前および5 日間の間に蝸牛の正円窓膜に局所的に投与された。治療の終了時に、動物は、二酸化炭素への曝露および断頭で殺傷された。蝸牛は、摘出され、蝸牛組織における内側有毛細胞および外側有毛細胞の数を決定するためにFITC抱合型ファロイジンで染色するために調製された〔Ding et al., Hearing Research 164 (2002) 115-126 および in Wang et al., The Journal of Neuroscience 23(24):8596-8607の記載のとおり〕。本願の明細書等に開示されるsiRNA化合物は、これらの化合物がゲンタマイシン誘発性の耳毒性を治療および/または予防することを示すこの動物モデルにおいて試験された。
音響性外傷
色素沈着モルモット(Pigmented guinea pigs)は、音響性外傷の研究に使用された〔Wang et al., The Journal of Neuroscience 23(24):8596-8607記載された〕。RTP801 siRNA 分子は、7 日間の間に蝸牛の正円窓膜に局所的に投与された。無処置の左の蝸牛は、聴覚性の有毛細胞欠損および聴力機能の損失を生じる音響性外傷の有効性のための対照として寄与する。動物は音響性外傷 [約 6 kHz, 120 dB 音圧レベル (SPL), 30 min]に暴露された。そして、両方の耳のオージオグラム(audiograms)は、長期にわたる正円窓の膜電極を介して聴神経から記録された複合作用ポテンシャル(CAPs;compound action potentials)から由来する。両耳からのCAPオージオグラムは、目覚めている動物で毎日測定された。音の曝露の30 d 後、動物は犠牲にされ、彼等の蝸牛は蝸牛管の全体の長さに関する全ての有毛細胞の数を計数するため走査型電子顕微鏡を用いて有毛細胞の損失の定量的な評価のために調製された。本願の明細書等に開示されるsiRNA化合物は、これらの化合物が音響性外傷誘発性の耳毒性を治療および/または予防することを示すこの動物モデルにおいて試験された。
更なるモデル, 方法およびRTP801 siRNAsに関する結果に関して、本発明の権利者のPCT公開番号WO06/023544A2 および PCT特許出願番号PCT/US2007/01468(参照によってその全体が本明細書中に援用される)を参照されたい。
褥瘡または圧迫潰瘍のモデル系
褥瘡または圧迫潰瘍(糖尿病性潰瘍を含む)は、持続的な圧力(通常、ベッドまたは車椅子からの圧力)が体の脆弱な部分〔特に、殿部(buttocks), 臀部(hips)および踵(heels)の皮膚〕への循環を遮断する場合に発生する皮膚 および 組織がダメージをうけた領域である。適切な血流が欠乏することによって、患部組織の虚血性壊死 および 潰瘍形成が生じる。褥瘡は、感覚が減少または欠除した、または衰弱した、痩せ衰えた、麻痺した、または寝たきりの患者において最もよく起こる。仙骨(sacrum), 坐骨(ischia), 大転子(greater trochanters), 外踝(external malleoli)および踵における組織は特に感受性である; 患者の状況に依存して他の部位も関与する可能性がある。
褥瘡, 潰瘍および類似する創傷のための本発明の活性インヒビター(例えば、siRNA 化合物)の試験は、Reid等〔Reid et al., (J Surgical Research.116:172-180, 2004)〕に記載されるマウスモデルで行われた。
付加的なウサギモデル〔Mustoe et al, (JCI, 1991. 87(2):694-703; Ahn and Mustoe, Ann Pl Surg, 1991. 24(1):17-23によって記載された〕は、本発明のsiRNA 化合物を試験するために使用された。本発明によるsiRNA 化合物(例えば、表 A中のもの)は、これらの siRNA 化合物が褥瘡および潰瘍を治療および予防することが示された動物モデルで試験された。
脊髄損傷のモデル系
脊髄損傷または骨髄障害(myelopathy)は、感覚(sensation)および/または運動(mobility)の欠損を生じる脊髄の障害である。二つの一般的なタイプの脊髄損傷は、外傷 および 疾患による。外傷性の傷害は、とりわけ、自動車事故, 落下, 発砲, ダイビング事故によりものである可能性があり、脊髄に影響する可能性がある疾患には、ポリオ, 二分脊髄, 腫瘍, およびフリートライヒ失調症が含まれる。
傷害された脊髄への注射の後のsiRNA 分子のニューロンへの取り込み:
異なるタイプの細胞におけるCy3 標識 siRNAの取り込み(注射で傷害された脊髄に送達される)は、傷害ラットおよび非傷害ラットにおける脊髄挫傷(spinal cord contusion)の後に検査された。矢状縫合(Sagittal)の凍結切片が産生される。また、異なるグループの抗体を用いる免疫染色は、取り込みがニューロン, アストログリア, オリゴデンドログリアおよび/またはマクロファージ/ミクログリアに生じるかどうかを決定するために行われた。ニューロンに関する例示的なマーカーは、NeuN,またはGAP43である;アストログリアおよび潜在的神経幹細胞(potential neural stem cells)に関する例示的なマーカーは、GFAP, ネスチンまたはビメンチンである;オリゴデンドログリアに関する例示的なマーカーは、NG2またはAPCである;マクロファージ/ミクログリアに関する例示的なマーカーは、ED1またはIba-1である(Hasegawa et al., 2005. Exp Neurol 193 394-410)。
ラットは、二つの異なる用量のCy3 標識したsiRNA (1 μg/μl, 10 μg/μl)を注射され、屠殺する前に1 および 3日間放置された。本発明が達成した結果によると、MAP2に対する抗体での免疫染色によって樹状突起への及び運動ニューロンを含んでいるニューロンの細胞体への標識の取り込みが同定された。アストロサイトまたはマクロファージに特異的な他の抗体での染色によって、ニューロンと比べてより低いCy3 標識 siRNAの取り込みが明らかとされた。これらの結果によって、傷害された脊髄に注射されたsiRNA 分子が運動ニューロンを含んでいるニューロンの細胞体および樹状突起に達することが指摘された。本願の明細書等に開示されるsiRNA 化合物は、これらの化合物が脊髄損傷を治療することを示すこの動物モデルで試験された。
緑内障のモデル系
緑内障を治療する又は予防するための本発明の活性インヒビター(例えば、siRNA)の試験は、例えば、Pease等〔Pease et al., J. Glaucoma, 2006, 15(6):512-9〕によって記載されたような動物モデルで行われた(実験的に緑内障を有するラット及び正常マウスにおけるTonoLab および TonoPen tonometersのマノメーターの較正および比較)。
表 Aによるものを含んでいる本発明のsiRNA 化合物は、これらのsiRNA 化合物が緑内障を治療する及び/又は予防することを示す動物モデルで試験された。
ラットでの肺移植後の虚血/再潅流傷害のモデル系
肺移植後の虚血/再潅流傷害または低酸素傷害を治療する又は予防するための本発明の活性インヒビター(例えば、siRNA)の試験は、例えば、文献〔Mizobuchi et al.,(2004. J. Heart Lung Transplant, 23:889-93); Huang, et al., (1995. J. Heart Lung Transplant. 14: S49); Matsumura, et al., (1995. Transplantation 59: 1509-1517); Wilkes, et al., (1999. Transplantation 67:890-896); Naka, et al., (1996. Circulation Research,79: 773-783)〕によって記載されたような一または二以上の実験動物モデルで行われた。
表 Aによるものなどの本発明のsiRNA 化合物は、これらのsiRNA 化合物が肺移植後の虚血再潅流傷害を治療および/または予防し、移植手術と併せて使用されてもよいことを示すこれらの動物モデルで試験された。
急性の呼吸困難症候群のモデル系
急性の呼吸困難症候群を治療するための本発明の活性インヒビター(例えば、siRNA)の試験は、Chen等〔Chen, et al (J Biomed Sci. 2003;10(6 Pt 1):588-92)〕に記載された動物モデルで行われた。表 Aによるものなどの本発明のsiRNA 化合物は、この動物モデルで試験された。これによってこれらの siRNAsが急性の呼吸困難症候群を治療および/または予防して、この状態を治療するために使用しえることが示された。
例3
siRNAsの調製
アルゴリズム(proprietary algorithms)および遺伝子 RTP801(配列番号1)の既知の配列を用いて、多くの可能性のあるsiRNAsの配列が発生された。上記明細書によるsiRNA 分子は、基本的に本願の明細書等に記載されるとおり調製された。
本発明のsiRNAsは、リボヌクレイック(またはデオキシリボヌクレイック)オリゴヌクレオチドの合成の当該技術分野において周知の任意の方法で合成できる。例えば、商業的に利用可能な機械(とりわけ, アプライドバイオシステムから利用可能である)を使用できる; オリゴヌクレオチドは、本願の明細書等に開示される配列にしたがって調製される。化学的に合成した断片のオーバーラップペアを、当該技術分野において周知の方法を用いて連結できる(例えば、米国特許第 6,121,426を参照されたい)。前記鎖は、別々に合成され、チューブ中で互いにアニールされる。次に、二本鎖のsiRNAsは、アニールしなかった一本鎖のオリゴヌクレオチド(例えば、そのうちの一方の過剰が理由で)からHPLCで分離される。本発明のsiRNAsまたはsiRNA 断片に関して、二または三以上の係る配列を合成し、本発明で使用するために共に連結できる。
本発明のsiRNA 分子は、当該技術分野において既知の処置〔例えば、Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684;およびWincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59に記載の処置)で合成でき、5'端でのジメトキシトリチルおよび3'端でのホスホラミダイトなどの一般的な核酸の保護およびカップリング基を利用しえる。修飾された(例えば、2'-O-メチル化)ヌクレオチドおよび無修飾ヌクレオチドは、所望により導入される。
代わりに、本発明の核酸分子は、別々に合成でき、合成後に、ライゲーション〔Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., International PCT publication No. WO93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247; Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204〕又は合成および/または脱保護の後のハイブリダイゼーションなどによって結合できる。また、本発明のsiRNA分子は、米国特許公開第US 2004/0019001(McSwiggen)に記載のとおりタンデム合成法(tandem synthesis methodology)で合成でき、両方のsiRNA鎖は切断可能なリンカーで分けられた単一の近接するオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成され、これは引き続いて切断されて、siRNA二重鎖とハイブリダイズし、siRNA二重鎖の精製を許容する分離したsiRNA 断片または鎖が提供される。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
更なる情報に関して、PCT公開番号WO 2004/015107 (ATUGEN)を参照されたい。
表 Aは、遺伝子RTP801に関して作製された様々な新規の siRNA 分子を詳細に記載する。本願の明細書等に開示されるsiRNA分子の何れも、新規であり、本発明の一部であると考えられる。(Chimpは、チンパンジーを意味する)
Figure 2010518880
Figure 2010518880
上記の表 Aにおいて、siRNAs 1〜34のセンス鎖はそれぞれ配列番号 3〜36を有し、siRNAs 1〜34のアンチセンス鎖はそれぞれ配列番号 37〜70を有する。

Claims (55)

  1. 以下の式を有している化合物:
    5' (N)x - Z 3' (アンチセンス鎖)
    3' Z'-(N')y 5' (センス鎖)
    式中の各々のNおよびN'は、糖残基において修飾または無修飾であってもよいリボヌクレオチドであり;(N)xおよび(N')yは、各々の連続的なNまたはN'が次の NまたはN'に共有結合で結合されたオリゴマーであり;
    式中のx および yの各々は、19 および 40の間の整数であり;
    式中のZ および Z'の各々は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合にはdTdTであり、それが存在する鎖の3' 末端に共有結合性に付着し;
    式中の(N)xの配列は、表 Aに存在する配列の一つを含む。
  2. 請求項1に記載の化合物であって、式中の共有結合はリン酸ジエステル結合であり、式中でx = yであり, 好ましくは式中でx = y = 19であり、式中のZおよびZ'は両方が非存在であり、式中の少なくとも一つのリボヌクレオチドはその糖残基が2' ポジションで修飾され、式中の2' ポジションの部分はメトキシ (2'-0-メチル)であり、式中の交代性リボヌクレオチドはアンチセンスおよびセンス鎖の両方で修飾され、式中のアンチセンス鎖の5'および3' 末端でのリボヌクレオチドは彼等の糖残基が修飾され、式中のセンス鎖の5'および3' 末端でのリボヌクレオチドは彼等の糖残基において無修飾である、化合物。
  3. 請求項1〜2の何れか一項に記載の化合物であって、式中の(N)xの配列は、表 Aのアンチセンス配列番号102 (配列番号44), 103 (配列番号38)または106 (配列番号58)を含む化合物。
  4. 請求項3に記載の化合物であって、アンチセンスおよびセンス鎖が5' および 3'端で非リン酸化である化合物。
  5. 一つの鎖が5'から3'に配列番号3〜36に記載の配列を有している連続的なヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチド,又は各末端領域におけるヌクレオチドの2つまでにおいて塩基が変更されたそのホモログを含む化合物。
  6. 一つの鎖が5'から3'に配列番号37〜70に記載の配列を有している連続的なヌクレオチドを含み、好ましくは2-O-メチル飾で複数の塩基が変更されてもよいオリゴリボヌクレオチド,又は各末端領域におけるヌクレオチドの2つまでにおいて塩基が変更されたそのホモログを含む化合物。
  7. 請求項1〜6の何れか一項に記載の化合物であって、アンチセンス鎖の一, 三, 五, 七, 九, 十一, 十三, 十五, 十七 および 十九 ヌクレオチドに及びセンス鎖の二, 四, 六, 八, 十, 十二, 十四, 十六および十八ヌクレオチドに2' O-Me基を含む化合物。
  8. リン酸化または非リン酸化された、請求項1〜7の何れか一項に記載の化合物。
  9. ジヌクレオチド dTdTが3'端に共有結合性に付着する、請求項1〜8の何れか一項に記載の化合物。
  10. 少なくとも一つのヌクレオチドにおいて糖残基が修飾された、請求項1〜9の何れか一項に記載の化合物。
  11. 修飾が2'-O-メチル修飾である、請求項10に記載の化合物。
  12. 請求項1〜11の何れか一項に記載の化合物であって、2' OH基が-H-OCH3, -OCH2CH3, -OCH2CH2 CH3, -NH2, および Fからなる群から選択される基または部分で置換された化合物。
  13. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄の損傷または疾患から選択される状態を患っている患者を治療する方法であって、患者に治療上効果的な量で請求項1〜12の何れか一項に記載の化合物を含んでいる薬学的組成物を投与して患者を治療することを含む方法。
  14. 請求項13に記載の方法であって、前記状態が眼疾患AMDである方法。
  15. 請求項13に記載の方法であって、前記状態が聴力障害の音響性外傷である方法。
  16. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄の損傷または疾患から選択される状態を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製における請求項1〜12の何れか一項に記載の化合物の治療上効果的な量の使用。
  17. 請求項1〜12の何れか一項に記載の二または三以上の化合物を含んでいる薬学的組成物。
  18. 第一の化合物が表 Aのオリゴリボヌクレオチドであり、第二の化合物が表 Aの又はPCT特許公開WO06/023544A2の表 AないしCの何れか一つの又はWO2007084684の表 AないしDの何れか一つのオリゴリボヌクレオチドまたは抗体またはアプタマーである、二または三以上の化合物を含んでいる薬学的組成物。
  19. 請求項17に記載の組成物であって、一または二以上の前記化合物が表 AのID番号102, 103, および 106から選択されるオリゴリボヌクレオチドである組成物。
  20. 請求項18に記載の組成物であって、第一の化合物が表 AのID番号102, 103, および 106から選択されるオリゴリボヌクレオチドである組成物。
  21. 請求項18に記載の組成物であって、第二の化合物が表 AのID番号102, 103, および 106から選択されるオリゴリボヌクレオチドである組成物。
  22. 請求項17〜21の何れか一項に記載の組成物であって、第二の化合物が有益な活性を産生する量で共に物理的に混合された組成物。
  23. 請求項17〜21の何れか一項に記載の組成物であって、第二の化合物が共有結合性または非共有結合性に結合された組成物。
  24. 請求項17〜21の何れか一項に記載の組成物であって、第二の化合物が2〜100, 好ましくは2〜50または2〜30ヌクレオチドの範囲の長さの核酸リンカーで共に結合された組成物。
  25. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害, 褥瘡または脊髄の損傷または疾患の治療のための請求項17〜24の何れか一項に記載の組成物の使用。
  26. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄の損傷または疾患から選択される状態を患っている患者を治療するための方法であって、患者に治療上効果的な量のRTP801ポリヌクレオチドインヒビターを含んでいる薬学的組成物を投与して患者を治療することを含む方法。
  27. 請求項26に記載の方法であって、前記ポリヌクレオチドがsiRNAである方法。
  28. 請求項27に記載の方法であって、前記siRNAは、表 A(配列番号3〜70)に又はPCT特許公開WO2007084684中の表 AないしDの何れか一つに記載される任意の配列と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含む方法。
  29. 請求項26に記載の方法であって、前記インヒビターは、siRNA, siRNAを含んでいるベクター, siRNAを発現するベクターおよび内因性にsiRNAにプロセスされる任意の分子からなる群から選択される方法。
  30. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害, 聴力障害, 褥瘡または脊髄の損傷または疾患から選択される状態を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製における表 Aに提供される配列を有しているRTP801インヒビターの治療上効果的な量の使用。
  31. 請求項30に記載の使用であって、前記聴力障害が音響性外傷である使用。
  32. 請求項30に記載の使用であって、前記siRNAが表 A(配列番号3〜70)に記載される任意の配列と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含む使用。
  33. 請求項30に記載の使用であって、前記インヒビターは、siRNA, siRNAを含んでいるベクター, siRNAを発現するベクターおよび内因性にsiRNAにプロセスされる任意の分子からなる群から選択される使用。
  34. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害または脊髄の損傷または疾患から選択される状態を患っている患者を治療するための方法であって、患者に治療上効果的な量の表 A(配列番号3〜70)に記載される任意の配列と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含むRTP801 遺伝子の発現を阻害するsiRNAを含んでいる薬学的組成物を投与して患者を治療することを含む方法。
  35. 請求項34に記載の方法であって、前記状態が眼疾患である方法。
  36. 請求項35に記載の方法であって、前記眼疾患が黄斑変性症である方法。
  37. 請求項34に記載の方法であって、前記状態が呼吸障害である方法。
  38. 請求項37に記載の方法であって、前記呼吸障害がCOPDである方法。
  39. 請求項38に記載の方法であって、前記呼吸障害が喘息である方法。
  40. 請求項37に記載の方法であって、前記呼吸障害が慢性気管支炎である方法。
  41. 請求項37に記載の方法であって、前記呼吸障害が気腫である方法。
  42. 請求項34に記載の方法であって、前記状態が微小血管の障害である方法。
  43. 請求項42に記載の方法であって、前記微小血管の障害が糖尿病性網膜症である方法。
  44. 請求項42に記載の方法であって、前記微小血管の障害が急性腎不全である方法。
  45. 呼吸障害, 眼疾患, 微小血管の障害, または脊髄の損傷または疾患から選択される状態を患っている患者の回復を促進するための医薬の調製における表 Aに記載される任意の配列(配列番号 3〜70)と同一の配列を有している連続的なヌクレオチドを含んでいるRTP801 遺伝子の発現を阻害するsiRNAの治療上効果的な量の使用。
  46. 請求項45に記載の使用であって、前記状態が眼疾患である使用。
  47. 請求項46に記載の使用であって、前記眼疾患が黄斑変性症である使用。
  48. 請求項45に記載の使用であって、前記状態が呼吸障害である使用。
  49. 請求項48に記載の使用であって、前記呼吸障害がCOPDである使用。
  50. 請求項48に記載の使用であって、前記呼吸障害が喘息である使用。
  51. 請求項48に記載の使用であって、前記呼吸障害が慢性気管支炎である使用。
  52. 請求項48に記載の使用であって、前記呼吸障害が気腫である使用。
  53. 請求項45に記載の使用であって、前記状態が微小血管の障害である使用。
  54. 請求項53に記載の使用であって、前記微小血管の障害が糖尿病性網膜症である使用。
  55. 請求項53に記載の使用であって、前記微小血管の障害が急性腎不全である使用。
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