TW201124160A - SiRNA compounds comprising terminal substitutions - Google Patents

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TW201124160A TW099141067A TW99141067A TW201124160A TW 201124160 A TW201124160 A TW 201124160A TW 099141067 A TW099141067 A TW 099141067A TW 99141067 A TW99141067 A TW 99141067A TW 201124160 A TW201124160 A TW 201124160A
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Description

201124160 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於經修飾之siRNA化合物、包含其之醫藥組 合物、及使用其抑制基因表現之方法。該等化合物及組合 •物展現有利之特性，包括阻斷標靶基因表現之活性，且適 用於治療罹患基因表現具有不利影響之疾病或病況及/或 與該等疾病或病況相關之症狀或有染上該等疾病或病況之 風險的個體。 〇 本申請案主張2009年11月26曰申請之美國臨時申請案第 6 1/264668號、20 10年1月17曰申請之美國臨時申請案第 61/295721號及2010年8月9曰申請之美國臨時申請案第 61/372072號的權益，該等案均以全文引用之方式且出於 所有目的併入本文中。 【先前技術】 本發明受讓人之PCT專利公開案第WO 2008/1 04978號及 第WO 2009/044392號揭示新穎的siRNA結構，該等公開案 〇 以全文引用之方式併入本文中。 仍需要展現增強之阻斷基因表現之活性、提高之穩定性 及/或降低之脫靶效應的活性及有效siRNA治療劑。 【發明内容】 本文所揭示之雙股RNA(dsRNA)化合物具有可例如增強 活性、提高穩定性、降低免疫原性、增強對RISC複合物之 負載及/或使毒性最小的結構及修飾；siRNA之新穎修飾可 有利地應用於適用於阻止或削弱標靶基因表現的雙股 152508.doc 201124160 RNA。 本文提供適用於下調基因表現之雙股（雙鏈體）寡核苷酸 化合物。本發明在某種程度上基於如下意外之觀測結果： 包含有義股及互補反義股且在反義股之5'末端核苷酸與標 靶RNA之核苷酸之間具有錯配的雙股核酸分子展示有效下 調標靶基因之活性。在較佳實施例中，dsRNA包含腺苷、 去氧腺苷、尿苷、去氧尿苷、核糖胸苷或胸苷取代於反義 股之位置1(5’末端）上而替代胞苷或鳥嘌呤。 根據一態樣，提供具有下述結構（A)之經修飾之雙股核 酸分子： ⑷ 5' N1-(N)x-Z 3，（反義股） 2 3, 5’（有義股） 其中Ν、Ν及Ν·各自為未經修飾或經修飾之核糖核苦酸或 非習知部分； 其中师及（ΝΜ自為募核㈣，其中錢續，藉由 共價鍵接合於相鄰Ν或Ν，； 且（Ν)χ與標靶rna中 其中X及y各自獨立地為17至39之整數 其中（N，)y之序列與（Ν)χ之序列互補， 之連續序列互補； 其中Ν1共價鍵結於（Ν)χ，且與標無r RNA互補2DNA部分； I飞為與私 為由天然或經修飾…、去氧核糖尿*、 分； ㈣料、料或去氧腺μ成之群的. 152508.doc 201124160 其中Z"可存在或不存在，但若存在，則為共價連接於 N -(N’）y之5’末端的封端部分；及 其中Z及Z’各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立 地為共價連接於其所存在股之3,末端的j -5個連續核苷酸、 連續非核苷酸部分或其組合。
在二貫施例中’（N')y之序列與（Ν)χ之序列完全互補。 在各種實施例中，N2-(N，)y之序列與^-(Ν#之序列互補。 在二實施例中，（N)x包含與標tRNA中之約17至約39個 連續㈣酸完全互補的反義序列。在其他實施例中，（N)X 包含與標抑NA中之約17至約Μ個連續核苷酸實質上互補 的反義序列。 在一些實施例中，斑Μ 與成華特生_克里克（WatsonCri 驗基對。在一 4b營尬点丨+ , 二貝施例中，N丨與N2形成非華特生_克里克 驗基對。在一地(營^J /丨, —、 1中，鹼基對形成於核糖核苷酸與去 氧核糖核^酸之間。 乂 18，x=y=19 或x=y=20。在較佳
在一些實施例中， 實施例中，X = y=l 8。 在一些實施例中， 配。在各種實施例中 互補之DNA部分。
N共價鍵結於（N)x且與標靶RNA錯 N共價鍵結於（N)x且為與標靶RNA 苦、去_、去氧尿芽、…位置1的尿苦經選自滕 代。在各種亥糖胸苷或去氧胸苷之N〗取 π隹谷種實施例中’ Ν1係ώ & 苷。 ’、自腺苷、去氧腺苷或去氧尿 152508.doc 201124160 *在-些實施例中，處於反義股之位置w鳥_經選自腺 苦、去氧腺芽、尿普、去氧尿普、核糖胸皆或去氧胸脊之 N取代。在各種實施例中’心選自腺苷、去氧腺芽 苷或去氧尿苷。 ★在-，實施例中，處於反義股之位置!的胞苷經選自腺 苷去乳腺普、尿苦、去氧尿普、核糖胸芽或去氧胸苦之 N取代。在各種實施财，⑷係選自腺*、去氧腺普 苷或去氧尿苷。 在一些實施例中，處於反義股之位置〗的腺普經選自去 氧腺苦、去氧料、核糖胸苦或去氧料W取代。在各 種實施例中’N1係選自去氧腺苦或去氧尿普。 /一些實施例中，心一成介於尿普或去氧尿普與腺 苷或去氧腺苷之間的鹼基對。在其他實施例中，心心 成介於去氧尿苷與腺苷之間的鹼基對。 在一些實施例中’雙股核酸分子為处财、s祖或 miRNA。 下表提供N1及相應N2之實例 標靶 核苷酸 完全匹配標靶 之反義股之5， 末端核苷酸 Ν1(反義股之 5’末端位置） N2(有義股之 3’末端位置） A ~ΰ----"— ------- Λ rA > dA rU、dU、rT、dT A ΓΛ 「U dU、rT、dT rA、dA C G rA、dA 'ΤΓ~ΓΓ；~--- rU、dU、rT、dT c G ----~~- rU、dU、rT、dT rA、dA VJ C rA ' dA rU、dU、rT、dT ---i 152508.doc 201124160
構（A)之某些實施例中，N2包含2,〇Me糖修飾之核糖核苦 酸。在結構（A)之一些實施例中，Nl包含2,〇Me糖修飾之核 糖尿苷且N2包含腺苷或經修飾之腺苷。在結構之—些
實施例中，N1包含”篇2包含核糖料或經修飾之核^ 尿苷。 在-些實施例中，Ζ及Ζ，不存在。在其他實施例中，2或 Ζ'之一者存在。 在一些實鉍例中，Ν及Ν'各自為未經修飾之核糖核苷 酸。在一些實施例中，Ν*Ν，之至少一者包含經化學修飾 之核糖核苷酸或非習知部分。在一些實施例中，非習知部 分係選自鏡像核苷酸、無鹼基核糖部分及無鹼基去氧核糖 部分。在一些實施例中，非習知部分為鏡像核苷酸，較佳 〇 為L-DNA部分。在一些實施例中，Ν或Ν'之至少一者包含 2’OMe糖修飾之核糖核苷酸。 在一些實施例中’（N，)y之序列與（N)X之序列完全互補。 在其他實施例中’（N，)y之序列與（Ν)χ之序列實質上互補。 在一些實施例中，（Ν)χ包含與標靶mRNA中之約17至約 39個連續核苷酸完全互補的反義序列。在其他實施例中， (N)x包含與標靶11111>1八中之約17至約39個連續核苷酸實質 上互補的反義序列。在一些實施例中，x=y=丨8。 152508.doc 201124160 根據某些較佳實施例’提供包含—或多個經修飾之核普 酸之siRNA化合物，其中該經修飾之核苦酸在糖部分、驗 基部分或核苷酸間鍵部分中具有修飾。 結構（A)基元適用於針對哺乳動物或非哺乳動物基因之 任何寡核苷酸對（有義股及反義股）。在一些實施例中，哺 乳動物基因為人類基因。 在一些實施例中，具有結構（A)之經修飾之siRNA化合物 在與對照化合物比較時展現有利之特性，包括增強之活性 (例：it IC50降低、阻斷基因表現之活性增強、殘餘抓難減 少），亦即反義寡核苷酸與中之核苷酸序列完全 互補（包括5,末端核苷酸鹼基配對，例如A_u、u_a、c_g、 G C)的S1RNA化合物。在―些實施例巾，與對照化合物比 較，活性增強至少5%、至少1〇%、至少2〇%、至少25%或 2 5 %以上。 在另一態樣中，本發明提供一種產生由過客寡核苷酸及 導引寡核苷酸組成之經修飾isiRNA雙鏈體的方法，其包 含以下步驟： )選擇払靶RNA中之具有連續17至25個核苷酸之序列且合 成與標乾mRNA之該具有連續17至25個核苦酸之序列互補 的反義版，其中該反義股之5,末端核苦酸經尿苦、經修飾 尿苷核糖胸苷、去氧核糖胸苷、腺苷、經修飾之腺 芽、2氧腺苦或經修飾之去氧腺芽取代，其限制條件為在 導引券核苷酸之5’末端核苷酸與標靶mRNA23，末端核苷酸 之間不產生rG:rU擺動鹼基對（w〇bble); 152508.doc 201124160 b) 合成與該反義股互補之具有17至25個核苷酸之有義股， 其中β亥有義股之3’末端核苷酸與反義股之5,末端核苷酸形 成華特生-克里克鹼基對；及 c) 黏接有義股與反義股，從而產生核酸雙鏈體。 根據態樣，本發明提供一種產生由過客寡核苷酸及導 引寡核苷酸組成之經修飾之siRNA雙鏈體的方法，其包含 以下步驟： 0 勾選擇標靶RNA申之具有連續17至25個核苷酸之序列且合 成與標靶mRNA之該具有連續17至25個核苷酸之序列互補 的反義股，其中該反義股之5,末端核苷酸經尿苷、經修飾 之尿苷、核糖胸苷、去氧核糖胸苷、腺苷、經修飾之腺 苷、去氧腺苷或經修飾之去氧腺苷取代，其限制條件為在 導引募核苷酸之5,末端核苷酸與標靶mRNA之3,末端核苷酸 之間不產生rG:rU擺動驗基對； b) 合成與該反義股互補之具有17至25個核苷酸之有義股， 〇 其中該有義股之3,末端核苷酸與反義股之5,末端核苷酸形 成華特生-克里克驗基對；及 c) 黏接有義股與反義股，從而產生經修飾之雙鏈 體在些實施例中，經修飾之siRNA雙鏈體在與未經修 飾之siRNA雙鏈體（亦即與標靶mRNA完全匹配之雙鏈體）比 較時展現增強之RNAi活性。 根據另一態樣，本發明提供一種產生由過客寡核苷酸及 導引寡核苷酸組成且在與未經修飾之siRNA雙鏈體比較時 展現增強之RNAi活性的經修飾isiRNA雙鏈體之方法，其 152508.doc 201124160 包含以下： a) 選擇標靶細胞中標靶mRNA中之具有連續^至以個核苷 I之序列且合成包含標&mRNA中之該具有連續17至25個 核苷酸之序列的過客募核苷酸，其中3，末端核苷酸經腺 苷經修飾之腺苷、去氧腺苷或經修飾之去氧腺苷取代； b) 〇成與有義股互補之具有17至25個核苷酸之導引寡核苷 酸，其中5’末端核苷酸包含核糖尿苷、經修飾之核糖尿 苷、去氧核糖尿苷或經修飾之去氧核糖尿苷且與過客股之 3'末端核苷酸形成驗基對； c) 將該過客股黏接於該導引股； 從而產生具有增強之RNAi活性的siRNA雙鏈體。
在些實施例中，步驟a)包括選擇標靶細胞中標靶RNA 中之具有連續17至25個核苷酸之序列其中3,末端核苷酸 不為腺普。 在另態樣中，本申請案包括一種醫藥組合物，其包含 抑制哺礼動物或非哺乳動物基因表現之有效量的結構（A) 化合物’·及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，哺 乳動物基因為人類基因 。在一些實施例中，非哺乳動物基 因與哺乳動物疾病，較佳人類疾病相關。 本申請案另外關於為有此需要之個體治療或預防疾病或 病況發生或嚴重度及/或降低該疾病或病況之風險或嚴重 度的方法，其中該疾病或病況及/或與其相關之症狀及/或 風險係與哺乳動物或非哺乳動物基a表現相關。在較佳實 施例中，個體為人類個體。 152508.doc 201124160 在一些貫施例中，疾病或病況係選自以下群組：聽力喪 失、急性腎衰竭（ARF)、腎移植後移植腎功能延遲恢復 (Delayed Graft Function，DGF)、青光眼、眼缺血性病況 (包括前部缺血性視神經病）、年齡相關之黃斑變性
(AMD)、缺血性視神經病（I〇N)、乾眼症候群、急性呼吸 窘迫症候群（ARDS)及其他急性肺及呼吸道損傷、慢性阻 塞性肺病（COPD)、原發性移植物功能衰竭、缺血再灌注 扣傷、再灌注損傷、再灌注水腫、同種異體移植功能障 礙、器官移植（尤其為肺移植）後肺部再植入反應及/或原發 性移植物功能障礙（PGD)、器官移植（包括肺、肝、心臟、 騰臟及腎移植）、腎毒性及神經毒性、脊趙損傷、腦損 傷、神經退化性疾病或病況、褥瘡、口腔黏膜炎、纖維變 性病況（包括肝纖維化、肺纖維化）；及癌症。該等方法包 括向需要該治療之哺乳動物投與防治或治療有效量之一或 多種該等抑㈣降低至少一種職因表王見或活性的化合 物。 現將描述之化合物、方法、材料及實例僅具有說明性而 不意欲具有限制性；與本文所述類似或等效之材料及方法 均可用於操作或測試本發明。本發明之其他特徵及優勢將 自下列詳細描述及申請專利範圍顯而易知。 【實施方式】 本發明A體係關於下調各縣因表現之寡核普酸化合 物’尤其小干擾RNA(siRNA)、特別經修飾之仙·化合 物’且係關於此等經修飾之仙财化合物用於製備醫藥組 152508.doc -11 - 201124160 合物及用於治療罹患各種醫學病況之個體的用途。 該等化合物及組合物展現有利之特性，包括有效之阻斷 標把基因之活性，且適用於治療羅患基因表現具有不利影 Z之疾病或病況及/或與該等疾病或病況相關之症狀或有 染上该等疾病或病況之風險的個體。 因此，在某些態樣中，提供適用於下調基因表現之經修 飾之siRNA化合物及包含其之醫藥組合物。 在另ϋ樣巾’本發明提供-種^療罹患或易患微血管 病症、眼部疾病或病症、聽力損傷（包括聽力喪失）、呼吸 道（匕括肺）病症、神經退化性疾病或病症、脊腾損傷、腦 相傷、血管生成相關病況及細胞凋亡相關病況之個體的方 法，其包含向該個體投與包含至少一種靶向哺乳動物或非 哺乳動物基因之本發明小干擾RNA的醫藥組合物，其中該 至少一種本發明小干擾RNA之量足以下調該基因表現。 在某些實施例中’本發明之化合物適用於抑制標靶基因 表現以尤其治療呼吸道病症、微血管病症或眼部病症。所 治療之特定疾病及病況為ARDS ; COPD ; ALI ;肺氣腫； 糖尿病性神經病、腎病及視網膜病；DME及其他糖尿病性 病況；青光眼；AMD ; BMT視網膜病；缺血性病況，包括 中風；OIS ;神經退化性病症’諸如帕金森氏症 (Parkinson's disorder)、阿茲海默氏症（Alzheimer’s disorder)、ALS ;腎病症：ARF、DGF、移植排斥反應； 聽力障礙；脊髓損傷；口腔黏膜炎；癌症、乾眼症候群及 得瘡。 J52508.doc -】2_ 201124160 定義 為方便起見’在本文中描述本說明書、實例及申請專利 範圍中所用之某些術語。 應注意，除非内容另外明確規定，否則如本文所用之單 數形式「一」及「該」包括複數形式。當根據馬庫西群組 (Markush group)或其他替代群組描述本發明之態樣或實施 例時，熟習此項技術者應瞭解，本發明亦由此根據群組成 員之任何個別成員或子群進行描述。 「抑制劑」為能夠降低（部分或完全）基因表現或基因產 物之活性達至足以實現所需生物或生理作用之程度的化合 物。如本文所用之術語「抑制劑」係指siRNA抑制劑。 「siRNA抑制劑」為能夠降低基因表現或基因產物之活性 達至足以實現所需生物或生理作用之程度的化合物。如本 文所用之術語「siRNA抑制劑」係指siRNA、shRNA、 siNA、合成shRNA、miRNA之一或多者。抑制亦可指下 調’或對於RNAi而言指沉默。 如本文所用之術語「抑制」係指降低基因表現或基因產 物之活性達至足以實現所需生物或生理作用的程度。抑制 為完全或部分抑制。 如本文所用之術語「抑制」標靶基因意謂抑制標靶基因 之基因表現（轉錄或轉譯）或基因產物之多肽活性。如本文 所用之「基因產物」係指諸如RNA轉錄物或多肽之基因產 物。術語「RNA轉錄物」、「mRNA聚核苷酸序列」、 「mRNA序列」與「mRNA」可互換使用。 152508.doc -13- 201124160 如本文所用之術語「聚核苷酸」及「核酸」可互換使用 且係指核苷酸序列，包含去氧核糖核酸（DNA)及核糖核酸 (RNA)。應瞭解’該等術語包括由核苷酸類似物製成之 RNA或DNA之類似物作為等效物。貫穿本申請案，mRNA 序列係闡述為表示相應基因。 「养核苦酸」或「寡聚物」係指具有約2至約5〇個核苷 酸之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。各Dna或RNA核 普酸可獨立地為天然或合成及/或經修飾或未經修飾之 DNA或RNA核苷酸。修飾包括募核苷酸中糖部分、驗基部 分及/或核苷酸間鍵之變化。本發明之化合物涵蓋包含去 氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之去氧核糖核苷酸、 經修飾之核糖核苷酸、核苷酸類似物、經修飾之核苷酸類 似物、非習知及無鹼基部分及其組合的分子。 實質上互補係指與另一序列之互補性大於約84%。舉例 而言，在由19個鹼基對組成之雙鏈體區域中，一處錯配產 生94.7%互補性，兩處錯配產生約89·5%互補性且三處錯配 產生約84.2%互補性，致使雙鏈體區域實質上互補。因 此’實質上一致係指與另一序列之一致性大於約84%。 「核苷酸」意欲涵蓋天然或合成及經修飾或未經修飾之 去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸。核苷酸包括合成、天然存 在及非天然存在之已知之核苷酸類似物。該等類似物之實 例包括（不限於）硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、 對掌性甲基膦酸酯、2ι_〇_甲基核糖核苷酸及肽核酸 (PNA)。修飾包括寡核糖核苷酸中糖部分、驗基部分及/或 152508.doc 201124160 核糖核普酸間鍵之變化。如本文所用之術語「核糖核苷 酸」涵蓋天然與合成、未經修飾與經修飾之核糖核苷酸以 及合成、天然存在及非天然存在之核糖核苷酸類似物。修 飾包括募核苷酸中糖部分、鹼基部分及/或核糖核苷酸間 • 鍵之變化。 核苷酸係選自天然存在或合成之經修飾之鹼基。天然存 在之鹼基包括腺嘌呤、烏嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧 ◎ 啶。核苷酸之經修飾之鹼基包括肌苷、黃嘌呤、次黃嘌 呤、2-胺基腺嘌呤、6_曱基腺嘌呤、2丙基腺嘌呤及其他 烷基腺嘌呤、5-鹵尿嘧啶、5_鹵胞嘧啶、6_氮雜胞嘧啶及 6-氮雜胸腺嘧啶、假尿嘧啶、去氧假尿嘧啶、4_硫尿嘧 定核糖硫尿苷、核糖-4-硫尿苷、豳腺嘌吟、8_胺基 腺嗓呤、8-硫醇腺嘌呤、8_硫醇烷基腺嘌呤、8_羥基腺嘌 7及其他8-經取代之腺嘌呤、8_齒鳥嘌呤、8胺基鳥嘌 7 8硫醇鳥嘌呤、8_硫烷基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤及其 〇 他經取代之鳥嘌呤、其他氮雜腺嘌呤及去氮腺嘌呤、其他 氮雜鳥嗓吟及去氮烏嘴吟、5_甲基核糖尿普、5_三氣甲基 尿嘴疋5甲基核糖胞喊σ定及5-三氟胞嘴咬。在一些實施 例中，寡聚物中之—或多個核芽酸經肌苦取代。 在二實細*例中，siRNA化合物進一步包含至少一種選 自由具有糖修飾、驗基修飾或核苦酸間鍵修飾之核糖核苦 成之群的經修飾之核糖核苷酸，且可含有DNa及經修 你之核苦酸，諸如LNA(鎖核酸）、ENA(伸乙基橋連核 酸）、pna(肽核酸）、阿拉伯糖皆、亞碌幾基緩酸或膊基叛 152508.doc •15· 201124160 酸核苷酸（PACE核苷酸）或具有六碳糖之核苷酸。 經修飾之去氧核糖核苷酸包括例如5,〇Me DNA(5_甲基_ 去氧核糖鳥苷-3，-磷酸），其可用作5，末端位置（位置編號υ 上之核苷酸；PACE(去氧核糖腺苷3·亞磷羧基乙酸、去氧 核糖胞苷3’亞磷羧基乙酸、去氧核糖烏苷3，亞磷羧基乙 酸、去氧核糖胸苷3'亞磷羧基乙酸）。 . 橋連核酸包括LNA(2’-〇,4，-C-亞甲基橋連核酸腺苷3,單 磷酸、2，-〇,4，-C-亞曱基橋連核酸5_甲基_胞苷3,單磷酸、 2 〇,4 -C-亞甲基橋連核酸鳥苷3’單磷酸、5_甲基-尿苷（或 胸苦）3,單磷酸）；及ENA(2，_0,4，_C_伸乙基橋連核酸腺芽3, 單磷酸、2’-〇,4’-C-伸乙基橋連核酸5_甲基-胞苷3，單磷酸、 2 0,4-C-伸乙基橋連核酸鳥苷3’單碟酸、5_甲基-尿皆（或 胸苷）3’單磷酸）。 核苷酸/寡核苷酸之所有類似物或修飾均可用於本發 明，其限制條件為該類似物或修飾實質上不會不利地影響 核苷酸/募核苷酸之特性，例如功能。可接受之修飾包括 糖部分之修飾、鹼基部分之修飾、核苷酸間鍵之修飾及其 組合。 糖修飾包括糖殘基之2,部分上之修飾且涵蓋胺基、氟、 烷氧基（例如曱氧基）、烷基、胺基、氟、氣、溴、CN、 CF、咪唑、羧酸酯基、硫代酸酯基（thi〇ate)、〇至（：1〇低 碳烷基、經取代之低碳烷基、烷芳基或芳烷基、〇CF3、 OCN、Ο-烷基、S-烧基或N•院基；〇_烯基、s_稀基或N—稀 基；soch3 ; so2ch3 ; ON〇2 ; N〇2、n3 ;雜環烷基；雜 152508.doc •16- 201124160 環烷芳基；胺基烷基胺基；聚烷基胺基或經取代之石夕燒 基’尤其如歐洲專利EP 〇 586 520 B1或EP 0 618 925 B1中 所述。 在一實施例中’經修飾之siRNA化合物包含至少一個包 含糖部分之2’修飾（「2'糖修飾」）的核糖核苷酸。在某些實 施例中，siRNA化合物包含視情況處於替代位置上之2,〇_ 炫基或2'-氟或2'0-稀丙基或任何其他2’修飾。其他穩定化 修飾亦有可能（例如末端修飾）。在一些實施例中，較佳 2’0-烧基為2Ό-曱基（甲氧基）糖修飾。 在一些實施例中，募核苷酸之主鏈經修飾且包含碟 酸-D-核糖實體’且亦可含有硫代磷酸_D_核糖實體、三 酯、硫代酸酯、2，-5,橋連主鏈（亦可稱作5，-2，）、PACE及其 類似者。 如本文所用之術語「非配對核苷酸類似物」意謂包含非 驗基配對部分之核苷酸類似物，該非鹼基配對部分包括 (但不限於）：6消胺基腺苷（水粉蕈素（Nebularine))、4-Me-0弓丨0朵、3-硝基η比洛、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖 ϋ、N3-Me核糖τ、N3-Me dC、N3-Me-dT、Nl-Me-dG、
Nl-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些實施例中， 非驗基配對核苷酸類似物為核糖核苷酸。在其他實施例 中’非驗基配對核苷酸類似物為去氧核糖核苷酸。另外， 可製備具有一或多個核苷酸之結構基本上改變之聚核脊酸 類似物，且較佳適用作治療或實驗試劑。核苷酸類似物之 一實例為肽核酸（PNA)，其中DNA(或RNA)中之磷酸去氧 152508.doc -17- 201124160 核糖（或核糖）主鏈經與在肽中所發現相似之聚醯胺主鏈置 換。PNA類似物已展示對酶降解具有抗性且在活體内及活 體外穩定性增強。其他修飾包括聚合物主鏈、環狀主鏈、 非環狀主鏈、硫代填酸-D-核糖主鏈、三酯主鏈、硫代酸 主鏈、2’-5'橋連主鏈、人工核酸、N-嗎啉基核酸、二醇核 酸（GNA)、蘇糖核酸（TNA)、阿拉伯糖苷及鏡像核苷（例如 β-L-去氧核糖核苷替代β-D-去氧核糖核苷）。包含LNa核苦 酸之siRNA化合物之實例揭示於Elmen等人（NAR 2005 33(1):439-447)中。 在一些實施例中，本發明之化合物係用一或多種反轉核 苷酸（例如反轉胸苷或反轉腺苷）來合成（參見例如Takei等 人，2002, JBC 277(26):23800-06)。 其他修飾包括3,末端修飾，亦稱作封端部分。該等末端 修飾係選自核苷酸、經修飾之核苷酸、脂質、肽、糖及反 轉無驗基部分。該等修飾係併人例如有義股及/或反義股 之3'末端上。 在本發明中有時稱作「無驗基核苦酸」<「無鹼基核苦 酸類似物」者更適當稱作假核普酸或非f知部分。核苦酸 為核酸之單體單元’由核糖或去氧核糖、嶙酸及驗基（在 腦中為腺嗓呤、鳥”、胸腺錢或胞㈣；在腿中 為腺H鳥嗓吟、尿切或胞組成 '經修飾之核 苦酸在糖、⑽及/或驗基中之—❹者中包含修飾。無 驗基假核Μ缺乏聽，因此在嚴格意義上不為核苦酸。 如本文所狀術語「封端部分」包括Μ基核㈣分、 152508.doc •18- 201124160 無鹼基去氧核糖部分、無鹼基核糖及無鹼基去氧核糖部分 之修飾，包括2Ό烷基修飾；反轉無驗基核糖及無驗基去 氧核糖部分及其修飾；C6-亞胺基-Pi ;鏡像核苷酸，包括 L-DNA及L-RNA ; 5O-Me核苷酸；及核苷酸類似物，包括
4'，5'-亞曱基核苷酸；赤呋喃糖基）核苷酸；4·-硫代 核苷酸、碳環核苷酸；磷酸5'-胺基-烷酯；磷酸1,3-二胺 基-2-丙酯、磷酸3-胺基丙酯；磷酸6-胺基己酯；磷酸12-胺基十二烷酯；磷酸羥基丙酯；1，5_去水己糖醇核苷酸； α-核苷酸；蘇-五呋喃糖基核苷酸；非環狀3，,4，_閉聯核苷 酸（acyclic 3'，4’-seco nucleotide) ; 3,4-二經基丁 基核苦 酸；3,5-二羥基戊基核苷酸、51_5’·反轉無鹼基部分；丨，4_ 丁二醇磷酸酯；5'_胺基；及橋連或非橋連甲基膦酸酯及5'- 魏基部分。 某些較佳封端部分為無鹼基核糖或無鹼基去氧核糖部 刀’反轉無驗基核糖或無驗基去氧核糖部分；C6-胺 基-Pi ;鏡像核苷酸’包括L-DNA及L-RNA。 「烴部分或其衍生物」係指直鏈或分支鏈烷基部分以及 本身或進步包含g忐基（包括醇、填酸二酯、硫代碟酸 西旨、亞磷叛基乙酸醋）之都八 α t X —刀，且亦包括胺、羧酸、酯、 醢胺、酸。「煙部分盘「 丨刀」/、坑基部分」可互換使用。 「末端官能基」包括-夸、 ♦ 」匕符因京、醇、胺、羧酸、酯、醯胺、 駿、酮、鍵之基團。 八如本文所述之術語「非習知部分」係指無驗基核糖部 刀、無鹼基去氧核糖部分、去氧核糖核苦酸、經修飾之去 152508.doc •19· 201124160 氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸、非驗基配對核苷酸類似物及 由2'-5’核苷酸間磷酸酯鍵接合於相鄰核苷酸之核苷酸；橋 連核酸’包括鎖核酸（LNA)及伸乙基橋連核酸（ΕΝΑ)。 無鹼基去氧核糖部分包括例如無鹼基去氧核糖-3'-磷 酸；1，2-二去氧-D-呋喃核糖-3-磷酸；1,4-去水-2-去氧-D-核糖醇-3-磷酸。 反轉無鹼基去氧核糖部分包括反轉無鹼基去氧核糖； 3'，5’反轉無驗基去氧核糖5'-磷酸。 「鏡像」核苷酸為對掌性與天然存在或通常使用之核苷 酸的對掌性相反之核苷酸，亦即天然存在者（D-核苷酸）之 鏡像（L-核苷酸）’在鏡像核糖核苷酸之狀況下亦稱作 L-RNA，及「鏡像異構物（spiegelmer)」。核苷酸可為核糖 核苷酸或去氧核糖核苷酸且可進一步包含至少一種糖、驗 基及/或主鏈修飾。參見美國專利第6,586,238號。同樣， 美國專利第6,602,858號揭示包含至少一種l-核苷酸取代之 核酸催化劑。鏡像核苷酸包括例如L-DNA(L-去氧核糖腺 苷-3'-麟酸（鏡像dA) ; L-去氧核糖胞苷_3，_構酸（鏡像扣）； L-去氧核糖鳥苷-3'-磷酸（鏡像dG) ; L-去氧核糖胸苦_3'_麟 酸（鏡像dT)及L-RNA(L-核糖腺普-3’-鱗酸（鏡像rA) ; L-核 糖胞苷-3'-磷酸（鏡像rC) ; L-核糖鳥苷_3，_磷酸（鏡像rG); L-核糖尿苷-3'-磷酸（鏡像dU)。 根據一態樣’本發明提供包含未經修飾之核糖核苦酸、 經修飾之核糖核苦酸及/或非習知部分的抑制性經修飾之 siRNA化合物。在一些實施例中，經修飾之siRNA化合物 152508.doc -20- 201124160 包含至少一種選自由糖修飾、鹼基修_及核苷酸間鍵修飾 組成之群的經修飾之核苷酸，且可含有經修飾之核苷酸， 諸如LNA(鎖核酸），包括ΕΝΑ(伸乙基橋連核酸）、PNA(肽 核酸）、阿拉伯糖苷、PACE(亞磷羧基乙酸及其衍生物）或 具有六碳糖之核苷酸，或選自以下之非習知部分：無驗基 -核糖部分、無鹼基去氧核糖部分、經修飾或未經修飾之去 氧核糖核苷酸、鏡像核苷酸及由2，-5,核苷酸間磷酸酯鍵接 〇 合於相鄰核苷酸之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核 糖核皆酸為2 OMe糖修飾之核糖核苦酸。 在些實施例中’ siRNA在化合物之3'末端上具有鈍 端，亦即siRNA在由有義股或過客股之3，_末端及反義股或 導引股之5'-末端界定之末端上具有鈍端。 在其他實施例中，兩股中之至少一者在3，_末端上具有含 至少一個核苷酸之3’突出物；該突出物包含至少一個去氧 核糖核苷酸。兩股中之至少一者視情況在3,末端上包含具 〇 有至乂個核苷酸之突出物。該突出物由約1至約5個核苷 酸組成。 在各種實施例中’突出物係獨立地選自核普酸、非核苦 酸及其組合。在$此宭_ , 隹系二貫施例中，各突出物若存在則獨立地 選自核糖核苦酸、麥盡妨抽_ β χ办 甘文去虱核糖核苷酸、無鹼基去氧核糖部 分、無驗基去氧核糖部分、C3_胺基_pi、e4_胺基c5_ 胺基-Pi、C6-胺基_Pi、鏡像核苷酸。 在一些實施例中，Z 、71 >4? A # 乙及/或2各自獨立地包括C2、C3、 C 4、C 5或C 6烧基部分，視愔、、牙或「^「石— 悦『月況為C3[丙烷，-(CH2)3_]部分 152508.doc -21 . 201124160 或”衍生物，包括丙醇（C3_〇h)、丙二醇及丙二酵之麟酸 酉曰衍生物（「C3Pi」）。在較佳實施例中，2及/或z，各自 匕括兩個烴部分，且在某些實例中，為c3pi_c3〇H或 CSPi-CSPi。各C3經由共價鍵（較佳為基於磷醯基之鍵）共價 結合於相鄰C3。在一些實施例中，基於磷醯基之鍵為硫代 鱗酸酯鍵、亞磷羧基乙酸酯鍵或磷酸二酯鍵。 在一特定實施例中’ x=y=19且Z包含C3-C3。在一些實 施例中’ C3-C3突出物經由共價鍵（例如磷酸二酯鍵）共價 連接於（N)x或（N，)y之3'末端。在一些實施例中，第一(：3與 弟二C 3之間的鍵為碟酸二醋鍵。在一些實施例中，3 ’非核 苷酸突出物為C3Pi-C3Pi。在一些實施例中，3'非核苷酸突 出物為C3Pi-C3Ps。在一些實施例中，3'非核苷酸突出物為 C3Pi-C30H(0H為羥基）。在一些實施例中，3’非核苷酸突 出物為 C3Pi-C30H。 在各種實施例中，烷基部分包含烷基衍生物，包括包含 末端羥基、末端胺基或末端磷酸醋基之C3烧基、C4炫* 基、C5烷基或C6烷基部分。在一些實施例中，烷基部分 為C3烷基或C3烷基衍生部分。在一些實施例中，C3烷基 部分包含丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙醋或其組合。 C3烧基部分經由碌酸二醋鍵共價鍵聯於（N')y之3 ’末端及 /或（N)x之3,末端。在一些實施例中，烧基部分包含丙醇、 磷酸丙酯或硫代磷酸丙醋。 在一些實施例中，Z及Z，各自獨立地選自丙醇、構酸丙 酯、硫代磷酸丙酯、其組合或其多者，尤其為2或3個共價 152508.doc •22· 201124160 鍵聯之丙醇、磷酸丙酯、硫代磷酸丙酯或其組合。 在一些實施例中，z及z'各自獨立地選自磷酸丙酯、硫 代磷酸丙酯、丙基磷醯基-丙醇；硫代磷酸丙基磷醯基-丙 酯；磷酸丙基磷醯基-丙酯；（磷酸丙酯）3、（磷酸丙酯）2-丙 醇、硫代磷酸（磷酸丙酯）2-丙酯。Z或Z·中可包括任何結合 丙烷或丙醇之部分。 例示性3'末端非核苷酸部分之結構如下：
在其他實施例中，Z及/或Z’各自包含無鹼基部分與未經 修飾之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之組合或烴部分與未 經修飾之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之組合或無鹼基部 152508.doc -23- 201124160 分（去氧核糖或核糖）與烴部分之組合。在該等實施例中， Z及/或Z'各自包含C3Pi-rAb或C3Pi-dAb。 RNA雙鏈體之長度為約18至約40個核糖核苦酸，較佳為 19至23個核糖核普酸。在一些實施例中，各股（寡聚物）之 長度係獨立地選自由約1 8至約40個鹼基組成之群，較佳為 18至23個鹼基且更佳為19、20或21個核糖核苷酸。 在一些實施例中，經修飾之siRNA化合物之反義股與標 挺核酸之間的互補性為完全互補。在其他實施例中，經修 飾之siRNA化合物之反義股與標靶核酸實質上互補，亦即 f| δ亥反義股與標把核酸之間有一處、兩處或至多三處錯配。 在某些實施例中’本發明經修飾之siRNA化合物之反義 股與有義股之間的互補性為完全互補。在一些實施例中， 該兩股實質上互補’亦即該反義股與該有義股之間有一 處、兩處或至多三處錯配。 本發明之siRNA化合物具有共價鍵結於反義股之5，_末端 且與標靶mRNA中之核苷酸錯配之末端部分。在各種實施 例中，反義股之5'-末端上之部分係選自由以下組成之群：t,/ 核糖尿苷、去氧核糖尿苷、經修飾之核糖尿苷、經修飾之 去氧核糖尿苷、假尿嘧啶、去氧假尿嘧啶、去氧核糖胸 苷、經修飾之去氧核糖胸苷、核糖胞嘧啶、經修飾之核糖 胞嘧啶、去氧核糖胞嘧啶、經修飾之去氧核糖胞嘧啶、5_ 甲基核糖胞嘧啶、經修飾之5_甲基核糖胞嘧啶、5_甲基核 糖尿苷、核糖-2·硫尿苷、核糖_4_硫尿苷、無鹼基核糖部 为及無驗基去氧核糖部分。 152508.doc -24- 201124160 在一些實施例中，本發明經修飾之siRNA化合物在與包 括5’-末端核苷酸之反義股與標靶mRNA中之連續序列完全 互補的siRNA化合物比較時展現增強之活性。 本發明之siRNA結構可有利地應用於適用於抑制或削弱 哺乳動物及非哺乳動物基因表現之雙股RNA。 siRNA募核苷酸 在一態樣中’本發明提供具有下述結構（A)之化合物： 〇 (A) 5’ N^C^x-Z 3,（反義股） 3, Z’-N2-(N，)y-z’’ 5·(有義股） 其中N2、N及Ν’各自為未經修飾或經修飾之核糖核苷酸或 非習知部分； 其中（Ν)χ及（N )y各自為募核普酸，其中各連續ν或ν•藉由 共價鍵接合於相鄰N或N，； 其中X及y各自獨立地為17至39之整數； 其中（N’)y之序列與（N)x之序列互補，且（Ν)χ與標靶rna中 之連續序列互補； 其中N共價鍵結於（n)x，且與標靶RNA錯配或為與標靶 RNA互補之DNA部分； - 纟中Nl為選自由天然或經修飾之尿苷、去氧核糖尿苷、核 ' #料、去氧核糖料、腺苦或去氧腺苦組成之群的部 分； 其2中Z"可存在或不存在’但若存在’則為共價連接於 N2-(N’）y之5’末端的封端部分；及 其中Z及Z，各自獨立地存在或不存在，但若存在，則獨立 152508.doc •25· 201124160 地為共價連接於其所存在股之3,末端的個連續核苷酸、 連續非核苷酸部分或其組合。 在一些實施例中，Ni共價鍵結於（Ν)χ且與標靶rna錯 配。 …在-些實施例中’ N1共價鍵結於（Ν)χ且為與標把驅互 補之DNA部分。 在一些實施例中，N1與N2一起形成華特生_克里克鹼基 對。在其他實施例中，心與…一起形成非華特生_ ^ 驗基對。 在一些實施例中，X=y=18。在其他實施例中，χ=尸Η。 在其他實施例中，x=y=2〇。在較佳實施例中，尸Μ。 在些實施例中，Ν1為經修飾之核糖胞嗔唆或經修飾之 ^尿皆。在之某些實施例中’經修飾之核糖胞喷咬或 :多錦之核糖尿㈣、選自包含5_甲基核糖胞㈣、經修飾 糖甲:核糖胞㈣、”基核糖料、核糖_2_硫尿*及 核糖-4-硫尿苷之群。 在某些實施例中，Ν丨传土鸯白± 啶、經佟飩 係選自由以下組成之群：核糖胞嘧 彡飾之核糖胞嘯咳、去氧核糖胞㈣、經修飾之去 平u t糖胞喷咬、 胞咬咬。在… 經修飾之5_甲基核糖 糖尿苦、去氣枯I施例中’Nl係選自由以下組成之群：核 氧核糖尿苦、、經修飾之核糖尿苦、經修飾之去 f核糖、=咬、去氧假尿㈣、5-甲基核糖尿 N1為去氧核艫…肖糖_4_硫尿苷。在-些實施例中， X胸苷或經修飾之去氧核糖胸苷。 I52508.doc • 26 - 201124160 在-實知你J中，Ν2為經修飾之核*核苦酸或未經修飾 之核糖核苷酸。在某些實施例中，Ν2係選自包含以下之 群：核糖鳥嘌呤、經修飾之核糖鳥嘌呤、去氧鳥嘌呤、經 修飾之去氧鳥嗓吟、核糖尿苦、經修飾之核糖尿普、去氧 :Κ苷4修飾之去氧核糖尿苦、腺_、經修飾之腺 普、去氧腺苦、經修飾之去氧腺苦、核糖胞。密咬、經修飾 =核糖胞㈣、去氧核糖胞•及經修飾之去氧核糖胞痛 Ο Ο 〇定〇 實施例中’ Ν2係選自由以下組成之群：核糖鳥嗓 7經修都之核糖烏嗓吟、去氧鳥嗓吟、核糖尿苦、去氧 ㈣：：、腺普、去氧腺苷、核糖胞料及去氧核糖胞嗔 在其他實施例中’ Ν2係選自由以下組成之群：核糖尿 二核叫去氧核⑽、經修飾之去氧核 苷、經修飾之腺苷、去氧腺苷、經修飾之去氧 =二：物、經修飾之核糖胞_、去氧核謝 疋部之去氧核糖胞0密咬。在其他實施財，Ν2係選 自由以下組成之群：核糖料、經修飾之核糖尿苦、去氧 核糖尿苷、經修飾之去4 冑之去减糖尿4 H經修飾之腺 氧腺普、經修飾之去氧腺普、核糖胞喷咬、經修飾 =亥糖胞t定、去氧核糖胞㈣及經修飾之去氧核糖胞嘧 口定0 在某=施例，’N1係選自由以下組成之群:核謝 氧：T核糖胞㈣、去氧核糖胞㈣、經修飾之去 乳核糖胞切、5_甲基核糖胞喷唆及經修飾之5_甲基核糖 152508.doc •27- 201124160 胞嘧啶’且N2係選自由以下組 飾之核糖烏嗓呤、去查良〜 鳥…經修 ^ 7 去氧烏嘌呤、核糖尿苷、去4枋 苷、腺苷、去氧臆贫A 去虱核糖尿 *乳腺彳、核糖胞濟唆及去氧核糖胞喷啶。 一些實施例中，N丨係選自由以下组成 苷、去氧桉撼历社 下、，.成之群.核糖尿 糖D 修飾之核糖料、經修飾之去氧核 2尿音、假尿。㈣、去氧假尿㈣、5_甲基核糖尿芽、核 群:2-:: *及核糖_心硫尿苦，且n2係選自由以下組成之 ^尿苷、經修飾之核糖尿苷、去氧核糖尿苷、經修 :之去氧核糖尿#、㈣、經修飾之料、去氧腺普、、: 修飾之去氧腺苦、核糖胞❹、經修飾之核糖胞心、去 氧核糖胞嘧啶及經修飾之去氧核糖胞嘧啶。 在某-實施例中，N1為去氧核糖胸芽或經修飾之去氧核 糖胸苦，且N2係選自由以下組成之群：核糖尿苦、經修飾 之核糖尿苦、去氧核糖尿普、經修飾之去氧核糖尿芽、腺 苷、經修飾之腺苦、去氧腺脊、經修飾之去氧腺普、核糖 胞嘧咬、經修飾之核糖胞㈣、去氧核糖胞射及經修飾 之去氧核糖胞嘧啶。 在結構（A)之一些實施例中，Nl包含2,〇Me糖修飾之核糖 尿苦或2戰糖修飾之核糖胞嘧啶。在結構⑷之某些實施 例中，N2包含2,〇Me糖修飾之核糖核苷酸。 在-些實施例中，Z及Z,不存在。在其他實施例中，2或 Z1中之一者存在。 在各種實施例中，Z及Z，係獨立地選自核苷酸、非核苷 酸及其組合。在某些實施例中 ’ Z及Z’各自若存在，則獨 152508.doc -28· 201124160 立地選自核糖核苷酸、去氧核糖核苦酸、無鹼基去氧核糖 部分、無鹼基去氧核糖部分、C%胺基_pi、C4_胺基_pi、 C5-胺基-Ρ!、C6-胺基-Pi、鏡像核苷酸。在一些實施例 中，Z存在。在其他實施例中，z，存在。在其他實施例 中，Z與Z’皆存在。在一些實施例中，2與乙存在且相同。 在其他實施例中，Z與P存在且不同。在一些實施例中，z 及Z獨立地為1、2、3、4或5個非核苷酸部分、或2、3、4 0 或5個非核苷酸部分與核苷酸之組合。在一些實施例中，z 及/或Z’各自包含經由磷酸二酯鍵共價鍵聯於siRNA股之3· 末端的2個非核苷酸部分。在一些實施例中，2及2，存在且 各自獨立地包含一或多個烷基部分及/或其衍生物。在一 些實施例中，N2包含核糖腺苷，且Νι包含尿苷（核糖尿 芽）。 非核苷酸部分係選自由以下組成之群：無鹼基部分、反 轉無驗基部分、烷基部分或其衍生物及無機磷酸根。在一 〇 些實施例中’非核苷酸部分為烷基部分或其衍生物。在— 些實施例中’烷基部分包含末端官能基，包括醇、末端 胺、末端磷酸酯或末端硫代磷酸酯部分。 在—些實施例中，Z存在且包含一或多個選自由以下組 成之群的非核苷酸部分：無鹼基部分、反轉無鹼基部分、 部分或其衍生物及無機磷酸根。在一些實施例中，乙存 在且包含一或多個烷基部分及/或其衍生物。 在其他實施例中，Z，存在且包含一或多個選自由以下組 成之群的非核苷酸部分：無鹼基部分、反轉無鹼基部分、 1525〇8.d〇c •29- 201124160 烴部分及無機磷酸根。在一些實施例中，z，存在且包含一 或多個烷基部分及/或其衍生物。 在其他實施例中，x=y=i8，且z或z，存在且獨立地包含2 個非核苦酸部分。 在其他實施例中，x=y=18，且Z及Z，存在且各自獨立地 包含2個非核苷酸部分。 在一些實施例中，Z及Z’各自包括無鹼基部分，例如無 驗基去氧核糖部分（本文稱作「dAb」）或無鹼基核糖部分 (本文稱作「rAb」）。在一些實施例中，Z及/或Z，各自包含 2個共價鍵聯之無驗基部分’且為例如dAb-dAb或rAb-rAb 或dAb-rAb或rAb-dAb。各部分經由共價鍵（較佳為基於磷 酿基之鍵）共價結合於相鄰部分。在一些實施例中，基於 磷醯基之鍵為硫代磷酸酯鍵、亞磷羧基乙酸酯鍵或填酸二 酉旨鍵。 在一些實施例中，Z及/或Z，各自獨立地包括烷基部分， 視情況為丙院[(CH2)3]部分或其衍生物，包括丙醇（C3-OH) 及丙二醇之磷醯基衍生物（「C3-3，Pi」）。在一些實施例 中’ Z及/或Z1各自包括2個煙部分，且在某些實例中，為 C3-C3。各C3經由共價鍵（較佳為基於破酿基之鍵）共價結 合於相鄰C3。在一些實施例中’基於填酿基之鍵為硫代鱗 酸酯鍵、亞磷鲮基乙酸酯鍵或磷酸二酯鍵。 在一特定實施例中’ x=y=18且Z包含C3Pi-C30H或 C3Pi-C3Pi。在一特定實施例中，x=y=i8且z包含c3Pi-C30H 或C3Pi-C3Pi。在一些實施例中，C3-C3突出物經由共價鍵 152508.doc • 30· 201124160 (例如磷酸二酯鍵）共價連接於（N)x或（N’)y之3,末端。在一 些實施例中，第一C3與第二C3之間的鍵為磷酸二酯鍵。 在各種實施例中，烧基部分為包含末端羥基、末端胺 基、末端磷酸酯基之C3烷基至C6烷基部分。在一些實施 例中，烷基部分為C3烷基部分《在一些實施例中，C3烷 基部分包含丙醇、磷酸丙醋、硫代鱗酸丙S旨或其組合。 C3烷基部分經由磷酸二酯鍵共價鍵聯於（N')y之3 ’末端及/ 或（N)x之3'末端。在一些實施例中，烷基部分包含丙醇、 磷酸丙酯或硫代磷酸丙酯。 在一些實施例中，Z及乙各自獨立地選自丙醇、磷酸丙 酯、硫代磷酸丙酯、其組合或其多者。 在一些實施例中，Ζ及Ζ'各自獨立地選自磷酸丙酯、硫 代磷酸丙酯、丙基磷醯基-丙醇；硫代磷酸丙基磷醯基-丙 酯；磷酸丙基磷醯基-丙酯；（磷酸丙酯）3、（磷酸丙酯）2_丙 醇、硫代磷酸（磷酸丙酯）2-丙酯。Ζ或Ζ’中可包括任何結合 丙烧或丙醇之部分。 在其他實施例十，Ζ及/或Ζ’各自包含無鹼基部分與未經 修飾之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之組合或烴部分與未 經修飾之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸之組合或無鹼基部 分（去氧核糖或核糖）與烴部分之組合。在該等實施例中， Ζ及/或Ζ1各自包含C3-rAb或C3-dAb。 在較佳實施例中，x=y=18，Z1不存在，Z存在且包含2個 彼此經由磷酸二酯鍵共價鍵聯之烷基部分’ N2包含核糖腺 苷，且N1包含尿苷。 152508.doc -31 - 201124160 在一些實施例中’ N及Ν’包含未經修飾之核苷酸。在一 些實施例中，Ν或Ν，中之至少一者包含經化學修飾之核糖 核皆酸或非習知部分。在一些實施例中，非習知部分係選 自由以下組成之群：鏡像核苷酸、無鹼基核糖部分、無鹼 基去氧核糖部分、去氧核糖核苷酸、經修飾之去氧核糖核 苷酸、鏡像核苷酸、非鹼基配對核苷酸類似物、橋連核酸 及由2’-5’核苷酸間磷酸酯鍵接合於相鄰核苷酸之核苷酸。 在一些實施例中，非習知部分為鏡像核苷酸，較佳為 L-DNA部分。在一些實施例中，Ν*Ν，中之至少一者在 糖、鹼基或連接子中之一或多處經修飾。在某些實施例 中，Ν或Ν，中之至少一者為2,〇^^糖修飾之核糖核苷酸。 在某些實施例中，（Ν)χ與（N')y完全互補❶在其他實施例 中，（N)x與（N’)y實質上互補。在某些實施例中，（Ν)χ與標 靶序列完全互補。在其他實施例中，（Ν)χ與標靶序列實質 上互補。根據某些較佳實施例，本發明提供包含一或多個 經修飾之核苷酸的經修飾之siRNA化合物，其中該經修飾 之核苷酸在糖部分、鹼基部分或核苷酸間鍵部分中具有修 飾0 在結構（A)化合物之某些實施例中，（Ν)χ及（N，）y中每一者 之交替核糖核苷酸為2，_OMe糖修飾之核糖核苷酸。在結構 (A)之一些實施例中’（Ν)χ中，核苷酸未經修飾，或（Ν)χ包 3交替的2'OMe糖修飾之核糖核苷酸與未經修飾之核糖核 苦酸’且Ν1-^^之中間位置上的核糖核苷酸經修飾或未 經修倚’較佳未經修飾；纟中（N,)y包含在末端或次末端位 152508.doc •32· 201124160 置上進-步包含一個經修飾之核苦酸的未經修飾之核糖核 苷酸。 在特定實施例中’ x=y=18，Nl包含2OMe糖修飾之核糖 核苷酸，（N)X包含2,0Me糖修飾之核糖核苷酸，且位於 中間處的核糖核苷酸未經修飾。在一些實施例 中，處於（N，）y之5,及3,末端中之任一者或兩者上的至少一 個核苦酸由2，-5,峨酸二醋鍵接合。在一些實施例中，^藉 0 由2’-5,磷酸二酯鍵接合於（N)x之5,末端。在一些實施例 中，處於（N，)x之5,及3,末端中之任一者或兩者上的至少一 個核苷酸由2，-5,磷酸二酯鍵接合。在一些實施例中，π藉 由2 -5磷酸二酯鍵接合於…炒之3，末端。在某些實施例 中一1 8，（N)x中，核苷酸在經修飾之核糖核苷酸與未 經修飾之核糖核苷酸之間交替，各經修飾之核糖核苷酸為 2 OMe糖修飾之核糖核苷酸，且位κΝι_(Ν)χ中間處之核糖 核苷酸未經修飾；Ν2由2，_5,磷酸二酯鍵接合於（1^炒之3，末 ❹ 且（N)y之3末端上的至少兩個核普酸由兩個2，_5•碳酸 一 S曰鍵接合。在其他較佳實施例中，x=y=丨8 ; (Ν)χ中，核 苷酸在經修飾之核糖核苷酸與未經修飾之核糖核苷酸之間 交替，各經修飾之核糖核苷酸為2'-〇Me糖修飾之核糖核苷 酸’且位於Ν1-"#中間處之核糖核苷酸未經修飾；且 (N’）y之5’末端上的至少三個連續核苷酸由三個2,_5,罐酸二 S旨鍵接合。在另一實施例中，位於N2-(N)y之中間位置上 的核苷酸（亦即位置1 〇上之核苷酸）為2,〇Me糖修飾之核糖 核苷酸。在另一較佳實施例中，（Ν)χ中，核苷酸在2，-〇Me 152508.doc •33· 201124160 糖修飾之核糖核苷酸與未經修飾之核糖核苷酸之間交替， 且（N>中，5·末端上之四個連續核苷酸由三個2,_5，磷酸二 西曰鍵接合，且5’末端核苷酸或5,末端上之兩個或三個連續 核苷酸包含3'-〇Me糖修飾。 在某些較佳實施例中，x=y=1 8，且（N,)y中，至少一個 位置上之核苷酸包含鏡像核苷酸、去氧核糖核苷酸及由 2^5’核苷酸間鍵接合於相鄰核苷酸之核苷酸。 在某些實施例中，含鏡像核苷酸。在 各種實施例中，鏡像核苷酸為L_DNA核苷酸。在某些實施 例中，L-DNA為L-去氧核糖胞苷。在一些實施例中，（N，)y 在位置17上包含L-DNA。在其他實施例中，（N，）y在位置16 及17上包含L-DNA。在某些實施例中，（N,)y在位置i以及 在位置16與17中之一者或兩者上包含L-DNA核苷酸。 在其他實施例中’（N，）y在位置14上包含DNA，且在位置 16與17中之一者或兩者上包含L_DNA。在該結構中，位置 1可進一步包含L-DNA或無鹼基非習知部分。 在其他實施例中，x=y=20，上文所論述之（N，）y之修飾 處於位置17、18、19、20上而非位置丨4、15、16、17上。 舉例而言，對於20聚體而言，位置16與17中之一者或兩者 上之修飾處於位置18或19中之一者或兩者上。18聚體之所 有修飾同樣適用於20聚體及22聚體。 根據各種實施例，在N2-(N')y中，N2由2'-5'磷酸二酿鍵 接合於（N)y之3,末端，且在（N，）y中，3,末端上之1、2、3、 4 5、6、7、8、9、10、11、12或13個連續核糖核苷酸由 152508.doc -34- 201124160 2-5’核苷酸間鍵鍵聯。在一實施例中，N、2，_5,磷酸二酯 鍵接口於（N)y之3'末端，且（N,)y23,末端上之三個連續核 苷酸由一個2 -5磷酸二酯鍵接合，其中形成2,_5，磷酸二酯 鍵之一或多個2’-5’核苷酸進一步包含3，_〇Me糖修飾。在一 二貫％例中，N包含2'-〇Me糖修飾。在其他實施例中， • (Ν)Υ之3’末端核苷酸包含2，-OMe糖修飾。在某些實施例 中，且在（N，)yt ’位置 14、15、16、17及18上 〇 之兩個或兩個以上連續核苷酸包含由2,-5,核苷酸間鍵接合 於相鄰核苷酸之核苦。在各種實施例巾，形成2，·5Ι核苦 酸間鍵之核苷酸包含3’去氧核糖核苷酸或3，甲氧基核苷 酸。在一些實施例中，（N，)y中位置16與17上之核苷酸由 2 -5核苷酸間鍵接合。在其他實施例中，（N，)y中位置 15-16、16-17或15-17上之核苷酸由2’-5’核苷酸間鍵接合。 在某些實施例中，（N，)y在位置2上包含L-DNA且在位置 15-16、16-17或15-17上包含2，-5,核苷酸間鍵。 〇 在一實施例中，（N，)y之3,末端核苷酸或3,末端上之兩或 三個連續核苷酸為L-去氧核糖核苷酸。 在其他實施例中，在N2-(N，)y中，N2為2,糖修飾之核苷 酸’且在（N’）y中，（N，)y任一末端上之 6、7、8、9、10、11、12或13個連續核糖核苷酸或5•及3, 末端中之每一者上之1至7個經修飾之核苷酸獨立地為2，糖 修飾之核苷酸。在一些實施例中，2'糖修飾包含存在胺 基、氟、院氧基或炫基部分。在某些實施例中，2,糖修飾 包含甲氧基部分（2’-OMe)。在一系列實施例中，（NI)y之5| 152508.doc -35- 201124160 末端上之三、四或五個連續核苷酸包含2，_〇Me修飾。在另 一實施例中，N2以及（N，）y之3,末端上之兩個連續核皆酸包 含2'-OMe修飾。 在一些實施例中，在（N，)y中5,及3,末端中之任一者上之 1 2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、11、12或13個連續核 糖核苷酸或5’及3’末端中之每一者上之丨至7個經修飾之核 苷酸獨立地為雙環核苷酸。在各種實施例中，雙環核苷酸 為鎖核酸（LNA)或LNA類，例如2，_〇,4，_c_伸乙基橋連核酸 (ΕΝΑ)為 LNA類。 在各種實施例中，（Ν，Μ 5,末端上或在3,與51末端上包 含經修飾之核苷酸。 在一些實施例中，（>1|>之5,上之至少兩個核苦酸由？_乙 氧基主鏈修飾接合。在一些實施例中，（N，）y23，上之N2由 p-乙氧基主鏈修飾接合。在某些實施例中，x=y=i8且其中 在（N)x中，核苷酸在經修飾之核糖核苷酸與未經修飾之核 糖核苦酸之間交替，各經修飾之核糖核芽酸為2,〇Me糖修 飾之核糖核#酸，且位於以_降之中間位置上的核糖核 苷酸未經修飾；Νι為2,0Me糖修飾之核糖核苷酸，且（N,)y 之3末端上之三個連續核㈣由兩個p_乙氧基主鍵修韩接 合，或（N，）y之5,末端上之四個連續核苦酸由三個p_乙氧基 主鏈修飾接合。在另一實施例中，（N，)y23，上之Μ 氧基主鏈修飾接合。 在-些實施例中，在（N，)y中，5，及3，末端中之每一者上 之1、2、3、4、5、6或7個連續核糖核苷酸獨立地為鏡像 152508.doc -36- 201124160 核苷酉文& 2 -5'鱗酸二醋鍵接合之核#酸、2,糖修飾之核 芽酸或雙環核*酸。在一實施例中，师之5，及3|末端二 之修飾相同。在-實施例中，（N，)y之5·末端上之四個連續 核普酸由三個2，_5|磷酸二酯鍵接合，且（>^%之3，末端上之 兩或二個連續核苷酸由兩個2，_5,磷酸二酯鍵接合。在另一 只施例中，（N)y之3,上之N2由2，-5,填酸二醋鍵接合於（N，）y 之3’末端。在另-實施例中’ (N，)y之5,末端上之修飾不同 於（N’）y之3’末端上之修飾。在—特定實施例中，之 末端上的經修飾之核苷酸為鏡像核苷酸，且（1^>之3，末端 上的經修飾之核苷酸由2，_5，磷酸二醋鍵接合。在另一特定 實施例中，（N，）y之5，末端上之三個連續核苷酸為LNA核苷 酸，且（N，）y之3’末端上之兩個連續核苷酸由兩個2,_5，磷酸 二酯鍵接合。在（N)X中，核苷酸在2,〇肘6糖修飾之核糖核 苷酸與未經修飾之核糖核苷酸之間交替，且位於Νΐ_(Ν)χ 中間處之核糖核普酸未經修飾。 在各種實施例中，N2由2，-5|碟酸二酯鍵接合於（N，）y23, 末端，且（N)x之3末端上之兩或三個連續核苷酸由一或兩 個2’-5’磷酸二酯鍵接合。在一些實施例中，N2由2,_5,磷酸 二酯鍵接合於（N，）y之3,末端，且（Ν,)χ之3,末端上之兩或三 個連續核苷酸由一或兩個2，-5'鱗酸二酯鍵接合，且3,末端 上之一個或兩個或三個連續核苷酸包含3，_〇Me糖修飾。在 另一實施例中，N2包含3，-〇Me糖修飾。 在另一實施例中’本發明提供如下化合物，其中x=y=18 且其中在（N)x中，核苷酸在經修飾之核糖核苷酸與未經修 152508.doc •37· 201124160 飾之核糖核*酸之間交替，各經修飾之核糖核普酸為 ^ OMe糖修飾之核糖核替酸且位於ν1 _(Ν)χ中間處之核糖核 苦酸未經修飾；（叫之3,末端上之兩個核㈣由兩個2，-5, 鱗酸二醋鍵接合，且(取5’末端上之三個核普酸為 ’諸如職。在另-實施例中，Ν2由2、5,磷酸二酯鍵 接合於（N')y之3,末端上。 實把例中，（N )y之5 '末端上之五個連續核苷酸包 含2'OMe糖修飾，且（心之3,末端上之兩個連續核普酸為 L-DNA。 在另一實施例中，本發明提供如下化合物，其中 x=y=18，其中（N)X由未經修飾之核糖核苷酸組成；（N，）y之 3·末端上之兩個連續核苷酸由2，_5,磷酸二酯鍵接合，且 (N’)y之5’末端上之三個連續核苷酸為LNA，諸如ena。在 另實施例中，N2由2'-5'磷酸二酯鍵接合於（N，)y之3，末 端。 根據其他實施例，在（N，)y中，5·或3,末端核苷酸或5，及3, 末&中任一末端上之2、3、4、5或6個連續核苷酸或5'及3, 末端中之每一者上之1至4個核苷酸獨立地為亞磷羧基羧酸 或膦基羧酸核苷酸（PACE核苷酸）。在一些實施例中， PACE核苷酸為去氧核糖核苷酸。在一些較佳實施例中， 在（N’)y中，5’及3'末端中每一者上之】或2個連續核苷酸為 PACE核苦酸。 在一些實施例中，本發明經修飾之siRNA化合物之兩股 在3 ’及5 ’末端處皆未填酸化。在其他實施例中，有義股及 152508.doc • 38 · 201124160 反義股在3'末端處磷酸化。在另一實施例中，反義股在末 端5'末端位置處使用可裂解或不可裂解之磷酸酯基磷酸 化。在另一實施例中，反義股與有義股中之任一者或兩者 在3'末端位置處使用可裂解或不可裂解之磷酸酯基磷酸 化。 結構（A)適用於針對哺乳動物或非哺乳動物基因之任何 募核苷酸對（有義股及反義股）。在一些實施例中，哺乳動 物基因為人類基因。寡核苷酸序列對之實例提供於PCT專 利公開案第 WO 2006/023544號、第 WO 2007/084684號、 第 WO 2008/050329 號、第 WO 2007/141796 號、第 WO 2009/044392號、第 WO 2008/106102號、第 WO 2008/152636 號、第 WO 2009/001359號、第 WO/2009/090639號中，該 等公開案讓渡於本發明之受讓人且以全文引用之方式併入 本文中。 除非另外指示，否則在本文所論述之結構之較佳實施例 中，各連續N與Ν’之間的共價鍵為磷酸二酯鍵。除非另外 指示’否則在本文所論述之結構之較佳實施例中，Ν1與 (Ν)χ之間及Ν2與（N')y之間的共價鍵為磷酸二酯鍵。在一些 實施例中’至少一個共價鍵為硫代磷酸酯鍵。 對於所有上述結構’在一些實施例中，（N)x之寡核苷酸 序列與（N')y之寡核苷酸序列完全互補。在其他實施例中， 反義股與有義股實質上互補。在某些實施例中，（N)x與哺 乳動物mRNA或微生物RNA或病毒RNA完全互補。在其他 實施例中’（N)x與哺乳動物mRNA或微生物RNA或病毒 152508.doc •39- 201124160 RNA實質上互補。 在一些實施例中，具有結構（A)之經修飾之siRNA化合物 在相較於N1與標靶mRNA中之核苷酸互補之siRNA化合物 時展現有利之特性，至少包括增強之活性。 本發明另外提供一種醫藥組合物，其包含有效抑制哺乳 動物或非哺乳動物基因表現之量的本發明結構（A)化合物 及醫藥學上可接受之載劑；以及其用於治療本文所揭示之 疾病及病症中之任一者的用途。在一些實施例中哺乳動 物基因為人類基因。在一些實施例中，非哺乳動物基因與 哺乳動物疾病、較佳人類疾病有關。 本發明另外係關於治療或預防有需要之個體的本文所揭 不之疾病或病狀中之任一者發生或嚴重或降低本文所揭示 之疾病或病狀之風險或嚴重度的方法，其中該疾病或病狀 及/或與其相關之症狀或風險與哺乳動物或非哺乳動物基 因表現相關。在一較佳實施例中，個體為人類個體。 siRNA合成 使用公用及專屬算法，產生潛在siRNAi有義及反義序 列，且siRNA之N1及/或N2經取代以產生結構（A)之經修飾 之siRNA化合物。 根據上述說明之siRNA分子基本上如本文所述來製備。 本發明之經修飾之siRNA化合物係藉由此項技術中熟知用 於合成核糖核酸（或去氧核糖核酸）寡核苷酸之任何方法來 &成。合成通常在市售合成器（尤其自Applied Bi〇systems 付到）中進行。寡核普酸合成例如描述於Beaucage及iyer. 152508.doc 40· 201124160
Tetrahedron 1992; 48:2223-231 1 ； Beaucage 及 Iyer,
Tetrahedron 1993; 49: 6123-6194 ;及 Caruthers 等人， Methods Enzymol. 1987; 154: 287-313 中；硫代酸酉旨之合成 尤其描述於 Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 1985; 54: 367-402 中，RNA分子之合成描述於 Sproat，Humana Press 2005，Herdewijn P.編；Kap. 2: 17-3 1 中，且各別下游方法 尤其描述於 Pingoud等人，IRL Press 1989, Oliver R.W.A. 編；Kap. 7: 183-208 中。 其他合成程序為此項技術中所知，例如Usman等人， 1987, J. Am. Chem. Soc·，109, 7845 ; Scaringe等人，1990, NAR·，18，5433 ; Wincott 等人，1995, NAR. 23，2677-2684 ；及 Wincott等人，1997, Methods Mol. Bio.，74, 59 中 所述之程序可利用常見核酸保護基及偶合基，諸如5'-末端 上之二曱氧基三苯曱基及3'-末端上之胺基磷酸酯。必要時 併入經修飾（例如2'-0-甲基化）之核苷酸及未經修飾之核苷 酸。 在一些實施例中，單獨合成本發明之寡核苷酸且在合成 後例如藉由接合（Moore等人，1992, Science 256, 9923 ; Draper等人，國際專利公開案第WO 93/23569號； Shabarova等人，1991, NAR 19, 4247 ; Bellon等人，1997, Nucleosides & Nucleotides, 16，951 ; Bellon等人，1997, Bioconjugate Chem. 8, 204)或藉由在合成及/或脫除保護基 後進行雜交而接合於一起。 化學合成之片段的重疊對可使用此項技術中熟知之方法 152508.doc -41 - 201124160 (例如參見美國專利第6，121，426號）接合。卩獨合成各股， 接著在管中彼此黏接。接著，藉由HPLC將雙股仙職邀未 黏接之單股寡核皆酸(例如由於其中一者過量)分離。關於 本發明之經修飾之siRNA化合物，可合成兩個或兩個以上 該等序列且將其鍵聯於一起以用於本發明中。 本發明之siRNA化合物具有共價鍵結於反義股之义末端 上且與標數mRNA中之核苦酸錯配的末端部分。在各種實 施例中，反義股之5，_末端上之部分係選自由以下組成之 群：核糖尿芽、去氧核糖尿苷、經修飾之核糖尿普、經修 飾之去氧核糖尿苷、假尿嘧啶、去氧假尿嘧啶、去氧核糖 胸苷、經修飾之去氧核糖胸苷、核糖胞嘧啶、經修飾之核 糖胞嘧啶、去氧核糖胞嘧啶、經修飾之去氧核糖胞嘧啶、 5-甲基核糖胞嘧啶、經修飾之5_甲基核糖胞嘧啶、5_甲基 核糖尿苷、核糖_2_硫尿苷、核糖_4_硫尿苷、無鹼基核糖 邛刀及無驗基去氧核糖部分，且有義股之3，_末端上之部分 係選自核糖核苷酸或經修飾之核糖核苷酸或非習知部分。 本發明之siRNA結構可有利地應用於適用於抑制或削弱哺 乳動物及非哺乳動物基因表現之雙股RNA。 醫藥組合物 雖然本發明之化合物可呈化學原料形式投與，但較佳呈 醫藥組合物形式提供。因此，本發明提供一種醫藥組合 物’其包含一或多種本發明之經修飾之siRNA化合物以及 醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥組合物包 含兩種或兩種以上本發明之經修飾之siRNA化合物。 152508.doc -42- 201124160 本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含有效抑制標 靶基因之量的至少一種共價或非共價鍵結於一或多種本發 明化合物之本發明化合物以及醫藥學上可接受之載劑。在 一些實施例中，經修飾之siRNA化合物藉由内源性細胞複 合物細胞内加工，產生一或多種本發明之寡核糖核普酸。 本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可 接受之載劑及有效下調標靶基因在哺乳動物體内細胞中表 現之量的一或多種本發明之經修飾之siRNA化合物，該一 或多種化合物包含與標靶mRNA之序列實質上互補的序 列。 在一些實施例中，本發明之經修飾之siRNA化合物為醫 藥組合物中之主要活性組分。在其他實施例中，本發明之 經修飾之siRNA化合物為含有兩種或兩種以上siRNA之醫 藥組合物中的活性組分之一，該醫藥組合物另外包含一或 多種靶向一或多種標靶基因之siRNA化合物。 本發明亦提供一種製備醫藥組合物之方法，其包含： 提供一或多種本發明之經修飾之雙股siRNA化合物；及 將該化合物與醫藥學上可接受之載劑混合。 在一較佳實施例中，將醫藥有效劑量的用於製備醫藥組 合物之經修飾之siRNA化合物與載劑混合。在一些實施例 中，本發明之經修飾之siRNA化合物結合於類固醇或脂質 或另一適合分子，例如膽固醇。 RNA干擾 近來已公開大量與RNAi現象有關之PCT申請案。此等公 152508.doc -43- 201124160
開案包括：PCT公開案WO 00/44895 ; PCT公開案WO 00/49035 ; PCT 公開案 WO 00/63364 ; PCT 公開案 WO
01/36641 ; PCT 公開案 WO 01/36646 ; PCT 公開案 WO
99/32619 ; PCT 公開案 WO 00/44914 ; PCT 公開案 WO 01/29058 ;及 PCT公開案 WO 01/75164。 RNA干擾（RNAi)係基於dsRNA物質進入細胞質蛋白質複 合物中之能力，其中dsRNA物質接著把向互補細胞RNA且 特異性降解其。RNA干擾反應特徵在於含有siRNA之核酸 内切酶複合物，通常稱作RNA誘導之沉默複合物（RISC)， 其介導序列與siRNA雙鏈體之反義股互補的單股RNA裂 解。標靶RNA之裂解可發生在與siRNA雙鏈體之反義股互 補之區域的中間（Elbashir等人，Genes Dev., 2001， 15(2):188-200)。更詳細而言，較長dsRNA由III型核糖核 酸酶（DICER、DROSHA 等；Bernstein 等人，Nature，2001, 409(6818):363-6 ; Lee等人，Nature, 2003, 425(6956):415-9) 消化成短（17-29 bp)dsRNA片段（亦稱作短抑制性RNA、 「siRNA」）。RISC蛋白質複合物識別此等片段及互補 mRNA。整個過程以核酸内切酶使標靶mRNA裂解而告結 (McManus及 Sharp, Nature Rev Genet, 2002，3(10):737-47 ; Paddison及Hannon, Curr Opin Mol Ther. 2003，5(3):217-24)。 (關於此等術語及所提出之機制的額外資訊，參見例如 Bernstein等人，RNA 2001，7(11):1509-21 ; Nishikura，Cell 2001，107(4):41 5-8及 PCT公開案 WO 01/36646)。 已廣泛報導對應於已知基因之siRNA的選擇及合成；參 152508.doc -44- 201124160 見例如 Ui-Tei 等人，J Biomed Biotechnol. 2006; 2006: 65052 ; Chalk等人，BBRC. 2004, 319(1): 264-74 ; Sioud及 Leirdal, Met. Mol Biol.; 2004，252:457-69 ; Levenkova等 人，Bioinform. 2004，20(3):430-2 ; Ui-Tei等人，Nuc. Acid Res· 2004，32(3):936-48。關於經修飾之siRNA之使用及產 生的實例，參見 Braasch 等人，Biochem.，2003，42(26): 7967-75 ; Chiu等人，RNA，2003, 9(9): 1034-48 ; PCT公開 案 WO 2004/015107(Atugen); WO 02/44321(Tuschl 等人）及 美國專利第5,898,031號及第6,107,094號。 siRNA及RNA干擾 RNA干擾（RNAi)為涉及雙股（ds)RNA依賴性基因特異性 轉錄後沉默的現象。一開始，研究此現象及以實驗方式操 作哺乳動物細胞之嘗試由可回應於長dsRNA分子而活化之 活性非特異性抗病毒防禦機制阻撓（Gil等人，Apoptosis， 2000. 5:107-114)。隨後，發現具有21個核苷酸之RNA之合 成雙鏈體可在哺乳動物細胞中介導基因特異性RNAi而不 刺激一般抗病毒防禦機制（參見Elbashir等人，Nature 2001, 411:494-498 及 Caplen 等人，PNAS USA 2001, 98:9742-9747)。因此，小干擾RNA(siRNA)成為試圖瞭解基因功能 的有效工具。 哺乳動物體内RNA干擾（RNAi)係由小干擾RNA(siRNA) (Fire 等人，Nature 1998，391:806)或微 RNA(miRNA) (Ambros, Nature 2004, 431(7006):350-355 - Bartel, Cell 2004, 116(2): 281-97)介導。植物中之相應過程常稱作特異 152508.doc •45· 201124160 性轉錄後基因沉默（PTGS)或RNA沉默且在真菌中亦稱作壓 制。 siRNA為一種雙股RNA或經修飾之RNA分子，其下調或 沉默（阻止）其内源性（細胞）對應物之基因/mRNA表現。下 文詳述RNA干擾之機制。 若干研究揭露siRNA治療劑在活體内對哺乳動物及人類 皆有效。Bitko等人已展示針對呼吸道細胞融合性病毒 (RSV)核衣殼N基因之特異性siRNA分子在經鼻内投與時有 效地治療小鼠（Nat. Med. 2005, 11(1):50-55)。可參見論述 siRNA治療劑之近期評述（Barik等人，J. Mol. Med 2005, 83:764-773 ; Dallas 及 Vlassov, Med. Sci. Monitor 2006, 12(4):RA67-74 ； Chakraborty, Current Drug Targets 2007, 8(3):469-82 ； Dykxhoorn 等人，Gene Therapy 2006. 13:541-552)。
Mucke(IDrugs 2007 10( 1):37-41)作出對當前用於治療眼 部疾病（例如年齡相關之黃斑變性（AMD)及青光眼）之包括 針對各種標靶之siRNA的治療劑之評述。 siRNA結構 已廣泛報導對應於已知基因之siRNA的選擇及合成；（參 見例如 Ui-Tei 等人，J Biomed Biotech. 2006; 2006: 65052 ; Chalk等人，BBRC. 2004, 319(1): 264-74 ; Sioud及 Leirdal, Met. Mol Biol.; 2004, 252:457-69 ; Levenkova等 人，Bioinform. 2004，20(3):430-2 ; Ui-Tei 等人，NAR· 2004, 32(3):936-48 ； De Paula 等人，RNA 2007，13:431- 152508.doc •46- 201124160 56) ° 關於經修飾之siRNA之使用及產生的實例，參見例如 Braasch等人，Biochem. 2003，42(26):7967-75 ; Chiu等人， RNA, 2003，9(9):1034-48 ; PCT 公開案 WO 2004/015107 (atugen AG)及 WO 02/44321(Tuschl等人）。美國專利第 5,898,031號及第6，107,094號描述經化學修飾之募聚物。美 國專利公開案第2005/0080246號及第2005/0042647號分別 提及具有交替基元之募聚化合物及具有經化學修飾之核苷 間鍵之dsRNA化合物。 其他修飾業已揭示。納入5'-磷酸酯部分展示會增強 siRNA在果織（Drosophila)胚胎中之活性（Boutla等人，Curr. Biol· 2001, 11:1776-1780)且為 siRNA 在人類海拉細胞（HeLa cell)中發揮功能所需（Schwarz 等人，Mol. Cell, 2002, 10:537-48)。Amarzguioui等人（NAR，2003, 31(2):589-95)展 示siRNA活性視2'-0-甲基修飾之定位而定。Holen等人 (NAR. 2003，31(9):2401-07)報導具有少量2'-0-甲基修飾之 核苷的siRNA與野生型相比具有良好活性，但活性隨著2’-0-甲基修飾之核苷的數目增加而降低。Chiu及Rana(RNA. 2003, 9:1034-48)描述相對於未經修飾之siRNA，2'-0-曱基 修飾之核苷併入有義股或反義股中（經完全修飾之股）會嚴 重降低siRNA活性。據報導2'-0-曱基置放在反義股之5’-末 端上會嚴重限制活性，而置放在反義股之3'-末端及有義股 之兩個末端上則可耐受（Czauderna等人，NAR· 2003, 31(11):2705-16 ; WO 2004/015107)。本發明之分子提供的 152508.doc -47· 201124160 優勢在於其穩定且具有活性，且該等分子適用於製備用於 治療各種疾病之醫藥組合物。 本發明受讓人之PCT專利公開案第WO 2008/104978號及 第WO 2009/044392號揭示新穎的siRNA結構，該等公開案 以全文引用之方式併入本文中。 本發明受讓人之PCT公開案第WO 2008/050329號及美國 第11/978,089號提及促細胞凋亡基因之抑制劑，且以全文 引用之方式併入本文中。 PCT 專利公開案第 WO 2004/111191 號及第 WO 2005/001043 號提及增強RNAi之方法。 本發明提供一種使標靶基因之表現比對照下調至少 20%、3 0%、40%或50%之方法，其包含使該標靶基因之 mRNA轉錄物與一或多種本發明化合物接觸。 另外，本發明提供一種使標靶基因在哺乳動物體内之表 現比對照下調至少20%、30%、40%或50%之方法，其包含 向該哺乳動物投與一或多種本發明化合物。在本發明之一 較佳實施例中，哺乳動物為人類。 在各種實施例中，結構（A)之雙股核酸分子下調標靶基 因之表現，其中標靶基因表現之下調係選自包含以下之 群：下調基因功能（其尤其例如藉由酶檢定或結合檢定用 天然基因/多肽之已知相互作用物來檢查）、下調基因之多 肽產物（其尤其例如藉由西方墨點法（Western blotting)、 ELISA或免疫沈澱來檢查）及下調基因之mRNA表現（其尤其 例如藉由北方墨點法（Northern blotting)、定量RT-PCR、 152508.doc -48- 201124160 原位雜交或微陣列雜交來檢查）。 傳遞 本發明之經修飾之s i R N A化合物係以化合物本身形式（亦 即以裸siRNA形式）或以醫藥學上可接受之鹽形式投與，且 單獨或作為活性成分與一或多種醫藥學上可接受之載劑、 溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑及媒劑組合投與。在一些實 施例中，本發明之siRNA分子藉由直接施用與載劑或稀釋 劑一起製備之裸分子來傳遞至標靶組織。 術語「裸siRNA」係指不含任何用以輔助、促進或幫助 siRNA分子進入細胞中之傳遞工具（包括病毒序列、病毒粒 子、微脂囊調配物、脂質體或沈澱劑及其類似者）的siRNA 分子。舉例而言，PBS中之siRNA為「裸siRJsJA」。 醫藥學上可接受之載劑、溶劑、稀釋劑、賦形劑、佐劑 及媒劑以及植入載體一般係指不與本發明之經修飾之活性 siRNA化合物反應的惰性無毒固體或液體填充劑、稀釋劑 或囊封物質’且其包括微脂囊及微球體。舉例而言，本發 明之siRNA化合物可與聚伸乙基亞胺（PEI)、pEI衍生物（例 如經油酸及硬脂酸修飾之分支PEI衍生物）、聚葡萄胺糖或 聚（乳酸-共-乙醇酸）(PLGA)—起調配。在例如微脂囊、微 球體或奈米球體及奈米粒子中調配組合物可增強移定：丨生2 有益於吸收。 另外’組合物可包括人工載氧體，諸如全氟化碳 (PFC)，例如全氟溴辛烷（全氟溴烷）。 適用於本發明中之傳遞系統之實例包括美國專利第 152508.doc •49- 201124160 5,225，182 號、帛 5，169,383 號、帛 5，167,616 號、第 4,959,217 號、帛 4,925,678 號、帛 4,487,6〇3 號、第 4,486，194 號、第 4,447,233 號、第 4,447,224 號、第 4,439，196號及第4,475，196號。多種該等植入物、傳遞系統 及模組為熟習此項技術者所熟知，在本發明之一特定實施 例中’選擇表面及經皮調配物。 因此，在一些實施例中’本發明isiRNA分子係以微脂 囊調配物及脂質體調配物及其類似者形式傳遞且可藉由熟 習此項技術者所熟知之方法來製備。該等方法描述於例如 美國專利第5,593,972號、第5,589,466號及第5,580,859號 中’ g亥寺專利以引用之方式併入本文中。 已研發特定旨在增強及改良siRNA傳遞至哺乳動物細胞 中之傳遞系統（參見例如Shen等人，FEBS Let. 539: 111- 114 (2003) ; Xia 等人，Nat. Biotech. 20: 1006-1010 (2002) ; Reich 等人，Mol· Vision 9: 210-216 (2003); Sorensen等人，J. Mol. Biol. 327: 761-766 (2003); Lewis 等人，Nat. Gen. 32: 107-108 (2002);及 Simeoni 等人， NAR 31，11: 2717-2724 (2003))。siRNA最近成功用於抑制 靈長類動物中之基因表現；（關於細節，參見例如 Tolentino等人，Retina 2004. 24(1):132-138) ° 其他用於改良本發明化合物之傳遞的調配物可包括未經 調配之化合物、共價結合於膽固醇之化合物及結合於標靶 抗體之化合物（Song 等人，Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface 152508.doc -50· 201124160 receptors, Nat Biotechnol. 2005. 23(6):709-17)。結合膽固 醇之siRNA(及其他結合類固醇及脂質之siRNA)可用於傳遞 (參見例如 Soutschek等人，Nature. 2004. 432:173-177 ;及 Lorenz 等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. 14:4975- 4977 = 裸siRNA或包含本發明之經化學修飾之siRNA的醫藥組 合物係根據良好醫療實踐，考慮個別患者之臨床情況、待 治療之疾病、投藥部位及方法、投藥時程、患者年齡、性 別、體重及其他為醫藥從業者所知之因素來投與及給藥。 出於本文之目的，「治療有效劑量」因此係藉由如此項 技術中已知之該等考慮因素來決定。劑量須有效實現改 善，包括（但不限於）提高存活率或更快地恢復，或改善或 消除症狀及其他如由熟習此項技術者選作適當量度的指示 物。本發明之siRNA可以單次給藥或多次給藥投與。 一般而言，在單次給藥或每日一次給藥或每日兩次或三 次或三次以上給藥歷時1-4週或更久之時段的方案中，用 於人類之化合物之有效劑量介於每日每公斤體重1 ng至約 2 0 -10 0 mg，較佳每日每公斤體重約0.01 mg至約2-10 mg之 範圍内。 本發明之經修飾之siRNA化合物可藉由任何習知投藥途 徑投與。經修飾之siRNA化合物經口、皮下或非經腸（包括 靜脈内、動脈内、肌肉内、腹膜内、眼内、經眼、經耳、 經鼓室及鼻内投與、氣管内滴注及氣管内吸入以及輸注技 術）投與。化合物之植入物亦適用。 152508.doc -51 - 201124160 體Hit製備㈣於侵入式投與（例如注射）或用於表 或局部或非侵人式投與。術語注射包括皮下、經皮、靜 2内、、肌肉内、勒内、眼内、經鼓室及其他本發明投藥途 仏。液體組合物包括含有及不含有機共溶劑之水性溶液、 水性或油性懸浮液、含可食用油之乳液以及類似醫藥媒 齊J在一特定實施例中，投藥包含靜脈内投藥。 在—實苑例中，本發明之化合物經調配以用於非侵入 式投與。在-些實施例中，本發明之化合物調配成用於表 面投與耳朵的滴耳劑。在-些實施例中，本發明之化合物 調配成用於表面投與眼睛表面之滴眼劑。其他關於投與本 發月化口物之資訊可見於Tolentino等人，Retina 2004 132 138，及Reich等人，M〇lecular Visi〇n, 216中。另外，在某些實施例中，用於治療之本發明組合 物為例如用於鼻内投與之氣霧劑形式。在某些實施例中， 用於治療之本發明組合物為例如用於鼻内滴注之滴鼻劑形 式。 本發明之治療組合物較佳藉由吸入含有此等組合物/化 合物之氣霧劑或藉由鼻内或氣管内滴注該等組合物來投與 肺中。關於肺部傳遞醫藥組合物之其他資訊，參見Weiss 等人 ’Human Gene Therapy 1999. 10:2287-2293 ；
Densmore 等人，Molecular therapy 1999. 1:180-188 ; Gautam 等人，Molecular Therapy 2001. 3:551-556 ;及
Shahiwala 及 Misra， AAPS PharmSciTech 2004. 24;6(3):E482-6。另外，siRNA之呼吸道調配物描述於美國 152508.doc -52- 201124160 專利申請公開案第2004/0063654號中。siRNA之呼吸道調 配物描述於美國專利申請公開案第2004/0063654號中。 在某些實施例中，口服組合物（諸如錠劑、懸浮液、溶 液）可有效地局部傳遞至口腔，諸如適用於治療口腔黏膜 炎之漱口水的口服組合物。 在一特定實施例中，本發明之經修飾之siRNA化合物經 調配以用於靜脈内投與來傳遞至腎中，以治療腎病症，例 如急性腎衰竭（ARF)、移植腎功能延遲恢復（DGF)及糖尿病 性視網膜病。應注意，將本發明之經修飾之siRNA化合物 傳遞至腎近端小管中之標靶細胞尤其有效治療ARF及 DGF。 將化合物傳遞至腦中可藉由若干方法達成，尤其諸如神 經外科植入物、血腦障壁破壞、脂質介導之輸送、載體介 導之流入或流出、血漿蛋白質介導之輸送、受體介導之轉 胞吞作用、吸收劑介導之轉胞吞作用、血腦障壁處之神經 肽輸送以及基因工程改造乾向藥物之「特洛伊木馬（Troj an horse)」。上述方法例如如「Drwg rargeikg··· ί/ze future of brain drug development , W.M. Pardridge, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2001)中戶斤述 來進行。 另外，在某些實施例中，用於治療之本發明組合物為例 如用於鼻内投與之氣霧劑形式。 已用乙醯膽鹼酯酶抑制劑實現鼻内傳遞以治療CNS疾 病，諸如加蘭他敏（galantamine)及加蘭他敏之各種鹽及衍 152508.doc -53- 201124160 生物’例如如美國專利申請公開案第2006003989號及PCT 申請公開案第WO 2004/002402號及第WO 2005/102275號 中所述。例如PCT申請公開案第WO 2007/107789號中描述 例如藉由鼻内滴注滴鼻劑鼻内傳遞核酸來治療CNS疾病。 治療方法 在一態樣中，本發明係關於一種治療罹患與標靶基因表 現相關之病症之個體的方法’其包含向該個體投與治療有 效里之本發明經修飾之siRNA化合物。在較佳實施例中， 所治療之個體為溫血動物，且尤其為哺乳動物，包括人 類。 「治療個體」係指向該個體投與有效改善與疾病相關之 症狀、減輕嚴重度或治癒疾病、減慢疾病發展、預防疾病 發生或延遲疾病發作的治療物質。「治療」係指治療性處 理及防治性或預防性措施，Μ目的在於預防病症、延遲 病症發作或減輕病症症狀。需要治療之個體包括已經歷疾 病或病況之個體、有患疾病或病況之傾向的個體以及有待 預防疾病或病況的個體。在疾病或病況發作之前、期間或 之後投與本發明之化合物。 & 劑量」係指醫藥化合物或組合物 體或其生理系統改善的量，該改善包 风個 提高、更快地恢復、症狀改善或 -限於)存活率 =A 4除、病症發作 病發展減慢及其他由熟習此項技 疾 的指示物。 技術者選作適當決定性量度 「呼吸道病症」係指呼吸系統之 /兄、疾病或症候群， 152508.doc -54· 201124160 包括（但不限於）所有類型之肺部病症，尤其包括慢性阻塞 性肺病（COPD)、肺氣腫、慢性支氣管炎、哮喘及肺癌。 肺氣腫及慢性支氣管炎可作為c_之一部分發生或獨立 #生。在各種實施例中，本發明提供適用於預防或治療有 需要之個體之原發性移植物功能衰竭、缺血再灌注損傷、 #灌注損傷、再較水腫、同種異體移植功輯礙、器官 移植（尤其肺移植）後肺再植入反應及/或原發性移植物功能 障礙（PGD)的方法及組合物。 〇 「微血管病症」係指任何影響微觀毛細管及淋巴管之病 狀，尤其血管痙攣性疾病、血管炎疾病及淋巴阻塞性疾 病。微血管病症之實例尤其包括：眼部病症，諸如暫時性 黑蒙（栓塞或繼發於SLE)、apla症候群、Pr〇t cs及八7111缺 乏症、因使用IV藥物而引起之微血管病變、異常蛋白血 症、顳動脈炎、缺血性視神經病（I〇N) '前部缺血性視神 經病（AION)、視神經炎（原發或繼發於自體免疫疾病）、青 Q 光眼、逢希柏林道症候群（von Hippel UndaU syndrome)、 角膜病、角膜移植排斥反應白内障、伊爾斯氏病（Eales, disease)、霜樣樹枝狀視網膜血管炎、環扣術、包括平坦 部炎之葡萄膜炎、脈絡膜黑素瘤、脈絡膜血管瘤、視神經 發育不全；視網膜病況，諸如視網膜動脈阻塞、視網膜靜 脈阻塞、早產兒視網膜病、HIV視網膜病、普爾夏氏視網 膜病（Purtscher retinopathy)、全身性血管炎及自體免疫疾 病之視網膜病、糖尿病性視網膜病、高血壓性視網膜病、 輻射性視網膜病、樹枝狀視網膜動脈或靜脈阻塞、特發性 152508.doc •55- 201124160 視網膜血管炎、動脈瘤、視神經網膜炎、視網膜栓塞、急 性視網膜壞死、鳥搶彈樣視網膜脈絡膜病變、長期視網膜 脫離，王身性病狀，諸如糖尿病、糖尿病性視網膜病 (DR)、糖尿病相關之微血管病變（如本文詳述）、高黏稠度 症候群、主動脈弓症候群及眼部缺血症候群、頸動脈海綿 竇瘺、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡症、SS_A自體抗 體之小動脈炎、急性多發性出血性血管炎、由感染所致之 血管k、由白塞病（Behcet's disease)所致之血管炎、類肉 瘤病、凝血障礙、神經病、腎病、腎微血管病及缺血性微 血管病狀。 微血管病症可包含新生血管性要素。術語「新生血管性 病症」係指血管形成（新血管生成）對患者有害之病狀。眼 邻新血S生成之貫例包括：視網膜病（糖尿病性視網膜 病、糖尿病性黃斑水腫、慢性青光眼、視網膜脫離及鐮狀 細胞性視網膜病）；虹膜紅變；增生性玻璃體視網膜病； 發炎性疾病；慢性葡萄膜炎；贅瘤（視網膜母細胞瘤、假 神、，查膠質瘤及黑素瘤）；福斯氏異色性虹膜睫狀體炎 (Fuchsf heterochromic iridocyclitis);新生血管性青光眼； 角膜新血管生成（虹膜發炎、移植及發育不全）；組合之玻 璃體切除術及晶狀體切除術後新血管生成；血管疾病（視 網膜缺血、脈絡膜血管機能不全、脈絡膜血栓症及頸動脈 缺血），視神經新血官生成；及由眼睛刺穿或撞傷性眼部 損傷所致之新血管生成。在各種實施例中，使用本發明之 化合物及醫藥組合物治療所有此等新生血管性病況。 152508.doc -56 · 201124160 「眼部疾病」係指眼睛之病況、疾病或症候群，包括 (但不限於）任何涉及脈絡膜新血管生成（⑽）之病況、濕' 型及乾型AMD、眼組織胞漿菌病症候群、血管樣條紋、布 魯赫氏膜《(ruptures in Brueh,s membrane)、近視性變 性、眼部腫瘤、視網膜退化性疾病及視網膜靜脈阻塞 (则)。在各種實施例中，根據本發明之方法治療本文所
揭T之病況，諸如DR’其在本文所提供之定義下視作微 血管病症及眼部疾病或兩者。 更特定而言’本發明提供適用於治療罹患或易患以下疾 病之個體的方法及組合物：成人呼吸窘迫症候群 (ARDS);慢性阻塞性肺病（c〇pD);急性肺損傷（Au);肺 氣腫；糖尿純神經病、腎病及視賴病；糖尿病性黃斑 水腫（DME)及其他糖尿病性病況；f光眼；年齡相關之黃 斑變性（AMD);骨髓移植（BMT)視網膜病；缺血性病況 眼缺血性症候群（0IS);腎病症：急性腎衰竭（arf)、移植 腎功能延遲恢復（DGF)、移植排斥反應；聽力障礙（包括聽 力喪失）；脊髓損傷；口腔黏膜炎；乾眼症候群及褥瘡； 由諸如以下之缺血性或缺氧性病況所致之神經病症：高血 壓同血壓性大腦血管病、血管收縮或阻塞（如血栓或栓 塞狀況下出現）、血管瘤、惡血質、任何形式之心臟功能 受損（包括心跳驟停或衰竭）、全身性低血壓；中風、cns 疾病、病症及損傷，包括（不限於）癲癎症、脊髓損傷、腦 損傷及神經退化性病症，包括（不限於）帕金森氏症、肌萎 縮陡侧索硬化（ALS、葛雷克氏症（l〇u Gehrig's Disease))、 152508.doc -57- 201124160 。效海，次氏症、了㈣員氏症㈣disease)及任何 其他疾病誘發性癡呆（諸如HIV相關之癡呆）。 本七月係關於適用於治療癌症之化合物、組合物及方 法。術語「癌症」係指或描述通常特徵為細胞生長失調之 哺乳動物生理病況。癌症之實例包括（但不限於）癌瘤、淋 巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性病。該等癌症 之其他實例包括腎癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸 癌肺癌（包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺 鱗狀、田胞癌）、鱗狀細胞癌（例如上皮鱗狀細胞癌）、子宮頸 癌、印巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝細胞 癌、胃癌（包括胃腸癌、胃腸基質腫瘤（GIST))、胰臟癌、 頭頭癌、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、星形細胞 瘤、泡膜細胞瘤、含睾丸細胞之卵巢腺瘤、肝瘤、血液惡 性病（包括非霍奇金氏淋巴瘤（n〇n_H〇dgkins lyinphoma， NHL)、多發性骨髓瘤及急性血液惡性病）、子宮内膜癌或 子宮癌、子宮内膜異位、纖維肉瘤、絨膜癌、唾液腺癌、 外陰癌、曱狀腺癌、食道癌、肝癌瘤、肛門癌、陰莖癌、 鼻因癌、喉癌、卡波西氏肉瘤（Kaposi's sarcoma)、黑素 瘤、皮膚癌、神經鞘瘤、少枝膠質瘤、神經母細胞瘤、橫 紋肌肉瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲狀腺 癌、威爾姆氏腫瘤（Wilm's tumor)，以及B細胞淋巴瘤（包 括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤（NHL);小淋巴細胞性 (SL)NHL;中度/濾泡性NHL;中度彌漫性NHL;高度免疫 母細胞性NHL ;高度淋巴母細胞性NHL ;高度小型無裂細 152508.doc -58· 201124160 胞性NHL ;腫塊性病變NHL ;套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋 巴瘤；及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症（Waldenstrom's Macroglobulinemia));慢性淋巴細胞性白血病（CLL);急 性淋巴母細胞性白血病（ALL);毛細胞白血病；慢性骨髓 母細胞性白血病；及移植後淋巴組織增生病症（PTLD)，以 及與母斑細胞病相關之異常血管增生、水腫（諸如與腦腫 瘤相關之水腫）及梅格斯氏症候群（Meigs' syndrome)。如本 文所用之「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖（惡性 或良性）及所有癌前及癌細胞及組織。 纖維變性病症包括肝纖維化、硬化、肺部纖維化（包括 肺纖維化（包括ILF))、由任何病況（例如CKD，包括ESRD) 引起之腎纖維化、腹膜纖維化、慢性肝損傷、原纖維生 成、其他器官之纖維變性疾病、與所有可能類型之皮膚損 傷（意外性及醫源性（手術））相關之異常症痕（瘢痕瘤）；硬皮 病；心臟纖維化、青光眼濾過手術失敗；及腸黏連。 另外，本發明提供一種使標靶基因之表現比對照下調至 少20%、3 0%、40%或5 0%的方法，其包含使標靶mRNA與 一或多種本發明之經修飾之siRNA化合物接觸。在各種實 施例中，本發明之經修飾之siRNA化合物下調標靶基因， 其中該下調係選自包含以下之群：下調基因功能、下調多 肽及下調mRNA表現。 本發明提供一種使標靶基因之表現比對照抑制至少 20%、30%或 40%，較佳 50%、60%或 70%，更佳 75%、80% 或90%的方法，其包含使標靶基因之mRNA轉錄物與一或 152508.doc -59- 201124160 多種本發明之經修飾之siRNA化合物接觸。 在實施命丨中，本發明之經修飾之siRNA化合物抑制標 靶基因多肽，其中該抑制係選自包含以下之群：抑制功能 (其尤其例如藉由酶檢定或結合檢定用天然基因/多肽之已" 矣相互作用物來檢查）、抑制標乾蛋白質（其尤其例如藉由
西方墨點法、ELISA或免疫沈殿來檢查）及抑制標乾mRNA 士現(其尤其例如藉由北方墨點法、定量rt_pcr、原位雜 父或微陣列雜交來檢查）。 ” 在其他實施例中，本發明提供_種治療罹患或易患任何 〇 伴有哺乳動物或非哺乳動物標乾基因含量升高之疾病或病 症之個體的方法’該方法包含向該個體投與治療有效劑量 之本發明經修飾之siRNA化合物或組合物’從而治療該個
本發明係關於下調哺乳動物標靶基因表現之化合物、 其結構（A)之經修飾之RNA化合物的用途，其係用於治 其中抑㈣乳動物標祕因表現有益之下列㈣或病況 ARDS ; COPD ; ALI ;肺氣腫；糖尿病性神經病、腎病 視網膜病；DME及其他糖尿病性病況；青光眼，· ; BMT視網膜病；缺血性病況，包括中風；〇is;神經退化 性病症，諸如帕金森氏症、阿茲海默氏症、ALs ;腎病 症：ARF、DGF、移植排斥反應；聽力障礙；脊趙損傷； 口腔黏膜炎；癌症，包括造血性及實體腫瘤癌症、乾眼症 候群及褥瘡。在另-實施例中’本發明之化合物適用於移 植前器官儲存及/或保存。 152508.doc -60- 201124160 「暴露於毒性劑」意謂毒性劑為哺乳動物獲得或與哺乳 動物接觸。毒性劑可對神經系統具有毒性。暴露於毒性劑 可藉由直接投與’例如藉由攝入或投與食物、藥物或治療 劑（例如化學治療劑），藉由意外污染，或藉由環境暴露（例 ' 如空氣或水暴露）而發生。 * 在其他實施例中’本發明之經化學修飾之siRNA化合物 及方法適用於治療或預防個體之其他疾病及病況發生或嚴 重。此等疾病及病況包括（但不限於）中風及中風樣情況（例 0 如大腦、腎臟、心臟衰竭）、神經元細胞死亡、在存在或 不存在再灌注下之腦損傷、脊髓損傷、慢性退化性疾病， 例如神經退化性疾病’包括阿茲海默氏症、帕金森氏症、 亨爾頓氏症、多發性硬化症、脊髓延髓萎縮、朊病毒疾病 及由創傷性腦損傷（TBI)引起之細胞凋亡。在另一實施例 中，本發明之化合物及方法係針對提供神經保護及/或大 腦保護。 Q 標靶基因係選自由以下組成之群（但不限於）： p53(TP53)、TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2(卡 斯蛋白酶 2)、NOX3、HRK ; C1QBP、BNIP3、MAPK8 ; " Racl、GSK3B、CD38、STEAP4、BMP2a ; GJA1、 - TYROBP 、 CTGF 、 SPP1 、 RTN4R 、 ANXA2 、 RHOA 、
DUOX1 、SLC5A1 、SLC2A2 、AKR1B1 、SORD 、 SLC2A1、MME、NRF2、SRM、REDD2(RTP801L)、 REDD1(RTP801)、NOX4、MYC、PLK1 、ESPL1 、 HTRA2、KEAP1 、p66、ZNHIT1 、LGALS3 、CYBB 152508.doc -61 - 201124160 (NOX2)、NOXl、NOXOl、ADRBl、HI 95、ARF1、 ASPP1、SOX9、FAS、FASLG、人類MLL、AF9、CTSD、 CAPNS1、CD80、CD86、HES1、HES5、CDKN1B、ID1、 ID2、ID3、CDKN2A、卡斯蛋白酶1、卡斯蛋白酶3、卡斯 蛋白酶4、卡斯蛋白酶5、卡斯蛋白酶6、卡斯蛋白酶7、卡 斯蛋白酶8、卡斯蛋白酶9、卡斯蛋白酶10、卡斯蛋白酶 12、卡斯蛋白酶 14、Apaf-1、Nodi、Nod2、Ipaf、 DEFCAP、RAIDD、RICK、BcllO、ASC、TUCAN、 ARC、CLARP、FADD、DEDD、DEDD2、隱熱蛋白 (Cryopirin)、PYC1、熱素（Pyrin)、TRADD、UNC5a、 UNC5b、UNC5c、ZUD、p84N5、LRDD、CDK1、CDK2、 CDK4、CDK5、CDK9、PITSLRE A、CHK2、LATS1、 Prk、MAP4K1、MAP4K2、STK4、SLK、GSK3a、 GSK3p、MEKK1、MAP3K5(Askl)、MAP3K7、MAP3K8、 MAP3K9、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K12、DRP]、 MKK6、p38、JNK3、DAPK1、DRAK1、DRAK2、IRAK、 RIP、RIP3、RIP5、PKR、IRE1、MSK1、PKCa、ΡΚΧβ、 PKC5 ' PKCe ' ΡΚΟη ' ΡΚΟμ ' PKC9 ' ΡΚΟζ ' CAMK2A > HIPK2、LKB1、BTK、c-Src、FYN、Lck、ABL2、 ZAP70、TrkA、TrkC、MYLK、FGFR2、EphA2、 AATYK、c-Met、RET、PRKAA2、PLA2G2A、SMPD1、 SMPD2、SPP1、FAN、PLCG2、IP6K2、PTEN、SHIP、 AIF ' AMID、細胞色素（：、81113(：、11仃入2、丁8八？6、0入？-1、FEM-、DAP-3、顆粒酶 B、DIO-1、DAXX、CAD、 152508.doc •62- 201124160 CIDE-A、CIDE-B、Fsp27、Apel、ERCC2、ERCC3、 BAP3 1、Bitl、AES、亨廷頓蛋白（Huntingtin)、HIP 1、 hSir2、PHAP1、GADD45b、GADD34、RAD21、MSH6、 ADAR、MBD4、WW45、ATM、mTOR、TIP49、雙泛素 /FAT10、FAF1、pl93、鐮刀蛋白（Scythe)/BAT3、Amida、 IGFBP-3、TDAG51、MCG10、PACT、p52/RAP、ALG2、 ALG3、早老素-l(presenelin-l)、PSAP、AIPl/Alix、 ES18、mda_7、pl4ARF、ANTI、p33INGl、p33ING2、 p53AIPl、p53DINPl、MGC35083、NRAGE、GRIM19、脂 質運載蛋白2、生殖糖蛋白A、NADE、導致膜傷基因 (Porimin)、STAG1、DAB2、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝 集素-9、SPRC、FLJ21908、WWOX、XK、DKK-1、 Fzdl、Fzd2、SARP2、axin 1、RGS3、DVL1、NFkB2、 IkBa、NF-ATCl、NF-ATC2、NF-ATC4、zf3/ZNF319、 Egrl、Egr2、Egr3、Spl、TIEG、WT1、Zacl、Icaros、 ZNF148、ZK1/ZNF443、ZNF274、WIG1、HIVEP1、 HIVEP3、Flizl、ZPR9、GATA3、TR3、PPARG、CSMF、 RXRa、RARa、RARb、RARg、T3Ra、ΕΓβ、VDR、 GR/GCCR、p53、p73a、p63(人類[ta a、ta β、ta γ、da a、a β、da γ]、53BP2、ASPP1、E2F1、E2F2、E2F3、 HIF1 a、TCF4、c-Myc、Max、Mad、MITF、Id2、Id3、 Id4、c-Jun、c-Fos、ATF3、NF-IL6、CHOP、NRF1、 c-Maf、Bach2、Msx2、Csx、Hoxa5、Ets-1、PUl/Spil、 Ets-2、ELK1、TEL1、c-Myb、TBX5、IRF1、IRF3、 -63 - 152508.doc 201124160 IRF4、IRF9、ΑΡ-2α、FKHR、FOXOIA、FKHRLl、 F0X03a ' AFX1、MLLT7、Tip60、BTG1、AUF1、 HNRPD、TIA1、NDG1、PCBP4、MCG10、FXR2、 TNFR2、LTbR、CD40、CD27、CD30、4-1BB 、 TNFRSF19、XEDAR、Fnl4、OPG、DcR3、FAS、 TNFR1、WSL-1、p75NTR、DR4、DR5、DR6、EDAR、 TNFa、FAS配位體、TRAIL、淋巴毒素a、淋巴毒素β、 4-1BBL、RANKL、TL1、TWEAK、LIGHT、APRIL、 IL-l-cx、IL-1-β、IL-18、FGF8、IL-2、IL-21、IL-5、 IL-4、IL-6、LIF、IL-12、IL-7、IL-10、IL-19、IL-24、 IFNa、IFNP、IFNy、M-CSF、促乳素、TLR2、TLR3、 TLR4、MyD88、TRIF、RIG-1、CD14、TCRa、CD3y、 CD8、CD4、CD7、CD19、CD28、CTLA4、SEMA3A、 SEMA3B、HLA-A、HLA-B、HLA-L、HLA-Dma、CD22、 CD33、CALL、DCC、ICAM1、ICAM3、CD66a、PVR、 CD47、CD2、Thy-1、SIRPal、CD5、E-鈣黏素、 ITGAM、ITGAV、CD18、ITGB3、CD9、IgE Fc ΙΙβ、 CD82、CD81、PERP、CD24、CD69、KLRD1、半乳糖凝 集素 1、B4GALT1、Clqoc、C5R1、ΜΙΡΙα、ΜΙΡΙβ、 RANTES、SDF1 、XCL1 、CCCKR5、OIAS/OAS1 、 INDO、MxA、IFI16、AIM2、iNOS、HB-EGF、HGF、 MIF、TRAF3、TRAF4、TRAF6、PAR-4、ΙΚΚγ、FIP2、 TXBP151 、FLASH、TRF1 、IEX-1S 、Dokl 、BLNK、 CIN85、Bif_l、HEF1、Vavl、RasGRPl、POSH、Racl、 152508.doc -64- 201124160
RhoA、RhoB、RhoC、ALG4、SPP1、TRIP、SIVA、 TRABID、TSC-22、BRCA1、BARD1、53BP1、MDC1、 Mdm4、Siah-1 、Siah-2、RoRet、TRIM35、PML、 RFWD1 、DIP1 、Socsl 、PARC 、USP7、CYLD、 SERPINH1(HSP47) 〇其他適用之標靶基因為微生物起源之 基因。 組合療法 治療本文所揭示之疾病的方法包括由本文所揭示之經修 飾之雙股核酸分子聯合或組合投與另一抑制劑、改良經修 飾之siRNA化合物之藥理學特性的物質或其他已知有效治 療已罹患或易患任何上述疾病及病症之個體的化合物，該 等疾病及病症包括微血管病症、眼部疾病及病況（例如黃 斑變性）、聽力損傷（包括聽力喪失）、呼吸道病症、腎病 症、器官移植、神經退化性病症、脊鎚損傷、腦損傷、血 管生成相關病況及細胞〉周亡相關病況。 本發明因此在另一態樣中提供一種醫藥組合物，其包含 本發明之治療性經修飾之siRNA化合物與至少一種其他治 療活性劑之組合。「聯合」或「組合」意謂之前、同時或 之後。因此，此類組合之個別組分係自相同或各別醫藥調 配物依序或同時投與。 包含已知用於治療微企管病症、眼部疾病及病況（例如 黃斑變性）、聽力損傷（包括聽力喪失）、呼吸道病症、腎病 症、器官移植、神經退化性病症（例如脊髓損傷）、血管生 成相關病況及細胞凋亡相關病況之治療聯合本文所述之經 152508.doc -65- 201124160 修飾之siRNA化合物及療法的組合療法視作本發明之一部 分。 因此’在本發明之另一態樣中，聯合本發明之醫藥組合 物投與另-醫藥有效化合物。另夕卜，使用本發明之經修飾 之siRNA化合物來製備㈣，料使用第二治療活性化合 物之輔助療法來治療該等病況。與本發明之經化學修飾之 siRNA化合物組合使狀以n療㈣適當劑量很容 易由熟習此項技術者所瞭解。 在-些實施例中，提出上文提及之組合呈單—醫藥調配 物形式使用。 包含任一種本發明之醫藥活性以尺1^八結合物之醫藥组合 物的投與係藉由多種已知投藥途徑(包括靜脈内:、動脈 内、皮下、腹膜内或大腦内)之任—種進行，由熟練之從 業人員決^。使用專門調配物，可經σ或經由吸入或經由 鼻内滴注投與組合物。在一些實施例中，本發明之化合物 經調配用於表面投與，包括調配成滴耳劑、滴眼劑、皮膚 調配物、經皮調配物及其類似者。 「聯合」意、謂另一醫藥有效化合物在投與本發明之化合 物或醫藥組合物之前、同時或之後投與。因此，上文所提 及之此類、组合之個別组分可自相同或各別醫藥調配物依序 或同時投與。如同本發明之經修飾之siRNA化合物的狀 況’第一治療劑可藉由任何適合途徑’例如藉由經口、經 頰、吸入、舌下、直腸、陰道、經尿道、經鼻、經耳、經 眼、表面、經由皮膚（亦即經皮）或非經腸（包括靜脈内、肌 152508.doc -66 · 201124160 肉内、皮下及冠狀動脈内）投藥來投與。 在一些實施例中，本發明之經修飾之siRNA化合物及第 二治療劑由相同途徑投與，其係以單個組合物或兩種或兩 種以上不同醫藥組合物形式提供。然而，在其他實施例 中，本發明之經修飾之siRNA化合物與第二治療劑之投藥 途徑不同係可能或較佳的。熟習此項技術者瞭解單獨或組 合投與各治療劑的最佳方式。 在各種實施例中，本發明之經修飾之siRNA化合物為醫 藥組合物中之主要活性組分。 在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含兩 種或兩種以上用於治療疾病及本文所提及之任何疾病及病 況的S1RNA分子。在一些實施例中，將兩種或兩種以上 siRNA分子或包含該等分子之調配物以產生相等或有益活 性之量混合成醫藥組合物。在某些實施例令，兩種或兩種 以上siRNA分子共價或非共價鍵結，或藉由長度為21〇〇 個、較佳2-50個或2-30個核苷酸之核酸連接子接合於一 起。 在一些實施例中，本發明之醫藥組合物進—步包含—或 多種靶向一或多種其他基因之其他siRNA分子。在一此實 施例中，同時抑制該或該等其他基因為治療本文所揭示之 疾病提供累加或協同作用。 根據投藥方式、投藥時程及劑量進行本發明之、二療方 案，從而改善患者自本文所揭示之病況之不利影響中進行 功能恢復，或延遲病症發作。 152508.doc -67· 201124160 所使用之術語 變化。因此， 除如特定所述 立已以說明性方式描述本發明，且應瞭解， 心欲具有描述措辭之性質而非限制性。 根據上述教示有可能對本發明進行修改及 應瞭解在隨附巾請專利範圍之料内，可以 之外的方式實踐本發明。 下文參考實例詳細說明本發明， 1一 +應視作限於該等實 例0 本文對任何文獻之引用不意欲為承認該文獻為相關先前 技術’或視為具本申請案之任何巾請專利範圍之專利性的 材料。任何關於任何文獻之内容或日期的說日㈣基於由本 發明申請者在巾請時得到之資訊，且不構成對該說明之正 確性的承認。 實例 在不進一步詳細描述下，咸信熟習此項技術者可使用先 月1j也述敢大程度地利用本發明，。因此，下列較佳特定實施 例僅視作說明性的，而不以任何方式限制所主張之本發 明。 本文未特定描述之此項技術中已知之標準分子生物學方
案一般基本上遵循 Sambrook等人，Mo/ecw/ar J laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory,
New-York (1989，1992)及 Ausubel 等人，Cwrrwi /VoiocoAs in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore,
Maryland (1988);及 Ausubel 等人，Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, 152508.doc -68- 201124160
Maryland (1989);及 Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988);及 Watson 等人，Recombinant DNA, Scientific American Books, New York ;及 Birren 等人（編）Genome Analysis: A Laboratory Manual Series，第 1-4 卷 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York (1998)中所述，以及如美國專利第 4,666,828 號、第 4,683,202 號、第 4,801，531 號、第 5，192,659號及第5,272,057號（以引用之方式併入本文中）中 所述之方法。聚合酶鍵反應（PCR)—般如PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)中所述來進行。原位（細胞内）PCR與流動 式細胞量測術之組合可用於偵測含有特定DNA及mRNA序 列之細胞（Testoni 等人，Blood 1996，87:3822)。進行 RT-PCR之方法亦為此項技術中所熟知。 實例1.產生針對標靶基因之siRNA的序列及產生經修飾之 siRNA化合物 使用專屬算法及任何基因之已知序列，視情況使用本文 所揭示之促細胞凋亡基因，產生多種潛在siRNA之tl9聚體 序列。除算法之外，藉由對19聚體序列進行5'及/或3'延長 產生一些23聚體寡聚物序列。使用此方法產生之反義股序 列與標靶mRNA序列之一部分完全或實質上互補。在一些 實施例中，反義序列與相應mRNA序列之一部分完全互 補。為產生本發明之經修飾之siRNA化合物，取代反義股 (N)x之5'末端位置（位置1 ; N1)上之核苷酸，產生結構（A) 152508.doc -69· 201124160 之實施例之雙股核酸分子。在其他實例中，取代反義股 (Ν)χ之5'末端位置上之核苷酸及有義股（N')y之3’末端位置 上之核苷酸，產生結構（A)之實施例之雙股核酸分子。 表A提供一些實例中所用之化合物之有義股及反義股的 核苷酸序列。表A1提供如所述產生以提供根據結構（A)之 實施例的經修飾之siRNA化合物的例示性雙股核酸分子。 本文所示之化合物不欲具有限制性，且可使用任何標靶 RNA來鑑別如本文所述之雙股核酸分子。表A2提供產生以 進行比較測試之經修飾之siRNA化合物。表A1及A2中之經 修飾之siRNA化合物靶向TLR2(智人toll樣受體2(TLR2)之 mRNA，gi|68160956|ref|NM_003264.3|，SEQ ID N0:4)基 因及CAPNS 1(鈣蛋白酶之小次單元1變異體， gi|51599152|ref|NM_001749.2|; SEQ ID ΝΟ:1 ;或鈣蛋白 酶之小次單元 1 變異體 2，gi|51599150|ref|NM_001003962_l|， SEQ ID NO:2)基因。其他化合物靶向人類RhoA mRNA(ras 同源物基因家族之成員A(RhoA)的mRNA，gi|50593005 |ref|NM_001664.2|，SEQ ID NO:3)。哺乳動物標靶基因之 mRNA序列可例如在NCBI網站[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/] 上獲得。
表A
dsRNA分子 SEQ ID 有義股 SEQ ID 反義股 CAPNS1一23 5 GAGAUGACAUGGAGGUCAG 10 CUGACCUCCAUGUCAUCUC TLR2 一 16 6 GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 11 GUUCAUACUUGCACCACUC TLR2_37 7 GGUGGAGAACCUUAUGGUC 12 GACCAUAAGGUUCUCCACC 152508.doc -70- 201124160
TLR2_46 8 AGAUAAUGAACACCAAGAC 13 GUCUUGGUGUUCAUUAUCU RHOA_61 9 GAUCUUCGGAAUGAUGAGA 14 UCUCAUCAUUCCGAAGAUC 表A1 :本發明之例示性TLR2雙股分子
siRNA化合物 (N，)y TLR2 16—S1016 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAG 3, 5' UUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR216—S1018 TLR2 16—S1019 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAG 3, 5' CUUCAUACUUGCACCACUC 3' 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAG 3' 反義股 5' dUUUCAUACUUGCACCACUC 3, TLR2_16_S1020 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAG 3' (SB mmmm mmm· 5' dBUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1022 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAU 3' 反 5' UUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1024 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAU 3' 5' CUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1025 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAU 3' 5' dUUUCAUACUUGCACCACUC 3, TLR2_16_S1026 TLR2_16_S1028 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAU 3' 5' dBUUCAUACUUGCACCACUC 3' 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3' Si股 5' CUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1029 P' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3' 5' dUUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1030 有毛^_ p' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3' 5' dBUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1032 GAGUGGUGCMGUAUGAAA 3' 5' CUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1033 有 ^ GAGUGGUGCMGUAUGAAA 3' ^ dUUUCAUACUUGCACCACUC 3' ILR2_16_S1034 有義 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAA 3' mmm mmm Km 5' dBUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S941 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3, ίϊί 5' UUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S938 有 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAA 3' 5' UUUCAUACUUGCACCACUC 3' 152508.doc -71 - 201124160 CAPNS1 一23_S938 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAA 3， mmm w» wmmmm 反義股 5' UUGACCUCCAUGUCAUCUC 3' CAPNS1—23一S898 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAA 3' 反義股 5' UUGACCUCCAUGUCAUCUC-dTdT 3， CAPNS1 一23_S939 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAA 3' 反義股 5, CUGACCUCCAUGUCAUCUC 3' 表A2 :合成進行比較測試之化合物 siRNA化合物 TLR2 一 16_S1015 (N')y (N)x 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAG 3， mmmm 反義股 5' GUUCAUACUUGCACCACUC 3， TLR2_16_S1017 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAG 3' 反義股 5' AUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1021 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAU 3' Mas wmmm · HM· 反義股 5' GUUCAUACUUGCACCACUC 3， TLR2_16_S1023 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAU 3' 反義股 5' AUUCAUACUUGCACCACUC 3， TLR2_16_S1027 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3, 反義股 5' AUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S1031 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAA 3' 反義股 5' AUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S73 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3' 反義股 5，GUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S939 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAA 3' 反義股 5' GUUCAUACUUGCACCACUC 3' CAPNS1_23_S73 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAG 3' 反義股 5' CUGACCUCCAUGUCAUCUC 3， CAPNS1_23_S867 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAG 3' 反義股 5' CUGACCUCCAUGUCAUCUC-dTdT 3' 下文表A3提供用於製備表A1及A2之siRNA寡核苷酸的 經修飾之核苷酸/非習知部分的代碼。 152508.doc •72· 201124160 表A3 :如本文各表中所用之經修飾之核苷酸/非習知部分 的代碼
代碼 修飾 dT 胸苷-3'-碟酸 A 2'_〇-甲基腺苷_3，_碟酸 C 2 〇甲基胞苦填酸 G 2-〇·甲基鳥苷-3，-填酸 U 2-〇-甲基尿苷-3，_填酸 dB 反轉無鹼基去氡核糖-3，-蛾酸 dU 去氧核糖尿苷_3，_磷酸 LdC L_去氧核糖胞苦_3,-磷酸(對映異構dC) C3 C3-OH C3C3 C3Pi-C3〇H 實例2 ··活體外測試經修飾之siRNA化合物 測試siRNA活性之方案 如下測試本發明之經修飾之siRNA化合物的活性：將每 孔約1 X 105個大鼠REF52(對於TLR2 siRNA活性）或〇.6xl〇5 個人類PC3細胞（對於CAPNS1 siRNA活性）接種於6孔板中 (30%-70%匯合）。培育約24小時後，用dsRNA寡聚物（參見 下表 A4及 A5)，使用 LipofectamineTM2000(Invitrogene) ’ 對 於TLR2 dsRNA以1-40 nM之最終濃度以及對於CAPNS1 dsRNA以5_40 nM之最終濃度轉染細胞。 表 A4 : TLR2_16 siRNA 化合物（SEQ ID NO:6 及 11) TLR2_16_S73 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3' G-C鹼基對。反義股 與標靶完全匹配。 (對照化合物） 反義股 5' GUUCAUACUUGCACCACUC 3, 152508.doc -73· 201124160 TLR2_16_S941 有義股 5, GAGUGGUGCAAGUAUGAAC 3’ U_C。反義股與標靶 錯配。 反義股 5' t/UUCAUACUUGCACCACUC 3, TLR2_16_S939 有義股 5, GAGUGGUGCAAGUAUGAA4 3' G-A。反義股與標靶 錯配。雙鏈體錯配 反義股 5, GUUCAUACUUGCACCACUC 3' TLR2_16_S938 有義股 5' GAGUGGUGCAAGUAUGAAA 3, U-A驗基對。反義股 與標靶錯配。 反義股 5' t/UUCAUACUUGCACCACUC 3, 表 A5 : CAPNSl—23 siRNA 化合物（SEQ ID NO:5 及 10) CAPNS1_23_S73 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAG 3' C-G驗基對。反 義股與標靶完 全匹配。 (對照化合物） 反義股 5' CUGACCUCCAUGUCAUCUC 3' CAPNS1_23_S867 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAG 3, C-G鹼基對。反 義股與標靶完 全匹配。 反義股 5' CUGACCUCCAUGUCAUCUC-dTdT 3' CAPNS1_23_S938 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCA^ 3' U-A鹼基對。 反義股與標靶 錯配。 反義股 5' ί/UGACCUCCAUGUCAUCUC 3, CAPNS1_23_S939 有義股 5' GAGAUGACAUGGAGGUCAi 3' C-A。反義股與 標把完全匹 配0 反義股 5’ CUGACCUCCAUGUCAUCUC 3’ 使用REDD14-Cy3.5標記之寡聚物作為細胞轉染效率之 陽性對照。使用零亂（CNL)募聚物（濃度與第1.2部分中所 提及之濃度相同）作為siRNA活性之陰性對照。細胞轉染24 小時後，藉由螢光顯微法測試轉染效率。 siRNA樣品製備：對於各轉染孔，將3 μΐ Lipofectamine 2000試劑在250 μΐ無血清培養基中稀釋，且在室溫下培育5 分鐘。 siRNA分子如下製備： siRNA工作溶液： REDD14-Cy3.5 原液，1.5χ106 nM(用 PBS 1:150 稀釋以具 152508.doc -74- 201124160 有10 μΜ之最終濃度）。 CNL原液，1·6χ106 ηΜ(用PBS 1:160稀釋以具有10 μΜ之 最終濃度）。 標靶基因原液，100 μΜ(用PBS 1:10稀釋以具有10 μΜ之 最終濃度）。 在 250 DMEM 培養基中，將 TLR2、CAPNS1 及 CNL siRNA募聚物之樣品稀釋至如上文所述（第1.2部分及第1.4 部分）之最終濃度，且將REDD14-Cy3.5 siRNA稀釋至20 ηΜ，每孔最終體積計算為2 ml。將Lipofectamine™ 2000 與siRNA組合（1:1體積），輕輕混合樣品且在室溫下培育20 分鐘。 轉染：將Lipofectamine/siRNA複合物添加至細胞上（每 孔500 μΐ)，將培養板來回搖動（各孔最終體積為2 ml)。在 C02培育箱中於37°C下培育細胞。 藉由qPCR定量mRNA含量：在細胞轉染48小時後，獲得 細胞且使用 EZ-RNATM套組[Biological Industries (貨號20-410-100)]分離RNA。進行cDNA合成且藉由qPCR量測 mRNA含量。相對於參考基因肽基脯胺醯基異構酶A(親環 素A; CycloA)之mRNA量校正所量測之mRNA量。 siRNA活性結果： TLR2_16 siRNA活性：對TLR2_16 siRNA轉染後，表現 内源基因之REF52細胞中大鼠TLR2之表現的qPCR分析（表 A6中之資料展示REF52細胞中之殘餘（佔對照未轉染細胞 之百分比）大鼠TLR2表現）。 152508.doc -75- 201124160 表A6 實例1 實例2 實例3 實例4 實例5 平均值 標準 偏差 對照 100 100 100 100 100 100 0 CNL 40 nM 131 131 131 0 20 nM 115 84 97 89 96 12 5 nM 101 102 102 0 TLR2 一 16—S73 G-C鹼基對。AS與 標靶完全匹配。 40 nM 22 26 13 20 6 20 nM 35 17 17 23 9 TLR2_16_S938 U-A鹼基對。AS與 標靶錯配。 40 nM 17 16 3 12 6 20 nM 13 18 24 19 5 5nM 24 52 38 14 1 nM 52 15 33 19 TLR2_16_S939 G-A。AS與標靶匹 配。雙鏈體錯配 40 nM 15 32 10 19 10 20 nM 26 39 57 41 13 5nM 57 50 53 4 1 nM 50 7 29 21 TLR2_16_S941 U-C。AS與標靶錯 配。雙鏈體錯配 40 nM 7 18 13 5 20 nM 18 26 132 59 52 5nM 132 28 80 52 最具活性之化合物為TLR2_16_S938，其具有與標靶mRNA 錯配之反義股及完全互補之雙鏈體。在TLR2_16_S938 中，N^U及N2=A，且N1與標靶mRNA中之C錯配。 CAPNS1_23 siRNA活性 對CAPNS1_23 siRNA轉染後，表現内源基因之人類PC-3 細胞中CAPNS 1之表現的qPCR分析（表A7中之資料展示 PC-3細胞中之殘餘（佔對照未轉染之細胞之百分比）人類 CAPNS1 表現）。 152508.doc -76- 201124160 表A7 實例1 對照 100 CNL 40 nM 147 20 ηΜ 132 5ηΜ 133 CAPNS1_23_S73 C-G驗基對。反義股與標輕完全匹配。 40 ηΜ 32 20 ηΜ 29 5ηΜ 43 CAPNS1_23—S867 C-G鹼基對。反義股與標靶完全匹配。 40 ηΜ 43 20 ηΜ 24 5ηΜ 38 CAPNS1_23_S938 U-A鹼基對。反義股與標靶錯配。 40 ηΜ 27 20 ηΜ 14 5ηΜ 22 CAPNS1—23—S939 C-A。反義股與標靶完全匹配。 雙鏈體錯配 40 ηΜ 28 20 ηΜ 29 5ηΜ 13
最具活性之化合物為CAPNS1_23_S938，其具有與標靶 mRNA錯配之反義股及完全互補之雙鏈體。在 CAPNS1_23_S938 中，：^=11 及 N2=A，且 N1 與標靶 mRNA 中 之C錯配。 結構（A)之測試化合物的活性比反義股與標靶mRNA完全 互補之對照化合物大至少10%。 雙股RNA分子之中靶及脫靶測試 此研究之目的在於評定對照（未經修飾）及測試（經化學修 飾）雙股核酸分子之中靶活性及潛在脫靶活性。 siRNA分子之雙股具有組態如關於標靶基因mRNA之有 義股及反義股的序列。在細胞中，siRNA之稱作導引股 152508.doc -77- 201124160 (GS)之反義股負載至RNA誘導之沉默複合物（RISC)中且用 以將RNAi機制導引至標靶mRNA中之互補序列。稱作過客 股（PS)之有義股遭破壞。當GS與標靶mRNA之間存在準確 互補性時，後者由RISC之RNaseH樣切割酶活性裂解。 在一些狀況下，siRNA分子可能下調轉錄物與3’-UTR中 GS種子區域（位置2-8上之核苷酸[5’>3'])互補之非預期基 因。不希望受理論限制，此脫靶效應可能由類似於微型 RNA(miRNA)之標靶沉默的機制介導。siRNA之另一類型 脫靶活性可因有義股（PS)負載於RISC中而出現。合成 siRNA之非預期脫靶效應可藉由對siRNA雙鏈體中之初始 siRNA序列進行化學修飾來降低或消除。因此設計測試分 子。 良γ基於導引種子序列及過客股之活性檢定Λ今，良Ά psiCHECKTM(Promega)質體構築體來評定測試分子之中靶 活性（針對標靶mRNA之活性）與脫靶活性（針對除標靶 mRNA以外之mRNA的活性）。測試及對照分子之活性係針 對完整標靶序列（與測試分子之GS或PS的具有19個鹼基之 整個序列完全互補的核苷酸序列）或種子標靶序列（與測試 分子之G S或P S之核苷酸1 - 8 [ 5' > 3']互補之序列）來測試。 相較於未經修飾之對照siRNA，測試分子至少針對GS完 整標靶位點具有活性。測試分子針對PS完整標靶位點無活 性，而未經修飾之對照siRNA針對同一位點表現活性。兩 種siRNA針對GS種子標靶序列及PS種子標靶序列位點皆無 活性。 152508.doc •78· 201124160 導引股（GS)係指雙股RNA中能夠進入RISC複合物中且導 引標靶RNA沉默之反義股。 過客股（PS)係指雙股RNA之有義股。 種子序列係指GS之核苷酸2-8(5'>3')且與脫靶識別相 關。 CM(完全匹配）係指合成DNA片段之核苷酸序列與雙股 RNA分子之導引股完全互補。此DNA片段係選殖於報導基 因之3’UTR中且用作RNA沉默之標祀。（Castanotto及Rossi (2009). Nature, 22:426-33) ° SM(種子匹配）係指合成DNA片段之核苷酸序列與測試分 子siRNA之導引股之核苷酸1-8(5’>3')(第1個核苷酸+種子） 完全互補。此DNA片段係選殖於報導基因之YUTR中且用 作基於種子之「脫靶」沉默的標靶。 psiCHECKTM系統能夠藉由監測標靶序列之表現量的變 化，對引起靶向及脫靶效應之GS(反義股）及PS(有義股）進 行評估。製備四種基於psiCHECK™-2(Promega)之構築體 來評估各測試分子GS及PS股之靶向活性及潛在脫靶活 性。在各構築體中，將測試分子PS或GS之完整標靶或種 子標靶序列之一個複本或三個複本選殖至位於1-UTR區域 中水母螢光素酶轉譯終止密碼子下游之多選殖位點中。所 得載體稱作： 1-GS-CM(導引股，完全匹配）載體，其含有完整標靶序列 (與測試分子之GS之整個19鹼基序列完全互補的核苷酸序 列）之一個複本或三個複本； 152508.doc •79- 201124160 2- PS-CM(過客股，完全匹配）載體，其含有完整標無序列 (與測試分子之PS之整個19鹼基序列完全互補的核苷酸序 列）之一個複本或三個複本； 3- GS-SM(導引股，種子匹配）載體，其含有種子區域標靶 序列（與測試分子之GS之核苷酸1-8互補的序列）之一個複 本或三個複本； 4- PS-SM(過客股，種子匹配）載體，其含有種子區域標靶 序列（與測試分子之P S之核普酸1 - 8互補的序列）之一個複本 或三個複本。 將位置19(反義股之位置丨）上存在或不存在核苷酸取代 之標靶序列選殖於水母螢光素酶報導基因之編碼區域下 游。測試分子針對此等序列之任一者的RNAi或種子介導 之活性引起融合mRNA(GS)裂解及隨後降解或引起轉譯抑 制（PS)。在兩種狀況下，均削弱蛋白質表現。 選殖測試分子GS及PS種子及完整標靶位點 將相關標靶之單個複本選殖於pSiCHECKTM_2(Pr〇mega) 載體中報導mRNA水母螢光素酶之3’UTR中。在載體中存 在多個選殖位點。所用典型選殖位點為Xh〇I及N〇tI。使用 ‘準；7.子生物學技術製備用於選殖之載體。化學合成 及SM之各股且藉由加熱至1〇(Γ(：及冷卻至室溫來黏接。使 用心準刀子生物學技術接合3小時。將接合之質體轉型至 大腸桿菌DH5a細胞中。 藉由群落PCR，使用相關引子’針對質體構築體之存在 師選所得群落。自一個陽性群落中純化各質體（載體）且驗 152508.doc 201124160 證其序列。 將載體轉染至人類海拉細胞中 每10 cm培養皿接種約1.3-2xlO6個人類海拉細胞 (ATCC，目錄號CCL-2)。接著在37°C±1°C、5% C02中培育 • 細胞24小時。接種1天後，以8 mL製備之新鮮生長培養基 置換生長培養基。如下使用LipofectamineTM2000試劑 (Invitrogen)，用載體之一轉染含細胞之各培養板：
在埃彭道夫管（Eppendorftube)中，將 15 pLLipofectamineTM 〇 2000試劑在1000 pL DMEM培養基中稀釋且在室溫（RT)下 培育5分鐘。在第二埃彭道夫管中，在1000 pL DMEM培養 基中稀釋載體達15 pg之最終濃度。將稀釋之 LipofectamineTM2000試劑與稀釋之DNA載體樣品輕輕混合 且在室溫下培育20-40分鐘。培育後，將DNA/Lipofectamine™ 2000添加（達2000 μί最終體積）至細胞中。輕輕搖動培養 板。在37°C ±1°C及5% C02下培育培養板5小時。培育5小 q 時後，將細胞以每孔5xl03個細胞之最終濃度於80 pL生長 培養基中再接種於96孔培養板中。1 6小時後，使用 LipofectamineTM2000，用測試或對照分子轉染細胞。如下 ' 所述’一式兩份進行各siRNA濃度之轉染： • 過量製備LipofectamineTM2000以足夠用於170個孔：將 85 μί UpofectamineTM2000與 3400 pL(3.4 mL)DMEM培養 基混合且在室溫下培育5分鐘。 製備測試及對照分子工作溶液：藉由稀釋1 〇 μΜ儲備溶 液來製備各種濃度之工作溶液。在100 pL DMEM轉染培養 152508.doc -81 - 201124160 基中製備此連續稀釋液以產生處於0.0095 nM至100 nM範 圍内之最終轉染濃度（0.0095 nM、0.019 nM、0.039 nM、 0.07 nM ' 0.15 nM ' 0.31 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM、5.0 nM、20.0 nM、100.0 nM) ° 將稀釋之Lipofectamine 2000之100 μι等分試樣與100 pL 稀釋之各測試分子或對照分子工作溶液（上述）輕輕混合且 在室溫下培育混合物20-40分鐘。培育後，將20 pL siRNA/LipofectamineTM2000混合物添加至細胞頂部（用上 述80 μί細胞培養基預先培育）。輕輕搖動培養板。在 37°C ±1°C及5% C02下培育細胞48小時。 測定轉染細胞中之水母螢光素酶活性 psiCHECK™-2載體能夠監測融合於水母螢光素酶報導基 因之標靶序列的表現變化。將測試/對照分子標靶序列選 殖至水母螢光素酶之3'-非轉譯區域（3’-UTR)中。量測水母 螢光素酶活性之降低，從而提供監測活性之便利方式。另 外，psiCHECK™-2載體含有第二報導基因螢火蟲螢光素 酶，其在不同啟動子下轉錄，用於對水母螢光素酶表現進 行校正。 測試或對照分子轉染48小時後，使用Dual-Luciferase® 檢定套組（Promega)，根據製造商之程序，量測各siRNA轉 染樣品中水母及螢火蟲螢光素酶活性： 自細胞完全移除培養基，接著藉由添加40微升/孔IX螢光 素酶溶解溶液溶解細胞。接著冷凍（-80°C )培養板且在室溫 下融化。藉由吸液若干次使細胞溶解產物懸浮，且將各樣 152508.doc • 82 - 201124160
品之12·5 pL等分試樣轉移至各別96孔板中。將5〇 榮光 素酶受質（LARII)添加至各提取物中，且藉由吸光度、螢 光及發光讀取器（Perkin Elmer, VictorTM 1240)量測螢火蟲 榮光素酶活性。將50 pL Stop&Glo試劑添加至各樣品中且 立即量測水母螢光素酶活性。將各樣品之水母螢光素酶活 性值除以螢火蟲螢光素酶活性值（校正）。水母螢光素酶活 性最終表示為測試樣品中之校正活性值相對於自在不存在 測試或對照分子下經相應psiCHECKTM_2質體轉染之細胞所 獲得之校正值的百分比。 IC50計算 測試及對照分子針對gs_cm位點之活性的IC50值係藉由 使用以各種最終siRNA濃度獲得之活性結果構築劑量_反應 曲線來確定。藉由繪製水母螢光素酶活性之相對校正值相 對於轉染之siRNA濃度之對數的曲線來構築劑量反應曲 線。藉由將最佳s形曲線擬合量測之數據來計算曲線。8形 擬合之方法稱作3點曲線擬合。 Y=Bot+ ___1 00-Bot_ "i + l〇(Logl(J5D-X)x希 _ 斜率 其中： F為殘餘卡斯蛋白酶2 mRNA反應， 义為轉染之siRNA濃度之對數， 忍W為底部平台期之F值， 為當7處於底部平台期與頂部平台期之間的一半處 時之I值，且#麖##為彎曲之斜率。 152508.doc •83- 201124160 為評估雙股RNA分子股之各股之潛在脫靶活性，使用 psiCHECK(Promega)質體構築體，利用「羞於箏歹/禮子^ /〆及if客展之活沒凝定」。對水母活性之量測可提供龄測 雙股RNA活性之便利方式。 量測標靶水母螢光素酶蛋白活性 在蛋白質層面上’藉由量測經各種濃度分子轉染之細胞 中水母螢光素酶報導蛋白質之相對活性，來評定測試與對 照分子針對四種標靶序列（GS-CM，導引股完全匹配； GS-SM ’導引股種子匹配；PS_cm，過客股完全匹配；及 PS-SM ’過客股種子匹配）之活性。各檢定重複三次。藉由 建構 >辰度-反應曲線來確定測試分子針對G s - C Μ標乾位點 之活性的IC50值。 測試與對照分子以劑量反應方式針對標靶gs_cm位點具 有活性。 兩種siRNA針對GS-SM及PS-SM位點無活性。 圖2-1 0及下表2-1 0展示如由殘餘標乾所量測，乾向標乾 序列之完全匹配物之雙股分子的活性，該標靶序列在位置 19(相當於反義股之位置1}上具有取代以併有以下中之一 者：核糖核苷酸、腺苷（A或rA)、胞苷（C或rC)、鳥苷（G或 rG)、核糖胸苷（rT，亦為5,甲基尿苷）及尿苷⑴或⑴）；或 去氧腺苷（dA)、去氧胞苷（dC)、去氧鳥苷（dG)、胸苷（dT) 及去氧尿苷（dU)，或2Ό曱基化腺苷（mA)、2,〇曱基化胞苷 (mC)、2Ό甲基化鳥苷（mG)、2,〇甲基化尿苷（mU)。「反義 152508.doc -S4 - 201124160 股第1位置」係指反義股之位置1(5’末端核苷酸）。 表2 : TLR2_16 siRNA(在雙股上以交替2'-OMe為末端之鈍 端） 反義股 第1位置-mC 反義股 第1位置-mG 反義股 第1位置-mA 反義股 第1位置-dU is 0.4 nM 標靶G 81 75 68 58 標靶u 91 93 81 59 4nM 標靶G 85 61 50 38 標靶u 84 78 56 40 20 nM 標靶G 57 55 38 32 標靶U 62 62 35 32 表2中所示之資料呈現於圖2中。反義股之位置1上之甲 基化核苷酸展示降低之標靶基因表現阻斷能力，與鹼基配 對無關。
表3未經C3-C3突出物或dTdT突出物修飾之TLR2_37 siRNA dTdT 突出物 C3-C3突出物 位置19 標靶 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-dU 反義股第 1位置-dT 反義股第 1位置-mU 反義股第 1位置-A < § •55 0.04 nM 標靶A 21 18 17 16 48 18 標靶C 20 15 22 21 39 6 標靶G 35 30 27 p 60 24 標靶U 33 33 28 32 64 27 0.4 nM 標靶A 13 8 8 9 23 11 標靶C 12 9 9 11 18 10 標靶G 17 13 12 13 34 16 標靶U 19 17 12 16 43 14 4ηΜ 標靶A 10 8 7 7 13 9 標靶C 8 7 8 9 12 10 標靶G 13 9 8 11 20 10 標靶U 12 13 8 9 22 12 表3中之資料呈現於圖3中。表3及圖3展示反義股第1位 置上之2OMe核糖核苷酸降低siRNA活性，與標靶之匹配 152508.doc -85 - 201124160 位置上之核普酸無關。
表4 :未經C3-C3突出物或dTdT突出物修飾之TLR2_37 siRNA dTdT突出物 C3-C3突出物 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-dU 反義股第 1位置-dT < § 0.04 nM 標靶A 21 18 17 16 標靶c 20 15 22 21 標靶G 35 30 27 27 標靶U 33 33 28 32 0.4 nM 標靶A 13 8 8 9 標靶c 12 9 9 11 標靶G 17 13 12 13 標靶u 19 17 12 16 表4中之資料呈現於圖4中。表4及圖4展示： 1. 當反義股第1位置上之U(dU或dT)與標靶中之C錯配或 與標靶中之A匹配時觀測到siRNA具有最高活性； 2. 若siRNA之反義股第1位置上之U(或dU或dT)與標靶中 之U錯配，則siRNA活性降低； 3. 若反義股第1位置上之U與標靶中之G擺動配對，則 siRNA活性降低。
表 5 TLR2_37 siRNA(未經 dTdT突出物修飾）-0.04 nM 反義股第 1位置-G 反義股第 1位置-U 標靶A 32 21 標靶c 29 20 標靶G 33 35 0.04 nM 標靶u 37 33 標fcA 14 13 < § 標靶c 13 12 標靶G 17 17 0.4 nM 標靶U 21 19 152508.doc -86 - 201124160 標靶A 10 10 標靶C 13 8 標靶G 10 13 4nM 標靶U 11 12 標靶A 9 11 標靶C 8 8 標靶G 8 11 20 nM 標靶U 10 11 標靶A 8 7 標靶C 5 7 標靶G 7 8 100 nM 標靶U 5 7 表5中之資料呈現於圖5中。表5及圖5展示： 〇 1.反義股第1位置上之U與標靶中之A匹配或與C錯配所 產生之結果比與U錯配或與G擺動配對所產生之結果優 良。 2.反義股第1位置上之G展示類似結果，其中匹配標靶位 置上之所有可能核苷酸（錯配物或擺動配對）均未提高活 性0 表6 : TLR2_46 siRNA(未經C3-C3或dTdT突出物修飾）
dTdT 突出物 C3-C3突出物 反義股第 1位置-u 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-dU 反義股第 1位置-dT 反義股第 1位置_mU 反義股 第1位置-A < § •a 0.04 nM 標靶A 70 83 61 69 79 52 標靶c 56 78 49 66 85 58 標靶u 68 85 57 69 95 67 0.4 nM 標靶A 41 30 33 36 83 37 標靶c 35 39 33 41 86 34 標靶u 56 46 43 36 94 48 4 nM 標靶A 13 16 17 20 39 14 標靶c 15 17 11 24 48 13 標靶u 19 21 17 14 59 19 20 nM 標靶A 8 7 8 8 28 10 標靶c 7 10 7 8 27 9 標靶u 10 12 10 6 40 13 152508.doc -87- 201124160 表6中之資料呈現於圖6中。表6及圖6展示l^lmU之取代 降低活性。 表7 TLR2_46 siRNA(未經dTdT突出物修飾） 反義股 第1位置-G 反義股 第1位置-u 標靶A 53 41 標靶c 61 35 0.4 nM 標靶U 68 56 標靶A 28 13 標靶c 28 15 4nM 標靶U 32 19 標靶A 16 8 標靶c 15 7 20 nM 標靶u 17 10 < g 標靶A 16 8 標靶C 15 7 100 nM 標靶u 17 10 表7中之資料呈現於圖7中。表7及圖7展示不管匹配標靶 位置之核苦酸類型如何，反義股第1位置上之U均產生較佳 KD(阻斷基因表現）。所有狀況意謂與siRNA與標靶之間在 導引股第1位置上之互補性或錯配或擺動對無關。 表8 RHOA_61 siRNA(未經C3-C3或dTdT突出物修飾） dTdT 突出物 C3-C3突出物 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-U 反義股第 1位置-dU 反義股第 1位置-dT 反義股第 1位置-mU 反義股第 1位置-A 標靶A 35 50 34 33 76 33 標靶C 32 38 33 32 86 34 標靶G 41 51 49 0.04 nM 標靶U 53 34 36 標把A 26 24 26 25 74 24 標靶c 26 22 22 66 23 標靶G 26 26 38 35 0.4 nM 標靶u 36 27 27 標靶A 22 22 24 17 37 20 < 標靶c 18 19 21 17 34 18 § 標靶G 21 31 25 4ηΜ 標靶U 30 22 22 152508.doc -88- 201124160 表8中之資料呈現於圖8中。 表9 RHOA_61 siRNA(未經C3-C3或dTdT突出物修飾） dTdT 突 出物 C3-C3突出物 反義股第 1位置-u 反義股第 1位置-U 反義股第1 位置-dU 反義股第 1位置-dT 反義股第1 位置-mU 反義股第 1位置-A < § 0.04 ηΜ 標It A 35 50 34 33 76 33 標靶C 32 38 33 32 86 34 標靶G 41 51 49 標靶U 53 34 36 0.4 ηΜ 標靶A 26 24 26 25 74 24 標靶C 26 22 22 66 23 標靶G 26 26 38 35 標靶U 36 27 27 4ηΜ 標把A 22 22 24 17 37 20 標靶C 18 19 21 17 34 18 標靶G 21 31 25 標靶U 30 22 22 表9中之資料呈現於圖9中。表9及圖9展示：
在反義股第1位置上具有U之siRNA比在第1位置上具有G 之siRNA更具活性，與標靶匹配位置中之核苷酸（匹配、錯 配、擺動）無關。結果未能藉由擺動驗基配對加以說明， ❹ 因為在siRNA中具有G及在標靶中具有U不等同於在siRNA 中具有U及在標靶中具有G。 表10 RhoA_61 siRNA(未經dTdT突出物修飾） 反義股 第1位置-G 反義股 第1位置-U 0.04 ηΜ 標靶A 52 35 標靶C 52 32 < 'Z, 標靶G 90 *53 標靶U 66 152508.doc -89· 201124160 0.4 nM 標靶A 49 26 標靶C 51 — — 26 標耙G 84 — — 標靶U 49 —- 4nM 23 22 標靶C 22 — — 18 標靶G 38 - 標靶U 28 20 nM 標靶A 21 20 標靶cl 18 17 標靶G 29 標靶U 21 100 nM 標靶A 18 19 標把C 19 16 標靶G 25 — 標靶U 20 ——~~__ 表10中之資料呈現於圖10中。 實例3:急性腎衰竭（ARF)模型系統 ARF為特徵為在數天内出現腎功能迅速衰退之臨床症候 群。不受理論限制，急性腎損傷可為腎缺血_再灌注損傷 (諸如經歷大型手術（諸如大型心臟手術）之患者的腎缺企_ 再灌注損傷）之結果。ARF之主要特徵為腎小球濾過率 (GFR)急劇下降，導致含氮廢物（尿素、肌酸酐）滯留。新 近研九s登貫，腎組織之細胞凋亡在大多數人類ARF病例中 為顯著的。細胞凋亡性細胞死亡之主要部位為遠端腎單 位。在缺jk性損傷之初始階段期間’肌動蛋白細胞骨架喪 失完整性可導致上皮變平，喪失刷狀緣，失去病灶性細胞 接觸’繼而細胞自下伏底層脫離。 152508.doc -90- 201124160 在、再灌'主誘發之ARF之動物模型中測試本發明化 合物治療缺血再灌注損傷之功效。 實例4:褥瘡或壓力性潰瘍模型系統 ^括糖尿病性潰癌之褥瘡或μ力性潰瘍為在持續壓力 (通常來自床或輪椅）切斷身體薄弱部分（尤其臀部、競部及 跟部上之皮膚)之#環時所形成的受損皮膚及組織區域。 缺^充足的血流可導致受影響組織缺血性壞死及潰瘍。褥 瘡取爷發生在感覺減弱或喪失或虛弱、消瘦、癱瘓或長期 臥床不起之患者中。瓶骨、坐骨、大轉子、外踩及跟部上 之組織尤其易受影響；其他部位亦可能涉及到，視患者之 情況而定。 尤其在如 Reid 等人，j Surg Res 116:172_18〇, 2〇〇4 中所 述之小鼠模型或如Mustoe等人，JCI，1991· 87(2):694- 703 ’ Ahn及Mustoe，Ann PI Surg，1991, 24(1):17-23所述之 兔模型中，測試本發明化合物治療褥瘡、潰瘍及類似創傷 之功效： 實例5:慢性阻塞性肺病（c〇pD)模型系統 慢性阻塞性肺病（c〇PD)特徵主要為肺氣腫，肺氣腫為 末端細支氣管遠端之周邊空氣間隙遭到永久性破壞。肺氣 腫之特徵亦為炎性細胞（諸如巨噬細胞及嗜中性白血球）在 細支氣管及肺泡結構中積聚。肺氣腫及慢性支氣管炎可作 為COPD之一部分出現或獨立出現。 尤其在諸如如下所揭示之動物模型的動物模型中，測試 本發明化合物治療COPD /肺氣腫/慢性支氣管炎之功效： 152508.doc -91 - 201124160
Starcher及 Williams, 1989. Lab. Animals, 23:234-240 ； Peng 等人，2004.; Am J Respir Crit Care Med, 169:1245-1251 ; Jeyaseelan 等人，2004· Infect. Immunol, 72: 7247-56。其他模型描述於讓渡給本申請案之受讓人的PCT專利 公開案WO 2006/023544(其係以引用之方式併入本申請案 中）中。 實例6 :脊髓損傷模型系統 脊髓損傷或脊髓病為一種導致感覺及/或活動性喪失之 脊髓破壞。脊髓損傷之兩種常見類型歸因於創傷及疾病。 創傷性損傷可尤其歸因於車禍、跌倒、槍擊、潛水事故， 且可累及脊髓之疾病包括脊髓灰質炎、脊椎裂、腫瘤及弗 里德希氏共濟失調（Friedreich’s ataxia)。 將siRNA注射至脊髓挫傷後及無損傷之大鼠體内之脊髓 中。製備矢狀冷凍切片且使用四個不同抗體群組進行免疫 染色以確定神經元、星形神經膠質、寡樹突神經膠質及/ 或巨噬細胞/小神經膠質中是否進行吸收。神經元之標記 物包括NeuN或GAP43 ;星形神經膠質及潛在神經幹細胞之 標記物包括GFAP、巢蛋白（nestin)或波形蛋白（vimentin); 寡樹突神經膠質之標記物包括NG2或APC ;巨噬細胞/小神 經膠質之標記物包括EDI或Iba-l(Hasegawa等人，2005. Exp Neurol 193:394-410)。 用兩種不同劑量之siRNA(l pg/μΐ、10 pg/μΐ)注射大鼠且 在處死前飼養1天及3天。結果指示，針對脊髓損傷標靶基 因之siRNA促進運動神經元恢復。 152508.doc -92- 201124160 實例7 :青光眼模型系統 在如以下所述之動物模型中，測試本發明化合物治療或 預防青光眼之功效：Pease等人，J. Glaucoma，2006, 15(6):512-9 (Manometric calibration and comparison of TonoLab and TonoPen tonometers in rats with experimental glaucoma and in normal mice) 0 實例7 A :缺血性視神經病（ION)模型系統 使用視神經擠壓傷方案，在成年韋斯大鼠（Wistar rat)中 建立缺血性視神經病動物模型。在離視神經擠壓尚有七天 時，藉由將逆行示蹤劑FluoroGold(2°/〇，螢光染料， Englewood, CO)施用至上丘來選擇性標記視網膜神經節細 胞（RGC)。示縱劑藉由沿RGC抽突逆向輸送來輸送，使所 有RGC在注射螢光示蹤劑後1週内完全及特異性標記。在 逆行示蹤7天後使動物經受視神經擠壓傷。經由眶上入路 暴露眼眶視神經，且藉由用鉗子在距筛板2 mm處擠壓10秒 來橫切視神經中之所有軸突。在視神經擠壓時，使用玻璃 微量吸液管，將單一劑量之每5 μΐ PBS 20 pg的經修飾之 測試siRNA化合物微注射至視神經乳頭前2 mm之玻璃體 中〇 在視神經擠壓後第7天，藉由計數平鋪之視網膜上經 FluoroGold標記之RGC來確定RGC之存活率。在視神經擠 壓後第1週用4%三聚甲醛經賁門灌注實驗動物。分割出兩 個視網膜，再固定30分鐘且平鋪於玻璃載片上，以用於神 經節細胞層定量。在各視網膜中之1 6個不同區域中計數螢 152508.doc -93- 201124160 光RGC之數目，且相較於自完全未經受視神經擠壓傷之大 鼠獲得之樣品或自用PBS、對照siRNA或GFP siRNA注射且 經受視神經擠壓傷之大鼠獲得之樣品來確定RGC存活率之 百分比。在吞嗟垂死RGC後可具有併入之FluoroGold的小 神經膠質細胞由其特徵形態而區分且自定量分析排除。 利用另一視神經軸突切斷術模型，其中藉由橫切靠近眼 睛之視神經對整個RGC群體進行軸突切斷術。（Cheng L等 人，《7. 2002;22:3977-3986)。 實例8:大鼠肺移植後缺血/再灌注損傷模型系統 在如以下所述之一或多種實驗動物模型中，測試本發明 化合物治療肺移植後缺血/再灌注損傷或缺氧性損傷之功 效：Mizobuchi 等人，2004. J. Heart Lung Transplant, 23:889-93 ; Huang 等人，1995. J. Heart Lung Transplant. 14: S49 ; Matsumura等人，1995. Transplantation 59: 1509-1517 ; Wilkes 等人，1999. Transplantation 67:890-896 ; Naka等人，1996. Circulation Research, 79: 773-783 ° 實例9 :急性呼吸窘迫症候群模型系統 尤其在 Chen 等人（J Biomed Sci. 2003;10(6 Pt 1):588-92) 所述之動物模型中，測試本發明化合物治療急性呼吸窘迫 症候群之功效。在此動物模型中測試靶向包括CYBA、 HRK、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、 P2RX7、TRPM2、PARG、SPP1 及 DUOX1之基因的經修飾 之siRNA化合物。 實例10:聽力喪失病況模型系統 152508.doc -94- 201124160 (i) 卡始（carboplatin)誘發或順鉑（Cisplatin)誘發之耳蝸毛細 胞死亡南美栗鼠（Chinchilla)模型 藉由將含特異性siRNA之生理食鹽水直接投與各動物之 左耳’對南美栗鼠進行預處理。將生理食鹽水給與各動物 之右耳作為安慰劑。在投與本發明之特異性經修飾之 ' SlRNA化合物後第2天，用卡鉑（75 mg/kg，腹膜内）或順鉑 (經30分鐘腹膜内輸注13 mg/kg)處理動物。在處死南美栗 鼠（卡鉑處理兩週後）後，計算左耳（經siRNA處理）及右耳 (經生理食鹽水處理）中内毛細胞（IHC)及外毛細胞（〇Hc)之 死細胞的百分比。經計算，左耳（經siRNA處理）中内毛細 胞（IHC)及外毛細胞（〇HC)之死細胞之百分比低於右耳（經 生理食鹽水處理）中。 (ii) 聲音誘發之耳蝸毛細胞死亡南美栗鼠模型 在南美栗鼠中，在聲音創傷模型中，研究特異性siRNA 之活性。將動物暴露於105 dB下集中於4 kHz之雜訊倍頻 ❹ 帶2·5小時。用含30 Mg siRNA之約1〇叫生理食鹽水預處理 (在聲音創傷前48小時）暴露於雜訊之南美栗鼠的左耳；用 媒劑（生理食鹽水）預處理右耳。複合動作電位（cap)為量 測自耳蜗傳遞之神，經活動的便利且彳靠之電生理學方法。 藉由將電極置放於靠近耳螞底部以摘測在聲音刺激（諸如 滴：聲或猝發音)突然開始時產生之局部場電位來記錄 CA:。在聲音創傷後第2.5週評定各耳朵之機能狀態。特定 而吕，在聲音創傷後第2·5週測定自圓窗記錄之複合動作 電位之平均臨限值’以確定經仰财處理之耳朵的臨限值 152508.doc -95- 201124160 是否低於（優於）未處理（生理食鹽水）之耳朵。另外，測定 經siRNA處理之耳朵及對照耳朵中内毛細胞及外毛細胞喪 失之量。 使用小鼠及大鼠之相似模型。在此等及其他聽力喪失及 聽力再生動物模型中，測試靶向包括BNIP3、CAPNS、 HES1、HES5、NOX3、ID1_3、HRK、ASPP2(TP53BP)、 CASP2、RAC1、HTRA2、CDKN1B之基因的經修飾之 siRNA化合物。 實例11.骨關節炎（OA)動物模型 膠原蛋白誘發之關節炎（CIA):小鼠CIA描述於Trentham 等人（1977_ J. Exp. Med. 146: 857-868)中。佐劑誘發之關 節炎（AA) : AA描述於 Kong 等人（1999. Nature, 402:304-308)中。半月板切除術模型描述於Han等人（1999. Nagoya J Med Sci 62(3-4):115-26)中。 除此項技術中已知之活體外模型之外，使用一或多種上 述模型評估不同siRNA抑制劑（諸如針對SSP1之siRNA)對 與OA相關之不同參數（諸如軟骨細'胞增殖、終末分化及關 節炎發展）的作用。在此等動物模型中，測試針對促細胞 凋亡基因、尤其SSP1之經修飾之siRNA化合物，顯示經修 飾之siRNA化合物治療及/或預防OA，因此可用於治療此 病況。 實例12 :大鼠與移植相關之急性腎損傷模型系統 熱缺jk (Warm ischemia)-對測試大鼠進行左腎切除術， 繼而自體移植，造成45分鐘之熱移植腎保存時段。在自體 152508.doc -96- 201124160 體1同一動物!行右腎切除術。在獲得移植腎前 、 處理）（「之前」）或在腎自體移植後（模擬接受者 理）或在獲得前與移植後（組合之供體與接受者處 理)（「夕 别•之後」），經由股靜脈，靜脈内投與針對俨 之經化學修飾之siRNA。 不 冷缺血-對供體動物進行左腎切除術，繼而冷藏（冰上）所 獲得之腎5小時之時段。在此時段結束時，接受大鼠將進
行雙侧腎切除術’繼而移植經冷藏之移植腎。總熱缺灰時 間（包括手術程序）為約30分鐘。在獲得腎前（「之前」）， 經由股靜脈，向供體動物靜脈内投與經化學修飾之
SiRNA，或在移植後15分鐘（「之後15分鐘」）或4小時（之 後】夺）經由股靜脈，向接受動物靜脈内投與經化學修 飾之siRNA。 為評定本發明之經修飾之siRNA化合物改善移植後腎功 能之功效，在移植後第1天、第2天及第7天量測熱缺血模 型與冷缺血模型之血清肌酸肝含量。 熟習此項技術者應瞭解或能夠僅僅使用常規實驗確定本 文所述之本發明特定實施例之等效物。該等等效物意欲由 下列申請專利範圍所涵蓋。 【圖式簡單說明】 圖1為如本文所提供之dsRNA分子的圖。在一實施例 中’反義股之5,末端G或C核苷酸經U、dU、rA、dA、rT、 dT取代；或反義股之5,末端u核苷酸經dU、rA、dA、rT、 dT取代；或反義股之51末端a核苷酸經u、dU、dA、rT、 152508.doc -97- 201124160 dT取代。在一實施例中，反義股之5’末端核苷醆與枳靶 mRNA錯配。在另一實施例中’反義股之5丨太迪分外 个鳊核苷酸為 與標靶mRNA互補之去氧核糖核苷酸。 圖2-10展示在反義股之位置1上具有不同核苦酸之 dsRNA分子對經修飾以在位置1 9(反義股之位置i )上個別包 括四種核糖核苷酸之標靶之活性（％殘餘標靶剩餘）的柱狀 圖。 152508.doc •98· 201124160 序列表 <110>美商夸克藥物有限公司 <120>含末端取代之SIRNA化合物 <130> 213/TW1 <140> 099141067 <141> 2010-11-25 <150> 61/264,668; 61/295,722; 61/372,072 <151> 2009-11-26; 2010-01-17; 2010-08-09 <160> 14 <170> Patentln version 3.5 <210〉 1 <211> 1492 <212> RNA <213>智人
<400〉 1 cgggcgacag cagggccgcg gugcaguguc cgacccgaga guugcggccu gagucaccgg 60 ccccgcccuc cggagccgga cgcugcggga ggcccgggag cggcagugga accgacuccc 120 agaacuccgg acgugugcgg cgcagugagu cgcagccaug uuccugguua acucguucuu ISO gaagggcggc ggcggcggcg gcgggggagg cgggggccug ggugggggcc ugggaaaugu 240 gcuuggaggc cugaucagcg gggccggggg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg 300 ugguggaggc ggcgguggcg guggaacggc caugcgcauc cuaggcggag ucaucagcgc 360 caucagcgag gcggcugcgc aguacaaccc ggagcccccg cccccacgca cacauuacuc 420 caacauugag gccaacgaga gugaggaggu ccggcaguuc cggagacucu uugcccagcu 480 ggcuggagau gacauggagg ucagcgccac agaacucaug aacauucuca auaagguugu 540 gacacgacac ccugaucuga agacugaugg uuuuggcauu gacacauguc gcagcauggu 600 ggccgugaug gauagcgaca ccacaggcaa gcugggcuuu gaggaauuca aguacuugug 660 gaacaacauc aaaagguggc aggccauaua caaacaguuc gacacugacc gaucagggac 720 cauuugcagu agugaacucc caggugccuu ugaggcagca ggguuccacc ugaaugagca 780 ucucuauaac augaucaucc gacgcuacuc agaugaaagu gggaacaugg auuuugacaa 840 cuucaucagc ugcuugguca ggcuggacgc cauguuccgu gccuucaaau cucuugacaa 900 agauggcacu ggacaaaucc aggugaacau ccaggagugg cugcagcuga cuauguauuc 960 cugaacugga gccccagacc cgcccccuca cugccuugcu auaggaguca ccuggagccu 1020 cggucucucc cagggccgau ccugucugca gucacaucuu uguggggccu gcugacccac 1080 aagcuuuugu ucucucagua cuuguuaccc agcuucucaa cauccagggc ccaauuugcc 1140 cugccuggag uucccccugg cucuaggaca cucuaacaag cucuguccac gggucucccc 1200 auucccacca ggcccugcac acacccacuc cguaaccucu ccccuguacc ugugccaagc 1260 cuagcacuug ugaugccucc augccccgag ggcccucucu caguucuggg aggaugacuc 1320 cagucccugc acgcccuggc acacccuuca cgguugcuac ccaggcggcc aagcuccaga 1380 ccgugccaga cccaggugcc ccagugccuu ugucuauauu cugcucccag ccugccaggc 1440 152508-序列表.doc 201124160 ccaggaggaa auaaacaugc cccaguugcu gaucucuaaa aaaaaaaaaa aa <210> 2 <211> 1489 <212> RNA <213〉智人 <400> 2 cgggcgacag cagggccgcg gugcaguguc cgacccgaga guugcggccu gagucaccgg ccccgcccuc cggagccgga cgcugcggga ggcccgggag cggcagugga accgacuccc agaacuccgg acgugugcgg cgugagucgc agccauguuc cugguuaacu cguucuugaa gggcggcggc ggcggcggcg ggggaggcgg gggccugggu gggggccugg gaaaugugcu uggaggccug aucagcgggg ccgggggcgg cggcggcggc ggcggcggcg gcggcggugg uggaggcggc gguggcggug gaacggccau gcgcauccua ggcggaguca ucagcgccau cagcgaggcg gcugcgcagu acaacccgga gcccccgccc ccacgcacac auuacuccaa cauugaggcc aacgagagug aggagguccg gcaguuccgg agacucuuug cccagcuggc uggagaugac auggagguca gcgccacaga acucaugaac auucucaaua agguugugac acgacacccu gaucugaaga cugaugguuu uggcauugac acaugucgca gcaugguggc cgugauggau agcgacacca caggcaagcu gggcuuugag gaauucaagu acuuguggaa caacaucaaa agguggcagg ccauauacaa acaguucgac acugaccgau cagggaccau uugcaguagu gaacucccag gugccuuuga ggcagcaggg uuccaccuga augagcaucu cuauaacaug aucauccgac gcuacucaga ugaaaguggg aacauggauu uugacaacuu caucagcugc uuggucaggc uggacgccau guuccgugcc uucaaaucuc uugacaaaga uggcacugga caaauccagg ugaacaucca ggaguggcug cagcugacua uguauuccug aacuggagcc ccagacccgc ccccucacug ccuugcuaua ggagucaccu ggagccucgg ucucucccag ggccgauccu gucugcaguc acaucuuugu ggggccugcu gacccacaag cuuuuguucu cucaguacuu guuacccagc uucucaacau ccagggccca auuugcccug ccuggaguuc ccccuggcuc uaggacacuc uaacaagcuc uguccacggg ucuccccauu cccaccaggc ccugcacaca cccacuccgu aaccucuccc cuguaccugu gccaagccua gcacuuguga ugccuccaug ccccgagggc ccucucucag uucugggagg augacuccag ucccugcacg cccuggcaca cccuucacgg uugcuaccca ggcggccaag cuccagaccg ugccagaccc aggugcccca gugccuuugu cuauauucug cucccagccu gccaggccca ggaggaaaua aacaugcccc aguugcugau cucuaaaaaa aaaaaaaaa 1492 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1489 6 L 2 A / 319聊智 ^ > > > 0 12 3 tl 1Λ 2 2 2 2 < < < < <400> 3 guggaugagc ugugagugcg gcugggcacu cggaggcgcg cucucgcgcu acccucccgc cuggucuuca gcuacccgcc cgcgcgugcg cggggccgcg cacgucguuc cccgcccucc cgcccgcggu ccuccgucgg uucgucuccg aguuugcgac accugugccg gcucgagccc cgccgccgcc cgcccucgcu uucucucguu aguccacggu ucgcggaccg gcguccccgg 60 120 180 152508-序列表.doc 240 300
300 O 201124160 cgcgaagagg cuggacucgg auucguugcc ugagcaaugg cugccauccg gaagaaacug gugauuguug gugauggagc cuguggaaag acaugcuugc ucauagucuu cagcaaggac caguucccag agguguaugu gcccacagug uuugagaacu auguggcaga uaucgaggug gauggaaagc agguagaguu ggcuuugugg gacacagcug ggcaggaaga uuaugaucgc cugaggcccc ucuccuaccc agauaccgau guuauacuga uguguuuuuc caucgacagc ccugauaguu uagaaaacau cccagaaaag uggaccccag aagucaagca uuucuguccc aacgugccca ucauccuggu ugggaauaag aaggaucuuc ggaaugauga gcacacaagg cgggagcuag ccaagaugaa gcaggagccg gugaaaccug aagaaggcag agauauggca aacaggauug gcgcuuuugg guacauggag uguucagcaa agaccaaaga uggagugaga gagguuuuug aaauggcuac gagagcugcu cugcaagcua gacgugggaa gaaaaaaucu gggugccuug ucuugugaaa ccuugcugca agcacagccc uuaugcgguu aauuuugaag ugcuguuuau uaaucuuagu guaugauuac uggccuuuuu cauuuaucua uaauuuaccu aagauuacaa aucagaaguc aucuugcuac caguauuuag aagccaacua ugauuauuaa cgauguccaa cccgucuggc ccaccagggu ccuuuugaca cugcucuaac agcccuccuc ugcacuccca ccugacacac caggcgcuaa uucaaggaau uucuuaacuu cuugcuucuu ucuagaaaga gaaacaguug guaacuuuug ugaauuaggc uguaacuacu uuauaacuaa cauguccugc cuauuaucug ucagcugcaa gguacucugg ugagucacca cuucagggcu uuacuccgua acagauuuug uuggcauagc ucuggggugg gcaguuuuuu gaaaaugggc ucaaccagaa aagcccaagu ucaugcagcu guggcagagu uacaguucug ugguuucaug uuaguuaccu uauaguuacu guguaauuag ugccacuuaa uguauguuac caaaaauaaa uauaucuacc ccagacuaga uguaguauuu uuuguauaau uggauuuccu aauacuguca uccucaaaga aaguguauug guuuuuuaaa aaagaaagug uauuuggaaa uaaagucaga uggaaaauuc auuuuuuaaa uucccguuuu gucacuuuuu cugauaaaag auggccauau uaccccuuuu cggccccaug uaucucagua ccccauggag cugggcuaag uaaauaggaa uugguuucac gccugaggca auuagacacu uuggaagaug gcauaaccug ucucaccugg acuuaagcau cuggcucuaa uucacagugc ucuuuucucc ucacuguauc cagguucccu cccagaggag ccaccaguuc ucaugggugg cacucagucu cucuucucuc cagcugacua aacuuuuuuu cuguaccagu uaauuuuucc aacuacuaau agaauaaagg caguuuucua aaaaaa 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1926 17A 人 434^智 '>>>> 0 12 3 1* 11 11 11 ^222 <400〉 4 cggaggcagc gagaaagcgc agccaggcgg cugcucggcg uucucucagg ugacugcucg gaguucuccc aguguuuggu guugcaagca ggauccaaag gagaccuaua gugacuccca ggagcucuua gugaccaagu gaagguaccu guggggcuca uugugcccau ugcucuuuca cugcuuucaa cugguaguug uggguugaag cacuggacaa ugccacauac uuuguggaug gugugggucu ugggggucau caucagccuc uccaaggaag aauccuccaa ucaggcuucu 152508-序列表.doc 60 120 180 240 300 201124160 cugucuugug accgcaaugg uaucugcaag ggcagcucag gaucuuuaaa cuccauuccc 360 ucagggcuca cagaagcugu aaaaagccuu gaccugucca acaacaggau caccuacauu 420 agcaacagug accuacagag gugugugaac cuccaggcuc uggugcugac auccaaugga 480 auuaacacaa uagaggaaga uucuuuuucu ucccugggca gucuugaaca uuuagacuua 540 uccuauaauu acuuaucuaa uuuaucgucu uccugguuca agccccuuuc uucuuuaaca 600 uucuuaaacu uacugggaaa uccuuacaaa acccuagggg aaacaucucu uuuuucucau 660 cucacaaaau ugcaaauccu gagaguggga aauauggaca ccuucacuaa gauucaaaga 720 aaagauuuug cuggacuuac cuuccuugag gaacuugaga uugaugcuuc agaucuacag 780 agcuaugagc caaaaaguuu gaagucaauu cagaauguaa gucaucugau ccuucauaug 840 aagcagcaua uuuuacugcu ggagauuuuu guagauguua caaguuccgu ggaauguuug 900 gaacugcgag auacugauuu ggacacuuuc cauuuuucag aacuauccac uggugaaaca 960 aauucauuga uuaaaaaguu uacauuuaga aaugugaaaa ucaccgauga aaguuuguuu 1020 cagguuauga aacuuuugaa ucagauuucu ggauuguuag aauuagaguu ugaugacugu 1080 acccuuaaug gaguugguaa uuuuagagca ucugauaaug acagaguuau agauccaggu 1140 aaaguggaaa cguuaacaau ccggaggcug cauauuccaa gguuuuacuu auuuuaugau 3200 cugagcacuu uauauucacu uacagaaaga guuaaaagaa ucacaguaga aaacaguaaa 1260 guuuuucugg uuccuuguuu acuuucacaa cauuuaaaau cauuagaaua cuuggaucuc 1320 agugaaaauu ugaugguuga agaauacuug aaaaauucag ccugugagga ugccuggccc 1380 ucucuacaaa cuuuaauuuu aaggcaaaau cauuuggcau cauuggaaaa aaccggagag 1440 acuuugcuca cucugaaaaa cuugacuaac auugauauca guaagaauag uuuucauucu 1500 augccugaaa cuugucagug gccagaaaag augaaauauu ugaacuuauc cagcacacga 1560 auacacagug uaacaggcug cauucccaag acacuggaaa uuuuagaugu uagcaacaac 1620 aaucucaauu uauuuucuuu gaauuugccg caacucaaag aacuuuauau uuccagaaau 1680 aaguugauga cucuaccaga ugccucccuc uuacccaugu uacuaguauu gaaaaucagu 1740 aggaaugcaa uaacuacguu uucuaaggag caacuugacu cauuucacac acugaagacu 1800 uuggaagcug guggcaauaa cuucauuugc uccugugaau uccucuccuu cacucaggag 1860 cagcaagcac uggccaaagu cuugauugau uggccagcaa auuaccugug ugacucucca 1920 ucccaugugc guggccagca gguucaggau guccgccucu cggugucgga augucacagg 1980 acagcacugg ugucuggcau gugcugugcu cuguuccugc ugauccugcu cacggggguc 2040 cugugccacc guuuccaugg ccugugguau augaaaauga ugugggccug gcuccaggcc 2100 aaaaggaagc ccaggaaagc ucccagcagg aacaucugcu augaugcauu uguuucuuac 2160 agugagcggg augccuacug gguggagaac cuuauggucc aggagcugga gaacuucaau 2220 ccccccuuca aguugugucu ucauaagcgg gacuucauuc cuggcaagug gaucauugac 2280 aauaucauug acuccauuga aaagagccac aaaacugucu uugugcuuuc ugaaaacuuu 2340 gugaagagug aguggugcaa guaugaacug gacuucuccc auuuccgucu uuuugaugag 2400 aacaaugaug cugccauucu cauucuucug gagcccauug agaaaaaagc cauuccccag 2460 cgcuucugca agcugcggaa gauaaugaac accaagaccu accuggagug gcccauggac 2520 gaggcucagc gggaaggauu uuggguaaau cugagagcug cgauaaaguc cuagguuccc 2580 -4· 152508·序列表.doc 201124160
auauuuaaga ccagucuuug ucuaguuggg aucuuuaugu cacuaguuau aguuaaguuc 2640 auucagacau aauuauauaa aaacuacgug gauguaccgu cauuugagga cuugcuuacu 2700 aaaacuacaa aacuucaaau uuugucuggg gugcuguuuu auaaacauau gccagauuua 2760 aaaauugguu uuugguuuuu cuuuuuucua ugagauaacc augaucauaa gucuauuacu 2820 gauaucugaa uauagucccu ugguauccaa gggaauuggu ugcaggaucc ucguggauau 2880 caaaauucau agaugaucaa gucccuuaua agaguggcau aguauuugca uauaaccugu 2940 guacauucuc cuguauacuu uaaaucaucu cuagauuacu uaugauaccc aauacaaugu 3000 aaauacuaug uaaauaguug uacugucuuu uuauuuauau uauuauuguu auuuuuuauu 3060 uucaaaauuu uuaaaacaua cuuuugaucc acaguugguu gacuucaugg augcagaacc 3120 cauggauaua gagggccaac uguaaucugu agcaacuggc uuaguucauu aggaaacagc 3180 acaaaugaac uuaagauucu caaugacugu gucauucuuu cuuccugcua agagacuccu 3240 cuguggccac aaaaggcauu cucuguccua ccuagcuguc acuucucugu gcagcugauc 3300 ucaagagcaa caaggcaaag uauuuggggc acuccccaaa acuuguugcu auuccuagaa 3360 aaaagugcug uguauuuccu auuaaacuuu acaggaugag aaaaaaaaaa aaaaaaa 3417 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223>化學合成 <400> 5 gagaugacau ggaggucag 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>化學合成 <400> 6 19 cugaccucca ugucaucuc <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213>人工 <220> <223>化學合成 <400> 7 gaguggugca aguaugaac 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223>化學合成 <400> 8 152508-序列表 201124160 guucauacuu gcaccacuc <210〉 9 <211> 19 <212> RNA <213>人工 <220> <223>化學合成 <400> 9 gguggagaac cuuaugguc <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213>人工序列 <220> <223〉化學合成 <400> 10 gaccauaagg uucuccacc <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213>人工 <220> <223>化學合成 <400> 11 agauaaugaa caccaagac 列 序 A工 1219硎人 <210〉 <211> <212> <213> <220> <223>化學合成 <400> 12 gucuuggugu ucauuaucu <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213>人工 <220> <223>化學合成 <400> 13 gaucuucgga augaugaga 列 A工 1419咖人 <210> <211> <212> <213〉 <220> <223>化學合成 <400> 14 ucucaucauu ccgaagauc 152508-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201124160 七、申請專利範圍： 1 · 一種雙股核酸分子，其具有下述結構（A): (A) 5' N1-(N)x-Z 3,（反義股） 3' Z’-N2-(N，)y-z，， 5,(有義股） • 其中N2、N及N·各自為未經修飾或經修飾之核糖核苷 酸或非習知部分； 其中（N)x及（N')y各自為寡核苷酸，其中各連續N或N1 藉由共價鍵接合於相鄰N或Ν'; Ο 其中χ及y各自獨立地為17至39之整數； 其中（N')y序列與（N)x序列互補，且（N)x與標靶RNA中 之連續序列互補； 其中N共價鍵結於（N)x ’且與該標靶RNA錯配或為與 該標乾RNA互補之DNA核苷酸； 其中N1為選自由天然或經修飾之尿|、去氧核糖尿 普、核糖料、去氧核糖胸苷、腺芽或去氧腺苦組成之 群的部分；
    其中z，|可存在或不存在’但若存在，則為共價連接於 N2-(N')y之5’末端的封端部分；及 其中Z及Z，各自獨立地存在或不存在，但若存在，則 獨立地為共價連接於其所存在股之3,末端的⑴個連續 核苷酸、連續非核苷酸部分或其組合。 2·如請求項1之雙股核酸分子， 床w入u 八中遠（N)y序列與該（N)x 序列完全互補。 3.如請求項1之雙股核酸分子 其中N2- ⑽)y序列與νι·(ν)χ 15250S.doc 201124160 序列互補。 4. 如請求⑹之雙股核酸分子，其中_包含與標^财中 之約17個至約39個連續核苷酸完全互補的反義序列。 5. 如請求項1之雙股核酸分子，其中（Ν)χ包含與標靶rna中 約17個至約39個連續核苷酸實質上互補的反義序列。 6. 如請求項1之雙股核酸分子，其中心與炉形成華特生-克 里克驗基對（Watson-Crick base pair)。 7. 如請求項2之雙股核酸分子，其中⑷與炉形成非華特生· 克里克鹼基對。 8·如請求項1至7中任一項之雙股核酸分子，其中$ x=y=19或x=y=20。 9·如請求項8之雙股核酸分子，其中x=y=18 10.如請求項！至7中任一項之雙股核酸分子，其中Μ共價鍵 結於（Ν)χ，且與該標靶rNa錯配。 、 11-如凊求項1至7中任-項之雙股核酸分子，其中^共價鍵 結於（N)x，且為與該標互補之dna部分。 12·如請求項1至7中任-項之雙股核酸分子，其中該反義股 之位置1上之尿苷係經選自腺苷、去氧腺苷、去氧尿 苷、核糖胸苷或去氧胸苷之N]取代。 13.如π求項12之雙股核酸分子，其中Nl係選自腺苦、去氧 腺苷或去氧尿苷。 14·如π求項1至7中任—項之雙股核酸分子’其中該反義股 ^位置1上之鳥苦係經選自腺苦、去氧腺苦、尿苦、去 氧尿苷、核糖胸苷或去氧胸苷之Ν1取代。 152508.doc 201124160 Μ•如請求項Η之雙股核酸分子，其中N1係選自腺芽、去氧 腺苦、尿苷或去氧尿苷。 1 6 ·如請求項1至7中任一項之離A 股核酸分子’其中該反義股 # 上之胞普係經選自腺苦、去氧腺芽、尿芽、去 氧尿苷、核糖胸苷或去氧胸苷之N1取代。 士二求項16之雙股核酸分子，其中Nl係選自腺苦、去氧 腺芽、尿苷或去氧尿苷。 〇 18·如4求項⑴中任—項之雙股核酸分子，其中該反義股 之位置i_hm系經選自去氧料、去氧尿#、核糖 胸苷或去氧胸苷之N1取代。 -月求項18之雙股核酸分子，其中Nl係選自去氧腺皆或 去氧尿苷。 •如π求項1至7中任一項之雙股核酸分子，其中〜與、2形 成尿苦或去氧尿芽與腺普或去氧腺普之間的驗基對。 如明求項1至7中任一項之雙股核酸分子，其中Ν1與Ν2形 ◎成去氧尿苦與腺苦之間的驗基對。 22. 如„月求項中任一項之雙股核酸分子，其中ζ"存在。 23. 如請求項1 $ 7 士 / 中任一項之雙股核酸分子，其中Z及Z'不存 ° 24·如請求項]$ 7 中任一項之雙股核酸分子，其中Z或Z'中之 一者存在。 25. 如請求項， 主7中任一項之雙股核酸分子，其中2或2，包含 非核苷酸部分。 26. 如請求項1至, /中任一項之雙股核酸分子，其中N或N，中 152508.doc 201124160 之至少一者包含2,〇Me糖修飾之核糖核苷酸。 27. 如請求項26之雙股核酸分子，其中N包含單一交替的未 經修飾之核糖核苷酸與2,〇Me糖修飾之核糖核苷酸。 28. 如凊求項1至7中任一項之雙股核酸分子，其中N2包含 2OMe糖修飾之核糖核苷酸。 29. 如請求項1至7中任一項之雙股核酸分子，其中該雙股核 酸分子為 siRNA、siNA 或 miRNA。 30. 如請求項1之雙股核酸分子，其中x=y=18，z，不存在，z 存在且包含兩個彼此經由磷酸二酯鍵共價鍵聯之烷基部 分’ N2包含腺苷且Νι包含尿苷。 3 1.如3青求項1之雙股核酸分子，其中x=y= 1 8，Z'不存在，Z 存在且包含兩個彼此經由磷酸二酯鍵共價鍵聯之烧基部 分’ N2包含尿苷或去氧尿苷且以包含腺苷。 32·如請求項丨至7中任一項之雙股核酸分子，其中該標靶 mRNA為哺乳動物基因之mRNA。 33. 如β求項32之雙股核酸分子，其中該標靶mRNA為人類 基因之mRNA。 34. 如请求項丨至7中任一項之雙股核酸分子，其係用於治 療。 35. -種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項α34中任 一項之雙股核酸分子；及醫藥學上可接受之載劑。 36. —種如請求項1至34中 一 峭I雙叔核酸分子或如請求 項35之醫藥組合物的料，其制於製備肋或治療或 延遲疾病或病況發作之藥物，其中該疾病或該病況及/或 152508.doc 201124160 與其相關之症狀係選自由以下組成之群：聽力喪失；急 性腎衰竭（ARF);腎移植後移植腎功能延遲恢復（dgf); 青光眼；眼缺血性病況，包括非動脈炎性缺血性視神經 病（NAION)、前部缺血性視神經病、年齡相關之黃斑變 性（AMD)、缺血性視神經病（I0N)及乾眼症候群；急性呼 、 吸窘迫症候群（ARDS)及其他急性肺及呼吸道損傷；慢性 阻基性肺病（COPD);原發性移植物功能衰竭；缺血-再 ◎ 灌注損傷；再灌注損傷；再灌注水腫；同種異體移植功 能障礙；器官移植，尤其肺移植後肺再植入反應及/或原 發性移植物功能障礙（PGD);器官移植，包括肺、肝、 〜臟、騰臟及腎移植；腎毒性及神經毒性；脊髓損傷； 腦損傷；神經退化性疾病或病況；褥瘡；口腔黏膜炎； 纖維變性病症；及癌症。 37. —種產生由有義股及反義股組成之經修飾之siRNA雙鏈 體的方法，其包含下列步驟： 〇 a)選擇標靶RNA中之具有連續17至25個核苷酸之序列 且合成與該標靶mRNA之該具有連續17至25個核苷酸之 序列互補的反義股，其中該反義股之5，末端核普酸係經 尿苦、經修飾之尿苷、核糖胸芽、去氧核糖胸普、腺 苷、經修飾之腺苷、去氧腺苷或經修飾之去氧腺苷取 代，其料m件為在該導彳丨隸㈣之5,末端核普酸與 該標乾mRNA之3,末端核#酸之間不產生&山擺動驗基 對； b)合成與該反義股互補之具有17至25個核苷酸之有義 152508.doc 201124160 股’其争該有義股之3f末端核苷酸與該反義股之5 ’末端 核苷酸形成華特生-克里克鹼基對；及 c)黏接該有義股與該反義股；從而產生經修飾之 siRNA雙鏈體。 38. —種產生由有義股及反義股組成之經修飾之siRNA雙鏈 體的方法’其包含下列步驟： a)選擇標^RNA中之具有連續18個核苷酸之序列且合 成與該標靶mRNA之該具有連續丨8個核苷酸之序列互補 的反義股，其中該反義股之5，末端核苷酸係經尿苷、經 去氧核糖胸苷、腺苷、經修飾
    修飾之尿苷、核糖胸苷、 之腺苷、去氧腺答或麵你 如清求項37或38之方法， 苦0
    152508.doc
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