JP5824463B2 - 非ヌクレオチドオーバーハングを含むオリゴヌクレオチド化合物 - Google Patents

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Description

本出願全体を通して、様々な特許および科学出版物が引用されている。これらの出版物の開示は、その全体が本明細書における参照により本出願に組み込まれ、本発明の属する最新技術をさらに完全に記載する。
関連出願
本出願は、２０１０年１月７日出願の米国特許仮出願第６１／２９２８７８号、２０１０年９月１６日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９０４７号および２０１０年１２月８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５９５７８号の優先権を主張する。これらは、本明細書における参照によりその全体が組み込まれる。
発明の分野
本明細書では、哺乳動物および非哺乳動物標的遺伝子の阻害のための修飾二重鎖核酸分子、この分子を含む医薬組成物およびその使用方法が開示される。従って、この化合物および組成物は、遺伝子発現が有害な結果をもたらす疾患もしくは状態および／またはこのような疾患もしくは状態に関連する症状に罹患している患者の治療に有用である。特定の実施形態では、本発明は、前記化合物を含む組成物およびその使用方法を提供する。
発明の背景
哺乳動物では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ １９９８、３９１：８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ ２００４、４３１（７００６）：３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ ２００４、１１６（２）：２８１−９７）により媒介される。植物の対応するプロセスは、通常、特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、また、真菌では、クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれる。
ｓｉＲＮＡは、その内在性（細胞性）カウンターパートの遺伝子／ｍＲＮＡの発現を下方制御または静める（防ぐ）二重鎖ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ干渉の機序は、以下で詳述する。
本発明の譲受人による国際公開第２００８／０５０３２９号および米国特許出願第１１／９７８、０８９号は、アポトーシス促進性遺伝子の阻害剤に関し、参照によってその全体が組み込まれる。本発明の譲受人による国際公開第２００８／１０４９７８号および同２００９／０４４３９２号は、化学修飾ｓｉＲＮＡ構造に関し、参照によってその全体が組み込まれる。
本発明は、一般的な遺伝子発現、および、特に、哺乳動物および原核生物遺伝子発現の阻害のための化学的または構造的修飾ｓｉＲＮＡ化合物を提供する。本明細書では、３’末端に３’（または２’）オーバーハングとして１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含むｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製に有用な新規構造的モチーフ、これを含む組成物およびその使用方法が提供される。出願人は、１つ、および好ましくは、２つまたは３つの非ヌクレオチド部分のｓｉＲＮＡの３’末端への付加により、ｓｉＲＮＡの活性および／または安定性および／または送達の観点から好都合な特性が得られることを明らかにした。従って、既存のｓｉＲＮＡを都合よく修飾でき、また、今後のｓｉＲＮＡを設計し、産生してこの知見を利用することができる。理論に拘泥する意図はないが、本明細書で開示され、３’非ヌクレオチドオーバーハング（ＺまたはＺ’すなわちＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ）を有する核酸分子は、アルゴノートのＰＡＺドメインに認識され、ＲＮＡｉを実行でき、また一方で、良好な安定性と活性を示す。
用語「３’末端」が、本出願の全体にわたり、非ヌクレオチド部分が結合しているｓｉＲＮＡ鎖の末端を示すために使用されているが、明確に別義が指示されていなければ、非ヌクレオチド部分、または「オーバーハング」は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の（デオキシ）リボース部分の３’位置、またはオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の（デオキシ）リボース部分の２’位置に、例えば、
（３’末端（デオキシ）リボース部分の３’位置に結合；図中、Ｂはヌクレオチド塩基、ＲはＨまたはＯＨ）または
（３’末端（デオキシ）リボース部分の２’位置に結合）のように、結合可能であることは理解されよう。
本明細書では、好都合な特性を有し、ｓｉＲＮＡをどのような標的配列にも適用可能とし、また、二重鎖の３’末端の１つまたは両方で非ヌクレオチドオーバーハングを含む二重鎖核酸分子の新規構造が提供される。本明細書で開示される化学修飾されたｓｉＲＮＡにおける修飾は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に役立つ安定で活性なｓｉＲＮＡ化合物の調製に有用である。
また、本出願は、１つまたは複数のこのようなオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および疾患または状態および／またはそれに関連する症状が標的遺伝子の発現に関連しており、このような組成物を必要としている患者の疾患または状態の発生または重篤さの治療または予防の方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、下記からなる群より選択される：難聴、急性腎不全（ＡＲＦ）、緑内障、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性の肺および呼吸損傷、肺移植後虚血再灌流障害、眼性虚血状態、肺、肝臓、心臓、膵臓を含む臓器移植、および臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）を含む腎臓移植、腎毒性および神経毒性、脊髄損傷、褥瘡、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ドライアイ症候群、口腔粘膜炎、虚血性視神経症（ＩＯＮ）および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）。このような方法は、予防または治療有効量の、少なくとも１つのこのような遺伝子の発現または活性を阻害する、または低減させる１つまたは複数のこのような化合物を、このような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含む。このような化合物は、他の治療と同時にまたはその代わりに投与することが可能である。
オリゴヌクレオチドは、任意の哺乳動物または非哺乳動物遺伝子を標的にするよう選択される。種々の実施形態では、修飾化合物は、配列番号９７〜６８６５４のいずれかに設定されたオリゴヌクレオチド配列を含む（米国特許出願第１１／９７８、０８９号および国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００７／００１２７８号で開示されている。これらは、参照によって本明細書にその全体が組み込まれる）。
一態様では、少なくとも１つの非ヌクレオチド３’末端オーバーハングを有する二重鎖ｓｉＲＮＡ化合物が提供される。本出願は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む合成二重鎖ｓｉＲＮＡ化合物を提供し、少なくとも１つのセンスまたはアンチセンス鎖が、３’末端に共有結合した、１、２、３、４、または５つの、好ましくは、２つまたは３つの非ヌクレオチド部分を含み、非ヌクレオチド部分は、逆位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）脱塩基部分、脱塩基部分、アルキル（炭化水素）部分またはその誘導体、およびリン酸塩ベース部分から選択される。一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、逆位脱塩基部分、アルキル（炭化水素）部分またはその誘導体およびリン酸塩ベース部分から選択される。一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、アルキル（炭化水素）部分またはその誘導体を含む。本明細書では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸分子が提供され、少なくとも１つの鎖が、非ヌクレオチド部分が存在する鎖の３’末端ヌクレオチドの糖残基の３’または２’位置で共有結合した非ヌクレオチド部分を含み；非ヌクレオチド部分がプロパノール、リン酸ジエステルに結合したＣ３アルキル部分、ホスホロチオエートに結合したＣ３アルキル部分、デオキシリボ脱塩基（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏａｂａｓｉｃ）部分、リボ脱塩基（ｒｉｂｏａｂａｓｉｃ）部分およびそれらの組み合わせ、からなる群より選択される。
一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、リン酸塩ベース結合、好ましくは、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合、を介して糖残基に結合する。一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、アンチセンス鎖の３’末端にある糖残基の３’または２’位置に共有結合したＣ３アルキル部分を含む。種々の実施形態では、Ｃ３アルキル部分は、Ｃ３ＰｉおよびＣ３ＯＨから選択される。
一部の実施形態では、分子は、リン酸ジエステルもしくはホスホロチオエート結合により共有結合した２つもしくは３つのＣ３アルキル部分、またはリン酸ジエステルもしくはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合した１つのＣ３アルキル部分を含む。好ましい実施形態では、分子は、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により共有結合した２つのＣ３アルキル部分を含む。
一部の実施形態では、Ｃ３アルキル部分は、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＰｉまたはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ部分から選択される。
他の実施形態では、分子は、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したＣ３アルキル部分を含み、脱塩基部分は、デオキシリボ脱塩基部分またはリボ脱塩基部分から選択される。一部の実施形態では、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したＣ３アルキル部分は、Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ、Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ、ｒＡｂ−Ｃ３ＯＨ、ｒＡｂ−Ｃ３Ｐｉ、ｄＡｂ−Ｃ３ＯＨ、またはｄＡｂ−Ｃ３Ｐｉから選択される。
一部の実施形態では、構造（Ａ１）：
（Ａ１） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
を有する二重鎖核酸分子が提供される。式中、各ＮおよびＮ’は、ヌクレオチドであり、非修飾もしくは修飾、または非通常（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）部分であってもよく；
各（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれ連続したＮまたはＮ’は、次のＮまたはＮ’に共有結合により結合され；
少なくとも１つのＺまたはＺ’が存在し、ＺまたはＺ’が存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み；
ｚ"は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、共有結合で（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合したキャッピング部分であり；
各ｘおよびｙは、独立に、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し相補的であり；さらに（Ｎ）ｘの配列は、標的ＲＮＡの連続した配列に対し相補的である。
一部の実施形態では、それぞれ連続したＮまたはＮ’を結合している共有結合はリン酸ジエステル結合である。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９〜２７、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７である。一部の実施形態では、ｘ＝ｙおよび各ｘおよびｙは、１９、２０、２１、２２または２３である。種々の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、ＺまたはＺ’の１つが存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成され；Ｚ’が存在し、１つの非ヌクレオチド部分から構成される。
さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、ＺおよびＺ’が存在し、それぞれ独立に２つの非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、二重鎖核酸分子は、アンチセンス鎖（５’末端）の位置１にＤＮＡ部分または標的に対するミスマッチを含む。このような構造は、本明細書に記載されている。一実施形態では、下記の構造（Ａ２）を有する二重鎖核酸分子が提供される：
（Ａ２） ５’ Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’（アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’（センス鎖）
それぞれ、Ｎ２、ＮおよびＮ’は、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非通常部分であり；
それぞれ（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、オリゴヌクレオチドであり、各連続したＮまたはＮ’は隣接するＮまたはＮ’に共有結合により結合し；
それぞれ、ｘおよびｙは、独立に、１７〜３９の整数であり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘに相補的であり、また、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡの連続した配列に相補的であり；
Ｎ１は、共有結合で（Ｎ）ｘに結合し、標的ＲＮＡにミスマッチであるか、または標的ＲＮＡに対し相補的なＤＮＡ部分であり；
Ｎ１は、天然もしくは修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシン、からなる群より選択される部分であり；
ｚ"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合したキャッピング部分であり；さらに
少なくとも１つのＺまたはＺ’が存在し、ＺまたはＺ’が存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、１つのＺまたはＺ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成され；Ｚ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、ＺおよびＺ’が存在し、それぞれ独立に、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し完全に相補的である。種々の実施形態では、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの配列は、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列に対して相補的である。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し完全に相補的なアンチセンスを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し実質的に相補的なアンチセンスを含む。
一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、ワトソン・クリック塩基対を形成する。一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、非ワトソン・クリック塩基対を形成する。一部の実施形態では、塩基対は、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの間で形成される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８である。Ｎ１−（Ｎ）ｘ中のｘ＝１８である場合、Ｎ１は位置１を指し、位置２〜１９は（Ｎ）１８に含まれる。Ｎ２−（Ｎ’）ｙ中のｙ＝１８である場合、Ｎ２は位置１９を指し、位置１〜１８は（Ｎ’）１８に含まれる。
一部の実施形態では、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ＲＮＡに対しミスマッチである。種々の実施形態では、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ＲＮＡに対し相補的なＤＮＡ部分である。
一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、ウリジンまたはデオキシウリジンおよびアデノシンまたはデオキシアデノシンの間で塩基対を形成する（ｒＵ−ｒＡ、ｒＵ−ｄＡ、ｄＵ−ｒＡ、ｄＵ−ｄＡ）。他の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、デオキシウリジンおよびアデノシンの間で塩基対を形成する。
一部の実施形態では、二重鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。本明細書で提供される二重鎖核酸分子は、また、「二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」とも呼ばれる。
特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８である。一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、ワトソン・クリック塩基対を形成する。他の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、非ワトソン・クリック塩基対を形成する。特定の実施形態では、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシン、からなる群より選択される。他の実施形態では、Ｎ１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、および修飾デオキシリボウリジン、からなる群より選択される。
一部の実施形態では、それぞれ、ＮおよびＮ’は、非修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’は、化学修飾ヌクレオチドまたは非通常部分を含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド（ｍｉｒｒｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。一部の実施形態では、通常部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し実質的に相補的である。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し完全に相補的なアンチセンス配列を含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示の核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
構造Ａ１およびＡ２の一部の実施形態では、Ｚが存在し、Ｚ’が存在しない。他の実施形態では、Ｚ’が存在し、Ｚが存在しない。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’両方が存在する。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’が存在し、両者は同じある。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’が存在し、両者は異なっている。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’は独立に、２、３、４もしくは５つの非ヌクレオチド部分または２、３、４、もしくは５つの非ヌクレオチド部分とヌクレオチドの組み合わせである。一部の実施形態では、それぞれ、Ｚおよび／またはＺ’は、リン酸ジエステル結合を介してｓｉＲＮＡ鎖の３’末端に共有結合した２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
非ヌクレオチド部分は、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分またはその誘導体、および無機リン酸塩、からなる群より選択される。一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、アルキル部分またはその誘導体である。一部の実施形態では、アルキル部分は、アルコール、末端アミン、末端リン酸塩および末端ホスホロチオエート部分、からなる群より選択される末端官能基を含む。
一部の実施形態では、Ｚが存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分またはその誘導体、および無機リン酸塩、からなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚが存在し、２つのアルキル部分またはその誘導体から構成される。
さらなる実施形態では、Ｚ’が存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、からなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚ’が存在し、１つまたは複数のアルキル部分またはその誘導体を含む。
一部の実施形態では、Ｚが存在し、２つのアルキル部分またはその誘導体から構成され、Ｚ’が存在し、単一のアルキル部分またはその誘導体から構成される。
一部の実施形態では、それぞれ、ＺおよびＺ’が、脱塩基部分、例えば、デオキシリボ脱塩基部分（本明細書では、「ｄＡｂ」と呼ぶ）またはリボ脱塩基部分（本明細書では、「ｒＡｂ」と呼ぶ）を含む。一部の実施形態では、それぞれ、Ｚおよび／またはＺ’が、２つの共有結合脱塩基部分を含み、例えば、５’>３’ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂまたはｄＡｂ−ｒＡｂまたはｒＡｂ−ｄＡｂである。各部分は、共有結合、好ましくは、リン酸ベース結合を介して隣接部分と共有結合する。一部の実施形態では、リン酸ベース結合はホスホロチオエート、ホスホノ酢酸またはリン酸ジエステル結合である。
一部の実施形態では、それぞれ、Ｚおよび／またはＺ’は、独立に、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６アルキル部分、任意選択で、Ｃ３［プロパン、−（ＣＨ２）３−］部分またはその誘導体、例えば、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ）、プロパンジオール、またはプロパンジオールのリン酸ジエステル誘導体（「Ｃ３Ｐｉ」）を含む。好ましい実施形態では、それぞれ、Ｚおよび／またはＺ’は、２つの炭化水素部分を含み、一部の例では、Ｃ３−Ｃ３である。それぞれ、Ｃ３は、共有結合、好ましくは、リン酸ベース結合を介して隣接のＣ３と共有結合する。一部の実施形態では、リン酸ベース結合は、ホスホロチオエート、ホスホノ酢酸またはリン酸ジエステル結合である。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、少なくとも１つのＺまたはＺ’が存在し、ＺまたはＺ’が存在する鎖に共有結合した少なくとも２つの非ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、それぞれ、ＺおよびＺ’は、独立に、Ｃ３アルキル、Ｃ３アルコールまたはＣ３エステル部分を含む。一部の実施形態では、Ｚ’が存在せず、Ｚが存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。一部の実施形態では、Ｚが存在せず、Ｚ’が存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。
構造Ａ１およびＡ２の一部の実施形態では、それぞれ、ＮおよびＮ’が非修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’は、化学修飾ヌクレオチドまたは非通常部を含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分、から選択される。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は（Ｎ）ｘの配列に対し実質的に相補的である。
他の実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、糖残基中で修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、化合物は、糖残基の２’位置の修飾を含む。一部の実施形態では、２’位置の修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、アルコキシ部分を含み、好ましい実施形態では、アルコキシ部分は、メトキシ部分（２’−Ｏ−メチル；２’ＯＭｅ；２’−ＯＣＨ３としても知られる）である。一部の実施形態では、核酸化合物は、アンチセンスおよびセンス鎖の片方または両方中の２’ＯＭｅ糖修飾交互（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ）リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、化合物は、アンチセンス鎖、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ、中にのみ２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の中間のリボヌクレオチド；例えば、１９塩基長の鎖中の位置１０のリボヌクレオチドは非修飾である。種々の実施形態では、核酸化合物は、少なくとも５つの交互２’ＯＭｅ糖修飾および非修飾リボヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、交互位置中に修飾リボヌクレオチドを含み、ここで、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’および３’末端の各リボヌクレオチドが糖残基中で修飾され、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’および３’末端の各リボヌクレオチドは、糖残基中で非修飾である。
一部の実施形態では、二重鎖分子は、１つまたは複数の次の修飾を含む：
ａ）アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、８、または９の位置の内の少なくとも１つのＮが、２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドから選択され；
ｂ）センス鎖の５’末端から９または１０の位置の内の少なくとも１つのＮ’が、２’５’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンから選択され；さらに
ｃ）（Ｎ’）ｙの３’末端位置の４、５、または６つの連続した位置中のＮ’が、２’５’ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、二重鎖分子は、次の修飾の組み合わせを含む：
ａ）アンチセンス鎖が、５’末端から５、６、７、８、または９の位置の少なくとも１つに２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み；さらに
ｂ）センス鎖が、５’末端から９または１０の位置に少なくとも１つの２’５’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンを含む。
一部の実施形態では、二重鎖分子は、次の修飾の組み合わせを含む：
ａ）アンチセンス鎖が、５’末端から５、６、７、８、または９の位置の少なくとも１つに２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み；さらに
ｃ）センス鎖が、３’の末端から２番目または３’末端位置に４、５、または６つの連続した２’５’ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖［（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ］が、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖が、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖が、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖中の全ピリミジンヌクレオチドが２’ＯＭｅ糖修飾されている。一部の実施形態では、センス鎖が、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖が、独立に、３’末端および５’末端でリン酸化または非リン酸化される。構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖が、３’および５’末端で非リン酸化される。他の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖が、３’末端でリン酸化される。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、（Ｎ）ｙが、ミラーヌクレオチド、２’５’ヌクレオチドおよびＴＮＡから選択される少なくとも１つの非通常部分を含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチドである。種々の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡである。特定の実施形態では、センス鎖が、９または１０（５’末端から）の位置に非通常部分を含む。好ましい実施形態では、センス鎖が、９（５’末端から）の位置に非通常部分を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、１９ヌクレオチド長であり、１５、（５’末端から）の位置に４、５、または６つの連続した非通常部分を含む。一部の実施形態では、センス鎖が、１５、１６、１７、および１８の位置に４つの連続した２’５’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖が、１５、１６、１７、１８および１９の位置に５つの連続した２’５’リボヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、センス鎖がさらにＺ’を含む。一部の実施形態では、Ｚ’は、Ｃ３ＯＨ部分またはＣ３Ｐｉ部分を含む。
構造Ａ１の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙが、１〜１７および１９の位置の非修飾リボヌクレオチドおよび３’末端から２番目の位置（位置１８）の１つのＬ−ＤＮＡから構成される。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙが、１〜１６および１９の位置の非修飾リボヌクレオチドおよび３’末端から２番目の位置（位置１７と１８）の２つの連続したＬ−ＤＮＡから構成される。種々の実施形態では、非通常部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により、隣接するヌクレオチドに結合したヌクレオチドである。種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合した３’末端の２、３、４、５、または６つの連続したリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４つの連続したヌクレオチドが、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチドが３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドが２’ＯＭｅ糖修飾を含むのが好ましい。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙが、１５、１６、１７、１８および１９の位置に、２’−５’ヌクレオチド間結合（２’−５’ヌクレオチド）により隣接ヌクレオチドと結合した２つ以上の連続したヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチド（３’Ｈまたは３’ＯＨの代わりに３’ＯＭｅ）を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１５、１６および１７の位置に２’−５’ヌクレオチドを含み、それにより、隣接ヌクレオチドが１５−１６、１６−１７および１７−１８の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合され；または、１５、１６、１７、１８、および１９の位置に２’−５’ヌクレオチドを含み、それにより、隣接ヌクレオチドが１５−１６、１６−１７、１７−１８および１８−１９の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合され、さらに３’ＯＨが、３’末端ヌクレオチドまたは１６、１７および１８の位置で利用可能となり、それにより、隣接ヌクレオチドが、１６−１７、１７−１８および１８−１９の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合される。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙが、１６および１７の位置または１７および１８の位置または１５および１７の位置に２’−５’ヌクレオチドを含み、それにより、隣接ヌクレオチドが、１６−１７および１７−１８の位置間または１７−１８および１８−１９の位置間または１５−１６および１７−１８の位置間で２’−５’ヌクレオチド間結合によりそれぞれ結合される。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）が、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドに置換される。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙが、４つの２’−５’結合、具体的には、１５−１６、１６−１７、１７−１８および１８−１９の位置のヌクレオチドの間の結合、により３’末端で結合された５つの連続したヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合により３’末端で結合された５つの連続したヌクレオチドを含み、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップ、から独立に選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。Ｃ３アルキルキャップは、３’または５’末端ヌクレオチドに共有結合している。一部の実施形態では、３’のＣ３末端キャップは、３’リン酸塩をさらに含む。一部の実施形態では、３’のＣ３末端キャップは、３’末端ヒドロキシル基をさらに含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡの位置１８を含み；さらに（Ｎ’）ｙは、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップ、から独立に選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、３’末端リン酸塩（すなわち、３’末端でリン酸化されている）を含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の全ピリミジンは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
構造Ａ２の一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２はリボアデノシン部分である。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８、であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合、具体的には、１５−１６、１６−１７、１７−１８および１８−１９の位置のヌクレオチド間の結合により結合された３’末端の５つの連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、結合は、リン酸ジエステル結合を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合により結合された３’末端の５つの連続したヌクレオチドを含み、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップ、から独立に選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡ位置１８を含み；さらに（Ｎ’）ｙが、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップ、から独立に選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。一部の実施形態では、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端リン酸塩を含む。一部の実施形態では、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置に、または１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置に、または３、５、９、１１、１３、１５、１７の位置に、または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置に、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１１、１３、１５、１７および１９（５’末端から）の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置にまたは３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の全ピリミジンは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５、６または７（５’>３’）の位置にＬ−ＤＮＡまたは２’−５’ヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、リボヌクレオチドをさらに含み、これは、５−６または６−７（５’>３’）の位置のリボヌクレオチド間の２’５’ヌクレオチド間結合を生成する。
さらなる実施形態では、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、Ｚをさらに含み、ここでＺは、非ヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態では、非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３-Ｃ３［１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］２である。
構造Ａ２の一部の実施形態では、（Ｎ）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１８の位置および３’末端から２番目の位置（位置１７）の１つのＬ−ＤＮＡの非修飾リボヌクレオチドから構成される。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１５および１８の位置および３’末端から２番目の位置（位置１６および１７）の２つの連続したＬ−ＤＮＡの非修飾リボヌクレオチドから構成される。種々の実施形態では、非通常部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドである。種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合した３’末端の２、３、４、５、または６つの連続したリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４つの連続したヌクレオチドが、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチドが３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含むのが好ましい。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙ中の１４、１５、１６、１７、および１８の位置の２つ以上の連続したヌクレオチドが、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１５−１６、１６−１７および１７−１８の位置の間または１６−１７および１７−１８の位置の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１４−１５、１５−１６、１６−１７、および１７−１８の位置の間または１５−１６、１６−１７、および１７−１８の位置の間または１６−１７および１７−１８の位置の間または１７−１８の位置の間または１５−１６および１７−１８の位置の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）が、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドで置換される。
Ｃ３アルキル部分は、（Ｎ’）ｙの３’末端および／またはリン酸ジエステル結合を介して（Ｎ）ｘの３’末端に共有結合可能である。一部の実施形態では、アルキル部分は、プロパノール、リン酸プロピルまたはプロピルホスホロチオエートを含む。一部の実施形態では、それぞれ、ＺおよびＺ’は、プロパノール、リン酸プロピル、プロピルホスホロチオエート、これらの組み合わせまたはそれらの倍数結合体、特に、２つまたは３つのプロパノール、リン酸プロピル、プロピルホスホロチオエートが共有結合したもの、またはそれらの組み合わせ、から独立に選択される。
一部の実施形態では、それぞれ、ＺおよびＺ’は、リン酸プロピル、プロピルホスホロチオエート、プロピルホスホ−プロパノール；プロピルホスホ−プロピルホスホロチオエート；プロピルホスホ−リン酸プロピル；（リン酸プロピル）３、（リン酸プロピル）２−プロパノール、（リン酸プロピル）２−プロピルホスホロチオエート、から独立に選択される。いずれのプロパンまたはプロパノール結合部分もＺまたはＺ’中に含めることが可能である。
さらなる実施形態では、それぞれ、Ｚおよび／またはＺ’が、脱塩基部分および非修飾デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの組み合わせ、または炭化水素部分および非修飾デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの組み合わせ、または脱塩基部分（デオキシリボもしくはリボ）および炭化水素部分の組み合わせを含む。このような実施形態では、それぞれ、Ｚおよび／またはＺ’が、Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ、Ｃ３Ｐｓ−ｒＡｂ、Ｃ３Ｐｓ−ｄＡｂまたはＣ３Ｐｉ−ｄＡｂを含む。
特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の修飾リボヌクレオチドまたは非通常部分をさらに含むｓｉＲＮＡ化合物を提供し、この化合物では、修飾ヌクレオチドは、糖部分、塩基部分またはヌクレオチド間結合部分に修飾を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数のＮまたはＮ’が、２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチド、２’５’またはＬ−ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、修飾および非修飾リボヌクレオチドを含み、それぞれ、修飾リボヌクレオチドは、糖（２’ＯＭｅ修飾または２’ＯＭｅ糖修飾）上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの３’末端のＮが修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘが３’末端から始まる合計で少なくとも５つの交互修飾リボヌクレオチドおよび少なくとも９つの修飾リボヌクレオチドを含み、残っているＮが、それぞれ非修飾リボヌクレオチドである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙが、少なくとも１つのミラーヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中に少なくとも１つの非通常部分が存在し、非通常部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾または非修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチド、から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮ’は、ミラーヌクレオチドである。
一部の実施形態では、非通常部分は、Ｌ−ＤＮＡミラーヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙの１５、１６、１７、または１８の内の１つの位置に少なくとも１つの非通常部分が存在する。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、位置１７、位置１８または位置１７および１８にＬ−ＤＮＡ部分が存在する。
一部の実施形態では、非通常部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドである。さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中の１５−１９または１６−１９または１７−１９の位置のヌクレオチドが、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合される。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中の１５−１９または１６−１９または１７−１９または１５−１８または１６−１８の位置のヌクレオチドが、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合される。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、９つの交互修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、９つの交互修飾リボヌクレオチドを含み、位置２に２’ＯＭｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ｘ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、奇数位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２および１８の片方または両方に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の少なくとも１つのピリミジンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の全ピリミジンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の実施形態では、Ｎ（ｘ）中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ピリミジンヌクレオチドが、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
種々の実施形態では、ｚ"が存在し、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボース部分；Ｃ３部分、Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；ミラーヌクレオチド、から選択される。
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的配列に対し実質的に相補的である。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的配列に対し１つのミスマッチを含む。好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは、（Ｎ）ｘの５’末端、すなわち、位置１に、標的配列に対し１つのヌクレオチドミスマッチを含む。
特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、実質的に相補的である。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１で標的配列に対し１つのミスマッチを含み、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、完全に相補的である。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１で標的配列に対し１つのヌクレオチドミスマッチを含み、（Ｎ’）ｙは、位置１で（Ｎ）ｘに対し１つのヌクレオチドミスマッチを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘ中の位置２〜１９の１８の連続したヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の１８の連続したヌクレオチドに対し相補的であり、位置１のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列に対しミスマッチである。種々の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の位置１のヌクレオチドは、リボウラシル、修飾リボウラシル、デオキシリボウラシル、修飾デオキシリボウラシル、プソイドウラシル、デオキシプソイドウラシル、デオキシリボチミジン、修飾デオキシリボチミジン、リボシトシン、修飾リボシトシン、デオキシリボシトシン、修飾デオキシリボシトシン、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分、からなる群より選択される部分で置換される。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の位置１のヌクレオチドは、リボウラシル、修飾リボウラシル、デオキシリボウラシル、修飾デオキシリボウラシル、からなる群より選択される部分で置換される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘ中の位置２〜１９の１８の連続したヌクレオチドは、標的ＲＮＡ中の１８の連続したヌクレオチドに対し相補的であり、位置１のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列に対しミスマッチであり、（Ｎ’）ｙの位置１９のヌクレオチドは、（Ｎ）ｘの位置１のヌクレオチドに対し相補的である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘの位置１のヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対しミスマッチであり、（Ｎ’）ｙの位置１９のヌクレオチドは、（Ｎ）ｘの位置１のヌクレオチドに対しミスマッチである。
本明細書で開示の二重鎖核酸分子は、平滑末端、または３’ｄＴｄＴを有する分子に比べて、改善された安定性および／または改善された活性および／または低減されたオフターゲット効果および／または低減された免疫応答および／または強化された細胞による取り込みを示すという点で有利である。
他の実施形態としては、ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３の場合を想定できる。構造（Ａ１）および（Ａ（２）は、哺乳動物または非哺乳動物（例えば、ウイルス、細菌性、植物）遺伝子に対する既知のおよび将来のオリゴヌクレオチド対（センスおよびアンチセンス鎖）にとって有用である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ヒト遺伝子である。種々の実施形態では、ヒト遺伝子のｍＲＮＡは、国際特許公開公報第２００９／０４４３９２号で説明されている。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチド対は、国際特許公開公報第２００９／０４４３９２号で説明されている。さらなる実施形態では、構造（Ａ１）または（Ａ２）は、国際特許公開公報第２００９／０４４３９２号で説明されている修飾およびモチーフをさらに含む。
別の態様では、本発明は、ヒト遺伝子発現を阻害するのに有効な量の本発明の分子および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。
さらに具体的には、本発明は、急性腎不全（ＡＲＦ）、難聴、緑内障、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）および他の急性の肺および呼吸障害、肺、腎臓、骨髄、心臓、膵臓、角膜もしくは肝臓移植を含むおよび臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）腎毒性を含む臓器移植傷害（例えば、虚血-再潅流障害）、脊髄損傷、褥瘡、ドライアイ症候群、口腔粘膜炎、虚血性視神経症（ＩＯＮ）ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、に罹患している患者の治療に有用な方法と組成物を提供する。
本発明の方法は、遺伝子の発現を阻害する１つまたは複数のｓｉＲＮＡ化合物を患者に投与することを含む。本明細書で開示される新規構造は、任意の標的遺伝子に対するアンチセンスおよび対応するセンス核酸配列中に組み込んだ場合、その標的遺伝子の発現の低減に有用なｓｉＲＮＡ化合物を提供する。標的遺伝子は、哺乳動物または非哺乳動物遺伝子である。
図１Ａ〜１Ｊは、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）にリン酸ジエステル結合を介して共有結合したいくつかの可能な３’アルキル／アルキル誘導体オーバーハングの化学構造を示す。ヌクレオチド部分上のＢは、ヌクレオチド「塩基」を指す。各例のＲは、ＨまたはＯＨのいずれかを指す。図１Ａは、リン酸ジエステル結合経由でプロパノール部分に共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｂは、リン酸ジエステル結合経由でＣ３Ｐｉ部分に共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｃは、リン酸ジエステル結合経由でＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分（Ｃ３はリン酸ジエステル結合経由でＣ３ＯＨに共有結合している）に共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｄは、リン酸ジエステル結合経由でＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ部分に共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｅは、リン酸ジエステル結合経由でＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨに共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｆは、リン酸ジエステル結合経由でＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉに共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｇは、リン酸ジエステル結合経由でＣ３Ｐｉ−ｒＡｂまたはＣ３Ｐｉ−ｄＡｂに共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｈは、リン酸ジエステル結合経由でｒＡｂ−Ｃ３Ｐｉ（Ｒ１＝ＯＨ）またはｄＡｂ−Ｃ３Ｐｉ（Ｒ１＝Ｈ）に共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。図１Ｊは、リン酸ジエステル結合経由でｒＡｂ−ｒＡｂ（Ｒ１＝Ｒ２＝ＯＨ）またはｄＡｂ−ｒＡｂ（Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ）またはｒＡｂ−ｄＡｂ（Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝Ｈ）またはｄＡｂ−ｄＡｂ（Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ）に共有結合した３’末端ヌクレオチドを示す。 図２Ａ〜２Ｆは、３’末端非ヌクレオチドオーバーハングがリボース部分の３’位置ではなく、２’位置に結合していること以外は、図１Ａ〜１Ｆに類似である。 図３Ａ〜３Ｋは、本発明の実施形態に従った、いくつかのオーバーハングを有する３’末端ヌクレオチドの具体的な例を図示したもので、一部の例では、亜リン酸に結合した酸素原子が硫黄で置換されている。 は、２つの二重鎖分子に対する安定性データを示し、Ｓ５０５は、平滑末端１９塩基長二重鎖（実施例中の表３の化合物５）であり、Ｓ８００は、非ヌクレオチドＣ３Ｃ３の３’末端オーバーハングを含む１９塩基長二重鎖（Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、実施例中の表３の化合物７）である。２つの化合物は、細胞抽出物中で少なくとも３６時間の間は安定なヌクレアーゼであるが、Ｓ８００は、約０．１７ｎＭのＩＣ５０値を有し、Ｓ５０５は、１．１ｎＭのＩＣ５０値を有する。２つの化合物を生成するために使用した配列は、配列番号１と２（それぞれ、センス鎖とアンチセンス鎖）に設定されている。
発明の詳細な説明
本出願は、センスおよびアンチセンス鎖の片方または両方の３’末端に共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド部分を含む二重鎖ｓｉＲＮＡ化合物に関する。非ヌクレオチド部分は、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分またはその誘導体、および無機リン酸塩から選択される。
構造設計
一態様では、本明細書では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸分子が提供され、少なくとも１つの鎖が３’末端末端に共有結合した１、２、３、４、または５つの非ヌクレオチド部分を含み；非ヌクレオチド部分が、アルキル（炭化水素）部分またはその誘導体およびリン酸塩ベース部分から選択される。特定の好ましい実施形態では、非ヌクレオチド部分は、アルキル部分またはアルキル誘導体部分を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの鎖は、アンチセンス鎖である。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端末端に共有結合した、Ｃ３−Ｃ３、Ｃ３−Ｃ３−Ｐｉ、Ｃ３−Ｃ３−Ｐｓ、ｉｄＡｂ−ｉｄＡｂを含む、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、構造（Ａ１）を有する二重鎖核酸分子が提供される：
（Ａ１） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
式中、それぞれ、ＮおよびＮ’は、ヌクレオチドであり、非修飾または修飾、または非通常部分であってもよく；
それぞれ、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれ、連続したＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合で結合し；
少なくとも１つのＺまたはＺ’が存在し、ＺまたはＺ’が存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み；
ｚ"は存在しても、存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合したキャッピング部分であり；
それぞれ、ｘおよびｙは、独立に、１８〜４０の間の整数であり；
（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に相補性を有し；さらに（Ｎ）ｘの配列は、標的ＲＮＡ中の連続した配列に相補性を有する。
一部の実施形態では、それぞれ連続したＮまたはＮ’を結合している共有結合は、リン酸ジエステル結合である。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９〜２７、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７である。一部の実施形態では、ｘ＝ｙであり、それぞれ、ｘおよびｙは、１９、２０、２１、２２または２３である。種々の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、１つのＺまたはＺ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成され、また、Ｚ’が存在し、１つの非ヌクレオチド部分から構成される。
さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、ＺおよびＺ’が存在し、それぞれ独立に、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、二重鎖核酸分子は、アンチセンス鎖の位置１（５’末端）で、標的に対しＤＮＡ部分またはミスマッチを含む。このような構造は、本明細書に記載されている。一実施形態では、以下に示されている構造（Ａ２）を有する二重鎖核酸分子が提供される：
（Ａ２） ５’ Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
式中、それぞれ、Ｎ２、ＮおよびＮ’は、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非通常部分であり；
それぞれ、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、それぞれ、連続したＮまたはＮ’が隣接ＮまたはＮ’に共有結合で結合しているオリゴヌクレオチドであり；
それぞれ、ｘおよびｙは、独立に、１７〜３９の間の整数であり；
（Ｎ’）ｙの配列が、（Ｎ）ｘの配列に対し相補性を有し、（Ｎ）ｘが、標的ＲＮＡ中の連続した配列に対し相補性を有し；
Ｎ１が、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ＲＮＡに対しミスマッチであるか、または標的ＲＮＡに対し相補的なＤＮＡ部分であり；
Ｎ１は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシン、からなる群より選択される部分であり；
ｚ"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合したキャッピング部分であり；さらに
少なくとも１つのＺまたはＺ’が存在し、ＺまたはＺ’が存在する鎖の３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、１つのＺまたはＺ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚ’が存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｚが存在し、２つの非ヌクレオチド部分から構成され、また、Ｚ’が存在し、１つの非ヌクレオチド部分から構成される。
さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、ＺおよびＺ’が存在し、それぞれ独立に、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し完全に相補的である。種々の実施形態では、Ｎ２−（Ｎ’）ｙの配列は、Ｎ１−（Ｎ）ｘの配列に対して相補的である。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し完全に相補的なアンチセンスを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し実質的に相補的なアンチセンスを含む。
一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、ワトソン・クリック塩基対を形成する。一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、非ワトソン・クリック塩基対を形成する。一部の実施形態では、塩基対は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの間で形成される。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２０である。好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８である。Ｎ１−（Ｎ）ｘのｘ＝１８である場合、Ｎ１は位置１を指し、位置２〜１９は、（Ｎ）１８に含まれ、Ｎ２−（Ｎ’）ｙのｙ＝１８である場合、Ｎ２は、位置１９を指し、位置１〜１８は、（Ｎ’）１８に含まれる。
一部の実施形態では、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ＲＮＡに対しミスマッチである。種々の実施形態では、Ｎ１は、（Ｎ）ｘに共有結合し、標的ＲＮＡに対し相補的なＤＮＡ部分である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の位置１のウリジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン（ｄＵ）、リボチミジンまたはデオキシチミジン、から選択されるＮ１で置換される。種々の実施形態では、Ｎ１は、アデノシン、デオキシアデノシンまたはデオキシウリジンから選択される。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の位置１のグアノシンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジン、から選択されるＮ１で置換される。種々の実施形態では、Ｎ１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジンまたはデオキシウリジン、から選択される。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の位置１のシチジンは、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジン、から選択されるＮ１で置換される。種々の実施形態では、Ｎ１は、アデノシン、デオキシアデノシン、ウリジンまたはデオキシウリジン、から選択される。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の位置１のアデノシンは、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、リボチミジンまたはデオキシチミジン、から選択されるＮ１で置換される。種々の実施形態では、Ｎ１は、デオキシアデノシンまたはデオキシウリジン、から選択される。
一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、ウリジンまたはデオキシウリジン、およびアデノシンまたはデオキシアデノシンとの間で塩基対を形成する。他の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、デオキシウリジンおよびアデノシンの間で塩基対を形成する。
一部の実施形態では、二重鎖核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。本明細書で提供される二重鎖核酸分子は、また、「二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」とも呼ばれる。
特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８である。一部の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、ワトソン・クリック塩基対を形成する。他の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は、非ワトソン・クリック塩基対を形成する。特定の実施形態では、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシン、からなる群より選択される。他の実施形態では、Ｎ１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、および修飾デオキシリボウリジン、からなる群より選択される。
特定の実施形態では、アンチセンス鎖の位置１（５’末端）は、デオキシリボウリジン（ｄＵ）またはアデノシンを含む。一部の実施形態では、Ｎ１は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシン、からなる群より選択され、Ｎ２は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、および修飾デオキシリボウリジン、からなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｎ１は、リボアデノシンおよび修飾リボアデノシン、からなる群より選択され、Ｎ２は、リボウリジンおよび修飾リボウリジン、からなる群より選択される。
特定の実施形態では、Ｎ１は、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、および修飾デオキシリボウリジン、からなる群より選択され、Ｎ２は、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシン、からなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｎ１は、リボウリジンおよびデオキシリボウリジン、からなる群より選択され、Ｎ２は、リボアデノシンおよび修飾リボアデノシン、からなる群より選択される。特定の実施形態では、Ｎ１は、リボウリジンであり、Ｎ２は、リボアデノシンである。特定の実施形態では、Ｎ１は、デオキシリボウリジンであり、Ｎ２は、リボアデノシンである。
構造（Ａ２）の一部の実施形態では、Ｎ１は、２’ＯＭｅ糖修飾リボウラシルまたは２’ＯＭｅ糖修飾リボアデノシンを含む。構造（Ａ２）の特定の実施形態では、Ｎ２は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む。
構造（Ａ２）の一部の実施形態では、Ｎ１は、２’ＯＭｅ糖修飾リボウラシルまたは２’ＯＭｅ糖修飾リボシトシンを含む。構造（Ａ２）の特定の実施形態では、Ｎ２は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、それぞれＮおよびＮ’は、非修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’が、化学修飾ヌクレオチドまたは非通常部分を含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’が、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し実質的に相補的である。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し完全に相補的なアンチセンス配列を含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的ＲＮＡ中の約１７〜約３９の連続したヌクレオチドに対し実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
構造Ａ１およびＡ２の一部の実施形態では、Ｚが存在し、また、Ｚ’が存在しない。他の実施形態では、Ｚ’が存在し、また、Ｚが存在しない。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在する。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’が存在し、両者は同じである。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’が存在し、両者は異なる。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’は、独立に、２、３、４または５つの非ヌクレオチド部分または２、３、４、または５つの非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせである。一部の実施形態では、それぞれＺおよび／またはＺ’は、リン酸ジエステル結合経由でｓｉＲＮＡ鎖の３’末端に共有結合した２つの非ヌクレオチド部分から構成される。
非ヌクレオチド部分は、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分またはその誘導体、および無機リン酸塩、からなる群より選択される。一部の実施形態では、非ヌクレオチド部分は、アルキル部分またはその誘導体である。一部の実施形態では、アルキル部分は、アルコール、末端アミン、末端リン酸塩および末端ホスホロチオエート部分、からなる群より選択される末端官能基を含む。
一部の実施形態では、Ｚが存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分またはその誘導体、および無機リン酸塩、からなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚが存在し、２つのアルキル部分またはその誘導体から構成される。
さらなる実施形態では、Ｚ’が存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、からなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚ’が存在し、１つまたは複数のアルキル部分またはその誘導体を含む。
一部の実施形態では、Ｚが存在し、２つのアルキル部分またはその誘導体から構成され、また、Ｚ’が存在し、単一アルキル部分またはその誘導体から構成される。
一部の実施形態では、それぞれＺおよびＺ’は、脱塩基部分、例えば、デオキシリボ脱塩基部分（本明細書では「ｄＡｂ」と呼ぶ）またはリボ脱塩基部分（本明細書では「ｒＡｂ」と呼ぶ）を含む。一部の実施形態では、それぞれＺおよび／またはＺ’は、２つの共有結合で結合した脱塩基部分を含み、例えば、５’>３’ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂまたはｄＡｂ−ｒＡｂまたはｒＡｂ−ｄＡｂである。それぞれの部分は、共有結合、好ましくは、リン酸ベース結合経由で隣接部分に共有結合する。一部の実施形態では、リン酸ベース結合は、ホスホロチオエート、ホスホノ酢酸またはリン酸ジエステル結合である。
一部の実施形態では、それぞれＺおよび／またはＺ’は、独立に、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６アルキル部分、任意選択で、Ｃ３［プロパン、−（ＣＨ２）３−］部分またはその誘導体、例えば、プロパノール（Ｃ３−ＯＨ）、プロパンジオール、またはプロパンジオール（「Ｃ３Ｐｉ」）のリン酸ジエステル誘導体を含む。好ましい実施形態では、それぞれＺおよび／またはＺ’は、２つの炭化水素部分を含み、一部の例では、それはＣ３−Ｃ３である。それぞれＣ３は、共有結合、好ましくは、リン酸ベース結合経由で隣接Ｃ３に共有結合している。一部の実施形態では、リン酸ベース結合は、ホスホロチオエート、ホスホノ酢酸またはリン酸ジエステル結合である。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、少なくとも１つのＺまたはＺ’が存在し、ＺまたはＺ’が存在する鎖に共有結合した少なくとも２つの非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、それぞれＺおよびＺ’は、独立に、Ｃ３アルキル、Ｃ３アルコールまたはＣ３エステル部分を含む。一部の実施形態では、Ｚ’が存在せず、Ｚが存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。一部の実施形態では、Ｚが存在せず、Ｚ’が存在し、非ヌクレオチドＣ３部分を含む。
構造Ａ１およびＡ２の一部の実施形態では、それぞれＮおよびＮ’は、非修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’が、化学修飾ヌクレオチドまたは非通常部分を含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分、から選択される。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’が、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し実質的に相補的である。
他の実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、糖残基中で修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、化合物は、糖残基の２’位置に修飾を含む。一部の実施形態では、２’位置の修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、アルコキシ部分を含み、好ましい実施形態では、アルコキシ部分は、メトキシ部分（２’−Ｏ−メチル；２’ＯＭｅ；２’−ＯＣＨ３としても知られる）である。一部の実施形態では、核酸化合物は、アンチセンスおよびセンス鎖の片方または両方に２’ＯＭｅ糖修飾交互リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、化合物は、アンチセンス鎖、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ、中にのみ２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の中間（中位）のリボヌクレオチド；例えば、１９塩基長鎖中の位置１０のリボヌクレオチドは非修飾である。種々の実施形態では、核酸化合物は、少なくとも５つの交互２’ＯＭｅ糖修飾および非修飾リボヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、交互位置の修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’および３’末端のそれぞれのリボヌクレオチドは、その糖残基中で修飾され、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’および３’末端のそれぞれのリボヌクレオチドは、その糖残基中で非修飾である。
一部の実施形態では、二重鎖分子は、１つまたは複数の次の修飾を含む。
ａ）アンチセンス鎖の５’末端から５、６、７、８、または９の位置の少なくとも１つのＮが、２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドから選択され；
ｂ）センス鎖の５’末端から９または１０の位置の少なくとも１つのＮ’は、２’５’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンから選択され；および
ｃ）（Ｎ’）ｙの３’末端位置の４、５、または６連続した位置のＮ’は、２’５’ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、二重鎖分子は、次の修飾の組み合わせを含む。
ａ）アンチセンス鎖は、５’末端から５、６、７、８、または９の少なくとも１つの位置の２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み；および
ｂ）センス鎖は、５’末端から９または１０の位置に少なくとも１つの２’５’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンを含む。
一部の実施形態では、二重鎖分子は、以下の修飾の組み合わせを含む。
ａ）アンチセンス鎖は、５’末端から５、６、７、８、または９の少なくとも１つの位置に２’５’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み；および
ｃ）センス鎖は、３’末端から２番目または３’末端位置に４、５、または６連続した２’５’ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖［（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ］は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１つまたは複数の２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖の全てのピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾である。一部の実施形態では、センス鎖は、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、３’末端および５’末端で、独立に、リン酸化されているか、または非リン酸化型である。構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、３’および５’末端で非リン酸化型である。他の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、３’末端でリン酸化されている。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、（Ｎ）ｙは、ミラーヌクレオチド、２’５’ヌクレオチドおよびＴＮＡから選択される少なくとも１つの非通常部分を含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチドである。種々の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）およびＬ−デオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）から選択される。好ましい実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡである。特定の実施形態では、センス鎖は、９の位置または１０の位置に（５’末端から）非通常部分を含む。好ましい実施形態では、センス鎖は、９の位置に（５’末端から）非通常部分を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、１９のヌクレオチド長さであり、１５の位置に（５’末端から）４、５、または６連続した非通常部分を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、１５、１６、１７、および１８の位置に４連続した２’５’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、１５、１６、１７、１８および１９の位置に５連続した２’５’リボヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、センス鎖は、Ｚ’をさらに含む。一部の実施形態では、Ｚ’は、Ｃ３ＯＨ部分またはＣ３Ｐｉ部分を含む。
構造Ａ１の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１７および１９の位置の非修飾リボヌクレオチド、および３’末端から２番目の位置（位置１８）の１つのＬ−ＤＮＡにより構成される。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１９の位置の非修飾リボヌクレオチド、および２つの連続した３’末端から２番目の位置（位置１７と１８）のＬ−ＤＮＡにより構成される。種々の実施形態では、非通常部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドである。種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合された３’末端の２、３、４、５、または６連続したリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４つの連続したヌクレオチドが３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチドが、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１５、１６、１７、１８および１９の位置に、２’−５’ヌクレオチド間結合（２’−５’ヌクレオチド）により隣接ヌクレオチドに結合した２つ以上の連続したヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成しているヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチド（３’ＯＨの代わりに３’Ｈまたは３’ＯＭｅ）を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、位置１５、１６および１７の位置に２’−５’ヌクレオチドを含み、それにより、隣接ヌクレオチドは、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８の位置の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合され；または１５、１６、１７、１８、および１９の位置に２’−５’ヌクレオチドを含み、それにより、隣接ヌクレオチドは、１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９の位置の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合され、３’ＯＨは、３’末端ヌクレオチドの位置または１６、１７および１８の位置で利用可能となり、それにより、隣接ヌクレオチドは、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９の位置の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合される。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、１６および１７または１７および１８または１５および１７の位置に２’−５’ヌクレオチドを含み、それにより、隣接ヌクレオチドは、それぞれ、１６〜１７および１７〜１８の位置の間、または１７〜１８および１８〜１９の位置の間、または１５〜１６および１７〜１８の位置の間で２’−５’ヌクレオチド間結合により結合される。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）が、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドで置換される。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合、特に、１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９のヌクレオチド位置の間の結合により結合された３’末端に、５つの連続したヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合で結合された３’末端に５つの連続したヌクレオチドを含み、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから独立に選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。Ｃ３アルキルキャップは、３’または５’末端ヌクレオチドに共有結合している。一部の実施形態では、３’Ｃ３末端キャップは、３’リン酸塩をさらに含む。一部の実施形態では、３’Ｃ３末端キャップは、３’末端ヒドロキシル基をさらに含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡ位置１８を含み；（Ｎ’）ｙは、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから独立に選択されるＺ’およびｚ’をさらに含む。
一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、３’末端リン酸塩（すなわち、３’末端でリン酸化された）を含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の全ピリミジンは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
構造Ａ２の一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２は、リボアデノシン部分である。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合、特に、結合１５〜１６、１６〜１７、１７〜１８および１８〜１９の位置のヌクレオチドの間の結合により結合された３’末端に５つの連続したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、結合は、リン酸ジエステル結合を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、４つの２’−５’結合により結合された３’末端に５つの連続したヌクレオチドを含み、任意選択で、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’をさらに独立に含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり。Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、Ｌ−ＤＮＡ位置１８を含み；任意選択で、（Ｎ’）ｙは、逆位脱塩基部分およびＣ３アルキル［Ｃ３；１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］キャップから選択されるＺ’およびｚ’を独立にさらに含む。一部の実施形態では、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端リン酸塩を含む。一部の実施形態では、Ｎ２−（Ｎ’）ｙは、３’末端ヒドロキシルを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置にまたは１、３、５、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置にまたは３、５、９、１１、１３、１５、１７の位置に、または２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１１、１３、１５、１７および１９（５’末端から）の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置にまたは３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の全てのピリミジンは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、５、６または７（５’>３’）位置にＬ−ＤＮＡまたは２’−５’ヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、アンチセンス鎖は、リボヌクレオチドをさらに含み、５〜６または６〜７（５’>３’）のリボヌクレオチド位置の間に２’５’ヌクレオチド間結合を生成する。
さらなる実施形態では、Ｎ１−（Ｎ）ｘは、Ｚをさらに含み、Ｚは、非ヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態では、非ヌクレオチドオーバーハングは、Ｃ３-Ｃ３［１、３−プロパンジオールモノ（リン酸二水素）］２である。
構造Ａ２の一部の実施形態では、（Ｎ）ｙは、少なくとも１つのＬ−ＤＮＡ部分を含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１６および１８の位置の非修飾リボヌクレオチドならびに３’末端から２番目の位置（位置１７）の１つのＬ−ＤＮＡから構成される。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１〜１５および１８の位置の非修飾リボヌクレオチドおよび２つの連続した３’末端から２番目の位置（位置１６と１７）のＬ−ＤＮＡから構成される。種々の実施形態では、非通常部分は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドである。種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合した３’末端に２、３、４、５、または６つの連続したリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４つの連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチドが、３’−Ｏ−メチル（３’ＯＭｅ）糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙ中の１４、１５、１６、１７、および１８の位置の２つ以上の連続したヌクレオチドが、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成しているヌクレオチドが、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１５〜１６、１６〜１７および１７〜１８の位置、または１６〜１７および１７〜１８の位置の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１８であり、（Ｎ’）ｙは、１４〜１５、１５〜１６、１６〜１７、および１７〜１８の位置の間、または１５〜１６、１６〜１７、および１７〜１８の位置の間、または１６〜１７および１７〜１８の位置の間、または１７〜１８の位置の間、または１５〜１６および１７〜１８の位置の間の２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドと結合したヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中のピリミジンリボヌクレオチド（ｒＵ、ｒＣ）は、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドで置換される。
構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、各Ｎは、非修飾リボヌクレオチドを含む。構造Ａ１および構造Ａ２の一部の実施形態では、各Ｎ’は、非修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのＮおよびＮ’は、修飾リボヌクレオチドまたは非通常部分である。
他の実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の分子は、糖残基中で修飾された少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、化合物は、糖残基の２’位置に修飾を含む。一部の実施形態では、２’位置の修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、アルコキシ部分を含み、好ましい実施形態では、アルコキシ部分は、メトキシ部分（２’−Ｏ−メチル；２’ＯＭｅ；２’−ＯＣＨ３としても知られる）である。一部の実施形態では、核酸化合物は、アンチセンスおよびセンス鎖の片方または両方に交互の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、化合物は、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ中に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドのみを含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖の中央のリボヌクレオチド、例えば、１９塩基長鎖の１０の位置のリボヌクレオチドは非修飾である。種々の実施形態では、核酸化合物は、少なくとも５つの交互の２’ＯＭｅ糖修飾および非修飾リボヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、交互位置の修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’および３’末端の各リボヌクレオチドは糖残基が修飾され、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’および３’末端の各リボヌクレオチドは糖残基が非修飾である。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘは、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘ中の全てのピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾である。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙは、２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含む。さらなる実施形態では、構造Ａ１または構造Ａ２の化合物は、交互位置の修飾リボヌクレオチドを含み、（Ｎ）ｘまたはＮ１−（Ｎ）ｘの５’および３’末端の各リボヌクレオチドは糖残基が修飾され、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ）ｙの５’および３’末端の各リボヌクレオチドは糖残基が非修飾である。
本明細書で開示の核酸分子は、一方の末端が平滑末端、例えば、Ｚおよびｚ"が存在しない、またはＺ’が存在しない場合であってもよい。核酸分子は、センスまたはアンチセンス鎖のどこの位置にあってもよい修飾ヌクレオチドまたは非通常部分で修飾されてもよい。核酸分子は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。核酸分子は、約１、２、３、４、５、６、７、または８つの非通常部分を含んでもよい。核酸分子は、一群の約１、２、３、４、５、６、７、または８つ、好ましくは１、２、３または４つの近接修飾ヌクレオチドまたは非通常部分を含んでもよい。修飾核酸は、センス鎖のみで、アンチセンス鎖のみで、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方で存在してもよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’デオキシフルオロ修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド等の２’糖修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド（すなわち、Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡ）または２’−５’結合（２’５’ヌクレオチド）形成可能なヌクレオチドを含む。
本明細書で使われる用語の「二重鎖領域」は、通常、ワトソン・クリック塩基対形成または二重鎖形成を可能にする他のいずれかの方法により２つの相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが、相互に塩基対を形成する二重鎖分子中の領域を指す。例えば、１９ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、１９ヌクレオチド単位の相補的なオリゴヌクレオチドと塩基対をつくることができ、または各鎖上の１５、１６ １７または１８塩基と塩基対をつくることができ、それにより「二重鎖領域」が１５、１６、１７または１８塩基対から構成される。残りの塩基対は、例えば、５’および３’オーバーハングとして存在できる。さらに、二重鎖領域内では、１００％の相補性は必要ない；二重鎖領域内では実質的な相補性で許容される。オーバーハング領域は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド部分から構成できる。本明細書で開示のように、少なくとも１つのオーバーハング領域が１つまたは複数の非ヌクレオチド部分から構成される。
一般的な非制限的核酸分子パターンを以下に示すが、この場合、Ｎ’＝二重鎖領域のセンス鎖ヌクレオチド；ｚ"＝センス鎖の５’末端に共有結合した５’−キャッピング部分；Ｃ３＝３炭素非ヌクレオチド部分；Ｎ＝二重鎖領域のアンチセンス鎖ヌクレオチド；ｉｄＢ＝逆位脱塩基デオキシリボヌクレオチド非ヌクレオチド部分である。各Ｎ、Ｎ’は、独立に、修飾もしくは非修飾または非通常部分である。センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に、１８〜４０ヌクレオチド長さである。以下に提供した例は、１９ヌクレオチドの二重鎖領域を有する；しかし、本明細書で開示の核酸分子は、１８と４０ヌクレオチドの間のどこにでも二重鎖領域を持つことができ、各鎖は、独立に、１８と４０ヌクレオチドの間の長さである。各二重鎖で、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは、最上部に示す。一部の実施形態では、二重鎖核酸分子は次の構造を有する：
一部の好ましい実施形態では、本明細書で開示の核酸分子は、次の構造を有する：
ここで、ＮおよびＮ’は、独立に、非修飾もしくは修飾、または非通常部分であってもよいリボヌクレオチドであり；
各Ｎは、隣接のＮに共有結合で結合しており；
各Ｎ’は、隣接のＮ’に共有結合で結合しており；さらに
ｚ"は、センス鎖の５’末端に共有結合したキャッピング部分である。用語の「ａＢ」は、リボ脱塩基部分もしくはデオキシリボ脱塩基部分、または逆位リボ脱塩基部分もしくは逆位デオキシリボ脱塩基部分であってもよい脱塩基部分を指す。
一部の実施形態では、本明細書で開示の核酸分子は、Ｚを含む。他の実施形態では、本明細書で開示の核酸分子は、Ｚ’を含む。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在する。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在し、同じである。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在し、異なる。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’は、独立に、１または２つの非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’は、独立に、２つの非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、Ｚが存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分またはそれらの誘導体、および無機リン酸塩部分から選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。
さらなる実施形態では、Ｚ’が存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分またはそれらの誘導体または無機リン酸塩部分から選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。
さらなる実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’が存在し、独立に、本明細書で開示の部分から選択される１つまたは複数のヌクレオチドおよび１つまたは複数の非ヌクレオチド部分の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、ＺおよびＺ’のそれぞれは、脱塩基部分、任意選択で、デオキシリボ脱塩基（本明細書では「ｄＡｂ」と呼ぶ）またはリボ脱塩基（本明細書では「ｒＡｂ」と呼ぶ）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、それぞれのＺおよび／またはＺ’は、ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂである。
一部の実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’のそれぞれは、独立に、アルキル部分、任意選択で、プロパンジオールのリン酸ジエステル誘導体（（ＣＨ２）３−Ｐｉ、本明細書では「Ｃ３Ｐｉ」とも呼ばれる）修飾部分を含む。一部の実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’はＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。具体的実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｚは、２つのプロパンジオール誘導体、Ｃ３−Ｃ３（すなわち−Ｃ３−Ｐｉ−Ｃ３−Ｐｉ）を含む。種々の実施形態では、Ｃ３部分は、リン酸ジエステル結合を介してセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端に共有結合している。
さらなる実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、１つまたは複数の脱塩基部分および非修飾ヌクレオチドの組み合わせ、または、１つまたは複数の炭化水素部分および非修飾ヌクレオチドの組み合わせまたは１つまたは複数の脱塩基および炭化水素部分の組み合わせを含む。このような実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、任意選択で、Ｃ３−ｒＡｂまたはＣ３−ｄＡｂである。
さらなる構造Ａ１またはＡ２に関する実施形態では、核酸分子は、アンチセンス鎖の２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９の位置のリボヌクレオチドの糖の２’Ｏ−Ｍｅ修飾をさらに含む。さらなる実施形態では、化合物は、また、センス鎖の位置１８にＬ−ＤＮＡヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、化合物は、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙの１５〜１９または１６〜１９または１７〜１９の位置のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合している。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙの１５〜１９または１６〜１９または１７〜１９または１５〜１８または１６〜１８の位置のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合している。
特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含むｓｉＲＮＡ化合物を提供し、この修飾ヌクレオチドは、糖部分、塩基部分またはヌクレオチド間結合部分に修飾を有する。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、修飾または非修飾リボヌクレオチドを含み、各修飾リボヌクレオチドは、糖に２’−Ｏ−メチルを有し、ここで、（Ｎ）ｘの３’末端のＮは、修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、３’末端から始まる少なくとも５つの交互修飾リボヌクレオチドを含み、また全体で少なくとも９つの修飾リボヌクレオチドを含み、さらにそれぞれの残っているＮは、非修飾リボヌクレオチドである。
一部の実施形態では、少なくとも１つの（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのミラーヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中に、少なくとも１つの非通常部分が存在し、この非通常部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾または非修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチド、または本明細書で開示のいずれかの他の非通常部分であってよい。
一部の実施形態では、非通常部分は、Ｌ−ＤＮＡミラーヌクレオチドであり；さらなる実施形態では、（Ｎ’）ｙの１５、１６、１７、または１８の位置に少なくとも１つの非通常部分が存在する。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、脱塩基リボース部分および脱塩基デオキシリボース部分から選択される。一部の実施形態では、非通常部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分が、位置１７、位置１８または位置１７および１８に存在する。
さらなる他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも５つの脱塩基リボース部分または脱塩基デオキシリボース部分を含み、少なくとも１つのＮ’は、ＬＮＡである。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、９つの交互修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、９つの交互修飾リボヌクレオチドを含み、これは位置２に２’修飾ヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、奇数番号の位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２と１８の位置の片方または両方に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。さらなる他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９の位置に２’ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の少なくとも１つのピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘの全ピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。一部の実施形態では、Ｎ（ｘ）中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ピリミジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾を含む。
種々の実施形態では、ｚ"が存在し、脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；ミラーヌクレオチドから選択される。
核酸分子の一実施形態では、（Ｎ’）ｙは、２’−５’リン酸ジエステル結合により（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の片方または両方に結合された少なくとも２つのヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり；（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチド間で交互に繰り返され、それぞれ修飾リボヌクレオチドが修飾されて糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの中央のリボヌクレオチドは非修飾であり；さらに（Ｎ’）ｙの３’末端の３つのヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合している。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり；（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチド間で交互に繰り返され、それぞれ修飾リボヌクレオチドは、修飾されて糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの中央のリボヌクレオチドは非修飾であり；さらに（Ｎ’）ｙの５’末端の４つの連続したヌクレオチドが、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｙの中央の位置の追加のヌクレオチドは、糖上の２’−Ｏ−メチルで修飾されてもよい。別の実施形態では、（Ｎ）ｘ中で、ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチド間で交互に繰り返され、（Ｎ’）ｙ中で５’末端の４つの連続したヌクレオチドが、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２つのもしくは３つの連続したヌクレオチドが３’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含む。
構造（Ａ１）の特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中の少なくとも１つの位置のヌクレオチドは、ミラーヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む。
構造（Ａ１）の特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙは、ミラーヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡは、Ｌ−デオキシリボシチジンである。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１８にＬ−ＤＮＡを含む。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１７と１８にＬ−ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２および位置１７と１８の片方または両方にＬ−ＤＮＡ置換を含む。構造（Ａ１）の他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３が想定され；これらの実施形態では、上記で考察した（Ｎ’）ｙに対する修飾は、１５、１６、１７、１８の位置の代わりに、２１塩基長に対する１７、１８、１９、２０の位置であり、２３塩基長に対する１９、２０、２１、２２の位置である。同様に、位置１７と１８の片方または両方の修飾は、２１塩基長に対しては、位置１９または２０の片方または両方への修飾であり、２３塩基長に対しては位置２１と２２の片方または両方への修飾である。１９塩基長に対する全ての修飾は、２１および２３塩基長に対し同様に調整される。
構造Ａ１またはＡ２の種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙ中の３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の連続したリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されている。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４つの連続したヌクレオチドが、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合で結合され、２’−５’リン酸ジエステル結合を形成する１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチドが３’−Ｏ−メチル糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含む。構造（Ａ１）の特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙ中で、１５、１６、１７、１８および１９の位置の２つ以上の連続したヌクレオチドが２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドが、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの１７および１８の位置のヌクレオチドが２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されている。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８の位置のヌクレオチドが２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されている。
特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２にＬ−ＤＮＡを含み、１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８の位置に２’−５’ヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８の位置に２’−５’ヌクレオチド間結合を含み、かつ５’末端キャップヌクレオチドを含む。
核酸分子の一実施形態では、３’末端ヌクレオチドまたは（Ｎ’）ｙの３’末端の２つもしくは３つの連続したヌクレオチドがＬ−デオキシリボヌクレオチドである。
（核酸分子の他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中いずれかの末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の連続したリボヌクレオチドまたはそれぞれの５’および３’末端の２〜８の修飾ヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシまたはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾は、メトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。
一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３、４または５つの連続したヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾を含む。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の３つの連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含む。
構造Ａ１またはＡ２の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙ中のいずれかの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の連続したリボヌクレオチドまたはそれぞれ５’および３’末端の２〜８修飾ヌクレオチドは、独立に、２環式ヌクレオチドである。種々の実施形態では、２環式ヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）である。Ａ２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）は、ＬＮＡの一種である（下記参照）。
種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙは、５’末端または３’および５’末端の両方に修飾ヌクレオチドを含む。
構造Ａ１またはＡ２の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の片方または両方の少なくとも２つのヌクレオチドがＰ−エトキシ骨格修飾により結合されている。特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３である。（Ｎ）ｘ中のヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドの間で交互に繰り返され、各修飾リボヌクレオチドは修飾されて糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの中央位置のリボヌクレオチドは非修飾であり；さらに（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の４つの連続したヌクレオチドは、３つのＰ−エトキシ骨格修飾により結合されている。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の３つの連続したヌクレオチドは、２つのＰ−エトキシ骨格修飾により結合されている。
構造Ａ１またはＡ２の一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙ中のそれぞれ５’および３’末端の２、３、４、５、６、７または８つの連続したリボヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチド、２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されたヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチドまたは２環式ヌクレオチドである。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’および３’末端の修飾は、同じである。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の４つの連続したヌクレオチドは、３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、（Ｎ’）ｙの３’末端の３つの連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾は、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾とは異なる。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。別の具体的実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３つの連続したヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの３’末端の３つの連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。（Ｎ）ｘ中のヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドの間で交互に繰り返され、各修飾リボヌクレオチドは修飾されて糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの中央のリボヌクレオチドは非修飾であり、または（Ｎ）ｘ中のリボヌクレオチドは非修飾である。
構造Ａ１の別の実施形態では、本発明は、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘ中のヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドの間で交互に繰り返され、各修飾リボヌクレオチドは修飾されて糖上に２’−Ｏ−メチルを有し、（Ｎ）ｘの中央のリボヌクレオチドは、非修飾であり、（Ｎ’）ｙの３’末端の３つのヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され、（Ｎ’）ｙの５’末端の３つのヌクレオチドはＥＮＡ等のＬＮＡであり、Ｚおよび／またはＺ’は、独立に、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、または１つまたは複数のヌクレオチド部分および１つまたは複数のヌクレオチドの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む化合物を提供する。一部の実施形態では、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ；ｄＡｂ−ｄＡｂおよびｒＡｂ−ｒＡｂから選択される。
別の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙの５’末端の５つの連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含み、（Ｎ’）ｙの３’末端の２つの連続したヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。
他の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙ中の５’もしくは３’末端ヌクレオチド、または末端またはそれぞれ５’および３’末端の１〜４修飾ヌクレオチドの２、３、４、５もしくは６連続したヌクレオチドは、独立に、ホスホノカルボキシラートまたはホスフィノカルボキシラートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）である。一部の実施形態では、ＰＡＣＥヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙまたはＮ２−（Ｎ’）ｙ中のそれぞれ５’および３’末端の１または２連続したヌクレオチドはＰＡＣＥヌクレオチドである。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は、米国特許第６、６９３、１８７号および同第７、０６７、６４１号に開示されており、両特許は参照によって組み込まれる。
構造（Ａ１）の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、非修飾リボヌクレオチドを含み、これは、２つの連続したヌクレオチドが、３’末端の１つの２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合されており、また、（Ｎ’）ｙは、非修飾リボヌクレオチドを含み、これは、２つの連続したヌクレオチドが、５’末端の１つの２’−５’ヌクレオチド間結合によって結合され、Ｚおよび／またはＺ’は、独立に、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、または１つまたは複数の非ヌクレオチド部分および１つまたは複数のヌクレオチドの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ；ｄＡｂ−ｄＡｂおよびｒＡｂ−ｒＡｂから選択され、各Ｃ３、ｒＡｂ、ｄＡｂは、リン酸ベース結合を介して隣接Ｃ３Ｐｉ、ｒＡｂ、ｄＡｂと共有結合している。一部の実施形態では、リン酸ベース結合は、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオホスファート結合である。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり；（Ｎ）ｘは、非修飾リボヌクレオチドを含み、これは、３’末端の３つの連続したヌクレオチドが２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され；（Ｎ’）ｙは、非修飾リボヌクレオチドを含み、これは、５’末端に４つの連続したヌクレオチドが３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され；さらに、Ｚおよび／またはＺ’は、独立に、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、または１つまたは複数の非ヌクレオチド部分および１つまたは複数のヌクレオチドの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ；ｄＡｂ−ｄＡｂおよびｒＡｂ−ｒＡｂから選択され、各Ｃ３、ｒＡｂ、ｄＡｂは、リン酸ベース結合を介して隣接Ｃ３Ｐｉ、ｒＡｂ、ｄＡｂと共有結合している。一部の実施形態では、リン酸ベース結合は、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオホスファート結合である。
構造Ａ１またはＡ２の一実施形態では、（Ｎ’）ｙまたは（Ｎ’）ｙ−Ｎ２の５’末端の４つの連続したヌクレオチドは、それぞれ３つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合され；（Ｎ’）ｘの３’末端の３つの連続したヌクレオチドは、２つの２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されており；Ｚおよび／またはＺ’は独立に、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、または１つまたは複数の非ヌクレオチド部分および１つまたは複数のヌクレオチドの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ；Ｃ３−ｄＡｂ；ｄＡｂ−ｄＡｂおよびｒＡｂ−ｒＡｂから選択される。（Ｎ’）ｙの５’末端の３つのヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｘの３’末端の２つのヌクレオチドは、また、３’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含んでもよい。
構造Ａ１またはＡ２の一実施形態では、（Ｎ’）ｙまたは（Ｎ’）ｙ−Ｎ２の５’末端の５つの連続したヌクレオチドは、それぞれ２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５つの連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含む。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１０の連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｘの３’末端の５つの連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含む。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１３の連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含み；（Ｎ’）ｘの３’末端の５つの連続したヌクレオチドは、２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含み；さらにＺおよび／またはＺ’は、独立に、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、または１つまたは複数の非ヌクレオチド部分および１つまたは複数のヌクレオチドの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。一部の実施形態では、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ；ｄＡｂ−ｄＡｂおよびｒＡｂ−ｒＡｂから選択される。
具体的実施形態では、（Ｎ’）ｙまたは（Ｎ’）ｙ−Ｎ２の５’末端の５つの連続したヌクレオチドは、それぞれ２’−Ｏ−Ｍｅ糖修飾を含み、（Ｎ’）ｙの３’末端の２つの連続したヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡである。さらに、化合物は、（Ｎ’）ｘの３’末端の５つの連続した２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドをさらに含んでもよく、Ｚおよび／またはＺ’は、独立に、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、および無機リン酸塩、または１つまたは複数の非ヌクレオチド部分および１つまたは複数のヌクレオチドの組み合わせからなる群より選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｚは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ；Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ；Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ；ｄＡｂ−ｄＡｂおよびｒＡｂ−ｒＡｂから選択される。
構造Ａ１またはＡ２の種々の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドとは異なる。例えば、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは、２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されているヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘの修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されているヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙの修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドである。
一部の実施形態では、下記の構造を有する化合物が提供される：
（Ｘ１） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり；
各（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、オリゴヌクレオチドであり、ここで、各連続したＮまたはＮ’は、共有結合により次のＮまたはＮ’に結合しており；
Ｚは、２つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせからなり；
Ｚ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は１つの非ヌクレオチド部分を含み；
ｚ"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり；
各ｘおよびｙは、独立に、１８〜２７の整数であり；
（Ｎ’）ｙは、３’末端、または３’末端から２番目の位置に少なくとも１つのミラーヌクレオチドを含み；さらに
（Ｎ）ｘの配列は、哺乳動物遺伝子に対するアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
一部の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡ部分から選択される。一部の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。一部の実施形態では、ＺまたはＺ’のいずれかが存在し、脱塩基部分もしくは炭化水素部分またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｚ’が存在せず、Ｚが存在し、疎水性の部分を含む。
一部の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡ部分から選択される。一部の実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡ部分である。
一部の実施形態では、Ｎ’（ｙ）は、３’末端に２つまたは３つのミラーヌクレオチドを含み、Ｎ（ｘ）は、任意選択で、３’末端に少なくとも１つのミラーヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、Ｎ’（ｙ）は、３’末端から２番目の位置に２つのミラーヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｎ（ｘ）は、３’末端から２番目の位置に１つまたは２つのミラーヌクレオチドを含み、Ｎ’（ｙ）は、任意選択で、５’末端から２番目の位置に１つまたは２つのミラーヌクレオチドをされに含む。一部の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端、または５’末端から２番目の位置に１つのミラーヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを非修飾リボヌクレオチドと交互に含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、位置（５’>３’）３、５および１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置６または７にミラーヌクレオチドまたは２’５’ヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対し相補性を有し；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ内の配列と同一性を有する。
別の実施形態では、下記の構造を有する化合物が提供される：
（Ｘ２） ５’（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり；
各（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、オリゴヌクレオチドであり、ここで、各連続したＮまたはＮ’は、共有結合により次のＮまたはＮ’に結合しており；
Ｚは、２つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせからなり；
Ｚ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は１つの非ヌクレオチド部分を含み；
ｚ"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり；
各ｘおよびｙは、独立に、１８〜２７の整数であり；
（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つまたは複数の２’ＯＭｅ修飾ピリミジンを含み；さらに
（Ｎ）ｘの配列は、哺乳動物遺伝子に対するアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
一部の実施形態では、ＺまたはＺ’のいずれかが存在する。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’両方が存在する。一部の実施形態では、Ｚ’が存在せず、Ｚが存在し、疎水性の部分を含む。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを非修飾リボヌクレオチドと交互に含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、位置（５’>３’）３、５および１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置６または７にミラーヌクレオチドまたは２’５’ヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対し相補性を有し；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ内の配列と同一性を有する。
一部の実施形態では、下記の構造を有する化合物が提供される：
（Ｘ３） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり；
各（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、オリゴヌクレオチドであり、ここで、各連続したＮまたはＮ’は、共有結合により次のＮまたはＮ’に結合しており；
Ｚは、２つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせからなり；
Ｚ’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は１つの非ヌクレオチド部分を含み；
ｚ"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合したキャッピング部分であり；
各ｘおよびｙは、独立に、１８〜２７の整数であり；
（Ｎ’）ｙは、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した少なくとも１つのヌクレオチドを含み；さらに
（Ｎ）ｘの配列は、哺乳動物遺伝子に対するアンチセンス配列を含む。
一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。
一部の実施形態では、Ｎ’（ｙ）は、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した２、３、４、５、６、７、または８つのヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ＺまたはＺ’のいずれかが存在し、脱塩基部分もしくは炭化水素部分またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、Ｚ’が存在せず、Ｚが存在し、疎水性の部分を含む。
一部の実施形態では、Ｎ’（ｙ）は、３’末端で２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した２、３、４、５、６、７、または８つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Ｎ’（ｙ）は、３’末端から２番目の位置で２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した２、３、４、５、６、７、または８つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｎ’（ｙ）は、３’末端で２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した２、３、４、または５つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、Ｎ’（ｙ）は、３’末端、すなわち、位置１５、１６、１７、１８および１９（５’>３’）で２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した５つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチド含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを非修飾リボヌクレオチドと交互に含む。一部の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘは、位置（５’>３’）３、５および１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置６または７にミラーヌクレオチドまたは２’５’ヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に対し相補性を有し；（Ｎ’）ｙの配列は、標的遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ内の配列と同一性を有する。
一部の好ましい実施形態では、本明細書で開示の核酸分子は、以下の構造を有する。
ここで、ＮおよびＮ’は、独立に、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり；
各Ｎは、隣接Ｎと共有結合で結合しており；
各Ｎ’は、隣接Ｎ’と共有結合で結合しており；
１〜１０のＮは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり；
位置５、６、７、８または９（５’>３’）のＮは、２’５ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドであり；
位置１５〜１９（５’>３’）のＮ’は、２’５’リボヌクレオチドであり；
ｚ"は、センス鎖の５’末端に共有結合したキャッピング部分である。
一部の好ましい実施形態では、本明細書で開示の核酸分子は、以下の構造を有する。
ここで、ＮおよびＮ’は、独立に、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり；
各Ｎは、隣接Ｎと共有結合で結合しており；
各Ｎ’は、隣接Ｎ’と共有結合で結合しており；
１〜１０のＮは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドであり；
位置５、６、７、８または９（５’>３’）のＮは、２’５ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドであり；
Ｎ’は、１つまたは複数の２’−ＯＭｅ糖修飾ピリミジンリボヌクレオチドを含み；
位置９または１０（５’>３’）のＮは、２’５ヌクレオチドであり；さらに
ｚ"は、センス鎖の５’末端に共有結合したキャッピング部分である。
構造（Ｘ１〜Ｘ３）の一部の実施形態では、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のどちらかまたはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、３’末端に、１つまたは２つの無機リン酸塩部分を含む。
構造（Ｘ１〜Ｘ３）の一部の実施形態では、（Ｎ）ｘ中の３’末端のＮは、修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、少なくとも８つの修飾リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、修飾リボヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、少なくとも８つの修飾リボヌクレオチドの少なくとも５つは、３’末端から始まる交互配置になっている。
構造（Ｘ１〜Ｘ３）の種々の実施形態では、ｚ"が存在し、脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；ミラーヌクレオチドから選択される。
構造（Ｘ１〜Ｘ３）の種々の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の少なくとも１つの追加の非通常部分が存在し、この非通常部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾または非修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対形成ヌクレオチド類似体または２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、（Ｎ）ｘも（Ｎ’）ｙも３’および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの片方または両方が３’末端でリン酸化されている。また別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの片方または両方が、非開裂型リン酸基を使って３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの片方または両方が、２’末端位置で、開裂型または非開裂型リン酸基を使ってリン酸化される。
特定の実施形態では、全ての上述の構造に対して、Ｚが存在する。他の実施形態では、Ｚ’が存在する。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在する。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在し、同じである。さらなる実施形態では、ＺおよびＺ’の両方が存在し、異なる。一部の実施形態では、ＺおよびＺ’は、独立に、１、２、３、４または５つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分とヌクレオチドの組み合わせである。
一部の実施形態では、Ｚが存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、例えば、（ＣＨ２）３、および無機リン酸塩部分から選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。
さらなる実施形態では、Ｚ’が存在し、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素部分、例えば、（ＣＨ２）３、および無機リン酸塩部分から選択される１つまたは複数の非ヌクレオチド部分を含む。
一部の実施形態では、各Ｚおよび／またはＺ’は、１つまたは２つの非ヌクレオチド部分を含み、ヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、脱塩基部分、任意選択で、デオキシリボ脱塩基（本明細書では「ｄＡｂ」と呼ぶ）またはリボ脱塩基（（本明細書では「ｒＡｂ」と呼ぶ）部分を含む。一部の実施形態では、各Ｚおよび／またはＺ’は、ｄＡｂ−ｄＡｂまたはｒＡｂ−ｒＡｂである。
一部の実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、１つまたは複数の炭化水素部分、任意選択で、（ＣＨ２）３−Ｐｉ（本明細書では「Ｃ３Ｐｉ」と呼ぶ）を含む。一部の実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；またはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。
さらなる実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、脱塩基部分および非修飾ヌクレオチドの組み合わせまたは炭化水素修飾部分および非修飾ヌクレオチドの組み合わせまたは脱塩基部分および炭化水素修飾部分の組み合わせを含む。このような実施形態では、Ｚおよび／またはＺ’は、任意選択で、Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂである。特定の実施形態では、Ｚのみが存在し、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ；Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉである。
上述の構造の実施形態では、化合物は、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分を含む少なくとも１つの３’オーバーハング（Ｚおよび／またはＺ’）を含む。ＺおよびＺ’は、独立に、１つの非ヌクレオチド部分および１つまたは複数の共有結合修飾もしくは非修飾ヌクレオチドまたは非通常部分、例えば、逆位ｄＴもしくはｄＡ；ｄＴ、ＬＮＡ、ミラーヌクレオチド、等を含む。Ｚおよび／またはＺ’が存在するｓｉＲＮＡは、Ｚおよび／またはＺ’が存在しない、またはＺおよび／またはＺ’がｄＴｄＴであるｓｉＲＮＡに比べて、改善された活性および／または安定性および／またはオフターゲット活性および／または低減免疫応答を有する。
特定の実施形態では、すべての上述の構造に対して、化合物は、１つまたは複数のホスホノカルボキシラートおよび／またはホスフィノカルボキシラートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ＰＡＣＥヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、ホスフィノカルボキシラートヌクレオチドは、ホスフィノアセタートヌクレオチドである。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は、米国特許第６、６９３、１８７号および同７、０６７、６４１号に開示されており、両特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、すべての上述の構造に対して、化合物は、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）（架橋核酸または２環式ヌクレオチドとしても定義される）を含む。代表的ロックド核酸には、２′−Ｏ、４′−Ｃ−エチレンヌクレオシド（ＥＮＡ）または２′−Ｏ、４′−Ｃ−メチレンヌクレオシドが含まれる。ＬＮＡおよびＥＮＡヌクレオチドの他の例は、国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第００／４７５９９号および国際公開第９９／１４２２６号に開示されており、すべてが参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、すべての上述の構造に対して、化合物は、１つまたは複数のアルトリトールモノマー（ヌクレオチド）を含む。これは、１、５アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−アルトリト−ヘキシトールとしても定義されている（例えば、Ａｌｌａｒｔ、ｅｔａｌ．、１９９８．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １７：１５２３−１５２６；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９． Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：１３７１−１３７６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００７、ＮＡＲ ３５（４）：１０６４−１０７４を参照；全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、それぞれのＮおよび／またはＮ’がデオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）である二重鎖化合物を明示的に排除する。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ超のデオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態では、それぞれのＮが、非修飾リボヌクレオチドであり、３’末端ヌクレオチドまたは（Ｎ’）ｙの３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４連続したヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである化合物が本明細書で提供される。さらなる他の実施形態では、各Ｎは非修飾リボヌクレオチドであり、５’末端ヌクレオチドまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の連続した（Ｎ’）ｙの５’末端のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。さらなる実施形態では、５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、または９連続したヌクレオチド、および（Ｎ）ｘの３’末端の１、２、３、４、５、または６連続したヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、各Ｎ’は、非修飾リボヌクレオチドである。またさらなる実施形態では、（Ｎ）ｘは、非修飾リボヌクレオチド、およびそれぞれの５’および３’末端に１または２、３または４連続したデオキシリボヌクレオチドを独立に、および内部位置に１または２、３、４、５または６連続したデオキシリボヌクレオチドを含み；さらにそれぞれのＮ’は、非修飾リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’末端ヌクレオチドまたは（Ｎ’）ｙの３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３もしくは１４連続したヌクレオチド、および５’末端ヌクレオチドまたは（Ｎ）ｘの５’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３もしくは１４連続したヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドのＮまたは２もしくは３つの連続したＮおよび１、２、もしくは３つのＮ’は、デオキシリボヌクレオチドである。活性ＤＮＡ／ＲＮＡｓｉＲＮＡキメラの特定の例が、米国特許公開第２００５／０００４０６４号、およびＵｉ−Ｔｅｉ、２００８（ＮＡＲ３６（７）：２１３６−２１５１）に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
共有結合は、１つのヌクレオチドモノマーを隣接ヌクレオチドモノマーに結合するヌクレオチド間結合を指す。共有結合は、例えば、リン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合、Ｐ−アルコキシ結合、Ｐ−カルボキシ結合、等を含む。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常なヌクレオシド間結合は、３’−５’リン酸ジエステル結合である。特定の実施形態では、共有結合は、リン酸ジエステル結合である。共有結合は、非亜リン酸含有ヌクレオシド間結合、例えば、特に、国際公開第２００４／０４１９２４号で開示のものを包含する。特に別に指定されていなければ、本明細書で考察している構造の実施形態において、それぞれの連続したＮまたはＮ’間の共有結合は、リン酸ジエステル結合である。
全ての上述の構造に対して、一部の実施形態では、（Ｎ）ｘのオリゴヌクレオチド配列は、（Ｎ’）ｙのオリゴヌクレオチド配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、実質的に相補的である。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的配列に対し完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的配列に対し実質的に相補的である。
定義
便宜上、本明細書、実施例および請求項で用いられる特定の用語について、以降で説明される。
内容が明確に別義を指し示していなければ、本明細書で使われる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数形を含むことに留意されるべきである。
本発明の態様または実施形が、Ｍａｒｋｕｓｈグループまたは他の選択肢のグルーピングを使って説明される場合は、当業者なら、その結果として、本発明は、また、グループのいずれか個別のメンバーまたはサブグループのメンバーの観点からも説明されることがわかるであろう。
二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ）または二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）ｓｉＲＮＡ化合物の「センス」または「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」として本明細書中で言及されていることは、標的核酸、例えば、標的ｍＲＮＡを含む標的ＲＮＡに対し同一性を有するオリゴヌクレオチドを指す。「アンチセンス」または「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」として本明細書中で言及されていることは、標的核酸、例えば、標的ｍＲＮＡに相補性を有するオリゴヌクレオチドを指す。理論に拘泥する意図はないが、アンチセンス、またはガイド鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、転写後遺伝子サイレンシングを指揮する。転写後遺伝子サイレンシングは、ガイド鎖塩基がメッセンジャーＲＮＡ分子の相補的配列と対を形成し、ＲＩＳＣ複合体の触媒部分であるアルゴノートによりｍＲＮＡの開裂を媒介する場合に起こる。
「アポトーシス促進性ポリペプチド」は、上記に挙げた遺伝子のいずれかによりコードされるポリペプチドを指し、スプライス変異体、アイソフォーム、相同分子種、またはパラログ、等を含む。
「阻害剤」は、目的の生物学的または生理的な効果を得るのに充分な程度に、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を低減させることができる化合物を指す。本明細書で使われる用語の「阻害剤」は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイム等の１つまたは複数のオリゴヌクレオチド阻害剤を指す。また、阻害は、下方制御として、または、ＲＮＡｉの場合は、サイレンシングとして言及してもよい。
本明細書で使われる用語の「阻害」は、目的の生物学的または生理的な効果を得るのに充分な程度に、遺伝子の発現またはこのような遺伝子の産物の活性を低減させることを指す。阻害は、完全でも部分的でもよい。
本明細書で使われる用語の「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、同義に使うことができ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。この用語は、また、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られるＲＮＡまたはＤＮＡ類似体も含むと理解されるべきである。本出願全体を通して、ｍＲＮＡ配列は、それらの対応する遺伝子の標的を表すものとして述べられている。用語の「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」およびｍＲＮＡは、同義に使用される。
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、約２〜約５０ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。各ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立に、天然でも、または合成でも、および／または修飾されていても、または非修飾であってもよい。修飾には、糖部分、塩基部分および／またはオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間の結合への変更が含まれる。本明細書で開示されている化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドおよびこれらの組み合わせ等の分子を包含する。本明細書で使われる用語の「非対形成ヌクレオチド類似体」は、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−ＭｅｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−ＭｅｄＣ等（これに限定されない）の非塩基対形成部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。一部の実施形態では、非塩基対形成ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態では、それは、デオキシリボヌクレオチドである。
本明細書では、インビボで標的遺伝子の発現を阻害するための方法と組成物が提供される。一般的には、その方法は、哺乳動物ｍＲＮＡを標的として、標的遺伝子の発現をＲＮＡ干渉機序により下方制御するのに充分な量のオリゴリボヌクレオチド、特に、低分子干渉ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）または細胞中でｓｉＲＮＡを生成する核酸物質を投与することを含む。特に、この方法は、その遺伝子の発現に関連する疾患に罹患している患者の治療を目的として遺伝子発現を阻害するのに有用である。本明細書で開示されるように、標的遺伝子のｓｉＲＮＡ分子または阻害剤は、種々の病状を治療するための薬剤として使用される。
「ｓｉＲＮＡ化合物」および「核酸分子」は、本明細書では同義に使用可能である。
「ヌクレオチド」は、ヌクレオシド（糖、通常は、リボースまたはデオキシリボース、およびプリンまたはピリミジン塩基）およびホスホリンカー；例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド（天然でも、または合成でもよく、また、修飾されていても、または非修飾であってもよい）から構成される化合物を包含することが意図される。修飾は、糖部分、塩基部分および／またはヌクレオチド間結合に対する変更と置換を含む。
「リン酸塩ベース」部分は、無機リン酸塩（Ｐｉ）およびホスホロチオエート（Ｐｓ）を含む。
ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの全ての類似体または修飾は、前記類似体または修飾が、ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの機能に対し実質的に悪い影響を与えない限り、本明細書で開示の分子を使って実行可能である。受容可能な修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間結合の修飾およびこれらの組み合わせが含まれる。
場合によっては「脱塩基ヌクレオチド」または「脱塩基ヌクレオチド類似体」として言及されるものは、より正確には、疑似ヌクレオチドまたは非通常部分として言及されるものである。ヌクレオチドは、核酸の単量体単位であり、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸塩、および塩基（ＤＮＡ中のアデニン、グアニン、チミン、またはシトシン；ＲＮＡ中のアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシン）から構成される。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の糖、リン酸塩および／または塩基中の修飾を含む。脱塩基疑似ヌクレオチドは、塩基が欠けており、従って、厳密にはヌクレオチドではない。脱塩基デオキシリボース部分は、例えば、脱塩基デオキシリボース−３’−リン酸塩；１、２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−リン酸塩；１、４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−リン酸塩を含む。逆位脱塩基デオキシリボース部分は、逆位デオキシリボ脱塩基；３’、５’逆位デオキシ脱塩基５’−リン酸塩を含む。一般的には、逆位脱塩基部分は、３’−３’結合を介して３’末端ヌクレオチドに共有結合しており；逆位脱塩基部分は、５’−５’結合を介して５’末端ヌクレオチドに共有結合しており；逆位脱塩基部分は、通常、５’−３’結合を介して逆位脱塩基部分に共有結合している。
本明細書で使われる用語の「キャッピング部分」（ｚ"）は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合可能な部分を含み、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分を含む。これらには、２’Ｏアルキル修飾；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分およびこれらの修飾；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡ等のミラーヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；および４’、５’−メチレンヌクレオチド等のヌクレオチド類似体が含まれる。また、ヌクレオチド類似体には、１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸塩；１、３−ジアミノ−２−リン酸プロピル、３−アミノリン酸プロピル；６−アミノヘキシルリン酸塩；１２−アミノドデシルリン酸塩；ヒドロキシプロピルリン酸塩；１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；ｔｈｒｅｏペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’、４’−セコヌクレオチド；３、４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３、５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位脱塩基部分；１、４−ブタンジオールリン酸塩；５’−アミノ；および架橋結合または非架橋結合メチルホスホネートおよび５’メルカプト部分、が挙げられる。
特定のキャッピング部分は、脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースまたは脱塩基デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡを含むミラーヌクレオチドである。本発明の化合物は、１つまたは複数の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを使って合成してもよい（例えば、Ｔａｋｅｉ、ｅｔ ａｌ．、２００２．ＪＢＣ２７７（２６）：２３８００−０６参照）。
用語の、「非ヌクレオチド部分」は、ヌクレオチドでない、すなわち、ヌクレオチドの全ての部分：糖、塩基およびリンカーを含まない部分を指す。
本明細書で使われる用語の「非通常部分」は、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、炭化水素（アルキル）部分、および無機リン酸塩を含み、さらにデオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡ）、非塩基対形成ヌクレオチド類似体および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチド（２’５’ヌクレオチドとしても知られる）；ＬＮＡおよびエチレン架橋核酸を含む架橋核酸、結合修飾（例えば、ＰＡＣＥ）および塩基修飾ヌクレオチドならびに本明細書で非通常部分として明示的に開示される追加の部分を含む、非ヌクレオチド部分を指す。
オーバーハングに関連して使われる場合、「アルキル部分」または「炭化水素部分」は、例えば、Ｃ２（エチル）、Ｃ３（プロピル）等のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６直鎖鎖もしくは分岐アルキル部分を指す。オーバーハングに関連して使われる場合、アルキルまたは炭化水素部分の「誘導体」は、特に、アルコール、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、ホスホノ酢酸、アミン、カルボン酸、エステル、アミドおよびアルデヒドから選択される官能基を含むＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６直鎖鎖もしくは分岐アルキル部分を指す。
リボースまたはデオキシリボース部分の修飾に関連して使われる場合、「アルキル」は、直鎖、分岐、または環式の飽和炭化水素構造およびこれらの組み合わせを含むことが意図されている。リボースまたはデオキシリボース部分の修飾に関連して使われる場合、「低級アルキル」は、１〜６炭素原子のアルキル基を特異的に指す。低級アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−およびｔ−ブチル等が含まれる。好ましいアルキル基は、Ｃ２０またはそれ未満のものである。シクロアルキルは、アルキルのサブセットであり、３〜８炭素原子の環式飽和炭化水素基を含む。シクロアルキル基の例には、ｃ−プロピル、ｃ−ブチル、ｃ−ペンチル、ノルボルニル、アダマンチル、等が含まれる。
「末端官能基」には、ハロゲン、アルコール、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、エーテル基が含まれる。
本発明において、「ミラー」ヌクレオチド（シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）とも呼ばれる）は、天然に存在するまたは通常使用されるヌクレオチドに対する逆キラリティーを有するヌクレオチド類似体、すなわち、天然に存在するまたは通常使用されるヌクレオチドの鏡像体である。ミラーヌクレオチドは、リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）であり、少なくとも１つの糖または塩基修飾および／または骨格修飾、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホネート部分をさらに含んでもよい。米国特許第６、６０２、８５８号は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒を開示している。ミラーヌクレオチドには、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−リン酸塩（ミラーｄＡ）；Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−リン酸塩（ミラーｄＣ）；Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸塩（ミラーｄＧ）；Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−リン酸塩（鏡像ｄＴ））およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−リン酸塩（ミラーｒＡ）；Ｌ−リボシチジン−３’−リン酸塩（ミラーｒＣ）；Ｌ−リボグアノシン−３’−リン酸塩（ミラーｒＧ）；Ｌ−リボウラシル−３’−リン酸塩（ミラーｄＵ）が含まれる。
修飾デオキシリボヌクレオチドには、例えば、５’ＯＭｅＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−リン酸塩）（これは、５’末端位置（位置番号１）のヌクレオチドとして有用と思われる）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノ酢酸、デオキシリボシチジン３’ホスホノ酢酸、デオキシリボグアノシン３’ホスホノ酢酸、デオキシリボチミジン３’ホスホノ酢酸が含まれる。
非通常部分には、ＬＮＡ（２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３’モノホスフェイト、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’モノホスフェイト、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３’モノホスフェイト、５−メチルウリジン（またはチミジン）３’モノホスフェイト；およびＥＮＡ（２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３’モノホスフェイト、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’モノホスフェイト、２’−Ｏ、４’−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３’モノホスフェイト、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’モノホスフェイト）等の架橋核酸が含まれる。
本発明の一部の実施形態では、非通常部分は、脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドである。
ヌクレオチドは、天然または合成修飾塩基から選択される。天然の塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが含まれる。ヌクレオチドの修飾塩基には、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、擬似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニンおよび他の置換グアニン、他のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシルおよび５−トリフルオロシトシンが含まれる。１つまたは複数の脱塩基疑似ヌクレオチド含有ｓｉＲＮＡ化合物は本発明に含まれる。脱塩基疑似ヌクレオチドモノマー等の修飾塩基を含むヌクレオチドモノマーが、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドを置換してもよい。脱塩基疑似ヌクレオチドモノマーは、１つまたは複数の末端位置に、または５’末端キャップとして含まれてもよい。５’末端キャップは、また、逆位脱塩基疑似ヌクレオチド類似体、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、およびＣ６−イミンリン酸塩から選択されてもよい。
さらに、ポリヌクレオチドの類似体は、１つまたは複数のヌクレオチドの構造が根本的に変更され、治療または実験用試薬としてさらに適合するように調製される。ヌクレオチド類似体の一例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸塩骨格は、ペプチド中に見つかったものと類似であるポリアミド骨格を含む。ＰＮＡ類似体は、酵素分解に対し耐性であること、およびインビボおよびインビトロで長寿命を有することが示されている。
糖残基に対する可能な修飾は、多様であり、２’−Ｏアルキル、２’−ハロ（例えば、２’デオキシフルオロ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシッド；アルトリトール（ＡＮＡ）およびモルホリノ、およびシクロヘキセニル他の６員糖を含む。糖残基の２’部分の可能な修飾には、アミノ、フルオロ、メトキシアルコキシ、アルキル、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、イミダゾール、カルボン酸塩、チオ酸塩、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロジクロアルキル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋｙｌ）；ヘテロジクロアルカリル（ｈｅｔｅｒｏｚｙｃｌｏａｌｋａｒｙｌ）；アミノアルキルアミノ；特に、欧州特許第ＥＰ０５８６５２０Ｂ１号または欧州特許第ＥＰ０６１８９２５Ｂ１号に記載のように、ポリアルキルアミノまたは置換シリル、が含まれる。１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドは、また、本発明の化合物中で許容できる。一部の実施形態では、（Ｎ’）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＤＮＡ部分を含む。
ＬＮＡ化合物は、国際公開第００／４７５９９号、同第９９／１４２２６号、および同第９８／３９３５２号で開示されている。ＬＮＡヌクレオチド含有ｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．、（ＮＡＲ２００５．３３（１）：４３９−４４７）および国際公開第２００４／０８３４３０号で開示されている。６員環ヌクレオチド類似体は、Ａｌｌａｒｔ、ｅｔ ａｌ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９８、１７：１５２３−１５２６、；およびＰｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ、ｅｔ ａｌ．、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇ．およびＭｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：１４５７−１４６０）で開示されている。ヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチドモノマー等の６員環ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、国際公開第２００６／０４７８４２号で開示されている。
ヌクレオチド間結合修飾としても知られる骨格修飾、例えば、エチル（ホスホエチルトリエステルを生じている）；プロピル（ホスホプロピルトリエステルを生じている）；およびブチル（ホスホブチルトリエステルを生じている）もまた、可能である。他の骨格修飾には、ポリマー骨格、環式の骨格、非環式骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、アミダート、ホスホノ酢酸誘導体が含まれる。特定の構造には、１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチド間結合（架橋または骨格）を有するｓｉＲＮＡ化合物が含まれる。
一部の実施形態では、（Ｎ）ｘも、（Ｎ’）ｙも３’および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの片方または両方が、３’末端（３’Ｐｉ）でリン酸化されている。また別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの片方または両方が、非開裂型リン酸基を有する３’末端でリン酸化されている。また別の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの片方または両方が、開裂型または非開裂型リン酸基を使って、末端の２’末端位置でリン酸化されている。さらに、本発明の阻害核酸分子は、１つまたは複数のギャップおよび／または１つまたは複数のニックおよび／または１つまたは複数のミスマッチを含んでもよい。理論に拘泥する意図はないが、ギャップ、ニックおよびミスマッチは、核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定化し、それにより、内在性細胞機構、例えば、ダイサー、ドローシャまたはＲＩＳＣによりさらに容易に阻害部分中へのプロセッシングを行なえるという利点を有する。
本発明において、核酸中のギャップは、１つの鎖における１つまたは複数の内部ヌクレオチドが存在しないことを指し、一方、核酸中のニックは、１つの鎖における２つの隣接ヌクレオチド間のヌクレオチド間結合が存在しないことを指す。本発明のいずれの分子も、１つまたは複数のギャップおよび／または１つまたは複数のニックを含むことができる。
オリゴヌクレオチド
非制限的例では、本発明の譲受人に譲渡された国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）は、本出願に従ってｓｉＲＮＡ化合物を調製するのに有用であるセンスおよび対応するアンチセンスオリゴマーの核酸配列を含む。化合物は、化学的におよび／または構造的に修飾された化合物として使用される。
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択と合成は、広範に報告がなされてきた；例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；６５０５２；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＲＣ．２００４、３１９（１）：２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ、Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４、２５２：４５７−６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４、２０（３）：４３０−２；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ．２００４、３２（３）：９３６−４８を参照。例えば、修飾ｓｉＲＮＡの使用と産生については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３、４２（２６）：７９６７−７５；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ．２００３、９（９）：１０３４−４８；国際公開第２００４／０１５１０７号および国際公開第０２／４４３２１号および米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号を参照。
本発明は、二重鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を提供し、これは、目的の遺伝子の発現を下方制御する。本発明のｓｉＲＮＡは、二重鎖オリゴリボヌクレオチドで、センス鎖は、目的の遺伝子のｍＲＮＡ配列由来であり、アンチセンス鎖は、少なくとも実質的にセンス鎖に相補的である。一般的に、標的ｍＲＮＡ配列からのわずかのずれは、ｓｉＲＮＡ活性を損なうことなく許容可能である（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ．２００３、３１（１１）：２７０５−２７１６を参照）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを破壊して、または破壊をしないで転写後レベルの遺伝子発現を阻害する。如何なる理論にも縛られるものではないが、ｓｉＲＮＡは、特異的開裂および分解のためにｍＲＮＡを標的にでき、および／または標的メッセージの翻訳を阻害することができる。
他の実施形態では、２つの鎖の内の少なくとも１つの鎖は、５’末端に少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを持つことが可能である。オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドから構成することができる。ＲＮＡ２重鎖の長さは、約１６〜約４０リボヌクレオチド、好ましくは、１９リボヌクレオチドである。さらに、各鎖の長さは、独立に、約１６〜約４０塩基、好ましくは、１８〜２３塩基、さらに好ましくは、１９リボヌクレオチドからなる群より選択される長さを有してもよい。
特定の実施形態では、前記第１の鎖および標的核酸の間の相補性は完全である。一部の実施形態では、鎖は、前記第１の鎖と標的ｍＲＮＡの間、または第１および第２の鎖の間で実質的に相補的である、すなわち、１つ、２つ、または５つまでのミスマッチを有する。実質的に相補的は、別の配列に対して約７０％超で１００％未満の相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域中では、１つのミスマッチにより９４．７％の相補性を生じ、２つのミスマッチにより約８９．５％の相補性を生じ、３つのミスマッチにより約８４．２％の相補性を生じ、４つのミスマッチにより約７９％の相補性を生じ、さらに５つのミスマッチにより約７４％の相補性を生じ、二重鎖領域に実質的な相補性を与える。従って、実質的な同一性は、別の配列に対する約７０％超の同一性を指す。
第１鎖および第２鎖は、ループ構造により結合してもよく、これを非核酸ポリマー、例えば、特に、ポリエチレングリコールで構成してもよい。あるいは、ループ構造を修飾および非修飾リボヌクレオチドならびに修飾および非修飾デオキシリボヌクレオチドを含む核酸で構成してもよい。
さらに、ｓｉＲＮＡの第１鎖の５’末端を、第２鎖の３’末端に結合させてもよく、または第１鎖の３’末端を、第２鎖の５’末端に結合させてもよく、前記結合は、通常、２〜１００核酸塩基、好ましくは、約２〜約３０核酸塩基の間の長さを有する核酸リンカーによるものである。
本発明の化合物が、該化合物のアンチセンスおよびセンス鎖の内の少なくとも１つにおいて修飾された交互リボヌクレオチドを有する一部の実施形態では、１９塩基および２３塩基オリゴマーに対し、アンチセンス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、糖残基が修飾され、センス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、糖残基が非修飾である。２１塩基オリゴマーに対しては、センス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、糖残基が修飾され、アンチセンス鎖の５’および３’末端のリボヌクレオチドは、糖残基が非修飾であるか、または任意選択で、３’末端のさらなる修飾を有してもよい。上述のように、一部の実施形態では、アンチセンス鎖の中央のヌクレオチドは非修飾である。
本発明の一実施形態では、オリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡのアンチセンスおよびセンス鎖は、３’末端のみでリン酸化され、５’末端ではリン酸化されない。本発明の別の実施形態では、アンチセンスおよびセンス鎖は、非リン酸化型である。さらに別の本発明の実施形態では、センス鎖の５’末端のリボヌクレオチドを修飾し、インビボでの５’リン酸化の可能性を完全に消滅させる。
本明細書で開示のいずれのｓｉＲＮＡ配列も、本明細書で開示される修飾／構造のいずれかを付与して調製される。配列と構造の組み合わせは新規性があり、本明細書で開示の状態の治療での使用に有用である。
医薬組成物
本発明の化合物を未処理の化学薬品として投与することも可能であるが、医薬組成物として提供することが好ましい。従って、本発明は、１つまたは複数の本発明の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。この組成物は、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡの混合物を含んでもよい。
本発明は、上記で開示されているように、１つまたは複数の遺伝子を阻害するのに有効な量の、共有結合でまたは非共有結合で１つまたは複数の本発明の化合物に結合した少なくとも１つの本発明の化合物、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物をさらに提供する。化合物は、内在性細胞複合体により細胞内でプロセッシングされて１つまたは複数の本発明のオリゴリボヌクレオチドを産生することができる。
本発明は、薬学的に許容可能なキャリア、および１つまたは複数の本発明の化合物を含む医薬組成物をさらに提供し、この化合物は、標的遺伝子および標的ｍＲＮＡ、および／または標的タンパク質を含む標的ＲＮＡの、細胞における発現を下方制御するのに有効な量であり、（Ｎ）ｘの配列に相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ウイルス性、細菌性または哺乳動物遺伝子である。種々の実施形態では、標的遺伝子は、哺乳動物遺伝子であり、好ましくは、ヒト遺伝子である。
さらに、本発明は、対照と比較して標的遺伝子の発現を少なくとも５０％阻害する方法を提供し、この方法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物を１つまたは複数の本発明の化合物と接触させることを含む。一部の実施形態では、活性ｓｉＲＮＡ化合物は、対照と比較して少なくとも５０％、６０％または７０％のレベルで遺伝子発現を阻害する。特定の実施形態では、阻害は、対照と比較して少なくとも７５％、８０％または９０％のレベルである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、本明細書で開示のアポトーシス促進性遺伝子である。
一実施形態では、オリゴリボヌクレオチドは、１つまたは複数の本発明のアポトーシス促進性遺伝子を阻害しており、それにより、阻害は、遺伝子機能の阻害、ポリペプチドの阻害およびｍＲＮＡ発現の阻害を含む群から選択される。
一実施形態では、化合物は、標的遺伝子によりコードされたポリペプチドの発現を阻害し、それにより、阻害は、機能の阻害（特に、ネイティブ遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用物質を使った酵素アッセイまたは結合アッセイにより調査可能である）、タンパク質の阻害（特に、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降により調査できる）およびｍＲＮＡ発現の阻害（特にノーザンブロッティング、定量ＲＴ−ＰＣＲ、インサイツハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイハイブリダイゼーションにより調査できる）を含む群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明により、高レベルの本発明のアポトーシス促進性遺伝子により起こる疾患に罹患している患者を治療する方法が提供され、この方法は、治療有効量の本発明の化合物を患者に投与し、それにより患者を治療することを含む。
送達
一部の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、キャリアまたは希釈剤と一緒に調製した裸の分子を直接適用することにより標的組織に送達される。
用語「裸のｓｉＲＮＡ」は、細胞への侵入を支援、促進、または容易化するように作用する、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈殿剤等の、送達ビークルを含まないｓｉＲＮＡ分子を指す。例えば、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡが「裸のｓｉＲＮＡ」である。
しかし、一部の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、リポソームまたはリポフェクチン製剤等の形態で送達され、当業者によく知られた方法で調製される。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号、に記載されており、これらの特許は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞中へ送達を強化および改善することを特に目的としたデリバリーシステムが開発されている（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌＦＥＢＳＬｅｔ．２００３、５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２、２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ ２００３、９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３．３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２、３２：１０７−１０８およびＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ ２００３、３１、１１：２７１７−２７２４を参照）。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類の遺伝子発現の阻害への使用に成功した（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照）。
薬学的に許容可能なキャリア、溶剤、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびビークルならびに植込剤キャリアは、通常、本発明の有効成分とは反応しない、不活性の、非毒性固体または液体の、充填剤、希釈剤またはカプセル化材料を指し、またリポソームおよびマイクロスフェアを含む。本発明に有用なデリバリーシステムの例としては、米国特許第５，２２５，１８２号；同第５，１６９，３８３号；同第５，１６７，６１６号；同第４，９５９，２１７号；同第４，９２５，６７８号；同第４，４８７，６０３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４３９，１９６号；および同第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のこのような植込剤、デリバリーシステム、およびモジュールは、当業者によく知られている。本発明の一具体的実施形態では、局所製剤および経皮製剤が、選択可能である。ｓｉＲＮＡまたは本発明の医薬組成物は、個別の患者の臨床的状態、治療される疾患、投与部位と方法、投与計画、患者年齢、性別、体重および医療従事者には既知の他の因子を考慮する、良質な医療行為に従って、投与および投薬される。
本明細書の目的のための「治療有効量」は、従って、当技術分野で既知の考慮事項により決定される。用量は、以下（これらに限定されない）を含む改善を達成するのに有効である必要がある：生存率の改善またはより急速な回復、または症状および適切な尺度として当業者により選択される他の示標の改善もしくは除去。
一般的に、投与量は、０．０１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重（例えば、０．１ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、または５００ｍｇ／ｋｇ体重）であってよい。
核酸分子の適切な投与ユニットは、０．００１〜０．２５ミリグラム／受容者のキログラム体重／日の範囲、または０．０１〜２０マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．０１〜１０マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．１０〜５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲であってもよい。
核酸分子の適切な量を投与することができ、これらの量は、標準的な方法を使って経験的に決定できる。細胞の環境下の個別の核酸分子種の有効な濃度は、約１フェムトモル濃度（ｆｍｏｌａｒ）、約５０フェムトモル濃度、１００フェムトモル濃度、１ピコモル濃度、１．５ピコモル濃度、２．５ピコモル濃度、５ピコモル濃度、１０ピコモル濃度、２５ピコモル濃度、５０ピコモル濃度、１００ピコモル濃度、５００ピコモル濃度、１ナノモル濃度、２．５ナノモル濃度、５ナノモル濃度、１０ナノモル濃度、２５ナノモル濃度、５０ナノモル濃度、１００ナノモル濃度、５００ナノモル濃度、１マイクロモル濃度、２．５マイクロモル濃度、５マイクロモル濃度、１０マイクロモル濃度、１００マイクロモル濃度またはそれ以上であってよい。
キャリア材料と組み合わせて単回剤形を作ることができる有効成分の量は、治療されるホストおよび具体的な投与様式に応じて変わる。投与ユニット剤形は、通常、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間の有効成分を含む。
いかなる特定の患者に対する個別の用量レベルも、使用される特定化合物の活性、年齢、体重、総合的健康、性別、食事、投与の時間、投与経路、および排出速度、薬剤の組み合わせ、ならびに治療中の特定の疾患の重症度を含む種々の因子に依存することは理解されよう。
本明細書で開示される核酸分子を含む医薬組成物は、１日１回、１日４回、１日３回、１日２回、毎日、または医学的に適切な任意の間隔で、任意の期間投与できる。しかし、治療薬は、２、３、４、５、６またはそれ以上の、１日を通し適切な間隔で投与される分割用量を含む投与ユニットで投与してもよい。そのような場合には、各分割用量中に含まれる核酸分子は、合計毎日投与ユニットになるように、対応してより少量とすることができる。投与ユニットは、また、数日間で単回用量になるように、例えば、数日間の期間に渡ってｄｓＲＮＡの持続的、一定の放出を提供する従来の徐放製剤を使って、配合することもできる。徐放製剤は、当技術分野でよく知られている。投与ユニットは、対応する一日量の倍量を含んでもよい。組成物を、複数のユニットの核酸を合計して、充分な用量を含むように配合することもできる。
キットおよび容器
また、標的遺伝子の発現を低減させことを目的とする本明細書で提供される核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）を含む、患者に核酸分子を投与するためのキット、容器および製剤が提供される。一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルが含まれる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、種々の材料、例えば、ガラス、金属またはプラスチックで形成してもよい。キットは、関連する指示書および／または説明書をさらに含めることもできる。また、試薬および他の組成物またはこの目的に使用されるツールも、含めることができる。
容器は、その他に、状態の治療、診断、予知または予防に有効な組成物を入れてもよく、また、無菌のアクセスポートを備えることもできる（例えば、容器は、皮下組織注入針が貫通可能な栓を有する静脈内注射用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の活性試薬は、特異的に標的遺伝子に結合できる、および／または標的遺伝子の機能を調節できる核酸分子であってもよい。
キットには、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲル溶液および／またはデキストロース溶液を入れた第２の容器をさらに含んでもよい。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、スターラー、注射針、シリンジ、および／または指示書および／または使用説明書を含む添付文書等の商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含めてもよい。
核酸分子が使用の前に充填されるユニット投与アンプルまたは複数回投与容器は、薬学的に有効量として適切な量または有効量の複数倍の量の核酸分子または核酸分子含有溶液を封入した気密シール容器を含んでもよい。核酸分子は、無菌の製剤としてパッケージされ、気密シール容器は、使用まで製剤を無菌に保持するように設計されている。
核酸分子含有容器は、ラベルを添付したパッケージを含んでもよく、ラベルには、政府当局、例えば、食品医薬品局により規定された書式の注意事項を表示することができる。この注意事項は、ヒトへの投与を目的とした使用ポリヌクレオチド材料の製造、使用、または販売の、連邦法に準拠した当局の承認が反映される。
連邦法または合衆国法では、医薬組成物のヒトの治療への使用は、連邦政府または合衆国政府当局の承認を必要とする。米国では、施行は、食品医薬品局の責任であり、該局はこのような承認を確実に行うための条例を公布する（詳細は２１Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３０１〜３９２参照）。同様の承認は大抵の外国でも必要であり、固有の手続きは、当業者にはよく知られており、本明細書で提供される組成物と方法は、それに準拠することが望ましい。
投与量は、治療される患者の状態およびサイズならびに治療頻度および投与経路に大きく依存する。用量と頻度を含む継続治療のための投与計画は、初期応答および臨床的判断に従って行うことができる。
本明細書で開示の核酸化合物は、いずれの従来の投与経路によっても投与できる。化合物は、化合物それ自体として、または薬学的に許容可能な塩として投与され、また、単独でもまたは薬学的に許容可能なキャリア、溶剤、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびビークルとの混合物中の有効成分としても投与されることは、留意すべきである。化合物は、経口、局所的、皮下、または、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、および鼻腔内、吸入、経鼓膜投与ならびに髄腔内および点滴法を含む非経口的に投与される。化合物の植込錠もまた、有用である。液状物が注射用に調製でき、この用語には、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、鞘内、および他の非経口投与経路用が含まれる。液体組成物は、有機共溶媒を添加したおよび添加しない水溶液、水性またはオイル懸濁液、食用オイルによる乳剤、ならびに類似の医薬品ビークルを含む。特定の実施形態では、投与は、静脈内投与を含む。別の実施形態では、投与は、局所的（topical）または局部的（local）投与を含む。一部の実施形態では、局所的投与は、哺乳動物外耳道への局所的投与を含む。一部の実施形態では、局所的投与は、哺乳動物の目の表面への局所的投与を含む。
さらに、特定の実施形態では、本発明の新規治療で使用する組成物は、例えば、鼻腔内投与用のエアロゾルとして形成できる。
特定の実施形態では、経口組成物（例えば、錠剤、懸濁剤、水剤）、例えば口腔粘膜炎の治療用うがい薬として適切な経口組成物は、口腔への局所送達に有効である可能性がある。
複数の実施形態では、治療される患者は、温血動物および、特に、ヒトを含む哺乳動物である。
さらなる実施形態では、修飾は、リン酸部分の修飾であり、それにより、修飾されたリン酸部分は、ホスホロチオエートを含む基またはリン酸欠乏基から選択される。
本発明の分子には、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、合成ｓｉＲＮＡ、合成ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡが含まれ、これらは、このような分子または他の阻害性ヌクレオチド分子をコードする他の核酸配列または分子のほかに追加して含まれる。
一部の実施形態では、核酸化合物は、診断に有用である。理論に拘泥する意図はないが、３’末端非ヌクレオチドを含む二重鎖核酸分子は、特定細胞および組織に効率的に送達可能であり、特定細胞または組織の障害の診断に有用である。従って、末端修飾には、発色剤、放射標識成分および酵素試薬等の検出可能部分を含む。一部の実施形態では、検出可能剤は、ビオチン基である。このようなビオチン基は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドまたはアンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドまたはこれらの末端の両方に結合するのが好ましい場合がある。本明細書で開示の種々の末端修飾は、本発明に従って、核酸のヌクレオチドのリボース部分の位置にあるのが好ましい。末端修飾は、リボース部分のいずれかのＯＨ基に結合するか、またはこの基を置換できればさらに好ましく、このＯＨ基には、これらに限定されないが、２’ＯＨ、３’ＯＨおよび５’ＯＨ位置が含まれる。ただし、このように修飾されるヌクレオチドが、末端ヌクレオチドであり、好ましくは、センス鎖の５’末端ヌクレオチドである場合に限られる。内在性細胞複合体（例えば、ダイサー（上記参照））によりプロセッシングされて本明細書で開示のｓｉＲＮＡ分子、または本明細書で開示のｓｉＲＮＡ分子を含む分子を形成する、本明細書で開示される核酸分子または任意の長い二重鎖ＲＮＡ分子（典型的には、２５〜５００ヌクレオチドの長さ）が、本発明の分子中に組み込まれ、さらなる新規分子を形成し、本明細書記載の疾患または障害の治療に使われることを理解されたい。
特に、長いオリゴヌクレオチドは、キャリア、好ましくは薬学的に許容可能なキャリア、により送達され、細胞内で内在性細胞複合体（例えば、上述のドローシャおよびダイサー）によりプロセッシングされ、１つまたは複数のより低分子の二重鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を産生できることが想定される。これが本発明のオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、タンデムｓｈＲＮＡ構築物と名付けられている。この長いオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のステムおよびループ構造を含む単鎖オリゴヌクレオチドであり、各ステム領域は、センスおよび対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含むと考えられている。任意の分子、例えば、本明細書で開示の阻害配列（適切な核酸修飾を有する）を含むアンチセンスＤＮＡ分子が特に好ましく、全ての本明細書で開示の使用と方法に対し、これらの対応するＲＮＡ／ｓｉＲＮＡと同じ能力で使用可能である。
骨格
本明細書で開示の核酸分子のヌクレオシドサブユニットは、リン酸ジエステル結合により相互に結合可能である。標準的５’３’リン酸ジエステル結合は、任意選択により、他の結合と置換可能である。例えば、ホスホロチオエート、チオホスフェート−Ｄ−リボース成分、トリエステル、チオ酸塩、２’−５’架橋骨格（５’−２’または２’５’とも呼ばれる）、ＰＡＣＥ、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオ―ホスホロチオエート、ホスホロジチオ酸塩、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノリン酸塩、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または５’−）アミノホスホロアミデート、水素ホスホネート、ホスホネート、ボラノリン酸エステル、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステル修飾、例えば、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステルリン結合、５’−エトキシリン酸ジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および非リン含有結合、例えば、炭酸塩、カルバマート、シリル、硫黄、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノ結合。さらに、ヌクレオチドの構造が根本的に変えられ、治療または実験用試薬としてより良く適合するポリヌクレオチド類似体が、調製可能である。ヌクレオチド類似体の例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸塩骨格が、ペプチド中に見出されるものと類似のポリアミド骨格を含む。ＰＮＡ類似体は、酵素による分解に耐性を示し、また、インビボおよびインビトロで寿命延長を示している。さらに、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ配列に対し、ＤＮＡ分子より強力に結合することが示されている。この観察結果は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖間の電荷反発の欠如が原因である。オリゴヌクレオチドの合成に有用な他の修飾モノマーには、ポリマー骨格、環式骨格、または非環式骨格を有する成分が含まれる。
治療方法
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の異常な発現に関連した疾患または障害の治療を必要としている患者の治療方法に関し、該方法は、その遺伝子の発現を低減する、または阻害するある量の阻害剤を患者に投与することを含む。
特定の実施形態では、治療される患者は、温血動物であり、特に、ヒトを含む哺乳動物である。
本発明の方法は、遺伝子の発現を下方制御する１つまたは複数の治療有効量の阻害化合物、特に、ｓｉＲＮＡを患者に投与し、それによりその患者を治療することを含む。
用語の「治療」は、治療的処置および予防的（prophylactic）または予防的（preventative）手段の両方を指し、ここでの目的は、本明細書に挙げた障害を予防する、または進行を遅らせる（和らげる）ことである。治療の必要な対象には、既に疾患または状態を経験している対象、疾患または状態に罹り易い対象、および疾患または状態を予防する必要がある対象が含まれる。本発明の化合物は、関連する疾患または状態または症状の発症の前、その間、またはその後に投与される。治療が予防目的である場合は、本発明は、疾患または障害の発症を遅延する、または進行を回避するための方法に関する。
本発明は、アポトーシス促進性遺伝子の発現の阻害が有益である以下の疾患または状態の治療における、本発明のアポトーシス促進性遺伝子の発現を下方制御する化合物の使用、特に、新規低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用に関する：難聴、急性腎不全（ＡＲＦ）、緑内障、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）ならびに他の急性肺および呼吸器損傷、肺移植後の虚血再灌流障害、ＤＧＦを含む肺、肝臓、心臓、骨髄、膵臓、角膜および腎臓移植を含む臓器移植；脊髄損傷、褥瘡、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ドライアイ症候群、ＩＯＮおよびＮＡＩＯＮ等の眼性虚血状態；口腔粘膜炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）。他の適応症には、化学誘導腎毒性および化学誘導神経毒性、例えば、シスプラチンおよびシスプラチン様化合物、アミノグリコシド、ループ利尿薬、ならびにヒドロキノンとその類似体により誘導される腎毒性が含まれる。
本発明のアポトーシス促進性遺伝子を阻害する方法、分子および組成物に関し本明細書で詳細に考察されてきたが、前記分子および／または組成物のいずれも、前記状態のいずれかに罹患している患者の治療において有益に使用される可能性がある。
さらなる態様では、本明細書で開示の適応症のいずれか１つに罹患している患者の処置に治療上効果的である本発明に記載のオリゴヌクレオチド組成物、および使用説明書を入れたパッケージング材料を含む製品が提供される。
本明細書では、標的遺伝子の発現を標的特異的に阻害または下方制御することが可能な二重鎖ＲＮＡ分子を調製する方法が開示され、各ＲＮＡ鎖は、１９〜２５ヌクレオチド長さを有し、少なくとも１つの鎖は、その３’末端の糖残基の３’位または２’位で共有結合した非ヌクレオチド部分を有し、この方法は、（ａ）それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長を有し、二重鎖ＲＮＡ分子を形成可能である２つのＲＮＡ鎖を合成すること、（ｂ）二重鎖ＲＮＡ分子が形成され、前記二重鎖ＲＮＡ分子が単一の二重鎖領域およびそれが存在する鎖の３’末端の糖残基の３’位または２’位で共有結合した非ヌクレオチド部分を含む少なくとも１つの単鎖領域とから構成され；前記非ヌクレオチド部分がプロパノール、リン酸ジエステルに結合したＣ３アルキル部分、ホスホロチオエートに結合したＣ３アルキル部分、デオキシリボ脱塩基（deoxyriboabasic）部分またはリボ脱塩基（riboabasic）部分およびこれらの組み合わせから選択される、条件下で前記合成されたＲＮＡ鎖を組み合わせることを含む。
本明細書では、医薬組成物を調製するプロセスが提供され、このプロセスは：
本明細書で開示の１つまたは複数の化合物を提供すること；および
前記化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合すること、
を含む。
また、本発明は、医薬組成物を調製するプロセスを提供し、このプロセスは、１つまたは複数の本発明の化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合することを含む。
一実施形態では、医薬組成物の調製で使用される化合物は、薬学的に有効な量でキャリアと混合される。特定の実施形態では、本発明の化合物は、ステロイドまたは脂質または別の適切な分子、例えば、コレステロールに結合される。
修飾化合物の合成
本発明の化合物は、リボ核酸（またはデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドを合成するための、当技術分野でよく知られたいずれの方法によっても合成可能である。このような合成は、特に、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２；４８：２２２３−２３１１；Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９３；４９：６１２３−６１９４およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、ｅｔ．ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：２８７−３１３、に記載されており；チオ酸塩の合成は、特に、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７−４０２に記載され、ＲＮＡ分子の合成は、Ｓｐｒｏａｔ、ｉｎ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００５ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ Ｐ．；Ｋａｐ．２：１７−３１に記載され、さらにそれぞれの下流プロセスは、特に、Ｐｉｎｇｏｕｄ ｅｔ．ａｌ．、ｉｎ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９ ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｌｉｖｅｒ Ｒ．Ｗ．Ａ．；Ｋａｐ．７：１８３−２０８、に記載されている。
他の合成方法が、当技術分野で既知であり、例えば、Ｕｓｍａｎｔｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８７、１０９：７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ、１９９０、１８：５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ １９９５、．２３：２６７７−２６８４；およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、１９９７、７４：５９、に記載されている。これらの方法では、通常の核酸保護基およびカップリング基、例えば、５′末端のジメトキシトリチル、および３′末端のホスホラミダイトを利用することができる。修飾（例えば、２′−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドが所望の通りに組み込まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、別々に合成して、例えば、ライゲーション（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２、２５６：９９２３；国際公開第９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ１９９１、１９：４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６：９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １９９７、８：２０４）により、または合成後、および／または脱保護後のハイブリダイゼーションによって、合成後に結合できる。
市販品の装置（特に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能な）が使用可能で、オリゴヌクレオチドは、本明細書で開示の配列に応じて調製されることに留意されたい。化学合成した断片のオーバーラップ対は当技術分野でよく知られた方法を使って連結可能である（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照）。鎖は別々に合成され、次にチューブ中で互いにアニールされる。その後、アニールされていない（例えば、それらの内の１つが過剰であるという理由で）単鎖オリゴヌクレオチドから二重鎖ｓｉＲＮＡをＨＰＬＣで分離する。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ断片に関連して、２つ以上のこのような配列が合成され、本発明での使用のために連結されうる。
本発明の化合物は、また、例えば、米国特許公開第２００４／００１９００１号（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）に記載のようにタンデム合成法により合成可能であり、この場合、両方のｓｉＲＮＡ鎖が、開裂型リンカーで分離された、一本鎖の連続するオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成され、該リンカーがその後切断されて、ハイブリダイズ形成し、ｓｉＲＮＡ二重鎖の精製を可能とする別々のｓｉＲＮＡ断片または鎖を与える。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーから選択される。
本明細書で使われる用語の「共有結合」は、原子間の電子対の共有を特徴とする化学結合を指す。
本明細書で使われる用語の「非共有結合」は、分子間、または分子もしくは分子の一部を、通常は特異的配向もしくは高次構造を有するように一緒に保持する力を与える分子の一部の間の、共有結合性では全くない種々の相互作用を指す。これらの非共有結合性相互作用には、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力および双極子−双極子結合が含まれる。
ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングを伴う現象である。この現象を研究し、哺乳動物細胞を実験的に操作する初期の試みは、長鎖ｄｓＲＮＡ分子に応答して活性化した能動的な、非特異的抗ウイルス防護機序によって挫折させられた（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、２０００．５：１０７−１１４）。後に、２１ヌクレオチドＲＮＡの合成二重鎖が、通常の抗ウイルス防護機序を刺激することもなく、哺乳動物細胞中の遺伝子特異的ＲＮＡｉを媒介する可能性があることが発見された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１、４１１：４９４−４９８およびＣａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００１、９８：９７４２−９７４７を参照）。その結果、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子の機能を理解しようとする試みを支援する強力なツールとなった。
哺乳動物中のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ １９９８、３９１：８０６）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Ａｍｂｒｏｓ、Ｎａｔｕｒｅ ２００４、４３１（７００６）：３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ ２００４、１１６（２）：２８１−９７）により媒介される。植物での対応するプロセスは、通常、特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）またはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌では、また、クエリングと呼ばれる。
ｓｉＲＮＡは、その内在性（細胞性）カウンターパートの遺伝子／ｍＲＮＡの発現を下方制御または静める（防ぐ）二重鎖ＲＮＡまたは修飾ＲＮＡ分子である。
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成については、広く報告がなされている（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００６；２００６：６５０５２；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＲＣ．２００４、３１９（１）：２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ、Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；２００４、２５２：４５７−６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４、２０（３）：４３０−２；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ．２００４、３２（３）：９３６−４８、を参照）。
修飾ｓｉＲＮＡの使用と産生の例については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３、４２（２６）：７９６７−７５；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ、２００３、９（９）：１０３４−４８；国際公開第２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ ＡＧ）および同第０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ）を参照のこと。米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号は、化学修飾オリゴマーについて教示している。米国特許公開第２００５／００８０２４６号および同第２００５／００４２６４７号は、それぞれ、交互モチーフを有するオリゴマー化合物および化学修飾ヌクレオシド間結合を有するｄｓＲＮＡ化合物に関する。
他の修飾についても開示されている。５’リン酸塩部分包含が、ショウジョウバエ胚のｓｉＲＮＡの活性を高めることが示され（Ｂｏｕｔｌａ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１、１１：１７７６−１７８０）、ヒトＨｅＬａ細胞においてもｓｉＲＮＡ機能のために必要とされる（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２、１０：５３７−４８）。Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ、等（ＮＡＲ、２００３、３１（２）：５８９−９５）は、ｓｉＲＮＡ活性が、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾の位置取りに依存することを示した。Ｈｏｌｅｎ、等（ＮＡＲ．２００３、３１（９）：２４０１−０７）は、少数の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡが、野性型に比べて良好な活性を与えるが、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの数が増えるにつれ、活性が減少することを報告している。ＣｈｉｕとＲａｎａ（ＲＮＡ．２００３、９：１０３４−４８）は、センスまたはアンチセンス鎖中への２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの組み込み（完全修飾鎖）が、非修飾ｓｉＲＮＡに比べて、大きくｓｉＲＮＡ活性を低下させることを教示している。アンチセンス鎖の５’末端への２’ＯＭｅ基の配置が、活性を大きく制限するが、一方、アンチセンスの３’末端およびセンス鎖の両末端への配置は、許容されたことが報告された（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ．２００３、３１（１１）：２７０５−１６；国際公開第２００４／０１５１０７号）。
いくつかの調査により、ｓｉＲＮＡ治療薬は、哺乳動物およびヒトの両方に対しインビボで有効であることが示された。Ｂｉｔｋｏ、等は、鼻腔内投与した場合、ＲＳウィルス（ＲＳＶ）ヌクレオカプシドＮ遺伝子に対する特異的ｓｉＲＮＡ分子が、マウス治療に有効であることを示した（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００５、１１（１）：５０−５５）。ｓｉＲＮＡ治療薬に関し考察した最近のレビューが入手できる（Ｂａｒｉｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ２００５、８３：７６４−７７３；Ｄａｌｌａｓ ａｎｄ Ｖｌａｓｓｏｖ、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔｏｒ ２００６、１２（４）：ＲＡ６７−７４；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００７、８（３）：４６９−８２；Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６．１３：５４１−５５２）。
Ｍｕｃｋｅ（ＩＤｒｕｇｓ ２００７ １０（１）：３７−４１）は、最新治療薬のレビューを発表しており、これには、眼疾患、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）および緑内障治療用の、種々の標的に対するｓｉＲＮＡが含まれる。
近年、ＲＮＡｉ現象に関連する多くのＰＣＴ出願公報がある。これらには、次のものが含まれる：国際公開第００／４４８９５号；国際公開第００／４９０３５号；国際公開第００／６３３６４号；国際公開第０１／３６６４１号；国際公開第０１／３６６４６号；国際公開第９９／３２６１９号；国際公開第００／４４９１４号；国際公開第０１／２９０５８号；および国際公開第０１／７５１６４号。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡ種の細胞質タンパク質複合体に侵入する能力に基づいており、次にそれが相補的な細胞性ＲＮＡを標的化し、特異的にそのＲＮＡを分解する。ＲＮＡ干渉応答は、ｓｉＲＮＡ含有エンドヌクレアーゼ複合体（通常はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれている）を特徴とし、これが、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する単鎖ＲＮＡの開裂を媒介する。標的ＲＮＡの開裂は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で起こる可能性がある（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２００１、１５（２）：１８８−２００）。さらに詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、ＩＩＩ型ＲＮＡｓｅ（ダイサー、ドローシャ、等；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４０９（６８１８）：３６３−６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００３、４２５（６９５６）：４１５−９）により消化されて短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片になる（これもまた、短い阻害性ＲＮＡ、「ｓｉＲＮＡｓ」と呼ばれる）。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらの断片および相補的ｍＲＮＡを認識する。全プロセスは、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ開裂により完結する（ＭｃＭａｎｕｓ & Ｓｈａｒｐ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、２００２、３（１０）：７３７−４７；Ｐａｄｄｉｓｏｎ & Ｈａｎｎｏｎ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３、５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提案された機序に関する追加の情報については、例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ ２００１、７（１１）：１５０９−２１；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ、Ｃｅｌｌ ２００１、１０７（４）：４１５−８および国際公開第０１／３６６４６号、を参照）。
ｓｉＲＮＡの構造
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成については、広く報告がなされている（例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００６；２００６：６５０５２；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．、ＢＢＲＣ．２００４、３１９（１）：２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ、Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；２００４、２５２：４５７−６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４、２０（３）：４３０−２；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ．２００４、３２（３）：９３６−４８、を参照）。
修飾ｓｉＲＮＡの使用と産生の例については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３、４２（２６）：７９６７−７５；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．、ＲＮＡ、２００３、９（９）：１０３４−４８；国際公開第２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ ＡＧ）および同第０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ）を参照のこと。米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号は、化学修飾オリゴマーについて教示している。米国特許公開第２００５／００８０２４６号および同第２００５／００４２６４７号は、それぞれ、交互モチーフを有するオリゴマー化合物および化学修飾ヌクレオシド間結合を有するｄｓＲＮＡ化合物に関する。
他の修飾についても開示されている。５’リン酸塩部分包含が、ショウジョウバエ胚のｓｉＲＮＡの活性を高めることが示され（Ｂｏｕｔｌａ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１、１１：１７７６−１７８０）、ヒトＨｅＬａ細胞においてもｓｉＲＮＡ機能が必要とされている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２００２、１０：５３７−４８）。Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ、等（ＮＡＲ、２００３、３１（２）：５８９−９５）は、ｓｉＲＮＡ活性が、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾の位置取りに依存することを示した。Ｈｏｌｅｎ、等（ＮＡＲ．２００３、３１（９）：２４０１−０７）は、少数の２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡが、野性型に比べて良好な活性を与えるが、２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの数が増えるにつれ、活性が減少することを報告している。ＣｈｉｕとＲａｎａ（ＲＮＡ．２００３、９：１０３４−４８）は、センスまたはアンチセンス鎖中への２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの組み込み（完全修飾鎖）が、非修飾ｓｉＲＮＡに比べて、大きくｓｉＲＮＡ活性を低下させることを教示している。アンチセンス鎖の５’末端への２’ＯＭｅ基の配置が、活性を大きく制限するが、一方、アンチセンスの３’末端およびセンス鎖の両末端への配置は、許容されたことが報告された（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．、ＮＡＲ．２００３、３１（１１）：２７０５−１６；国際公開第２００４／０１５１０７号）。
本明細書で開示の二重鎖ＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖上に１つの３’非ヌクレオチドオーバーハングを有し、任意選択で、センスおよびアンチセンス鎖のそれぞれに１つずつ、合計２つの３’オーバーハングを有する。
本明細書で開示の分子は、非毒性で、種々の疾患と障害の治療用の医薬組成物の調製に有用であるという点で有利な点がある。
本発明の譲受人に譲渡された国際出願ＰＣＴ／ＩＬ２００７／００１２７８（国際公開第２００８／０５０３２９号）および米国特許出願第１１／９７８、０８９号は、アポトーシス促進性遺伝子の阻害剤に関し、参照によってその全体が組み込まれる。
概して、本発明は、種々の遺伝子の発現を下方制御する化合物、特に、新規低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および種々の医学的状態に罹患している患者の治療におけるこれらの新規ｓｉＲＮＡの使用に関する。
分子および組成物に関し本明細書で詳細に考察されてきたが、前記分子および／または組成物のいずれも、前記状態のいずれかに罹患している患者の治療において有益に使用される可能性がある。
本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、例えば、活性を増加させ、安定性を増加させ、および／または毒性を最小化することができる構造および修飾を有し、本発明のｓｉＲＮＡの新規修飾は、標的遺伝子発現、特に、本明細書で考察の標的遺伝子の発現防止または減弱化に有用である二重鎖ＲＮＡに有利に適用される。
一態様では、非修飾および／または修飾ヌクレオチドを含有する阻害性オリゴヌクレオチド化合物が本明細書で提供される。化合物の１つの鎖は、少なくとも１つの非ヌクレオチド部分、好ましくは、２つの非ヌクレオチド部分を含む少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。本明細書で開示の化合物は、好ましくは、非修飾リボヌクレオチドおよび修飾リボヌクレオチドおよび／または１つまたは複数の非通常部分を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのＮまたはＮ’は、糖修飾、塩基修飾およびヌクレオチド間結合修飾からなる群より選択される。一部の実施形態では、本明細書で開示の化合物は、ＤＮＡ、ＥＮＡ（エチレン架橋核酸）を含むＬＮＡ（ロックド核酸）；ＰＮＡ（ペプチド核酸）；アラビノシド；ＰＡＣＥ（ホスホノ酢酸およびその誘導体）、ミラーヌクレオチド、または６員糖類似体を有するヌクレオチド（例えば、ヘキソースまたはモルホリノ）等の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態では、化合物は、糖部分上の２’修飾（「２’糖修飾」）を有する少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、化合物は、２’Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロまたは２’Ｏ−アリルまたは、任意選択で代替位置上の他のいずれかの２’糖修飾を含む。１つの可能な２’修飾は、２’Ｏ−メチル（２’メトキシ、２’ＯＭｅ）である。
他の安定化修飾も可能である（例えば、オリゴマーの３’または５’末端に付加された修飾ヌクレオチド）。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの骨格は、修飾され、リン酸塩−Ｄ−リボース成分を含むが、また、チオホスフェート−Ｄ−リボース成分、リン酸ジエステルＬ−リボース成分、トリエステル、チオ酸塩、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも呼ばれる）、ＰＡＣＥ修飾ヌクレオチド間結合またはいずれかの他の修飾タイプを含むこともできる。
本発明について、例を用いて説明してきたが、使用した用語は、説明の単語の性質を意図したものであって、制限する意図はないことは理解されよう。
上述の教示を踏まえて、発明の多くの変更および変形が可能であることは明らかである。従って、添付された特許請求の範囲内で、具体的に記載されている内容とは他の方法で本発明を実施することが可能であることが理解されよう。
本発明は、実施例を参照しながら以下に詳細に説明されるが、これに限定されると解釈されるべきではない。
本明細書中のいずれの文書の引用も、これらの文書が関連先行技術であることの承認、またはいずれかの本出願の特許請求の範囲の特許性に対し考慮される資料であることの承認の意図はない。どの文書の内容または日付に関するいずれの記載も、出願人が出願時点で利用可能な情報に基づいており、このような記載の正確さに関して認めるものではない。
実施例
さらなる詳細が無くても、当業者なら、今までの記載を使って、最大限に本発明を利用することが可能であると考えられる。従って、以下の具体的実施形態は、単に説明のためのものと解釈されるべきで、多少なりとも請求された発明を制限するものではない。
具体的に本明細書に記載されていない、当技術分野で既知の標準的分子生物学プロトコルは、通常、以下の文献にある内容に基本的に倣われる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）およびＰｅｒｂａｌ、分子クローニング実践ガイド（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＢｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ（ｅｄｓ）ゲノム分析：実験マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｖｏｌｓ．１−４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）。方法論は次に記載がある：米国特許第４，６６６，８２８号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８０１，５３１号；米国特許第５，１９２，６５９号および米国特許第５，２７２，０５７号。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、通常は、Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）、にあるように行った。フローサイトメトリーと組み合わせたインサイツ（細胞内）ＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含む細胞の検出に対し有用である（Ｔｅｓｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １９９６、８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲを行う方法も、当技術分野でよく知られている。
配列リスト
添付の配列リスト電子ファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる（ファイル名：２１７＿ＰＣＴ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；作成日付：２０１１年１月６日；ファイルサイズ：６．００Ｋｂ）。
実施例１：核酸分子の生成と修飾ｓｉＲＮＡ化合物のインビトロ試験
特許化アルゴリズムおよび標的ヌクレオチドの既知の配列、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡを使って、多くの潜在的ｓｉＲＮＡ核酸分子のセンスおよびアンチセンス配列が生成される。特段の指示がなければ、核酸分子を５’−３’の方向で示し、センスおよび相補的なアンチセンス配列を表の同じ行に示す。
表Ａは、本明細書で開示の核酸分子生成に有用な代表的、非制限的、核酸配列を提供する。
活性：
標準的合成手順を使って、単鎖オリゴヌクレオチド（センス鎖およびアンチセンス鎖）を合成する。ＤＭＴ−プロパン−ジオールホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社；ＣＬＰ−９９０８）を０．０５Ｍの濃度でカップリングさせる。相補的な単鎖オリゴヌクレオチドのアニーリングにより二重鎖を生成する。層流フード中で、単鎖オリゴヌクレオチドの約５００μＭ保存溶液をＷＦＩ（注射剤用の水、Ｎｏｒｂｒｏｏｋ社）で希釈して調製する。実際のｓｓＲＮＡ濃度を、それぞれ５００μＭのｓｓＲＮＡをＷＦＩで１：２００に希釈し、Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐを使ってＯＤを測定することにより決定する。この手続きを３回繰り返し、平均濃度を計算する。次に、２５０μＭの最終濃度に保存溶液を希釈する。相補的な単鎖を８５℃に加熱し、少なくとも４５分かけて室温まで放冷することによりアニールする。二重鎖の５μｌを２０％ポリアクリルアミドゲル操作および染色して、アニーリングが完了したがどうかの試験を行った。試料を−８０℃で保存した。
本明細書で開示の二重鎖核酸分子の活性試験を次のように行った：ウエル当たり約１．５〜２ｘ１０５試験細胞（ヒト遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ用のＨｅＬａ細胞および／または２９３Ｔ細胞ならびにラット／マウス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ用のＮＲＫ５２（正常なラット腎臓近位尿細管細胞）細胞および／またはＮＭｕＭＧ細胞（マウス乳房上皮細胞株））を６ウエルプレート中に播種した（コンフルエントの７０〜８０％）。
約２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使って、０．００１ｎＭ〜約５０ｎＭの最終濃度で、修飾ｓｉＲＮＡ化合物を細胞に形質移入した。この細胞をＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で７２時間インキュベートした。
形質移入用陽性対照として、ＰＴＥＮ−Ｃｙ３標識修飾ｓｉＲＮＡ化合物を使用する。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ化合物をｓｉＲＮＡ活性用陰性対照として使用する。
７２時間後、トランスフェクション細胞を回収し、ＲＮＡを細胞から抽出する。トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡検査で試験する。特異的な好ましいｓｉＲＮＡ構造を使った遺伝子発現の阻害率を、内在性遺伝子を発現している細胞中の標的遺伝子のｑＰＣＲ分析により決定する。
試験したＲＮＡｉ活性のＩＣ５０値は、種々の最終ｓｉＲＮＡ濃度で得られた活性の結果を使って用量反応曲線を作ることにより測定される。用量反応曲線は、形質移入したｓｉＲＮＡ濃度の対数に対し相対量の残余標的ｍＲＮＡをプロットすることにより作成される。曲線は、測定データに最良のシグモイド曲線をフィットさせることにより計算される。シグモイド曲線フィットを使うこの方法は、また、３点曲線フィットとしても知られる。
式中、Ｙは、残余標的ｍＲＮＡ反応、Ｘは、形質移入ｓｉＲＮＡ濃度の対数、Ｂｏｔは、最小プラトーのＹ値、ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最小と最大プラトーの中間であるときのＸ値、およびＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きである。
血清安定性実験
ヒト血清またはヒト組織抽出物中の二重鎖核酸分子の二重鎖の安定性を以下のように試験した：
７ｕＭの最終濃度のｓｉＲＮＡ分子を１００％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ社 Ｃａｔ＃Ｈ４５２２）中、３７℃でインキュベートする。（ｓｉＲＮＡ保存液１００ｕＭをヒト血清で１：１４．２９に希釈したもの、または種々の組織型からのヒト組織抽出物）。５ｕｌを１５ｕｌの１．５ｘＴＢＥローディングバッファーに種々の時点で添加する（例えば、０、３０ｍｉｎ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、８ｈ、１０ｈ、１６ｈおよび２４ｈ）。試料を液体窒素で直ちに凍結し、−２０°Ｃで保存する。
各試料を、当技術分野で既知の方法に従って調製された非変性２０％アクリルアミドゲルにロードする。。オリゴをＵＶ光下、臭化エチジウムで可視化する。
一般的に、インビトロ試験用に選択される特異的配列を有するｓｉＲＮＡは、ヒトおよび第２の種、例えば、ラットまたはウサギ遺伝子に対しても特異的である。
エキソヌクレアーゼに対する安定性
核酸分子上の３’非ヌクレオチド部分の安定化効果を調べるために、センス鎖、アンチセンス鎖およびアニールしたｓｉＲＮＡ二重鎖を異なる細胞型から調製したサイトゾル抽出物中でインキュベートする。ＨＣＴ１１６細胞中の安定性試験プロトコルを以下に示す。
抽出物：ＨＣＴ１１６サイトゾル抽出物（１２ｍｇ／ｍｌ）。
抽出緩衝液：２５ｍＭヘペス ｐＨ約７．３（３７℃）；８ｍＭ ＭｇＣｌ；１ｍＭ ＤＴＴ含有１５０ｍＭ ＮａＣｌを使用直前に新しく添加した。
方法：３．５ｍｌの試験ｓｉＲＮＡ（１００ｍＭ）を１２０ｍｇのＨＣＴ１１６サイトゾル抽出物含有の４６．５ｍｌ液と混合した。４６．５ｍｌは、１２ｍｌのＨＣＴ１１６抽出物、およびＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤混合物／１００（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ｓｅｔＩＩＩ−５３９１３４）を補充した３４．５ｍｌの抽出緩衝液からなる。インキュベーションチューブ中のｓｉＲＮＡ最終濃度は、７ｍＭである。この試料を３７℃でインキュベートし、指定時点で、５ｍｌを新しいチューブに取りだし、１５ｍｌの１ＸＴＢＥ−５０％グリセリンローディングバッファーと混合後、液体Ｎ２中で急速凍結した。ローディングバッファー中のｓｉＲＮＡの最終濃度は、１．７５ｍＭ（２１ｎｇ ｓｉＲＮＡ／ｍｌ）である。ネイティブＰＡＧＥおよびＥｔＢｒ染色による分析のために、レーン当たり５０ｎｇを加える。ノーザン分析用に、レーン当たり１ｎｇの試験ｓｉＲＮＡを加えた。他の細胞型には、ＨｅＬａおよび肝星細胞（ＨＳＣ）が含まれる。
出願人は、３’末端アルキル、またはアルキル誘導体オーバーハングを含む核酸分子は、平滑末端核酸分子および３’ヌクレオチドオーバーハングを含む核酸分子に比べて、強化された安定性を示すことを示した。
代表的化合物
３’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含むｓｉＲＮＡ化合物を合成し、上述のように試験した。図２は、本明細書で開示の配列および修飾を含む、ＲＮＡｉに有用な化合物の表である。修飾の凡例は次の通り：プリフィックス「ｚ」は、３’または５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分（ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド）を示す。例えば、ｚｄＴは、ｄＴオーバーハングを指す；ｚｄＴ；ｚｄＴは、ｄＴｄＴオーバーハングを指す。プリフィックス「ｙ」は、ヌクレオチド置換を示し、例えば、ｙＬｄＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖中のリボヌクレオチドのＬ−デオキシリボアデニン置換を指し、ｙｄＴは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチドのデオキシリボチミジン置換を指す。プリフィックス「ｍ」は、２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを指す。他の記号を下表Ｂに記載する。
次の表では、「センス５−>３アンチセンス５−>３」の名称の列で使われている記号は、表Ｂで示した記号である。「センス修飾」および「アンチセンス修飾」の名称の列は、センスおよびアンチセンス鎖のそれぞれで使われる位置上の修飾の簡単な説明を与え、例えば、２０−Ｃ３；Ｃ３は、３’Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ末端オーバーハングを指し、２０−ｄＴｄＴは、３’ｄＴｄＴ末端オーバーハングを指し（１９塩基長の位置２０から始まる）、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８−２’−ＯＭｅは、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８の位置の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを指す。
表１のデータは、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ ３’末端オーバーハング（２）が、平滑末端非修飾ｓｉＲＮＡ（１）に比べて、細胞抽出物中のｓｉＲＮＡヌクレアーゼ耐性を改善することを示す。Ｃ３−Ｃ３の安定化効果は、ｄＴｄＴ（３）および２’ＯＭｅＵ（４）３’末端オーバーハングと類似である。ＲＡＣ１＿２配列は、配列番号５と６に記載される。
表２のデータは、Ｃ３−Ｃ３ ３’末端オーバーハング（１）ならびに５’および３’逆位デオキシ脱塩基部分（２）を含む鎖は、非修飾鎖（３）に比べて、細胞抽出物中の鎖のヌクレアーゼ耐性を改善することを示す。ＣＡＳＰ２＿４配列は、配列番号１および２に記載される。
表３のデータは、１）Ｃ３−Ｃ３部分（３、４および７）、逆位デオキシ脱塩基（２）、Ｃ３−リボ脱塩基（８）の、アンチセンスまたはアンチセンスとセンス鎖の両方の３’末端への導入が、平滑末端化合物（１と５）に比べて、ｓｉＲＮＡ活性を改善し、３’ｄＴｄＴオーバーハングを有する同じ化合物（６）より活性が高く、２）両化合物（５と７）とも、極めて安定である（少なくとも３６ｈ）という理由から、３’末端Ｃ３−Ｃ３を含む化合物の活性の改善は、細胞抽出物中での増加した安定性に起因するものではないことを示す。
表４のデータは、Ｃ３Ｃ３が、アンチセンスおよびセンス両鎖の３’末端（２）に存在する場合に、平滑末端（１）および１つの鎖上のみのＣ３−Ｃ３（３または４）に比べて、最も際立った活性増加が得られることを示している。
表５のデータは、１）アンチセンス鎖上のＣ３ＯＨ（２）またはＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ（３）部分の存在は、平滑末端ｓｉＲＮＡ（５）に比べて、活性を改善せず、また、２）アンチセンス鎖上のＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ（１）およびＣ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ（４）部分の存在は、平滑末端化合物に比べて、活性を改善し、その効果は、Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉの場合に著しいことを示している。
表６のデータは、センスおよびアンチセンス両鎖上に逆位デオキシ脱塩基部分を有する化合物（１）は、平滑末端化合物（４）または１つの鎖上に逆位脱塩基を有する化合物（２または３）よりも、活性が高いことを示している。
表７のデータから、アンチセンス鎖の３’末端およびセンス鎖の３’末端の両方に末端キャップ（逆位デオキシ脱塩基部分）を有する二重鎖ＲＮＡ化合物は、アンチセンス鎖の３’末端に共有結合した３’末端キャップを有するｄｓＲＮＡ化合物に比べて、強化された活性を示すことがわかる（化合物２と３および化合物４と５を比較されたい）。
表８のデータから、アンチセンス鎖（ガイド鎖）の３’末端に共有結合した３’末端Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨオーバーハングを含む二重鎖ＲＮＡ化合物（Ｚ＝２つのＣ３部分）は、相補的なセンス鎖上の修飾に関係なく優れた活性（２０ｎＭで８０％より大きいノックダウン）を示すことがわかる（化合物１〜７参照）。
化合物１〜７は、配列番号３と４に記載された配列を利用し、３’末端ヌクレオチドに共有結合した２つの３’末端Ｃ３部分（Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ）を含む共通アンチセンス鎖（配列番号４）および本出願で開示の種々の修飾を含む異なるセンス鎖を含有する。化合物１のセンス鎖は、位置１〜１４および１９に非修飾リボヌクレオチドならびに位置１５〜１８に２’５’リボヌクレオチドを含む。化合物２のセンス鎖は、位置１〜１４に非修飾リボヌクレオチドおよび位置１５〜１９に２’５’リボヌクレオチドを含み、また、末端リン酸塩（Ｐ（Ｏ）３）を含む。化合物３のセンス鎖は、位置１〜１４に非修飾リボヌクレオチド、および位置１５〜１９に２’５’リボヌクレオチドを含み、また、３’末端Ｃ３Ｐｉを含む。化合物４のセンス鎖は、位置１〜１４に非修飾リボヌクレオチドおよび位置１５〜１９に２’５’リボヌクレオチドを含み、また、３’末端ヌクレオチドに共有結合した３’末端アミノＣ６部分を含む。化合物５のセンス鎖は、位置１〜１９に非修飾リボヌクレオチドを含む（各Ｎ’は非修飾）。化合物６のセンス鎖は、位置１〜１４および１９に非修飾リボヌクレオチドならびに位置１５〜１８に２’５’リボヌクレオチドを含み、また、３’末端ヌクレオチドに共有結合した３’末端逆位脱塩基部分を含む。化合物７のセンス鎖は、位置１〜３、５、７〜８、１４〜１６および１９に非修飾リボヌクレオチドならびに位置４、６、９、１０〜１３および１７〜１８にデオキシリボヌクレオチドを含み、また、３’末端ヌクレオチドに共有結合した逆位脱塩基部分の５’末端で共有結合した３’末端リン酸塩（Ｐｉ）およびＣ３ＯＨ部分を含む。
化合物９は、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端に共有結合した２つのＣ３部分を有し、アンチセンス鎖の３’末端に共有結合した２つのＣ３部分を有する類似の化合物（８）より活性が大きい。
実施例２：ＣＡＳＰ２を標的にする修飾核酸分子の網膜への送達
標的細胞へのｓｉＲＮＡ送達、標的細胞遺伝子ノックダウン活性および標的遺伝子ｍＲＮＡ開裂の特異性の評価
標的遺伝子のノックダウンを標的組織中で、例えば、ラット網膜への硝子体内注射後、測定する。
背景：ＣＡＳＰ２遺伝子を標的にするｓｉＲＮＡに対し、異なる構造修飾を行い、エキソヌクレアーゼ耐性試験を行う。この試験の目的は、以下に記載されるような、これらの修飾を含むオリゴヌクレオチドの分布と活性を、インビボで調べることである。
試験材（Ｓ１００３）の説明：以下の構造を有するＲＮＡ二重鎖：センス鎖：５’と３’−キャップとして逆位脱塩基を有する非修飾１９塩基長鎖。アンチセンス鎖：位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’Ｏ−Ｍｅおよび３’−キャップとして逆位脱塩基を有する１９塩基長鎖。アニール材料。供給量：３３６μｇ、保存状態：−８０℃。
試験材（Ｓ８００）の説明：以下の構造を有するＲＮＡ二重鎖：センス鎖：位置１８にＬ−ＤＮＡを有する１９塩基長鎖。アンチセンス鎖：位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７&１９に２’ＯＭｅ、および３’末端に２つの（ＣＨ２）３プロパンジオール（Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ）を有する１９塩基長鎖。供給量：８４０μｇ。保存状態：−８０℃。
ＣＮＬ：Ｓ８００と同じ修飾を有するが、３’末端に結合したＣ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ部分のないＲＮＡ二重鎖。
動物：年齢：６〜８週齢の雄ラット。１８０〜２２０ｇｒ
群サイズ：ｎ＝４／１０；動物全体数：１１２匹
動物の管理：食事：動物に、自由に市販げっ歯類用食事（げっ歯類用Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ｄｉｅｔ）を与え、飲料水も自由に摂取させた。
環境：（ｉ）少なくとも５日間の順化。
（ｉｉ）試験期間全体を通して、全ての動物を環境的に管理された居住条件下のアクセスの制約された施設中に収容し、ＨＢＩ承認標準業務手順書（ＳＯＰ）に従って維持した。自動制御環境条件を、維持温度：２０〜２４℃、相対湿度（ＲＨ）：３０〜７０％、１２時間明期１２時間暗期サイクルおよび１５〜３０回の試験室中空気交換／時間に設定。温度、ＲＨおよび光サイクルを制御コンピュータによりモニターした。
実験計画を表２−１に示す。
試験計画：実験群Ｉ〜ＸＩＩ由来の全動物に、１０μｌ ＰＢＳビークル中の２０μｇの用量の試験品もしくは対照（ＣＮＬ）または１０μｌビークルのみの、片眼（左目（ＬＥ））の硝子体内（ＩＶＴ）への注射を行った。実験群ＸＩＩＩは、インタクト対照として使用する。終了ステップを試験計画に従って実行する（ＩＶＴ治療後、１日目、３日目および７日目）。
麻酔：動物を、イソフルラン特殊循環システム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社、米国）を使って麻酔した。瞳孔は、Ｍｙｄｒａｍｉｄ（０．５％トロピカミド）点眼薬で拡張される。追加の局所麻酔として、Ｌｏｃａｌｉｎ（オキシブプロカイン塩酸塩０．４％）を使用する。Ｌａｃｒｏｍｙｃｉｎ（ゲンタマイシン硫酸塩（０．３％ゲンタマイシン塩基に相当））点眼液で手術後炎症過程を防ぐ／減らす。
解剖顕微鏡下、硝子体内注射を行った。３０／３３ゲージ注射針を使って、耳側輪部１ｍｍ後方にパンチ切開を行い、拡張瞳孔を通して観察しながら、注射針（３０／３３ゲージインスリン注射筒０．３ｍｌ、ＰＩＣ ０．８ｍｍ、Ｉｔａｌｙ）を切開部から１．５ｍｍの深さに挿入した。
計画安楽死：全動物に深く麻酔をかけ（エキテシン ４ｍｌ／ｋｇＩ．Ｐ）、試験計画（表、終結）に従って安楽死させた（断頭した）。
組織採取：全動物から両眼を摘出し、氷上で保存した。眼を顕微鏡下で解剖し、全体病状を検体評価尺度に基づいて分類する（「眼病理学スコア」に関する付録５参照）。角膜を、２７／３０Ｇ針を使って穿刺し、前眼房から眼房水を取り出す。顕微手術用ブレードを使って、角膜縁に沿って切開し、角膜と水晶体を取り出す。残りの眼杯を強膜を通って矢状切断することにより開く。網膜を眼杯から摘出し、ＰＢＳですすぎ、分離する。先の細い鉗子を使って、網膜を適切な試験チューブに採取し、液体窒素中で凍結し、全ＲＮＡの抽出のため、分子生物学部署に移送する。
評価
ラット網膜中のＣＡＳＰ２を標的とするｓｉＲＮＡのノックダウン活性をｑＰＣＲ法を使ってＣＡＳＰ２ ｍＲＮＡ発現レベル定量化により測定した。標的遺伝子上のＣＡＳＰ２＿４ｓｉＲＮＡ開裂部位は、ＲＡＣＥによって検証予定である。また、網膜中のｓｉＲＮＡの定量化をＳ&Ｌ ｑＰＣＲ（ステムループｑＰＣＲ）により行った。
試料ＲＮＡの単離：ＲＮＡを、ＥＺＲＮＡを使った二重抽出による全ＲＮＡの単離のための標準的方法に従って、網膜試料から処理を行った。ｑＰＣＲによるＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡ定量化：ＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡの網膜中への送達をｑＰＣＲ ｓｉＲＮＡ定量化により測定した。ｑＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７３００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使って、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法により行った。ラット網膜中のＣＡＳＰ２ ｍＲＮＡのＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡ指向性開裂を、それぞれの実験群でＲＡＣＥ（相補ＤＮＡ末端の急速増幅）方法を使った開裂生成物の検出により測定した。予測開裂生成物の証拠が認められる場合は、標的遺伝子上のｓｉＲＮＡ開裂部位は、配列解析により検証されることになる。また、任意選択として、開裂生成物がｑＰＣＲを使って定量化される。ｑＰＣＲによるＣＡＳＰ２ ｍＲＮＡの定量化：相補ＤＮＡが調製された後、ｑＰＣＲによるＣＡＳＰ２ ｍＲＮＡ定量化により、ＣＡＳＰ２ノックダウンが検証される。ｑＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７３００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ上でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を使い、標準的方法に従って行われる。
予備的結果
予備的結果は、Ｓ８００は、Ｓ１００３より効率的に網膜細胞中に取り込まれることを示している。結果を下表２−２に示す。
実施例３：ＭＹＤ８８を標的とする修飾核酸分子の網膜への送達
標的細胞へのｓｉＲＮＡ送達の評価：この調査の目的は、
１．１ 片眼硝子体内（ＩＶＴ）注射後の４時間目、１日目および３日目に、構造および修飾が異なるＭＹＤ８８＿１１ ｓｉＲＮＡのラット網膜への送達を測定すること、
１．２ ＭＹＤ８８を標的とする、構造が異なるＭＹＤ８８＿１１ ｓｉＲＮＡのノックダウン活性を、ラット眼中へのＩＶＴ注射後のＭＹＤ８８ ｍＲＮＡのｑＰＣＲにより、ＩＶＴ注射後の４時間目、１日目および３日目に測定すること、
である。
背景：異なる構造的修飾をＣＡＳＰ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ中に作成した。これを使って、エキソヌクレアーゼ耐性試験を行う。この調査の目的は、本明細書で開示の、下記に具体的に記載の修飾を有する二重鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドのインビボ分布を調べることである。
試験材Ｓ５０５の説明：下記の構造を有するＲＮＡ二重鎖：センス鎖：位置１８に１つのＬ−ＤＮＡ部分（小文字の太字）を有する非修飾１９塩基長鎖。アンチセンス鎖：位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９に２’Ｏ−Ｍｅを有する１９塩基長鎖。アニール材料。保存状態：−８０℃。
試験材Ｓ１１５９の説明：下記の構造を有するＲＮＡ二重鎖：センス鎖：５’キャップとして逆位脱塩基、および位置１５〜１８に２’−５’架橋ＲＮＡを有する１９塩基長鎖。アンチセンス鎖：位置１、４〜６、９、１２〜１３、１５、１７〜１９に２’Ｏ−Ｍｅ、およびリン酸ジエステル結合による１、３−プロパンジオール結合の３’末端の２つの構成的ユニットを有する１９塩基長鎖。アニール材料。保存状態：−８０℃。
試験材Ｓ１２７０の説明：下記の構造を有するＲＮＡ二重鎖：センス鎖：位置１５〜１９に２’５’ヌクレオチド、および末端リン酸塩（Ｐｉ）を有する１９塩基長鎖。アンチセンス鎖：位置１、４、５、６、９、１２、１３、１５、１７〜１９に２’ＯＭｅ、および３’末端に２つの（ＣＨ２）３プロパンジオール（Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ）を有する１９塩基長鎖。アニール材料。保存状態：−８０℃。
動物：年齢：８〜１０週齢雄ラット。１８０〜２２０ｇｒ。
群のサイズ：ｎ＝４／８；動物の全体数：１０４匹。
動物の管理：食事：動物に、自由に市販げっ歯類用食事（げっ歯類用Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ｄｉｅｔ）を与え、飲料水も自由に摂取させた。
環境：（ｉ）少なくとも５日間の順化。
（ｉｉ）試験期間全体を通して、全ての動物を環境的に管理された居住条件下のアクセスの制約された施設中に収容し、ＨＢＩ承認標準業務手順書（ＳＯＰ）に従って維持した。自動制御環境条件を、維持温度：２０〜２４℃、相対湿度（ＲＨ）：３０〜７０％、１２時間明期１２時間暗期サイクルおよび１５〜３０回の試験室中空気交換／時間に設定。温度、ＲＨおよび光サイクルを制御コンピュータによりモニターした。
試験計画：実験群１〜１２の全動物の左目（ＬＥ）に、２０μｇの用量の試験材または１０μｌのＰＢＳビークルのみを片眼ＩＶＴ注射した。実験群１３は、インタクト対照として使用した。終了ステップを試験計画に従って実行した（ＩＶＴ処理後、４時間目、１日目、７日目）。
実験計画を表３−１に示す。
試験計画：実験群１〜１２の全動物の左目（ＬＥ）に２０μｇの用量の試験品または１０μｌのＰＢＳビークルのみを片眼ＩＶＴ注射を行った。実験群１３は、インタクト対照として使用した。終了ステップを試験計画に従って実行した（ＩＶＴ処理後、４時間目、１日目、７日目、）。
麻酔：動物を、イソフルラン特殊循環システム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社、米国）（設定：６００〜８００ｍｌ／ｍｉｎのＯ２流量、Ｏ２中３〜４．５％イソフルラン）を使って麻酔した。瞳孔は、Ｍｙｄｒａｍｉｄ（０．５％トロピカミド）点眼薬で拡張した。追加の局所麻酔として、Ｌｏｃａｌｉｎ（オキシブプロカイン塩酸塩０．４％）を使用する。Ｌａｃｒｏｍｙｃｉｎ（ゲンタマイシン硫酸塩（０．３％ゲンタマイシン塩基に相当））点眼液で手術後炎症過程を防ぐ／減らす。
解剖顕微鏡下、硝子体内注射を行った。３０／３３ゲージ注射針を使って、耳側輪部１ｍｍ後方にパンチ切開を行い、拡張瞳孔を通して観察しながら、注射針（３０／３３ゲージインスリン注射筒０．３ｍｌ、ＰＩＣ ０．８ｍｍ、Ｉｔａｌｙ）を切開部から１．５ｍｍの深さに挿入した。
計画安楽死：全動物に深く麻酔をかけ（エキテシン４ｍｌ／ｋｇＩ．Ｐ）、試験計画（表、終結）に従って安楽死させた（断頭した）。
組織採取：全動物から両眼を摘出し、氷上で保存した。眼を顕微鏡下で解剖し、全体病状を検体評価尺度に基づいて分類する（「眼病理学スコア」に関する付録５参照）。角膜を、２７／３０Ｇ針を使って穿刺し、前眼房から眼房水を取り出す。顕微手術用ブレードを使って、角膜縁に沿って切開し、角膜と水晶体を取り出す。残りの眼杯を強膜を通って矢状切断することにより開く。網膜を眼杯から摘出し、ＰＢＳですすぎ、分離する。先の細い鉗子を使って、網膜を適切な試験チューブに採取し、液体窒素中で凍結し、全ＲＮＡを抽出した。
評価
網膜中のｓｉＲＮＡの定量化をステムループｑＰＣＲにより行い、ラット網膜中のＭＹＤ８８を標的とするｓｉＲＮＡのノックダウン活性をｑＰＣＲ法を使ってＭＹＤ８８ ｍＲＮＡ発現レベル定量化により測定する。
試料ＲＮＡの単離：ＲＮＡを、ＥＺ ＲＮＡキットを使った標準的方法に従って、網膜試料から処理を行った。
ｑＰＣＲによるＭＹＤＤ８８ ｓｉＲＮＡ定量化：網膜中のＭＹＤＤ８８ ｓｉＲＮＡの送達をｑＰＣＲ ｓｉＲＮＡ定量化（Ｓ&Ｌ）により測定した。ｑＰＣＲを標準的方法に従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７３００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使って、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法により行った。
ｑＰＣＲによるＭＹＤＤ８８ ｍＲＮＡ定量化：相補ＤＮＡを標準的方法により調製し、ＭＹＤＤ８８ノックダウンをｑＰＣＲによるＭＹＤ８８ ｍＲＮＡ定量化により検証する。ｑＰＣＲをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７３００ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使って、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法により行う。
予備的結果を下表３−２に示す。
Ｃ３Ｃ３修飾化合物（Ｓ１１５９およびＳ１２７０）の網膜神経節細胞への送達は、平滑末端（Ｓ５０５）を有する化合物の送達よりも有意に高かった（「中央値」カラムのデータを参照。値はフェムトモル単位）。
実施例４：急性腎不全（ＡＲＦ）モデル系
ＡＲＦは、数日以内に発生する腎機能の急速劣化を特徴とする臨床的症候群である。理論に束縛されるものではないが、急性の腎臓傷害は、腎臓虚血再灌流障害、例えば、大心臓手術等の大手術を受けている患者の腎臓虚血再灌流障害の結果である可能性がある。ＡＲＦの主要な特徴は、糸球体濾過率（ＧＦＲ）の急激減少で、窒素性廃棄物（尿素、クレアチニン）の貯溜が生ずる。最近の研究は、腎臓組織のアポトーシスが大抵のヒトのＡＲＦ症例で顕著であることを裏付けている。アポトーシス細胞死の主要部位は、遠位のネフロンである。虚血傷害の初期相の間に、アクチン細胞骨格の完全性の欠如により、刷毛縁の損失を伴う上皮の平坦化が起こり、局所的細胞接触が失われ、その結果、下部の基層から細胞が離脱する。
活性ｓｉＲＮＡ化合物の試験を、国際公開第２００９／０４４３９２号に示されるように、虚血再灌流誘導ＡＲＦ動物モデルを使って行った。
既存ｓｉＲＮＡを都合よく修飾可能であり、また、さらにｓｉＲＮＡを設計・製作して活性な核酸分子を得ることもできる。非制限的例では、国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のオリゴヌクレオチド対を利用するｓｉＲＮＡ化合物、特に、特異的アポトーシス促進性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ、特に、遺伝子ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、およびＳＰＰ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに、少なくとも１つの本発明の３’オーバーハングを含むさらなるｓｉＲＮＡが上記モデル系で試験され、虚血再灌流に対する防御薬であることが明らかにされる。
実施例５：褥瘡または圧迫性壊死モデル系
糖尿病性潰瘍を含む褥瘡または圧迫性壊死は、持続的圧迫（通常は、ベッドまたは車椅子からの）が、身体の脆弱な部分、特に、臀部、尻および踵の皮膚への循環を遮断する場合に発生する、損傷を受けた皮膚および組織の部位のことである。適切な血液流の不足は、患部組織の虚血性壊死および潰瘍につながる。褥瘡は、感覚の減弱した、もしくは欠如した患者、または衰弱した、痩せ衰えた、麻痺した、または長く寝たきりの患者で発生することが多い。仙骨、坐骨、大転子、外くるぶし、および踵の組織が、特に、罹りやすい。患者の状況によっては、他の部位も関係する可能性がある。
圧迫性壊死、潰瘍および類似の創傷の治療を目的とした本発明の活性阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ化合物）の試験を、Ｒｅｉｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．１１６：１７２−１８０、２００４、に記載のようにマウスモデルを使って行う。
追加のウサギモデルは、Ｍｕｓｔｏｅ ｅｔ ａｌ、ＪＣＩ、１９９１．８７（２）：６９４−７０３；Ａｈｎ ａｎｄ Ｍｕｓｔｏｅ、Ａｎｎ Ｐｌ Ｓｕｒｇ、１９９１．２４（１）：１７−２３、により記載されており、本明細書で開示のように設計・合成したｓｉＲＮＡ化合物の試験用として使用する。既存ｓｉＲＮＡを都合よく修飾可能であり、また、さらにｓｉＲＮＡを設計・製作して活性な核酸分子を得ることもできる。一部の実施形態では、国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のオリゴヌクレオチド対を利用するｓｉＲＮＡ化合物、および遺伝子ＣＩＱＢＰ、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、またはＴＹＲＯＢＰを特異的に標的とするｓｉＲＮＡならびに、少なくとも１つの本発明の３’非ヌクレオチドオーバーハングを含むｓｉＲＮＡが動物モデルでさらに試験され、それにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が褥瘡および潰瘍を治療および予防することが明らかにされる。
実施例６：慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）モデル系
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、主に、肺気腫を特徴とし、これは、遠位の末端細気管支である末梢気腔の永久破壊である。肺気腫は、また、細気管支および肺胞構造中の炎症性の細胞、例えば、マクロファージおよび好中球の蓄積を特徴とする。肺気腫および慢性気管支炎は、ＣＯＰＤの一部としても、または独立にも発生する可能性がある。
ＣＯＰＤ／肺気腫／慢性気管支炎の治療を目的として、本発明の活性阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の試験を、下記の開示等の動物モデルを使って行った。
Ｓｔａｒｃｈｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、１９８９．Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌｓ、２３：２３４−２４０；Ｐｅｎｇ、ｅｔ ａｌ．、２００４．；Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６９：１２４５-１２５１；Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．、２００４．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、７２：７２４７−５６。さらなるモデルは、本出願の譲受人に譲渡された国際公開第２００６／０２３５４４号に記載されている。該出願は、ここでの参照によって本出願に組み込まれる。
既存ｓｉＲＮＡを都合よく修飾可能であり、また、さらにｓｉＲＮＡを設計・製作して活性な核酸分子を得ることもできる。一部の実施形態では、国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のオリゴヌクレオチド対を利用するｓｉＲＮＡ化合物、特に、遺伝子ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、およびＤＵＯＸ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに少なくとも１つの本発明で開示の３’オーバーハングを含むさらなるｓｉＲＮＡがこれらのモデル系で試験され、これにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が、肺気腫、慢性気管支炎およびＣＯＰＤを治療および／または予防することができることが明らかにされる。
実施例７：脊髄損傷モデル系
脊髄損傷、またはミエロパシーは、感覚および／または可動性の消失を生ずる脊髄の障害である。脊髄損傷の２つの共通の型は、外傷および疾患に起因する。外傷は、特に、自動車事故、転落、銃撃、ダイビング中の事故に起因する可能性があり、脊髄に悪影響を与える可能性がある疾患には、ポリオ、脊椎披裂、腫瘍およびフリードライヒ運動失調症がある。
既存ｓｉＲＮＡを都合よく修飾可能であり、また、さらにｓｉＲＮＡを設計・製作して活性な核酸分子を得ることもできる。一部の実施形態では、国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のオリゴヌクレオチド対を利用するｓｉＲＮＡ化合物、特に、遺伝子ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＨＲＫ、ＣＩＱＢＰ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＣＤ３８、ＳＴＥＡＰ４、ＢＭＰ２、ＣＸ４３、ＴＹＲＯＢＰ、ＣＴＧＦ、およびＲＨＯＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに少なくとも１つの本発明で開示の３’オーバーハングを含むさらなるｓｉＲＮＡがこれらのモデル系で試験され、これにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が、脊髄損傷後の機能回復を促進し、従って、脊髄損傷の治療に使用可能であることが明らかにされる。
実施例８：緑内障モデル系
緑内障の治療または予防を目的として、例えば、Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｇｌａｕｃｏｍａ、２００６、１５（６）：５１２−９（実験用緑内障のマウスおよび正常なマウスを使ったＴｏｎｏＬａｂとＴｏｎｏＰｅｎ眼圧計のマノメーター較正および比較（Ｍａｎｏｍｅｔｒｉｃ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＴｏｎｏＬａｂ ａｎｄ ＴｏｎｏＰｅｎ ｔｏｎｏｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌａｕｃｏｍａ ａｎｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ））に記載の動物モデルを使って、本発明の活性阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の試験を行う。
既存ｓｉＲＮＡを都合よく修飾可能であり、また、さらにｓｉＲＮＡを設計・製作して活性な核酸分子を得ることもできる。一部の実施形態では、国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のオリゴヌクレオチド対を利用するｓｉＲＮＡ化合物、特に、遺伝子ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＡＴＦ３、ＣＡＳＰ２、ＨＲＫ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、およびＲＨＯＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに少なくとも１つの本明細書で開示の３’非ヌクレオチドオーバーハングを含むさらなるｓｉＲＮＡがこのモデル系で試験され、これにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が緑内障を治療および／または予防することが明らかにされる。
実施例８Ａ：虚血性視神経症（ＩＯＮ）モデル系
視神経圧挫損傷プロトコルを使って虚血性視神経症用の動物モデルを成体ウィスターラットで樹立した。視神経圧挫の７日前に、逆行型トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ（２％、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ社）を上丘に適用することにより、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を選択的に標識する。トレーサーは、蛍光トレーサーの注射後１週間以内に全ＲＧＣの完全で特異的標識を生じているＲＧＣ軸索に沿って逆行型輸送により輸送される。動物は、逆行型トレース後７日目に視神経圧挫損傷を受ける。眼窩上からアプローチして眼窩視神経を露出し、視神経中の全軸索を鉗子で１０秒間圧挫して篩状板から２ｍｍ切断する。Ａ単回用量の５μｌのＰＢＳ中の２０μｇの本発明のｓｉＲＮＡ化合物を、視神経圧挫時にガラスマイクロピペットを使って神経頭の前方２ｍｍの硝子体中に微量注入する。視神経圧挫後７日目にフラットマウント網膜中のＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ標識ＲＧＣをカウントすることにより、ＲＧＣの生存を測定する。実験動物を、視神経圧挫の１週間後に、４％パラホルムアルデヒドで経心的に潅流する。両網膜を切りだし、さらに３０分間固定し、神経細胞層定量化のためにガラススライド上にフラットマウントする。各網膜の１６箇所の異なる領域で蛍光のＲＧＣの数をカウントし、ＲＧＣ生存パーセントを測定して、視神経圧挫損傷を全く受けていないラット由来の検体または視神経圧挫損傷を受けて、かつ、ＰＢＳ、対照ｓｉＲＮＡまたはＧＦＰ ｓｉＲＮＡを注射されているラット由来の検体と比較する。臨死ＲＧＣの食作用後にＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを組み込んだ可能性のあるミクログリア細胞をそれらの特徴的形態により区別し、定量分析から除外した。
目の近くの視神経の切断によりＲＧＣの全体集団が軸索切断される視神経軸索切断の別のモデルは、本発明の化合物および組成物の試験に有用である（ＣｈｅｎｇＬ、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍａｙ １５、２００２ ２００２；２２：３９７７−３９８６）。
実施例９：肺移植後虚血／再潅流傷害のラットモデル系
肺移植後の虚血／再潅流傷害または低酸素傷害を治療または予防することを目的とする本発明の活性阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の試験を１つまたは複数の実験動物モデル、例えば、Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．、２００４．Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２３：８８９−９３；Ｈｕａｎｇ、ｅｔ ａｌ．、１９９５．Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４：Ｓ４９；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、ｅｔ ａｌ．、１９９５．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９：１５０９−１５１７；Ｗｉｌｋｅｓ、ｅｔ ａｌ．、１９９９．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６７：８９０−８９６；Ｎａｋａ、ｅｔ ａｌ．、１９９６．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７９：７７３−７８３、に記載の動物モデルを使って行う。
既存ｓｉＲＮＡを都合よく修飾可能であり、また、さらにｓｉＲＮＡを設計・製作して活性な核酸分子を得ることもできる。一部の実施形態では、国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のオリゴヌクレオチド対を利用するｓｉＲＮＡ化合物、特に、ＴＰ５３ＢＰ２、ＬＲＤＤ、ＣＹＢＡ、ＣＡＳＰ２、ＢＮＩＰ３、ＲＡＣ１、およびＤＵＯＸ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに少なくとも１つの本明細書で開示の３’非−ヌクレオチドオーバーハングを含むさらなるｓｉＲＮＡがこれらの動物モデルで試験され、これにより、これらのｓｉＲＮＡ化合物が肺移植後の虚血再灌流障害を治療および／または予防し、従って、移植手術と合わせて使用可能であることが示される。
実施例１０：急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）モデル系
急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の治療を目的として、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．２００３；１０（６Ｐｔ１）：５８８−９２、に記載のように動物モデルを使って本発明の活性阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の試験を行う。国際公開第２００９／０４４３９２号の表Ｂ（Ｂ１〜Ｂ７４）、表Ｃ（Ｃ１〜Ｃ４）および表Ｄ（Ｄ１〜Ｄ３４）に記載のｓｉＲＮＡ化合物、特に、遺伝子ＣＹＢＡ、ＨＲＫ、ＢＮＩＰ３、ＭＡＰＫ８、ＭＡＰＫ１４、ＲＡＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、Ｐ２ＲＸ７、ＴＲＰＭ２、ＰＡＲＧ、ＳＰＰ１、およびＤＵＯＸ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ならびに少なくとも１つの本明細書で開示の３’オーバーハングを含むさらなるｓｉＲＮＡがこの動物モデルで試験され、これにより、これらのｓｉＲＮＡが急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を治療および／または予防し、従って、この状態の治療に使用可能であることが示される。
実施例１１．変形性関節症（ＯＡ）動物モデル
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）：マウスのＣＩＡは、Ｔｒｅｎｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４６：８５７−８６８）に記載がある。アジュバント誘導関節炎（ＡＡ）：ＡＡは、Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、（１９９９．Ｎａｔｕｒｅ、４０２：３０４−３０８）に記載されている。半月板切除術モデルは、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９９．Ｎａｇｏｙａ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ６２（３−４）：１１５−２６）に記載されている。
ＳＳＰ１に対するｓｉＲＮＡ、等の異なるｓｉＲＮＡ阻害剤の、ＯＡに関連するパラメータ、例えば、軟骨細胞増殖、末端分化および関節炎の発生に与える効果が、当技術分野で既知のインビトロモデルに加えて、１つまたは複数の上記モデルを使って評価される。特異的アポトーシス促進性遺伝子、特にＳＳＰ１、を標的とするｓｉＲＮＡ化合物、ならびに少なくとも１つの３’オーバーハングを含む本明細書で開示のさらなるｓｉＲＮＡ化合物がこれらの動物モデルを使って試験され、これにより、これらのｓｉＲＮＡがＯＡを治療しおよび／または予防し、従って、この状態の治療に使用可能でであることが示される。
実施例１２：移植関連急性腎傷害用ラットモデル系
温虚血-試験ラットで、左腎摘除術、続いて、自家移植を行い、これにより４５分の腎臓移植片常温（ｗａｒｍ）保存期間がもたらされる。腎臓移植片採取前（ドナー治療の模倣）（「ｐｒｅ」）、もしくは腎臓自家移植後（レシピエント治療の模倣）に、または採取前および移植後の両方（ドナーおよびレシピエント治療の組み合わせ）（「ｐｒｅ−ｐｏｓｔ」）に、自家移植後、右腎摘除術を同じ動物に行う。標的に対する化学修飾ｓｉＲＮＡを大腿静脈経由静脈内投与する。
冷虚血-左腎摘除術をドナー動物で行い、続いて、採取した腎臓の冷保存（氷上で）を５時間行う。この保存期間の最後に、レシピエントラットは、左右両側の腎摘除術を行い、続いて、冷温保存腎臓移植片の移植を行う。全体温虚血時間（外科手術を含む）は約３０分である。化学修飾ｓｉＲＮＡをドナー動物に腎臓採取前（「ｐｒｅ」）に、またはレシピエント動物に対し、移植１５分（「ｐｏｓｔ１５分」）後、もしくは４時間（ｐｏｓｔ４時間）後に、大腿静脈経由静脈内投与を行う。
レベルの改善に対するｓｉＲＮＡの有効性を評価するために、温および冷虚血モデルに対し、移植後腎機能、血清クレアチニンを移植後１、２、および７日目に測定する。

Claims (12)

  1. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸分子であって、少なくとも１つの鎖が、存在する鎖の３’末端ヌクレオチドの糖残基の３’または２’位置に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して共有結合した非ヌクレオチドオーバーハングを含み、前記非ヌクレオチドオーバーハングが、リン酸ジエステルもしくはホスホロチオエート結合により共有結合した２つまたは３つのＣ３アルキル部分を含み、前記非ヌクレオチドオーバーハングが、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉおよび−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ部分からなる群から選択されるか、もしくは、前記非ヌクレオチドオーバーハングが、デオキシリボ脱塩基部分（ｄＡｂ）またはリボ脱塩基部分（ｒＡｂ）から選択される脱塩基部分に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合によって共有結合した１つのＣ３アルキル部分を含み、前記非ヌクレオチドオーバーハングは、−Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ、−Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ、−Ｃ３Ｐｓ−ｒＡｂ、−Ｃ３Ｐｓ−ｄＡｂ、−ｒＡｂＰｉ−Ｃ３ＯＨ、−ｒＡｂＰｓ−Ｃ３ＯＨ、−ｒＡｂＰｉ−Ｃ３Ｐｉ、−ｒＡｂＰｓ−Ｃ３Ｐｉ、−ｄＡｂＰｉ−Ｃ３ＯＨ、−ｄＡｂＰｓ−Ｃ３ＯＨ、−ｄＡｂＰｉ−Ｃ３Ｐｉ、−ｄＡｂＰｉ−Ｃ３Ｐｓ、−ｄＡｂＰｓ−Ｃ３Ｐｉおよび−ｄＡｂＰｓ−Ｃ３Ｐｓからなる群から選択される、分子、または、そのような分子の、薬学的に許容可能な塩。
  2. 前記非ヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖残基の３’または２’位置に共有結合した請求項１に記載の分子。
  3. 次の構造（Ａ１）を有する請求項１に記載の二重鎖核酸分子：
    （Ａ１） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
    ３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
    （式中、各ＮおよびＮ’は、非修飾もしくは修飾されていてもよく、または非通常部分であるヌクレオチドであり；
    各（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、各連続したＮまたはＮ’が次のＮまたはＮ’に共有結合により結合しているオリゴヌクレオチドであり；
    Ｚが、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ、−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｓ−Ｃ３Ｐｉ、−Ｃ３Ｐｉ−ｒＡｂ、−Ｃ３Ｐｉ−ｄＡｂ、−Ｃ３Ｐｓ−ｒＡｂ、−Ｃ３Ｐｓ−ｄＡｂ、−ｒＡｂＰｉ−Ｃ３ＯＨ、−ｒＡｂＰｓ−Ｃ３ＯＨ、−ｒＡｂＰｉ−Ｃ３Ｐｉ、−ｒＡｂＰｓ−Ｃ３Ｐｉ、−ｄＡｂＰｉ−Ｃ３ＯＨ、−ｄＡｂＰｓ−Ｃ３ＯＨ、−ｄＡｂＰｉ−Ｃ３Ｐｉ、−ｄＡｂＰｉ−Ｃ３Ｐｓ、−ｄＡｂＰｓ−Ｃ３Ｐｉおよび−ｄＡｂＰｓ−Ｃ３Ｐｓからなる群から選択される非ヌクレオチドオーバーハングを含み、；
    Ｚ’は存在するか、または存在せず；
    ｚ"は、存在しても、または存在しなくてもよいが、存在する場合は、（Ｎ’）ｙの５’末端に共有結合したキャッピング部分であり；
    各ｘおよびｙは、独立に、１８と４０の間の整数であり；
    （Ｎ’）ｙの配列は、（Ｎ）ｘの配列に対し相補性を有し；さらに、（Ｎ）ｘの配列は、標的ＲＮＡ中の連続した配列に対し相補性を有する。）；または、そのような分子の、薬学的に許容可能な塩。
  4. Ｚ’が存在する請求項３に記載の分子。
  5. Ｚ’が無機リン酸塩であるか、または、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分もしくはその誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択される非ヌクレオチドオーバーハングである、請求項４に記載の分子。
  6. Ｚが、−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３Ｐｉまたは−Ｃ３Ｐｉ−Ｃ３ＯＨからなる請求項３に記載の分子。
  7. Ｚ’が無機リン酸塩である、請求項５または６に記載の分子。
  8. Ｚ’が−Ｃ３ＯＨ、−Ｃ３Ｐｉおよび−Ｃ３Ｐｓからなる群より選択される、請求項５または６に記載の分子。
  9. Ｚ’がリン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合で相互に共有結合した少なくとも２つのＣ３アルキル部分を含む、請求項５または６に記載の分子。
  10. 下記の構造（Ａ２）を有する請求項１または２に記載の分子：
    （Ａ２） ５’ Ｎ１−（Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
    ３’ Ｚ’−Ｎ２−（Ｎ’）ｙ−ｚ" ５’ （センス鎖）
    （式中、Ｎ、Ｎ’、Ｚ、Ｚ’およびｚ"は請求項３で上記のとおりに定義したものであり；
    Ｎ２は、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非通常部分であり；
    各ｘおよびｙが、独立に、１７および３９の間の整数であり；
    Ｎ１は（Ｎ）ｘに共有結合し、かつ、Ｎ２とワトソン・クリック塩基対を形成し；
    Ｎ１は標的ＲＮＡにミスマッチであるか、または標的ＲＮＡに対し相補的なＤＮＡ部分であり；
    Ｎ１は、天然または修飾された、ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシンからなる群より選択される部分である。）；または、そのような分子の、薬学的に許容可能な塩。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分子、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
  12. 標的遺伝子の発現に関連する疾患または障害に罹患している対象の治療用医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分子または請求項１１に記載の医薬組成物の使用。
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