JP2013516190A - 非ヌクレオチドオーバーハングを含むオリゴヌクレオチド化合物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし。
Description
本出願は、2010年1月7日出願の米国特許仮出願第61/292878号、2010年9月16日出願の国際出願PCT/US2010/049047号および2010年12月8日出願の国際出願PCT/US2010/059578号の優先権を主張する。これらは、本明細書における参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書では、哺乳動物および非哺乳動物標的遺伝子の阻害のための修飾二重鎖核酸分子、この分子を含む医薬組成物およびその使用方法が開示される。従って、この化合物および組成物は、遺伝子発現が有害な結果をもたらす疾患もしくは状態および/またはこのような疾患もしくは状態に関連する症状に罹患している患者の治療に有用である。特定の実施形態では、本発明は、前記化合物を含む組成物およびその使用方法を提供する。
哺乳動物では、RNA干渉(RNAi)は、低分子干渉RNA(siRNA)(Fire et al、Nature 1998、391:806)またはマイクロRNA(miRNA)(Ambros、Nature 2004、431(7006):350−355;Bartel、Cell 2004、116(2):281−97)により媒介される。植物の対応するプロセスは、通常、特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)またはRNAサイレンシングと呼ばれ、また、真菌では、クエリング(quelling)とも呼ばれる。
(A1) 5’ (N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
を有する二重鎖核酸分子が提供される。式中、各NおよびN’は、ヌクレオチドであり、非修飾もしくは修飾、または非通常(unconventional)部分であってもよく;
各(N)xおよび(N’)yは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれ連続したNまたはN’は、次のNまたはN’に共有結合により結合され;
少なくとも1つのZまたはZ’が存在し、ZまたはZ’が存在する鎖の3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み;
z"は存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、共有結合で(N’)yの5’末端に共有結合したキャッピング部分であり;
各xおよびyは、独立に、18〜40の整数であり;
(N’)yの配列は、(N)xの配列に対し相補的であり;さらに(N)xの配列は、標的RNAの連続した配列に対し相補的である。
(A2) 5’ N1−(N)x−Z 3’(アンチセンス鎖)
3’ Z’−N2−(N’)y−z" 5’(センス鎖)
それぞれ、N2、NおよびN’は、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非通常部分であり;
それぞれ(N)xおよび(N’)yは、オリゴヌクレオチドであり、各連続したNまたはN’は隣接するNまたはN’に共有結合により結合し;
それぞれ、xおよびyは、独立に、17〜39の整数であり;
(N’)yの配列は、(N)xに相補的であり、また、(N)xは、標的RNAの連続した配列に相補的であり;
N1は、共有結合で(N)xに結合し、標的RNAにミスマッチであるか、または標的RNAに対し相補的なDNA部分であり;
N1は、天然もしくは修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシン、からなる群より選択される部分であり;
z"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、N2−(N’)yの5’末端に共有結合したキャッピング部分であり;さらに
少なくとも1つのZまたはZ’が存在し、ZまたはZ’が存在する鎖の3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含む。
a)アンチセンス鎖の5’末端から5、6、7、8、または9の位置の内の少なくとも1つのNが、2’5’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドから選択され;
b)センス鎖の5’末端から9または10の位置の内の少なくとも1つのN’が、2’5’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンから選択され;さらに
c)(N’)yの3’末端位置の4、5、または6つの連続した位置中のN’が、2’5’ヌクレオチドを含む。
a)アンチセンス鎖が、5’末端から5、6、7、8、または9の位置の少なくとも1つに2’5’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み;さらに
b)センス鎖が、5’末端から9または10の位置に少なくとも1つの2’5’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンを含む。
a)アンチセンス鎖が、5’末端から5、6、7、8、または9の位置の少なくとも1つに2’5’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み;さらに
c)センス鎖が、3’の末端から2番目または3’末端位置に4、5、または6つの連続した2’5’ヌクレオチドを含む。
本出願は、センスおよびアンチセンス鎖の片方または両方の3’末端に共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチド部分を含む二重鎖siRNA化合物に関する。非ヌクレオチド部分は、脱塩基部分、逆位脱塩基部分、アルキル部分またはその誘導体、および無機リン酸塩から選択される。
一態様では、本明細書では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸分子が提供され、少なくとも1つの鎖が3’末端末端に共有結合した1、2、3、4、または5つの非ヌクレオチド部分を含み;非ヌクレオチド部分が、アルキル(炭化水素)部分またはその誘導体およびリン酸塩ベース部分から選択される。特定の好ましい実施形態では、非ヌクレオチド部分は、アルキル部分またはアルキル誘導体部分を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの鎖は、アンチセンス鎖である。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖は、3’末端末端に共有結合した、C3−C3、C3−C3−Pi、C3−C3−Ps、idAb−idAbを含む、2つの非ヌクレオチド部分を含む。
(A1) 5’ (N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、それぞれ、NおよびN’は、ヌクレオチドであり、非修飾または修飾、または非通常部分であってもよく;
それぞれ、(N)xおよび(N’)yは、オリゴヌクレオチドであり、それぞれ、連続したNまたはN’が次のNまたはN’に共有結合で結合し;
少なくとも1つのZまたはZ’が存在し、ZまたはZ’が存在する鎖の3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み;
z"は存在しても、存在しなくてもよいが、存在する場合は、(N’)yの5’末端に共有結合したキャッピング部分であり;
それぞれ、xおよびyは、独立に、18〜40の間の整数であり;
(N’)yの配列は、(N)xの配列に相補性を有し;さらに(N)xの配列は、標的RNA中の連続した配列に相補性を有する。
(A2) 5’ N1−(N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−N2−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、それぞれ、N2、NおよびN’は、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非通常部分であり;
それぞれ、(N)xおよび(N’)yは、それぞれ、連続したNまたはN’が隣接NまたはN’に共有結合で結合しているオリゴヌクレオチドであり;
それぞれ、xおよびyは、独立に、17〜39の間の整数であり;
(N’)yの配列が、(N)xの配列に対し相補性を有し、(N)xが、標的RNA中の連続した配列に対し相補性を有し;
N1が、(N)xに共有結合し、標的RNAに対しミスマッチであるか、または標的RNAに対し相補的なDNA部分であり;
N1は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシン、からなる群より選択される部分であり;
z"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、N2−(N’)yの5’末端に共有結合したキャッピング部分であり;さらに
少なくとも1つのZまたはZ’が存在し、ZまたはZ’が存在する鎖の3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含む。
a)アンチセンス鎖の5’末端から5、6、7、8、または9の位置の少なくとも1つのNが、2’5’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドから選択され;
b)センス鎖の5’末端から9または10の位置の少なくとも1つのN’は、2’5’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンから選択され;および
c)(N’)yの3’末端位置の4、5、または6連続した位置のN’は、2’5’ヌクレオチドを含む。
a)アンチセンス鎖は、5’末端から5、6、7、8、または9の少なくとも1つの位置の2’5’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み;および
b)センス鎖は、5’末端から9または10の位置に少なくとも1つの2’5’ヌクレオチドおよびプソイドウリジンを含む。
a)アンチセンス鎖は、5’末端から5、6、7、8、または9の少なくとも1つの位置に2’5’ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドを含み;および
c)センス鎖は、3’末端から2番目または3’末端位置に4、5、または6連続した2’5’ヌクレオチドを含む。
各Nは、隣接のNに共有結合で結合しており;
各N’は、隣接のN’に共有結合で結合しており;さらに
z"は、センス鎖の5’末端に共有結合したキャッピング部分である。用語の「aB」は、リボ脱塩基部分もしくはデオキシリボ脱塩基部分、または逆位リボ脱塩基部分もしくは逆位デオキシリボ脱塩基部分であってもよい脱塩基部分を指す。
(X1) 5’ (N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、各NおよびN’は、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり;
各(N)xおよび(N’)yは、オリゴヌクレオチドであり、ここで、各連続したNまたはN’は、共有結合により次のNまたはN’に結合しており;
Zは、2つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせからなり;
Z’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は1つの非ヌクレオチド部分を含み;
z"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、(N’)yの5’末端で共有結合したキャッピング部分であり;
各xおよびyは、独立に、18〜27の整数であり;
(N’)yは、3’末端、または3’末端から2番目の位置に少なくとも1つのミラーヌクレオチドを含み;さらに
(N)xの配列は、哺乳動物遺伝子に対するアンチセンス配列を含む。
(X2) 5’(N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、各NおよびN’は、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり;
各(N)xおよび(N’)yは、オリゴヌクレオチドであり、ここで、各連続したNまたはN’は、共有結合により次のNまたはN’に結合しており;
Zは、2つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせからなり;
Z’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は1つの非ヌクレオチド部分を含み;
z"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、(N’)yの5’末端で共有結合したキャッピング部分であり;
各xおよびyは、独立に、18〜27の整数であり;
(N’)yは、少なくとも1つまたは複数の2’OMe修飾ピリミジンを含み;さらに
(N)xの配列は、哺乳動物遺伝子に対するアンチセンス配列を含む。
(X3) 5’ (N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3 Z’−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、各NおよびN’は、非修飾であっても修飾されてもよいリボヌクレオチド、または非通常部分であり;
各(N)xおよび(N’)yは、オリゴヌクレオチドであり、ここで、各連続したNまたはN’は、共有結合により次のNまたはN’に結合しており;
Zは、2つの非ヌクレオチド部分、または非ヌクレオチド部分およびヌクレオチドの組み合わせからなり;
Z’は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は1つの非ヌクレオチド部分を含み;
z"は、存在しても存在しなくてもよいが、存在する場合は、(N’)yの5’末端で共有結合したキャッピング部分であり;
各xおよびyは、独立に、18〜27の整数であり;
(N’)yは、2’−5’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合した少なくとも1つのヌクレオチドを含み;さらに
(N)xの配列は、哺乳動物遺伝子に対するアンチセンス配列を含む。
各Nは、隣接Nと共有結合で結合しており;
各N’は、隣接N’と共有結合で結合しており;
1〜10のNは、2’−OMe糖修飾リボヌクレオチドであり;
位置5、6、7、8または9(5’>3’)のNは、2’5ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドであり;
位置15〜19(5’>3’)のN’は、2’5’リボヌクレオチドであり;
z"は、センス鎖の5’末端に共有結合したキャッピング部分である。
各Nは、隣接Nと共有結合で結合しており;
各N’は、隣接N’と共有結合で結合しており;
1〜10のNは、2’−OMe糖修飾リボヌクレオチドであり;
位置5、6、7、8または9(5’>3’)のNは、2’5ヌクレオチドまたはミラーヌクレオチドであり;
N’は、1つまたは複数の2’−OMe糖修飾ピリミジンリボヌクレオチドを含み;
位置9または10(5’>3’)のNは、2’5ヌクレオチドであり;さらに
z"は、センス鎖の5’末端に共有結合したキャッピング部分である。
便宜上、本明細書、実施例および請求項で用いられる特定の用語について、以降で説明される。
非制限的例では、本発明の譲受人に譲渡された国際公開第2009/044392号の表B(B1〜B74)、表C(C1〜C4)および表D(D1〜D34)(参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)は、本出願に従ってsiRNA化合物を調製するのに有用であるセンスおよび対応するアンチセンスオリゴマーの核酸配列を含む。化合物は、化学的におよび/または構造的に修飾された化合物として使用される。
本発明の化合物を未処理の化学薬品として投与することも可能であるが、医薬組成物として提供することが好ましい。従って、本発明は、1つまたは複数の本発明の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。この組成物は、2つ以上の異なるオリゴヌクレオチド/siRNAの混合物を含んでもよい。
一部の実施形態では、本発明のsiRNA分子は、キャリアまたは希釈剤と一緒に調製した裸の分子を直接適用することにより標的組織に送達される。
また、標的遺伝子の発現を低減させことを目的とする本明細書で提供される核酸分子(例えば、siNA分子)を含む、患者に核酸分子を投与するためのキット、容器および製剤が提供される。一部の実施形態では、キットは、少なくとも1つの容器および少なくとも1つのラベルが含まれる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、種々の材料、例えば、ガラス、金属またはプラスチックで形成してもよい。キットは、関連する指示書および/または説明書をさらに含めることもできる。また、試薬および他の組成物またはこの目的に使用されるツールも、含めることができる。
本明細書で開示の核酸分子のヌクレオシドサブユニットは、リン酸ジエステル結合により相互に結合可能である。標準的5’3’リン酸ジエステル結合は、任意選択により、他の結合と置換可能である。例えば、ホスホロチオエート、チオホスフェート−D−リボース成分、トリエステル、チオ酸塩、2’−5’架橋骨格(5’−2’または2’5’とも呼ばれる)、PACE、3’−(または−5’)デオキシ−3’−(または−5’)チオ―ホスホロチオエート、ホスホロジチオ酸塩、ホスホロセレネート、3’−(または−5’)デオキシホスフィネート、ボラノリン酸塩、3’−(または−5’)デオキシ−3’−(または5’−)アミノホスホロアミデート、水素ホスホネート、ホスホネート、ボラノリン酸エステル、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステル修飾、例えば、アルキルホスホトリエステル、ホスホトリエステルリン結合、5’−エトキシリン酸ジエステル、P−アルキルオキシホスホトリエステル、メチルホスホネート、および非リン含有結合、例えば、炭酸塩、カルバマート、シリル、硫黄、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセチル、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノ結合。さらに、ヌクレオチドの構造が根本的に変えられ、治療または実験用試薬としてより良く適合するポリヌクレオチド類似体が、調製可能である。ヌクレオチド類似体の例は、ペプチド核酸(PNA)であり、DNA(またはRNA)中のデオキシリボース(またはリボース)リン酸塩骨格が、ペプチド中に見出されるものと類似のポリアミド骨格を含む。PNA類似体は、酵素による分解に耐性を示し、また、インビボおよびインビトロで寿命延長を示している。さらに、PNAは、相補的なDNA配列に対し、DNA分子より強力に結合することが示されている。この観察結果は、PNA鎖とDNA鎖間の電荷反発の欠如が原因である。オリゴヌクレオチドの合成に有用な他の修飾モノマーには、ポリマー骨格、環式骨格、または非環式骨格を有する成分が含まれる。
別の態様では、本発明は、標的遺伝子の異常な発現に関連した疾患または障害の治療を必要としている患者の治療方法に関し、該方法は、その遺伝子の発現を低減する、または阻害するある量の阻害剤を患者に投与することを含む。
本明細書で開示の1つまたは複数の化合物を提供すること;および
前記化合物を薬学的に許容可能なキャリアと混合すること、
を含む。
本発明の化合物は、リボ核酸(またはデオキシリボ核酸)オリゴヌクレオチドを合成するための、当技術分野でよく知られたいずれの方法によっても合成可能である。このような合成は、特に、Beaucage and Iyer、Tetrahedron 1992;48:2223−2311;Beaucage and Iyer、Tetrahedron 1993;49:6123−6194およびCaruthers、et.al.、Methods Enzymol.1987;154:287−313、に記載されており;チオ酸塩の合成は、特に、Eckstein、Annu.Rev.Biochem.1985;54:367−402に記載され、RNA分子の合成は、Sproat、in Humana Press 2005 edited by Herdewijn P.;Kap.2:17−31に記載され、さらにそれぞれの下流プロセスは、特に、Pingoud et.al.、in IRL Press 1989 edited by Oliver R.W.A.;Kap.7:183−208、に記載されている。
RNA干渉(RNAi)は、二重鎖(ds)RNA依存性遺伝子特異的転写後サイレンシングを伴う現象である。この現象を研究し、哺乳動物細胞を実験的に操作する初期の試みは、長鎖dsRNA分子に応答して活性化した能動的な、非特異的抗ウイルス防護機序によって挫折させられた(Gil et al.Apoptosis、2000.5:107−114)。後に、21ヌクレオチドRNAの合成二重鎖が、通常の抗ウイルス防護機序を刺激することもなく、哺乳動物細胞中の遺伝子特異的RNAiを媒介する可能性があることが発見された(Elbashir et al.Nature 2001、411:494−498およびCaplen et al.PNAS USA 2001、98:9742−9747を参照)。その結果、低分子干渉RNA(siRNA)は、遺伝子の機能を理解しようとする試みを支援する強力なツールとなった。
既知の遺伝子に対応するsiRNAの選択および合成については、広く報告がなされている(例えば、Ui−Tei et al.、J Biomed Biotech.2006;2006:65052;Chalk et al.、BBRC.2004、319(1):264−74;Sioud & Leirdal、Met.Mol Biol.;2004、252:457−69;Levenkova et al.、Bioinform.2004、20(3):430−2;Ui−Tei et al.、NAR.2004、32(3):936−48、を参照)。
さらなる詳細が無くても、当業者なら、今までの記載を使って、最大限に本発明を利用することが可能であると考えられる。従って、以下の具体的実施形態は、単に説明のためのものと解釈されるべきで、多少なりとも請求された発明を制限するものではない。
添付の配列リスト電子ファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる(ファイル名:217_PCT2_ST25.txt;作成日付:2011年1月6日;ファイルサイズ:6.00Kb)。
特許化アルゴリズムおよび標的ヌクレオチドの既知の配列、例えば、標的遺伝子のmRNAを使って、多くの潜在的siRNA核酸分子のセンスおよびアンチセンス配列が生成される。特段の指示がなければ、核酸分子を5’−3’の方向で示し、センスおよび相補的なアンチセンス配列を表の同じ行に示す。
標準的合成手順を使って、単鎖オリゴヌクレオチド(センス鎖およびアンチセンス鎖)を合成する。DMT−プロパン−ジオールホスホラミダイト(ChemGenes社;CLP−9908)を0.05Mの濃度でカップリングさせる。相補的な単鎖オリゴヌクレオチドのアニーリングにより二重鎖を生成する。層流フード中で、単鎖オリゴヌクレオチドの約500μM保存溶液をWFI(注射剤用の水、Norbrook社)で希釈して調製する。実際のssRNA濃度を、それぞれ500μMのssRNAをWFIで1:200に希釈し、Nano Dropを使ってODを測定することにより決定する。この手続きを3回繰り返し、平均濃度を計算する。次に、250μMの最終濃度に保存溶液を希釈する。相補的な単鎖を85℃に加熱し、少なくとも45分かけて室温まで放冷することによりアニールする。二重鎖の5μlを20%ポリアクリルアミドゲル操作および染色して、アニーリングが完了したがどうかの試験を行った。試料を−80℃で保存した。
ヒト血清またはヒト組織抽出物中の二重鎖核酸分子の二重鎖の安定性を以下のように試験した:
7uMの最終濃度のsiRNA分子を100%ヒト血清(Sigma社 Cat#H4522)中、37℃でインキュベートする。(siRNA保存液100uMをヒト血清で1:14.29に希釈したもの、または種々の組織型からのヒト組織抽出物)。5ulを15ulの1.5xTBEローディングバッファーに種々の時点で添加する(例えば、0、30min、1h、3h、6h、8h、10h、16hおよび24h)。試料を液体窒素で直ちに凍結し、−20°Cで保存する。
核酸分子上の3’非ヌクレオチド部分の安定化効果を調べるために、センス鎖、アンチセンス鎖およびアニールしたsiRNA二重鎖を異なる細胞型から調製したサイトゾル抽出物中でインキュベートする。HCT116細胞中の安定性試験プロトコルを以下に示す。
抽出物:HCT116サイトゾル抽出物(12mg/ml)。
抽出緩衝液:25mMヘペス pH約7.3(37℃);8mM MgCl;1mM DTT含有150mM NaClを使用直前に新しく添加した。
3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含むsiRNA化合物を合成し、上述のように試験した。図2は、本明細書で開示の配列および修飾を含む、RNAiに有用な化合物の表である。修飾の凡例は次の通り:プリフィックス「z」は、3’または5’末端ヌクレオチドに共有結合した部分(ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド)を示す。例えば、zdTは、dTオーバーハングを指す;zdT;zdTは、dTdTオーバーハングを指す。プリフィックス「y」は、ヌクレオチド置換を示し、例えば、yLdAは、センス鎖またはアンチセンス鎖中のリボヌクレオチドのL−デオキシリボアデニン置換を指し、ydTは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド中のリボヌクレオチドのデオキシリボチミジン置換を指す。プリフィックス「m」は、2’OMe糖修飾リボヌクレオチドを指す。他の記号を下表Bに記載する。
標的細胞へのsiRNA送達、標的細胞遺伝子ノックダウン活性および標的遺伝子mRNA開裂の特異性の評価
標的遺伝子のノックダウンを標的組織中で、例えば、ラット網膜への硝子体内注射後、測定する。
背景:CASP2遺伝子を標的にするsiRNAに対し、異なる構造修飾を行い、エキソヌクレアーゼ耐性試験を行う。この試験の目的は、以下に記載されるような、これらの修飾を含むオリゴヌクレオチドの分布と活性を、インビボで調べることである。
(ii)試験期間全体を通して、全ての動物を環境的に管理された居住条件下のアクセスの制約された施設中に収容し、HBI承認標準業務手順書(SOP)に従って維持した。自動制御環境条件を、維持温度:20〜24℃、相対湿度(RH):30〜70%、12時間明期12時間暗期サイクルおよび15〜30回の試験室中空気交換/時間に設定。温度、RHおよび光サイクルを制御コンピュータによりモニターした。
実験計画を表2−1に示す。
ラット網膜中のCASP2を標的とするsiRNAのノックダウン活性をqPCR法を使ってCASP2 mRNA発現レベル定量化により測定した。標的遺伝子上のCASP2_4siRNA開裂部位は、RACEによって検証予定である。また、網膜中のsiRNAの定量化をS&L qPCR(ステムループqPCR)により行った。
予備的結果は、S800は、S1003より効率的に網膜細胞中に取り込まれることを示している。結果を下表2−2に示す。
標的細胞へのsiRNA送達の評価:この調査の目的は、
1.1 片眼硝子体内(IVT)注射後の4時間目、1日目および3日目に、構造および修飾が異なるMYD88_11 siRNAのラット網膜への送達を測定すること、
1.2 MYD88を標的とする、構造が異なるMYD88_11 siRNAのノックダウン活性を、ラット眼中へのIVT注射後のMYD88 mRNAのqPCRにより、IVT注射後の4時間目、1日目および3日目に測定すること、
である。
(ii)試験期間全体を通して、全ての動物を環境的に管理された居住条件下のアクセスの制約された施設中に収容し、HBI承認標準業務手順書(SOP)に従って維持した。自動制御環境条件を、維持温度:20〜24℃、相対湿度(RH):30〜70%、12時間明期12時間暗期サイクルおよび15〜30回の試験室中空気交換/時間に設定。温度、RHおよび光サイクルを制御コンピュータによりモニターした。
網膜中のsiRNAの定量化をステムループqPCRにより行い、ラット網膜中のMYD88を標的とするsiRNAのノックダウン活性をqPCR法を使ってMYD88 mRNA発現レベル定量化により測定する。
C3C3修飾化合物(S1159およびS1270)の網膜神経節細胞への送達は、平滑末端(S505)を有する化合物の送達よりも有意に高かった(「中央値」カラムのデータを参照。値はフェムトモル単位)。
ARFは、数日以内に発生する腎機能の急速劣化を特徴とする臨床的症候群である。理論に束縛されるものではないが、急性の腎臓傷害は、腎臓虚血再灌流障害、例えば、大心臓手術等の大手術を受けている患者の腎臓虚血再灌流障害の結果である可能性がある。ARFの主要な特徴は、糸球体濾過率(GFR)の急激減少で、窒素性廃棄物(尿素、クレアチニン)の貯溜が生ずる。最近の研究は、腎臓組織のアポトーシスが大抵のヒトのARF症例で顕著であることを裏付けている。アポトーシス細胞死の主要部位は、遠位のネフロンである。虚血傷害の初期相の間に、アクチン細胞骨格の完全性の欠如により、刷毛縁の損失を伴う上皮の平坦化が起こり、局所的細胞接触が失われ、その結果、下部の基層から細胞が離脱する。
糖尿病性潰瘍を含む褥瘡または圧迫性壊死は、持続的圧迫(通常は、ベッドまたは車椅子からの)が、身体の脆弱な部分、特に、臀部、尻および踵の皮膚への循環を遮断する場合に発生する、損傷を受けた皮膚および組織の部位のことである。適切な血液流の不足は、患部組織の虚血性壊死および潰瘍につながる。褥瘡は、感覚の減弱した、もしくは欠如した患者、または衰弱した、痩せ衰えた、麻痺した、または長く寝たきりの患者で発生することが多い。仙骨、坐骨、大転子、外くるぶし、および踵の組織が、特に、罹りやすい。患者の状況によっては、他の部位も関係する可能性がある。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、主に、肺気腫を特徴とし、これは、遠位の末端細気管支である末梢気腔の永久破壊である。肺気腫は、また、細気管支および肺胞構造中の炎症性の細胞、例えば、マクロファージおよび好中球の蓄積を特徴とする。肺気腫および慢性気管支炎は、COPDの一部としても、または独立にも発生する可能性がある。
脊髄損傷、またはミエロパシーは、感覚および/または可動性の消失を生ずる脊髄の障害である。脊髄損傷の2つの共通の型は、外傷および疾患に起因する。外傷は、特に、自動車事故、転落、銃撃、ダイビング中の事故に起因する可能性があり、脊髄に悪影響を与える可能性がある疾患には、ポリオ、脊椎披裂、腫瘍およびフリードライヒ運動失調症がある。
緑内障の治療または予防を目的として、例えば、Pease et al.、J.Glaucoma、2006、15(6):512−9(実験用緑内障のマウスおよび正常なマウスを使ったTonoLabとTonoPen眼圧計のマノメーター較正および比較(Manometric calibration and comparison of TonoLab and TonoPen tonometers in rats with experimental glaucoma and in normal mice))に記載の動物モデルを使って、本発明の活性阻害剤(例えば、siRNA)の試験を行う。
視神経圧挫損傷プロトコルを使って虚血性視神経症用の動物モデルを成体ウィスターラットで樹立した。視神経圧挫の7日前に、逆行型トレーサーFluoroGold(2%、Fluorochrome、Englewood社)を上丘に適用することにより、網膜神経節細胞(RGC)を選択的に標識する。トレーサーは、蛍光トレーサーの注射後1週間以内に全RGCの完全で特異的標識を生じているRGC軸索に沿って逆行型輸送により輸送される。動物は、逆行型トレース後7日目に視神経圧挫損傷を受ける。眼窩上からアプローチして眼窩視神経を露出し、視神経中の全軸索を鉗子で10秒間圧挫して篩状板から2mm切断する。A単回用量の5μlのPBS中の20μgの本発明のsiRNA化合物を、視神経圧挫時にガラスマイクロピペットを使って神経頭の前方2mmの硝子体中に微量注入する。視神経圧挫後7日目にフラットマウント網膜中のFluoroGold標識RGCをカウントすることにより、RGCの生存を測定する。実験動物を、視神経圧挫の1週間後に、4%パラホルムアルデヒドで経心的に潅流する。両網膜を切りだし、さらに30分間固定し、神経細胞層定量化のためにガラススライド上にフラットマウントする。各網膜の16箇所の異なる領域で蛍光のRGCの数をカウントし、RGC生存パーセントを測定して、視神経圧挫損傷を全く受けていないラット由来の検体または視神経圧挫損傷を受けて、かつ、PBS、対照siRNAまたはGFP siRNAを注射されているラット由来の検体と比較する。臨死RGCの食作用後にFluoroGoldを組み込んだ可能性のあるミクログリア細胞をそれらの特徴的形態により区別し、定量分析から除外した。
肺移植後の虚血/再潅流傷害または低酸素傷害を治療または予防することを目的とする本発明の活性阻害剤(例えば、siRNA)の試験を1つまたは複数の実験動物モデル、例えば、Mizobuchi et al.、2004.J.Heart Lung Transplant、23:889−93;Huang、et al.、1995.J.Heart Lung Transplant.14:S49;Matsumura、et al.、1995.Transplantation 59:1509−1517;Wilkes、et al.、1999.Transplantation 67:890−896;Naka、et al.、1996.Circulation Research、79:773−783、に記載の動物モデルを使って行う。
急性呼吸促迫症候群(ARDS)の治療を目的として、Chen et al(J Biomed Sci.2003;10(6Pt1):588−92、に記載のように動物モデルを使って本発明の活性阻害剤(例えば、siRNA)の試験を行う。国際公開第2009/044392号の表B(B1〜B74)、表C(C1〜C4)および表D(D1〜D34)に記載のsiRNA化合物、特に、遺伝子CYBA、HRK、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、SPP1、およびDUOX1を標的とするsiRNA、ならびに少なくとも1つの本明細書で開示の3’オーバーハングを含むさらなるsiRNAがこの動物モデルで試験され、これにより、これらのsiRNAが急性呼吸促迫症候群(ARDS)を治療および/または予防し、従って、この状態の治療に使用可能であることが示される。
コラーゲン誘導関節炎(CIA):マウスのCIAは、Trentham et al.(1977.J.Exp.Med.146:857−868)に記載がある。アジュバント誘導関節炎(AA):AAは、Kong et al.、(1999.Nature、402:304−308)に記載されている。半月板切除術モデルは、Han et al.、(1999.Nagoya J Med Sci 62(3−4):115−26)に記載されている。
温虚血-試験ラットで、左腎摘除術、続いて、自家移植を行い、これにより45分の腎臓移植片常温(warm)保存期間がもたらされる。腎臓移植片採取前(ドナー治療の模倣)(「pre」)、もしくは腎臓自家移植後(レシピエント治療の模倣)に、または採取前および移植後の両方(ドナーおよびレシピエント治療の組み合わせ)(「pre−post」)に、自家移植後、右腎摘除術を同じ動物に行う。標的に対する化学修飾siRNAを大腿静脈経由静脈内投与する。
Claims (73)
- センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸分子であって、少なくとも1つの鎖が、存在する鎖の3’末端ヌクレオチドの糖残基の3’または2’位置に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み、非ヌクレオチド部分が、プロパノール、リン酸ジエステルに結合したC3アルキル部分またはホスホロチオエートに結合したC3アルキル部分、デオキシリボ脱塩基部分、リボ脱塩基部分およびこれらの組み合わせからなる群より選択される分子。
- 非ヌクレオチド部分が、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して糖残基に結合している請求項1に記載の分子。
- 非ヌクレオチド部分が、アンチセンス鎖の3’末端の糖残基の3’または2’位置に共有結合したC3アルキル部分を含む請求項1に記載の分子。
- C3アルキル部分が、C3PiおよびC3OHから選択される請求項3に記載の分子。
- 分子が、リン酸ジエステルもしくはホスホロチオエート結合により共有結合した2つもしくは3つのC3アルキル部分、またはリン酸ジエステルもしくはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合した1つのC3アルキル部分を含む請求項1に記載の分子。
- 分子が、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により共有結合した2つまたは3つのC3アルキル部分を含む請求項5に記載の分子。
- 2つまたは3つのC3アルキル部分が、C3Pi−C3OH、C3Pi−C3Pi、C3Pi−C3Ps、C3Pi−C3Pi−C3OH、C3Ps−C3Ps−C3OH、C3Pi−C3Ps−C3OH、C3Ps−C3Pi−C3OH、C3Pi−C3Pi−C3Pi、C3Ps−C3Ps−C3Ps、C3Pi−C3Ps−C3Ps、C3Ps−C3Pi−C3Ps、C3Ps−C3Ps−C3Pi、C3Pi−C3Pi−C3Ps、C3Ps−C3Pi−C3PiまたはC3Pi−C3Ps−C3Pi部分からなる請求項6に記載の分子。
- 分子が、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合で脱塩基部分に共有結合した1つのC3アルキル部分を含む請求項5に記載の分子。
- 脱塩基部分が、デオキシリボ脱塩基部分またはリボ脱塩基部分よりなる請求項8に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分が、C3Pi−rAb、C3Pi−dAb、rAb−C3OH、rAb−C3Pi、dAb−C3OH、およびdAb−C3Piからなる請求項9に記載の分子。
- 次の構造(A1)を有する請求項1に記載の二重鎖核酸分子:
(A1) 5’ (N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、各NおよびN’は、非修飾もしくは修飾であってもよく、または非通常部分であるヌクレオチドであり;
各(N)xおよび(N’)yは、各連続したNまたはN’が次のNまたはN’に共有結合により結合しているオリゴヌクレオチドであり;
少なくとも1つのZまたはZ’が存在し、それが存在する鎖の3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み;
z"は、存在しても、または存在しなくてもよいが、存在する場合は、(N’)yの5’末端に共有結合したキャッピング部分であり;
各xおよびyは、独立に、18と40の間の整数であり;
(N’)yの配列は、(N)xの配列に対し相補性を有し;さらに、(N)xの配列は、標的RNA中の連続した配列に対し相補性を有する。 - (N)xおよび(N’)yが、完全に相補的である請求項11に記載の分子。
- x=y=19である請求項11に記載の分子。
- Zが存在する請求項11に記載の分子。
- Z’が存在する請求項11に記載の分子。
- ZおよびZ’の両方が存在する請求項11に記載の分子。
- ZおよびZ’が同じでない請求項16に記載の分子。
- ZおよびZ’が同じである請求項16に記載の分子。
- 各ZおよびZ’が、独立に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合で相互に共有結合した少なくとも2つのC3アルキル部分を含む請求項16に記載の分子。
- Zが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した少なくとも2つのC3アルキル部分を含む請求項14に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した少なくとも2つのC3アルキル部分が、C3Pi−C3OH、C3Pi−C3Pi、C3Pi−C3Ps、C3Ps−C3Pi、C3Ps−C3OHまたはC3Ps−C3Psを含む請求項19または20に記載の分子。
- 各ZおよびZ’が、独立に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分を含む請求項16に記載の分子。
- Zが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分を含む請求項14に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分が、C3Pi−rAb、C3Ps−rAb、C3Pi−dAb、C3Ps−dAb、rAb−C3OH、rAb−C3Pi、rAb−C3Ps、dAb−C3OH、dAb−C3Pi、またはdAb−C3Psを含む請求項22または23に記載の分子。
- 各ZおよびZ’が、独立に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した2つの脱塩基部分を含む請求項16に記載の分子。
- Zが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した2つの脱塩基部分を含む請求項14に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した2つの脱塩基部分が、rAb−rAb、dAb−rAb、rAb−dAb、またはdAb−dAbを含む請求項25または26に記載の分子。
- Zが、C3Pi−C3PiまたはC3Pi−C3OHからなる請求項21に記載の分子。
- Zが、C3Pi−C3OHからなる請求項28に記載の分子。
- Zが、C3Pi−C3Piからなる請求項28に記載の分子。
- Zおよび/またはZ’が、脱塩基部分および非修飾ヌクレオチド、またはC3アルキル部分および非修飾ヌクレオチドを含む請求項11に記載の分子。
- x=y=19であり、(N)xが、2、4、6、8、11、13、15、17および19のそれぞれの位置に2’OMe糖修飾リボヌクレオチドを含む請求項11〜31のいずれか1項に記載の分子。
- x=y=19であり、(N)xが、1、3、5、7、9、11、13、15、17および19のそれぞれの位置に2’OMe糖修飾リボヌクレオチドを含む請求項11〜31のいずれか1項に記載の分子。
- x=y=19であり、(N’)yが、位置18にL−DNAを含む請求項11〜33のいずれか1項に記載の分子。
- x=y=19であり、(N’)yが、2’−5’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む請求項11〜33のいずれか1項に記載の分子。
- (N)xが、標的RNAに完全に相補的ではない請求項11に記載の分子。
- 下記の構造(A2)を有する請求項36に記載の分子:
(A2) 5’ N1−(N)x−Z 3’ (アンチセンス鎖)
3’ Z’−N2−(N’)y−z" 5’ (センス鎖)
式中、各N2、NおよびN’は、非修飾もしくは修飾リボヌクレオチド、または非通常部分であり;
各(N)xおよび(N’)yは、各連続NまたはN’が、隣接NまたはN’に共有結合で結合したオリゴヌクレオチドであり;
各xおよびyが、独立に、17および39の間の整数であり;
(N’)yの配列は、(N)xの配列に対し相補性を有し、(N)xは、標的RNA中の連続した配列に相補性を有し;
N1は、(N)xに共有結合し、標的RNAにミスマッチであるか、または標的RNAに対し相補的なDNA部分であり;
N1は、天然または修飾ウリジン、デオキシリボウリジン、リボチミジン、デオキシリボチミジン、アデノシンまたはデオキシアデノシンからなる群より選択される部分であり;
z"は、存在しても、または存在しなくてもよいが、存在する場合には、N2−(N’)yの5’末端に共有結合したキャッピング部分であり;さらに
少なくとも1つのZまたはZ’が存在し、それが存在する鎖の3’末端に共有結合した非ヌクレオチド部分を含む。 - (N)xが、哺乳動物または非哺乳動物RNA中の連続した配列に対し相補的である請求項37に記載の分子。
- x=y=18である請求項37に記載の分子。
- N1およびN2が、ワトソン・クリック塩基対を形成する請求項37に記載の分子。
- N1およびN2が、非ワトソン・クリック塩基対を形成する請求項37に記載の分子。
- N1が、リボアデノシン、修飾リボアデノシン、デオキシリボアデノシン、修飾デオキシリボアデノシンからなる群より選択される請求項37に記載の分子。
- N1が、リボウリジン、デオキシリボウリジン、修飾リボウリジン、および修飾デオキシリボウリジンからなる群より選択される請求項37に記載の分子。
- N1が、修飾リボアデノシンまたは修飾リボウリジンである請求項37に記載の分子。
- N1が、2’OMe糖修飾リボウリジンまたは2’OMe糖修飾リボアデノシンである請求項44に記載の分子。
- N2が、2’OMe糖修飾リボヌクレオチドまたは2’OMe糖修飾デオキシリボヌクレオチドである請求項37に記載の分子。
- Zが存在する請求項37に記載の分子。
- Z’が存在する請求項37に記載の分子。
- ZおよびZ’の両方が存在する請求項37に記載の分子。
- ZおよびZ’が同じでない請求項49に記載の分子。
- ZおよびZ’が同じである請求項49に記載の分子。
- 各ZおよびZ’が、独立に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した少なくとも2つのC3アルキル部分を含む請求項49に記載の分子。
- Zが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した少なくとも2つのC3アルキル部分を含む請求項47に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した少なくとも2つのC3アルキル部分が、C3Pi−C3OH、C3Pi−C3Pi、C3Pi−C3Ps、C3Ps−C3Pi、C3Ps−C3OHまたはC3Ps−C3Psを含む請求項52または53に記載の分子。
- 各ZおよびZ’が、独立に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分を含む請求項49に記載の分子。
- Zが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分を含む請求項47に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により脱塩基部分に共有結合したC3アルキル部分が、C3Pi−rAb、C3Ps−rAb、C3Pi−dAb、C3Ps−dAb、rAb−C3OH、rAb−C3Pi、rAb−C3Ps、dAb−C3OH、dAb−C3Pi、またはdAb−C3Psを含む請求項55または56に記載の分子。
- 各ZおよびZ’が、独立に、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合で相互に共有結合した2つの脱塩基部分を含む請求項49に記載の分子。
- Zが、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合で相互に共有結合した2つの脱塩基部分を含む請求項47に記載の分子。
- リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合により相互に共有結合した2つの脱塩基部分が、rAb−rAb、dAb−rAb、rAb−dAb、またはdAb−dAbを含む請求項58または59に記載の分子。
- Zが、C3Pi−C3PiまたはC3Pi−C3OHからなる請求項54に記載の分子。
- Zが、C3Pi−C3OHからなる請求項61に記載の分子。
- Zが、C3Pi−C3Piからなる請求項61に記載の分子。
- Zおよび/またはZ’が、脱塩基部分および非修飾ヌクレオチド、またはC3アルキル部分および非修飾ヌクレオチドを含む請求項37に記載の分子。
- x=y=18であり、(N’)yが、位置17にミラーヌクレオチドを含む請求項37〜64のいずれか1項に記載の分子。
- ミラーヌクレオチドがL−DNAである請求項65に記載の分子。
- x=y=18であり、(N’)yが、2’−5’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合したヌクレオチドを含む請求項37〜64のいずれか1項に記載の分子。
- (N)xが、少なくとも1つの2−OMe糖修飾リボヌクレオチドを含む請求項37〜67のいずれか1項に記載の分子。
- 請求項1〜68のいずれか1項に記載の分子、および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
- 標的遺伝子の発現に関連する疾患または障害に罹患している患者を治療する方法であって、標的遺伝子の発現を減らすのに有効な量の請求項1〜68のいずれか1項に記載の分子を患者に投与し、それにより、患者を治療することを含む方法。
- 標的RNAの開裂を媒介する二重鎖RNA分子を調製する方法であって、
(a)18〜27長のヌクレオチドを有し、標的RNA中の配列に対し同一性を有するRNA鎖を合成するステップ、
(b)(a)のRNA鎖に相同性を有する第2のRNA鎖を合成するステップ、さらに
(c)二重鎖RNA分子を形成するのに適切な条件下で、合成したRNA鎖をアニールするステップを含み、
前記二重鎖RNA分子が、14〜25ヌクレオチド長の二重鎖領域、およびそれが存在する鎖の3’末端の糖残基の3’または2’位置に共有結合した非ヌクレオチド部分を有し、非ヌクレオチド部分が、プロパノール、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエートに結合したC3アルキル部分、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合に結合したC3アルキル部分、デオキシリボ脱塩基部分またはリボ脱塩基部分およびこれらの組み合わせから選択され;さらにRNA鎖が、修飾リボヌクレオチドを含む、方法。 - 前記RNA鎖が、19〜21ヌクレオチド長を有する請求項71に記載の方法。
- 標的遺伝子の発現を下方制御できる二重鎖RNA分子を調製する方法であって、各RNA鎖が、19〜25ヌクレオチドの長さを有し、少なくとも1つの鎖が、3’末端の糖残基の3’または2’位置に共有結合した非ヌクレオチド部分を有し、
(a)それぞれ19〜25ヌクレオチド長を有する2つのRNA鎖を合成するステップであって、前記RNA鎖が、二重鎖RNA分子を形成可能であるステップ、
(b)合成したRNA鎖を標的核酸の下方制御を媒介する二重鎖RNA分子が形成される条件下で結合するステップを含み、
前記二重鎖RNA分子が、単一二重鎖領域からなり、少なくとも1つの単鎖領域が、それが存在する鎖の3’末端の糖残基の3’または2’位置に共有結合した非ヌクレオチド部分を含み;非ヌクレオチド部分が、プロパノール、リン酸ジエステルに結合したC3アルキル部分、ホスホロチオエートに結合したC3アルキル部分、デオキシリボ脱塩基部分、リボ脱塩基部分またはこれらの組み合わせから選択される方法。
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