CN102770541B

CN102770541B - 包含非核苷酸突出的寡核苷酸化合物

Info

Publication number: CN102770541B
Application number: CN201180011234.0A
Authority: CN
Inventors: 莎伦·阿夫金-纳祖姆; 埃琳娜·费因斯坦
Original assignee: Quark Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Quark Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2010-01-07
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2016-03-09
Anticipated expiration: 2031-01-06
Also published as: WO2011084193A1; HK1178566A1; EP2521783B1; US9249414B2; US20150159154A1; CN102770541A; EP2521783A1; WO2011085056A1; US8859751B2; ES2640091T3; US20130035368A1; JP2013516190A; JP5824463B2

Abstract

本发明涉及包含一个非核苷酸部分的siRNA化合物以下调人基因的表达，所述非核苷酸部分共价连接到有义链或反义链的至少一者。本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含此类化合物和药学上可接受的载体，以及涉及治疗和/或预防各种与所述靶基因相关的疾病或病症的发生率或严重性和/或与此类疾病或病症相关的症状的方法。

Description

包含非核苷酸突出的寡核苷酸化合物

在本申请全文中，引用了多份专利和科学出版物。这些出版物的公开内容整体据此以引用方式并入本申请，以更全面地描述本发明所属的现有技术的状态。

相关申请

本申请要求2010年1月7日提交的美国临时专利申请No.61/292878、2010年9月16日提交的PCT专利申请No.PCT/US2010/049047以及2010年12月8日提交的PCT专利申请No.PCT/US2010/059578的优先权，它们据此全文以引用方式并入。

发明领域

本文所公开的是修饰的双链核酸分子、包含该核酸分子的药物组合物以及它们用于抑制哺乳动物和非哺乳动物靶基因的方法。这些化合物和组合物因此可用于治疗患有疾病或病症和/或与此类疾病或病症相关的症状的受试者，在这些疾病或病症中基因表达具有不良后果。在特定实施方案中，本发明提供包含该核酸分子的组合物及其使用方法。

发明背景

哺乳动物中的RNA干扰(RNAi)由小干扰RNA(siRNA)介导(Fire等，Nature1998，391：806)或microRNA(miRNA)(Ambros，Nature2004，431(7006)：350-355；Bartel，Cell2004，116(2)：281-97)。植物中的相应过程通常被称为特异性转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为压制(quelling)。

siRNA是一种双链RNA或修饰的RNA分子，其下调或沉默(阻止)其内源性(细胞)对应物(counterpart)的基因/mRNA的表达。RNA干扰的机制在下文有详细描述。

转让给本发明受让人的PCT公布No.WO2008/050329和美国No.11/978,089涉及促凋亡基因的抑制剂，并且它们全文以引用方式并入。转让给本发明受让人的PCT专利公布No.WO2008/104978和WO2009/044392涉及化学修饰的siRNA结构，它们全文以引用方式并入。

发明概述

本发明提供化学和/或结构修饰的siRNA化合物，一般用于抑制基因表达，并且尤其是哺乳动物和原核基因的表达。本文提供的是新型结构基序，其可用于制备在3’-末端包含一个或多个非核苷酸部分作为3’(或2’)突出的siRNA寡核苷酸，以及包含该寡核苷酸的组合物及其使用方法。本申请人已确定，向siRNA的3’末端添加一个、并且优选两个或三个非核苷酸部分在活性和/或稳定性和/或递送方面为siRNA提供有利特性。因此，可对现有siRNA进行有利地修饰，并可设计和制备将来的siRNA以利用此发现。不希望受到理论的约束，本文所公开的并具有3’非核苷酸突出(Z或Z’，即C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb)的核酸分子由Argonaute的PAZ域识别，并能够执行RNAi，同时表现出良好的稳定性和活性。

应当理解，虽然术语“3’末端”在本申请全文中用于指代siRNA链连接非核苷酸部分的末端，但是除非另外明确说明，否则非核苷酸部分或“突出”可连接在寡核苷酸链3’-末端的(脱氧)核糖部分的3’位或寡核苷酸链3’-末端的(脱氧)核糖部分的2’位，例如(连接在3’-末端(脱氧)核糖部

分的3’位；在图中，B为核苷酸碱基，而R为H或OH)或(连接在3’-末端(脱氧)核糖部分的2’位)。

本文提供的是双链核酸分子的新型结构，其具有有利的特性，并且可应用于针对任何靶序列的siRNA，在双链体的一个或两个3’末端包含非核苷酸突出。本文所公开的化学修饰的siRNA修饰可用于制备可用于RNA干扰(RNAi)的稳定且活性siRNA化合物。

本申请还提供包含一种或多种此类寡核苷酸的药物组合物以及在对其有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症发生率或严重性的方法，其中该疾病或病症和/或与其相关的症状与靶基因的表达相关。在一些实施方案中，该疾病或病症选自由下列组成的组：听力损失、急性肾衰竭(ARF)、青光眼、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其它急性肺部和呼吸道损伤、肺移植后的缺血-再灌注损伤、眼缺血性病症、器官移植(包括肺、肝脏、心脏、胰腺和肾脏移植)中的损伤并包括移植功能延迟恢复(DGF)、肾毒性和神经毒性、脊髓损伤、褥疮、年龄相关性黄斑变性(AMD)、干眼综合征、口腔黏膜炎、缺血性眼神经病变(ION)和慢性阻塞性肺病(COPD)。此类方法涉及向需要这种治疗的哺乳动物施用预防或治疗有效量的一种或多种此类化合物，其抑制或降低至少一种这样的基因的表达或活性。此类化合物可与其它治疗一起施用或取代其它治疗而施用。

对寡核苷酸进行选择以靶向任何哺乳动物或非哺乳动物基因。在多种实施方案中，修饰的化合物包含如SEQIDNO：97-68654(在美国专利No.11/978,089和PCT专利申请No.PCT/IL2007/001278中公开，它们据此以引用方式全文并入)中任一项所示的寡核苷酸序列。

在一个方面，提供了包含至少一个非核苷酸3’末端突出的双链siRNA化合物。本申请提供包含有义链和反义链的合成的双链siRNA化合物，其中该有义链或反义链的至少一条包含1、2、3、4或5个优选2或3个共价连接在3’末端的非核苷酸部分，其中该非核苷酸部分选自反向的脱碱基部分、脱碱基部分、烷基(烃)部分或其衍生物以及基于磷酸酯的部分。在一些实施方案中，该非核苷酸部分选自反向的脱碱基部分、烷基(烃)部分或其衍生物以及基于磷酸酯的部分。在一些实施方案中，该非核苷酸部分包括烷基(烃)部分或其衍生物。本文提供的是包含有义链和反义链的双链核酸分子，其中至少一条链包含非核苷酸部分，该非核苷酸部分共价连接在其所存在的链的3’末端核苷酸的糖残基的3’或2’位；其中非核苷酸部分选自由下列组成的组：丙醇、连接到磷酸二酯的C3烷基部分、连接到硫代磷酸酯的C3烷基部分、脱氧核糖脱碱基部分、核糖脱碱基部分以及它们的组合。

在一些实施方案中，非核苷酸部分通过基于磷酸酯的键合(优选磷酸二酯或硫代磷酸酯键合)连接到糖残基。在一些实施方案中，非核苷酸部分包括共价连接在反义链3’末端的糖残基的3’或2’位的C3烷基部分。在多种实施方案中，C3烷基部分选自C3Pi和C3OH。

在一些实施方案中，该分子包含两个或三个通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键合共价连接的C3烷基部分或一个通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键合共价连接到脱碱基部分的C3烷基部分。在优选的实施方案中，该分子包含两个通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键合共价连接的C3烷基部分。

在一些实施方案中，C3烷基部分选自：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3Pi-C3OH、C3Ps-C3Ps-C3OH、C3Pi-C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi-C3Pi、C3Ps-C3Ps-C3Ps、C3Pi-C3Ps-C3Ps、C3Ps-C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3Ps-C3Pi、C3Pi-C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3Ps-C3Pi部分。

在其它实施方案中，该分子包含一个通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键合共价连接到脱碱基部分的C3烷基部分，其中脱碱基部分选自脱氧核糖脱碱基部分或核糖脱碱基部分。在一些实施方案中，通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键合共价连接到脱碱基部分的C3烷基部分选自C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、rAb-C3OH、rAb-C3Pi、dAb-C3OH或dAb-C3Pi。

在一些实施方案中，提供了具有结构(A1)的双链核酸分子：

(A1)5’(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)

其中N和N’的每一个均为未修饰或修饰的核苷酸，或非常规部分；

其中(N)x和(N’)y的每一个均为其中每个连续的N或N’通过共价键接合到下一个N或N’的寡核苷酸；

其中Z或Z’的至少一者是存在的，并包含共价连接在其所存在的链的3’末端的非核苷酸部分；

其中z”可以存在或不存在，但是如果存在时，则为共价连接在(N’)y的5’末端的加帽部分；

其中x和y的每一个独立地为18与40之间的整数；

其中(N’)y的序列与(N)x的序列具有互补性；并且其中(N)x的序列与靶RNA中的连续序列具有互补性。

在一些实施方案中，接合每个连续N或N’的共价键为磷酸二酯键。

在一些实施方案中，x＝y＝19至27，例如19、20、21、22、23、24、25、26、27。在一些实施方案中，x＝y，并且x和y的每一个均为19、20、21、22或23。在多种实施方案中，x＝y＝19。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且Z或Z′之一是存在的并由两个非核苷酸部分组成。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且Z’是存在的并由两个非核苷酸部分组成。

在优选的实施方案中，x＝y＝19并且Z是存在的并由两个非核苷酸部分组成。

在优选的实施方案中，x＝y＝19并且Z是存在的并由两个非核苷酸部分组成；以及Z’是存在的并由一个非核苷酸部分组成。

在另外的实施方案中，x＝y＝19并且Z和Z′是存在的，而每一个独立地包含两个非核苷酸部分。

在一些实施方案中，该双链核酸分子在反义链的第1位(5’末端)包含DNA部分或与靶的错配。本文将描述这种结构。根据一个实施方案，提供了具有如下所示的结构(A2)的双链核酸分子：

(A2)5’N1-(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)

其中N2、N和N’的每一个均为未修饰的或修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；

其中(N)x和(N’)y的每一个均为其中每个连续的N或N’通过共价键接合到相邻N或N’的寡核苷酸；

其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；

其中(N’)y的序列与(N)x的序列具有互补性，并且(N)x与靶RNA中的连续序列具有互补性；

其中N1共价结合到(N)x并与靶RNA错配或为与靶RNA互补的DNA部分；

其中N1为选自由下列组成的组的部分：天然或修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷；

其中z”可以存在或不存在，但是如果存在时，则为共价连接在N2-(N’)y的5’末端的加帽部分；并且

其中Z或Z’的至少一者是存在的，并包含共价连接在其所存在的链的3’末端的非核苷酸部分。

在一些实施方案中，x＝y＝18并且Z或Z′之一是存在的并由两个非核苷酸部分组成。

在一些实施方案中，x＝y＝18并且Z’是存在的并由两个非核苷酸部分组成。

在优选的实施方案中，x＝y＝18并且Z是存在的并由两个非核苷酸部分组成。

在优选的实施方案中，x＝y＝18并且Z是存在的并由两个非核苷酸部分组成；以及Z’是存在的并由一个非核苷酸部分组成。

在另外的实施方案中，x＝y＝18并且Z和Z′是存在的，而每一个独立地包含两个非核苷酸部分。

在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在多种实施方案中，N2-(N’)y的序列与N1-(N)x的序列互补。在一些实施方案中，(N)x包含与靶RNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶RNA中的约17至约39个连续核苷酸基本上互补的反义序列。

在一些实施方案中，N1和N2形成Watson-Crick碱基对。在一些实施方案中，N1和N2形成非Watson-Crick碱基对。在一些实施方案中，在核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间形成碱基对。

在一些实施方案中，x＝y＝18、x＝y＝19或x＝y＝20。在优选的实施方案中，x＝y＝18。当N1-(N)x中x＝18时，N1是指第1位，而第2-19位包含在(N)18中。当N2-(N’)y中y＝18时，N2是指第19位，而第1-18位包含在(N’)18中。

在一些实施方案中，N1共价结合到(N)x，并与靶RNA错配。在多种实施方案中，N1共价结合到(N)x，并为与靶RNA互补的DNA部分。

在一些实施方案中，N1和N2在尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对(rU-rA、rU-dA、dU-rA、dU-dA)。在其它实施方案中，N1和N2在脱氧尿苷与腺苷之间形成碱基对。

在一些实施方案中，双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。如本文所提供的双链核酸分子也称为“双链体”。

在某些优选的实施方案中，x＝y＝18。在一些实施方案中，N1和N2形成Watson-Crick碱基对。在其它实施方案中，N1和N2形成非Watson-Crick碱基对。在某些实施方案中，N1选自由下列组成的组：核糖腺苷、修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷、修饰的脱氧核糖腺苷。在其它实施方案中，N1选自由下列组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、修饰的核糖尿苷以及修饰的脱氧核糖尿苷。

在一些实施方案中，N和N’的每一个为未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，N或N’的至少一个包含化学修饰的核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，该非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，该非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’的至少一者包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在其它实施方案中，(N’)y的序列与(N)x的序列基本上互补。

在一些实施方案中，(N)x包含与靶RNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶RNA中的约17至约39个连续核苷酸基本上互补的反义序列。

在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。

在结构A1和A2的一些实施方案中，Z是存在的，而Z’不存在。在其它实施方案中，Z′是存在的，而Z不存在。在另外的实施方案中，Z和Z′都存在。在一些实施方案中，Z和Z′存在且相同。在另外的实施方案中，Z和Z′存在且不同。在一些实施方案中，Z和Z′独立地为2、3、4或5个非核苷酸部分，或2、3、4或5个非核苷酸部分与核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z和/或Z’的每一个由两(2)个非核苷酸部分组成，这两个部分通过磷酸二酯键共价连接到siRNA链的3’末端。

非核苷酸部分选自由下列组成的组：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烷基部分或其衍生物以及无机磷酸酯。在一些实施方案中，非核苷酸部分为烷基部分或其衍生物。在一些实施方案中，烷基部分包含选自由下列组成的组的末端官能团：醇、末端胺、末端磷酸酯和末端硫代磷酸酯部分。

在一些实施方案中，Z是存在的，并包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分或其衍生物以及无机磷酸酯。在一些实施方案中，Z是存在的并由两个烷基部分或其衍生物组成。

在另外的实施方案中，Z′是存在的，并包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分以及无机磷酸酯。在一些实施方案中，Z’是存在的，并包含一个或多个烷基部分或其衍生物。

在一些实施方案中，Z是存在的，并由两个烷基部分或其衍生物组成，并且Z’是存在的，并由单个烷基部分或其衍生物组成。

在一些实施方案中，Z和Z′的每一个包含脱碱基部分，例如脱氧核糖脱碱基部分(本文中称为″dAb″)或核糖脱碱基部分(本文称为″rAb″)。在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个包含两个共价连接的脱碱基部分，并且例如为5’＞3’dAb-dAb或rAb-rAb或dAb-rAb或rAb-dAb。每个部分通过共价键优选基于磷的键共价缀合到相邻的部分。在一些实施方案中，基于磷的键为硫代磷酸酯、磷酰乙酸酯或磷酸二酯键。

在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个独立地包含C2、C3、C4、C5或C6烷基部分，任选地为C3[丙烷，-(CH2)₃-]部分或其衍生物，例如丙醇(C3-OH)、丙二醇或丙二醇的磷酸二酯衍生物(″C3Pi″)。在优选的实施方案中，Z和/或Z′的每一个包含两个烃部分，并在一些实例中为C3-C3。每个C3通过共价键优选基于磷的键共价缀合到相邻的C3。在一些实施方案中，基于磷的键为硫代磷酸酯、磷酰乙酸酯或磷酸二酯键。

在结构A1和结构A2的一些实施方案中，Z或Z’的至少一者是存在的，并包含至少两个共价连接到其所存在的链的非核苷酸部分。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地包含C3烷基、C3醇或C3酯部分。在一些实施方案中，Z’不存在而Z存在并包含非核苷酸C3部分。在一些实施方案中，Z不存在而Z’存在并包含非核苷酸C3部分。

在结构A1和A2的一些实施方案中，N和N’的每一个都为未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，N或N’的至少一个包含化学修饰的核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中，该非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，该非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，N或N’的至少一者包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在其它实施方案中，结构A1或结构A2的化合物包含至少一个在糖残基中修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，该化合物在糖残基的2’位包含修饰。在一些实施方案中，2’位的修饰包括存在氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，该2’修饰包括烷氧基部分。在优选的实施方案中，烷氧基部分为甲氧基部分(也称为2’-O-甲基、2’OMe、2’-OCH3)。在一些实施方案中，核酸化合物在反义链和有义链的一者或两者中包含2’OMe糖修饰的交替核糖核苷酸。在其它实施方案中，化合物仅在反义链(N)x或N1-(N)x中包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，反义链的中间核糖核苷酸，如19-mer链中的第10位核糖核苷酸，为未修饰的。在多种实施方案中，核酸化合物包含至少5个交替的2’OMe糖修饰的和未修饰的核糖核苷酸。在另外的实施方案中，结构A1或结构A2的化合物在交替的位置中包含修饰的核糖核苷酸，其中(N)x或N1-(N)x的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中被修饰，而(N’)y或N2-(N)y的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中未修饰。

在一些实施方案中，双链分子包含以下修饰的一种或多种

a)从反义链的5’末端起的第5、6、7、8或9位的至少一个中的N选自2’5’核苷酸或镜像核苷酸；

b)从有义链的5’末端起的第9或10位的至少一个中的N’选自2’5’核苷酸和假尿苷；以及

c)(N’)y3’末端位置的4、5或6个连续位置中的N’包含2’5’核苷酸。

在一些实施方案中，双链分子包含以下修饰的组合

a)反义链在从5’末端起的第5、6、7、8或9位的至少一个中包含2’5’核苷酸或镜像核苷酸；以及

b)有义链在从5’末端起的第9或10位中包含2’5’核苷酸和假尿苷的至少一个。

在一些实施方案中，双链分子包含以下修饰的组合

c)有义链在3’倒数第二位或3’末端位置包含4、5或6个连续的2’5’核苷酸。

在一些实施方案中，有义链[(N)x或N1-(N)x]包含1、2、3、4、5、6、7、8或9个2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位包含2’OMe修饰的核糖核苷酸。在其它实施方案中，反义链在第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位包含2’OMe修饰的核糖核苷酸。在其它实施方案中，反义链在第3、5、7、9、11、13、15、17和19位包含2’OMe修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，反义链包含一个或多个2’OMe糖修饰的嘧啶。在一些实施方案中，反义链中的所有嘧啶核苷酸均为2’OMe糖修饰的。在一些实施方案中，有义链包含2’OMe糖修饰的嘧啶。

在结构A1和结构A2的一些实施方案中，有义链和反义链在3’末端和5’末端独立地磷酰化或未磷酰化。在结构A1和结构A2的一些实施方案中，有义链和反义链在3’和5’末端未磷酰化。在其它实施方案中，有义链和反义链在3’末端磷酰化。

在结构A1和结构A2的一些实施方案中，(N)y包含选自镜像核苷酸、2’5’核苷酸和TNA的至少一个非常规部分。在一些实施方案中，该非常规部分为镜像核苷酸。在多种实施方案中，该镜像核苷酸选自L-核糖核苷酸(L-RNA)和L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。在优选的实施方案中，该镜像核苷酸为L-DNA。在某些实施方案中，有义链在第9或10位(从5’末端起)包含非常规部分。在优选的实施方案中，有义链在第9位(从5’末端起)包含非常规部分。在一些实施方案中，有义链长度为19个核苷酸，并在第15位(从5’末端起)包含4、5或6个连续的非常规部分。在一些实施方案中，有义链在第15、16、17和18位包含4个连续的2’5’核糖核苷酸。在一些实施方案中，有义链在第15、16、17、18和19位包含5个连续的2’5’核糖核苷酸。在多种实施方案中，有义链进一步包含Z’。在一些实施方案中，Z’包括C3OH部分或C3Pi部分。

在结构A1的一些实施方案中，(N’)y包含至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y由第1-17位和第19位的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位(第18位)的一个L-DNA组成。在其它实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y由第1-16位和第19位的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位(第17和18位)的两个连续L-DNA组成。在多种实施方案中，非常规部分为通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键合接合到相邻核苷酸的核苷酸。根据多种实施方案，(N’)y在3′末端包含通过2’-5’核苷酸间键合连接的2、3、4、5或6个连续的核糖核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的3’末端的四个连续的核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合，其中形成2’-5’磷酸二酯键的2’-5’核苷酸的一个或多个进一步包含3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包含2’OMe糖修饰。在某些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第15、16、17、18和19位包含两个或更多个连续的核苷酸，其通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻的核苷酸(2’-5’核苷酸)。在多种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸(3’H或3’OMe替代3’OH)。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第15、16和17位包含2’-5’核苷酸，使得相邻的核苷酸通过第15-16、16-17和17-18位之间的2’-5’核苷酸间键连接；或在第15、16、17、18和19位包含2’-5’核苷酸，使得相邻的核苷酸通过第15-16、16-17、17-18和18-19位之间的2’-5’核苷酸间键连接，并且3’OH在3’末端核苷酸或第16、17和18位可用，使得相邻的核苷酸通过第16-17、17-18和18-19位之间的2’-5’核苷酸间键连接。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第16和17位或第17和18位或第15和17位包含2’-5’核苷酸，使得相邻的核苷酸分别通过第16-17和17-18位之间或第17-18和18-19位之间或第15-16和17-18位之间的2’-5’核苷酸间键连接。在其它实施方案中，(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸(rU、rC)被通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸取代。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合接合的五个连续核苷酸，具体地讲为第15-16、16-17、17-18和18-19位核苷酸之间的键合。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合接合的五个连续核苷酸，并任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3，1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。C3烷基帽共价连接到3’或5’末端核苷酸。在一些实施方案中，3’C3末端帽进一步包含3’磷酸酯。在一些实施方案中，3’C3末端帽进一步包含3’末端羟基。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第18位包含L-DNA；以及(N’)y任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3；1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。

在一些实施方案中，(N’)y包含3’末端磷酸酯(即，在3’末端磷酰化)。在一些实施方案中，(N’)y包含3’末端羟基。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19位或第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N)x包含2’OMe糖修饰的嘧啶。在一些实施方案中，(N)x中的所有嘧啶都包含2’OMe糖修饰。

在结构A2的一些实施方案中，x＝y＝18并且N2为核糖腺苷部分。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N2-(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合连接的五个连续核苷酸，具体地讲为第15-16、16-17、17-18和18-19位核苷酸之间的键合。在一些实施方案中，该键合包括磷酸二酯键。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N2-(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合接合的五个连续核苷酸，并任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3；1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N2-(N’)y在第18位包含L-DNA；以及(N’)y任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3，1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。在一些实施方案中，N2-(N’)y包含3’末端磷酸酯。在一些实施方案中，N2-(N’)y包含3’末端羟基。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19位或第1、3、5、9、11、13、15、17、19位或第3、5、9、11、13、15、17位或第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第11、13、15、17和19位(从5’末端起)包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19位或第3、5、7、9、11、13、15、17、19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x包含2’OMe糖修饰的嘧啶。在一些实施方案中，(N)x中的所有嘧啶都包含2’OMe糖修饰。在一些实施方案中，反义链进一步在第5、6或7位(5’＞3’)包含L-DNA或2’-5’核苷酸。在其它实施方案中，反义链进一步包含核糖核苷酸，其在第5-6或6-7位(5’＞3’)中的核糖核苷酸之间生成2’5’核苷酸间键合。

在另外的实施方案中，N1-(N)x进一步包含Z，其中Z包含非核苷酸突出。在一些实施方案中，非核苷酸突出为C3-C3[1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]2。

在结构A2的一些实施方案中，(N)y包含至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y由第1-16位和第18位的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位(第17位)的一个L-DNA组成。在其它实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y由第1-15位和第18位的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位(第16和17位)的两个连续L-DNA组成。在多种实施方案中，非常规部分为通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键合接合到相邻核苷酸的核苷酸。根据多种实施方案，(N’)y在3′末端包含通过2’-5’核苷酸间键合连接的2、3、4、5或6个连续的核糖核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的3’末端的四个连续的核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合，其中形成2’-5’磷酸二酯键的2’-5’核苷酸的一个或多个进一步包含3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包含2’OMe糖修饰。在某些实施方案中，x＝y＝18并且在(N’)y中第14、15、16、17和18位的两个或更多个连续核苷酸包括通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在多种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y包含通过第15-16、16-17和17-18位之间或第16-17和17-18位之间的2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且(N’)y包含通过第14-15、15-16、16-17和17-18位之间或第15-16、16-17和17-18位之间或第16-17和17-18位之间或第17-18位之间或第15-16和17-18位之间的2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在其它实施方案中，(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸(rU、rC)被通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸取代。

C3烷基部分可通过磷酸二酯键共价连接到(N’)y的3’末端和/或(N)x的3’末端。在一些实施方案中，烷基部分包含丙醇、丙基磷酸酯或丙基硫代磷酸酯。在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自丙醇、丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯、其组合或其多个，尤其是2或3个共价连接的丙醇、丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯或其组合。

在一些实施方案中，Z和Z’的每一个独立地选自丙基磷酸酯、丙基硫代磷酸酯、丙基磷-丙醇；丙基磷-丙基硫代磷酸酯；丙基磷-丙基磷酸酯；(丙基磷酸酯)3、(丙基磷酸酯)2-丙醇、(丙基磷酸酯)2-丙基硫代磷酸酯。任何丙烷或丙醇缀合部分都可包含在Z或Z’中。

在另外的实施方案中，Z和/或Z′的每一个包含脱碱基部分和未修饰脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合，或烃部分和未修饰脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的组合，或脱碱基部分(脱氧核糖或核糖)和烃部分的组合。在此类实施方案中，Z和/或Z’的每一个都包含C3Pi-rAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb或C3Pi-dAb。

根据某些实施方案，本发明提供siRNA化合物，其进一步包含一个或多个修饰的核糖核苷酸或非常规部分，其中修饰的核苷酸在糖部分、在碱基部分或在核苷酸间键合部分具有修饰。在一些实施方案中，N或N’的一个或多个包含2’OMe修饰的核糖核苷酸、2’5’或L-核苷酸。

在一些实施方案中，(N)x包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸在其糖上具有2’-O-甲基(2’OMe修饰的或2’OMe糖修饰的)，其中(N)x的3’末端的N为修饰的核糖核苷酸，(N)x从3’端开始包含至少五个交替的修饰核糖核苷酸，并总共包含至少九个修饰的核糖核苷酸，而其余的每个N为未修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，(N)x和(N’)_y的至少一者包含至少一个镜像核苷酸。在一些实施方案中，在(N’)y中，存在至少一个非常规部分，该非常规部分选自脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸以及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，N’的至少一个为镜像核苷酸。

在一些实施方案中，非常规部分为L-DNA镜像核苷酸。在另外的实施方案中，x＝y＝19并且在(N’)y中的第15、16、17或18位之一存在至少一个非常规部分。在一些实施方案中，该非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，在第17位、第18位或第17和18位存在L-DNA部分。

在一些实施方案中，非常规部分为通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在另外的实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y中第15-19或16-19或17-19位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y中第15-19或16-19或17-19或15-18或16-18位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻的核苷酸。

在一些实施方案中，(N)x包含九个交替的修饰核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x包含九个交替的修饰核糖核苷酸，而后者进一步在第2位包含2’OMe修饰核苷酸。在一些实施方案中，x＝19并且(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19奇数位包含2’OMe修饰核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x进一步在第2和18位之一或两者包含2’OMe修饰核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe修饰核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x中的至少一个嘧啶核苷酸包含2’OMe糖修饰。在一些实施方案中，(N)x中的所有嘧啶核苷酸都包含2’OMe糖修饰。在一些实施方案中，N(x)中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个嘧啶核苷酸包含2’OMe糖修饰。

在多种实施方案中，z”是存在的并选自脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖部分、反向的脱碱基核糖部分、C3部分、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。

在某些实施方案中，(N)x与靶序列完全互补。在其它实施方案中，(N)x与靶序列基本上互补。在一些实施方案中，(N)x包含与靶序列的一个错配。在优选的实施方案中，(N)x在(N)x的5’末端(即第1位)包含与靶序列的一个核苷酸错配。

在某些实施方案中，(N)x和(N’)y完全互补。在其它实施方案中，(N)x和(N’)y基本上互补。

在一些实施方案中，(N)x在第1位包含与靶序列的一个错配，并且(N)x和(N’)y完全互补。在一些实施方案中，(N)x在第1位包含与靶序列的一个核苷酸错配，并且(N’)y在第1位包含与(N)x的一个核苷酸错配。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且在(N)x中，第2-19位的十八个连续核苷酸与靶RNA中的十八个连续核苷酸互补，并且第1位的核苷酸与靶RNA序列错配。在多种实施方案中，(N)x中第1位的核苷酸被选自由下列组成的组的部分取代：核糖尿嘧啶、修饰的核糖尿嘧啶、脱氧核糖尿嘧啶、修饰的脱氧核糖尿嘧啶、假尿嘧啶、脱氧假尿嘧啶、脱氧核糖胸腺嘧啶、修饰的脱氧核糖胸腺嘧啶、核糖胞嘧啶、修饰的核糖胞嘧啶、脱氧核糖胞嘧啶、修饰的脱氧核糖胞嘧啶、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，(N)x中第1位的核苷酸被选自由下列组成的组的部分取代：核糖尿嘧啶、修饰的核糖尿嘧啶、脱氧核糖尿嘧啶、修饰的脱氧核糖尿嘧啶。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且在(N)x中第2-19位的18个连续核苷酸与靶RNA中的18个连续核苷酸互补，并且第1位的核苷酸与靶RNA序列错配，而(N’)y第19位的核苷酸与(N)x第1位的核苷酸互补。在其它实施方案中，x＝y＝19并且(N)x第1位的核苷酸与靶mRNA序列错配，并且(N’)y第19位的核苷酸与(N)x第1位的核苷酸错配。

本文所公开的双链核酸分子的优势在于：当与钝端或具有3’dTdT的分子相比时，它们表现出改善的稳定性和/或改善的活性和/或降低的脱靶效应和/或降低的免疫应答和/或增强的细胞摄取。

构想了其中x＝y＝21或其中x＝y＝23的其它实施方案。具有已知和将来的寡核苷酸对(有义和反义链)的结构(A1)和(A2)可用于哺乳动物或非哺乳动物(例如病毒、细菌、植物)基因。在一些实施方案中，哺乳动物基因为人基因。在多种实施方案中，人基因的mRNA在PCT专利公布No.WO2009/044392中示出。在另外的实施方案中，寡核苷酸对在PCT专利公布No.WO2009/044392中示出。在另外的实施方案中，结构(A1)或(A2)进一步包含PCT专利公布No.WO2009/044392中所示的修饰和基序。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含抑制人基因表达有效量的本发明的分子和药学上可接受的载体。

更具体地讲，本发明提供可用于治疗患有以下疾病的受试者的方法和组合物：急性肾衰竭(ARF)、听力损失、青光眼、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其它急性肺部和呼吸道损伤、器官移植(包括肺、肾脏、骨髓、心脏、胰腺、角膜或肝脏移植)中的损伤(如缺血-再灌注损伤)并包括移植功能延迟恢复(DGF)中毒性肾损害、脊髓损伤、褥疮、干眼综合征、口腔黏膜炎、缺血性眼神经病变和慢性阻塞性肺病(COPD)。

本发明的方法包括向受试者施用抑制基因表达的一种或多种siRNA化合物。本文所公开的新型结构当整合进针对任何靶基因的反义及相应的有义核酸序列时提供可用于降低该靶基因表达的siRNA化合物。靶基因为哺乳动物或非哺乳动物基因。

附图简述

图1A-1J显示了一些可能的3’烷基/烷基衍生物突出在通过磷酸二酯键共价连接到寡核苷酸链的3’末端核苷酸(DNA或RNA)时的化学结构。核苷酸部分上的B称为核苷酸“碱基”；在每种情况下R为H或OH任一者；图1A显示了通过磷酸二酯键合共价连接到丙醇部分的3’末端核苷酸；图1B显示了通过磷酸二酯键合共价连接到C3Pi部分的3’末端核苷酸；图1C显示了通过磷酸二酯键合共价连接到C3Pi-C3OH部分的3’末端核苷酸(C3通过磷酸二酯键共价连接到C3OH)；图1D显示了通过磷酸二酯键合共价连接到C3Pi-C3Pi部分的3’末端核苷酸；图1E显示了通过磷酸二酯键合共价连接到C3Pi-C3Pi-C3OH的3’末端核苷酸。图1F显示了通过磷酸二酯键合共价连接到C3Pi-C3Pi-C3Pi的3’末端核苷酸。图1G显示了通过磷酸二酯键合共价连接到C3Pi-rAb或C3Pi-dAb的3’末端核苷酸。图1H显示了通过磷酸二酯键合共价连接到rAb-C3Pi(R1＝OH)或dAb-C3Pi(R1＝H)的3’末端核苷酸。图1J显示了通过磷酸二酯键合共价连接到rAb-rAb(R1＝R2＝OH)或dAb-rAb(R1＝H、R2＝OH)或rAb-dAb(R1＝OH、R2＝H)或dAb-dAb(R1＝R2＝H)的3’末端核苷酸。

图2A-2F与图1A-1F相似，不同的是3’-末端非核苷酸突出被连接到核糖部分的2’位而不是3’-位。

图3A-3K示出了根据本发明实施方案的具有突出的3’-末端核苷酸的一些具体实例，在一些情况下，其中连接到磷的氧原子已被硫替代。

图4提供了以下两种双链分子的稳定性数据：为钝端19-mer双链体的S505(实施例表3中的化合物5)，以及为包含非核苷酸C3C33’末端突出的19-mer双链体的S800(C3Pi-C3OH，实施例中表3中的化合物7)。这两种化合物在细胞提取物中核酸酶稳定至少36个小时，但是S800具有约0.17nM的IC50值而S505具有1.1nM的IC50值。用于生成这两种化合物的序列如SEQIDNO：1和2(分别为有义链和反义链)所示。

发明详述

本发明涉及双链siRNA化合物，其包含共价连接在有义链和反义链之一或两者的3’末端的至少一个非核苷酸部分。非核苷酸部分选自脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烷基部分或其衍生物以及无机磷酸酯。

结构设计

在一个方面，本文提供的是包含有义链和反义链的双链核酸分子，其中至少一条链包含共价连接在3’末端的1、2、3、4或5个非核苷酸部分；其中非核苷酸部分选自烷基(烃)部分或其衍生物和基于磷酸酯的部分。在某些优选的实施方案中，非核苷酸部分包括烷基部分或烷基衍生物部分。在一些实施方案中，所述至少一条链为反义链。在优选的实施方案中，反义链包含共价连接在3’末端的两个非核苷酸部分，包括C3-C3、C3-C3-Pi、C3-C3-Ps、idAb-idAb。

在一些实施方案中，提供了具有结构(A1)的双链核酸分子：

(A1)5’(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)

其中N和N’的每一个均为可未修饰或修饰的核苷酸，或非常规部分；

其中x和y的每一个独立地为18与40之间的整数；

(A2)5’N1-(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)

其中N2、N和N’的每一个为未修饰的或修饰的核糖核苷酸，或非常规部分；

其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；

在一些实施方案中，x＝y＝18、x＝y＝19或x＝y＝20。在优选的实施方案中，x＝y＝18。当N1-(N)x中x＝18时，N1是指第1位，而第2-19位包含在(N)1818中。当N2-(N’)y中y＝18时，N2是指第19位，而第1-18位包含在(N’)18中。

在一些实施方案中，反义链第1位的尿苷被选自腺苷、脱氧腺苷、脱氧尿苷(dU)、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多种实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，反义链第1位的鸟苷被选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多种实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，反义链第1位的胞苷被选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多种实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，反义链第1位的腺苷被选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在多种实施方案中，N1选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。

在一些实施方案中，N1和N2在尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间形成碱基对。在其它实施方案中，N1和N2在脱氧尿苷和腺苷之间形成碱基对。

在某些实施方案中，反义链的第1位(5’末端)包含脱氧核糖尿苷(dU)或腺苷。在一些实施方案中，N1选自由下列组成的组：核糖腺苷、修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷、修饰的脱氧核糖腺苷，而N2选自由下列组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、修饰的核糖尿苷和修饰的脱氧核糖尿苷。在某些实施方案中，N1选自由下列组成的组：核糖腺苷和修饰的核糖腺苷，而N2选自由下列组成的组：核糖尿苷和修饰的核糖尿苷。

在某些实施方案中，N1选自由下列组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、修饰的核糖尿苷和修饰的脱氧核糖尿苷，而N2选自由下列组成的组：核糖腺苷、修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷、修饰的脱氧核糖腺苷。在某些实施方案中，N1选自由下列组成的组：核糖尿苷和脱氧核糖尿苷，而N2选自由下列组成的组：核糖腺苷和修饰的核糖腺苷。在某些实施方案中，N1为核糖尿苷而N2为核糖腺苷。在某些实施方案中，N1为脱氧核糖尿苷而N2为核糖腺苷。

在结构(A2)的一些实施方案中，N1包含2’OMe糖修饰的核糖尿嘧啶或2’OMe糖修饰的核糖腺苷。在结构(A2)的某些实施方案中，N2包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。

在结构(A2)的一些实施方案中，N1包含2’OMe糖修饰的核糖尿嘧啶或2’OMe糖修饰的核糖胞嘧啶。在结构(A2)的某些实施方案中，N2包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个独立地包含C2、C3、C4、C5或C6烷基部分，任选地为C3[丙烷，-(CH2)₃-]部分或其衍生物，例如丙醇(C3-OH)、丙二醇或丙二醇的磷酸二酯衍生物(″C3Pi″)。在优选的实施方案中，Z和/或Z′的每一个包括两个烃部分，并且在一些实例中为C3-C3。每个C3通过共价键优选基于磷的键共价缀合到相邻的C3。在一些实施方案中，基于磷的键为硫代磷酸酯、磷酰乙酸酯或磷酸二酯键。

在一些实施方案中，双链分子包含以下修饰的一种或多种

a)从反义链的5’末端起的第5、6、7、8或9位至少一个中的N选自2’5’核苷酸或镜像核苷酸；

c)(N’)y的3’末端位置的4、5或6个连续位置中的N’包含2’5’核苷酸。

在一些实施方案中，双链分子包含以下修饰的组合

a)反义链在从5’末端起的第5、6、7、8或9位至少一个中包含2’5’核苷酸或镜像核苷酸；以及

在一些实施方案中，双链分子包含以下修饰的组合

在结构A1和结构A2的一些实施方案中，有义链和反义链在3’末端和5’末端被独立地磷酰化或未磷酰化。在结构A1和结构A2的一些实施方案中，有义链和反义链在3’和5’末端未磷酰化。在其它实施方案中，有义链和反义链在3’末端磷酰化。

在结构A1的一些实施方案中，(N’)y包含至少一个L-DNA部分。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y由第1-17位和第19位的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位(第18位)的一个L-DNA组成。在其它实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y由第1-16位和第19位的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位(第17和18位)的两个连续L-DNA组成。在多种实施方案中，非常规部分为通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键合接合到相邻核苷酸的核苷酸。根据多种实施方案，(N’)y在3′末端包含通过2’-5’核苷酸间键合连接的2、3、4、5或6个连续的核糖核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的3’末端的四个连续核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合，其中形成2’-5’磷酸二酯键的2’-5’核苷酸的一个或多个进一步包含3’-O-甲基(3’OMe)糖修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包含2’OMe糖修饰。在某些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第15、16、17、18和19位包含两个或更多个连续的核苷酸，其通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻的核苷酸(2’-5’核苷酸)。在多种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸(3’H或3’OMe替代3’OH)。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第15、16和17位包含2’-5’核苷酸，使得相邻的核苷酸通过第15-16、16-17和17-18位之间的2’-5’核苷酸间键连接；或在第15、16、17、18和19位包含2’-5’核苷酸，使得相邻的核苷酸通过第15-16、16-17、17-18和18-19位之间的2’-5’核苷酸间键连接，并且3’OH在3’末端核苷酸或第16、17和18位可用，使得相邻的核苷酸通过第16-17、17-18和18-19位之间的2’-5’核苷酸间键连接。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第16和17位或第17和18位或第15和17位包含2’-5’核苷酸，使得相邻的核苷酸分别通过第16-17和17-18位之间或第17-18和18-19位之间或第15-16和17-18位之间的2’-5’核苷酸间键连接。在其它实施方案中，(N’)y中的嘧啶核糖核苷酸(rU、rC)被通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸取代。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合接合的五个连续核苷酸，具体地讲为第15-16、16-17、17-18和18-19位核苷酸之间的键合。

在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y在第18位包含L-DNA；以及(N’)y任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3，1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。

在结构A2的一些实施方案中，x＝y＝18并且N2为核糖腺苷部分。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N2-(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合接合的五个核苷酸，具体地讲为第15-16、16-17、17-18和18-19位核苷酸之间的键合。在一些实施方案中，该键合包括磷酸二酯键。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N2-(N’)y在3’末端包含通过四个2’-5’键合接合的五个连续核苷酸，并任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3，1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N2-(N’)y在第18位包含L-DNA；以及(N’)y任选地进一步包含独立地选自反向的脱碱基部分和C3烷基[C3，1，3-丙二醇单(磷酸二氢酯)]帽的Z’和z’。在一些实施方案中，N2-(N’)y包含3’末端磷酸酯。在一些实施方案中，N2-(N’)y包含3’末端羟基。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19位或第1、3、5、9、11、13、15、17、19位或第3、5、9、11、13、15、17位或第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第11、13、15、17和19位(从5’末端起)包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19位或第3、5、7、9、11、13、15、17、19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝18并且N1-(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe，糖修饰的核糖核苷酸。

在结构A1和结构A2的一些实施方案中，每个N都由未修饰的核糖核苷酸组成。在结构A1和结构A2的一些实施方案中，每个N’都由未修饰的核苷酸组成。在优选的实施方案，N和N’的至少一者为修饰的核糖核苷酸或非常规部分。

在其它实施方案中，结构A1或结构A2的分子包含至少一个在糖残基中修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，该化合物在糖残基的2’位包含修饰。在一些实施方案中，2’位的修饰包括存在氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，该2’修饰包括烷氧基部分。在优选的实施方案中，烷氧基部分为甲氧基部分(也称为2’-O-甲基、2’OMe、2’-OCH3)。在一些实施方案中，核酸化合物在反义链和有义链的一者或两者中包含2’OMe糖修饰的交替核糖核苷酸。在其它实施方案中，化合物仅在反义链(N)x或N1-(N)x中包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，反义链的中间核糖核苷酸，如19-mer链中的第10位核糖核苷酸，为未修饰的。在多种实施方案中，核酸化合物包含至少5个交替的2’OMe糖修饰的和未修饰的核糖核苷酸。

在另外的实施方案中，结构A1或结构A2的化合物在交替的位置中包含修饰的核糖核苷酸，其中(N)x或N1-(N)x的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中被修饰，而(N’)y或N2-(N)y的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中未修饰。

在一些实施方案中，(N)x或N1-(N)x包含在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x(N)x或N1-(N)x包含在第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位的2’OMe修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x或N1-(N)x包含2’OMe修饰的嘧啶。在一些实施方案中，(N)x或N1-(N)x中所有嘧啶核苷酸都为2’OMe修饰的。在一些实施方案中，(N’)y或N2-(N’)y包含2’OMe修饰的嘧啶。在另外的实施方案中，结构A1或结构A2的化合物在交替的位置中包含修饰的核糖核苷酸，其中(N)x或N1-(N)x的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中被修饰，而(N’)y或N2-(N)y的5’和3’末端的每个核糖核苷酸在其糖残基中未修饰。

本文所公开的核酸分子可在一端具有钝端，例如当Z和z”不存在或其中Z’不存在时。核酸分子可被可位于沿着有义链或反义链任一条链的任何位置的修饰核苷酸或非常规部分修饰。核酸分子可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个修饰的核苷酸。核酸分子可包含约1、2、3、4、5、6、7或8个非常规部分。核酸分子可包含一组约1、2、3、4、5、6、7或8个，优选1、2、3或4个连续的修饰核苷酸或非常规部分。修饰的核酸可仅存在于有义链、仅存在于反义链或存在于有义链和反义链两者。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括2’糖修饰的核苷酸，包括2’O-甲基修饰的核苷酸、2’脱氧氟代修饰的核苷酸、2’-氨基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，非常规部分包括镜像核苷酸(即L-DNA或L-RNA)或能够形成2’-5’键合的核苷酸(2’5’核苷酸)。

如本文所用，术语“双链体区域”是指双链分子中两个互补或基本上互补的寡核苷酸通常通过Watson-Crick碱基配对或通过任何其它允许形成双链体的方式彼此形成碱基对的区域。例如，具有19个核苷酸单元的寡核苷酸可与19个核苷酸单元的互补寡核苷酸碱基配对，或者可与每条链上的15、16、17或18个碱基配对，使得“双链体区域”由15、16、17或18个碱基对组成。其余的碱基对可例如作为5’和3’突出存在。此外，在双链体区域内，不需要100％的互补性；基本上互补在双链体区域内是允许的。突出区域可由核苷酸或非核苷酸部分组成。如本文所公开，至少一个突出区域由一个或多个非核苷酸部分组成。

通用非限制性核酸分子模式如下所示，其中N'＝双链体区域中的有义链核苷酸；z”＝共价连接在有义链的5’末端的5’-加帽部分；C3＝3个碳的非核苷酸部分；N＝双链体区域中的反义链核苷酸；idB＝反向的脱碱基脱氧核糖核苷酸非核苷酸部分。每个N、N’独立地为修饰的或未修饰的或非常规的部分。有义链和反义链的长度各自独立地为18-40个核苷酸。下面提供的实例具有19个核苷酸的双链体区域；然而，本文所公开的核酸分子可具有介于18和40个核苷酸之间的任何值的双链体区域，并且其中每条链的长度独立地介于18和40个核苷酸之间。在每个双链体中，反义链(N)x均显示在上面。在一些实施方案中，双链核酸分子具有以下结构：

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′PiC3-PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′PiC3-PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3pi-C3Pi

3′PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′HOC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′HOC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-aB-aB

3′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-aB-aB

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-idB-idB

3′aB-aB-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-aB-aB

3′aB-aB-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

3′PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Pi

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

3′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

3′ROC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

3′ROC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Ps

3′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Ps

3′OHC3-PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3Ps

3′OHC3-PiC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″

在一些优选的实施方案中，本文所公开的核酸分子具有以下结构：

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

或

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

3′iPC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-Z″

其中N和N’独立地为可未修饰的或修饰的核糖核苷酸，或为非常规部分；

其中每个N通过共价键连接到相邻的N；

其中每个N’通过共价键连接到相邻的N’；并且

其中z”为共价连接到有义链5’末端的加帽部分。术语″aB″是指可为核糖脱碱基部分或脱氧核糖脱碱基部分或反向的核糖脱碱基部分或反向的脱氧核糖脱碱基部分的脱碱基部分。

在一些实施方案中，本文所公开的核酸分子包含Z。在其它实施方案中，本文所公开的核酸分子包含Z′。在另外的实施方案中，Z和Z′都存在。在一些实施方案中，Z和Z′都存在且相同。在另外的实施方案中，Z和Z′都存在且不同。在一些实施方案中，Z和Z′独立地包含1或2个非核苷酸部分。在一些实施方案中，Z和Z′独立地包含2个非核苷酸部分。

在一些实施方案中，Z是存在的，并包含一个或多个选自下列的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烷基部分或其衍生物以及无机磷酸酯部分。

在另外的实施方案中，Z′是存在的并包含一个或多个选自下列的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烷基部分或其衍生物或无机磷酸酯部分。

在另外的实施方案中，Z和/或Z′是存在的并独立地包含一个或多个核苷酸和一个或多个选自本文所公开的部分的非核苷酸部分的组合。

在一些实施方案中，Z和Z′的每一个都包含脱碱基部分，任选地为脱氧核糖脱碱基(本文中称为″dAb″)或核糖脱碱基(本文中称为″rAb″)核苷酸。在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个为dAb-dAb或rAb-rAb。

在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个独立地包含烷基部分，任选地为丙二醇的磷酸二酯衍生物((CH2)3-Pi，本文中也称为″C3Pi″)修饰的部分。在一些实施方案中，Z和/或Z′为C3Pi-C3Pi。在具体的实施方案中，x＝y＝19并且Z包含两个丙二醇衍生物C3-C3(即-C3-Pi-C3-Pi)。在多种实施方案中，C3部分通过磷酸二酯键共价连接到有义或反义链的3’末端。

在另外的实施方案中，Z和/或Z′包含一个或多个脱碱基部分和未修饰的核苷酸的组合或一个或多个烃部分和未修饰的核苷酸的组合或一个或多个脱碱基和烃部分的组合。在此类实施方案中，Z和/或Z’任选地为C3-rAb或C3-dAb。

在涉及结构A1或A2的另外的实施方案中，核酸分子在反义链第2、4、6、8、11、13、15、17和19位的核糖核苷酸的糖上进一步包含2′O-Me修饰。在另外的实施方案中，化合物还在有义链的第18位包含L-DNA核苷酸。在另外的实施方案中，化合物包含通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在另外的实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y中第15-19或16-19或17-19位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻的核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y中第15-19或16-19或17-19位或15-18或16-18位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻的核苷酸。

根据某些实施方案，本发明提供siRNA化合物，其进一步包含一个或多个修饰的核苷酸，其中该修饰的核苷酸在糖部分、在碱基部分或在核苷酸间键合部分具有修饰。

在一些实施方案中，(N)x包含修饰的和未修饰的核糖核苷酸，每个修饰的核糖核苷酸在其糖上具有2’-O-甲基，其中(N)x的3’末端的N为修饰的核糖核苷酸，(N)x从3’端开始包含至少五个交替的修饰核糖核苷酸，并总共包含至少九个修饰的核糖核苷酸，并且其余的每个N为未修饰的核糖核苷酸。

在一些实施方案中，(N)x和(N’)y的至少一者包含至少一个镜像核苷酸。在一些实施方案中，在(N’)y中，存在至少一个非常规部分，该非常规部分可为脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸以及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸或本文所公开的任何其它非常规部分。

在一些实施方案中，非常规部分为L-DNA镜像核苷酸；在另外的实施方案中，在(N’)y的第15、16、17或18位存在至少一个非常规部分。在一些实施方案中，该非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分和脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中，该非常规部分为镜像核苷酸，优选L-DNA部分。在一些实施方案中，在第17位、第18位或第17和18位存在L-DNA部分。

在其它实施方案中，(N’)y包含至少五个脱碱基核糖部分或脱碱基脱氧核糖部分，并且N’的至少一个为LNA。

在一些实施方案中，(N)x包含九个交替的修饰核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x包含九个交替的修饰核糖核苷酸，而后者进一步在第2位包含2’修饰核苷酸。在一些实施方案中，(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19奇数位包含2’OMe修饰核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x进一步在第2和18位之一或两者包含2’OMe修饰核糖核苷酸。在其它实施方案中，(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、17、19位包含2’OMe修饰核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x中的至少一个嘧啶核苷酸包含2’OMe糖修饰。在一些实施方案中，(N)x中的所有嘧啶核苷酸都包含2’OMe糖修饰。在一些实施方案中，N(x)中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个嘧啶核苷酸包含2’OMe糖修饰。

在多种实施方案中，z”是存在的并选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、反向的脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。

在核酸分子的一个实施方案中，(N’)y在(N’)y的5’和3’末端任一者或两者包含至少两个通过2’-5’磷酸二酯键接合的核苷酸。在某些实施方案中，x＝y＝19；在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以便在其糖上具有2’-O-甲基，而位于(N)x中间的核糖核苷酸未修饰；并且(N’)y的3’末端的三个核苷酸通过两个2’-5’磷酸二酯键接合。在其它实施方案中，x＝y＝19；在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以便在其糖上具有2’-O-甲基，而位于(N)x中间的核糖核苷酸未修饰；并且(N’)y的5’末端的四个连续核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合。在另外的实施方案中，位于(N)y中间位置的另外核苷酸可在其糖上被2’-O-甲基修饰。在另一个实施方案中，在(N)x中，核苷酸在2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸与未修饰的核糖核苷酸之间交替，以及在(N’)y中，5’末端的四个连续核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合，并且5’末端核苷酸或5’末端的两个或三个连续核苷酸包含3’-O-Me糖修饰。

在结构(A1)的某些实施方案中，x＝y＝19并且在(N’)y中至少一个位置的核苷酸包括镜像核苷酸、脱氧核糖核苷酸和通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸；

在结构(A1)的某些实施方案中，x＝y＝19并且(N’)y包含镜像核苷酸。在多种实施方案中，镜像核苷酸为L-DNA核苷酸。在某些实施方案中，L-DNA为L-脱氧核糖胞苷。在一些实施方案中，(N’)y在第18位包含L-DNA。在其它实施方案中，(N’)y在第17和18位包含L-DNA。在某些实施方案中，(N’)y在第2位以及在第17和18位之一或两者包含L-DNA取代。构想了其中x＝y＝21或其中x＝y＝23的结构(A1)的其它实施方案；在这些实施方案中，上述(N’)y修饰不是在第15、16、17、18位，而是对于21mer，在第17、18、19、20位；并且对于23mer，在第19、20、21、22位；类似地，在第17和18位之一或两者的修饰对于21mer在第19或20位之一或两者，对于23mer在第21和22位之一或两者。将19mer中的所有修饰针对21和23mer类似地进行调整。

根据结构A1或A2的多种实施方案，在(N’)y或N2-(N’)y的3′末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸通过2’-5’核苷酸间键合连接。在一个实施方案中，(N’)y的3’末端的四个连续核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合，其中形成2’-5’磷酸二酯键的2’-5’核苷酸的一个或多个进一步包含3’-O-甲基糖修饰。优选地，(N’)y的3’末端核苷酸包含2’-O-甲基糖修饰。在结构(A1)的某些实施方案中，x＝y＝19并且在(N’)y中第15、16、17、18和19位的两个或更多个连续核苷酸包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在多种实施方案中，形成2’-5’核苷酸间键的核苷酸包括3’脱氧核糖核苷酸或3’甲氧基核苷酸。在一些实施方案中，在(N’)y中第17和18位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间键接合。在其它实施方案中，在(N’)y中第16、17、18、16-17、17-18或16-18位的核苷酸通过2’-5’核苷酸间键接合。

在某些实施方案中，(N’)y包含第2位的L-DNA以及第16、17、18、16-17、17-18或16-18位的2’-5’核苷酸间键。在某些实施方案中，(N’)y包含第16、17、18、16-17、17-18或16-18位的2’-5’核苷酸间键以及5’端帽核苷酸。

在核酸分子的一个实施方案中，(N’)y的3’末端核苷酸或3’末端的两个或三个连续核苷酸为L-脱氧核糖核苷酸。

在核酸分子的其它实施方案中，在(N’)y中，任一末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或5’和3′末端每一个的2-8个修饰核苷酸独立地为2’糖修饰的核苷酸。在一些实施方案中，2’糖修饰包括存在氨基、氟、烷氧基或烷基部分。在某些实施方案中，2’糖修饰包括甲氧基部分(2’-OMe)。

在一个实施方案中，(N’)y的5’末端的三个、四个或五个连续核苷酸包含2’-OMe修饰。在另一个实施方案中，(N’)y的3’末端的三个连续核苷酸包含2’-O-Me糖修饰。

在结构A1或A2的一些实施方案中，在(N’)y或N2-(N’)y中，任一末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核糖核苷酸或5’和3′末端每一个的2-8个修饰核苷酸独立地为双环核苷酸。在多种实施方案中，双环核苷酸为锁核酸(LNA)。2′-O，4′-C-乙烯桥核酸(ENA)是一种LNA(见下)。

在多种实施方案中，(N’)y或N2-(N’)y在5’末端或在3’和5’末端两者包含修饰的核苷酸。

在结构A1或A2的一些实施方案中，在(N’)y的5’和3’末端任一者或两者的至少两个核苷酸通过P-乙氧基主链修饰接合。在某些实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝23；在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以便在其糖上具有2’-O-甲基，而位于(N)x中间位置的核糖核苷酸未修饰；并且在(N’)y的3’末端或5’末端的四个连续核苷酸通过三个P-乙氧基主链修饰接合。在另一个实施方案中，在(N’)y的3’末端或5’末端的三个连续核苷酸通过两个P-乙氧基主链修饰接合。

在结构A1或A2的一些实施方案中，在(N’)y或N2-(N’)y中，在5’和3′末端每一个的2、3、4、5、6、7或8个连续核糖核苷酸独立地为镜像核苷酸、通过2’-5’磷酸二酯键接合的核苷酸、2’糖修饰的核苷酸或双环核苷酸。在一个实施方案中，(N’)y的5’和3’末端的修饰相同。在一个实施方案中，(N’)y的5’末端的四个连续核苷酸通过三个2’-5’磷酸二酯键接合，而(N’)y的3’末端的三个连续核苷酸通过两个2’-5’磷酸二酯键接合。在另一个实施方案中，(N’)y的5’末端的修饰与(N’)y的3’末端的修饰不同。在一个实施方案中，(N’)y的5’末端的修饰核苷酸为镜像核苷酸，并且(N’)y的3’末端的修饰核苷酸通过2’-5’磷酸二酯键接合。在另一个具体的实施方案中，(N’)y的5’末端的三个连续核苷酸为LNA核苷酸，并且(N’)y的3’末端的三个连续核苷酸通过两个2’-5’磷酸二酯键接合。在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以便在其糖上具有2’-O-甲基，而位于(N)x中间的核糖核苷酸未修饰，或(N)x中的核糖核苷酸未修饰。

在结构A1的另一个实施方案中，本发明提供其中x＝y＝19的化合物；在(N)x中，核苷酸在修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸之间交替，每个修饰的核糖核苷酸被修饰以便在其糖上具有2’-O-甲基，而位于(N)x中间的核糖核苷酸未修饰；(N’)y的3’末端的三个核苷酸通过两个2’-5’磷酸二酯键接合，并且(N’)y的5’末端的三个核苷酸为LNA，诸如ENA；以及Z和/或Z′独立地包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分和无机磷酸酯，或一个或多个非核苷酸部分和一个或多个核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z选自C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3OH、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、dAb-dAb和rAb-rAb。

在另一个实施方案中，(N’)y或N2-(N’)y的5’末端的五个连续核苷酸包含2’-O-甲基糖修饰，并且(N’)y的3’末端的两个连续核苷酸为L-DNA。

根据其它实施方案，在N’)y或N2-(N’)y中，5’或3’末端核苷酸或者任一末端的2、3、4、5或6个连续核苷酸或者5’和3’末端每一个的1-4个修饰核苷酸独立地为膦酰羧酸酯或膦基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施方案中，PACE核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，在N’)y或N2-(N’)y中，5’和3′末端每一个的1或2个连续核苷酸为PACE核苷酸。PACE核苷酸及类似物的实例在均以引用方式并入的美国专利No.6,693,187和7,067,641中有所公开。

在结构(A1)的一个实施方案中，x＝y＝19；(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，其中3’末端的两个连续核苷酸通过一个2′-5′核苷酸间键合连接；(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，其中5’末端的两个连续核苷酸通过一个2′-5′核苷酸间键合连接；以及Z和/或Z′独立地包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分和无机磷酸酯，或一个或多个非核苷酸部分和一个或多个核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z选自C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、dAb-dAb和rAb-rAb，每个C3、rAb、dAb通过基于磷的键共价连接到相邻的C3Pi、rAb、dAb。在一些实施方案中，基于磷的键为磷酸二酯键或磷硫代磷酸酯(phosphorothiophosphate)键。

在一些实施方案中，x＝y＝19；(N)x包含未修饰的核糖核苷酸，其中3’末端的三个连续核苷酸通过两个2′-5′磷酸二酯键接合到一起；(N’)y包含未修饰的核糖核苷酸，其中5’末端的四个连续核苷酸通过三个2′-5′磷酸二酯键接合到一起；以及Z和/或Z′独立地包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分和无机磷酸酯，或一个或多个非核苷酸部分和一个或多个核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z选自C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、dAb-dAb和rAb-rAb，其中每个C3Pi、rAb、dAb通过基于磷的键共价连接到相邻的C3Pi、rAb、dAb。在一些实施方案中，基于磷的键为磷酸二酯键或磷硫代磷酸酯键。

根据结构A1或A2的一个实施方案，(N’)y或(N’)y-N2的5’末端的四个连续核苷酸分别通过三个2’-5’磷酸二酯键接合；(N’)x的3’末端的三个连续核苷酸通过两个2’-5’磷酸二酯键接合；以及Z和/或Z′独立地包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分和无机磷酸酯，或一个或多个非核苷酸部分和一个或多个核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z选自C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3-dAb、dAb-dAb和rAb-rAb。(N’)y的5’末端的三个核苷酸和(N’)x的3’末端的两个核苷酸也可包含3’-O-Me糖修饰。

在结构A1或A2的一个实施方案中，(N’)y或(N’)y-N2的5’末端的五个连续核苷酸分别包含2’-O-Me糖修饰，以及(N’)x的3’末端的五个连续核苷酸包含2’-O-Me糖修饰。在另一个实施方案中，(N’)y的5’末端的十个连续核苷酸包含2’-O-Me糖修饰，并且(N’)x的3’末端的五个连续核苷酸包含2’-O-Me糖修饰。在另一个实施方案中，(N’)y的5’末端的十三个连续核苷酸包含2’-O-Me糖修饰；(N’)x的3’末端的五个连续核苷酸包含2’-O-Me糖修饰；以及Z和/或Z′独立地包含一个或多个选自由下列组成的组的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分和无机磷酸酯，或一个或多个非核苷酸部分和一个或多个核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z选自C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、dAb-dAb和rAb-rAb。

在具体的实施方案中，(N’)y或(N’)y-N2的5’末端的五个连续核苷酸分别包含2’-O-Me糖修饰，并且(N’)y的3’末端的两个连续核苷酸为L-DNA。此外，该化合物可进一步包含(N’)x的3’末端的五个连续2’-O-甲基修饰的核苷酸，并且Z和/或Z′可独立地包含一个或多个非核苷酸部分，其选自由下列组成的组：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分和无机磷酸酯，或一个或多个非核苷酸部分与一个或多个核苷酸的组合。在一些实施方案中，Z选自C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、dAb-dAb和rAb-rAb。

在结构A1或A2的多种实施方案中，(N)x中的修饰核苷酸与(N’)y中的修饰核苷酸不同。例如，(N)x中的修饰核苷酸为2’糖修饰的核苷酸，而(N’)y中的修饰核苷酸为通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸为镜像核苷酸，而(N’)y中的修饰核苷酸为通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸。在另一个实例中，(N)x中的修饰核苷酸为通过2’-5’核苷酸间键合连接的核苷酸，而(N’)y中的修饰核苷酸为镜像核苷酸。

在一些实施方案中，本文提供的是具有如下所示结构的化合物：

(X1)5’(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)

其中N和N’的每一个为可未修饰的或修饰的核糖核苷酸，或为非常规部分；

其中Z由两个非核苷酸部分或非核苷酸部分与核苷酸的组合组成；

其中Z’可以存在或不存在，但当存在时包含一个非核苷酸部分；

其中z”可以存在或不存在，但当存在时，为共价连接在(N’)y的5’末端的加帽部分；

其中x和y的每一个独立地为18至27的整数；

其中(N′)y在3′末端或3’倒数第二位包含至少一个镜像核苷酸；并且

其中(N)x的序列包含哺乳动物基因的反义序列。

在一些实施方案中，x＝y＝19。

在一些实施方案中，镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA部分。在一些实施方案中，镜像核苷酸为L-DNA部分。在一些实施方案中，Z或Z′是存在的并包含脱碱基部分或烃部分或它们的组合。在一些实施方案中，Z’不存在，Z存在并包含疏水部分。

在一些实施方案中，镜像核苷酸选自L-DNA和L-RNA部分。在一些实施方案中，镜像核苷酸为L-DNA部分。

在一些实施方案中，N′(y)在3′末端包含两个或3个镜像核苷酸，而N(x)在3′末端任选地包含至少一个镜像核苷酸。

在一些实施方案中，N′(y)在3′倒数第二位包含两个镜像核苷酸。在一些实施方案中，N(x)在3′倒数第二位包含一个或两个镜像核苷酸，而N′(y)在5′倒数第二位任选地包含一个或两个镜像核苷酸。在一些实施方案中，(N′)y在5′末端或5’倒数第二位包含一个镜像核苷酸。

在一些实施方案中，(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含与未修饰的核糖核苷酸交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N)x在第(5’＞3’)3、5和11、13、15、17和19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x在第6或7位进一步包含镜像核苷酸或2’5’核苷酸。

在一些实施方案中，(N)x的序列与(N’)y的序列具有互补性；以及(N’)y的序列与靶基因编码的mRNA内的序列具有同一性。

在另一个实施方案中，本文提供的是具有如下所示结构的化合物：

(X2)5’(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)

其中x和y的每一个独立地为18至27的整数；

其中(N′)y包含至少一个或多个2’OMe修饰的嘧啶并且

其中(N)x的序列包含哺乳动物基因的反义序列。

在一些实施方案中，x＝y＝19。

在一些实施方案中，Z或Z′任一者是存在的。在一些实施方案中，Z和Z′均存在。在一些实施方案中，Z’不存在，Z存在并包含疏水部分。

(X3)5’(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)

其中x和y的每一个独立地为18至27的整数；

其中(N′)y包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的至少一个核苷酸；并且

其中(N)x的序列包含哺乳动物基因的反义序列。

在一些实施方案中，x＝y＝19。

在一些实施方案中，N′(y)包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。

在一些实施方案中，Z或Z′是存在的并包含脱碱基部分或烃部分或它们的组合。在一些实施方案中，Z’不存在，Z存在并包含疏水部分。

在一些实施方案中，N′(y)在3’末端包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。在一些实施方案中，N′(y)在3’倒数第二位包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的2、3、4、5、6、7或8个核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且N′(y)在3’末端包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的2、3、4或5个核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且N′(y)在3’末端包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的5个核苷酸，即在第15、16、17、18和19位(5’＞3’)。在一些实施方案中，(N)x包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含2’OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x包含与未修饰的核糖核苷酸交替的2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，x＝y＝19并且(N)x在第(5’＞3’)3、5和11、13、15、17和19位包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N)x在第6或7位进一步包含镜像核苷酸或2’5’核苷酸。

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

3′HOC3-N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′N′-z″或

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

其中每个N通过共价键连接到相邻的N；

其中每个N’通过共价键连接到相邻的N’；

其中1至10个N为2’-OMe糖修饰的核糖核苷酸；

其中第5、6、7、8或9位(5’＞3’)的N为2’5核苷酸或镜像核苷酸；

其中第15-19位(5’＞3’)的N’为2’5’核糖核苷酸；

其中z”为共价连接到有义链5’末端的加帽部分。

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

或

5′NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-C3Pi-C3OH

其中每个N通过共价键连接到相邻的N；

其中每个N’通过共价键连接到相邻的N’；

其中1至10个N为2’-OMe糖修饰的核糖核苷酸；

其中N’包含一个或多个2’-OMe糖修饰的嘧啶核糖核苷酸；

其中第9或10位(5’＞3’)的N为2’5核苷酸；并且

其中z”为共价连接到有义链5’末端的加帽部分。

在结构(X1-X3)的一些实施方案中，有义链或反义链任一者或反义链和有义链两者在3′末端包含一个或两个无机磷酸酯部分。

在结构(X1-X3)的一些实施方案中，在(N)x中，3′末端的N为修饰的核糖核苷酸，并且(N)x包含至少8个修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸包括2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。在其它实施方案中，所述至少8个修饰的核糖核苷酸中的至少5个从在3′端开始交替。

在结构(X1-X3)的多种实施方案中，z”是存在的并选自脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、反向的脱碱基核糖部分、脱氧核糖部分、C6-氨基-Pi、镜像核苷酸。

在结构(X1-X3)的多种实施方案中，在(N’)y中，存在至少一个附加的非常规部分，该非常规部分可以为脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、修饰或未修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对核苷酸类似物或通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中，(N)x和(N’)y在3’和5’末端均不磷酰化。在其它实施方案中，(N)x和(N’)y任一者或两者在3’末端磷酰化。在另一个实施方案中，(N)x和(N’)y任一者或两者在3’末端使用不可裂解的磷酸酯基团磷酰化。在另一个实施方案中，(N)x和(N’)y任一者或两者在2’末端位置使用可裂解的或不可裂解的磷酸酯基团磷酰化。

在所有上述结构的某些实施方案中，Z是存在的。在其它实施方案中，Z′是存在的。在另外的实施方案中，Z和Z′都存在。在一些实施方案中，Z和Z′都存在且相同。在另外的实施方案中，Z和Z′都存在且不同。在一些实施方案中，Z和Z′独立地为1、2、3、4或5个非核苷酸部分或为非核苷酸部分与核苷酸的组合。

在一些实施方案中，Z是存在的，并包含一个或多个选自下列的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分诸如(CH2)3以及无机磷酸酯部分。

在另外的实施方案中，Z是存在的，并包含一个或多个选自下列的非核苷酸部分：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃部分诸如(CH2)3以及无机磷酸酯部分。

在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个包含一个或两个非核苷酸部分并进一步包含核苷酸。

在一些实施方案中，Z和/或Z′包含脱碱基部分，任选地为脱氧核糖脱碱基(本文称为″dAb″)或核糖脱碱基(本文称为″rAb″)部分。在一些实施方案中，Z和/或Z′的每一个为dAb-dAb或rAb-rAb。

在一些实施方案中，Z和/或Z′包含一个或多个烃部分，任选地为(CH2)3-Pi(本文称为″C3Pi″)。在一些实施方案中，Z和/或Z′为C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH或C3Pi-C3Pi。

在另外的实施方案中，Z和/或Z′包含脱碱基部分和未修饰的核苷酸的组合或烃修饰部分和未修饰的核苷酸的组合或脱碱基部分和烃修饰部分的组合。在此类实施方案中，Z和/或Z′任选地为C3Pi-rAb。在特定的实施方案中，只存在Z，并为C3Pi-C3Ps、C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi。

在上述结构的实施方案中，化合物包含至少一个3’突出(Z和/或Z’)，该突出包含至少一个非核苷酸部分。Z和Z’独立地包含一个非核苷酸部分和一个或多个共价连接的修饰或未修饰的核苷酸或非常规部分，例如反向的dT或dA；dT、LNA、镜像核苷酸等。当与其中Z和/或Z’不存在或其中Z和/或Z’为dTdT的siRNA相比时，其中存在Z和/或Z’的siRNA具有改善的活性和/或稳定性和/或脱靶活性和/或降低的免疫应答。

在所有上述结构的某些实施方案中，化合物包含一个或多个膦酰羧酸酯和/或膦基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)。在一些实施方案中，PACE核苷酸为脱氧核糖核苷酸，并且膦基羧酸酯核苷酸为膦基乙酸酯核苷酸。PACE核苷酸及类似物的实例在均以引用方式并入本文的美国专利No.6,693,187和7,067,641中有所公开。

在所有上述结构的某些实施方案中，化合物包含一个或多个锁核酸(LNA)，其也定义为桥核酸或双环核苷酸。示例性锁核酸包括2′-O，4′-C-乙烯核苷(ENA)或2′-O，4′-C-亚甲基核苷。LNA和ENA核苷酸的其它实例在均以引用方式并入本文的WO98/39352、WO00/47599和WO99/14226中有所公开。

在所有上述结构的某些实施方案中，化合物包含一个或多个阿卓(altritol)糖醇单体(核苷酸)，其也定义为1，5无水-2-脱氧-D-阿卓己糖醇(参见例如Allart，等，1998.Nucleosides&Nucleotides17：1523-1526；Herdewijn等，1999.Nucleosides&Nucleotides18：1371-1376；Fisher等，2007，NAR35(4)：1064-1074；这些文献均以引用方式并入本文)。

本发明明确地排除其中N和/或N’的每一个为脱氧核糖核苷酸(dA、dC、dG、dT)的双链化合物。在某些实施方案中，(N)x和(N’)y可独立地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，本文提供的是其中每个N为未修饰的核糖核苷酸并且(N’)y的3’末端核苷酸或3’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸为脱氧核糖核苷酸的化合物。在其它实施方案中，每个N为未修饰的核糖核苷酸并且(N’)y的5’末端核苷酸或5’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在另外的实施方案中，(N)x的5’末端核苷酸或5’末端的2、3、4、5、6、7、8或9个连续核苷酸以及3’末端的1、2、3、4、5或6个连续核苷酸为脱氧核糖核苷酸，并且每个N’均为未修饰的核糖核苷酸。在另外的实施方案中，(N)x包含未修饰的核糖核苷酸和独立地位于5’和3’末端每一个的1或2、3或4个连续脱氧核糖核苷酸以及内部位置的1或2、3、4、5或6个连续脱氧核糖核苷酸；并且每个N’均为未修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中，(N’)y的3’末端核苷酸或3’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸以及(N)x的5’末端核苷酸或5’末端的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，N的5’末端核苷酸或N的连续2或3个和N’的1、2或3个为脱氧核糖核苷酸。活性DNA/RNAsiRNA嵌合体的某些实例在全文以引用方式并入本文的美国专利公布2005/0004064和Ui-Tei，2008(NAR36(7)：2136-2151)中有所公开。

共价键是指将一个核苷酸单体连接到相邻核苷酸单体的核苷酸间键合。共价键包括例如磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、P-烷氧基键、P-羧基键等。RNA和DNA的正常核苷间键合为3′至5′磷酸二酯键合。在某些实施方案中，共价键为磷酸二酯键。共价键涵盖不含磷的核苷间键合，诸如尤其是在WO2004/041924中公开的那些。除非另外指明，否则在本文所讨论的结构的实施方案中，各连续N或N’之间的共价键为磷酸二酯键。

对于所有上述结构，在一些实施方案中，(N)x的寡核苷酸序列与(N′)y的寡核苷酸序列完全互补。在其它实施方案中，(N)x和(N’)y基本上互补。在某些实施方案中，(N)x与靶序列完全互补。在其它实施方案中，(N)x与靶序列基本上互补。

定义

为方便起见，本文将描述在说明书、实施例和权利要求中采用的某些术语。

应注意的是，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也包括复数形式，除非明确相反指出。

当本发明的各方面或实施方案根据Markush群组或其它备选项分组进行描述时，本领域的技术人员将认识到本发明也因此根据该组的任何单个成员或成员亚组进行描述。

本文称为双链或双链体siRNA化合物的“有义”或“有义链”或“过客链”的物质是指与靶核酸(例如靶RNA，包括靶mRNA)具有同一性的寡核苷酸。本文称为“反义”或“反义链”或“引导链”的物质是指与靶核酸例如靶mRNA具有互补性的寡核苷酸。不希望受到理论的约束，反义或引导链并入到RNA诱导的沉默复合体(RISC)并指导转录后基因沉默，这种现象在引导链与信使RNA分子的互补序列碱基配对时发生并通过RISC复合体的催化组分Argonaute介导mRNA的裂解。

“促凋亡多肽”是指由任何上列基因编码的多肽，包括剪切变体、同种型、直系同源或旁系同源等等。

“抑制剂”是能够将基因的表达或此基因产物的活性降低到足以达到所需的生物或生理效应的程度的化合物。如本文所用的术语“抑制剂”是指寡核苷酸抑制剂的一种或多种，包括siRNA、shRNA、miRNA和核糖酶。抑制也可称为下调或对于RNAi而言称为沉默。

如本文所用的术语“抑制”是指将基因的表达或此基因产物的活性降低到足以达到所需的生物或生理效应的程度。抑制可以是完全抑制或部分抑制。

如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并指包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。还应当理解，这些术语等同地包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA任一者的类似物。在本申请全文中，将mRNA序列示为代表其相应基因的靶。术语“mRNA多核苷酸序列”和mRNA可互换使用。

“寡核苷酸”或“寡聚物”是指约2至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。各DNA或RNA核苷酸可独立地为天然或合成的，和/或修饰或未修饰的。修饰包括改变寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和/或核苷酸之间的键合。本文所公开的化合物涵盖以下分子，包括：脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸和它们的组合。如本文所用，术语“非配对的核苷酸类似物”是指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物，这些部分包括但不限于：6脱氨基腺苷(Nebularine)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-MeriboU、N3-MeriboT、N3-MedC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-MedC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为核糖核苷酸。在其它实施方案中，其为脱氧核糖核苷酸。

本文提供的是体内抑制靶基因表达的方法和组合物。一般来讲，该方法包括施用寡核糖核苷酸尤其是小干扰RNA(即，siRNA)或在细胞内生成siRNA的核酸物质，以靶向哺乳动物mRNA，其用量足以通过RNA干扰机制下调靶基因的表达。具体地讲，该方法可用于抑制基因表达，以治疗患有与该基因表达相关的疾病的受试者。如本文所公开，siRNA分子或靶基因抑制剂用作治疗多种病变的药物。

“siRNA化合物”和“核酸分子”可互换使用。

“核苷酸”旨在涵盖由核苷(糖，通常为核糖或脱氧核糖，以及嘌呤或嘧啶碱基)和磷连接基组成的化合物；诸如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以为天然的或合成的以及修饰的或未修饰的。修饰包括改变和取代糖部分、碱基部分和/或核苷酸间键合。

“基于磷酸酯”部分包括无机磷酸酯(Pi)和硫代磷酸酯(Ps)。

可采用具有本文所公开的分子的核苷酸/寡核苷酸的所有类似物或修饰，前提是所述类似物或修饰不会对核苷酸/寡核苷酸的功能产生显著的不利影响。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键合中的修饰以及它们的组合。

有时称为“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”的物质更适合称为假核苷酸或非常规部分。核苷酸为核酸的单体单元，由核糖或脱氧核糖、磷酸酯和碱基(在DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；在RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。修饰的核苷酸在糖、磷酸酯和/或碱基的一者或多者中包含修饰。脱碱基假核苷酸不含碱基，因此并非严格意义上的核苷酸。脱碱基脱氧核糖部分包括例如脱碱基脱氧核糖-3’-磷酸酯；1，2-二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸酯；1，4-无水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸酯。反向的脱碱基脱氧核糖部分包括反向的脱氧核糖脱碱基；3’，5’反向的脱氧脱碱基5’-磷酸酯。一般来讲，反向的脱碱基部分通过3’-3’键合共价连接到3’末端核苷酸；反向的脱碱基部分通过5’-5’键合共价连接到5’末端核苷酸；反向的脱碱基部分一般通过5’-3’键合共价连接到反向的脱碱基部分。

如本文所用的术语“加帽部分”(z”)包括可共价连接到(N’)y的5′末端的部分并包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、包含2’O烷基修饰的修饰脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分；反向的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分以及它们的组合；C6-亚氨基-Pi；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸；5’OMe核苷酸；和包括4′，5′-亚甲基核苷酸的核苷酸类似物；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5′-氨基烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯，3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3′，4′-断核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向的脱碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；和桥或无桥甲基膦酸酯以及5′-巯基部分。

某些加帽部分为脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；反向的脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi、包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸。本发明的化合物可使用一种或多种反向的核苷酸例如反向的胸苷或反向的腺嘌呤而合成(例如参见Takei，等，2002.JBC277(26)：23800-06)。

术语“非核苷酸部分”是指不是核苷酸的部分，即不包含核苷酸的所有组分：糖、碱基和连接基。

如本文所用的术语“非常规部分”是指包括脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烃(烷基)部分和无机磷酸酯的非核苷酸部分，并进一步包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸(也称为2’5’核苷酸)、包括LNA和乙烯桥核酸的桥核酸、键合被修饰的(如PACE)和碱基被修饰的核苷酸以及本文明确公开为非常规部分的另外部分。

当关于突出使用时，“烷基部分”或“烃部分”是指C2、C3、C4、C5或C6直链或支链烷基部分，包括例如C2(乙基)、C3(丙基)。当关于突出使用时，烷基或烃部分的“衍生物”是指包含官能团的C2、C3、C4、C5或C6直链或支链烷基部分，所述官能团可尤其选自醇、磷酸二酯、硫代磷酸酯、磷酰乙酸酯、胺、羧酸、酯、酰胺和醛。

当关于核糖或脱氧核糖部分的修饰使用时，“烷基”旨在包括直链、支链或环状饱和烃结构以及它们的组合。当关于核糖或脱氧核糖部分的修饰使用时，“低级烷基”具体指具有1至6个碳原子的烷基基团。低级烷基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基和叔丁基等等。优选的烷基基团为C₂₀或以下的那些。环烷基是烷基的子集，并包括具有3至8个碳原子的环状饱和烃基。环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、降冰片基(norbornyl)、金刚烷基等等。

“末端官能团”包括卤素、醇、胺、羧基、酯、酰胺、醛、酮、醚基。

在本发明的上下文中，“镜像”核苷酸(也称为spiegelmer)是与天然存在的或常用的核苷酸的手性相反的核苷酸类似物，即，为天然存在的或常用的核苷酸的镜像。镜像核苷酸为核糖核苷酸(L-RNA)或脱氧核糖核苷酸(L-DNA)并可以进一步包含至少一个糖或碱基修饰和/或主链修饰，诸如硫代磷酸酯或膦酸酯部分。美国专利No.6,602,858公开了包含至少一个L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像dA)、L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像dC)、L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像dG)、L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸酯(镜像dT))和L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸酯(镜像rA)、L-核糖胞苷-3’-磷酸酯(镜像rC)、L-核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜像rG)、L-核糖尿嘧啶-3’-磷酸酯(镜像dU))。

修饰的脱氧核糖核苷酸包括例如：5’OMeDNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3′-磷酸酯)，其可用作5’末端位置(1号位置)的核苷酸；PACE(脱氧核糖腺嘌呤3′磷酰乙酸酯、脱氧核糖胞苷3′磷酰乙酸酯、脱氧核糖鸟苷3′磷酰乙酸酯、脱氧核糖胸苷3′磷酰乙酸酯)。

非常规部分包括桥核酸，包括LNA(2′-O，4′-C-亚甲基桥核酸腺苷3′单磷酸酯、2′-O，4′-C-亚甲基桥核酸5-甲基-胞苷3′单磷酸酯、2′-O，4′-C-亚甲基桥核酸鸟苷3′单磷酸酯、5-甲基-尿苷(或胸苷)3′单磷酸酯)；和ENA(2′-O，4′-C-乙烯桥核酸腺苷3′单磷酸酯、2′-O，4′-C-乙烯桥核酸5-甲基-胞苷3′单磷酸酯、2′-O，4′-C-乙烯桥核酸鸟苷3′单磷酸酯、5-甲基-尿苷(或胸苷)3′单磷酸酯)。

在本发明的一些实施方案中，非常规部分为脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸以及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键接合到相邻核苷酸的核苷酸。

核苷酸选自天然存在的或合成的修饰碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基1，2-丙基和其它烷基腺嘌呤、5-卤素尿嘧啶、5-卤素胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤素腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫醇腺嘌呤、8-硫醇烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代腺嘌呤、8-卤素鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫醇鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它取代鸟嘌呤、其它氮杂和去氮腺嘌呤、其它氮杂和去氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。本发明涵盖包含一个或多个脱碱基假核苷酸的siRNA化合物。包含修饰碱基的核苷酸单体，包括脱碱基假核苷酸单体，可被寡核苷酸的一个或多个核糖核苷酸取代。脱碱基假核苷酸单体可包含在末端位置的一个或多个或作为5’末端帽。5’末端帽还可选自反向的脱碱基假核苷酸类似物、L-DNA核苷酸和C6-亚胺磷酸酯。

此外，制备多核苷酸的类似物，其中一个或多个核苷酸的结构从根本上改变并更适合作为治疗或实验试剂。核苷酸类似物的实例为肽核苷酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链包含与存在于肽中类似的聚酰胺主链。已表明，PNA类似物耐酶降解，并具有更长的体内和体外寿命。

糖残基的可能修饰是多种多样的，并包括2’-O烷基、2’-卤素(如2’脱氧氟代)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿拉伯糖苷；阿卓糖醇(ANA)和其它6元糖，包括吗啉代类和环己烯类(cyclohexinyls)。糖残基的2’部分上的可能修饰包括氨基、氟代、甲氧基烷氧基、烷基、氨基、氟代、氯代、溴代、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫代酯(thioate)、C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-、S-或N-烷基；O-、S或N-烯基；SOCH₃SO₂CH₃；ONO₂；NO₂、N₃；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基或取代的甲硅烷基，如除了别的以外在欧洲专利EP0586520B1或EP0618925B1中所述。本发明的化合物中也容许存在一个或多个脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，(N’)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个DNA部分。

LNA化合物在国际专利公布No.WO00/47599、WO99/14226和WO98/39352中有所公开。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例在Elmen等，(NAR2005.33(1)：439-447)以及国际专利公布No.WO2004/083430中有所公开。六元环核苷酸类似物在Allan，等，(Nucleosides&Nucleotides，1998，17：1523-1526；和Perez-Perez，等，1996，Bioorg.andMedicinalChemLetters6：1457-1460)中有所公开。包括含有己糖醇和阿卓糖醇核苷酸单体的6元环核苷酸类似物的寡核苷酸在国际专利申请公布No.WO2006/047842中有所公开。

诸如乙基(产生磷-乙基三酯)、丙基(产生磷-丙基三酯)和丁基(产生磷-丁基三酯)的主链修饰(也称为核苷酸间键合修饰)也是可能的。其它主链修饰包括聚合物主链、环状主链、无状主链、硫代磷酸酯-D-核糖主链、酰胺化物、磷酰乙酸酯衍生物。某些结构包括具有一个或多个2’-5’核苷酸间键合(桥或主链)的siRNA化合物。

在一些实施方案中，(N)x和(N’)y在3’和5’末端均不磷酰化。在其它实施方案中，(N)x和(N’)y任一者或两者在3’末端磷酰化(3′Pi)。在另一个实施方案中，(N)x和(N’)y任一者或两者在3’末端使用不可裂解的磷酸酯基团磷酰化。在另一个实施方案中，使用可裂解或不可裂解的磷酸酯基团将(N)x和(N’)y任一者或两者在2’末端位置磷酰化。另外，本发明的抑制性核分子可包含一个或多个裂口和/或一个或多个缺口和/或一个或多个错配。不希望受理论的约束，裂口、缺口和错配具有使核酸/siRNA部分去稳定的优点，使得其可更容易地由内源性细胞机制诸如DICER、DROSHA或RISC加工成其抑制性组分。

在本发明上下文中，核酸中的裂口是指一条链中不存在一个或多个内部核苷酸，而核酸中的缺口是指一条链的两个相邻核苷酸之间不存在核苷酸间键合。本发明的任何分子可包含一个或多个裂口和/或一个或多个缺口。

寡核苷酸

在非限制性实例中，转让给本发明受让人的并全文以引用方式并入的PCT专利申请公布No.WO2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)包含可用于制备根据本发明的siRNA化合物的有义和相应反义寡聚物的核酸序列。将这些化合物作为化学和/或结构修饰的化合物使用。

对应已知基因的siRNA的选择和合成已广泛报道；参见例如Ui-Tei等，JBiomedBiotechnol.2006；65052；Chalk等，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.MolBiol.2004，252：457-69；Levenkova等，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等，NAR.2004，32(3)：936-48。对于修饰siRNA的使用和制备的实例，参见例如Braasch等，Biochem.2003，42(26)：7967-75；Chiu等，RNA.2003，9(9)：1034-48；PCT公布No.WO2004/015107和WO02/44321以及美国专利No.5,898,031和6,107,094。

本发明提供双链寡核苷酸(如siRNA)，其下调所需基因的表达。本发明的siRNA为双链体寡核糖核苷酸，其中有义链衍生自所需基因的mRNA序列，而反义链至少基本上与有义链互补。一般来讲，可以容忍与靶mRNA序列的某些偏差而不降低siRNA活性(参见例如Czauderna等，NAR.2003，31(11)：2705-2716)。本发明的siRNA在破坏或不破坏mRNA的情况下在转录后水平上抑制基因表达。不受理论的约束，siRNA可将mRNA靶向特异性裂解和降解和/或可抑制所靶向的信息的翻译。

在其它实施方案中，两条链的至少一条可在5′-末端具有至少一个核苷酸的突出；该突出可由至少一个脱氧核糖核苷酸组成。RNA双链体的长度为约16至约40个核糖核苷酸，优选19个核糖核苷酸。另外，每条链可独立地具有选自由下列组成的组的长度：约16至约40个碱基，优选18至23个碱基，更优选19个核糖核苷酸。

在某些实施方案中，所述第一链和靶核酸之间完美互补。在一些实施方案中，所述链基本上互补，即，在所述第一链和靶mRNA之间或第一和第二链之间具有一个、两个或最多五个错配。基本上互补是指与另一序列大于约70％并小于100％的互补性。例如，在由19个碱基对组成的双链体区域中，一个错配产生94.7％的互补性，两个错配产生约89.5％的互补性，3个错配产生约84.2％的互补性，4个错配产生约79％的互补性以及5个错配产生约74％的互补性，从而导致双链体区域基本上互补。因此，“基本上相同”是指与另一序列大于约70％的同一性。

第一链和第二链可通过环状结构连接，该环状结构可由非核酸聚合物诸如尤其是聚乙二醇构成。作为另外一种选择，环状结构可由核酸构成，包括修饰和未修饰的核糖核苷酸以及修饰和未修饰的脱氧核糖核苷酸。

另外，siRNA第一链的5′-末端可连接到第二链的3′-末端，或者第一链的3′-末端可连接到第二链的5′-末端，所述键合为经由通常具有2-100个核碱基优选约2至约30个核碱基长度的核酸连接基。

在化合物的反义和有义链至少一者中具有修饰的交替核糖核苷酸的本发明化合物的一些实施方案中，对于19mer和23mer寡聚物，反义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基中被修饰，而有义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基中未修饰。对于21mer寡聚物，有义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基中被修饰，而反义链5’和3’末端的核糖核苷酸在其糖残基中未修饰或者可在3’末端具有任选的另外修饰。如上所述，在一些实施方案中，反义链的中间核苷酸未修饰。

根据本发明的一个实施方案，寡核苷酸/siRNA的反义和有义链只在3’-末端而不在5’-末端磷酰化。根据本发明的另一个实施方案，反义和有义链未磷酰化。根据本发明的又一个实施方案，有义链中的5′最末端核糖核苷酸被修饰以消除体内5′-磷酰化的任何可能性。

制备本文所公开的具有本文所公开的任何修饰/结构的任何siRNA序列。序列与结构的组合是新型的，并可用于治疗本文所公开的病症。

药物组合物

虽然可能将本发明的化合物作为原始化学品施用，但优选的是，将其表现为药物组合物。因此，本发明提供包含本发明化合物的一种或多种和药学上可接受的载体的药物组合物。此组合物可包含两种或更多种不同寡核苷酸/siRNA的混合物。

本发明进一步提供包含有效抑制上文所公开的一种或多种基因的量的共价或非共价结合到本发明一种或多种化合物的至少一种本发明化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。该化合物可在细胞内通过内源性细胞复合体加工以产生一种或多种本发明的寡核糖核苷酸。

本发明进一步提供包含药学上可接受的载体和有效下调细胞中靶RNA(包括靶基因和靶mRNA和/或靶蛋白)表达的量的一种或多种本发明化合物的药物组合物，该化合物包含与(N)_x序列具有互补性的序列。在某些实施方案中，靶基因为病毒、细菌或哺乳动物基因。在多种实施方案中，靶基因为哺乳动物基因，优选为人类基因。

此外，本发明提供与对照相比抑制靶基因表达至少50％的方法，包括使靶基因的mRNA转录物与本发明化合物的一种或多种接触。在一些实施方案中，活性siRNA化合物与对照相比以至少50％、60％或70％的水平抑制基因表达。在某些实施方案中，与对照相比，抑制水平为至少75％、80％或90％。在一些实施方案中，靶基因为如本文所公开的促凋亡基因。

在一个实施方案中，寡核糖核苷酸抑制本发明的促凋亡基因的一种或多种，因此抑制选自由下列组成的组：基因功能的抑制、多肽的抑制反和mRNA表达的抑制。

在一个实施方案中，该化合物抑制由靶基因编码多肽的表达，因此抑制选自由下列组成的组：功能的抑制(其尤其可通过酶学测定或与天然基因/多肽的已知作用子的结合测定而检查)、蛋白质的抑制(其尤其可通过Western印迹、ELISA或免疫沉淀检查)以及mRNA表达的抑制(其尤其可通过Northern印迹、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交检查)。

在另外的实施方案中，本发明提供治疗患有伴随本发明的促凋亡基因水平升高的疾病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的本发明的化合物，从而治疗该受试者。

递送

在一些实施方案中，通过直接应用用载体或稀释剂制备的裸分子将本发明的siRNA分子递送到靶组织。

术语“裸siRNA”是指不含任何有助于、促进或利于进入细胞的递送媒介物的siRNA分子，这些媒介物包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体制剂、Lipofectin或沉淀剂等。例如，PBS中的siRNA为“裸siRNA”。

然而，在一些实施方案中，将本发明的siRNA分子在脂质体或Lipofectin制剂等中递送，并通过本领域技术人员熟知的方法制备。此类方法在例如美国专利No.5,593,972、5,589,466和5,580,859中有所公开，这些专利以引用方式并入本文。

已经开发出了专门针对增强和改善siRNA向哺乳动物细胞递送的递送系统(参见，例如Shen等FEBSLet.2003，539：111-114；Xia等，Nat.Biotech.2002，20：1006-1010；Reich等，Mol.Vision2003，9：210-216；Sorensen等，J.Mol.Biol.2003.327：761-766；Lewis等，Nat.Gen.2002，32：107-108以及Simeoni等，NAR2003，31，11：2717-2724)。siRNA最近被成功地用于抑制灵长类动物中的基因表达(参见例如Tolentino等，Retina24(4)：660)。

药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物以及植入载体一般是指惰性的、不与本发明活性成分反应的无毒固体或液体填充剂、稀释剂或包封材料，并且它们包括脂质体和微球。可用于本发明的递送系统的实例包括美国专利No.5,225,182、5,169,383、5,167,616、4,959,217、4,925,678、4,487,603、4,486,194、4,447,233、4,447,224、4,439,196和4,475,196。许多其它此类植入物、递送系统和模块对本领域的技术人员而言是熟知的。在本发明的一个具体实施方案中，可以选择外用和透皮制剂。本发明的siRNA或药物组合物根据优良医疗规范考虑到以下方面而施用和给药：个体患者的临床病症、待治疗的疾病、施用部位和方法、施用计划、患者年龄、性别、体重以及医师已知的其它因素。

因此，出于本文目的，“治疗有效剂量”通过如本领域已知的此类考量而确定。剂量必须有效实现改善，包括但不限于改善存活率或更快恢复、或者改善或消除症状以及本领域技术人员选择为合适措施的其它指标。

一般来讲，剂量可以为每千克体重0.01mg至1g(例如，每千克0.1mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg、500mg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg或500mg)。

核酸分子的合适剂量单位可在每天每千克受体体重0.001至0.25毫克的范围内，或在每天每千克体重0.01至20微克的范围内，或在每天每千克体重0.01至10微克的范围内、或在每天每千克体重0.10至5微克的范围内或在每天每千克体重0.1至2.5微克的范围内。

可施用合适量的核酸分子，并且这些量可使用标准方法从经验上确定。在细胞环境中各个核酸分子物质的有效浓度可为约1飞摩尔(fmolar)、约50飞摩尔、100飞摩尔、1皮摩尔、1.5皮摩尔、2.5皮摩尔、5皮摩尔、10皮摩尔、25皮摩尔、50皮摩尔、100皮摩尔、500皮摩尔、1纳摩尔、2.5纳摩尔、5纳摩尔、10纳摩尔、25纳摩尔、50纳摩尔、100纳摩尔、500纳摩尔、1微摩尔、2.5微摩尔、5微摩尔、10微摩尔、100微摩尔或更高。

可与载体物质结合以产生单剂量形式的活性成分的量根据治疗的宿主和特定的施用模式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg的活性成分。

应当理解，任何特定受试者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康情况、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄率、药物组合以及接受治疗的特定疾病的严重性。

包含本文所公开的核酸分子的药物组合物可每日一次、每日四次、每日三次、每日两次、每日一次或以任何间隔施用并持续医学上合适的任何时长。然而，治疗剂也可按包含在一天中以合适的间隔施用的二个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量的剂量单位给药。在此情况下，包含在每个亚剂量中的核酸分子可相应地较小，以便实现总的每日剂量单位。也可将剂量单元单位复合成经数天的单剂量，例如使用常规的持续释放制剂，其在数天的时间内提供持续和一致的dsRNA释放。持续释放制剂在本领域中是熟知的。剂量单位可以包含相应的多个每日剂量。可以这样的方式复合组合物，使得核酸多个单位的总和一起包含足够的剂量。

试剂盒和容器

还提供试剂盒、容器和包含如本文所提供的用于降低靶基因表达的核酸分子(如，siNA分子)的制剂以将该核酸分子施用给受试者。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料诸如玻璃、金属或塑料形成。试剂盒可进一步包括相关的适应症和/或说明；也可包括用于此目的的试剂和其它组合物或工具。

作为另外一种选择，容器可容纳有效治疗、诊断、预测或预防病症的组合物，并可具有无菌入口(例如，容器可为静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂可为能够特异性结合靶基因和/或调节靶基因功能的核酸分子。

试剂盒可进一步包括第二容器，其容纳药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和/或葡萄糖溶液。其可进一步包括从商业和用户角度上所期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、搅拌器、针头、注射器和/或具有适应症和/或使用说明的包装说明书。

在使用前包装核酸分子的单位剂量安瓿或多剂量容器可包括气密封的容器，其封装一定量的核酸分子或含有核酸分子的溶液，该量适合于其一个药学有效剂量或多个有效剂量。将核酸分子作为无菌制剂包装，并将气密封的容器设计为保证使用前制剂的无菌性。

容纳核酸分子的容器可包括贴有标签的包装，并且该标签可具有政府机构例如食品药品监督管理局规定形式的公告，该公告反映在联邦法下得到了政府机构的批准，其内容为其中的用于人体施用的多核苷酸物质的生产、使用或销售信息。

联邦或国家法律要求药物组合物用于人类治疗必须得到联邦或国家政府机构的批准。在美国，该实施由食品药品监督管理局负责，其发布了获得此批准的规范，详见于21U.S.C.§301-392。大多数外国国家独有的程序要求类似的审批是本领域技术人员熟知的，并且本文提供的组合物和方法优选相应地符合审批。

要施用的剂量在很大程度上取决于接受治疗的受试者的病症和大小以及治疗频率和施用途径。连续治疗的方案(包括剂量和频率)可根据初始响应和临床判断而定。

本文所公开的核酸化合物通过任何常规施用途径施用。应当注意的是，将化合物按原样施用或作为药学上可接受的盐施用，以及单独施用或作为活性成分结合药学上可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物施用。化合物的施用途径为经口、外用、皮下或非肠道(包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内)、吸入、鼓室内施用以及鞘内注射和输注技术。化合物的植入物也是有用的。可制备液体注射剂型，该术语包括皮下、透皮、静脉内、肌内、鞘内和其它非肠道施用途径。液体组合物包括含和不含有机共溶剂的水溶液、水或油混悬剂、含食用油以及类似药学载体的乳剂。在特定实施方案中，施用包括静脉内施用。在另一个实施方案中，施用包括外用或局部施用。在一些实施方案中，外用包括外部施用到哺乳动物耳道。在一些实施方案中，外用包括外部施用到哺乳动物眼表面。

此外，在某些实施方案中，用于本发明新型治疗的组合物可形成为气溶胶，例如用于鼻内施用。

在某些实施方案，口腔组合物(诸如片剂、混悬剂、溶液剂)可有效用于局部递送到口腔，诸如适用于治疗口腔黏膜炎的漱口水的口腔组合物。

在实施方案中，进行治疗的受试者为温血动物并尤其为包括人的哺乳动物。

在另外的实施方案中，修饰为磷酸酯部分的修饰，因此修饰的磷酸酯部分选自由硫代磷酸酯组成的组或不含磷酸酯基团。

本发明的分子除了编码此类分子或其它抑制性核苷酸分子的其它核酸序列或分子，还包括siRNA、siNA、合成的siRNA、合成的shRNA和miRNA。

在一些实施方案中，该核酸化合物可用于诊断。不希望受到理论的约束，包含3’末端非核苷酸的双链核酸分子可被有效递送到特定细胞和组织并可用于诊断关于该特定细胞或组织的病况。因此，末端修饰包括可检测的部分，包括生色剂(colorgenicagent)、放射性标记部分和酶试剂。在一些实施方案中，可检测试剂为生物素基团。此生物素基团可优选地连接到有义链的5’最末端核苷酸或反义链的3’最末端核苷酸的任一者或连接到这两个末端。本文所公开的各种末端修饰优选地位于根据本发明的核酸的核苷酸的核糖部分。更具体地将，末端修饰可连接到核糖部分的任何OH-基团或代替任何OH-基团，包括但不限于2’OH、3’OH和5’OH位，前提是因而被修饰的核苷酸为末端核苷酸，优选地为有义链的5’末端核苷酸。应当理解，将本文所公开的核酸分子、或由内源性细胞复合体(诸如DICER，参见上文)加工以形成本文所公开的siRNA分子的任何长双链RNA分子(长度通常为25-500个核苷酸)、或包含本文所公开的siRNA分子的分子并入到本发明的分子中以形成另外的新型分子，并用于治疗本文所述的疾病或病况。

具体地讲，据设想，长寡核苷酸可在载体(优选药学上可接受的载体)中递送，并可通过内源性细胞复合体(如，通过如上所述的DROSHA和DICER)在细胞内加工，以形成作为本发明寡核苷酸的一种或多种较小的双链寡核苷酸(siRNA)。此寡核苷酸称为串联shRNA构建体。据设想，此长寡核苷酸为包含一个或多个茎环结构的单链寡核苷酸，其中每个茎区域包含有义和相应的反义siRNA序列。诸如例如包含本文所公开的抑制性序列(具有合适的核酸修饰)的反义DNA分子的任何分子是尤其所需的，并可以与其相应RNA/siRNA相同的能力用于本文所公开的所有用途和方法。

主链

本文所公开的核酸分子的核苷亚单位可通过磷酸二酯键彼此连接。标准5’3’磷酸二酯键可任选地被其它键合取代。例如，硫代磷酸酯、硫代磷酸酯-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’桥主链(也可称为5’-2’或2’5’)、PACE、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧亚磷酸酯、硼烷磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)氨基磷酸酯、氢膦酸酯、膦酸酯、硼烷磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯修饰诸如烷基磷酸三酯、磷酸三酯磷键合、5’-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸三酯、甲基膦酸酯和不含磷的键合例如碳酸酯、氨基甲酸酯、甲硅烷基、硫、磺酸酯、磺酰胺、formacetal、thioformacetyl、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲基氧甲基亚氨基键合。此外，可制备多核苷酸的类似物，其中核苷酸的结构从根本上改变并更适合作为治疗或实验试剂。核苷酸类似物的实例为肽核苷酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链包含与存在于肽中类似的聚酰胺主链。已表明，PNA类似物耐酶降解，并具有延长的体内和体外寿命。另外，已表明PNA比DNA分子与互补DNA序列的结合力更强。此发现归因于PNA链和DNA链之间不存在电荷排斥。可用于合成寡核苷酸的其它修饰单体包括具有聚合物主链、环状主链或无环主链的部分。

治疗方法

在另一方面，本发明涉及对需要治疗与靶基因异常表达相关的疾病或病况的受试者进行治疗的方法，包括向受试者施用一定量的降低或抑制该基因表达的抑制剂。

在某些实施方案中，进行治疗的受试者为温血动物并尤其为包括人的哺乳动物。

本发明的方法包括向受试者施用下调基因表达的一种或多种抑制性化合物；并尤其为治疗有效剂量的siRNA以便对该受试者进行治疗。

术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施两者，其中目的是要防止或减缓(缓解)本文所列的病况。需要治疗的那些受试者包括已患有疾病或病症的那些、有发生疾病或病症倾向的那些以及要预防疾病或病症的那些。本发明的化合物在发生疾病或病症或与之相关的症状之前、过程中或之后施用。在将治疗用于本发明目的的情况下，则本发明涉及延迟疾病或病况发生或防止其发展的方法。

本发明涉及下调本发明促凋亡基因的表达的化合物在治疗其中抑制该促凋亡基因表达是有益的以下疾病或病症中的用途，尤其是涉及新型小干扰RNA(siRNA)：听力损失、急性肾衰竭(ARF)、青光眼、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)及其它急性肺部和呼吸道损伤、肺移植后的缺血-再灌注损伤、器官移植(包括肺、肝脏、心脏、骨髓、胰腺、角膜和肾脏移植)中的损伤，其包括DGF；脊髓损伤、褥疮、老年性黄斑变性(AMD)、干眼综合征、眼部缺血病症(包括ION和NAION)；口腔黏膜炎和慢性阻塞性肺病(COPD)。其它适应症包括化学诱导肾毒性和化学诱导神经毒性，例如由顺铂和顺铂类化合物、由氨基糖苷类、由袢利尿药以及由氢醌及其类似物诱导的毒性。

本文详细讨论了抑制本发明促凋亡基因的方法、分子和组合物，并且任何所述分子和/或组合物均可有利地用于治疗患有任何所述病症的受试者。

在另一方面，提供一种制造制品，其包括包装材料和使用说明，该包装材料容纳根据本发明的寡核苷酸组合物，其在治疗学上有效治疗患有本文所公开的适应症的任何一种的受试者。

本文公开的是一种制备能够靶特异性抑制或下调靶基因表达的双链RNA分子的方法，其中每条RNA链具有19至25个核苷酸的长度，其中至少一条链具有非核苷酸部分，所述非核苷酸部分共价连接在其3’末端的糖残基的3’或2’位，所述方法包括(a)合成两条长度均为19至25个核苷酸的RNA链，其中所述RNA链能够形成双链RNA分子，(b)在一定条件下合并所述合成的RNA链，其中形成双链RNA分子，其中所述双链RNA分子由单个双链区域和至少一个单链区域组成，所述至少一个单链区域包含非核苷酸部分，所述非核苷酸部分共价连接在其所存在的链的3’末端的糖残基的3’或2’位；其中所述非核苷酸部分选自丙醇、连接到磷酸二酯的C3烷基部分、连接到硫代磷酸酯的C3烷基部分、脱氧核糖脱碱基部分、核糖脱碱基部分以及它们的组合。

本文提供的是制备药物组合物的工艺，其包括：

提供本文所公开的一种或多种化合物；并且

将所述化合物与药学上可接受的载体配混。

本发明还提供制备药物组合物的工艺，其包括将本发明的一种或多种化合物与药学上可接受的载体配混。

在一个实施方案中，以药学有效剂量将用于制备药物组合物的化合物与载体配混。在特定的实施方案中，将本发明的化合物缀合到类固醇或脂质或另一合适的分子例如胆固醇。

修饰化合物的合成

本发明的化合物可通过本领域熟知的用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的任何方法合成。此合成除了别的以外在Beaucage和Iyer，Tetrahedron1992；48：2223-2311；Beaucage和Iyer，Tetrahedron1993；49：6123-6194和Caruthers，等，MethodsEnzymol.1987；154：287-313中有所描述；硫代酯的合成除了别的以外在Eckstein，Annu.Rev.Biochem.1985；54：367-402中有所描述；RNA分子的合成在Sproat，HumanaPress2005，HerdewijnP.主编；Kap.2：17-31中有所描述；以及相应的下游过程除了别的以外在Pingoud等，IRLPress1989，OliverR.W.A.编著；Kap.7：183-208中有所描述。

其它合成程序在本领域中是已知的，例如，如Usman等，J.Am.Chem.Soc.，1987，109：7845；Scaringe等，NAR，1990，18：5433；Wincott等，NAR1995，.23：2677-2684；和Wincott等，MethodsMol.Bio.，1997，74：59中所述的程序，并且这些程序可利用共同的核酸保护和偶联基团，诸如5′-末端的二甲氧基三苯甲基和3′-末端的亚磷酰胺。修饰的(如2′-O-甲基化)核苷酸和未修饰的核苷酸根据需要并入。

本发明的寡核苷酸可单独地合成并在合成后结合到一起，例如通过连接(ligation)(Moore等，Science1992，256：9923；国际专利公布No.WO93/23569；Shabarova等，NAR1991，19：4247；Bellon等，Nucleosides&Nucleotides，1997，16：951；Bellon等，BioconjugateChem1997，8：204)或通过合成和/或去保护后杂交。

值得注意的是，可使用市售设备(尤其可得自AppliedBiosystems)；根据本文所公开的序列制备寡核苷酸。可使用本领域熟知的方法连接重叠的化学合成片段对(例如，参见美国专利No.6,121,426)。单独合成各条链，然后在管中彼此退火。接着，通过HPLC将双链siRNA与未退火(例如，因为其中一种过量)的单链寡核苷酸分离。关于本发明的siRNA或siRNA片段，可合成两个或更多个此类序列并连接到一起以用于本发明。

本发明的化合物还可通过串联合成方法合成，如例如在美国专利公布No.2004/0019001(McSwiggen)中所述，其中将两条siRNA链均以以下形式合成：单个连续寡核苷酸片段、或通过可裂解的连接基(其随后被裂解以提供单独的siRNA片段)分离的链、或杂交并允许纯化siRNA双链体的链。连接基选自多核苷酸连接基或非核苷酸连接基。

如本文所用的术语“共价结合”是指特征在于原子之间共享电子对的化学结合。

如本文所用的术语“非共价结合”是指分子之间或分子部分之间本质上非共价的多种相互作用，这些相互作用提供作用力，通常以具体的取向或构象将分子或分子部分结合在一起。这些非共价相互作用包括：离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力和偶极子-偶极子键。

siRNA和RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是一种涉及双链(ds)RNA-相关基因特异性转录后沉默的现象。研究此现象并在实验上操纵哺乳动物细胞的最初努力因活性、非特异性抗病毒防御机制而失败，这种机制会响应长dsRNA分子而被激活(Gil等Apoptosis，2000.5：107-114)。后来，有人发现合成的21个核苷酸的RNA双链体能介导哺乳动物细胞中的基因特异性RNAi，而不刺激一般的抗病毒防御机制(参见Elbashir等Nature2001，411：494-498和Caplen等PNASUSA2001，98：9742-9747)。因此，小干扰RNA(siRNA)已成为尝试了解基因功能的强有力工具。

哺乳动物中的RNA干扰(RNAi)由小干扰RNA(siRNA)(Fire等，Nature1998，391：806)或microRNA(miRNA)(Ambros，Nature2004，431(7006)：350-355；Bartel，Cell2004，116(2)：281-97)介导。植物中的相应过程通常被称为特异性转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，在真菌中也称为压制。

siRNA是一种双链RNA或修饰的RNA分子，其下调或沉默(阻止)其内源性(细胞)对应物的基因/mRNA表达。

对应已知基因的siRNA的选择和合成已广泛报道；(参见例如Ui-Tei等，JBiomedBiotech.2006；2006：65052；Chalk等，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.MolBiol.；2004，252：457-69；Levenkova等，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等，NAR.2004，32(3)：936-48)。

对于修饰siRNA的使用和制备的实例，参见例如Braasch等，Biochem.2003，42(26)：7967-75；Chiu等，RNA，2003，9(9)：1034-48；PCT公布WO2004/015107(atugenAG)和WO02/44321(Tuschl等)。美国专利No.5,898,031和6,107,094教导了化学修饰的寡聚物。美国专利公布No.2005/0080246和2005/0042647分别涉及具有交替基序的寡聚化合物以及具有化学修饰核苷间键合的dsRNA化合物。

已公开了其它修饰。已表明，包含5′-磷酸酯部分增强了siRNA在果蝇胚胎中的活性(Boutla，等，Curr.Biol.2001，11：1776-1780)并为人HeLa细胞中的siRNA功能所必需(Schwarz等，Mol.Cell，2002，10：537-48)。Amarzguioui等，(NAR，2003，31(2)：589-95)表明siRNA活性依赖于2’-O-甲基(2’OMe)修饰的定位。Holen等(NAR.2003，31(9)：2401-07)报道了具有较少数量的2’OMe修饰核苷的siRNA与野生型相比产生了良好的活性，但是随着2’OMe修饰核苷数量的增加，活性降低。Chiu和Rana(RNA.2003，9：1034-48)教导了在有义或反义链中并入2’OMe修饰核苷(完全修饰链)相对于未修饰的siRNA严重降低了siRNA活性。据报道，在有义链上的5′-末端放置2’OMe基团会严重限制活性，然而容许在反义链的3′-末端以及有义链的两个末端放置(Czauderna等，NAR.2003，31(11)：2705-16；WO2004/015107)。

多项研究已表明，在哺乳动物和人类中，siRNA治疗剂均在体内有效。Bitko等人已证实，针对呼吸道合胞病毒(RSV)核衣壳N基因的特异性siRNA分子在鼻内施用时可有效治疗小鼠(Nat.Med.2005，11(1)：50-55)。最近有人对siRNA治疗剂进行了综述(Barik，等，J.Mol.Med2005，83：764-773；Dallas和Vlassov，Med.Sci.Monitor2006，12(4)：RA67-74；Chakraborty，CurrentDrugTargets2007，8(3)：469-82；Dykxhoorn等，GeneTherapy2006.13：541-552)。

Mucke(IDrugs200710(1)：37-41)对治疗眼科疾病例如年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼的当前治疗剂(包括针对多种靶的siRNA)进行了综述。

最近公布了许多涉及RNAi现象的PCT申请。这些包括：PCT公布WO00/44895、PCT公布WO00/49035、PCT公布WO00/63364、PCT公布WO01/36641、PCT公布WO01/36646、PCT公布WO99/32619、PCT公布WO00/44914、PCT公布WO01/29058和PCT公布WO01/75164。

RNA干扰(RNAi)基于dsRNA物质进入胞浆蛋白复合体的能力，其中dsRNA随后被靶向互补的细胞RNA并将其特异性降解。RNA干扰反应的特征是包含siRNA的内切酶复合体，通常被称为RNA诱导的沉默复合体，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解可发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中间(Elbashir等，GenesDev.，2001，15(2)：188-200)。更具体地讲，较长的dsRNA被III型RNA酶(DICER、DROSHA等；Bernstein等，Nature，2001，409(6818)：363-6；Lee等，Nature，2003，425(6956)：415-9)消化成短(17-29bp)dsRNA片段(也称为短抑制性RNA，“siRNA”)。RISC蛋白复合体识别这些片段和互补的mRNA。整个过程以靶mRNA的内切酶裂解结束(McManus&Sharp，NatureRevGenet，2002，3(10)：737-47；Paddison&Hannon，CurrOpinMolTher.2003，5(3)：217-24)。(有关这些术语和提出的机制的详细信息，参见例如Bernstein等，RNA2001，7(11)：1509-21；Nishikura，Cell2001，107(4)：415-8和PCT公布WO01/36646)。

siRNA结构

对应已知基因的siRNA的选择和合成已广泛报道；(参见例如Ui-Tei等，JBiomedBiotech.2006；2006：65052；Chalk等，BBRC.2004，319(1)：264-74；Sioud&Leirdal，Met.MolBio1.；2004，252：457-69；Levenkova等，Bioinform.2004，20(3)：430-2；Ui-Tei等，NAR.2004，32(3)：936-48)。

本文所公开的双链RNA分子在有义或反义链任一者上具有一个3′非核苷酸突出并任选地具有两个3′突出，其在有义和反义链每一者上各一个。

本文所公开的分子提供的优势在于它们无毒并可用于制备用于治疗多种疾病和病况的药物组合物。

转让给本发明受让人的PCT专利申请No.PCT/IL2007/001278(PCT公布No.WO2008/050329)和美国专利No.11/978,089涉及促凋亡基因的抑制剂，并且它们全文以引用方式并入。

本发明整体涉及下调多种基因表达的化合物，尤其涉及新型小干扰RNA(siRNA)，以及涉及这些新型siRNA在治疗患有多种医疗病症的受试者中的用途。

本文详细讨论了这些分子和组合物，并且任何所述分子和/或组合物均可有利地用于治疗患有任何所述病症的受试者。

本发明的siRNA化合物具有可例如增强活性、增加稳定性和/或最小化毒性的结构和修饰；本发明的siRNA的新型修饰可有利地应用到可用于防止或减弱靶基因(尤其是本文所讨论的靶基因)表达的双链RNA。

根据一个方面，本文提供包含未修饰和/或修饰核苷酸的抑制性寡核苷酸化合物。化合物的一条链包含至少一个3′突出，其含有至少一个非核苷酸部分，优选两个非核苷酸部分。本文所公开的化合物优选地包含未修饰的核糖核苷酸和修饰的核糖核苷酸以及一个或多个非常规部分。在一些实施方案中，N或N’中的至少一个选自由下列组成的组：糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键合修饰。在一些实施方案中，本文所公开的化合物包含至少一个修饰的核苷酸，包括DNA、包括ENA(乙烯桥核酸)的LNA(锁核酸)；PNA(肽核酸)；阿拉伯糖苷；PACE(磷酰乙酸酯及其衍生物)、镜像核苷酸或具有6元糖类似物(如己糖或吗啉代)的核苷酸。

在一个实施方案中，化合物包含至少一个修饰的核糖核苷酸，其在糖部分上具有2’修饰(“2’糖修饰”)。在某些实施方案中，化合物包含2’O-烷基或2’-氟代或2’O-烯丙基或任何其它2’糖修饰，任选地位于交替位置上。一种可能的2’修饰为2’O-甲基(2’甲氧基，2’OMe)。

其它稳定化修饰也是可能的(如添加到寡聚物的3’或5’末端的修饰核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的主链被修饰并包含磷酸酯-D-核糖实体，但也可以包含硫代磷酸酯-D-核糖实体、磷酸二酯L-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’桥主链(也可称为5’-2’)、PACE修饰的核苷酸键合或任何其它类型的修饰。

本发明以示例性方式描述，并且应当理解的是所用的术语旨在具有说明性而非限制性词性。

显然，鉴于上述教导，本发明的许多修饰和变型都是可能的。因此，应当理解的是，在所附权利要求书的范围内，本发明可按具体描述之外的方式实践。

本发明将在下文根据实施例详细示出，但不应被解释为受限于此。

本文引用任何文献不意味着承认此文献切合现有技术，或视材料具有本申请任何权利要求的可专利性。关于任何文献内容或日期的任何说明基于申请人在提交时可获得的信息，并且不构成对此说明正确性的承认。

实施例

无需进一步详细阐述，据信，本领域的技术人员使用前述说明能够最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方案应被解释为仅为示例性的，而不是以任何方式限制受权利要求书保护的发明。

本文未具体描述的本领域已知的标准分子生物学方案一般基本上遵循以下文献所述：Sambrook等，Molecularcloning：Alaboratorymanual，ColdSpringsHarborLaboratory，New-York(1989，1992)；和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley和Sons，Baltimore，Maryland(1988)；和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；和Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)；Watson等，RecombinantDNA，ScientificAmericanBooks，NewYork；Birren等(主编)GenomeAnalysis：ALaboratoryManualSeries，第1-4卷ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998)以及如美国专利No.4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所示并以引用方式并入本文的方法。聚合酶链反应(PCR)一般如PCRProtocols：AGuideToMethodsAndApplications，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中所述而进行。结合流式细胞术的原位(细胞中)PCR可用于检测含有特异性DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，Blood1996，87：3822)。执行RT-PCR的方法也是本领域熟知的。

序列表

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实施例1：产生核酸分子以及体外测试修饰的siRNA化合物

使用专有算法以及靶核苷酸的已知序列，例如靶基因的mRNA，产生许多潜在siRNA核酸分子的有义和反义序列。除非另外指明，否则核酸分子均以5’至3’取向示出，并且有义和互补的反义序列均在表格中的同一行示出。

表A提供了可用于产生本文所公开的核酸分子的示例的、非限制性核酸序列。

表A：

活性：

使用标准合成程序合成单链寡核苷酸(有义链和反义链)。以0.05M的浓度进行DMT-丙烷-二醇亚磷酰胺(ChemGenes；CLP-9908)偶联。通过退火互补的单链寡核苷酸产生双链体。在层流罩中，通过在WFI(注射用水，Norbrook)中稀释，配制约500μM的单链寡核苷酸储液。通过用WFI按1∶200的比例稀释各500μMssRNA并使用NanoDrop测量OD而测定实际的ssRNA浓度。将该程序重复3次，并计算平均浓度。然后将储液稀释到250μM的最终浓度。通过加热到85℃并经至少45分钟冷却至室温而退火互补的单链。通过在20％聚丙烯酰胺凝胶上测试5μl和染色，测试双链体是否完全退火。将双链体保存在-80℃。

如下测试本文所公开的双链核酸分子的活性：以每孔大约1.5-2×10⁵个的密度将测试细胞(对于靶向人类基因的siRNA为HeLa细胞和/或293T细胞；以及对于靶向大鼠/小鼠基因的siRNA为NRK52细胞(正常大鼠肾近端小管细胞)和/或NMuMG细胞(小鼠乳腺上皮细胞系))接种到6孔板中(70-80％汇合度)。

约24小时后，使用LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)以0.001nM至约50nM的最终浓度用修饰的siRNA化合物转染细胞。将细胞在37℃的CO₂培养箱中孵育72h。

作为转染的阳性对照，使用PTEN-Cy3标记的修饰siRNA化合物。将GFPsiRNA化合物用作siRNA活性的阴性对照。

转染后72h时，收获细胞，并从细胞中提取RNA。通过荧光显微镜法测试转染效率。

在表达内源基因的细胞中，使用靶基因的qPCR分析，测定使用特定优选的siRNA结构产生的基因表达抑制百分比。

使用通过各种最终siRNA浓度获得的活性结果，建立剂量反应曲线，从而测定测试的RNAi活性的IC50值。通过相对于转染siRNA浓度的对数对残余的靶mRNA的相对量绘图，建立剂量反应曲线。通过将最佳S形曲线拟合到测得的数据对曲线进行计算。S形拟合方法也称为3点曲线拟合。

Y = Bot + \frac{100 - Bot}{1 + 10^{(LogIC 50 - X) \times HillSlope}}

其中Y为残余的靶mRNA反应，X为转染siRNA浓度的对数，Bot为底部平台的Y值，LogIC50为Y在底部和顶部平台之间的一半处时的X值，以及HillSlope为曲线的陡度。

血清稳定性实验

在人血清或人组织提取物中测试双链核酸分子的双链体稳定性，方法如下：

在100％人血清(Sigma目录号H4522)中，将最终浓度为7μM的siRNA分子在37℃温育。(以1∶14.29的比例在人血清中稀释成100μM的siRNA储液，或在来自各种组织类型的人组织提取物中)。将五微升(5μl)在不同的时间点(例如0、30min、1h、3h、6h、8h、10h、16h和24h)加到15μl1.5×TBE上样缓冲液中。将样品立即在液氮中冷冻，并保持在-20℃。

将各样品上样到根据本领域已知的方法制备的非变性20％丙烯酰胺凝胶。在紫外灯下通过溴化乙锭显示寡聚物。

一般来讲，选择用于体外测试的具有特定序列的siRNA对人和第二物种诸如大鼠和兔子基因具有特异性。

对外切核酸酶的稳定性

为了研究3’非核苷酸部分对核酸分子有义链的稳定作用，在由不同细胞类型制备的胞质提取物中孵育有义链、反义链和退火的siRNA双链体。下面提供了在HCT116细胞中测试稳定性的方案。

提取物：HCT116胞质提取物(12mg/ml)。

提取缓冲液：25mMHepespH-7.3，37℃；8mMMgCl；在使用前添加现配的具有1mMDTT的150mMNaCl。

方法：将3.5ml测试siRNA(100mM)与含有120mgHCT116胞质提取物的46.5ml溶液混合。该46.5ml溶液由12mlHCT116提取物和34.5ml提取缓冲液组成，该缓冲液补充了DDT以及蛋白酶抑制剂混合物/100(Calbiochem，setIII-539134)。孵育管中siRNA的最终浓度为7mM。将样品在37℃孵育，并且在指定的时间点，取5ml移到新的管中，与15ml1XTBE-50％甘油上样缓冲液混合，并且在液氮中速冻。上样缓冲液中siRNA的最终浓度为1.75mM(21ngsiRNA/ml)。对于通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)和EtBr染色进行分析，每个泳道上样50ng。对于Northern分析，每个泳道上样1ng测试的siRNA。其它细胞类型包括HeLa和肝星状细胞(HSC)。

申请人已证实，包含3’末端烷基或烷基衍生物突出的核酸分子与钝端核酸分子和包含3’核苷酸突出的核酸分子相比表现出增强的稳定性。

示例性化合物

如上所述合成并测试了包含共价连接到3’末端的非核苷酸部分的siRNA化合物。图2提供了可用于RNAi的包含本文所公开的序列和修饰的化合物的表格。修饰的图例如下：前缀“z”表示共价连接到3’或5’末端核苷酸的部分(核苷酸或非核苷酸)。例如，zdT是指dT突出；zdT；zdT是指dTdT突出。前缀“y”表示核苷酸取代，例如yLdA是指取代有义链或反义链中的核糖核苷酸的L-脱氧核糖腺嘌呤；以及ydT是指取代有义或反义寡核苷酸中的核糖核苷酸的脱氧核糖胸苷。前缀“m”是指2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。另外的代码如下表B所示。

表B

在以下表格中，用于标记了“有义5-＞3反义5-＞3”的列的代码为表B中所示的代码。标记为“有义修饰”和“反义修饰”的列提供了用于各有义链和反义链的位置修饰的简要说明，例如20-C3；C3是指3’C3Pi-C3OH末端突出，以及20-dTdT是指3’dTdT末端突出(在19-mer上从第20位开始)；2，4，6，8，10，12，14，16，18-2′-OMe是指第2、4、6、8、10、12、14、16、18位的2'OMe糖修饰核糖核苷酸。

表1

表1中所示的数据表明，与钝的未修饰siRNA(1)相比，C3Pi-C3OH3’末端突出(2)改善了siRNA在细胞提取物中的核酸酶耐性。C3-C3的稳定作用与dTdT(3)和2′OMeU(4)3’末端突出类似。RAC1_2序列如SEQIDNO：5和6所示。

表2

表2中的数据表明，与未修饰的链(3)相比，C3-C33’末端突出(1)以及包含5’和3’反向的脱氧脱碱基部分的链(2)改善了链在细胞提取物中的核酸酶耐性。CASP2_4序列如SEQIDNO：1和2所示。

表3

表3中提供的数据表明：1)在反义链的3′末端或在有义链和反义链两者上引入C3-C3部分(3、4和7)、反向的脱氧脱碱基(2)、C3-核糖脱碱基(8)与钝端化合物(1和5)相比改善了siRNA活性，并且与具有3’dTdT突出的相同化合物(6)相比更具活性；以及2)包含3’末端C3-C3的化合物改善的活性不是由于细胞提取物中增强的稳定性，而是由于两种化合物(5和7)都高度稳定(至少36h)。

表4

表4中的数据表明：当在反义链和有义链的3’末端都存在C3C3时(2)与钝端(1)和只在一条链上存在C3-C3(3或4)相比获得了最显著的活性增强。

表5

表5中的数据表明：1)在反义链上存在C3OH(2)或C3Pi-C3Pi-C3OH(3)部分与钝siRNA(5)相比不会改善活性；以及2)在反义链上存在C3Pi-C3Pi(1)和C3Pi-C3Ps(4)部分与钝端化合物相比改善了活性并且该作用在C3Pi-C3Pi情况下最明显。

表6

表6中的数据表明：在有义链和反义链上均具有反向的脱氧脱碱基部分的化合物(1)比钝端化合物(4)或在一条链上具有反向的脱碱基部分的化合物(2或3)更具活性。

表7

表7中的数据表明：在反义链的3’末端以及有义链的3’末端都具有末端帽(反向的脱氧脱碱基部分)的双链RNA化合物与具有共价连接到反义链的3’末端的3’末端帽的dsRNA化合物相比(比较化合物2和3与化合物4和5)表现出增强的活性。

表8

表8中的数据表明：包含共价连接到反义链(引导链)3’末端的3’末端C3Pi-C3OH突出的双链RNA化合物(Z＝两个C3部分)表现出优异的活性(在20nM超过80％的敲低)，而不论互补有义链上的修饰如何(参见化合物1-7)。

化合物1-7利用如SEQIDNO：3和4所示的序列并包含共同的反义链(SEQIDNO：4)和不同的有义链，其中反义链包含共价连接到3’末端核苷酸的两个3’末端C3部分(C3Pi-C3OH)，有义链包含本申请所公开的多种修饰。化合物1有义链在第1-14位和19位包含未修饰的核糖核苷酸，并在第15-18位包含2’5’核糖核苷酸。化合物2有义链在第1-14位包含未修饰的核糖核苷酸，并在第15-19位包含2’5’核糖核苷酸，以及包含末端磷酸酯(P(O)3)。化合物3有义链在第1-14位包含未修饰的核糖核苷酸，并在第15-19位包含2’5’核糖核苷酸，以及包含3’末端C3Pi。化合物4有义链在第1-14位包含未修饰的核糖核苷酸，并在第15-19位包含2’5’核糖核苷酸，以及包含共价连接到3’末端核苷酸的3’末端氨基C6部分。化合物5有义链在第1-19位包含未修饰的核糖核苷酸(每个N’都未修饰)。化合物6有义链在第1-14位和19位包含未修饰的核糖核苷酸，并在第15-18位包含2’5’核糖核苷酸，以及包含共价连接到3’末端核苷酸的3’末端反向的脱碱基部分。化合物7有义链在第1-3、5、7-8、14-16和19位包含未修饰的核糖核苷酸，并在第4、6、9、10-13和17-18位包含脱氧核糖核苷酸，以及包含共价连接在反向的脱碱基部分(共价连接到3’末端核苷酸)5’末端的3’末端磷酸酯(Pi)和C3OH部分。

具有共价连接到有义链和反义链的3’末端的两个C3部分的化合物9比具有共价连接到反义链的3’末端的两个C3部分的类似化合物(8)更具活性。

实施例2：靶向CASP2的修饰核酸分子向视网膜的递送。

靶细胞siRNA递送、靶细胞基因敲低活性和靶基因mRNA裂解特异性的评估

例如在经玻璃体腔内注射进大鼠视网膜后，在靶组织中测量靶基因的敲低。

背景：在靶向CASP2基因的siRNA中进行不同的结构修饰，测试它们的外切核酸酶耐性。本研究的目的是检查包含如下所述的这些修饰的寡核苷酸的体内分布和活性。

S1003inv-dAb-GCCAGAAUGUGGAACUCCU-inv-dAb

AGGAGUUCCACAUUCUGGC-inv-dAb

S800GCCAGAAUGUGGAACUCCU

AGGAGUUCCACAUUCUGGC-C3Pi-C3OH

测试材料(S1003)的说明：具有以下结构的RNA双链体：有义链为具有反向的脱碱基部分作为5’和3’-帽的未修饰的19mer。反义链为在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位具有2’O-Me并具有反向的脱碱基部分作为3’-帽的19-mer，退火。提供的量：336μg。保存条件：-80℃。

测试材料(S800)的说明：具有以下结构的RNA双链体：有义链为在第18位具有L-DNA的19-mer。反义链为在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位具有2’OMe并在3’端具有两个(CH2)3丙二醇(C3Pi-C3OH)的19-mer。提供的量：840μg。保存条件：-80℃。

CNL：具有与S800的相同修饰但无连接到3’末端的C3Pi-C3OH部分的RNA双链体。

动物：年龄：6-8周龄雄性大鼠。180-220g

组大小：n＝4/10；动物总数：112

动物饲养管理：饮食：为动物提供随意采食的啮齿动物商品饲料(HarlanTeklad啮齿动物饲料)，并让其自由饮水。

环境：(i)习服至少5天。

(ii)将所有的动物关闭在活动受限的设施内，其具有在整个研究期间对环境进行控制的室内条件，以及根据HBI批准的标准操作规程(SOP)进行维持。将自动控制的环境条件设定为在研究室内维持20-24℃的温度、30-70％的相对湿度(RH)、12小时光照/12小时黑暗循环以及15-30次换气/小时。通过控制用计算机监控温度、相对湿度和光照循环。

实验设计在表2-1中提供

研究设计：对实验组I-XII的所有动物均以10μlPBS媒介物中的20μg供试品或对照品(CNL)剂量或仅10μlPBS媒介物经IVT单侧注射进左眼(LE)。实验组XIII将被用作正常对照。根据研究设计完成结束步骤(IVT治疗后1天、3天和7天)。

麻醉：通过异氟烷特殊回路系统(Stoelting，USA)将动物麻醉。用Mydramid(0.5％托吡卡胺)眼药水扩瞳。对于另外的局部麻醉，将使用Localin(0.4％盐酸奥布卡因)。使用Lacromycin(硫酸庆大霉素(相当于0.3％庆大霉素碱))滴眼液防止/减少术后炎症过程。

在解剖显微镜下进行玻璃体内注射。使用30/33号针头在颞侧角膜缘后方刺出1mm的切口，并将注射器针头(30/33号胰岛素注射器0.3ml，PIC0.8mm，Italy)插入切口1.5mm深(通过散开的瞳孔观察)。

预定的安乐死：根据研究设计(表，结束)对所有动物深度麻醉(Equithesine4ml/kgI.P)并实施安乐死(断头处死)。

组织采集：从所以动物剜出双眼，并保存在冰上。将使用显微镜对眼睛进行解剖，并根据样本评级量表(参见附录5的“眼睛病理学评分”)对大体病理学进行评级。将使用27/30G针头穿刺角膜，以从前房除去房水。使用显微外科刀片，沿着角膜缘产生切口，并且摘除角膜和晶状体。剩余的眼杯将通过经巩膜进行矢状切开而打开。将从眼杯中提取出视网膜，在PBS中漂洗，然后分离。使用细尖钳子，将视网膜采集到合适的试管中，在液氮中冷冻，然后转移到MolecularBiologyUnit提取总RNA。

评价

使用qPCR方法通过CASP2mRNA表达水平定量测定大鼠视网膜中靶向CASP2的siRNA的敲低活性。将通过RACE确认靶基因上的CASP2_4siRNA裂解位点，并通过S&LqPCR(茎环qPCR)进行了视网膜中的siRNA定量。

样品RNA分离：通过双重抽提根据用EZRNA进行总RNA分离的标准程序由视网膜样品处理RNA。通过qPCR进行CASP2_4siRNA定量：通过qPCRsiRNA定量法测量视网膜中CASP2_4siRNA的递送。使用SYBRGreen方法在AppliedBiosystem7300PCR系统上根据标准方法执行qPCR。在相应的实验组中，使用RACE(cDNA末端快速扩增)方法通过检测裂解产物，测定了大鼠视网膜中CASP2_4siRNA指导的CASP2mRNA裂解。如果显示预期裂解产物的证据，则将通过序列分析确认靶基因上的siRNA裂解位点，并任选地将使用qPCR进行裂解产物的定量。通过qPCR进行CASP2mRNA定量：在制备cDNA后，将通过qPCR进行CASP2mRNA定量来确认CASP2敲低。将使用SYBRGreen方法在AppliedBiosystem7300PCR系统上根据标准方法执行qPCR。

初步结果

初步结果表明S800比S1003更有效地摄入到了视网膜细胞。结果在下表2-2中示出。

表2-2

实施例3：靶向MYD88的修饰核酸分子向视网膜的递送。

靶细胞siRNA递送的评估。本研究的目的是：

1.1确定在单侧玻璃体内(IVT)注射后4小时、一天和三天时不同结构和修饰的MYD88_11siRNA向大鼠视网膜的递送。

1.2通过MYD88mRNA的qPCR确定在大鼠眼睛中经IVT注射后4小时、一天和三天时靶向MYD88的不同结构的MYD88_11siRNA的敲低活性。

背景：在靶向CASP2基因的siRNA中进行不同的结构修饰，测试它们的外切核酸酶耐性。本研究的目的是检查具有如本文所公开的修饰(具体地讲为如下所述的修饰)的双链RNA寡核苷酸的体内分布。

MYD88_11S5055′GAAUGUGACUUCCAGACCA

5′UGGUCUGGAAGUCACAUUC

MYD88_11S11595′idAb-GAAUGUGACUUCCAGACCA

5′UGGUCUGGAAGUCACAUUC-C3Pi-C3OH

MYD88_11S12705′OHC3-GAAUGUGACUUCCAGACCA-Pi

5′UGGUCUGGAAGUCACAUUC-C3Pi-C3OH

测试材料S505的说明：具有以下结构的RNA双链体：有义链为在第18位(小写粗体)具有一个L-DNA部分的未修饰19mer。反义链为在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位具有2’O-Me的19-mer，退火。保存条件：-80℃。

测试材料S1159的说明：具有以下结构的RNA双链体：有义链为具有作为5’帽的反向脱碱基部分和第15-18位的2’-5’桥RNA的19-mer。反义链为具有第1、4-6、9、12-13、15、17-19位的2’O-Me以及3’末端通过磷酸二酯键连接的两个1，3-丙二醇组成单元的19-mer。退火。保存条件：-80℃。

测试材料S1270的说明：具有以下结构的RNA双链体：有义链为具有第15-19位的2’5’核苷酸和末端磷酸酯(Pi)的19-mer。反义链为具有第1、4、5、6、9、12、13、15、17-19位的2’OMe以及3’末端的两个(CH2)3丙二醇(C3Pi-C3OH)的19-mer。退火。保存条件：-80℃。

动物：年龄：8-10周龄雄性大鼠。180-220g

组大小：n＝4/8；动物总数：104

环境：(i)习服至少5天。

研究设计：对实验组1-12的所有动物均以20μg供试品剂量或仅10μlPBS媒介物经IVT单侧注射进左眼(LE)。将实验组13用作正常对照。根据研究设计完成结束步骤(IVT治疗后4小时、1天和7天)。

实验设计在表3-1中提供

表3-1

麻醉：通过以下异氟烷特殊回路系统(Stoelting，USA)工作设置将动物麻醉：3-4.5％的混于O₂中的异氟烷，以600-800ml/min的O₂流速。用Mydramid(0.5％托吡卡胺(tropicamide))眼药水扩瞳。对于另外的局部麻醉，将使用Localin(0.4％盐酸奥布卡因)。使用Lacromycin(硫酸庆大霉素(相当于0.3％庆大霉素碱))滴眼液防止/减少术后炎症过程。

组织采集：从动物剜出双眼，并保存在冰上。将使用显微镜对眼睛进行解剖，并根据样本评级量表(参见附录5的“眼睛病理学评分”)对大体病理学进行评级。将使用27/30G针头穿刺角膜，以从前房除去房水。使用显微外科刀片，沿着角膜缘产生切口，并摘除角膜和晶状体。剩余的眼杯将通过经巩膜进行矢状切开而打开。将从眼杯中提取出视网膜，在PBS中漂洗，然后分离。使用细尖钳子，将视网膜采集到合适的试管中，在液氮中冷冻，并提取总RNA。

评价

将通过茎环qPCR执行视网膜中的siRNA定量，并将通过使用qPCR进行MYD88mRNA表达水平定量而测定大鼠视网膜中靶向MYD88的siRNA的敲低活性。

RNA分离：使用EZRNA试剂盒，根据标准程序，由视网膜样品处理RNA。

通过qPCR进行MYDD88siRNA定量：通过qPCRsiRNA定量(S&L)测量视网膜中MYDD88siRNA的递送。使用SYBRGreen方法在AppliedBiosystem7300PCR系统上根据标准程序执行qPCR。

通过qPCR进行MYDD88mRNA定量：使用标准程序制备cDNA，并通过qPCR进行MYD88mRNA定量来确认MYDD88敲低。将使用SYBRGreen方法在AppliedBiosystem7300PCR系统上执行qPCR。

初步结果在下表3-2中提供。

C3C3修饰化合物(S1159和S1270)向视网膜神经节细胞的递送明显高于具有钝端的化合物(S505)的递送(参见“中值”列中提供的数据。值以飞摩尔为单位给出)。

表3-2

实施例4：急性肾衰竭(ARF)的模型系统

ARF是一种特征在于在数天内发生肾功能急速衰退的临床综合征。不受理论的约束，急性肾损伤可能是肾缺血-再灌注损伤的结果，诸如接受大型手术(诸如大型心脏手术)的患者中的肾缺血-再灌注损伤。ARF的主要特征是肾小球滤过率(GFR)的急剧降低，从而导致氮废物(尿素、肌酸酐)的截留。最近的研究表明肾组织的细胞凋亡在大部分人类ARF病例中都明显存在。凋亡细胞死亡的主要部位为远端肾单位。在缺血性损伤的初始阶段，肌动蛋白细胞骨架完整性的丧失导致上皮细胞扁平化，且刷状缘缺失、病灶细胞失去接触以及随后细胞与下面的基底脱离。

使用缺血-再灌注诱导的ARF的动物模型，测试活性siRNA化合物，如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392中所示。

可有利地对现有siRNA进行修饰，并可设计和制备将来的siRNA以提供活性核酸分子。在非限制性实例中，在上述模型系统中测试利用如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)所示的寡核苷酸对的siRNA化合物，尤其是针对特定促凋亡基因具体为TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF和SPP1基因并进一步包含根据本发明的至少一个3’突出的siRNA化合物，并发现它们可预防缺血-再灌注。

实施例5：褥疮或压力性溃疡的模型系统

包括糖尿病溃疡的褥疮或压力性溃疡是当持续性压力(通常来自床或轮椅)切断身体脆弱部分的循环时发生的皮肤和组织损伤区域，尤其是臀部、髋部和脚跟上的皮肤。血流不足导致受影响组织的缺血性坏死和溃疡。褥疮最常见于感觉能力低下或无感觉能力或者虚弱、憔悴、瘫痪或长期卧床不起的患者。骶骨、坐骨、大转子、外踝和脚跟上的组织尤其易患；其它部位也可能根据患者的情况而牵涉到。

在如Reid等，JSurg.Res.116：172-180，2004所述的小鼠模型中，测试本发明的活性抑制剂(诸如siRNA化合物)用于治疗褥疮、溃疡和类似伤口。

Mustoe等JCI，1991.87(2)：694-703；Ahn和Mustoe，AnnPlSurg，1991.24(1)：17-23描述了另外的兔子模型，并用于测试如本文所公开的设计并合成的siRNA化合物。可有利地对现有siRNA进行修饰，并可设计和制备将来的siRNA以提供活性核酸分子。在一些实施方案中，在动物模型中测试利用如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)所示的寡核苷酸对的siRNA化合物，尤其是针对CIQBP、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43或TYROBP基因的并进一步包含根据本发明的至少一个3’非核苷酸突出的化合物，表明这些siRNA化合物可治疗和/或预防褥疮和溃疡。

实施例6：慢性阻塞性肺病(COPD)的模型系统

慢性阻塞性肺病(COPD)的主要特征在于肺气肿，其为终末细支气管远端的外周气道永久性破坏。肺气肿的特征还在于细支气管和蜂窝结构中炎性细胞诸如巨噬细胞和中性粒细胞的集聚。肺气肿和慢性支气管炎可作为COPD的一部分或独立地发生。

在诸如如下所公开的那些动物模型中，测试本发明的活性抑制剂(诸如siRNA)用于治疗COPD/肺气肿/慢性支气管炎：

Starcher和Williams，1989.Lab.Animals，23：234-240；Peng，等，2004.；AmJRespirCritCareMed，169：1245-1251；Jeyaseelan等，2004.Infect.Immunol，72：7247-56。另外的模型在转让给本申请受让人的PCT专利公布WO2006/023544中有所描述，该专利公布据此以引用方式并入本申请。

可有利地对现有siRNA进行修饰，并可设计和制备将来的siRNA以提供活性核酸分子。在一些实施方案中，在这些动物模型中测试利用如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)所示的寡核苷酸对的siRNA化合物，尤其是针对CIQBP、BNIP3、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF和DUOXl基因并进一步包含如本文所公开的至少一个3’突出的siRNA，表明这些siRNA化合物可治疗和/或预防肺气肿、慢性支气管炎和COPD。

实施例7：脊髓损伤的模型系统

脊髓损伤或脊髓病是一种导致感觉和/或运动丧失的脊髓障碍。这两种常见类型的脊髓损伤因创伤和疾病所致。创伤的原因尤其有车祸、跌倒、枪击、潜水意外，和可影响脊髓的疾病包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤和弗里德赖希共济失调。

可有利地对现有siRNA进行修饰，并可设计和制备将来的siRNA以提供活性核酸分子。在一些实施方案中，在此动物模型中测试利用如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)所示的寡核苷酸对的siRNA化合物，并尤其是针对LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、HRK、CIQBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、CX43、TYROBP、CTGF和RHOA基因并进一步包含如本文所公开的至少一个3’突出的siRNA，表明这些siRNA化合物可促进脊髓损伤后的功能恢复并因而可用于治疗脊髓损伤。

实施例8：青光眼的模型系统

在例如如Pease等，J.Glaucoma，2006，15(6)：512-9(ManometriccalibrationandcomparisonofTonoLabandTonoPentonometersinratswithexperimentalglaucomaandinnormalmice)所述的动物模型中，测试本发明的活性抑制剂(诸如siRNA)用于治疗或预防青光眼。

可有利地对现有siRNA进行修饰，并可设计和制备将来的siRNA以提供活性核酸分子。在一些实施方案中，在此动物模型中测试利用如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)所示的寡核苷酸对，尤其是针对TP53BP2、LRDD、CYBA、ATF3、CASP2、HRK、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1和RHOA基因并进一步包含如本文所公开的至少一个3’非核苷酸突出的siRNA化合物，表明这些siRNA化合物可治疗和/或预防青光眼。

实施例8A：缺血性视神经病变(ION)的模型系统

使用视神经夹伤方案，在成年Wistar大鼠中建立缺血性视神经病变的动物模型。在视神经夹伤前七天，通过向上丘施加逆行示踪剂FluoroGold(2％，Fluorochrome，Englewood，CO)而选择性标记视网膜神经节细胞(RGC)。示踪剂通过逆运输沿RGC轴突转运，导致在注射荧光示踪剂后1周内完整且特异性标记所有RGC。在逆行示踪后7天使动物经历视神经夹伤。通过眶上入路暴露出眼眶视神经，并且通过距筛状板2mm用钳子夹10秒，切断视神经中的所有轴突。在视神经夹伤时，使用微玻璃针将单剂量20μg/5μl的根据本发明的siRNA化合物的PBS显微注射进神经头前2mm的玻璃体。在视神经夹伤后7天，通过在平铺视网膜上进行FluoroGold标记的RGC的计数，来测定RGC的存活数。在视神经夹伤后1周时，使用4％多聚甲醛通过心脏灌注实验动物。解剖出两视网膜，再固定30分钟，然后平铺在载玻片上，用于神经节细胞层定量。在每个视网膜中的16个不同区域对荧光RGC进行计数，并且与从完全未接受视神经夹伤的大鼠中获取的样品或从接受了视神经夹伤并注射了PBS、对照siRNA或GFPsiRNA的大鼠中获取的样品进行比较，从而确定RGC的存活百分比。可能在RGC染色的细胞吞噬作用后并入了FluoroGold的小胶质细胞通过它们的特征形态而区分并从定量分析中排除。

其中通过靠近眼睛横切视神经而切开整个RGC群的视神经切断术的另一种模型可用于测试本发明的化合物和组合物(ChengL，等J.Neurosci.May15，20022002；22：3977-3986)。

实施例9：大鼠肺移植后缺血/再灌注损伤的模型系统

在一个或多个实验动物模型中，例如，如Mizobuchi等，2004.J.HeartLungTransplant，23：889-93；Huang，等，1995.J.HeartLungTransplant.14：S49；Matsumura，等，1995.Transplantation59：1509-1517；Wilkes，等，1999.Transplantation67：890-896；Naka，等，1996.CirculationResearch，79：773-783所述，测试本发明的活性抑制剂(诸如siRNA)用于治疗或预防肺移植后的缺血/再灌注损伤或缺氧损伤。

可有利地对现有siRNA进行修饰，并可设计和制备将来的siRNA以提供活性核酸分子。在一些实施方案中，在这些模型中测试利用如PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)所示的寡核苷酸对，尤其是针对TP53BP2、LRDD、CYBA、CASP2、BNIP3、RAC1和DUOX1基因的并进一步包含如本文所公开的至少一个3’非核苷酸突出的siRNA化合物，这表明这些siRNA化合物可治疗和/或预防肺移植后的缺血/再灌注损伤并因而可结合移植手术使用。

实施例10：急性呼吸窘迫综合征的模型系统

在如Chen等(JBiomedSci.2003；10(6Pt1)：588-92所述的动物模型中测试本发明的活性抑制剂(诸如siRNA)用于治疗急性呼吸窘迫综合征。在此动物模型中，测试根据PCT专利申请公布No.WO/2009/044392的表B(B1-B74)、表C(C1-C4)和表D(D1-D34)的，尤其是针对CYBA、HRK、BNIP3、MAPK8、MAPK14、RAC1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、SPP1和DUOX1基因并进一步包含如本文所公开的至少一个3’突出的siRNA化合物，表明这些siRNA可治疗和/或预防急性呼吸窘迫综合征并因而可用于治疗此病症。

实施例11：骨关节炎(OA)动物模型

胶原诱导型关节炎(CIA)：Trentham等对小鼠CIA进行了描述(1977.J.Exp.Med.146：857-868)。佐剂诱导型关节炎(AA)：Kong等对AA进行了描述(1999.Nature，402：304-308)。Han等对半月板切除模型进行了描述(1999.NagoyaJMedSci62(3-4)：115-26)。

除了本领域已知的体外模型外，使用上述模型中的一种或多种对不同siRNA抑制剂(诸如针对SSP1的siRNA)对与OA相关的不同参数(诸如软骨细胞增殖、终末分化和关节炎发展)的影响进行评价。在这些动物模型中对针对特定促凋亡基因(特别是针对SSP1)并进一步包含如本文所公开的至少一个3’突出的siRNA化合物进行测试，表明这些siRNA可治疗和/或预防OA并因而可用于治疗此病症。

实施例12：移植相关急性肾损伤的大鼠模型系统

热缺血-在实验大鼠中，施行左肾切除术，然后进行自体移植，其导致45分钟的热移植肾保存期。自体移植后，对同一动物施行右肾切除术。在收获移植肾前(模拟供体治疗)(“pre”)或在肾自体移植后(模拟受体治疗)或在收获前和移植后(合并的供体和受体治疗)(“pre-post”)，经股静脉施用针对靶的化学修饰siRNA。

冷缺血-对供体动物施行左肾切除术，然后将收获的肾冷保存(在冰上)5小时的时间。在此期间结束时，受体大鼠将接受双侧肾切除术，然后移植冷保存的移植肾。总热缺血时间(包括手术过程)为约30分钟。经股静脉将化学修饰的siRNA在收获肾脏之前(“pre”)施用到供体动物或者在移植后15分钟(“post15min”)或4小时(post4h)注射到受体动物。

为了评估siRNA在改善移植后肾功能方面的功效，在热缺血和冷缺血两种模型中在移植后第1天、第2天和第7天测量血清肌酸酐水平。

Claims

1.一种双链核酸分子，所述双链核酸分子包含有义链和反义链，其中至少所述反义链包含非核苷酸突出，所述非核苷酸突出通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接在其所存在的链的3’末端核苷酸的糖残基的3’或2’位；其中所述非核苷酸突出包含选自由下列组成的组的C3烷基部分：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi、C3Ps-C3Ps、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps，其中Pi表示无机磷酸酯，Ps表示硫代磷酸酯，rAb表示核糖脱碱基部分，且dAb表示脱氧核糖脱碱基部分；

或所述分子的药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述的双链核酸分子，具有结构(A1)

(A1)5’(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)

其中Z包含通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接在3’末端核苷酸的糖残基的3’或2’位的非核苷酸突出；其中所述非核苷酸突出包含选自由下列组成的组的C3烷基部分：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi、C3Ps-C3Ps、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps

其中Z’存在或不存在；

其中x和y的每一个独立地为18与40之间的整数；

其中(N’)y的序列与(N)x的序列具有互补性；并且其中(N)x的序列与靶RNA中的连续序列具有互补性；

或所述分子的药学上可接受的盐。

3.如权利要求2所述的分子，其中(N)x和(N’)y完全互补。

4.如权利要求2所述的分子，其中x＝y＝19。

5.如权利要求2所述的分子，其中Z'是存在的。

6.如权利要求5所述的分子，其中Z’是无机磷酸酯或非核苷酸突出，所述非核苷酸突出选自由下列组成的组：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烷基部分或其衍生物及其组合。

7.如权利要求6所述的分子，其中Z’是选自由C3OH、C3Pi和C3Ps组成的组的烷基部分。

8.如权利要求6所述的分子，其中Z’是无机磷酸酯。

9.如权利要求6所述的分子，其中Z和Z’的每一个独立地包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi和C3Ps-C3Ps。

10.如权利要求2所述的分子，其中Z包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi和C3Ps-C3Ps。

11.如权利要求6所述的分子，其中Z和Z’的每一个独立地包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps。

12.如权利要求2所述的分子，其中Z包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps。

13.如权利要求5所述的分子，其中Z由C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH组成。

14.如权利要求13所述的分子，其中Z由C3Pi-C3OH组成。

15.如权利要求13所述的分子，其中Z由C3Pi-C3Pi组成。

16.如权利要求13所述的分子，其中Z’选自由C3OH、C3Pi和C3Ps组成的组。

17.如权利要求2-16任一项所述的分子，其中x＝y＝19并且(N)x在第2、4、6、8、11、13、15、17和19位的每一个包含2'OMe糖修饰的核糖核苷酸。

18.如权利要求2-16任一项所述的分子，其中x＝y＝19并且(N)x在第1、3、5、7、9、11、13、15、17和19位的每一个包含2'OMe糖修饰的核糖核苷酸。

19.如权利要求2-16任一项所述的分子，其中x＝y＝19并且(N’)y在第18位包含L-DNA。

20.如权利要求17所述的分子，其中x＝y＝19并且(N’)y在第18位包含L-DNA。

21.如权利要求18所述的分子，其中x＝y＝19并且(N’)y在第18位包含L-DNA。

22.如权利要求2-16任一项所述的分子，其中x＝y＝19并且(N’)y包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。

23.如权利要求17所述的分子，其中x＝y＝19并且(N’)y包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。

24.如权利要求18所述的分子，其中x＝y＝19并且(N’)y包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。

25.如权利要求2所述的分子，其中所述(N)x不与靶RNA完全互补。

26.如权利要求1所述的分子，具有如下所示的结构(A2)：

(A2)5’N1-(N)x-Z3’(反义链)

3’Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)

其中x和y的每一个独立地为17与39之间的整数；

其中N1共价结合到(N)x并与N2形成Watson-Crick碱基对；

其中N1与所述靶RNA错配或为与所述靶RNA互补的DNA部分；

其中Z包含通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接在3’末端核苷酸的糖残基的3’或2’位的非核苷酸突出，其中所述非核苷酸突出选自由下列组成的组的C3烷基部分：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi、C3Ps-C3Ps、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps；并且

其中Z’存在或不存在；

或所述分子的药学上可接受的盐。

27.如权利要求26所述的分子，其中(N)x与哺乳动物或非哺乳动物RNA中的连续序列具有互补性。

28.如权利要求26所述的分子，其中x＝y＝18。

29.如权利要求26所述的分子，其中N1选自由下列组成的组：核糖腺苷、修饰的核糖腺苷、脱氧核糖腺苷、修饰的脱氧核糖腺苷。

30.如权利要求26所述的分子，其中N1选自由下列组成的组：核糖尿苷、脱氧核糖尿苷、修饰的核糖尿苷以及修饰的脱氧核糖尿苷。

31.如权利要求26所述的分子，其中N1为修饰的核糖腺苷或修饰的核糖尿苷。

32.如权利要求31所述的分子，其中N1为2’OMe糖修饰的核糖尿苷或2’OMe糖修饰的核糖腺苷。

33.如权利要求26所述的分子，其中N2为2’OMe糖修饰的核糖核苷酸或2’OMe糖修饰的脱氧核糖核苷酸。

34.如权利要求26所述的分子，其中Z'是存在的。

35.如权利要求34所述的分子，其中Z’是无机磷酸酯或非核苷酸突出，所述非核苷酸突出选自由下列组成的组：脱碱基部分、反向的脱碱基部分、烷基部分或其衍生物及其组合。

36.如权利要求35所述的分子，其中Z’是选自由C3OH、C3Pi和C3Ps组成的组的烷基部分。

37.如权利要求35所述的分子，其中Z’是无机磷酸酯。

38.如权利要求34所述的分子，其中Z和Z’的每一个独立地包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi和C3Ps-C3Ps。

39.如权利要求26所述的分子，其中Z包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi和C3Ps-C3Ps。

40.如权利要求34所述的分子，其中Z和Z’的每一个独立地包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps。

41.如权利要求26所述的分子，其中Z包含选自由下列组成的组的非核苷酸突出：C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps。

42.如权利要求26所述的分子，其中Z由C3Pi-C3Pi或C3Pi-C3OH组成。

43.如权利要求42所述的分子，其中Z由C3Pi-C3OH组成。

44.如权利要求42所述的分子，其中Z由C3Pi-C3Pi组成。

45.如权利要求26-44任一项所述的分子，其中x＝y＝18并且(N’)y在第17位包含镜像核苷酸。

46.如权利要求45所述的分子，其中所述镜像核苷酸为L-DNA。

47.如权利要求26-44任一项所述的分子，其中x＝y＝18并且(N’)y包含通过2’-5’核苷酸间键接合到相邻核苷酸的核苷酸。

48.如权利要求26-44任一项所述的分子，其中(N)x包含至少一个2-OMe糖修饰的核糖核苷酸。

49.如权利要求45所述的分子，其中(N)x包含至少一个2-OMe糖修饰的核糖核苷酸。

50.如权利要求46所述的分子，其中(N)x包含至少一个2-OMe糖修饰的核糖核苷酸。

51.如权利要求47所述的分子，其中(N)x包含至少一个2-OMe糖修饰的核糖核苷酸。

52.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-16和26-44任一项所述的分子和药学上可接受的载体。

53.如权利要求1-16和26-44任一项所述的分子在制备用于治疗患有与靶基因的表达相关的疾病或病况的受试者的药物中的用途。

54.一种用于制备介导靶RNA裂解的双链RNA分子的方法，所述方法包括：

(a)合成具有18至27个核苷酸的长度并与所述靶RNA中的序列具有同一性的RNA链，

(b)合成与(a)的所述RNA链具有互补性的第二条RNA链；以及

(c)在适于形成双链RNA分子的条件下对所述合成的RNA链退火，其中所述双链RNA分子具有长度为14至25个核苷酸的双链区域以及非核苷酸突出，所述非核苷酸突出通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接在至少所述第二RNA链的3’末端的糖残基的3’或2’位；其中所述非核苷酸突出包含选自由下列组成的组的C3烷基部分：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi、C3Ps-C3Ps、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps，其中Pi表示无机磷酸酯，Ps表示硫代磷酸酯，rAb表示核糖脱碱基部分，且dAb表示脱氧核糖脱碱基部分。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述RNA链具有19-21个核苷酸的长度。

56.一种制备能够下调靶基因表达的双链RNA分子的方法，其中每条RNA链具有19至25个核苷酸的长度，其中至少一条链具有非核苷酸突出，所述非核苷酸突出通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接在其3’末端的糖残基的3’或2’位，所述方法包括(a)合成两条长度均为19至25个核苷酸的RNA链，其中所述RNA链能够形成双链RNA分子，(b)在一定条件下合并所述合成的RNA链，其中形成介导靶核酸下调的双链RNA分子，其中所述双链RNA分子由单个双链区域和至少一个单链区域组成，所述至少一个单链区域包含非核苷酸突出，所述非核苷酸突出共价连接在其所存在的链的3’末端的糖残基的3’或2’位；其中所述非核苷酸突出包含选自由下列组成的组的C3烷基部分：C3Pi-C3OH、C3Pi-C3Pi、C3Pi-C3Ps、C3Ps-C3OH、C3Ps-C3Pi、C3Ps-C3Ps、C3Pi-rAb、C3Pi-dAb、C3Ps-rAb、C3Ps-dAb、rAbPi-C3OH、rAbPs-C3OH、rAbPi-C3Pi、rAbPs-C3Pi、dAbPi-C3OH、dAbPs-C3OH、dAbPi-C3Pi、dAbPi-C3Ps、dAbPs-C3Pi和dAbPs-C3Ps，其中Pi表示无机磷酸酯，Ps表示硫代磷酸酯，rAb表示核糖脱碱基部分，且dAb表示脱氧核糖脱碱基部分。