CN103492572A - 用于治疗肺疾病和损伤的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于治疗哺乳动物的肺疾病、病症和损伤的治疗方法,其包括治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植之后的闭塞性细支气管炎以及肺移植诱发的急性移植物功能障碍,包括治疗、预防原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植(特别在肺移植中)之后的原发性移植物功能障碍(PGD)的或阻止所述疾病发展,包括下调TLR2基因或TLR2基因与TLR4基因两者。本文提供了用于治疗肺疾病、病症和损伤的组合物、方法以及试剂盒。
Description
相关申请
本申请要求2011年3月3日提交、名称为“用于治疗肺疾病和损伤的组合疗法(Combination Therapy for Treating Lung Disease AndInjury)”的美国临时申请序列号61/448,723的权益,并且所述申请以引用的方式整体并入本文并用于所有的目的。
序列表
本申请包含名称为228-PCT1_ST25.txt、在2012年2月6日创建且大小为2,280kb的序列表,并且所述序列表以引用的方式整体并入本文。
在本申请中引用了各种专利和出版物。这些文件的公开内容以引用的方式整体并入本申请以更充分地描述本发明所属领域的状态。
发明领域
本文提供了用于治疗肺疾病和损伤的组合物、方法以及试剂盒。
发明概述
本文提供了用于治疗肺疾病的组合物、方法以及试剂盒。在某些方面和实施方案中,提供了用于治疗哺乳动物的肺病症或损伤的疗法的组合物和方法,其包括治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素(bleomycin)诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植诱发的急性移植物功能障碍以及肺移植之后的闭塞性细支气管炎。在某些方面和实施方案中,提供了用于治疗或预防与器官移植(特别是肺移植)相关的炎症和/或移植物排斥的组合疗法的组合物和方法,其包括治疗、预防或减弱原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植之后(特别在肺移植中)的原发性移植物功能障碍(PGD)的发展。在某些方面和实施方案中,提供了用于治疗哺乳动物的肺病症或损伤的组合疗法的组合物和方法。所述组合物和方法涉及抑制基因Toll样受体2(TLR2)或基因Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)。
在各种方面和实施方案中,本文提供的组合物、方法和试剂盒可以靶向、减少、下调或抑制基因Toll样受体2(TLR2)的表达/活性/功能。在各种方面和实施方案中,本文所提供的组合物、方法和试剂盒可以靶向、减少、下调或抑制以下基因的表达/活性/功能:(i)Toll样受体2(TLR2)和(ii)Toll样受体4(TLR4)。
一方面,提供了一种用于治疗有需要的哺乳动物的肺病症、疾病或损伤的方法。所述方法可以包括以有效治疗所述哺乳动物的量对所述哺乳动物施用选自TLR2抑制剂或其药学上可接受盐或前药的至少一种治疗剂。
另一方面,提供了一种用于治疗有需要的哺乳动物的肺病症、疾病或损伤的方法。所述方法可以包括以有效治疗所述哺乳动物的量对所述哺乳动物施用选自以下的至少两种治疗剂:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药。
所述方法可以包括预防、治疗、改善和/或减慢受试者的肺病症或损伤的发展,所述肺病症或损伤如但不限于ARDS、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、COPD以及与肺移植相关的疾病、病症或损伤。所述方法可以涉及通过对所述受试者施用治疗有效量的针对基因TLR2的治疗剂来治疗、改善和/或减慢上述疾病或病状或其相关症状或并发症的发展。所述方法可以涉及通过对所述受试者施用治疗有效量的至少一种下调TLR2的治疗剂和至少一种下调TLR4的治疗剂来治疗、改善和/或减慢上述疾病或病状或其相关症状或并发症的发展。所述方法可以涉及通过对所述受试者施用治疗有效量的能够下调基因TLR2和TLR4和/或基因TLR2和TLR4的基因产物的单一治疗剂来治疗、改善和/或减慢上述疾病或病状或其相关症状或并发症的发展。
在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗方法组合来抑制基因Toll样受体2(TLR2):手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗生素疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法以及营养补充剂。在各种实施方案中,在所提供的用于治疗肺病症、疾病或损伤的方法之前、之后或同时施用另外的治疗。在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与免疫抑制剂疗法组合来抑制基因Toll样受体2(TLR2)。在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗方法组合来抑制基因Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4):手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗生素疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法以及营养补充剂。在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与免疫抑制剂疗法组合来下调基因Toll样受体2(TLR2)和基因Toll样受体4(TLR4)。
在某些实施方案中,所提供的方法可以包括以下一种或多种:
A.施用包含选自TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的治疗剂;以及药学上可接受的载剂的药物组合物;或者
B.联合施用(例如同时或按序)治疗有效量的至少两种治疗剂,其中至少一种治疗剂是用于下调基因TLR2并且至少一种治疗剂是用于下调基因TLR4;并且所述治疗剂选自:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;或者
C.施用包含至少两种治疗剂的组合的药物组合物,其中至少一种治疗剂是用于下调基因TLR2并且至少一种治疗剂是用于下调基因TLR4;并且所述治疗剂选自:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂;或者
D.施用包含能够下调基因TLR2和TLR4和/或基因TLR2和TLR4的基因产物的治疗剂的药物组合物。这些单一药剂的非限制性实例是在PCT专利公布号WO2007/091269中公开的串联且多臂的RNAi分子。
一方面,提供了一种药剂,其包括靶向、减少、下调或抑制基因TLR2的表达/活性/功能的治疗剂或其药学上可接受的盐或前药。适用于如本文所提供的组合中的治疗剂包括但不限于小有机分子化合物;蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。
一方面,提供了一种药剂,其包括靶向、减少、下调或抑制以下基因的表达/活性/功能的至少两种治疗剂:(i)TLR2和(ii)TLR4,其中至少一种治疗剂下调基因TLR2并且至少一种治疗剂下调基因TLR4;并且所述治疗剂选自:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药。适用于如本文提供的组合中的治疗剂包括但不限于小有机分子;蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。
在一些实施方案中,所述治疗剂包含核酸分子。在一些实施方案中,各核酸分子独立地选自由以下组成的组:结合编码选自TLR2和TLR4的靶基因的核苷酸序列(如mRNA序列)的反义分子、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA),例如:
●如SEQ ID NO:1(gi|68160956|ref|NM_003264.3|智人Toll样受体2(TLR2),mRNA)所例示的人TLR2的mRNA编码序列,或者
●如SEQ ID NO:2(gi|207028550|ref|NR_024169.1|智人Toll样受体4(TLR4),转录变异体4,非编码mRNA)所例示的人TLR4的mRNA编码序列;或者
●如SEQ ID NO:3(gi|207028620|ref|NM_138554.3|智人Toll样受体4(TLR4),转录变异体1,mRNA)所例示的人TLR4的mRNA编码序列;或者
●如SEQ ID NO:4(gi|207028451|ref|NR_024168.1|智人Toll样受体4(TLR4),转录变异体3,非编码RNA)所例示的人TLR4的mRNA编码序列。
在各种实施方案中,各核酸分子是或包括dsRNA分子或siRNA分子。在各种实施方案中,所述核酸分子(a)包括有义链和反义链;(b)所述核酸分子的各链的长度独立地是17至40个核苷酸;(c)反义链的17至40个核苷酸序列与编码人TLR2(例如,SEQ ID NO:1)或TLR4(例如,SEQ ID NO:2至4)的mRNA序列互补;并且(d)有义链的17至40个核苷酸序列与反义链的序列互补并且包括编码人TLR2(例如,SEQ ID NO:1)或TLR4(例如,SEQ ID NO:2至4)的mRNA的17至40个核苷酸序列。
如本文所提供的药物产品可例如为包含处于药学上可接受的载剂中的治疗剂的药物组合物。如本文所提供的药物产品可以例如是包含处于药学上可接受的载剂中的第一和第二治疗剂的混合物的药物组合物。或者,所述药物产品可例如为包含第一治疗剂的制剂和第二治疗剂的制剂以及任选地用于对有需要的患者同时、连续或单独地施用所述制剂的说明书的试剂盒。
在第一个方面,提供了一种预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法,其包括对所述受体施用治疗有效量的至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及治疗有效量的至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药,由此预防或减轻所述受体的PGD症状。在各种实施方案中,PGD症状包括炎症、急性移植物排斥、移植物排斥、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、肺功能受损、闭塞性细支气管炎、血氧合作用受损、炎症性细胞因子的产生增加、移植物内和气道内粒细胞积累、肺水肿以及血氧不足。
在一些实施方案中,肺移植受体是具有发展原发性移植物功能障碍(PGD)的风险或者正在治疗原发性移植物功能障碍(PGD)的人。在一些实施方案中,如本文提供的所述方法可以例如用于预防或减轻冷缺血相关的PGD的症状。或者,所述方法可以例如用于预防或减轻热缺血相关的PGD的症状。
在各种实施方案中,施用所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药引起以下一种或多种结果:肺水肿减轻、血氧合作用增加、血氧合作用得到保持、肺功能得到改善、肺移植受体的肺功能得到保持以及移植的肺的肺功能得到改善。
在各种实施方案中,在肺移植之前、期间或之后对肺移植受体施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
在一些实施方案中,在同一制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。或者,在不同制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
在一些实施方案中,通过相同途径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在其它实施方案中,通过不同途径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在各种实施方案中,所述方法包括同时施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在一些实施方案中,所述方法包括单独施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在一些实施方案中,所述方法包括组合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在其它实施方案中,所述方法包括连续施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
在各种实施方案中,所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法进一步包括选自由以下组成的组的至少一种另外的治疗:手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法、营养补充剂及其任意组合。在各种实施方案中,在施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂之前、之后或同时施用所述另外的治疗。在一些实施方案中,所述另外的治疗包括免疫抑制剂疗法。
在各种实施方案中,施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂的途径选自:全身性施用或局部施用。在各种实施方案中,对肺移植受体施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂的方法选自包括以下的组:静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、直接注射、气管内滴注、吸入、鼻内、肺部以及经由泵施用到肺中。在一些实施方案中,通过吸入对肺移植受体施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂。在另外的实施方案中,通过气管内滴注对肺移植受体施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂。
在所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法的各种实施方案中,所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂各自独立地选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。在一些实施方案中,至少一种抑制剂包含核酸分子。在其它实施方案中,各抑制剂包含核酸分子。在一些实施方案中,各抑制剂包含核酸分子并且第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。在一些实施方案中,所述双链寡核苷酸一个接另一个地串联地连接或形成RNAistar时退火。
在一些实施方案中,所述第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;
并且所述第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;以及
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:1中列出,并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在一些实施方案中,在同一制剂中对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在其它实施方案中,在不同制剂中对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在一些实施方案中,通过相同途径对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在一些实施方案中,通过不同途径对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在各种实施方案中,对肺移植受体施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸的模式选自包括以下的组:单独施用、组合施用、同时施用以及连续施用。
在一些实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体施用一次。在其它实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体施用至少一天一次。在其它实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体施用多次。
在所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在结构(A1)的各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出,并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在结构(A1)的一些优选实施方案中,x=y=19。
在结构(A1)的一些实施方案中,(N)x包含选自由具有SEQ ID NO:723-1440、2247-3052、7076-8312和8459-8604的寡核苷酸组成的组的反义寡核苷酸并且(N’)y包含选自由具有SEQ ID NO:5-722、1441-2246、5839-7075以及8313-8458的寡核苷酸组成的组的互补有义链寡核苷酸。
在所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法的各种实施方案中,结合编码TLR2基因的核苷酸序列的所述至少一种双链寡核苷酸和结合编码TLR4基因的核苷酸序列的所述至少一种双链寡核苷酸的施用分别引起TLR2表达和TLR4表达的下调。
在所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法的一些实施方案中,至少一种双链化合物独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且其中(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的所述mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在结构(A2)的各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出,并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在结构(A2)的一些优选实施方案中,x=y=18。
在结构(A2)的一些实施方案中,(N)x的序列包含选自由具有SEQID NO:4153-5252、5546-5838、10319-12032以及12085-12136的寡核苷酸组成的组的反义链寡核苷酸并且(N’)y的序列包含选自由具有SEQ ID NO:3053-4152、5253-5545、8605-10318以及12033-12084的寡核苷酸组成的组的有义链寡核苷酸。
在第二方面,提供了一种用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法,所述方法包括对所述患者施用至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的治疗有效组合,由此治疗所述患者的肺病症、疾病或损伤。在各种实施方案中,所述肺病症、疾病或损伤选自急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、与肺移植相关的病症以及肺气肿。在一些实施方案中,所述肺病症、疾病或损伤是与肺移植相关的病症。在各种实施方案中,与肺移植相关的所述肺病症选自由以下组成的组:炎症、移植物排斥、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、急性移植物功能障碍、肺再移植反应、闭塞性细支气管炎以及原发性移植物功能障碍(PGD)。在一个实施方案中,与肺移植相关的所述肺病症是PGD。
在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的一些实施方案中,在同一制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在其它实施方案中,在不同制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在各种实施方案中,通过相同途径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在其它实施方案中,通过不同途径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。在各种实施方案中,施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂的模式选自包括以下的组:单独施用、组合施用、同时施用以及连续施用。
在一些实施方案中,所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法进一步包括选自由以下组成的组的至少一种另外的治疗:手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法、营养补充剂及其任意组合。在一些实施方案中,所述另外的治疗包括免疫抑制剂疗法。在各种实施方案中,在施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂之前、之后或同时施用所述另外的治疗。
在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的一些实施方案中,所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂的对所述患者的施用包括全身性施用或局部施用。在各种实施方案中,施用方法选自包括以下的组:静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、直接注射、气管内滴注、吸入、鼻内、肺部以及经由泵施用到肺中。在一些实施方案中,施用方法包括吸入。在一些实施方案中,施用方法包括气管内滴注。
在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的一些实施方案中,所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂各自是独立地选自由以下组成的组的抑制剂:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。在一些实施方案中,至少一种抑制剂包含核酸分子。在其它实施方案中,各抑制剂包含核酸分子。在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的各种实施方案中,第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。在一些实施方案中,所述双链寡核苷酸一个接另一个地串联地连接或形成RNAistar时退火。
在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的一些实施方案中,所述第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;
并且所述第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在一些实施方案中,在同一制剂中对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在其它实施方案中,在不同制剂中对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在一些实施方案中,通过相同途径对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在一些实施方案中,通过不同途径对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在各种实施方案中,对肺移植受体施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸的模式选自包括以下的组:单独施用、组合施用、同时施用以及连续施用。
在一些实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次。在其它实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用至少一天一次。在其它实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用多次。
在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在结构(A1)的各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在结构(A1)的一些优选实施方案中,x=y=19。
在结构(A1)的一些实施方案中,(N)x包含选自由具有SEQ ID NO:723-1440、2247-3052、7076-8312以及8459-8604的寡核苷酸组成的组的反义寡核苷酸并且(N’)y包含选自由具有SEQ ID NO:5-722、1441-2246、5839-7075以及8313-8458的寡核苷酸组成的组的有义链寡核苷酸。
在所提供的用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法的一些实施方案中,至少一种双链化合物包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且其中(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的所述mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在结构(A2)的各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在结构(A2)的一些优选实施方案中,x=y=18。
在结构(A2)的一些实施方案中,(N)x的序列包含选自由具有SEQID NO:4153-5252、5546-5838、10319-12032以及12085-12136的寡核苷酸组成的组的反义寡核苷酸并且(N’)y的序列包含选自由具有SEQ ID NO:3053-4152、5253-5545、8605-10318以及12033-12084的寡核苷酸组成的组的有义寡核苷酸。
另一方面,提供了一种组合物,其包含:至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂。在各种实施方案中,各抑制剂独立地选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。在一些实施方案中,各抑制剂独立地选自由以下组成的组:小有机分子;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。
在所提供的组合物的一些实施方案中,各抑制剂包含核酸分子。在一些实施方案中,第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。在所述组合物的一些实施方案中,所述核酸分子串联地连接或形成RNAistar时退火。
在所提供的组合物的一些实施方案中,第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;
并且第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ IDNO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在一些实施方案中,组合物中各双链寡核苷酸的量的范围独立地为约0.05mg至约10.0mg。
在所提供的组合物的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在所述组合物的各种实施方案中,在结构(A1)中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在所述组合物的一些优选实施方案中,在结构(A1)中,x=y=19。
在所述组合物的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸化合物独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z”5’(有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在所提供的组合物的各种实施方案中,在结构(A2)中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在所提供的组合物的一些优选实施方案中,在结构(A2)中,x=y=18。
在一些实施方案中,配制所提供的组合物以用于对所述受体施用一次。在其它实施方案中,配制所提供的组合物以用于对所述受体施用至少一天一次。在其它实施方案中,配制所提供的组合物以用于对所述受体施用多次。
另一方面,提供了一种试剂盒,其包含至少两种治疗剂,其中至少一种药剂包含TLR2抑制剂并且第二药剂包含TLR4抑制剂;以及任选地使用说明书。
在所提供的试剂盒的一些实施方案中,各治疗剂独立地选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。在所述试剂盒的一些实施方案中,至少一种治疗剂包含核酸分子。在所提供的试剂盒的其它实施方案中,各治疗剂包含核酸分子。
在所提供的试剂盒的一些实施方案中,第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。在所述的一些实施方案中,所述双链寡核苷酸一个接另一个地串联地连接或形成RNAistar时退火。
在所提供的试剂盒的一些实施方案中,第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR24的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;
并且所述第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在所提供的试剂盒的各种实施方案中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在所述试剂盒的一些实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于在同一制剂中对受体联合施用。在其它实施方案中,在不同制剂中对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在一些实施方案中,通过相同途径对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在一些实施方案中,通过不同途径对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。在各种实施方案中,对肺移植受体施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸的模式选自包括以下的组:单独施用、组合施用、同时施用以及连续施用。
在所提供的试剂盒的一些实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次。在其它实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用至少一天一次。在其它实施方案中,配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用多次。
在所提供的试剂盒的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在所提供的试剂盒的各种实施方案中,在结构(A1)中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在所提供的试剂盒的一些优选实施方案中,在结构(A1)中,x=y=19。
在所提供的试剂盒的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在所提供的试剂盒的各种实施方案中,在结构(A2)中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
在所提供的试剂盒的一些优选实施方案中,在结构(A2)中,x=y=18。
另一方面,提供了一种包装,其包含:A)至少两个选自以下的单独剂量单位:(i)包含TLR2抑制剂的至少一个剂量单位和(ii)包含TLR4抑制剂的至少一个剂量单位;以及任选地B)包含用于使用剂量单位的说明书的包装插页。
在所提供的包装的各种实施方案中,所述TLR2抑制剂是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸并且所述TLR4抑制剂是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
在所提供的包装的一些实施方案中,所述TLR2抑制剂是包含以下的双链寡核苷酸:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;
并且所述TLR4抑制剂是包含以下的双链寡核苷酸:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在所提供的包装的一些实施方案中,通过相同途径对患者联合施用所述剂量单位。在所述包装的其它实施方案中,通过不同途径对患者联合施用所述剂量单位。在各种实施方案中,施用所述剂量单位的模式选自包括以下的组:单独施用、组合施用、同时施用以及连续施用。
在所提供的包装的一些实施方案中,所述剂量单位被设计为对所述患者施用一次。在其它实施方案中,所述剂量单位是用于对所述患者施用至少一天一次。在其它实施方案中,所述剂量单位是用于对所述患者施用多次。
在所提供的包装的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在所提供的包装的一些实施方案中,至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在所提供的试剂盒或所提供的包装的各种实施方案中,所述说明书或包装插页指示所述治疗剂或剂量单位适合用于治疗罹患选自由以下组成的组的肺疾病、损伤或病症的患者:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、与肺移植相关的病症以及肺气肿。在所提供的试剂盒或所提供的包装的一些实施方案中,所述说明书或包装插页指示所述治疗剂或剂量单位适合用于治疗罹患与肺移植相关的病症的患者。
在所提供的试剂盒或所提供的包装的一些实施方案中,与肺移植相关的肺病症选自由以下组成的组:炎症、移植物排斥、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、急性移植物功能障碍、肺再移植反应、闭塞性细支气管炎以及原发性移植物功能障碍(PGD)。
另一方面,提供了一种预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法,所述方法包括对所述受体施用治疗有效量的至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药,由此预防或减轻受体的PGD的症状。
在所提供的方法的一些实施方案中,肺移植受体是正在治疗原发性移植物功能障碍(PGD)的人。在一些实施方案中,所述方法是用于预防或减轻冷缺血相关的PGD的症状。在其它实施方案中,所述方法是用于预防或减轻热缺血相关的PGD的症状。在所提供的方法的各种实施方案中,所述症状选自由以下组成的组:炎症、急性移植物排斥、移植物排斥、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、肺功能受损、闭塞性细支气管炎、血氧合作用受损、炎症性细胞因子的产生增加、移植物内和气道内粒细胞积累、肺水肿以及血氧不足。
在所提供的方法的一些实施方案中,施用治疗有效量的至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药引起以下一种或多种:肺水肿减轻、血氧合作用增加、血氧合作用得到保持、肺功能改善、肺移植受体的肺功能得到保持以及移植肺的肺功能得到改善。
在所提供的方法的各种实施方案中,在肺移植之前、期间或之后对肺移植受体施用所述至少一种TLR2抑制剂。
在各种实施方案中,所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法进一步包括选自由以下组成的组的至少一种另外的治疗:手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法、营养补充剂及其任意组合。在各种实施方案中,在施用至少一种TLR2抑制剂之前、之后或同时施用所述另外的治疗。在一些实施方案中,所述另外的治疗包括免疫抑制剂疗法。
在所提供的方法的各种实施方案中,施用至少一种TLR2抑制剂的途径选自:全身性施用或局部施用。
在各种实施方案中,对肺移植受体施用至少一种TLR2抑制剂的方法选自包括以下的组:静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、直接注射、气管内滴注、吸入、鼻内、肺部以及经由泵施用到肺中。在一些实施方案中,通过吸入对肺移植受体施用至少一种TLR2抑制剂。在另外的实施方案中,通过气管内滴注对肺移植受体施用至少一种TLR2抑制剂。
在所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法的各种实施方案中,所述至少一种TLR2抑制剂选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。在一些实施方案中,至少一种抑制剂包含核酸分子。在一些实施方案中,所述核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
在所提供的预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法的各种实施方案中,所述双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在所提供的方法的各种实施方案中,配制所述双链寡核苷酸以用于对所述受体施用一次。在所提供的方法的一些实施方案中,配制所述双链寡核苷酸以用于对所述受体施用至少一天一次。在其它实施方案中,配制所述双链寡核苷酸以用于对所述受体施用多次。
在所提供的方法的各种实施方案中,所述双链寡核苷酸包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含编码TLR2的mRNA的反义序列。
在所提供的方法的各种实施方案中,在结构(A1)中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出。
在所提供的方法的一些优选实施方案中,在结构(A1)中,x=y=19。
在所提供的方法的各种实施方案中,在结构(A1)中,(N)x包含存在于SEQ ID NO:723-1440和2247-3052中的反义寡核苷酸并且(N’)y包含存在于SEQ ID NO:5-722和1441-2246中的有义链寡核苷酸。
在所提供的方法的各种实施方案中,所述双链化合物包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且其中(N)x与编码TLR2的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与编码TLR2的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在所提供的方法的各种实施方案中,在结构(A2)中,TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出。
在所提供的方法的一些优选实施方案中,在结构(A2)中,x=y=18。
在所提供的方法的各种实施方案中,在结构(A2)中,(N)x的序列选自SEQ ID NO:4153-5252和5546-5838中的任一个并且(N’)y的序列选自SEQ ID NO:3053-4152和5253-5545中的任一个。
在所提供的方法的各种实施方案中,施用结合编码TLR2基因的核苷酸序列的至少一种双链寡核苷酸引起TLR2表达的下调。
另一方面,提供了一种试剂盒或包装,其包含:含有TLR2抑制剂的至少一个剂量单位;以及任选地使用说明书,其中所述说明书指示所述剂量单位适合用于治疗罹患选自由以下组成的组的肺疾病、损伤或病症的患者:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、与肺移植相关的病症以及肺气肿。
在一些实施方案中,所提供的试剂盒或包装用于在治疗罹患与肺移植相关的病症的患者中使用。
在所提供的试剂盒或包装的各种实施方案中,所述TLR2抑制剂选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。在所述试剂盒或包装的一些实施方案中,所述TLR2抑制剂选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。在所述试剂盒或包装的其它实施方案中,所述TLR2抑制剂包含核酸分子。
在所提供的试剂盒或包装的一些实施方案中,所述核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。在所述试剂盒或包装的一些实施方案中,所述双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
在所提供的试剂盒或包装的一些实施方案中,配制所述双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次。在一些实施方案中,配制所述双链寡核苷酸以用于对所述患者施用至少一天一次。在所提供的试剂盒或包装的一些实施方案中,配制所述双链寡核苷酸以用于对所述患者施用多次。
在所提供的试剂盒或包装的一些实施方案中,所述双链寡核苷酸包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含编码TLR2的mRNA的反义序列。
在所提供的试剂盒或包装的一些实施方案中,所述双链寡核苷酸包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且(N)x与编码TLR2的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与编码TLR2的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在一些实施方案中,所提供的试剂盒或包装用于在治疗罹患与肺移植相关的病症的患者中使用。在各种实施方案中,与肺移植相关的所述病症选自由以下组成的组:炎症、移植物排斥、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、急性移植物功能障碍、肺再移植反应、闭塞性细支气管炎以及原发性移植物功能障碍(PGD)。
另一方面,提供了包含以下的组合物的用途:至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂,所述用途为用于制备用于治疗或预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的药剂。
另一方面,提供了包含以下的组合物的用途:至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂,所述用途为用于治疗或预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状。
在所提供的用途的各种实施方案中,肺移植受体是正在治疗原发性移植物功能障碍(PGD)的人。在一些实施方案中,所述用途为用于预防或减轻冷缺血相关的PGD的症状。在其它实施方案中,所述用途为用于预防或减轻热缺血相关的PGD的症状。
在所述用途的各种实施方案中,所述症状选自由以下组成的组:炎症、急性移植物排斥、移植物排斥、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、肺功能受损、闭塞性细支气管炎、血氧合作用受损、炎症性细胞因子的产生增加、移植物内和气道内粒细胞积累、肺水肿以及血氧不足。
另一方面,提供了包含以下的组合物的用途:至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂,所述用途为用于制备用于治疗或预防选自以下的肺疾病、病症或损伤的药剂:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎以及肺气肿。
另一方面,提供了包含以下的组合物的用途:至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂,所述用途为用于治疗或预防选自以下的肺疾病、病症或损伤:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎以及肺气肿。
附图简述
图1示出组合施用25μg/小鼠的剂量的对TLR2具有特异性的双链RNA(dsRNA)和25μg/小鼠的剂量的对TLR4具有特异性的双链RNA(dsRNA),有效减轻了移植的小鼠肺中的移植后肺水肿和出血。正位肺移植后24小时时获得受体的肺的照片。左图:在肺移植手术结束时(吻合开口后立即)通过气管内滴注而对所述受体施用dsRNA组合(对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合,各dsRNA为25μg/小鼠(在图中标识为“siRNA混合液,25μg”))。右图:媒介物。箭头:显著出血。
图2示出靶向TLR2和TLR4基因的双靶dsRNA组合(第3列和第4列)恢复了所述受体肺的肺功能。肺移植和dsRNA施用后24h时测量小鼠的动脉血的氧合作用。施用靶向TLR2的单一dsRNA(第5列和第6列)也显著有效保留肺功能。然而施用靶向TLR4的单一dsRNA(第8列和第9列)对于保留肺功能无效。对照组由以下组成:(i)施用媒介物的小鼠(一般阴性对照,第2列)和(ii)冷保存仅1小时(1小时冷缺血时间(CIT))后经受肺移植(Tx)的小鼠(再灌注对照,第1列)。
图3示出靶向TLR2和TLR4基因的双靶dsRNA组合(第4至6列)恢复了所述受体肺的肺功能。肺移植和dsRNA施用后24h时测量小鼠的动脉血的氧合作用。阴性对照组由以下组成:正常(完整)小鼠(一般阴性对照,第1列)、以及冷保存仅1小时(1小时冷缺血时间(CIT))后经受肺移植(Tx)的小鼠(再灌注对照,第2列)和用媒介物处理的小鼠(18小时冷缺血时间(CIT),第3列)。
图4示出对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500)(第3列)、以及包含对TLR2具有特异性的dsRNA(TLR2_4_S73)的个别处理(第4至6列)减少了从移植的肺中获得的BAL中的气道内粒细胞积累。肺移植后24h时,从所有小鼠收集BAL。通过FACS测量细胞总量和不同细胞群(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的量。将不同的细胞计数作为总细胞计数的分数呈示。
图5示出在同种异基因移植后第7天,用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500(在图中标识为“siRNA混合液”))进行处理减小了移植物内IFNγ+CD8+T细胞的丰度。(A).显示移植物内IFNγ+CD8+T细胞的代表性丰度百分比的FACS(N>6);(B)移植物内IFNγ+CD8+T细胞的丰度百分比的图。
图6示出在第0天和第1天用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500)进行处理,显著减弱了在协同刺激阻滞中的急性移植物排斥的组织病理学信号—处理的1h CIT或18H CIT Balb/c->B6移植物、用对照dsRNA(EGFP_5_S763)或对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500)进行气管内处理(标识为“siRNA混合液”)。(A.)在同种异基因肺移植后第7天受体肺的代表性组织病理学图像(HE)。(B).由通过职业资格认证的肺移植病理医师以单盲方式评价的排斥分数。通常在临床中使用如下的评分系统:级别A0(无)、级别A1(最低)、级别A2(轻度)、级别A3(中等)以及级别A4(严重)。
发明详述
本公开内容部分涉及用于治疗有需要的哺乳动物的肺病症、疾病或损伤的方法。所述方法可包括:以有效治疗所述哺乳动物的量对所述哺乳动物施用选自TLR2抑制剂或其药学上可接受盐或前药的至少一种治疗剂。所述方法可包括对所述哺乳动物施用至少两种治疗剂,其中至少一种治疗剂靶向TLR2基因或基因产物并且至少一种治疗剂靶向TLR4基因或基因产物。在一些实施方案中,所述治疗剂包括:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;量为有效治疗所述哺乳动物的肺病症、疾病或损伤的量。本公开内容还涉及包括所述治疗剂的组合、组合物、试剂盒以及包装。
在一些实施方案中,方法可包括以足够减少TLR2基因的表达和/或抑制其功能的量对所述哺乳动物施用至少一种治疗剂。在一些实施方案中,方法可包括以足够减少TLR2基因和TLR4基因两者的表达和/或抑制两者的功能的量对所述哺乳动物施用至少两种治疗剂的组合或组合的治疗剂。在某些实施方案中,所述肺疾病或损伤选自由以下组成的组:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植诱发的急性移植物功能障碍以及肺移植之后的闭塞性细支气管炎。在某些实施方案中,提供了用于治疗或预防与器官移植(特别是肺移植)相关的炎症和/或移植物排斥的组合疗法的组合物和方法,包括治疗、预防或减弱原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植(特别在肺移植中)之后的原发性移植物功能障碍(PGD)的发展。
在一些实施方案中,所述至少一种治疗剂是TLR2抑制剂。在一些实施方案中,所述至少两种治疗剂是TLR2抑制剂和TLR4抑制剂。在一些实施方案中,所述至少两种治疗剂是联合施用的,例如同时或按序施用。在其它实施方案中,所述至少两种治疗剂以包含其组合的药物组合物来施用。在一些实施方案中,所述治疗剂是组合抑制剂,其意指能够下调基因TLR2和基因TLR4两者和/或其基因产物的表达和/或活性的单一药剂。这些单一药剂的非限制性实例是在PCT专利公布号WO2007/091269中公开的串联且多臂的RNAi分子。
在一个实施方案中,所述方法包括施用治疗有效量的靶向TLR2的治疗剂。
在一些实施方案中,所述方法包括施用(a)治疗有效量的靶向TLR2的第一治疗剂和(b)治疗有效量的靶向TLR4的第二治疗剂。
在一个实施方案中,所述方法包括施用治疗有效量的靶向TLR2和TLR4两者的组合抑制剂。
在一些实施方案中,所述治疗剂是TLR2抑制剂。在一些实施方案中,所述治疗剂选自由以下组成的组:小有机分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;肽;肽模拟物以及核酸分子。在一些实施方案中,至少一种治疗剂是核酸分子。在一些实施方案中,所述治疗剂包含核酸分子。在一些实施方案中,所述核酸分子独立地选自由以下组成的组:结合编码基因TLR2的核苷酸序列(如mRNA序列)的反义分子、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA),所述核苷酸序列例如为由SEQID NO:1(gi|68160956|ref|NM_003264.3|)所例示的人TLR2的mRNA编码序列。
在一些实施方案中,所述至少两种治疗剂是TLR2抑制剂和TLR4抑制剂。在一些实施方案中,各治疗剂独立地选自由以下组成的组:小有机分子;蛋白质;抗体或其片段;肽;肽模拟物以及核酸分子。在一些实施方案中,至少一种治疗剂是核酸分子。在一些实施方案中,各治疗剂包含核酸分子。
在一些实施方案中,各核酸分子独立地选自由以下组成的组:结合编码选自TLR2和TLR4的靶基因的核苷酸序列(如mRNA序列)的反义分子、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA),例如:由SEQ ID NO:1所例示的人TLR2的mRNA编码序列或者由SEQ IDNO:2至4所例示的人TLR4的mRNA编码序列。在各种实施方案中,各核酸分子是dsRNA分子或siRNA分子。
在各种实施方案中,各治疗剂包含核酸分子,其中:
(a)所述核酸分子包括有义链和反义链;
(b)所述核酸分子的各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与选自编码TLR2(例如,SEQ ID NO:1)的mRNA或编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补,并且包括选自编码TLR2(例如,SEQ ID NO:1)的mRNA和编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA的17至40个核苷酸序列。
在各种实施方案中,各治疗剂包含具有结构(A1)的核酸分子:
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在一些实施方案中,TLR2mRNA的序列在SEQ ID NO:1中列出。在各种实施方案中,TLR2siRNA寡核苷酸的有义链和反义链选自在SEQ ID NO:5-722;1441-2246;3053-4152;以及5253-5545中列出的有义链序列和在SEQ ID NO:723-1440;2247-3052;4153-5252以及5546-5838中列出的反义链序列。在一些实施方案中,TLR4mRNA的序列在SEQ ID NO:2;SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中列出。在各种实施方案中,TLR4siRNA寡核苷酸的有义链和反义链选自在SEQID NO:5839-7075、8313-8458、8605-10318、12033-12084中列出的有义链序列和在SEQ ID NO:7076-8312、8459-8604、10319-12032、12085-12136中列出的反义链序列。
在一些实施方案中,双链寡核苷酸化合物的(N)x包含存在于SEQID NO:723-1440、2247-3052、4153-5252、5546-5838、7076-8312、8459-8604、10319-12032、12085-12136中的反义寡核苷酸。在一些实施方案中,(N’)y的序列与(N)x的序列部分互补。在一些实施方案中,(N’)y的序列与(N)x的序列实质上互补。在一些实施方案中,(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在一些实施方案中,双链寡核苷酸化合物的(N)x包含存在于标识为TLR2_4、TLR2_7或TLR4_4的双链RNA化合物中的反义寡核苷酸。
在所述双链寡核苷酸化合物的一些实施方案中,x=y=19。在各种实施方案中,Z和Z’两者都存在于双链寡核苷酸化合物中。在各种实施方案中,Z和Z’两者都不存在于双链寡核苷酸化合物中;即所述双链化合物的两端都是平端。在一些实施方案中,Z或Z’中至少一个存在于所述双链寡核苷酸化合物中。
在一些实施方案中,Z或Z’独立地是选自以下的非常规部分:脱碱基脱氧核糖部分、脱碱基核糖部分反向脱碱基脱氧核糖部分、反向脱碱基核糖部分;C3部分、C4部分、C5部分、氨基-6部分。在一些优选实施方案中,Z或Z’独立地选自C3部分和氨基-C6部分。
在一些实施方案中,双链寡核苷酸化合物中的N或N’中的至少一个包含2’糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中,所述2’糖修饰包含存在氨基、氟代基、烷氧基或烷基部分。在一些优选实施方案,2’糖修饰包含存在烷氧基部分,优选地,所述烷氧基部分包含2’-O-甲基部分。
在双链寡核苷酸化合物的一些实施方案中,(N)x包含交替的2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸和未修饰的核糖核苷酸。在某些实施方案中,(N)x包含至少5个交替的2’-O-甲基糖修饰或未修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中,(N)x在位置2、4、6、8、11、13、15、17和19处包含2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中,(N)x在位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19处包含2’-O-甲基糖修饰的核糖核苷酸。在一些实施方案中,(N)x包含2’-O-甲基糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。在一些实施方案中,在(N)x中的所有嘧啶核糖核苷酸都包含2’-O-甲基糖修饰的嘧啶核糖核苷酸。
在一些实施方案中,(N)x包含选自以下的至少一个非常规部分:镜像核苷酸以及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接于相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中,(N)x中的非常规部分是镜像核苷酸。在一些实施方案中,(N)x中的镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。在各种实施方案中,(N)x在位置6或7处包含L-DNA部分(5’>3’)。
在一些实施方案中,(N’)y包含选自以下的至少一个非常规部分:镜像核苷酸以及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接于相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中,(N’)y中的非常规部分是镜像核苷酸。在一些实施方案中,(N’)y中的镜像核苷酸是L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)。在一些实施方案中,(N’)y由位置1至17和19处的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位置(位置18)处的一个L-DNA组成。在一些实施方案中,(N’)y由位置1至16和19处的未修饰核糖核苷酸以及3’倒数第二位置(位置17和18)处的两个连续L-DNA组成。在一些实施方案中,(N’)y中的非常规部分是通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接于相邻核苷酸的核苷酸。在一些实施方案中,(N’)y中通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接于相邻核苷酸的核苷酸进一步包含3’-O-甲基(3’O-Me)糖修饰。
在各种实施方案中,所述治疗剂是具有如下所示的结构(A2)的双链寡核苷酸化合物:
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补,并且(N)x与在选自编码TLR2(例如,SEQ ID NO:1)的mRNA和编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2(例如,SEQ IDNO:1)的mRNA和编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在根据结构(A)2的双链寡核苷酸化合物的一些实施方案中,x=y=18。
在一些实施方案中,(N)x与SEQ ID NO:1(人TLR2mRNA)中的连续序列互补。在一些实施方案中,(N)x包括选自SEQ ID NO:4153-5252和5546-5838中的任一个的反义寡核苷酸。在一些实施方案中,x=y=18并且N1-(N)x包括选自SEQ ID NO:723-1440和2247-3052中的任一个的反义寡核苷酸。在一些实施方案中,x=y=19或者x=y=20。在某些优选实施方案中,x=y=18。
在一些实施方案中,(N)x与SEQ ID NO:2(人TLR4,转录变异体4,非编码RNA)或SEQ ID NO:3(人TLR4,转录变异体1,mRNA)或SEQ ID NO:4(人TLR4,转录变异体3,非编码RNA)中的连续序列互补。在一些实施方案中,(N)x包括选自SEQ ID NO:10319-12032和12085-12136中的任一个的反义寡核苷酸。在一些实施方案中,x=y=18并且N1-(N)x包括选自SEQ ID NO:7076-8312和8459-8604中的任一个的反义寡核苷酸。在一些实施方案中,x=y=19或者x=y=20。在某些优选实施方案中,x=y=18。
在一些实施方案中,N1和N2形成Watson-Crick碱基对。在其它实施方案中,N1和N2形成非Watson-Crick碱基对。在一些实施方案中,N1是修饰的腺嘌呤核糖核苷或修饰的尿嘧啶核糖核苷。
在某些实施方案中,N1选自由腺嘌呤核糖核苷、修饰的腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷、修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷组成的组。在其它实施方案中,N1选自由尿嘧啶核糖核苷、尿嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的尿嘧啶核糖核苷以及修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷组成的组。
在某些实施方案中,N1选自由腺嘌呤核糖核苷、修饰的腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷、修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷组成的组,并且N2选自由尿嘧啶核糖核苷、尿嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的尿嘧啶核糖核苷以及修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷组成的组。在某些实施方案中,N1选自由腺嘌呤核糖核苷和修饰的腺嘌呤核糖核苷组成的组,并且N2选自由尿嘧啶核糖核苷和修饰的尿嘧啶核糖核苷组成的组。
在某些实施方案中,N2选自由腺嘌呤核糖核苷、修饰的腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷、修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷组成的组,并且N1选自由尿嘧啶核糖核苷、尿嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的尿嘧啶核糖核苷以及修饰的尿嘧啶脱氧核糖核苷组成的组。在某些实施方案中,N1选自由尿嘧啶核糖核苷和修饰的尿嘧啶核糖核苷组成的组,并且N2选自由腺嘌呤核糖核苷和修饰的腺嘌呤核糖核苷组成的组。在某些实施方案中,N1是尿嘧啶核糖核苷并且N2是腺嘌呤核糖核苷。
在(A2)的一些实施方案中,(N)x选自SEQ ID NO:4153-5252和5546-5838中的任一个并且(N’)y与选自SEQ ID NO:3053-4152和5253-5545的序列实质上互补。在(A2)的一些实施方案中,(N)x选自SEQ ID NO:10319-12032和12085-12136中的任一个并且(N’)y与选自SEQ ID NO:8605-10318和12033-12084的序列实质上互补。在一些实施方案中,(N’)y的序列与(N)x的序列部分互补。在一些实施方案中,(N’)y的序列与(N)x的序列完全互补。在一些实施方案中,双链寡核苷酸化合物的(N)x包含存在于标识为TLR2_4、TLR2_7或TLR4_4的双链RNA化合物中的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中,施用方法是全身性施用。在一些实施方案中,施用方法是局部施用。在各种实施方案中,施用方法是气管内、吸入、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、皮内、局部、通过注射或经由泵直接施用到靶肺组织中。
一方面,提供了一种药物组合物,其包括:选自TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的至少一种治疗剂;以及药学上可接受的载剂。
另一方面,提供了一种组合,其包括:选自以下的至少两种治疗剂:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药和(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂。
另一方面,提供了一种药物组合物,其包括:选自以下的至少两种治疗剂的组合:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药和(iii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中,所述组合物包含由TLR2抑制剂组成的治疗剂。在一些实施方案中,所述组合或组合物包含至少两种治疗剂,其中所述治疗剂中的至少一种是TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药并且所述治疗剂中的至少一种是TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药。在一些实施方案中,所述组合或组合物包含TLR2抑制剂和TLR4抑制剂。
在一些实施方案中,所述TLR2抑制剂选自由以下组成的组:小分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。在一些实施方案中,所述TLR2抑制剂包含核酸分子。在一些实施方案中,所述核酸分子选自结合编码靶基因TLR2的核苷酸序列(如mRNA序列)的短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。在一些实施方案中,所述核酸分子是靶向TLR2的双链RNA(dsRNA)或短干扰RNA(siRNA)。
在一些实施方案中,各治疗剂独立地选自由以下组成的组:小分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。在一些实施方案中,各治疗剂包含核酸分子。在一些实施方案中,各核酸分子独立地选自结合编码选自TLR2和TLR4的靶基因的核苷酸序列(如mRNA序列)的短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。在一些实施方案中,各核酸分子是双链RNA(dsRNA)或短干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中,至少两种dsRNA或siRNA是靶向TLR2的dsRNA或siRNA和靶向TLR4的dsRNA或siRNA。
在一个实施方案中,所述方法包括治疗有效量的下调TLR2的治疗剂。
在一个实施方案中,所述方法包括(a)治疗有效量的下调TLR2的第一治疗剂和(b)治疗有效量的下调TLR4的第二治疗剂。
一方面,提供了一种试剂盒,其包含由TLR2抑制剂组成的治疗剂;以及任选地使用说明书。
另一方面,提供了一种试剂盒,其包含至少两种治疗剂,其中所述两种药剂选自由TLR2抑制剂和TLR4抑制剂组成的组;以及任选地使用说明书。
在所述试剂盒的一些实施方案中,各治疗剂独立地选自由以下组成的组:小分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。在一些实施方案中,各治疗剂包含核酸分子。在一些实施方案中,各核酸分子独立地选自结合编码选自TLR2和TLR4的靶基因的核苷酸序列(如mRNA序列)的短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。在一些实施方案中,各核酸分子是双链RNA(dsRNA)或短干扰RNA(siRNA)。在一些实施方案中,各核酸分子选自由以下组成的组:靶向TLR2的dsRNA或靶向TLR2的siRNA;以及靶向TLR4的dsRNA或靶向TLR4的siRNA。在一些实施方案中,至少两种siRNA由以下组成:靶向TLR2的dsRNA或siRNA;以及靶向TLR4的dsRNA或siRNA。
在一些实施方案中,本文提供的试剂盒包含:组合抑制剂,其意指能够下调选自由TLR2和TLR4两者组成的组的至少两种基因和/或基因产物的单一药剂;以及任选地使用说明书。
在一些实施方案中,所述试剂盒的各治疗剂包含核酸分子,其中:
(a)所述核酸分子包含有义链和反义链;
(b)所述核酸分子的各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与选自编码TLR2(例如,SEQ ID NO:1)的mRNA和编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补,并且包括选自编码TLR2(例如,SEQ ID NO:1)的mRNA和编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA的17至40个核苷酸序列。
在一些实施方案中,所述试剂盒的各治疗剂包含具有结构(A1)的核酸分子:
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在各种实施方案中,所述双链分子在引导链(反义链)的5’端核苷酸处包含与靶mRNA的错配。因此,在一些实施方案中,所述试剂盒的各治疗剂包含具有如下所示的结构(A2)的双链寡核苷酸化合物
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补,并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA(例如,SEQ ID NO:1)和编码TLR4的mRNA(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2(例如,SEQ IDNO:1)的mRNA和编码TLR4(例如,SEQ ID NO:2-4)的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
另一方面,提供了一种包装,其包含:A)至少两种单独的选自以下的剂量单位:(i)包含TLR2抑制剂的剂量单位和(ii)包含TLR4抑制剂的剂量单位;以及任选地B)包含用于使用剂量单位的说明书的包装插页。
在所述包装的另一个实施方案中,各抑制剂包含核酸分子,其中:
(a)所述核酸分子包含有义链和反义链;
(b)所述核酸分子的各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补,并且包括选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的17至40个核苷酸序列。
在所述包装的一些实施方案中,各抑制剂包含具有结构(A1)的核酸分子:
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
在各种实施方案中,所述双链分子在引导链(反义链)的5’端核苷酸处包含与靶mRNA的错配。因此,在所述包装的一些实施方案中,各抑制剂包含具有如下所示的结构(A2)的双链寡核苷酸化合物:
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
在所述试剂盒或包装的各种实施方案中,所述说明书或包装插页指示所述治疗剂或剂量单位或所述多种治疗剂或剂量单位适合用于治疗罹患选自由以下组成的组的疾病或病状的患者:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植诱发的急性移植物功能障碍以及肺移植之后的闭塞性细支气管炎。在所述试剂盒或包装的各种实施方案中,所述说明书或包装插页指示所述治疗剂或剂量单位适合用于治疗罹患与器官移植(特别是肺移植)相关的炎症和/或移植物排斥或者具有罹患所述炎症和/或移植物排斥的风险的患者,所述炎症和/或移植物排斥包括但不限于原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植(特别在肺移植中)之后的原发性移植物功能障碍(PGD)。
在各种实施方案中,所述组合物包含下调或抑制包括DNA和mRNA在内的TLR2基因和/或TLR2基因产物的表达/活性/功能的一种或多种双链核酸(dsNA)药剂。
在各种实施方案中,所述组合包含下调或抑制选自以下的包括DNA和mRNA在内的至少两种基因和/或基因产物的表达/活性/功能的一种或多种双链核酸(dsNA)药剂:(i)TLR2和(ii)TLR4。
人TLR2的mRNA编码序列由SEQ ID NO:1所例示,并且人TLR4的mRNA编码序列由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所例示。
在一个实施方案中,所述组合物包含下调TLR2的至少一种dsNA分子。
在另一个实施方案中,所述组合包含下调TLR2和TLR4的一种或多种dsNA药剂。在一个实施方案中,所述组合包含下调TLR2的至少一种dsNA分子和下调TLR4的至少一种dsNA分子。
在一些实施方案中,提供了一种包含靶向至少TLR2和TLR4两者的dsRNA的串联dsRNA。
在一些实施方案中,提供了一种三臂结构,所述结构也被称为RNAistar。所述三链寡核糖核苷酸包含具有以下通用结构的寡核糖核苷酸:
其中接头A、接头B或接头C中的一个或多个是存在的;两种或更多种寡核苷酸与接头A至C中的一种或多种的任意组合是可能的,只要所述链的极性和所述分子的通用结构保留即可。此外,如果接头A至C中的两种或更多种是存在的,则它们可以是相同或不同的。在一些实施方案中,优选“有间隙的”RNAistar化合物,其中所述化合物包含三个RNA双链体。
由形成三个RNA双链体的四条核糖核苷酸链组成的化合物具有以下通用结构:
其中寡A、寡B、寡C、寡D、寡E以及寡F各自代表至少19个连续核糖核苷酸,其中在寡A、B、C、D、E以及F各自中18个至40个这些连续核糖核苷酸构成RNA双链体的一条链,其中各核糖核苷酸可以是修饰或未修饰的
其中链1包含是作为所述化合物第一RNA双链体的有义部分或反义部分的寡A,链2包含与寡A中的至少19个核苷酸互补的寡B,并且寡A和寡B一起形成靶向第一靶mRNA的第一RNA双链体;
其中链1进一步包含是作为所述化合物第二RNA双链体的有义部分或反义链部分的寡C,链3包含与寡C中的至少19个核苷酸互补的寡D,并且寡C和寡D一起形成靶向第二靶mRNA的第二RNA双链体;
其中链4包含是作为所述化合物第三RNA双链体的有义部分或反义链部分的寡E,链2进一步包含与寡E中的至少19个核苷酸互补的寡F,并且寡E和寡F一起形成靶向第三靶mRNA的第三RNA双链体;并且
其中接头A是共价连接寡A和寡C的部分;接头B是共价连接寡B和寡F的部分,并且接头A和接头B可以是相同或不同的。
在一些实施方案中,所述第一、第二和第三RNA双链体靶向相同的基因,即TLR2。在其它实施方案中,所述第一、第二和第三siRNA双链体中的两个靶向相同的mRNA,例如TLR2,并且所述第三RNA双链体靶向不同的mRNA,例如TLR4。在其它实施方案中,所述第一、第二和第三siRNA双链体中的两个靶向相同的mRNA,例如TLR4,并且所述第三RNA双链体靶向不同的mRNA,例如TLR2。
“Toll样受体2”或“tlr-2”或“TLR-2”或“tlr2”或“TLR2”可互换使用并且是指具有任何TLR2蛋白质活性的任何Toll样受体2肽或多肽。TLR2还已被称为CD282(分化抗原簇282)。Toll样受体2(或更具体地为人TLR2)可以具有与SEQ ID NO.1相同或实质上相同的氨基酸序列。
“Toll样受体4”或“tlr-4”或“TLR-4”或“tlr4”或“TLR4”可互换使用并且是指具有任何TLR4蛋白质活性的任何Toll样受体4肽或多肽。TLR4还已被称为CD284(分化抗原簇284)。Toll样受体4(或更具体地为人TLR4)可以具有与SEQ ID NO.2至4相同或实质上相同的氨基酸序列。
如本文使用的术语“编码TLR2和TLR4的核苷酸序列”意指分别编码TLR2和TLR4蛋白质或其部分的核苷酸序列。术语“编码TLR2和TLR4的核苷酸序列”还意欲包括TLR2和TLR4编码序列如TLR2和TLR4亚型、突变型TLR2和TLR4基因、TLR2和TLR4基因的剪接变异体以及TLR2和TLR4基因多态现象。编码TLR2和TLR4的核酸序列包括编码TLR2和TLR4的mRNA序列,所述mRNA序列还可以被称为TLR2mRNA和TLR4mRNA。人TLR2的示例性序列是SEQ ID NO:1。人TLR4mRNA的示例性序列是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中,本文所公开的抑制剂或治疗剂包含一种分子,其为能够下调或抑制选自TLR2和TLR4的基因和/或基因产物的表达和/或功能的化合物。优选地,所述治疗剂独立地选自由以下组成的组:小有机分子;蛋白质;抗体或其片段;肽;肽模拟物以及核酸分子。
抗体的实例包括多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人抗体以及其抗原结合片段。TLR2结合抗体的实例是针对TLR2产生的抗人TLR2抗体、小鼠单克隆抗人TLR2、兔抗人TLR2、山羊抗人TLR2等。
抗体的实例包括多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人抗体以及其抗原结合片段。TLR4结合抗体的实例是针对TLR4产生的抗人TLR4抗体、小鼠单克隆抗人TLR4、兔抗人TLR4、山羊抗人TLR4等。
在一些实施方案中,本公开内容的抑制剂或治疗剂包含肽。如本文使用的术语“肽”是指由约二至约九十个氨基酸残基组成的化合物,其中一个氨基酸的氨基通过肽键连接另一个氨基酸的羧基。优选的肽序列是短的(例如3至20个氨基酸长度)且有亲脂性的,这使得它们可以跨过细胞膜达到足够的程度。例如,肽可以通过酶裂解或化学裂解来源于天然蛋白质或从天然蛋白质中移除,或者可以使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术来制备(参见Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。“肽”可以包含任何合适的L-和/或D-氨基酸,例如普通的o-氨基酸(例如,丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸)、非-α-氨基酸(例如,β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸)以及特殊氨基酸(例如,瓜氨酸、高瓜氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸)。在肽上的氨基、羧基和/或其它官能团可为游离的(例如,未修饰)或者被合适的保护基保护。对于氨基和羧基来说合适的保护基以及用于添加或除去保护基的方式在本领域中是已知的,并且在例如Green和Wuts,"Protecting Groups in Organic Synthesis",JohnWiley and Sons,1991中公开。肽的官能团还可以使用业内已知的方法来进行衍生化(例如,烷基化)。
在一些实施方案中,本文提供的抑制剂或治疗剂包括肽模拟物。如本文使用的术语“肽模拟物”是指不是多肽但模拟了它们的结构方面并具有与可抑制TLR2或TLR4的肽相同的官能团的分子。例如通过确定TLR2或TLR4的肽抑制剂并使用氨基酸取代物修饰它来设计肽模拟物,所述氨基酸取代物例如通过增加稳定性和或活性来有利地修改肽的特性。
在一些实施方案中,本文公开的抑制剂或治疗剂包括核酸分子。如本文使用的术语“核酸分子”或“核酸”可互换使用并且是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸。在本文中更详细地描述了“核酸分子”的变化。核酸分子涵盖了如本文所述的修饰的核酸分子和未修饰的核酸分子两者。核酸分子可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或核苷酸类似物的任意组合。
如本文使用的术语“核苷酸”是指具有糖(或其类似物、或修饰的糖)、核苷酸碱基(或其类似物、或修饰的碱基)以及磷酸酯基(或其类似物、或修饰的磷酸酯基)的化学部分。核苷酸涵盖了如本文所述的修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸两者。如本文使用的核苷酸可以包括脱氧核糖核苷酸(例如,未修饰的脱氧核糖核苷酸)、核糖核苷酸(例如,未修饰的核糖核苷酸)以及修饰的核苷酸类似物,特别包括锁核酸和解锁核酸、肽核酸、L-核苷酸(也被称为镜像核苷酸)、乙烯桥连核酸(ENA)、阿拉伯糖苷(arabinoside)、PACE、具有6碳糖的核苷酸、以及常常被认为是非核苷酸的核苷酸类似物(包括脱碱基核苷酸)。在一些实施方案中,核苷酸可以在糖、核苷酸碱基和/或在磷酸酯基中用本领域已知的任何修饰和/或如本文所述的修饰等任何修饰来进行修饰。如本文使用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指连接的核苷酸的链;如本领域中众所周知的和/或本文所公开的,多核苷酸和寡核苷酸同样也可以在核苷酸糖、核苷酸碱基和磷酸主链中具有修饰。
如本文使用的术语“短干扰核酸”、“siNA”或“短干扰核酸分子”是指能够调节基因表达或病毒复制的任何核酸分子。优选地,siNA抑制或下调基因表达或病毒复制。siNA包括但不限于能够介导序列特异性RNA干扰(RNAi)的核酸分子,例如短干扰RNA(siRNA)、双链NA(dsNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其它。如本文使用的“短干扰核酸”、“siNA”或“短干扰核酸分子”具有在本文其它地方详细描述的意思。
如本文使用的术语“互补”意指核酸可以通过传统的Watson-Crick模式或其它非传统的模式来与另一个核酸序列形成氢键。就本文公开的核酸分子而言,核酸分子与其互补序列的结合自由能足够允许进行所述核酸的相关功能,例如RNAi活性。测定核酸分子的结合自由能在本领域是众所周知的(参见,例如Turner等,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII第123-133页;Frier等,1986,Proc.Nat.Acad.Sci.USA83:9373-9377;Turner等,1987,J.Am.Chem.Soc.109:3783-3785)。互补性百分比表示在可以与第二核酸序列形成氢键(例如,Watson-Crick碱基配对)的核酸分子中连续残基的百分比(例如,在与具有10个核苷酸的第二核酸序列碱基配对的第一寡核苷酸中总的10个核苷酸中的5、6、7、8、9或10个核苷酸分别代表50%、60%、70%、80%、90%以及100%互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。在一个实施方案中,本文公开的核酸分子包括约15至约35或更多(例如,约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35或更多)个核苷酸与一个或多个靶核酸分子或其部分互补。
如本文使用的术语“有义区”是指与dsNA分子的反义区互补(部分或完全)的dsNA分子的核苷酸序列。dsNA分子的有义链可以包括与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。如本文使用的“有义链”是指包括有义区并且还可以包括另外的核苷酸的核酸分子。有义链的长度可以在17个与40个核苷酸之间,例如17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。
如本文使用的术语“反义区”是指与靶核酸序列(优选靶dsNA)互补(部分或完全)的dsNA分子的核苷酸序列。dsNA分子的反义链任选地包括与dsNA分子的有义区互补的核酸序列。如本文使用的“反义链”是指包括反义区并且还可以包括另外的核苷酸的核酸分子。反义链的长度可以在17个与40个核苷酸之间,例如17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。
如本文使用的术语“实质上互补”意指反义链包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个与寡核苷酸的核苷酸序列(如有义链或靶mRNA)不互补的核苷酸。在一些实施方案中,反义链可包括1、2或3个不配对的,即在有义链或靶mRNA中不具有相应互补核苷酸的核苷酸。
如本文使用的术语“RNA”是指包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。
如本文使用的术语“双链体区”是指在通过Watson-Crick碱基配对抑或通过允许在互补或实质上互补的寡核苷酸链之间形成双链体的任何其它方式来彼此形成碱基对的两个互补或实质上互补的寡核苷酸中的区域。例如,具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可以与21个核苷酸单元的另一个寡核苷酸碱基配对,但是在每条链上仅19个碱基是互补或实质上互补的,这使得“双链体区”由19个碱基对组成。余下的碱基对可以例如作为5’和3’悬突而存在。此外,在双链体区内,不要求100%互补;在双链体区内可以允许实质性互补。实质性互补是指在链之间的互补性使得它们能够在生物条件下退火。凭经验确定两条链是否能够在生物条件下退火的技术在本领域是众所周知的。或者,可以合成两条链并在生物条件下添加在一起以确定它们是否彼此退火。
如本文使用的术语“非配对核苷酸类似物”意指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物,所述类似物包括但不限于:6脱氨基腺嘌呤核苷(水粉菌素)、4-甲基-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-甲基核糖U、N3-甲基核糖T、N3-甲基dC、N3-甲基-dT、N1-甲基-dG、N1-甲基-dA、N3-乙基-dC、N3-甲基dC。在一些实施方案中,非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其它实施方案中,它是脱氧核糖核苷酸。
如本文使用的术语“末端官能团”包括但不限于卤素、醇、氨基、羧基、酯、酰胺、醛、酮、醚基。
如本文使用的“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”在本文和本领域中还被称为假核苷酸或非常规部分。虽然核苷酸是核酸的单体单元,但是其通常由核糖或脱氧核糖糖、磷酸酯基以及碱基(在DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶;在RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成,而脱碱基或假核苷酸缺少碱基,且因此严格意义上并不是如本领域通常所使用的术语核苷酸。脱碱基脱氧核糖部分包括例如脱碱基脱氧核糖-3’-磷酸;1,2-双脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸;1,4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸。反向脱碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖脱碱基;3’,5’反向脱氧脱碱基5’-磷酸。
如本文使用的术语“封端部分”(或者“z”)包括可共价连接至有义链((N’)y)的5'端的部分并且包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、对脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分的修饰(包括2’O烷基修饰);反向脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及其修饰;C6-亚氨基-Pi;镜像核苷酸(包括L-DNA和L-RNA);5’甲氧基(5’OMe)核苷酸;以及核苷酸类似物(包括4',5'-亚甲基核苷酸);1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸;4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸;5'-氨基-烷基磷酸酯;1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯;6-氨基己基磷酸酯;12-氨基十二烷基磷酸酯;羟丙基磷酸酯;1,5-脱水己糖醇核苷酸;α-核苷酸;苏式-戊呋喃糖基核苷酸;无环3',4'-开环核苷酸;3,4-二羟基丁基核苷酸;3,5-二羟基戊基核苷酸、5'-5'-反向脱碱基部分;1,4-丁二醇磷酸酯;5'-氨基;以及桥连或非桥连甲基膦酸酯以及5'-巯基部分。
某些封端部分可以是脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分;反向脱碱基核糖或反向脱碱基脱氧核糖部分;C6-氨基-Pi;包括L-DNA和L-RNA在内的镜像核苷酸。如本文公开的核酸分子可以使用一种或多种反向核苷酸例如反向胸腺嘧啶或反向腺嘌呤来合成(例如参见Takei等,2002.JBC277(26):23800-06)。
在结构(A1)和结构(A2)的一些实施方案中,Z或Z’中的至少一个是存在的并包含共价连接至其所存在于其中的链的至少两个非核苷酸部分。在一些实施方案中,Z和Z’各自独立地包括C3烷基、C3醇或C3酯部分。在一些实施方案中,Z’是不存在的并且Z是存在的并且包括非核苷酸C3部分。在一些实施方案中,Z是不存在的并且Z’是存在的且包含非核苷酸C3部分。示例性非核苷酸部分包括如下所示的烷基和修饰的烷基部分:
在结构(A1)和(A2)的一些实施方案中,N和N’各自是未修饰的核苷酸。在一些实施方案中,N或N’中的至少一个包括化学修饰的核苷酸或非常规部分。在一些实施方案中,所述非常规部分选自镜像核苷酸、脱碱基核糖部分以及脱碱基脱氧核糖部分。在一些实施方案中,非常规部分是镜像核苷酸、优选地为L-脱氧核糖核苷酸(L-DNA)部分。在一些实施方案中,N或N’中的至少一个包括2’-甲氧基糖修饰的核糖核苷酸。
如本文使用的术语“非常规部分”是指包括脱碱基部分、反向脱碱基部分、烃(烷基)部分及其衍生物在内的非核苷酸部分,并且进一步包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、非碱基配对的核苷酸类似物以及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键连接于相邻核苷酸的核苷酸;包括LNA在内的桥连核酸和乙烯桥连核酸、键修饰(例如PACE)和碱基修饰的核苷酸、以及在本文中作为非常规部分而明确公开的另外的部分。
如本文使用的关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“减少”意指靶基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的RNA分子或等同的RNA分子(例如,mRNA)的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性减小至低于在不存在抑制因子(如核酸分子,例如像具有如本文所述的结构特征的dsNA)的情况下所观察到的结果;例如所述表达可以减少至90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或小于在不存在抑制剂的情况下观察到的结果。
RNA干扰和dsNA核酸分子
RNA干扰是指在动物中通过短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Zamore等,2000,Cell,101,25-33;Fire等,1998,Nature,391,806;Hamilton等,1999,Science,286,950-951;Lin等,1999,Nature,402,128-129;Sharp,1999,Genes&Dev.,13:139-141;以及Strauss,1999,Science,286,886)。在植物中的相应过程(Heifetz等,国际PCT公布号WO99/61631)常常被称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默。转录后基因沉默的过程被认为是用于防止外源基因表达的进化上保守的细胞防御机制(Fire等,1999,TrendsGenet.,15,358)。防止外源基因表达的这种保护可能是回应于产生来源于病毒感染或来源于转座子元件在宿主基因组中随机整合的双链RNA(dsRNA)而经由特异性破坏同源单链RNA或病毒基因组RNA的细胞反应而进化出来的。细胞中dsRNA的存在通过仍待充分表征的机制触发了RNAi反应。这个机制似乎与涉及双链RNA特异性核糖核酸酶的其它已知机制不同,所述其它已知机制如由通过核糖核酸酶L引起mRNA非特异性裂解的dsRNA-介导的蛋白激酶PKR和2',5'-寡腺苷酸合成酶活化所引起的干扰反应(参见例如美国专利号6,107,094;5,898,031;Clemens等,1997,J.Interferon&Cytokine Res.,17,503-524;Adah等,2001,Curr.Med.Chem.,8,1189)。
细胞中长dsRNA的存在刺激了被称为dicer的核糖核酸酶III酶的活性(Bass,2000,Cell,101,235;Zamore等,2000,Cell,101,25-33;Hammond等,2000,Nature,404,293)。Dicer参与将dsRNA加工成被称为短干扰RNA(siRNA)的dsRNA短链片段(Zamore等,2000,Cell,101,25-33;Bass,2000,Cell,101,235;Berstein等,2001,Nature,409,363)。来源于dicer活性的短干扰RNA通常是约21至约23个核苷酸长并且包括约19个碱基对的双链体(Zamore等,2000,Cell,101,25-33;Elbashir等,2001,Genes Dev.,15,188)。Dicer还涉及从与转录控制有关的保守结构的前体RNA上切除21和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA)(Hutvagner等,2001,Science,293,834)。所述RNAi反应还具有通常被称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物的特征,所述复合物介导具有与siRNA双链体反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解发生在与siRNA双链体反义链互补的区域中间(Elbashir等,2001,Genes Dev.,15,188)。
已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等,1998,Nature,391,806首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察了RNAi。Bahramian和Zarbl,1999,Molecular and Cellular Biology,19,274-283以及Wianny和Goetz,1999,Nature Cell Biol.,2,70,描述了在哺乳动物系统中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等,2000,Nature,404,293,描述了在用dsRNA转染的果蝇细胞中的RNAi。Elbashir等,2001,Nature,411,494以及Tuschl等,国际PCT公布号WO01/75164描述了在培养的哺乳动物细胞(包括人胚肾和HeLa细胞)中通过引入合成的21个核苷酸的RNA双链体而诱导的RNAi。在果蝇胚胎裂解液中进行的近期工作(Elbashir等,2001,EMBO J.,20,6877以及Tuschl等,国际PCT公布号WO01/75164)已揭示了介导有效的RNAi活性所必要的对siRNA长度、结构、化学组成以及序列的某些要求。
核酸分子(例如具有如本文所公开的结构特征)可以通过以序列特异性的方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制;参见例如Zamore等,2000,Cell,101,25-33;Bass,2001,Nature,411,428-429;Elbashir等,2001,Nature,411,494-498;以及Kreutzer等,国际PCT公布号WO00/44895;Zernicka-Goetz等,国际PCT公布号WO01/36646;Fire,国际PCT公布号WO99/32619;Plaetinck等,国际PCT公布号WO00/01846;Mello和Fire,国际PCT公布号WO01/29058;Deschamps-Depaillette,国际PCT公布号WO99/07409;以及Li等,国际PCT公布号WO00/44914;Allshire,2002,Science,297,1818-1819;Volpe等,2002,Science,297,1833-1837;Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218;以及Hall等,2002,Science,297,2232-2237;Hutvagner和Zamore,2002,Science,297,2056-60;McManus等,2002,RNA,8,842-850;Reinhart等,2002,Gene&Dev.,16,1616-1626;以及Reinhart&Bartel,2002,Science,297,1831)。
双链核酸分子可以由两个单独的多核苷酸链组装而成,其中一条链是有义链并且另一条是反义链,其中所述反义链和有义链是自身互补的(即每条链包括与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列);如其中所述反义链和有义链形成具有如本文对于所提供的核酸分子所述的任意长度和结构的双链体或双链结构,例如其中双链区(双链体区)是约15至约40个(例如,约17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对);所述反义链包括与靶核酸分子(即TLR2和TLR4mRNA)中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列并且所述有义链包括与靶核酸序列或其部分相对应的核苷酸序列(例如,在本文中核酸分子的约17至约40个核苷酸与靶核酸或其部分互补)。
在某些方面和实施方案中,本文所提供的核酸分子(例如,dsNA分子)可以是“RISC长度”分子或者可以是如下文更详细描述的Dicer底物。
dsNA核酸分子可以包括独立的有义和反义序列或区域,其中所述有义区和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸接头分子来共价连接,或者替代地通过离子相互作用、氢键、范德华(van derWaals)相互作用、疏水相互作用和/或堆积作用来非共价连接。核酸分子可包括与靶基因或靶mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列。核酸分子可以按引起靶基因表达抑制的方式来与靶基因的核苷酸序列相互作用。
或者,dsNA核酸分子由单一多核苷酸组装而来,其中核酸分子的自身互补有义区和反应区借助于基于核酸或基于非核酸的接头来连接,即,所述反义链和有义链是具有折叠形成双链体区(例如形成如本领域所熟知的“发夹”结构)的反义区和有义区的一条单一多核苷酸的一部分。这种dsNA核酸分子可为带有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构、具有自身互补的有义区和反义区的多核苷酸,其中所述反义区包括与单独的靶核酸分子(例如,TLR2mRNA或TLR4mRNA)中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列并且所述有义区具有与所述靶核酸序列相对应的核苷酸序列(即,TLR2mRNA的序列或TLR4mRNA的序列)。这种dsNA核酸分子可以是具有两个或更多个环结构以及包含自身互补有义区和反义区的主干的环形单链多核苷酸,其中所述反义区包括与靶核酸分子(例如TLR2mRNA或TLR4mRNA)中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列并且所述有义区具有与靶核酸序列(例如TLR2mRNA或TLR4mRNA)或其部分相对应的核苷酸序列,并且其中环形多核苷酸可在体内抑或体外加工以产生能够介导RNAi的活性核酸分子。
核酸分子的化学修饰
在某些方面和实施方案中,本文所提供的方法利用核酸治疗剂。如本文所提供的核酸分子(例如,dsNA分子)包含一个或多个修饰(或化学修饰)。不受理论限制,所述化学修饰赋予所述核酸分子有益的特性,所述特性包括核酸酶稳定性、减小的脱靶活性和或减小的免疫刺激作用。在某些实施方案中,这些修饰包括会使分子不同于标准核糖核苷酸或RNA分子(即包括标准腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤部分)的对核酸分子或多核苷酸的任何改变;所述标准核糖核苷酸或RNA分子也被称为“未修饰”核糖核苷酸或未修饰核糖核酸。具有2’-脱氧糖的传统DNA碱基和多核苷酸(由腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤所代表)可以被称为“未修饰的脱氧核糖核苷酸”或“未修饰的脱氧核糖核酸”;因此,如本文使用的术语“未修饰的核苷酸”或“未修饰的核酸”是指“未修饰的核糖核苷酸”或“未修饰的核糖核酸”,除非有明确相反的说明。这些修饰可以是在核苷酸糖、核苷酸碱基、核苷酸磷酸酯基和/或多核苷酸的磷酸酯主链中。
在某些实施方案中,如本文所公开的修饰可用于增加dsNA分子的RNAi活性和/或增加dsNA分子的体内稳定性(特别是血清内稳定性)和/或增加dsNA分子的生物利用度。修饰的非限制性实例包括但不限于核苷酸间或核苷间键联;在双链核酸分子的任意位置和链上的脱氧核糖核苷酸或二脱氧核糖核苷酸;在2’-位置处具有优选选自氨基、氟代基、甲氧基、烷氧基和烷基的修饰的核酸(例如,核糖核酸);2’-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸、生物素基团以及末端甘油基和/或反向脱氧基脱碱基残基并入、空间位阻分子、如荧光分子等。其它核苷酸修饰剂可包括3’-脱氧腺嘌呤核苷(蛹虫草菌素)、3’-叠氮基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)、2’,3’-二脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)、2’,3’-二脱氧-3’-硫代胞嘧啶核苷(3TC)、2’,3’-二脱氢-2’,3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(d4T)以及3’-叠氮基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)、2’,3’-二脱氧-3’-硫代胞嘧啶核苷(3TC)和2’,3’-二脱氢-2’,3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(d4T)的单磷酸酯核苷酸。关于各种修饰的更多细节在下文进行更详细地描述。
具有N构型(northern configuration)的经过化学修饰的核苷酸的非限制性实例包括锁核酸(LNA)核苷酸(例如,2’-O,4’-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸);2’-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸;2’-甲基-硫代-乙基、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸、2’-脱氧-2’-氯代核苷酸、2’-叠氮基核苷酸、以及2’-O-甲基核苷酸。锁核酸或LNA描述于例如Elman等,2005;Kurreck等,2002;Crinelli等,2002;Braasch和Corey,2001;Bondensgaard等,2000;Wahlestedt等,2000;以及国际专利公布号WO00/47599、WO99/14226、和WO98/39352以及WO2004/083430中。在本文所提供的治疗剂的一个实施方案中,LNA并入在核酸分子有义链的5’端。
化学修饰还包括作为非核苷酸无环类似物的解锁核酸或UNA,其中C2’-C3’键不存在(虽然UNA不是真实的核苷酸,但是它们明确地包括在如本文所涵盖的“修饰的”核苷酸或修饰的核酸的范围内)。示例性UNA公开于Nucleic Acids Symposium Series No.52第133–134页(2008)中。在某些实施方案中,如本文所述的核酸分子(例如,siNA分子)包括一个或多个UNA;或者一个UNA。在一些实施方案中,如本文所述的核酸分子(例如,siNA分子)具有3’-悬突,在所述3’-悬突中包含了一个或两个UNA。在一些实施方案中,如本文所述的核酸分子(例如,siNA分子)在反义链中;例如在反义链的位置6或位置7中包含UNA(例如一个UNA)。
化学修饰还包括非配对的核苷酸类似物,例如如本文所公开的。化学修饰进一步包括如本文所公开的非常规部分。
化学修饰还包括在寡核苷酸的5’和/或3’部分上的末端修饰并且也被称为封端部分。这些末端修饰选自核苷酸、修饰的核苷酸、脂质、肽以及糖、脱碱基核糖部分以及脱碱基脱氧核糖部分。
化学修饰还包括六元的“六元环核苷酸类似物”。六元环核苷酸类似物的实例公开于Allart等(Nucleosides&Nucleotides,1998,17:1523-1526;以及Perez-Perez等,1996,Bioorg.and Medicinal ChemLetters6:1457-1460)中包含含有己糖醇和阿卓糖醇核苷酸单体的六元环核苷酸类似物的寡核苷酸公开于国际专利申请公布号WO2006/047842中。
化学修饰还包括相比于正常天然存在的核苷酸具有反向手性的“镜像”核苷酸;即镜像核苷酸可以是天然存在的D-核苷酸的“L-核苷酸”类似物(参见美国专利号6,602,858)。镜像核苷酸可以进一步包括至少一个糖或碱基修饰和/或主链修饰,例如如本文所述的,如硫代磷酸酯或膦酸酯部分。美国专利号6,602,858公开了包含至少一个L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-腺嘌呤脱氧核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像dA);L-胞嘧啶脱氧核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像dC);L-鸟嘌呤脱氧核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像dG);L-胸腺嘧啶脱氧核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像dT))和L-RNA(L-腺嘌呤核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像rA);L-胞嘧啶核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像rC);L-鸟嘌呤核糖核苷-3’-磷酸酯(镜像rG);L-尿嘧啶核糖核苷-3’-磷酸(镜像dU)。
在一些实施方案中,修饰的核糖核苷酸包括修饰的脱氧核糖核苷酸,例如可能适合用作5’末端位置(位置编号1)中的核苷酸的5’甲氧基DNA(5-甲基-鸟嘌呤脱氧核糖核苷-3'-磷酸酯);PACE(腺嘌呤脱氧核糖核苷3'磷酰基乙酸酯、胞嘧啶脱氧核糖核苷3'磷酰基乙酸酯、鸟嘌呤脱氧核糖核苷3'磷酰基乙酸酯、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷3'磷酰基乙酸酯。
修饰可存在于本文公开的核酸分子的一条或多条链中,例如在有义链、反义链或两条链中。在某些实施方案中,反义链可包含修饰并且有义链可仅包含未修饰的核糖核苷酸。
核碱基
本文公开的核酸的核碱基可包括未修饰的核糖核苷酸(嘌呤和嘧啶),如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶。一条或两条链中的核碱基可以用天然和合成的核碱基修饰,如胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、任何“通用碱基”核苷酸;腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、脱氮嘌呤、嘌呤和嘧啶的杂环取代类似物(例如氨基乙氧基吩噁嗪)、嘌呤和嘧啶的衍生物(例如,1-烷基-、1-烯基-、杂芳香族-及1-炔基衍生物)及其互变异构体、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-二氮黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶以及4,4-乙烷撑胞嘧啶)。合适碱基的其它实例包括非嘌呤基和非嘧啶基碱基如2-氨基吡啶和三嗪。
糖部分
本文公开的核酸中的糖部分可包括没有任何修饰的2’-羟基-戊呋喃糖基糖部分。或者,糖部分可以被修饰,如2’-脱氧-戊呋喃糖基糖部分、D-核糖、己糖,在戊呋喃糖基糖部分的2’位置处的修饰如2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-O-乙基),即2’-烷氧基、2’-氨基、2’-O-烯丙基、2’-S-烷基、2’-卤素(包括2’-氟代、氯代及溴代)、2’-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-2-甲氧基乙基、2’-烯丙氧基(-OCH2CH=CH2)、2’-炔丙基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基、CF、氰基、咪唑、羧酸酯、硫代酯、C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基;O-、S或N-烯基;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2、N3;杂环烷基;杂环烷芳基;氨基烷基氨基;聚烷基氨基或取代的甲硅烷基以及其它修饰,例如如欧洲专利EP0 586 520B1或EP0 618 925B1中所述。
烷基包括饱和脂肪族基,所述饱和脂肪族基包括直链烷基(例如,甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族)(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基以及环烷基取代的烷基。在某些实施方案中,直链或支链烷基在其主链中具有6个或更少的碳原子(例如,对于直链来说为C1-C6,对于支链来说为C3-C6),并且更优选为4个或更少。同样地,优选的环烷基在其环结构中可具有3至8个碳原子,并且更优选地在环结构中具有5或6个碳。术语C1-C6包括含有1至6个碳原子的烷基。所述烷基可以是取代的烷基,如具有置换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分。这些取代基可包括例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酰氧基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基以及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基以及脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。
烷氧基包括共价连接至氧原子的取代和未取代的烷基、烯基和炔基。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基以及戊氧基。取代的烷氧基的实例包括卤代烷氧基。烷氧基可用以下基团取代:如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯基、膦酰氧基、亚膦酸基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基以及烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基以及脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、硫酸酯基、烷基亚磺酰基、磺酸基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳香族或杂芳香族部分。卤素取代的烷氧基的实例包括但不限于氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
在一些实施方案中,戊呋喃糖基环可以置换为缺乏戊呋喃糖基环的C2′–C3′-键的无环衍生物。例如,无环核苷酸可以用2-羟基乙氧基甲基取代正常存在于dNMP中的2’-脱氧呋喃核糖基糖。
卤素包括氟、溴、氯、碘。
主链
本文所公开的核酸的核苷亚单位可以通过磷酸二酯键相互连接。所述磷酸二酯键可以任选地用其它键联取代。例如,硫代磷酸酯、硫代磷酸-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’桥连主链(还可以被称为5’-2’)、PACE、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫代-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧亚磷酸酯、甲硼烷磷酸酯、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)氨基磷酸氨基酯、氢膦酸酯、膦酸酯、甲硼烷磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸烷酯或芳酯以及如烷基磷酸三酯等磷酸三酯修饰、磷酸三酯磷键、5’-乙氧基磷酸二酯、P-烷氧基磷酸三酯、甲基膦酸酯以及含非磷键联例如碳酸酯、氨基甲酸酯、甲硅烷基、硫、磺酸酯、磺酰胺、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetyl)、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲亚氨基、亚甲基肼撑、亚甲基二甲基肼撑以及亚甲氧基甲亚氨基键联。
本文公开的核酸分子可包含肽核酸(PNA)主链。所述PNA主链包含通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元。各种碱基如嘌呤、嘧啶、天然或合成的碱基通过亚甲基羰基键连接至所述主链。
末端磷酸酯
可以在末端磷酸酯基处进行修饰。可以使用不同稳定化学的非限制性实例,例如以稳定核酸序列的3’-末端,其包括(1)[3-3’]-反向脱氧核糖;(2)脱氧核糖核苷酸;(3)[5’-3’]-3’-脱氧核糖核苷酸;(4)[5’-3’]-核糖核苷酸;(5)[5’-3’]-3’-O-甲基核糖核苷酸;(6)3’-甘油基;(7)[3’-5’]-3’-脱氧核糖核苷酸;(8)[3’-3’]-脱氧核糖核苷酸;(9)[5’-2’]-脱氧核糖核苷酸;以及(10)[5-3’]-二脱氧核糖核苷酸。示例性化学修饰的末端磷酸酯基包括以下所示的那些:
缀合物
如本文所提供的修饰的核苷酸和核酸分子(例如,dsNA分子)可包括缀合物,例如共价连接至化学修饰的核酸分子的缀合物。缀合物的非限制性实例包括在Vargeese等,美国序列号10/427,160中描述的缀合物和配体。所述缀合物可经由生物可降解的接头共价连接至核酸分子(如siNA分子)。所述缀合物分子可连接在化学修饰的核酸分子的有义链、反义链抑或两条链的3’-末端。所述缀合物分子可连接在化学修饰的核酸分子的有义链、反义链抑或两条链的5’-末端。所述缀合物分子可连接在化学修饰的核酸分子的有义链、反义链抑或两条链的3’-末端和5’-末端、或其任意组合。在一个实施方案中,缀合物分子可包含有助于化学修饰的核酸分子递送至生物系统如细胞中的分子。在另一个实施方案中,连接至化学修饰的核酸分子的缀合物分子是聚乙二醇、人血清白蛋白或可介导细胞摄取的细胞受体的配体。本文涵盖的可连接至化学修饰的核酸分子的特定缀合物分子的实例描述于Vargeese等,美国序列号10/201,394中。
接头
本文提供的核酸分子(例如,dsNA分子)可包含将所述核酸的有义区连接至所述核酸的反义区的核苷酸、非核苷酸、或混合的核苷酸/非核苷酸接头。核苷酸接头可以是≥2个核苷酸长度的接头,例如约2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长度。所述核苷酸接头可以是核酸适体。如本文使用的术语“适体”或“核酸适体”是指特异性结合靶分子的核酸分子,其中所述核酸分子具有包含在其天然背景中由靶分子识别的序列的序列。或者,适体可以是结合靶分子(如TLR2mRNA和TLR4mRNA)的核酸分子,其中所述靶分子不天然结合核酸。例如,适体可用于结合蛋白质的配体结合结构域,由此防止天然存在的配体与蛋白质发生相互作用。这是非限制性的实例并且本领域技术人员将认识到使用本领域通常已知的技术可轻易地产生其它实施方案。参见例如Gold等;1995,Annu.Rev.Biochem.,64,763;Brody和Gold,2000,J.Biotechnol.,74,5;Sun,2000,Curr.Opin.Mol.Ther.,2,100;Kusser,2000,J.Biotechnol.,74,27;Hermann和Patel,2000,Science,287,820;以及Jayasena,1999,Clinical Chemistry,45,1628。
非核苷酸接头可包括脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合化合物(例如,聚乙二醇,如具有2个与100个之间的乙二醇单元的那些聚乙二醇)。具体的实例包括由以下文献描述的那些:Seela和Kaiser,Nucleic Acids Res.1990,18:6353和Nucleic Acids Res.1987,15:3113;Cload和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.1991,113:6324;Richardson和Schepartz,J.Am.Chem.Soc.1991,113:5109;Ma等,Nucleic Acids Res.1993,21:2585和Biochemistry1993,32:1751;Durand等,Nucleic Acids Res.1990,18:6353;McCurdy等,Nucleosides&Nucleotides1991,10:287;Jschke等,Tetrahedron Lett.1993,34:301;Ono等,Biochemistry1991,30:9914;Arnold等,国际公布号WO89/02439;Usman等,国际公布号WO95/06731;Dudycz等,国际公布号WO95/11910以及Ferentz和Verdine,J.Am.Chem.Soc.1991,113:4000。
5’末端、3’末端和悬突
本文公开的核酸分子(例如,dsNA分子)在两侧可以是平端、在两端具有悬突或者是平端和悬突端的组合。悬突可存在于有义链或反义链的5’-末端抑或3’-末端。
双链核酸分子(例如,dsNA)的5’-末端和/或3’-末端可以是平端或具有悬突。在有义链抑或反义链中5’-末端可以是平端并且3’-末端具有悬突。在其它实施方案中,在有义链抑或反义链中3’-末端可以是平端并且5’-末端具有悬突。在其它实施方案中,5’-末端和3’-末端两者都是平端或者5’-末端和3’-末端两者都具有悬突。
核酸的一条或两条链的5’-末端和/或3’-末端可包含游离的羟基。可修饰任意核酸分子链的5’-末端和/或3’-末端以包含化学修饰。这种修饰可使核酸分子稳定,例如由于核酸分子修饰的存在,3’-末端可具有增加的稳定性。末端修饰(例如端帽)的实例包括但不限于脱碱基、脱氧脱碱基、反向(脱氧)脱碱基、甘油基、二核苷酸、无环核苷酸、氨基、氟代、氯代、溴代、CN、CF、甲氧基、咪唑、羧酸酯、硫代酯、C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2、N3;杂环烷基;杂环烷芳基;氨基烷基氨基;聚烷基氨基或取代的甲硅烷基以及其它,如欧洲专利EP586,520和EP618,925中描述的其它修饰、以及本文公开的其它修饰。
核酸分子包括具有平端(即不包含悬突核苷酸的末端)的那些核酸分子。核酸分子可包含一个或多个平端。平端的核酸分子具有的碱基对数目等于存在于核酸分子每条链中的核苷酸数目。所述核酸分子可包含一个平端,例如,在反义链的5’-末端和有义链的3’-末端不具有任何悬突核苷酸的情况下。核酸分子可包含一个平端,例如,在反义链的3’-末端和有义链的5’-末端不具有任何悬突核苷酸的情况下。核酸分子可包含两个平端,例如在反义链的3’-末端和有义链的5’-末端以及反义链的5’-末端和有义链的3’-末端不具有任何悬突核苷酸的情况下。存在于平端核酸分子中的其它核苷酸可包含例如错配、凸起、环或摇摆碱基对以调节核酸分子的活性,例如以介导RNA干扰。
在本文所提供的核酸分子(例如,dsNA分子)的某些实施方案中,所述分子的至少一个末端具有至少一个核苷酸的悬突(例如1至8个悬突核苷酸)。例如,本文公开的双链核酸分子的一条或两条链可在5’-末端或在3’-末端或两者处具有悬突。悬突可存在于所述核酸分子的有义链和反义链中的任一者或两者中。悬突的长度可以少至一个核苷酸和长达1至8个或更多个核苷酸(例如,1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸;在一些优选实施方案中,悬突是2、3、4、5、6、7或8个核苷酸;例如悬突分别可以是2个核苷酸。形成悬突的核苷酸可以包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、天然或非天然的核碱基或在糖、碱基或磷酸酯基中进行修饰的任何核苷酸,如本文所公开。双链核酸分子可具有5’-悬突和3’-悬突两者。5’-末端和3’-末端的悬突可具有不同的长度。悬突可包含至少一个核酸修饰,所述修饰可以是脱氧核糖核苷酸。一个或多个脱氧核糖核苷酸可以位于5’-端处。核酸分子相应相对链的3’-末端可不具有悬突,更优选为不是脱氧核糖核苷酸的悬突。所述一个或多个脱氧核糖核苷酸可以位于3’-端处。dsRNA相应相对链的5’-末端可不具有悬突,更优选为不是脱氧核糖核苷酸的悬突。在链的5’-末端抑或3’-末端的悬突可以是1至8个(例如,约1、2、3、4、5、6、7或8个)未配对核苷酸,优选地,所述悬突是2至3个未配对核苷酸;更优选为2个未配对核苷酸。核酸分子可包括具有约1至约20个(例如,约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、1、15、16、17、18、19或20个);优选1至8个(例如,约1、2、3、4、5、6、7或8个)核苷酸的悬突端的双链体核酸分子,例如具有约19个碱基对和3’-端单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸悬突的约21个核苷酸的双链体。本文所提供的核酸分子可包括具有平端的双链体核酸分子,其中两个末端是平端,或者其中末端之一是平端。本文所公开的核酸分子可包含一个或多个平端,即其中平端不具有任何悬突核苷酸。在一个实施方案中,平端的核酸分子具有的碱基对数目等于存在于核酸分子每条链中的核苷酸数目。所述核酸分子可包含一个平端,例如,在反义链的5’-末端和有义链的3’-末端不具有任何悬突核苷酸的情况下。所述核酸分子可包含一个平端,例如,在反义链的3’-末端和有义链的5’-末端不具有任何悬突核苷酸的情况下。核酸分子可包含两个平端,例如在反义链的3’-末端和有义链的5’-末端以及反义链的5’-末端和有义链的3’-末端不具有任何悬突核苷酸的情况下。在某些优选实施方案中,核酸化合物是平端的。存在于平端dsNA分子中的其它核苷酸可包含例如错配、凸起、环或摇摆碱基对以调节核酸分子的活性以便介导RNA干扰。
在多个实施方案中,如本文所述的核酸分子(例如,dsNA分子)的一个或多个或全部悬突核苷酸包括如本文所述的那样来修饰的核苷酸;例如所述核苷酸中的一个或多个或全部可为2’-脱氧核苷酸。
核酸化合物的修饰的量、位置和型态
本文所公开的核酸分子(例如,dsNA分子)可包含以存在于所述核酸分子中核苷酸总数的百分比计算的修饰的核苷酸。因此,核酸分子可包含约5%至约100%修饰的核苷酸(例如,约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%修饰的核苷酸)。存在于给定核酸分子中的修饰的核苷酸的实际百分比将取决于存在于所述核酸中的核苷酸总数。如果所述核酸分子是单链,则修饰百分比可基于存在于单链核酸分子中的核苷酸总数。同样地,如果所述核酸分子是双链,则修饰百分比可基于存在于有义链、反义链或有义链和反义链两者中的核苷酸总数。
本文所公开的核酸分子可包含以核酸分子中总核苷酸的百分比计算的未修饰RNA。因此,核酸分子可包含约5%至约100%未修饰的核苷酸(例如,存在于核酸分子中的总核苷酸的约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)。
核酸分子(例如,dsNA分子)可包含有义链,所述有义链包含约1至约5个(具体地说为约1、2、3、4或5个)硫代磷酸酯核苷酸间键联、和/或一个或多个(例如,约1、2、3、4、5个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟代、和/或一个或多个(例如,约1、2、3、4、5个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸、以及任选地在有义链的3-末端、5’-末端或3’-末端和5’-末端两者处的端帽分子;并且其中反义链包含约1至约5个或更多个(具体地说为约1、2、3、4、5或更多个)硫代磷酸酯核苷酸间键联、和/或一个或多个(例如,约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)2’-脱氧、2’-O-甲基、2’-脱氧-2’-氟代、和/或一个或多个(例如,约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)通用碱基修饰的核苷酸、以及任选地在反义链的3’-末端、5’-末端、或3’-末端和5’-末端两者处的端帽分子。核酸分子可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个有义和/或反义核酸链的嘧啶核苷酸,所述核酸链用2’-脱氧、2’-O-甲基和/或2’-脱氧-2’-氟代核苷酸进行化学修饰,其具有或不具有约1至约5个或更多个(例如,约1、2、3、4、5或更多个)硫代磷酸酯核苷酸间键联和/或3’-末端、5’-末端、或3’-末端和5’-末端两者处的端帽分子,存在于相同或不同链中。
核酸分子可在核酸分子的每条链中包含约1至约5个或更多个(具体地说为约1、2、3、4、5个或更多个)硫代磷酸酯核苷酸间键联。
核酸分子可例如在一条或两条核酸序列链的3’-末端、5’-末端或3’-末端和5’-末端两者处包含2’-5’核苷酸间键联。此外,所述2’-5’核苷酸间键联可存在于一条或两条核酸序列链中的各种其它位置,例如,siNA分子的一条或两条链中的嘧啶核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸间键联(包括每个)可包含2’-5’核苷酸间键联,或者siNA分子的一条或两条链中的嘌呤核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸间键联(包括每个)可包含2’-5’核苷酸间键联。
化学修饰的短干扰核酸(dsNA)分子可包含反义区,其中存在于所述反义区中的任何(例如,一个或多个或全部)嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸(例如,其中全部嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸或者多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸),并且其中存在于所述反义区中的任何(例如,一个或多个或全部)嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸)。
化学修饰的短干扰核酸(dsNA)分子可包含反义区,其中存在于所述反义区中的任何(例如,一个或多个或全部)嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸(例如,其中全部嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸或者多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸),并且其中存在于所述反义区中的任何(例如,一个或多个或全部)嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸)。
能够在细胞内介导针对TLR2和/或TLR4的RNA干扰(RNAi)或者在体外系统中重构的化学修饰的短干扰核酸(dsNA)分子可包含有义区,其中存在于所述有义区中的一个或多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸(例如,其中全部嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸或者多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸),并且存在于所述有义区中的一个或多个嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-脱氧嘌呤核苷酸);以及反义区,其中存在于所述反义区中的一个或多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸(例如,其中全部嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸或者多个嘧啶核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸),并且存在于所述反义区中的一个或多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸)。所述有义区和/或反义区可具有端帽修饰,如任选地存在于有义和/或反义序列的3’-末端、5’-末端或者3’-末端和5’-末端两者处的任意修饰。所述有义区和/或反义区可任选地进一步包含具有约1至约4个(例如,约1、2、3或4个)2’-脱氧核糖核苷酸的3’-端核苷酸悬突。悬突核苷酸可进一步包含一个或多个(例如,约1、2、3、4或更多个)硫代磷酸酯、磷酰基乙酸酯和/或硫代磷酰基乙酸酯核苷酸间键联。在所述有义区中的嘌呤核苷酸可以可选地为2’-O-甲基嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸)并且存在于所述反义区中的一个或多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸)。在所述有义区中的一个或多个嘌呤核苷酸可以可选地为嘌呤核糖核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是嘌呤核糖核苷酸),并且存在于所述反义区中的任意嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸(例如,其中全部嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸或者多个嘌呤核苷酸是2’-O-甲基嘌呤核苷酸)。在所述有义区中和/或存在于所述反义区中的一个或多个嘌呤核苷酸可以可选地选自由2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸组成的组(例如,其中全部嘌呤核苷酸选自由2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸组成的组,或者多个嘌呤核苷酸选自由2’-脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、4’-硫代核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸组成的组)。
在一些实施方案中,如本文所述的核酸分子(例如,siNA分子)在反义链中;例如在反义链的位置6或位置7中包含修饰的核酸分子(例如一个修饰的核苷酸)。
核酸化合物的修饰型态和交替修饰
本文提供的核酸分子(例如,dsNA分子)可具有修饰和未修饰核酸的型态。一段连续的核苷酸中核苷酸的修饰型态可为在单一核苷酸或者经由标准磷酸二酯键或至少部分通过硫代磷酸酯键而彼此共价连接的核苷酸组内含有的修饰。因此,如本文所涵盖的“型态”不一定需要涉及重复单元,尽管它可以涉及。可结合本文所提供的核酸分子(例如,dsNA分子)一起使用的修饰型态的实例包括Giese,美国专利号7,452,987中所公开的那些修饰型态。例如,本文所提供的核酸分子(例如,dsNA分子)包括具有如与Giese美国专利号7,452,987的图2中以图表示出的型态相似或相同的修饰型态的那些核酸分子。
修饰的核苷酸或修饰的核苷酸组可处于有义链或反义链的5’-末端或3’-末端,侧翼核苷酸或核苷酸组排列在修饰的核苷酸或组的两侧,其中所述侧翼核苷酸或组是未修饰的抑或不具有与前述核苷酸或核苷酸组相同的修饰。然而,所述侧翼核苷酸或核苷酸组具有不同的修饰。修饰的核苷酸或修饰的核苷酸组以及未修饰或不同修饰的核苷酸或未修饰或不同修饰的核苷酸组的此序列可分别重复一次或多次。
在一些型态中,链的5’-端核苷酸是修饰的核苷酸,而在其它型态中,链的5’-端核苷酸是未修饰的核苷酸。在一些型态中,链的5’-末端以修饰的核苷酸组开始,而在其它型态中,5’-末端是未修饰的核苷酸组。这个型态可以是在第一段或第二段核酸分子上抑或两者上。
核酸分子的一条链的修饰的核苷酸可在原位与另一条链的修饰或未修饰的核苷酸或核苷酸组互补。
相对于另一条链的修饰型态在修饰或修饰型态之间可存在相迁移,以使得修饰组不会重叠。在一个例子中,所述迁移是这样的,即有义链的修饰的核苷酸组与反义链的未修饰的核苷酸组相对应,并且反之亦然。
修饰型态可存在部分迁移以使得修饰的组重叠。在任意给定链中的修饰的核苷酸的组可任选地具有相同长度,但也可具有不同长度。类似地,在任意给定链中的未修饰的核苷酸的组可任选地具有相同长度,或具有不同长度。
在一些型态中,在链末端的第二(倒数第二)个核苷酸是未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸的组的开头。优选地,这个未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸的组位于有义链和反义链两者之一或两者的5’-末端处,并且甚至更优选地在有义链的末端处。未修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸组可以位于有义链的5’-末端处。在一个实施方案中,所述型态由交替的单一修饰和未修饰的核苷酸组成。
在一些双链核酸分子中,2’-O-甲基修饰的核苷酸和未修饰的核苷酸或未进行2’-O-甲基修饰的核苷酸以交替方式并入在两条链上,由此产生交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸和未修饰或至少不包含2’-O-甲基修饰的核苷酸的型态。在某些实施方案中,2’-O-甲基修饰和未修饰的相同序列存在于第二条链上;在其它实施方案中,交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸仅存在于有义链中并且不存在于反义链中;并且在其它实施方案中,交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸仅存在于反义链中并且不存在于有义链中。在某些实施方案中,在两条链之间存在相迁移,使得第一链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与第二链上的未修饰的核苷酸进行碱基配对,并且反之亦然。在某些实施方案中,特别优选此特定的排列,即在两条链上的2’-O-甲基修饰和未修饰的核苷酸进行碱基配对。在某些实施方案中,贯穿整个核酸分子;或整个双链体区中存在交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸的型态。在其它实施方案中,仅在部分核酸分子;或部分双链体区中存在交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸的型态。
在“相迁移”型态中,可优选地为,如果反义链以在5’末端的2’-O-甲基修饰的核苷酸开始,则借以因此第二核苷酸是未修饰的,第三、第五、第七等核苷酸因此也是2’-O-甲基修饰的,而第二、第四、第六、第八等核苷酸是未修饰的核苷酸。
核酸化合物的示例性修饰位置和型态
虽然下文更详细地提供了示例性型态,但涵盖了具有本文公开的核酸分子和本领域已知的那些核酸分子的所有可能特征的全部排列型态(例如,特征包括但不限于有义链的长度、反义链的长度、双链体区的长度、悬突的长度、双链核酸分子的一端或两端是否是平端或是否具有悬突、修饰的核酸的位置、、修饰的核酸数、修饰的类型、双链悬突核酸分子在每端的悬突上是否具有相同或不同的核苷酸数、一种或多于一种类型的修饰是否用于核酸分子、以及连续的修饰/未修饰的核苷酸数)。关于下文所提供的全部详细实例,虽然双链体区显示有19个核苷酸,但本文所提供的核酸分子可具有在1至40个核苷酸长度范围内的双链体区,因为双链体区的每条链的长度可独立地是17至40个核苷酸本文提供了示例性型态。
核酸分子在包含单一或连续组的修饰的核酸的两端可具有平端。所述修饰的核酸可位于沿着有义链或反义链的任意位置处。核酸分子可包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续修饰的核苷酸的组。修饰的核酸可构成核酸链的1%、2%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或100%。紧接下文的实例的修饰核酸可仅在有义链中、仅在反义链中或在有义链和反义链两者中。
核酸链中的缺口和间隙
本文提供的核酸分子(例如,siNA分子)可具有含缺口或间隙的链,优选为有义链。因此,核酸分子可具有三条或更多条链,例如像在国际专利申请号PCT/US07/081836中所公开的局部双链体(meroduplex)RNA(mdRNA)。具有缺口或间隙链的核酸分子可为RISC长度(例如,约15至25个核苷酸)或者Dicer底物长度(例如,约25至30个核苷酸)。
Dicer底物
在某些实施方案中,本文所提供的核酸分子(例如,siNA分子)可以是前体“Dicer底物”分子,例如在体内进行加工以产生活性核酸分子的双链核酸,例如,如Rossi,美国专利申请号20050244858中所述。在某些条件和状况中,已发现这些相对更长的dsRNA siNA种类(例如具有约25至约30个核苷酸)可在作用的效力和持续时间方面给予特别有效的结果。不希望受到任何具体理论的束缚,认为更长的dsRNA种类用作细胞的细胞质中的Dicer酶的底物。除了将双链核酸裂解为更短的区段之外,Dicer可有助于将来源于裂解的dsRNA的单链裂解产物并入RNA诱导的沉默复合物(RISC复合物)中,所述复合物负责破坏来源于靶基因的细胞质RNA。
Dicer底物可具有增强由Dicer对其进行的加工的某些性质。Dicer底物具有足够的长度以使得其由Dicer进行加工以产生活性核酸分子,并且可进一步包含以下性质中的一种或多种:(i)dsRNA是不对称的,例如在第一条链(反义链)上具有3′悬突、以及(ii)dsRNA在第二条链(有义链)上具有修饰的3′末端以指导Dicer结合dsRNA和将dsRNA加工成活性siRNA的取向。在某些实施方案中,在Dicer底物中的最长链可为24个至30个核苷酸。
Dicer底物可以是对称或不对称的。Dicer可具有包含22至28个核苷酸的有义链和可包含24至30个核苷酸的反义链;因此,在一些实施方案中,所生成的Dicer底物可在反义链的3′末端具有悬突。Dicer底物可具有25个核苷酸长度的有义链和有27个核苷酸长度及3’-悬突的反义链。所述悬突可以为1至3个核苷酸,例如2个核苷酸。所述有义链还可具有5′磷酸酯。
像本文所提供的其它siNA分子一样,Dicer底物的反义链可具有在生物条件(如在真核细胞的细胞质内)与所述反义链退火的任何序列。
Dicer底物可如本领域已知和/或如本文对于其它核酸分子(如siNA分子)所述具有核苷酸碱基、糖或磷酸酯主链的任何修饰。在某些实施方案中,Dicer底物可具有有义链,其由位于有义链3’末端的合适修饰剂进行修饰以用于Dicer加工,即dsRNA被设计为指导Dicer结合和加工的取向。合适修饰剂包括核苷酸(如脱氧核糖核苷酸、二脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等)和空间位阻分子(如荧光分子等)。无环核苷酸用2-羟基乙氧基甲基取代正常存在于脱氧核苷单磷酸酯(dNMP)中的2’-脱氧呋喃核糖基糖。可用于Dicer底物siNA分子中的其它核苷酸修饰剂可包括3’-脱氧腺嘌呤核苷(蛹虫草菌素)、3’-叠氮基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)、2’,3’-二脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)、2’,3’-二脱氧-3’-硫代胞嘧啶核苷(3TC)、2’,3’-二脱氢-2’,3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(d4T)以及3’-叠氮基-3’-脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)、2’,3’-二脱氧-3’-硫代胞嘧啶核苷(3TC)和2’,3’-二脱氢-2’,3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(d4T)的单磷酸核苷酸。在一个实施方案中,使用脱氧核苷酸作为修饰剂。当使用核苷酸修饰剂时,它们可置换核糖核苷酸(例如,在有义链的3’末端上用1至3个核苷酸修饰剂或2个核苷酸修饰剂取代核糖核苷酸)以使得Dicer底物的长度不会改变。当使用空间位阻分子时,它们可连接至反义链3’末端的核糖核苷酸。因此,在某些实施方案中,在并入修饰剂的情况下,链的长度不会改变。在某些实施方案中,取代dsRNA中的两个DNA碱基,以指导反义链的Dicer加工的取向。在另一个实施方案中,用两个末端DNA碱基取代在有义链3’末端的两个核糖核苷酸,以在有义链的3’末端和反义链的5’末端上形成双链体的平端,并且两个核苷酸的RNA悬突位于反义链的3’-末端。这是不对称的组合物,其中在平端上具有DNA并且在悬突端上具有RNA碱基。
在某些实施方案中,在Dicer底物中包含修饰,使得所述修饰不会阻止核酸分子用作Dicer的底物。在一个实施方案中,进行一个或多个增强Dicer底物的Dicer加工的修饰。可进行一个或多个引起更有效的RNAi产生的修饰。可进行一个或多个支持更强的RNAi效果的修饰。进行一个或多个使得每个Dicer底物递送至细胞中的效力更高的修饰。修饰可并入3’-端区域、5’-端区域中、在3’-端和5’-端两个区域中或者在序列内的各种位置。可在Dicer底物中并入任意数量的修饰和修饰的组合,只要所述修饰不阻止所述核酸分子用作Dicer的底物即可。当存在多个修饰时,它们可以是相同或不同的。本文涵盖了对碱基、糖部分、磷酸酯主链及其组合的修饰。或者5’-端可被磷酸化。
不要求Dicer底物的有义链和反义链完全互补。它们仅需要实质上互补以在生物条件下退火并提供产生与靶序列足够互补的siRNA的Dicer底物。
Dicer底物的一条链(特别是反义链)的区域可具有至少19个核苷酸的序列长度,其中这些核苷酸是在邻近反义链3’末端的21个核苷酸的区域内并且与从靶基因中产生的RNA核苷酸序列足够互补。Dicer底物还可具有一种或多种以下另外的性质:(a)反义链具有从相应21聚体的右迁移(即,当与相应21聚体比较时,反义链在分子的右侧包含核苷酸);(b)链可能不完全互补,即所述链可能包含简单的错配;以及(c)碱基修饰如锁核酸可包含在有义链的5’末端。
可修饰Dicer底物核酸分子的反义链以在5’-末端包含1至9个核糖核苷酸,以获得22至28个核苷酸的长度。当反义链具有21个核苷酸的长度时,那么可在3’-末端添加1至7个核糖核苷酸或2至5个核糖核苷酸和或4个核糖核苷酸。所添加的核糖核苷酸可具有任意序列。尽管所添加的核糖核苷酸可与靶基因序列互补,但是不要求靶序列与反义链之间完全互补。即,所得的反义链与靶序列足够互补。因此有义链可具有24至30个核苷酸。有义链可与反义链实质上互补以在生物条件下与反义链退火。在一个实施方案中,可合成反义链以包含指导Dicer加工的修饰的3’-末端。有义链可具有3’悬突。可合成反义链以包含用于Dicer结合和加工的修饰的3’-末端并且有义链可具有3’悬突。
用于抑制TLR2和TLR4的方法和组合物
在各种方面,提供了用于抑制TLR2表达以治疗哺乳动物的肺疾病、病症或损伤的组合物和方法。在各种实施方案中,所述方法包括:对所述哺乳动物施用有效治疗所述哺乳动物的量的选自TLR2抑制剂或其药学上可接受盐或前药的至少一种治疗剂。在各种实施方案中,所述治疗剂选自由以下组成的组:小有机分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。
在各种方面,提供了用于抑制TLR2和TLR4表达以治疗哺乳动物的肺疾病、病症或损伤的组合物和方法。在各种实施方案中,所述方法包括对所述哺乳动物施用选自以下的至少两种治疗剂:(i)TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及(ii)TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;量为有效治疗所述哺乳动物的量。在各种实施方案中,各治疗剂独立地选自由以下组成的组:小分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。
在一些实施方案中,治疗剂是组合抑制剂,其意指能够抑制以下两者中的至少两种基因和/或其基因产物的表达和/或活性的单一药剂。TLR2和TLR4。这些单一药剂的非限制性实例是PCT专利公布号WO2007/091269中所公开的串联且多臂的RNAi分子。
在一些实施方案中,小核酸分子选自能够介导或介导针对TLR2和TLR4基因表达的RNA干扰的短干扰核酸(siNA)、双链核酸(dsNA)、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、以及短发夹RNA(shRNA)分子。本文所公开的组合物和方法还适用于治疗或预防与器官移植(特别是肺移植)相关的炎症和/或移植物排斥,其包括治疗、预防或减弱原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植(特别是肺移植)之后的原发性移植物功能障碍(PGD)的发展。
本文所提供的核酸分子和/或方法可用于下调编码例如由以下所表示的RNA的基因的表达:Genbank保藏编号NM_003264.3(TLR2)、NR_024169.1(TLR4)、NM_138554.3(TLR4)以及NR_024168.1(TLR4)。
本文所提供的组合物、方法和试剂盒可包括独立地或组合地调节(例如,下调)与如下疾病、病状或病症的维持和/或发展相关的TLR2和TLR4蛋白质和/或编码TLR2和TLR4蛋白质的基因的表达的一种或多种核酸分子(例如,dsNA)和方法:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植(特别是肺移植)之后的原发性移植物功能障碍(PGD)(例如,基因编码序列包括由GenBank保藏编号NM_003264.3、NR_024169.1、NM_138554.3和NR_024168.1所表示的那些序列、或者其中基因或基因家族序列共享序列同源性的TLR2和TLR4基因家族成员)。关于示例性基因TLR2和TLR4,提供了各种方面和实施方案的描述。然而,各种方面和实施方案还针对其它相关的TLR2和TLR4基因,如同源基因和转录变异体、以及与某些TLR2和TLR4基因相关的多态现象(例如,单核苷酸多态现象,(SNP))因此,各种方面和实施方案还针对涉及与例如本文所述的疾病、性状或病状的维持或发展相关的TLR2和TLR4介导的信号转导或基因表达路径的其它基因。使用本文中针对TLR2和TLR4基因所述的方法可分析这些另外的基因的靶位点。因此,可如本文所述进行、测定和测量对其它基因的调节和对其它基因的这种调节的效果。
在一个实施方案中,本文所提供的组合物和方法包含下调TLR2基因(例如,由SEQ ID NO:1所例示的人TLR2)的表达的双链短干扰核酸(dsNA)分子,其中所述核酸分子包含约17至约40个碱基对。
在一个实施方案中,本文所提供的组合物和方法包含下调TLR2基因和TLR4基因(例如,由SEQ ID NO:1所例示的人TLR2以及由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所例示的人TLR4)的表达的双链短干扰核酸(dsNA)分子,其中所述核酸分子包含约17至约40个碱基对。
在一个实施方案中,本文所公开的核酸可用于抑制TLR2和/或TLR4基因或者其中基因或基因家族序列共享序列同源性的TLR2和/或TLR4基因家族的表达。这些同源序列可如本领域所已知,例如使用序列比对进行鉴定。可将核酸分子设计为靶向这些同源序列,例如使用完全互补的序列或者通过并入可提供另外的靶序列的非经典的碱基对(例如错配和/或摇摆碱基对)。在鉴定出错配的情况下,非经典的碱基对(例如,错配和/或摇摆碱基)可用于产生靶向一个以上的基因序列的核酸分子。在非限制性实例中,非经典的碱基对如UU和CC碱基对用于产生能够靶向区别共享序列同源性的TLR2和/或TLR4靶标的序列的核酸分子。因此,使用本文所公开的dsRNA的一个优势是单一核酸可设计为包含与在同源基因之间保守的核苷酸序列互补的核酸序列。以这种方法,可使用单一核酸来抑制一个以上基因的表达,而不是使用一个以上核酸分子靶向不同基因。
核酸分子可用于靶向对应于一个基因家族或多个基因家族如TLR2和/或TLR4家族基因的保守序列。因此,靶向多个TLR2和/或TLR4靶标的核酸分子可提供增强的治疗效果。此外,核酸可用于表征多种应用中基因功能的路径。例如,在基因功能分析、mRNA分析或翻译分析中,核酸分子可用于抑制路径中的靶基因的活性以确定未表征的基因的功能。核酸分子可用于确定针对药物开发的涉及各种疾病或病状中的潜在靶基因路径。核酸分子可用于了解以下疾病中所涉及的基因表达的路径:例如急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植之后的闭塞性细支气管炎、和/或与器官移植诱发的急性移植物功能障碍(特别是肺移植诱发的急性移植物功能障碍)相关的炎症和/或移植物排斥。
在一个实施方案中,本文所提供的组合物和方法包含具有针对TLR2的RNAi活性的核酸分子。在另一个实施方案中,本文所提供的组合物和方法包含具有针对TLR2RNA的RNAi活性的核酸分子和具有针对TLR4RNA的RNAi活性的核酸分子,其中所述核酸分子包含与具有TLR2和/或TLR4编码序列的任意RNA互补的序列。在另一个实施方案中,核酸分子可具有针对TLR2和/或TLR4RNA的RNAi活性,其中所核酸分子包含与具有变异型TLR2和/或TLR4编码序列的RNA互补的序列,例如本领域已知与如本文所述的肺疾病、病症或损伤的维持和/或发展相关的其它突变型TLR2和/或TLR4基因。在另一个实施方案中,本文所公开的核酸分子包含可与TLR2和/或TLR4基因的核苷酸序列相互作用并由此分别介导TLR2和/或TLR4基因表达沉默的核苷酸序列,例如,其中所述核酸分子通过调节TLR2和/或TLR4基因的染色质结构或甲基化型态和阻止TLR2和/或TLR4基因转录的细胞过程,介导TLR2和/或TLR4基因表达的调节。
抗体疗法
在一些实施方案中,如本文所提供的抑制剂或治疗剂包含抗体。应了解,当使用术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”时,此旨在包含完整抗体,如多克隆抗体或单克隆抗体(mAbs)及其蛋白水解片段如Fab或F(ab')2片段。在所提供的方法和组合物的范围内还包含嵌合抗体;人和人源化抗体;重组和工程改造抗体及其片段。此外,编码抗体可变区的DNA可插入到编码其它抗体的DNA中,以产生嵌合抗体(参见,例如,美国专利号4,816,567)。单链抗体属于本发明的范围内。单链抗体可为具有抗原结合能力并包含与免疫球蛋白轻链和重链的可变区同源或类似的氨基酸序列的单链复合多肽(连接的VH-VL或单链Fv(ScFv))。VH和VL两者都可拷贝天然单克隆抗体序列或者所述链中的一条或两条可包含美国专利号5,091,513中所述类型的CDR-FR构建体,所述专利的全部内容以引用的方式并入本文。通过多肽接头将类似于轻链和重链的可变区的独立多肽连接在一起。产生这种单链抗体(特别是其中编码VH和VL多肽结构的DNA是已知的)的方法可根据例如美国专利号4,946,778、5,091,513和5,096,815中所述的方法来实现,所述各专利的全部内容以引用的方式并入本文。
另外,可进行CDR移植以改变抗体分子的某些性质,包括亲和力和特异性。CDR移植的非限制性实例公开在美国专利号5,225,539中。
治疗方法
本文提供了一种用于治疗有需要的哺乳动物的肺病症或损伤的方法,其包括:对所述哺乳动物施用有效治疗所述哺乳动物的量的选自TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的至少一种治疗剂。
在各种实施方案中,所述治疗剂选自由以下组成的组:小分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;肽、肽模拟物以及核酸分子。
本文提供了一种用于治疗有需要的哺乳动物的肺病症或损伤的方法,其包括对所述哺乳动物施用选自以下的至少两种治疗剂:(i)至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及(ii)至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;量为有效治疗所述哺乳动物的量。在一些实施方案中,所述治疗剂是组合抑制剂,其意指能够抑制TLR2基因或其基因产物和TLR4基因或其基因产物两者的表达和/或活性的单一药剂。
在各种实施方案中,各治疗剂独立地选自由以下组成的组:小分子化合物;蛋白质;抗体或其片段;肽、肽模拟物以及核酸分子。
在一个实施方案中,核酸分子可用于下调或抑制由与疾病或病症(例如,如本文所述的肺疾病、病症或损伤)相关的TLR2和TLR4单倍型多态现象产生的TLR2和TLR4蛋白质的表达。对TLR2和TLR4基因、或TLR2和TLR4蛋白质或者RNA水平的分析可用于鉴定具有这些多态现象的受试者或者具有发展本文所述的病症、症状或疾病的风险的那些受试者。这些受试者适合治疗,例如用本文所公开的核酸分子或适用于治疗与TLR2和/或TLR4基因表达有关的任何其它组合物进行治疗。因此,对TLR2和/或TLR4蛋白质或RNA水平的分析可用于确定治疗受试者的治疗类型和疗程。对TLR2和/或TLR4蛋白质或RNA水平的监测可用于预测治疗结果和确定调节与本文所述的性状、病状或疾病相关的某些TLR2和/或TLR4蛋白质的水平和/或活性的化合物和组合物的功效。
在优选实施方案中,正在治疗的受试者是温血动物并且具体来说是包括人和非人灵长类动物在内的哺乳动物。
提供了通过使用如本文所提供的小核酸分子来抑制TLR2和TLR4表达的组合物和方法,所述小核酸分子如能够介导或介导针对TLR2和/或TLR4基因表达的RNA干扰的短干扰核酸(siNA)、双链核酸(dsNA)、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、以及短发夹RNA(shRNA)分子。本文所公开的组合物和方法还适用于治疗各种肺病症和损伤,如急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植之后的闭塞性细支气管炎以及肺移植诱发的急性移植物功能障碍。本文所公开的组合物和方法还适用于治疗或预防与器官移植(特别是肺移植)相关的炎症和/或移植物排斥,包括治疗、预防或减弱原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或器官移植(特别是肺移植)之后的原发性移植物功能障碍(PGD)的发展。
本文所公开的核酸分子可个别地或与其它药物组合或相结合一起用于预防或治疗与TLR2和/或TLR4相关的疾病、性状、病状和/或病症,如与器官移植(特别是肺移植)相关的肺病症或损伤或移植物排斥。
本文所公开的核酸分子能够以序列特异性方式下调TLR2和/或TLR4的表达。核酸分子可包含有义链和反义链,所述链包含至少部分与TLR2和/或TLR4mRNA互补(反义)的连续核苷酸。
在一些实施方案中,对TLR2和/或TLR4具有特异性的dsRNA可结合其它dsRNA一起使用。
可以使用如本文所公开的核酸分子通过RNA干扰来治疗肺病症和损伤。本文公开了示例性肺病症和损伤。本文所公开的核酸分子可以序列特异性方式抑制TLR2和/或TLR4的表达。
可通过使用本领域已知的合适技术测定PaO2水平来监测肺损伤的治疗。还可以通过使用本领域已知的合适技术测定不同细胞群(例如,嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)的总的和分类的支气管肺泡灌洗(BAL)计数来监测治疗。还可以通过测定在受影响的组织的细胞中的TLR2和/或TLR4mRNA水平或TLR2和/或TLR4蛋白质水平来监测治疗。还可以通过非侵入性地扫描受影响的器官或组织如通过计算机辅助断层扫描、核磁共振弹性成像扫描以及本领域已知的其它合适技术来监测治疗。
用于治疗或预防受试者或生物体的TLR2相关的疾病或病状的方法可包括在适合下调所述受试者或生物体的TLR2基因表达的条件下使所述受试者或生物体与如本文所提供的核酸分子接触。用于治疗或预防受试者或生物体的TLR2和TLR4相关的疾病或病状的方法可包括在适合下调所述受试者或生物体的TLR2和TLR4基因表达的条件下使所述受试者或生物体与如本文所提供的核酸分子接触。
用于治疗或预防受试者或生物体的肺疾病、病状或损伤的方法可包括在适合下调所述受试者或生物体的TLR2基因表达的条件下使所述受试者或生物体与核酸分子接触。
用于治疗或预防受试者或生物体的肺疾病、病状或损伤的方法可包括使所述受试者或生物体在适合下调所述受试者或生物体的TLR2基因表达的条件下与核酸分子接触并且在适合下调所述受试者或生物体的TLR4基因两者的表达的条件下与核酸分子接触。
用于治疗或预防受试者或生物体的选自由以下组成的组的一种或多种肺疾病或病症的方法可包括在适合下调所述受试者或生物体的TLR2基因表达的条件下使所述受试者或生物体与核酸分子接触:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植之后的闭塞性细支气管炎以及与器官移植(特别是肺移植)相关的移植物排斥。
用于治疗或预防受试者或生物体的选自由以下组成的组的一种或多种肺疾病或病症的方法可包括使所述受试者或生物体在适合下调所述受试者或生物体的TLR2表达的条件下与核酸分子接触并且在适合下调所述受试者或生物体的TLR4基因表达的条件下与核酸分子接触:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械通气诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植之后的闭塞性细支气管炎以及与器官移植(特别是肺移植)相关的移植物排斥。
在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗方法组合来抑制基因Toll样受体2(TLR2):手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法以及营养补充剂。在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与免疫抑制剂疗法组合来下调基因Toll样受体2(TLR2)。
在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗方法组合来下调基因Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4):手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法以及营养补充剂。在各种实施方案中,所提供的治疗肺疾病、病症或损伤的方法包括与免疫抑制剂疗法组合来下调基因Toll样受体2(TLR2)基因和下调Toll样受体4(TLR4)基因。
肺病症和损伤
本文所公开的方法和组合物适用于治疗经历或罹患以下或具有罹患以下的风险的受试者:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿以及肺移植的医学并发症,所述医学并发症包括但不限于原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、肺再移植反应、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和/或原发性移植物功能障碍(PGD)。
急性呼吸窘迫综合症(ARDS)
ARDS被定义为特征在于在不存在心源性肺水肿迹象的情况下两侧肺浸润和严重血氧不足的急性病症。急性呼吸窘迫综合症(ARDS)与弥漫性肺泡损伤(DAD)和肺毛细管内皮损伤相关。早期阶段被描述为是渗出性的,而晚期阶段在特征上为纤维增生。
早期ARDS的特征在于肺泡毛细管屏障渗透性增加,从而导致液体流入到肺泡中。所述肺泡毛细血管屏障由肺泡的微血管内皮和上皮衬层形成。因此,引起血管内皮抑或肺泡上皮损伤的多种损害会导致ARDS。损伤的主要部位可集中在血管内皮(例如,败血症)抑或肺泡上皮(例如,吸入胃内含物)上。
对内皮的损伤引起增加的毛细血管渗透性和富含蛋白质的液体流入到肺泡腔中。对肺泡衬层细胞的损伤也促进了肺水肿形成。存在两种类型的肺泡上皮细胞。构成90%肺泡上皮的I型细胞容易受到损伤。对I型细胞的损伤既允许增加液体进入肺泡又允许减少液体从肺泡腔中清除。II型细胞具有若干重要的功能,包括表面活性剂的产生、离子转运以及细胞损伤之后增殖及分化为I型细胞。对II型细胞的损伤导致表面活性剂的产生减少,同时使得依从性降低和肺泡萎缩。干扰肺中的正常修复过程可能会导致发展纤维化。
ARDS引起肺内分流显著增加,从而导致严重的血氧不足。虽然需要高吸入氧浓度来维持充足的组织氧合作用和生命,但是常常需要另外的措施,如在正呼气末压(PEEP)情况下的肺募集。ARDS一贯与肺动脉高压相关。肺动脉血管收缩可能促成通气-灌注失调并且这是ARDS中的血氧不足的机制之一。当解决所述综合症时,出现肺动脉压的正常化。发病率相当大。患有ARDS的患者可能具有长期住院过程,并且他们频繁地发展医院感染,特别是呼吸机相关性肺炎。此外,患者常常具有显著的体重减轻和肌无力,并且功能障碍在出院之后可持续数月之久。大多数ARDS中的死亡可归因于败血症或多器官衰竭,而不是原发性肺病因,尽管最近使用较小潮气量的机械通气的成功可能提示肺损伤的作用是死亡的直接原因。
急性肺损伤(ALI)
急性肺损伤(ALI)是特征在于血氧不足、非心源性肺气肿、低肺依从性和广泛的毛细血管泄漏的弥散性不均匀的肺损伤。ALI是由局部或全身性炎症(主要是败血症)的任意刺激物引起。
ALI存在两种形式。原发性ALI是由对肺的直接损伤(例如,肺炎)引起。继发性ALI是由间接损害(例如,胰腺炎)引起。存在两个阶段——急性阶段的特征在于肺泡-毛细血管界面的破坏、富含蛋白质的液体泄漏到间质组织和肺泡腔中以及细胞因子大量释放和嗜中性粒细胞迁移。随后的修复阶段的特征在于纤维化增生和肺组织重塑。
核心病理学为肺泡-毛细血管界面的破坏:这实际上是指两个单独的屏障——肺泡的内皮和基底膜。在ALI的急性阶段,这个屏障存在增加的渗透性并且富含蛋白质的液体从毛细血管中漏出。肺泡上皮细胞存在两种类型——1型肺细胞占90%的细胞表面积并且容易受到损伤。2型肺细胞对损伤更具抗性,这非常重要,因为这些细胞产生表面活性剂、转运离子并且增殖和分化为1型细胞。
对内皮和肺泡上皮的损伤导致在肺与血液之间形成开放界面,从而促进微生物从肺中传播到全身,进而激起全身性炎症反应。此外,对上皮细胞的损伤妨碍了肺将液体泵出空气腔的能力。充满液体空气腔、表面活性剂损失、微血管血栓形成和无序的修复(这导致了纤维化)减少了静止肺容量(依从性降低),从而增加了通气-灌注失调、右到左的分流以及呼吸功。此外,似乎减少了肺单元的淋巴引流——受到急性损伤刺激:这促进了血管外液体的积累。
患者具有低肺容量、肺不张、依从性降低、通气-灌注失调(增加的死腔)以及右到左的分流。临床特征为——严重呼吸困难、呼吸急促和抗性血氧不足。
长期炎症和肺细胞破坏导致成纤维细胞增殖、透明膜形成和肺纤维化。这个纤维化小肺泡炎可早在初次损伤后五天内就变得明显。随后的恢复的特征可在于生理储备减少和对其它肺损伤的敏感性增加。大量的微血管血栓形成可导致肺高血压、心肌功能障碍和全身性低血压。
肺纤维化(特发性)
特发性肺纤维化(IPF)是组织病理学特征在于存在普通型间质性肺炎的特发性间质性肺炎。普通型间质性肺炎的标志性病理学特征为具有健康肺、间质性炎症、纤维化以及蜂窝样变化的交替区域的异质性斑驳外观。纤维化比炎症占优势。特发性肺纤维化预示不良预后,并且到目前为止,没有已证明有效的疗法可用于治疗肺移植之后的特发性肺纤维化。
特发性肺纤维化的病因仍不明确;然而,在目前关于特发性肺纤维化(IPF)的发病机理的假说中,易感染的宿主暴露于刺激因素(例如,吸烟、环境污染物、环境灰尘、病毒感染、胃食管反流病、慢性吸入)可导致初次肺泡上皮损伤。这个损伤可导致肺泡上皮细胞活化,这引起间充质细胞的迁移、增殖和活化,同时形成纤维母细胞/肌纤维母细胞病灶,从而导致细胞外基质的积累增加和肺实质的不可逆破坏。
已通过对家族性肺纤维化的研究来认识特发性肺纤维化的其它可能的原因。家族性肺纤维化可占特发性肺纤维化的全部病例中的20%。在患有家族性肺纤维化的一些个体中已发现血清表面活性蛋白质C中的基因突变。据信在血清表面活性蛋白质C中的这些突变可损伤II型肺泡上皮细胞。另外,已描述了突变型端粒酶与家族特发性肺纤维化相关。
博来霉素诱发的肺纤维化
博来霉素是从细菌轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的菌株中分离的糖肽抗生素。博来霉素是指在结构上相关的化合物的家族。当用作抗癌剂时,化学治疗形式主要是博来霉素A2和B2。其通过引起DNA断裂而起作用。所述药物用于治疗多种恶性疾病,包括头和颈、子宫颈以及食管的鳞状细胞癌;生殖细胞肿瘤;睾丸癌;以及霍奇金(Hodgkin)和非霍奇金(non-Hodgkin)淋巴瘤两者。其它抗癌药(例如像环磷酰胺和甲氨蝶呤)可引起与博来霉素相似的肺纤维化。
博来霉素疗法的严重并发症是肺纤维化/间质性肺纤维化(也被称为纤维性肺泡炎)和肺功能受损。另外,肺损伤的较不常见的形式包括迁延性肺炎和过敏性肺炎。
慢性阻塞性肺病(COPD)
慢性阻塞性肺病(COPD)也被称为慢性阻塞性肺部疾病(COLD)、慢性阻塞性气道疾病(COAD)、慢性气流通气受限(CAL)以及慢性阻塞性呼吸道疾病(CORD),它是指慢性细支气管炎和肺气肿,这是其中气道变窄的一对肺常见共存疾病。这导致了空气流进肺中和从肺中流出受限,从而引起呼吸短促。在临床实践中,COPD由其在肺功能检测时的特征性低气流所定义。与哮喘相反,此受限的可逆性差并且通常在一段时间内逐渐变得更差。
COPD由引发肺中的异常炎症反应的有害粒子或气体(最通常来自吸烟)所引起。在较大气道中的炎症反应被称为慢性支气管炎,它在临床上当人们经常咳出痰时得到诊断。在肺泡中,炎症反应引起肺组织的破坏,此过程被称为肺气肿。COPD的自然病程的特征在于被称为急性加重期的症状临时突然恶化,其大多数由感染和空气污染所引起。
常常在单一患者中组合发现肺气肿破坏和小气道炎症两者,从而导致被称为COPD的疾病谱。当肺气肿为中度或重度时,弹性反弹的损失(而不是细支气管疾病)是气流受限的机制。与此相反,当肺气肿为轻度时,细支气管异常是肺功能不足的最主要原因。尽管肺气肿中的气流阻塞常常是不可逆的,但是由于炎症导致的支气管狭窄导致有限量的可逆性。
在慢性阻塞性肺病(COPD)中的病理学变化发生在大(中心)气道、小(外周)细支气管以及肺实质中。病理学机制不清楚但是最可能涉及不同的机制。增加数量的活化的多形核白细胞和巨噬细胞以不能由抗蛋白酶有效抵消的方式释放弹性蛋白酶,从而引起肺损伤。主要的危害来自人白细胞弹性蛋白酶,其中提出蛋白酶3和来源于巨噬细胞的基质蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及纤溶酶原活化因子可能具有协同作用。此外,由香烟烟雾中的自由基所引起的氧化应激增加、由噬菌细胞所释放的氧化剂以及多形核白细胞全部都可导致暴露的细胞的细胞凋亡或坏死。还已提出加速老化和自身免疫机制在COPD发病机理中起作用。
慢性支气管炎
慢性支气管炎是肺中支气管(中等大小的气道)的慢性炎症。它通常被认为是慢性阻塞性肺病(COPD)的两种形式之一。它在临床上被定义为在连续的两年中持续至少三个月的产生痰和黏液的持续性咳嗽。黏液腺增大是慢性支气管炎的组织学标志。所描述的气道中的结构改变包括萎缩、局部鳞状化生、纤毛异常、可变量的气道平滑肌增生、炎症以及支气管壁增厚。嗜中性白细胞增多在气道内腔中发展并且嗜中性浸润物积累在黏膜下层。呼吸性细支气管显示单核细胞炎症性过程、由黏液堵塞引起的内腔闭塞、杯状细胞化生、平滑肌增生以及由于纤维化造成的形变。这些改变与支持肺泡附着点的损失相组合通过允许气道壁使气道内腔变形并变窄而引起气流受限。
肺气肿
肺气肿是主要引起呼吸短促的长期的进行性肺疾病。在患有肺气肿的人中,支持肺的物理形状和功能所必须的组织受到破坏。它包括在一组COPD中。肺气肿被称为阻塞性肺病,因为较小囊(被称为肺泡)周围的肺组织的破坏使得这些空气囊在呼气时不能支持其功能形状。它常常由吸烟或长期暴露在空气污染中引起。
肺气肿具有3种形态模式。第一种类型为腺泡中央型肺气肿,其特征在于仅限于呼吸性细支气管和肺泡的中央部分的局部破坏。这种形式的肺气肿与吸烟相关并且在肺上叶最严重。第二种类型为泡性肺气肿,其涉及末端细支气管远端的整个肺泡。泡性类型在较低肺区中是最严重的并且通常在具有纯合子α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺陷的患者中发展。第三种类型,腺泡远端肺气肿或隔旁肺气肿是最不常见的形式并且涉及远端气道结构、肺泡管和囊。这种形式的肺气肿位于纤维间隔或位于胸膜并且导致大泡的形成。顶端大泡可引起气胸。隔旁肺气肿与气流阻塞无关。
肺移植及其并发症
术语“肺移植”意欲涵盖其中患者病变的肺部分或完全由来自供体的肺所替代的手术程序。尽管在某些情况下可以涵盖异种移植,但是通常同种异体移植是优选的。
肺移植已成为患有晚期/末期肺疾病的患者的治疗选择。肺移植的指示包括慢性阻塞性肺病(COPD)、肺动脉高压、囊性纤维化、特发性肺纤维化以及艾森门格(Eisenmenger)综合症。通常使用四种不同的手术技术:单肺移植、双侧连续移植、心肺联合移植以及肺叶移植,其中大多数器官是从已故供体获得。在近几十年内,已实质上改进了供体管理、器官保存、免疫抑制方案以及感染性并发症的控制,并且已发展了移植程序的手术操作技术。尽管如此,原发性移植物功能障碍(PGD)影响了预计10%至25%的肺移植并且是早期移植后发病和肺受体死亡的首要原因(Lee JC和Christie JD.2009.Proc Am Thorac Soc,vol.6:39-46)。PGD表现为由胸部x光片上的弥散性浸润和异常氧化作用所定义的急性肺损伤。在此,存在一些证据表明再灌注损伤、急性排斥以及后续发展慢性移植物功能障碍之间的关系。慢性排斥被称为闭塞性细支气管炎/闭塞性细支气管炎综合症(BOS),它是为什么五年存活率仅为50%的关键原因,所述存活率显著低于大多数其它实质器官移植。研究者最近已证明独立于其它风险因素之外,PGD增加了BOS发展的风险,并且PGD的严重程度与BOS的风险增加直接相关(Daud SA,Yusen RD等2007Am J Respir Crit Care Med.2007;175(5):507–513)。
肺移植之后的闭塞性细支气管炎
闭塞性细支气管炎及其临床上关联的闭塞性细支气管炎综合症影响了高达50%至60%的移植后存活5年的患者。在大多数患者中,闭塞性细支气管炎是对增强的免疫抑制反应不好的进行性过程,并且它是发生于术后第三年之后的全部死亡中的30%以上的原因。在闭塞性细支气管炎发病之后的第5年的存活率仅为30%至40%,并且在移植之后的第5年的存活率在患有闭塞性细支气管炎的患者中比未患闭塞性细支气管炎的患者低20%至40%。
闭塞性细支气管炎的诊断是基于组织学,但是使用经支气管的肺活检常常难以获得组织学证据。因此,在1993年,由心肺移植国际学会(ISHLT)发起的委员会提出了闭塞性细支气管炎(被称为BOS)的临床描述,它是基于FEV1的改变。对于每一位患者,稳定的移植后基线FEV1被定义为BOS阶段0;在经历FEV1降低的患者中,根据减少的量来定义从1至3的BOS进行性阶段。尽管全世界的移植中心已经采用此分类系统作为适用的慢性同种异体移植物功能障碍的描述符,但是已经出现关于其检测小的肺功能改变的能力的担忧。此担忧最近导致制定出用于BOS的修订的分类系统,这包括被定义为呼气中期流速(FE25–75)和/或FEV1降低的新的“可能的BOS”阶段(BOS0-p)。纳入FEF25–75的基本原理来自心肺和双侧肺受体的研究,所述研究显示此变量在BOS发病时在FEV1之前变差。新的BOS0-p阶段意欲警告医师并指示需要密切功能监测和使用BOS的替代标记进行深入评估。然而,在单肺受体(特别是患有肺气肿的那些受体)中阶段BOS0-p的适用性仍需要确定。
闭塞性细支气管炎的组织病理学特征表明上皮细胞的损伤和炎症以及小气道的上皮下结构由于上皮再生低效和组织修复异常而导致过度的纤维增生。与已提出来解释其它器官同种异体移植物的慢性功能障碍的“损伤反应”概念类似,气道损伤可能是经由同种免疫相关和同种免疫独立的机制单独或组合地起作用而发生。演进的概念为闭塞性细支气管炎代表“最后共同路径”病变,其中不同损害可以导致相似的组织学结果和临床结果。然而在未移植的个体中此综合症的罕见性表明同种免疫相关的机制通常起到关键的作用。
核酸分子和药物制剂的递送
核酸分子可被改适用于单独或与其它治疗剂组合地预防或治疗肺疾病、损伤、性状或病状和/或病症。核酸分子可包含用于对受试者施用的递送媒介物(包括脂质体)、载剂和稀释剂及其盐,和/或可存在于药学上可接受的制剂中。
本文所公开的核酸分子可作为化合物本身(即裸核酸分子)或作为药学上可接受的盐来递送或施用,并且可单独地或作为活性成分与一种或多种药学上可接受的载剂、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或媒介物组合地递送或施用。在一些实施方案中,通过直接应用与载剂或稀释剂一起制备的裸分子来对靶组织递送本文所公开的核酸分子。
术语“裸核酸分子”是指没有任何起到帮助、促进或辅助进入细胞中的作用的递送媒介物的核酸分子,所述媒介物包括例如病毒载体、病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、脂转染剂或沉淀剂等。例如,在PBS中的siRNA是“裸siRNA”。
通过直接应用具有载剂或稀释剂或任何其它递送媒介物的核酸分子可对受试者递送或施用核酸分子,所述递送媒介物起到帮助、促进或辅助进入细胞中的作用,其包括例如病毒载体、病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、脂转染剂或沉淀剂等。有助于将核酸引入到所需的受试者体内的多肽描述于美国申请公布号20070155658中(例如,三聚氰胺衍生物如2,4,6-三胍基三嗪和2,4,6-Tramidosarcocyl三聚氰胺、聚精氨酸多肽以及包括交替的谷氨酰胺和天冬酰胺残基的多肽)。
用于递送核酸分子的方法描述在以下文献中:Akhtar等,TrendsCell Bio.,2:139(1992);Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics,编著,Akhtar,(1995),Maurer等,Mol.Membr.Biol.,16:129-140(1999);Hofland和Huang,Handb.Exp.Pharmacol.,137:165-192(1999);以及Lee等,ACS Symp.Ser.,752:184-192(2000);美国专利号6,395,713;6,235,310;5,225,182;5,169,383;5,167,616;4,959217;4.925,678;4,487,603;以及4,486,194和Sullivan等,PCT WO94/02595;PCT WO00/03683和PCT WO02/08754;以及美国专利申请公布号2003077829。这些方案可用于递送几乎任何核酸分子。通过本领域技术人员已知的多种方法可将核酸分子施用到细胞中,所述方法包括但不限于囊封于脂质体中、通过离子导入法或通过并入到其它媒介物中,所述媒介物如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见例如Gonzalez等,Bioconjugate Chem.,10:1068-1074(1999);Wang等,国际PCT公布号WO03/47518和WO03/46185)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和PLCA微球(参见例如美国专利号6,447,796和美国申请公布号2002130430)、生物可降解的纳米胶囊以及生物粘附微球)或者通过蛋白质载体(O’Hare和Normand,国际PCT公布号WO00/53722)。或者,通过直接注射、口服滴注、吸入或通过使用输液泵来局部递送核酸组合物/组合。直接注射如本文所提供的核酸分子,无论是例如气管内、皮下、肌肉内或皮肤内,都可使用标准针头和注射器方法或通过无针技术来进行,所述无针技术如在Conry等,Clin.Cancer Res.,5:2330-2337(1999)和Barry等,国际PCT公布号WO99/31262中所述的那些。本文所提供的分子可用作药剂。药剂预防受试者的疾病病况、调节疾病病况的发生或治疗疾病病况(将症状减轻至一定程度,优选为全部症状)。
核酸分子可与阳离子脂质复合、包装在脂质体中或者以其它方式递送至靶细胞或组织。在有或没有并入到生物聚合物中的情况下,通过直接真皮应用、经皮应用或注射,可将核酸或核酸复合物离体或体内局部施用到相关组织中。
递送系统包括含有聚(乙二醇)脂质的表面修饰的脂质体(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)。这些制剂提供了一种用于增加药物在靶组织中的积累的方法。此类药物载剂耐受由单核吞噬细胞系统(MPS或RES)进行的调理作用和消除,借此使囊封药物的血液循环时间能够更长并且提高其组织暴露(Lasic等Chem.Rev.1995,95,2601-2627;Ishiwata等,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。
核酸分子可与聚乙烯亚胺(例如,直链或支链的PEI)和/或聚乙烯亚胺衍生物一起配制或复合,所述聚乙烯亚胺和/或聚乙烯亚胺衍生物包括例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物、接枝的PEI如半乳糖PEI、胆固醇PEI、抗体衍生的PEI及其聚乙二醇PEI(PEG-PEI)衍生物(参见例如Ogris等,2001,AAPA PharmSci,3,1-11;Furgeson等,2003,Bioconjugate Chem.,14,840-847;Kunath等,2002,Pharmaceutical Research,19,810-817;Choi等,2001,Bull.KoreanChem.Soc.,22,46-52;Bettinger等,1999,Bioconjugate Chem.,10,558-561;Peterson等,2002,Bioconjugate Chem.,13,845-854;Erbacher等,1999,Journal of Gene Medicine Preprint,1,1-18;Godbey等,1999,PNAS USA,96,5177-5181;Godbey等,1999,Journal of ControlledRelease,60,149-160;Diebold等,1999,Journal of Biological Chemistry,274,19087-19094;Thomas和Klibanov,2002,PNAS USA,99,14640-14645;Sagara,美国专利号6,586,524和美国专利申请公布号20030077829)。
核酸分子可与膜破裂试剂复合,所述试剂如美国专利申请公布号20010007666中所述的那些。一种或多种膜破裂试剂和核酸分子还可与阳离子脂质或辅助脂质分子复合,所述脂质分子如美国专利号6,235,310中所述的那些。
经由肺部递送,如通过吸入经由吸入装置或雾化器施用的气雾剂或喷雾干燥制剂,可递送或施用核酸分子,从而提供核酸分子到相关肺组织中的快速局部摄取。通过研磨干燥的或冻干的核酸组合物并且然后使微粉化的组合物通过例如400目筛以破碎或分离出大团块,可制备含有可呼吸的微粉化核酸组合物干燥粒子的固体微粒组合物。含有本文所提供的核酸组合物的固体微粒组合物可任选地含有用于促进气雾剂形成的分散剂以及其它治疗化合物。合适的分散剂为乳糖,它可按任意比率(如1比1的重量比)与核酸化合物混合。
液体粒子的气雾剂可包含本文所公开的核酸分子并可通过任意合适的方式(如用雾化器)来制造(参见例如美国专利号4,501,729)。雾化器是可商购获得的装置,它借助于使压缩气体(通常为空气或氧气)加速通过狭窄的文丘里管孔抑或借助于超声搅拌来将活性成分的溶液或悬浮液转变成治疗气雾剂薄雾。用于在雾化器中使用的合适制剂在液体载剂中包含量高达制剂的40%w/w、优选小于20%w/w的活性成分。所述载剂通常是水或稀释醇水溶液,优选通过添加例如氯化钠或其它合适的盐而使其与体液等渗。如果制剂没有制备成无菌,则任选的添加剂包括防腐剂,例如羟苯甲酸甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发油、缓冲剂和乳化剂以及其它配制表面活性剂。使用任意固体微粒气雾剂发生器同样可产生包含活性组合物和表面活性剂的固体粒子气雾剂。用于对受试者施用固体微粒治疗剂的气雾剂发生器产生如上文所解释的可呼吸的粒子并且以适合用于人施用的速率产生一定体积的含有预定计量剂量的治疗剂组合物的气雾剂。一种说明性类型的固体微粒气雾剂发生器是吹药器。用于通过吹入来施用的合适制剂包括可借助于吹药器来递送的精细粉碎的粉末。在吹药器中,所述粉末,例如有效进行本文所述的治疗的计量剂量的粉末包含在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中,所述胶囊或药筒被当场刺穿或打开,并且粉末通过在吸入时流过装置的空气或者借助于手动操作的泵来递送。在吹药器中所用的粉末单独由活性成分组成抑或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂如乳糖以及任选的表面活性剂的粉末掺混物组成。活性成分通常包含制剂的0.1至100w/w。第二类型的说明性气雾剂发生器包括计量剂量吸入器。计量剂量吸入器是加压的气雾剂分配器,它通常含有活性成分于液化的推进剂中的悬浮液或溶液制剂。在使用这些装置期间,通过经过改适来递送计量体积的阀门排放所述制剂,以产生含有活性成分的细粒子喷雾。合适的推进剂包括某些氯氟烃化合物,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷及其混合物。所述制剂可另外含有一种或多种共溶剂,例如乙醇、乳化剂或其它配制表面活性剂如油酸或三油酸脱水山梨糖醇酯、抗氧化剂以及合适的调味剂。用于肺部递送的其它方法描述在例如美国专利申请公布号20040037780和美国专利号6,592,904;6,582,728;6,565,885中。
递送系统可包括例如水性和非水性凝胶剂、乳膏剂、多种乳液、微乳液、脂质体、软膏剂、水性和非水性溶液、洗剂、气雾剂、烃基质以及散剂,并且可含有赋形剂如增溶剂、渗透促进剂(例如,脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇以及氨基酸)以及亲水聚合物(例如,聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中,药学上可接受的载剂为脂质体或透皮促进剂。可根据本文所提供的组合物和方法来使用的脂质体的实例包括以下:(1)CellFectin,阳离子脂质N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四软脂酰-y-精胺和二油酰基磷脂酰-乙醇胺(DOPE)(GIBCO BRL)的1:1.5(M/M)脂质体制剂;(2)Cytofectin GSV,阳离子脂质和DOPE(Glen Research)的2:1(M/M)脂质体制剂;(3)DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)-N,N,N-三-甲基-硫酸二甲酯铵)(Boehringer Manheim);以及(4)Lipofectamine,聚阳离子脂质DOSPA、中性脂质DOPE(GIBCO BRL)和二烷基化氨基酸(DiLA2)的3:1(M/M)脂质体制剂。
核酸分子可包含生物缀合物,例如如在Vargeese等,美国序列号10/427,160;美国专利号6,528,631;美国专利号6,335,434;美国专利号6,235,886;美国专利号6,153,737;美国专利号5,214,136;美国专利号5,138,045中所述的核酸缀合物。
核酸分子的表达
本文所公开的组合物、方法和试剂盒可包括表达载体,所述载体包含以允许核酸分子表达的方式编码如本文所提供的至少一种核酸分子的核酸序列。将核酸分子或能够表达dsRNA链的一种或多种载体引入到细胞环境中的方法将取决于细胞的类型及其环境的组成。可将核酸分子或载体构建体直接引入到细胞中(即,细胞内);或者引入到细胞外的腔、胞间隙中、到生物体循环中,口服引入,或者可通过在含有dsRNA的溶液中洗涤生物体或细胞而引入。所述细胞优选为哺乳动物细胞;更优选为人细胞。表达载体的核酸分子可包含有义区和反义区。反义区可包含与编码选自TLR2基因和TLR4基因的基因的RNA或DNA序列互补的序列;并且有义区可包含与所述反义区互补的序列。核酸分子可包含具有互补的有义区和反义区的两条不同的链。核酸分子可包含具有互补的有义区和反义区的单链。
与靶RNA分子相互作用并下调编码靶RNA分子(例如,由本文的Genbank保藏编号所表示的靶RNA分子)的基因的核酸分子可由插入到DNA或RNA载体中的转录单元来表达。重组载体可为DNA质粒或病毒载体。表达病毒载体的核酸分子可基于但不限于腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒来构建。能够表达核酸分子的重组载体可如本文所述进行递送并存留于靶细胞中。或者,可使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。必要时,这些载体可重复施用。一旦表达,则核酸分子经由RNA干扰(RNAi)结合和下调基因功能或表达。核酸分子表达载体的递送可以是全身性的,例如通过静脉内或肌肉内施用、通过直接施用至肺、例如通过气管内注射、通过施用到从受试者中取出的靶细胞之后再次引入到所述受试者体内、或者通过允许引入到所需靶细胞中的任何其它方式。
表达载体可包含以允许核酸分子表达的方式编码本文所公开的至少一种核酸分子的核酸序列。例如,所述表达载体可编码核酸双链体的一条链或两条连或自身杂交成核酸双链体的单一自身互补的链。编码核酸分子的核酸序列可以允许核酸分子表达的方式可操作地连接。这些表达载体的非限制性实例描述在以下文献中:Paul等,2002,Nature Biotechnology,19,505;Miyagishi和Taira,2002,NatureBiotechnology,19,497;Lee等,2002,Nature Biotechnology,19,500;以及Novina等,2002,Nature Medicine,高级在线出版物doi:10.1038/nm725。表达载体也可包含在哺乳动物(例如,人)细胞中。
表达载体可包含编码两个或更多个核酸分子的核酸序列,所述核酸分子可为相同或不同的。表达载体可包含与由Genbank保藏编号NM_003264.3(TLR2)、NR_024169.1(TLR4)、NM_138554.3(TLR4)或NR_024168.1(TLR4)所表示的核酸分子互补的核酸分子的序列。
表达载体可包含以下一种或多种:a)转录起始区(例如,真核pol I、II或III起始区);b)转录终止区(例如,真核pol I、II或III终止区);c)内含子以及d)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列,其中所述序列以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接至起始区和终止区。所述载体可任选地包含用于蛋白质的可操作地连接在编码核酸分子的序列的5’-侧或3’-侧上的开放阅读框(ORF);和/或内含子(插入序列)。
核酸分子序列的转录可由真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子来驱动。来自pol II或pol III启动子的转录物在所有细胞中以高水平进行表达;在给定的细胞类型中给定的pol II启动子的水平取决于附近所存在的基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。也使用原核RNA聚合酶启动子,条件是原核RNA聚合酶在适当细胞中表达(Elroy-Stein和Moss,1990,PNAS USA,87,6743-7;Gao和Huang1993,Nucleic Acids Res.,21,2867-72;Lieber等,1993,Methods Enzymol.,217,47-66;Zhou等,1990,Mol.Cell.Biol.,10,4529-37)。若干研究者已证明由这些启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中起作用(例如,Kashani-Sabet等,1992,Antisense Res.Dev.,2,3-15;Ojwang等,1992,PNAS USA,89,10802-6;Chen等,1992,Nucleic Acids Res.,20,4581-9;Yu等,1993,PNAS USA,90,6340-4;L’Huillier等,1992,EMBO J.,11,4411-8;Lisziewicz等,1993,PNAS USA,90,8000-4;Thompson等,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259;Sullenger&Cech,1993,Science,262,1566)。更具体地说,转录单元如来源于编码U6小核酸RNA(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的转录单元适用于在细胞中产生高浓度的所需RNA分子如siNA(Thompson等,见上文;Couture和Stinchcomb,1996,见上文;Noonberg等,1994,Nucleic Acid Res.,22,2830;Noonberg等,美国专利号5,624,803;Good等,1997,Gene Ther.,4,45;Beigelman等,国际PCT公布号WO96/18736)。上述核酸转录单元可并入到多种载体中以用于引入到哺乳动物细胞中,所述载体包括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺相关病毒载体)或者病毒RNA载体(如逆转录病毒或甲病毒载体)(参见Couture和Stinchcomb,1996见上文)。
核酸分子可在细胞内由真核启动子表达(例如,Izant和Weintraub,1985,Science,229,345;McGarry和Lindquist,1986,PNASUSA83,399;Scanlon等,1991,PNAS USA,88,10591-5;Kashani-Sabet等,1992,Antisense Res.Dev.,2,3-15;Dropulic等,1992,J.Virol.,66,1432-41;Weerasinghe等,1991,J.Virol.,65,5531-4;Ojwang等,1992,PNAS USA,89,10802-6;Chen等,1992,NucleicAcids Res.,20,4581-9;Sarver等,1990Science,247,1222-1225;Thompson等,1995,Nucleic Acids Res.,23,2259;Good等,1997,GeneTherapy,4,45)。本领域的技术人员认识到任意核酸可在真核细胞中由适当DNA/RNA载体来表达。可通过经由酶性核酸使其从初级转录物中释放来增强这些核酸的活性(Draper等,PCT WO93/23569和Sullivan等,PCT WO94/02595;Ohkawa等,1992,Nucleic Acids Symp.Ser.,27,15-6;Taira等,1991,Nucleic Acids Res.,19,5125-30;Ventura等,1993,Nucleic Acids Res.,21,3249-55;Chowrira等,1994,J.Biol.Chem.,269,25856)。
包装到病毒粒子中的病毒构建体会同时实现表达构建体到细胞中的有效引入和由表达构建体编码的dsRNA构建体的转录。
用于口服引入的方法包括直接混合RNA和生物体的食物以及其中将用作食物的物质进行工程改造来表达RNA、然后喂给欲影响的生物体的工程改造方法。可使用物理方法将核酸分子溶液引入到细胞中。引入核酸的物理方法包括注射含有核酸分子的溶液、利用由核酸分子覆盖的粒子进行轰击、在RNA溶液中浸泡细胞或生物体或者在核酸分子存在下对细胞膜进行电穿孔。
可使用本领域已知的用于将核酸引入到细胞中的其它方法,如脂质介导的载体转运、化学介导的转运如磷酸钙等。因此,核酸分子可连同执行以下活性中的一个或多个的组分一起引入:增强细胞的RNA摄取、促进双链体链的退火、使退火的链稳定或以其它方式增强靶基因的抑制。
核酸制剂
可使用合适的制剂将核酸分子或载体构建体引入到细胞中,所述制剂例如脂质制剂,如在LipofectamineTM2000(Invitrogen,CA,USA)中、维生素A偶合的脂质体中(Sato等Nat Biotechnol2008;26:431–442,PCT专利公布号WO2006/068232)。也可对动物施用脂质制剂,如通过静脉内、肌肉内或腹膜内注射或气管内注射或口服或通过吸入或如本领域已知的其它方法。当制剂适合用于施用到动物如哺乳动物且更具体地说为人中时,所述制剂也是药学上可接受的。用于施用寡核苷酸的药学上可接受的制剂是已知的且可使用。在一些情况下,可优选在缓冲溶液或盐水溶液中配制核酸分子(例如dsRNA)并将所配制的dsRNA直接注射到靶器官或到靶细胞中,如在使用卵母细胞的研究中。还可进行dsRNA双链体的直接注射。对于引入dsRNA的合适方法,参见例如美国公布专利申请号2004/0203145、20070265220,所述专利申请以引用方式并入本文。
用于治疗肺病症或损伤的药学上可接受的制剂是已知的且可用于施用本文所公开的治疗组合。在一些情况下,可配制本文所公开的治疗组合物以用于全身性递送的静脉内施用或者作为气雾剂而例如用于鼻内施用或者作为滴鼻剂而例如用于鼻内滴注或者适用于气管内滴注。
聚合的纳米胶囊和微胶囊促进囊封或结合的核酸分子(例如dsRNA)到细胞中的转运和释放。它们包含聚合的或单体的材料,例如特别包含聚氰基丙烯酸丁酯。材料和制备方法的概述已被公布(参见Kreuter,1991)。由单体和/或寡聚体前体在聚合作用/纳米粒子产生步骤中形成的聚合材料根据现有技术本身是已知的,聚合材料的分子量和分子量分布也是已知的,制造纳米粒子领域中的技术人员可根据常见技术对其进行适当选择。
可将核酸分子配制成微乳液。微乳液是水、油和两亲分子的系统,它是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液。通常通过首先在水性表面活性剂溶液中分散油并且然后添加足够量的第4个组分(通常为中等链长度的醇)以形成透明的系统来制备微乳液。
可在微乳液的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独或与共表面活性剂组合的离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油烯醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油硬油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DA0750)。所述共表面活性剂,通常为短链醇如乙醇、1-丙醇以及1-丁醇,用于通过渗入表面活性剂薄膜并随后由于表面活性剂分子间产生的孔隙空间而形成无序薄膜来增加界面流动性。
水溶性交联聚合物
递送制剂可包含水溶性可降解交联聚合物,所述交联聚合物可包含一个或多个可降解的交联脂质部分、一个或多个PEI部分和/或一个或多个mPEG(PEG(甲氧基聚(乙二醇)的甲基醚衍生物)。
可降解的交联脂质部分可如下方案A所示与聚乙烯亚胺(PEI)反应:
方案A
可通过在搅拌下、优选在室温下、持续若干小时使PEI和二丙烯酸酯(I)于互溶剂如乙醇、甲醇或二氯甲烷中混合、然后蒸发掉溶剂以回收所生成的聚合物来进行方案A中所示的反应。虽然不希望受到任何具体理论的束缚,但是据信在PEI和二丙烯酸酯(I)之间的反应涉及PEI的一个或多个氨基与二丙烯酸酯的双键之间的Michael反应(参见J.March,Advanced Organic Chemistry第3版,第711-712页(1985))。方案A中所示的二丙烯酸酯可按如美国申请号11/216,986(美国公布号2006/0258751)中所述的方式来制备。
PEI的分子量范围优选为约200至25,000道尔顿、更优选为400至5,000道尔顿、更优选为600至2,000道尔顿。PEI可为分支或线性的。
PEI与二丙烯酸酯的摩尔比的范围优选为约1:2至约1:20。阳离子脂质聚合物的重均分子量的范围可为约500道尔顿至约1,000,000道尔顿、优选范围为约2,000道尔顿至约200,000道尔顿。可通过使用PEG标准的尺寸排除色谱法或通过琼脂糖凝胶电泳法来测定分子量。
所述阳离子脂质聚合物优选为可降解的、更优选为生物可降解的,例如可通过选自由以下组成的组的机制来降解:水解作用、酶促裂解、还原、光裂解和声波处理。虽然不希望受到任何具体理论的束缚,但是据信在细胞内式(II)的阳离子脂质聚合物的降解通过酯键的酶促裂解和/或水解作用来进行。
通过使可降解的脂质部分与如上文所述的PEI部分反应可进行合成。然后添加mPEG(PEG(甲氧基聚(乙二醇)的甲基醚衍生物)以形成可降解的交联聚合物。在优选实施方案中,在室温下进行所述反应。可通过本领域已知的任何方式(包括色谱技术)分离反应产物。在优选实施方案中,可通过沉淀然后离心来移除反应产物。
剂量和剂量单位
适用于施用的剂量和施用的具体模式将根据以下因素而变化:如细胞类型或用于体内使用、年龄、体重和具体受体及其待治疗的区域、所使用的具体核酸和递送方法、所涵盖的治疗或诊断用途以及制剂形式(例如悬浮液、乳液、胶束或脂质体),这对于本领域技术人员而言将是显示易见的。通常,在较低水平下施用剂量并增加剂量直到达到所需的效果。
在使用脂质来递送核酸时,施用的脂质化合物的量可改变并且通常取决于所施用的核酸的量。例如,脂质化合物与核酸的重量比优选为约1:1至约30:1,其中更优选为约5:1至约10:1的重量比。
在以短(例如1-5分钟)或长(例如若干小时)时间间隔给予单次剂量或一系列剂量的方案中,核酸分子的合适剂量单位可在每天每千克受体体重约0.001至20-100毫克的范围内、或者在每天每千克体重0.01至20毫克的范围内、或者在每天每千克体重0.01至10毫克的范围内、或者在每天每千克体重0.1至5毫克的范围内、或者在每天每千克体重0.1至2.5毫克的范围内。
在某些实施方案中,在以短(例如1-5分钟)或长(例如若干小时)时间间隔给予单次剂量或一系列剂量的方案中,核酸分子的合适剂量单位可在以下范围内:每天每千克受体体重约0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.0.6mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.0mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg、4.0mg、4.1mg、4.2mg、4.3mg、4.4mg、4.5mg、4.6mg、4.7mg、4.8mg、4.9mg、5.0mg、5.1mg、5.2mg、5.3mg、5.4mg、5.5mg、5.6mg、5.7mg、5.8mg、5.9mg、6.0mg、6.1mg、6.2mg、6.3mg、6.4mg、6.5mg、6.6mg、6.7mg、6.8mg、6.9mg、7.0mg、7.1mg、7.2mg、7.3mg、7.4mg、7.5mg、7.6mg、7.7mg、7.8mg、7.9mg、8.0mg、8.1mg、8.2mg、8.3mg、8.4mg、8.5mg、8.6mg、8.7mg、8.8mg、8.9mg、9.0mg、9.1mg、9.2mg、9.3mg、9.4mg、9.5mg、9.6mg、9.7mg、9.8mg、9.9mg、10.0mg、10.1mg、10.2mg、10.3mg、10.4mg、10.5mg、10.6mg、10.7mg、10.8mg、10.9mg、11.0mg、11.1mg、11.2mg、11.3mg、11.4mg、11.5mg、11.6mg、11.7mg、11.8mg、11.9mg、12.0mg、12.1mg、12.2mg、12.3mg、12.4mg、12.5mg、12.6mg、12.7mg、12.8mg、12.9mg、13.0mg、13.1mg、13.2mg、13.3mg、13.4mg、13.5mg、13.6mg、13.7mg、13.8mg、13.9mg、14.0mg、14.1mg、14.2mg、14.3mg、14.4mg、14.5mg、14.6mg、14.7mg、14.8mg、14.9mg、15.0mg、15.1mg、15.2mg、15.3mg、15.4mg、15.5mg、15.6mg、15.7mg、15.8mg、15.9mg、16.0mg、16.1mg、16.2mg、16.3mg、16.4mg、16.5mg、16.6mg、16.7mg、16.8mg、16.9mg、17.0mg、17.1mg、17.2mg、17.3mg、17.4mg、17.5mg、17.6mg、17.7mg、17.8mg、17.9mg、18.0mg、18.1mg、18.2mg、18.3mg、18.4mg、18.5mg、18.6mg、18.7mg、18.8mg、18.9mg、19.0mg、19.1mg、19.2mg、19.3mg、19.4mg、19.5mg、19.6mg、19.7mg、19.8mg、19.9mg、20.0mg。
可引入合适量的核酸分子并且这些量可使用标准方法凭经验确定。在细胞环境中个别核酸分子物质的有效浓度可为约1飞摩尔浓度(femtomolar)、约50飞摩尔浓度、100飞摩尔浓度、1皮摩尔浓度(picomolar)、1.5皮摩尔浓度、2.5皮摩尔浓度、5皮摩尔浓度、10皮摩尔浓度、25皮摩尔浓度、50皮摩尔浓度、100皮摩尔浓度、500皮摩尔浓度、1纳摩尔浓度(nanomolar)、2.5纳摩尔浓度、5纳摩尔浓度、10纳摩尔浓度、25纳摩尔浓度、50纳摩尔浓度、100纳摩尔浓度、500纳摩尔浓度、1微摩尔浓度、2.5微摩尔浓度、5微摩尔浓度、10微摩尔浓度、100微摩尔浓度或更大。
各治疗剂的剂量可独立地为每kg体重约0.01μg至约1g(例如,每kg体重0.1μg、0.25μg、0.5μg、0.75μg、1μg、2.5μg、5μg、10μg、25μg、50μg、100μg、250μg、500μg、1mg、2.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、250mg或500mg或1g)。
在某些实施方案中,约每天每千克体重约0.1mg至约140mg的剂量水平适用于治疗上文所指示的病状(每天每位受试者约0.5mg至约7g)。可与载剂材料组合以产生单次剂量形式的活性成分的量根据所治疗的宿主和施用的具体模式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg之间的活性成分。
在某些实施方案中,双链RNA化合物按以下剂量水平存在于组合物中:每剂型约0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg、3.0mg、3.1mg、3.2mg、3.3mg、3.4mg、3.5mg、3.6mg、3.7mg、3.8mg、3.9mg、4.0mg、4.1mg、4.2mg、4.3mg、4.4mg、4.5mg、4.6mg、4.7mg、4.8mg、4.9mg、5.0mg、5.1mg、5.2mg、5.3mg、5.4mg、5.5mg、5.6mg、5.7mg、5.8mg、5.9mg、6.0mg、6.1mg、6.2mg、6.3mg、6.4mg、6.5mg、6.6mg、6.7mg、6.8mg、6.9mg、7.0mg、7.1mg、7.2mg、7.3mg、7.4mg、7.5mg、7.6mg、7.7mg、7.8mg、7.9mg、8.0mg、8.1mg、8.2mg、8.3mg、8.4mg、8.5mg、8.6mg、8.7mg、8.8mg、8.9mg、9.0mg、9.1mg、9.2mg、9.3mg、9.4mg、9.5mg、9.6mg、9.7mg、9.8mg、9.9mg或10.0mg。
应理解,用于任何具体受试者的特定剂量水平取决于多种因素,包括使用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、治疗频率、施用路径以及排泄率、药物组合以及正在进行治疗的特定疾病的严重程度。
包括剂量和频率在内的连续治疗方案可通过初始反应和临床判断来指导。
肺部施用路径为优选的,如通过气管内滴注、气雾剂制剂吸入,不过在特定施用中可要求其它路径,如例如施用至鼻、咽喉、支气管组织或肺的黏膜上。还可使用透皮施用路径,包括通过显微操作针或经由超声波或激光施加的能量来驱动递送的主动系统。
本文所公开的治疗组合物优选通过吸入含有组合物/组合的气雾剂、通过鼻内或气管内滴注或通过经由呼吸机(例如用于对无意识的患者进行施用)进行吸入来施用到罹患肺损伤、病症或疾病或经历肺移植的受试者的肺中。在一些实施方案中,本文所公开的寡核苷酸组合物通过吸入来施用到已经历肺移植的受试者的肺中。关于药物组合物的肺部递送的其它信息,参见Weiss等,Human Gene Therapy1999.10:2287-2293;Densmore等,Molecular therapy1999.1:180-188;Gautam等,Molecular Therapy2001.3:551-556;以及Shahiwala和Misra,AAPS PharmSciTech2004.24;6(3):E482-6。此外,dsRNA的呼吸制剂描述在美国专利申请公布号2004/0063654中。dsRNA的呼吸制剂描述在美国专利申请公布号2004/0063654中。本发明的受让人之一的并以引用的方式整体并入本文的国际专利公布号WO2008/132723公布了用于将dsRNA递送到呼吸系统的治疗性递送。
各治疗剂的剂量是独立地确定。
包含本文所公开的核酸分子的药物组合物可每天一次(q.d.)、每天两次(b.i.d.)、每天三次(t.i.d.)、每天四次(q.i.d.)或以任意时间间隔施用并持续在医学上适当的任意一段持续时间。然而,所述治疗剂还可以按剂量单位给药,所述剂量单位含有在全天内以适当时间间隔施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量。在这种情况下,在各亚剂量中所含的核酸分子可相对较少以便达到总的每日剂量单位。所述剂量单位还可以混配用作若干天内的单次剂量,例如使用药物递送泵;或使用在若干天时间内提供dsRNA的持续并一致的释放的常规缓释制剂。缓释制剂在本领域已众所周知。所述剂量单位可含有相应的多个每日剂量。组合物可以使得多个单位的核酸一起的总和含有足够剂量的方式混配。
药物组合物、试剂盒和容器
本文提供了包含靶向、减少、下调或抑制基因TLR2的表达/活性/功能的至少一种治疗剂(例如,小有机分子化合物;蛋白质、抗体、肽、肽模拟物以及核酸分子)的组合物、试剂盒、容器和制剂以用于施用给患者。
本文还提供了包含至少两种治疗剂(例如,小有机分子化合物;蛋白质、抗体、肽、肽模拟物以及核酸分子)的组合物、试剂盒、容器和制剂以用于施用给患者,其中至少一种治疗剂靶向、减少、下调或抑制基因TLR2的表达/活性/功能并且至少一种治疗剂靶向、减少、下调或抑制基因TLR4的表达/活性/功能。
试剂盒可包含至少一个容器和至少一个标签。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。所述容器可由多种材料如玻璃、金属或塑料形成。所述容器可容纳氨基酸、小分子、核酸、蛋白质、肽、肽模拟物、细胞群和/或抗体。在一个实施方案中,所述容器容纳有效治疗、诊断、预测或预防本文所述的病状的组合物并可具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂可为能够特异性结合TLR2和/或调节TLR2功能的核酸分子。组合物中的活性剂可为能够特异性结合TLR4和/或调节TLR4功能的核酸分子。组合物中的活性剂可为能够特异性结合TLR2和TLR4和/或调节TLR2和TLR4功能的核酸分子。
试剂盒可进一步包含相关指示和/或指导;出于如本文所述的目的来使用的试剂和其它组合物或工具。
试剂盒可进一步包含第二容器,所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂,如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)和/或右旋糖溶液。它可进一步包含从商业或使用者立场来看合乎需要的其它材料,包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、搅拌器、针、注射器和/或具有关于使用的指示和/或说明书的包装插页。
治疗剂在使用之前包装于其中的单位剂量安瓿或多剂量容器可包括装入适合于药学有效剂量或多个有效剂量的量的治疗剂或含有治疗剂的溶液的密封容器。治疗剂以无菌制剂形式包装并且密封封住的容器被设计成保持制剂无菌直到使用。
可贴标签于其中包装了治疗剂分子的容器,并且所述标签可具有政府机构(例如食品和药品管理局)所规定的形式的告示,所述告示说明在联邦法律下的所述机构批准了其中用于人施用的治疗材料的制造、使用或销售。
联邦法律规定药物组合物在人的疗法中的使用应获得联邦政府机构的批准。在美国,强制执行是食品和药品管理局的责任,所述机构颁布了用于保护这种批准的适当法规,详见21U.S.C.§301-392。在42U.S.C.§262下提供了生物材料的法规,所述生物材料包括由动物组织所制成的产品。大多数国家要求相似的批准。法规随着国家不同而变化,但是个别程序对于本领域技术人员而言已熟知,并且因此本文所提供的组合物和方法优选遵循。
因此,本文提供了一种药物产品,其可包含作为于药学上可接受的可注射载剂中的溶液且适合用于施用给患者的核酸分子的组合以及与容器相关的呈由规范药物的制造、使用和销售的政府机构所规定的形式的告示,所述告示说明所述机构批准了包含用于人施用的核酸的溶液的制造、使用或销售。本文所公开的组合物、试剂盒和方法可包括包装本文所公开的核酸分子,其包含标签或包装插页。所述标签可包含关于核酸分子的使用的指示,如用于治疗或预防人的肺病症或损伤,包括治疗急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、肺气肿、肺移植之后的闭塞性细支气管炎和肺移植诱发的急性移植物功能障碍、以及与单独或与其它疗法组合来下调细胞或组织中的TLR2表达有关或将对该下调有反应;或者与单独或与其它疗法组合来下调TLR2和TLR4表达有关或对该下调有反应的任何其它疾病或病状。标签可包含用于减少TLR2基因的表达的指示。标签可包含用于减少TLR2基因和TLR4基因的表达的指示。“包装插页”是用于表示通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书,其包含关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、待与包装的产品组合的其它治疗产品和/或涉及使用这些治疗产品的提醒等信息。
本领域技术人员将认识到本领域已知的其它肺病症/损伤的治疗、药物和疗法可轻易地与本文所公开的治疗组合来组合并因此涵盖在本文中。
现在将通过参考以下非限制性实施例来更加详细地描述本文所提供的方法和组合物。
实施例
实施例1:产生针对TLR2和TLR4基因的活性dsRNA化合物
的序列和制造dsRNA化合物
使用专有算法和本文所公开的基因的已知序列,产生dsRNA化合物的反义和相应有义序列。除算法之外,通过19-聚体序列的5’和/或3’延长来产生20-、21-、22-和23-聚体寡聚物序列。已使用这种方法产生的序列与相应mRNA序列的区段完全互补。
SEQ ID号5-12、136提供了适用于制备本文所公开的dsRNA化合物的寡核苷酸序列。各序列以5’至3’方向提供。
对于各基因,19-聚体有义和相应反义寡核苷酸序列存在单独的列表,所述序列基于它们在专有算法中的分数而优先作为用于靶向人基因表达的最好序列。
通过本文以下所述的任何方法合成本文所公开的siRNA化合物。
实施例2:评价靶向TLR2和TLR4基因的dsRNA化合物的抑
制活性
通过将dsRNA化合物转染到人HeLa或人PC3细胞中来体外评估dsRNA化合物的抑制活性。
制备用于dsRNA转染的细胞
如Czauderna等(NAR,2003.31:670-82)所述培养HeLa细胞(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))。
在6孔板的各孔中,于2mL生长培养基中孵育1X105个人HeLa细胞(ATCC,目录号CCL-2)以便一天后达到30%-50%汇合。然后在37±1℃、5%CO2孵育器中孵育细胞24小时。接种之后的第一天,用每孔1.5mL新鲜生长培养基替换细胞培养基。
dsRNA转染
孵育之后,使用最终浓度范围在0.0035nM至100nM之间(在细胞培养孔中的最终dsRNA浓度)的LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)来以dsRNA化合物转染细胞。然后在37±1℃、5%CO2孵育器中孵育细胞48小时。
对于转染效率的测定,类似地用靶向DDIT4基因转录物的Cy3标记的dsRNA的20nM溶液转染细胞。
作为阴性对照,类似地用最终浓度为40和100nM的加扰序列dsRNA(CNL_1)转染细胞。
用于实时qPCR(qPCR)的RNA制备
在转染后48h时,收获细胞并从使用EZ-RNA试剂盒[BiologicalIndustries(#20-410-100)]分离的细胞中提取RNA。
通过荧光显微镜检查测试转染效率。
在体外测定抑制活性
使用qPCR分析测定使用本文所公开的特异性dsRNA化合物下调基因表达的百分比。使用由dsRNA转染的细胞样本各自所制备的RNA作为模板测定靶基因mRNA的相对量。基于dsRNA处理的样本与非转染的对照样本中的靶基因mRNA量的比率来测定dsRNA活性。
如所述在体外测试本文所公开的化学修饰的dsRNA化合物并且所述化合物显示下调靶基因的表达。
实施例3:dsRNA化合物的稳定性
在人血清和/或支气管肺泡灌洗液(BALF)中测试本文所公开的dsRNA化合物的核酸酶抗性。
对于稳定性测试,在人血清或支气管肺泡灌洗液(BALF)中稀释dsRNA化合物至所要求的最终浓度(例如7μM)。将5μL等分试样转移至15μL的1.5xTBE加样缓冲液中,立即在液氮中冷冻并转移至-20℃下。这代表“时间点0”。将余下的dsRNA溶液分成5μL等分试样,在37℃下将其孵育30min、1h、6h、8h、10h、16h或24h。
孵育之后,将dsRNA化合物样本转移到15μL的1.5xTBE加样缓冲液中。将加样缓冲液样本中的5μL的各dsRNA化合物装载到非变性20%聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳。将阳性对照双链迁移参考(不相关的、19个碱基对的、平端的、具有相似化学修饰的双链RNA)和单链迁移参考(不相关的具有化学修饰的ssRNA)以及时间点0样本装载到同一凝胶上并进行平行电泳。
对于dsRNA观测,将所述凝胶用溴化乙锭溶液(1.0μg/μL)染色。
通过检测dsRNA样本在PAGE上的迁移型态、随后在人血清和/或支气管肺泡灌洗液(BALF)中进行孵育来测定本文所公开的dsRNA化合物的稳定性。
实施例4:dsRNA在正位血管化充气肺移植的小鼠模型中的功
效
在同基因和同种异基因小鼠的肺移植正位模型中测试本文所述的dsRNA化合物在预防由长期冷缺血和免疫排斥两者所引起的原发性移植物功能障碍方面的治疗功效。在小鼠中正位血管化充气左肺移植的方法利用了肺动脉、肺静脉和支气管吻合的套管技术。此方法已在若干出版物中报道(Okazaki等,Am J Transplant,2007;7:1672-9和Krupnick等Nature Protocols,2009;第4卷第1期:86-93)。
dsRNA测试化合物
在同基因小鼠的肺移植正位模型中测试靶向TLR4的一种dsRNA化合物(指定为TLR4_4_S500)和靶向TLR2的两种dsRNA化合物(指定为TLR2_7_S73和TLR2_4_S73)。在同种异基因小鼠的肺移植正位模型中测试靶向TLR4的一种dsRNA化合物(指定为TLR4_4_S500)和靶向TLR2的一种dsRNA化合物(指定为TLR2_4_S73)。在这些实验中,将针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的dsRNA化合物(指定为EGFP_5_S763)和/或媒介物(磷酸盐缓冲溶液(PBS))用作阴性对照。
表1列出了在同基因和同种异基因小鼠的肺移植正位模型中测试的dsRNA化合物。
表1
DsRNA化合物 | 靶基因 |
TLR4_4_S500 | TLR4,Toll样受体4 |
TLR2_7_S73 | TLR2,Toll样受体2 |
TLR2_4_S73 | TLR2,Toll样受体2 |
EGFP_5_S763 | EGFP,增强型绿色荧光蛋白 |
表2提供了在同基因和同种异基因小鼠的肺移植正位模型中测试的dsRNA化合物的有义链和反义链序列。表2进一步提供了交叉物种数据。
表2
表3提供了在同基因和同种异基因小鼠的肺移植正位模型中测试的dsRNA化合物的有义链和反义链修饰型态。
表3
剂量和施用
在肺移植手术结束时(吻合开口之后立即)通过气管内滴注对所述受体施用dsRNA化合物。在这些动物模型中测试以下剂量的个别dsRNA化合物:6μg/小鼠、12.5μg/小鼠、25μg/小鼠以及50μg/小鼠。
小鼠同基因肺移植(C57Bl/6->C57Bl/6)
实验设计
供体和受体两者皆为C57BL/6小鼠。移植之前,通过经由在具有与用于保存人肺移植物的溶液相似的组分的低右旋糖溶液中冷藏18小时(18小时的冷缺血时间(CIT))来对肺移植物进行长期冷保存以诱导缺血再灌注损伤。此方法诱发了与移植后24小时的原发性移植物功能障碍一致的症状。再灌注后的5至10分钟内,将25μg/小鼠(或如本文所述的不同剂量)的对对照siRNA、TLR2、TLR4或者TLR2和TLR4两者具有特异性的siRNA施用到气管内。肺损伤后24小时评估肺受体。
施用
通过对肺气管内滴注dsRNA溶液;在第0天在吻合开口后立即施用1剂dsRNA化合物或dsRNA化合物的组合。
评价
在移植后24小时通过评估肺功能来评价肺受体,如通过以下来测量:
·总体病理学–肺水肿的外观;
·在移植之后的肺中的肺功能–PaO2,左肺动脉中的动脉血的氧合作用;
·细胞浸润物的气道内积累;以及
·支气管肺泡灌洗(BAL)细胞的总数和分类计数
结果
在此同基因模型中,暴露于长期冷缺血(18小时CIT)的小鼠同系移植物发生了如移植后24小时所测量到的氧合作用降低、肺水肿、炎症性细胞免疫因子产生增加以及移植物内和气道内粒细胞积累。与此相反,1小时冷保存的移植物(1小时CIT)的小鼠肺受体在移植后24小时几乎没有肺损伤的迹象。
相比于其它处理组和阴性对照动物(用媒介物或用对EGFP具有特异性的dsRNA处理),用对TLR2具有特异性的dsRNA抑或用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA两者的组合处理的肺受体具有显著更好的效果和显著较少的BAL细胞浸润物。
图1(N=5/组的代表性图片)示出25μg/小鼠剂量下的对TLR2具有特异性的dsRNA(即TLR2_4_S73)和25μg/小鼠剂量下的对TLR4具有特异性的dsRNA(即TLR4_4_S500)的组合施用有效减轻了此小鼠肺移植模型的肺水肿。在用TLR2的dsRNA和TLR4的dsRNA的组合处理的任何肺中没有观察到明显水肿。使用TLR2_7_S73和TLR4_4_S500(其中各自25μg/小鼠的剂量)的组合获得相似的结果。使用12.5μg/小鼠剂量的各TLR2dsRNA化合物和TLR4dsRNA化合物(TLR2_7_S73和TLR4_4_S500)获得相似的结果,而在用媒介物或用靶向EGFP的dsRNA处理的动物中出现明显水肿)。
图2示出在用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合处理的小鼠中、以及在用对TLR2具有特异性的单一dsRNA处理的小鼠中,移植后24小时所测量的受损的受体肺功能得到恢复,但是在使用针对TLR4的单一dsRNA处理的小鼠中没有恢复。
在这些实验中以1:1的比率测试对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的两个组合:
(ii)25μg/小鼠的各TLR2_7_S73和TLR4_4_S500的组合,总治疗量:50μg/小鼠;以及
(iii)25μg/小鼠的各TLR2_4_S73和TLR4_4_S500的组合,总治疗量:50μg/小鼠;以及
用对TLR2具有特异性的个别dsRNA抑或用对TLR4具有特异性的个别dsRNA测试另外的动物组。
在实验中测试对TLR2具有特异性的两种dsRNA:25μg/小鼠剂量下的TLR2_4_S73和25μg/小鼠和50μg/小鼠剂量下的TLR2_7_S73。
在实验中测试对TLR4具有特异性的一种dsRNA:在25μg/小鼠和50μg/小鼠剂量下的TLR4_4_S500。
用媒介物处理阴性对照动物。
在打开吻合口并开始再灌注之后立即施用测试物品(组合物包含dsRNA TLR2和TLR4dsRNA的组合;对TLR2具有特异性的dsRNA;对TLR4具有特异性的dsRNA;或媒介物)。
图2示出施用dsRNA化合物各自25μg/小鼠剂量下的双靶dsRNA组合物(包含TLR2_7_S73和TLR4_4_S500(N=5)或TLR2_4_S73和TLR4_4_S500(N=3))显著保留了肺功能,使血氧合作用保持在几乎正常的水平(PaO2=500-530mm Hg)下。
施用个别dsRNA化合物25μg/小鼠剂量下的特异性靶向TLR2的单一dsRNA化合物(TLR2_7_S73(N=3)或TLR2_4_S73(N=5))也显著有效保留肺功能,使血氧合作用保持在与1小时CIT对照组获得的水平相似的水平下。用更高剂量(50μg/小鼠)的特异性靶向TLR2的单一dsRNA化合物(TLR2_7_S73;(N=5))获得相似的结果。
显著地,用靶向TLR2基因不同区域的两种不同dsRNA TLR2化合物(TLR2_7_S73和TLR2_4_S73)获得相似的结果。
在25μg/小鼠(N=2)或50μg/小鼠(N=3)剂量下施用特异性靶向TLR4的单一dsRNA化合物(TLR4_4_S500)对保留肺功能无效,使血氧合作用保持在与媒介物对照组获得的水平相似的水平下。
图3示出在用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(在图3中标识为“siRNA混合液”)处理的小鼠中,肺移植之后24小时时测量的受损的受体肺功能得到恢复。在这些实验中使用1:1的比率的TLR2_7_S73和TLR4_4_S500的组合。
测试以下三种剂量:
(i)25μg/小鼠的各TLR2_7_S73和TLR4_4_S500的组合,总治疗量:50μg/小鼠;
(ii)12.5μg/小鼠的各TLR2_7_S73和TLR4_4_S500的组合,总治疗量:25μg/小鼠;以及
(iii)6μg/小鼠的各TLR2_7_S73和TLR4_4_S500的组合,总治疗量:12μg/小鼠
用媒介物或用50μg/小鼠、25μg/小鼠或12.5μg/小鼠剂量的对EGFP具有特异性的dsRNA(EGFP_5_S763)处理阴性对照动物。
在打开吻合口并开始再灌注之后立即施用测试物品(组合物包含TLR2dsRNA和TLR4dsRNA的组合;或媒介物;或对EGFP具有特异性的dsRNA(在图3中标识为“对照siRNA”))。
图3示出1h冷移植物保存后的肺移植之后(再灌注对照),肺功能仅轻微恶化(PaO2=363±31mm Hg),然而,冷保存时间的延长(18hCIT)导致受体的肺功能显著降低(对于媒介物组PaO2=170±13mmHg),指示严重的PGD(3级;ISHLT定义)。施用各dsRNA化合物25μg/小鼠剂量的双靶siRNA组合物(包含TLR2_7_S73和TLR4_4_S500)显著(P<0.005)保留了肺功能(PaO2=435±64),使血氧合作用保持在几乎正常的水平(PaO2=500-530mm Hg)。施用相同剂量的非靶向对照dsRNA(50μg/小鼠剂量的EGFP_5_S763)未改善肺功能。
施用各dsRNA化合物12.5μg/小鼠剂量的双靶dsRNA组合物(包含TLR2_7_S73和TLR4_4_S500)也显著有效(P<0.05)保留肺功能,使血氧合作用保持在与1小时CIT对照组获得的水平相似的水平。施用相同剂量的非靶向对照dsRNA(25μg/小鼠剂量的EGFP_5_S763)未改善肺功能。
施用各dsRNA化合物6μg/小鼠剂量的双靶dsRNA组合物(包含TLR2_7_S73和TLR4_4_S500)对保留肺功能无效,使血氧合作用保持在与用未改善肺功能的媒介物和非靶向对照dsRNA(50μg/小鼠、25μg/小鼠和12.5μg/小鼠剂量的EGFP_5_S763)获得的水平相似的水平。
图4示出对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500)、以及包含对TLR2具有特异性的dsRNA(TLR2_4_S73)的个别处理减少了粒细胞的气道内积累。PGD的病理生理学特征之一为细胞浸润物快速流入到间质性肺空腔,这通常在患者的胸片中检测到。与此一致的是,经受18hCIT后肺移植的小鼠(媒介物组)中的总支气管肺泡灌洗(BAL)细胞计数显著(P<0.01)高于经受1h CIT后肺移植的小鼠中的那些计数(分别为24±6与9±4个细胞x10^5/肺)(N=2)。用各dsRNA化合物25μg/小鼠剂量的对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500;(N=5))的组合进行处理以及包含50μg/小鼠(N=2)剂量或25μg/小鼠(N=5)剂量的对TLR2具有特异性的dsRNA(TLR2_4_S73)的个别处理减少了与长期冷保存相关的细胞BAL浸润。此外,用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合进行处理以及包含对TLR2具有特异性的dsRNA的个别处理减少了肺气道中的粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)积累。
施用50μg/小鼠(N=2)剂量的特异性靶向TLR4的单一dsRNA化合物(TLR4_4_S500)对减少气道内的粒细胞积累无效,使气道内粒细胞积累保持在与使用媒介物和50μg/小鼠(N=2)、25μg/小鼠(N=5)或12.5μg/小鼠(N=5)剂量的非靶向对照dsRNA(EGFP_5_S763)所获得的水平相似的水平。
小鼠同种异基因肺移植((Balb/C->C57Bl/6)
实验设计
在此模型中,长期冷缺血防止了由免疫抑制所介导的肺同种异体移植物接受。在此模型中,Balb/c肺经受了18小时的冷缺血时间(CIT)并被移植到用以下免疫抑制剂处理的C57Bl/6受体中:在手术后第0天用抗CD40L和在第2天用CTLA4Ig。与接受储存1小时的同种异体移植物的受体相反,储存18小时的那些受体强烈排斥其同种异体移植物,其中IFNγ+CD8+T细胞发生显著的移植物内积累。
评价
移植后7天内通过评估以下方面来评价肺受体:
·移植物内IFNγ+CD8+T细胞的丰度(通过FACS测定)
·急性移植物排斥的组织病理学信号,A分数
施用
通过对肺进行气管内滴注dsRNA溶液;在吻合开口后第0天立即和肺移植后第1天施用2剂dsRNA化合物或dsRNA化合物的组合。
结果
施用各dsRNA化合物25μg/小鼠(N=5)剂量的对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500,标识为“siRNA混合液”)或者25μg/小鼠(N=4)剂量的对TLR2具有特异性的单一dsRNA(TLR2_4_S73)减小了同种异体移植中的移植物内IFNγ+CD8+T细胞的丰度。在此同种异基因模型中,在长期冷缺血中防止了由免疫抑制所介导的肺同种异体移植物接受。在此模型中,Balb/c肺经受了18小时(18CIT)的冷缺血并被移植到在手术后(POD)第0天用抗CD40L且在POD第2天用CTLA4Ig处理的C57BL/6(B6)受体中。这两种免疫抑制试剂目前处于由大多数制药公司进行的临床前开发中并且当一起使用时,通常是指双倍共刺激阻断治疗(DCB)。与接受储存1小时(1CIT)(N=6-)的同种异体移植物的受体相反,18CIT Balb/c->DCB+B6肺受体(N=6)强烈排斥其同种异体移植物,其中IFNγ+CD8+T发生显著移植物内积累(图5A,上部)。通过组织病理学评价此排斥也是明显的(图6A、图6B)。
在此模型中,对照dsRNA(EGFP_5_S763)处理的肺受体(N=3)强烈排斥其同种异体移植物,其中在同种异体移植物组织中具有显著提高的IFNγ+CD8+T细胞积累。与此相反,在第0天和第1天用对TLR2具有特异性的dsRNA和对TLR4具有特异性的dsRNA的组合(TLR2_4_S73和TLR4_4_S500,确定为“siRNA混合液”;(N=5))处理的受体小鼠具有显著降低的移植物内IFNγ+CD8+T细胞丰度(图5A、图5B)以及显著更少的组织学急性排斥迹象(图6A、图6B)。
这些实验显示使用对TLR2具有特异性的dsRNA化合物或对TLR2和TLR4具有特异性的dsRNA化合物的组合来靶向TLR功能显著改善/防止了肺移植物损伤。在TLR2或TLR2-dsRNA和TLR4-dsRNA处理的受体中的肺功能与1小时冷保存的移植物的肺受体相似,说明此方法可适用于预防/治疗肺移植物受体中的原发性移植物功能障碍。这些实验程序和dsRNA治疗可在主要组织相容性复合体(MHC)-失调的供体和受体中进行。
实施例5:dsRNA寡核苷酸有义和反义对
序列表提供了用于产生适用于进行本文所公开的方法的双链寡核苷酸化合物的有义和反义寡核苷酸。
在SEQ ID NO:5-722;1441-2246;3053-4152;以及5253-5545中所列出的有义链序列中和在SEQ ID NO:723-1440;2247-3052;4153-5252以及5546-5838中所列出的反义链序列中提供了TLR2双链寡核苷酸的有义链和反义链。
在SEQ ID NO:5839-7075、8313-8458、8605-10318、12033-12084中所列出的有义链序列和在SEQ ID NO:7076-8312、8459-8604、10319-12032、12085-12136中所列出的反义链序列中提供了TLR4双链寡核苷酸的有义链和反义链。
本文所提及或引用的文章、专利、和专利申请、以及所有其它文献和电子版可用信息的内容以引用的方式整体并入本文,其程度犹如明确地并单独地指出将各个别出版物以引用的方式并入本文一般。
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对于本领域技术人员将显而易见的是,根据本文所公开的发明可在不背离本发明的范围和精神的情况下作出不同的替代和修改。因此,这些另外的实施方案处于本发明和所附权利要求的范围内。本公开内容教授了本领域技术人员测试对于产生对治疗哺乳动物的肺病症或损伤具有提高的活性的治疗组合的不同组合。这种提高的活性可包括例如提高的稳定性、提高的生物利用度、介导RNAi的细胞反应的活化提高。因此,本文所述的具体实施方案为非限制性的并且本领域技术人员可轻易了解到可无需针对确认治疗组合具有增加的活性进行过度实验的情况下测试另外的特定组合。
本文说明性描述的本发明可在不存在本文未具体公开的任意一个或多个要素、一个或多个限制的情况下进行适当的实践。因此,例如在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中),术语“一个(种)(a/an)”以及“所述(the)”以及相似指示语欲解释为覆盖单数和复数两者,除非本文另外指示或者上下文明显矛盾。术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”、“含有(containing)”等应广泛解读并且没有限制(例如,意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明,否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地表示属于所述范围的各单独值的速记方法,并且犹如本文分别描述过地那样将各单独值并入到说明书中。可按任意合适顺序进行本文所述的全部方法,除非本文另外指明或上下文明显矛盾。本文所提供的任何以及全部实施例或示例性语言(例如,“如”)的使用仅意图更好地说明本发明并且除非另外要求,否则不会对本发明的范围施加限制。说明书中的语言不应解释为表明任何未要求保护的要素对实施本发明必不可少。另外,本文所采用的术语和表述已用作描述性术语而非限制性术语,并且没有意图使用这些术语和表述来排除所示或所述的特征的任何等同物或其部分,但认识到在所要求的本发明的范围内的各种修改是可能的。因此,应理解,尽管本发明已由优选实施方案和任选特征来具体公开,但是本领域技术人员可采用本文所公开、在其中所呈现的本发明的修改和变化,并且可认为这些修改和变化处于本发明的范围内。
本发明已在本文中进行了广泛性和一般性的描述。属于一般性公开内容的各较窄种类和亚属分组也形成本发明的一部分。这包括具有附带条件或否定限制的本发明的一般性描述,以从类属中移除任何主题而不管删除的材料在本文中是否进行了具体叙述。其它实施方案处于以下权利要求中。此外,根据Markush组描述了本发明的特征或方面,本领域技术人员将认识到本发明还因此根据Markush组的任何个别成分或成分亚组进行了描述。
Claims (169)
1.一种预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法,其包括对所述受体施用治疗有效量的至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药以及治疗有效量的至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药,由此预防或减轻所述受体的PGD的所述症状。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述肺移植的所述受体为具有发展原发性移植物功能障碍(PGD)的风险或者正在治疗原发性移植物功能障碍的人。
3.如权利要求1所述的方法,其用于预防或减轻冷缺血相关的PGD的所述症状。
4.如权利要求1所述的方法,其用于预防或减轻热缺血相关的PGD的所述症状。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述症状选自由以下组成的组:炎症、急性移植物排斥、移植物排斥、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、肺功能受损、闭塞性细支气管炎、血氧合作用受损、炎症性细胞因子的产生增加、移植物内和气道内粒细胞积累、肺水肿以及血氧不足。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用使得所述受体的肺水肿减轻。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用使得所述受体的血氧合作用增加。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用使得所述受体的血氧合作用得到保持。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用使得所述受体的肺功能改善。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用使得所述受体的肺功能得到保持。
11.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药、以及所述至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用使得所述移植的肺的肺功能改善。
12.如权利要求1所述的方法,其中在肺移植之前、期间或之后对肺移植的所述受体施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
13.如权利要求12所述的方法,其中在肺移植之前对肺移植的所述受体施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
14.如权利要求12所述的方法,其中在肺移植期间对肺移植的所述受体施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
15.如权利要求12所述的方法,其中在肺移植之后对肺移植的所述受体施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
16.如权利要求1所述的方法,其中在同一制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
17.如权利要求1所述的方法,其中在不同制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
18.如权利要求1所述的方法,其中通过相同途径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
19.如权利要求1所述的方法,其中通过不同途径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
20.如权利要求1所述的方法,其中对所述受体的所述施用是同时的。
21.如权利要求1所述的方法,其中对所述受体的所述施用是连续的。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法,其进一步包括选自由以下组成的组的至少一种另外的治疗:手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法、营养补充剂及其任意组合。
23.如权利要求22所述的方法,其中在施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂之前、之后或同时施用所述另外的治疗。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述另外的治疗包括免疫抑制剂疗法。
25.如权利要求1所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括全身性施用或局部施用。
26.如权利要求25所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括全身性施用。
27.如权利要求25所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括局部施用。
28.如权利要求25所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括选自以下的方法:静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、直接注射、气管内滴注、吸入、鼻内、肺部以及经由泵施用到肺中。
29.如权利要求28所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括吸入。
30.如权利要求28所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括气管内滴注。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法,其中各抑制剂独立地选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。
32.如权利要求31所述的方法,其中至少一种抑制剂包括核酸分子。
33.如权利要求32所述的方法,其中各抑制剂包括核酸分子。
34.如权利要求33所述的方法,其中第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
35.如权利要求34所述的方法,其中所述双链寡核苷酸一个接另一个地串联地连接或形成RNAistar时退火。
36.如权利要求34所述的方法,其中所述第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;并且
其中所述第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
37.如权利要求36所述的方法,其中在同一制剂中对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
38.如权利要求36所述的方法,其中在不同制剂中对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
39.如权利要求36所述的方法,其中通过相同途径对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
40.如权利要求36所述的方法,其中通过不同途径对所述受体联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
41.如权利要求36所述的方法,其中对所述受体的所述施用是同时的。
42.如权利要求36所述的方法,其中对所述受体的所述施用是连续的。
43.如权利要求36所述的方法,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体施用一次。
44.如权利要求36所述的方法,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体施用至少一天一次。
45.如权利要求36所述的方法,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体施用多次。
46.如权利要求34所述的方法,其中至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则各自独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
47.如权利要求34或46所述的方法,其中TLR2的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出并且其中TLR4的mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
48.如权利要求46所述的方法,其中(N)x包含选自由具有SEQID NO:723-1440、2247-3052、7076-8312和8459-8604的寡核苷酸组成的组的反义寡核苷酸并且其中(N’)y包含选自由具有SEQ ID NO:5-722、1441-2246、5839-7075以及8313-8458的寡核苷酸组成的组的互补有义链寡核苷酸。
49.如权利要求34或46所述的方法,其中施用结合编码TLR2基因的核苷酸序列的所述至少一种双链寡核苷酸和结合编码TLR4基因的核苷酸序列的所述至少一种双链寡核苷酸分别引起TLR2表达和TLR4表达的下调。
50.如权利要求46至48中任一项所述的方法,其中x=y=19。
51.如权利要求34所述的方法,其中至少一种双链化合物独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补并且其中(N)x与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的所述mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
52.如权利要求51所述的方法,其中x=y=18。
53.如权利要求51或52所述的方法,其中(N)x的所述序列包含选自由具有SEQ ID NO:4153-5252、5546-5838、10319-12032和12085-12136的寡核苷酸组成的组的反义链寡核苷酸。
54.如权利要求53所述的方法,其中(N’)y的所述序列包含选自由具有SEQ ID NO:3053-4152、5253-5545、8605-10318和12033-12084的寡核苷酸组成的组的有义链寡核苷酸。
55.一种用于治疗有需要的患者的肺病症、疾病或损伤的方法,其包括对所述患者施用至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药和至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的治疗有效组合,由此治疗所述患者的所述肺病症、疾病或损伤。
56.如权利要求55所述的方法,其中所述肺病症、疾病或损伤选自急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、与肺移植相关的病症以及肺气肿。
57.如权利要求56所述的方法,其中所述肺病症、疾病或损伤是与肺移植相关的病症。
58.如权利要求57所述的方法,其中与肺移植相关的所述肺病症选自由以下组成的组:炎症、移植物排斥、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、急性移植物功能障碍、肺再移植反应、闭塞性细支气管炎以及原发性移植物功能障碍(PGD)。
59.如权利要求58所述的方法,其中与肺移植相关的所述肺病症为PGD。
60.如权利要求55至59中任一项所述的方法,其中在同一制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
61.如权利要求55至59中任一项所述的方法,其中在不同制剂中对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
62.如权利要求55至59中任一项所述的方法,其中通过相同路径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
63.如权利要求55至59中任一项所述的方法,其中通过不同路径对所述受体联合施用所述至少一种TLR2抑制剂和所述至少一种TLR4抑制剂。
64.如权利要求55至59中任一项所述的方法,其中对所述受体的所述施用是同时的。
65.如权利要求55至59中任一项所述的方法,其中对所述受体的所述施用是连续的。
66.如权利要求55至65中任一项所述的方法,其进一步包括选自由以下组成的组的至少一种另外的治疗:手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法、营养补充剂及其任意组合。
67.如权利要求66所述的方法,其中在施用至少一种TLR2抑制剂和至少一种TLR4抑制剂之前、之后或同时施用所述另外的治疗。
68.如权利要求67所述的方法,其中所述另外的治疗包括免疫抑制剂疗法。
69.如权利要求55至65中任一项所述的方法,其中对所述患者的所述施用包括全身性施用或局部施用。
70.如权利要求69所述的方法,其中对所述患者的所述施用包括全身性施用。
71.如权利要求69所述的方法,其中对所述患者的所述施用包括局部施用。
72.如权利要求69所述的方法,其中对所述患者的所述施用包括选自以下的方法:静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、直接注射、气管内滴注、吸入、鼻内、肺部以及经由泵施用到肺中。
73.如权利要求72所述的方法,其中对所述患者的所述施用包括吸入。
74.如权利要求72所述的方法,其中对所述患者的所述施用包括气管内滴注。
75.如权利要求55所述的方法,其中各抑制剂独立选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。
76.如权利要求75所述的方法,其中至少一种抑制剂包含核酸分子。
77.如权利要求76所述的方法,其中各抑制剂包含核酸分子。
78.如权利要求77所述的方法,其中第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
79.如权利要求77所述的方法,其中所述双链寡核苷酸一个接另一个地串联地连接或形成RNAistar时退火。
80.如权利要求78所述的方法,其中所述第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;并且
其中所述第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
81.如权利要求80所述的方法,其中在同一制剂中对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
82.如权利要求80所述的方法,其中在不同制剂中对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
83.如权利要求80所述的方法,其中通过相同途径对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
84.如权利要求80所述的方法,其中通过不同途径对所述患者联合施用所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸。
85.如权利要求80所述的方法,其中对所述患者的所述施用是同时的。
86.如权利要求80所述的方法,其中对所述患者的所述施用是连续的。
87.如权利要求80所述的方法,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次。
88.如权利要求80所述的方法,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用至少一天一次。
89.如权利要求80所述的方法,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用多次。
90.如权利要求78所述的方法,其中至少一种双链寡核苷酸包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
91.如权利要求78或90所述的方法,其中TLR2的所述mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出,并且其中TLR4的所述mRNA多核苷酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中的任一个中列出。
92.如权利要求90所述的方法,其中(N)x包含选自由具有SEQID NO:723-1440、2247-3052、7076-8312和8459-8604的寡核苷酸组成的组的反义寡核苷酸并且其中(N’)y包含选自由具有SEQ ID NO:5-722、1441-2246、5839-7075以及8313-8458的寡核苷酸组成的组的有义链寡核苷酸。
93.如权利要求90至92中任一项所述的方法,其中x=y=19。
94.如权利要求78所述的方法,其中至少一种双链化合物包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补并且其中(N)x与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的所述mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
95.如权利要求94所述的方法,其中x=y=18。
96.如权利要求94或95所述的方法,其中(N)x的所述序列包含选自由具有SEQ ID NO:4153-5252、5546-5838、10319-12032以及12085-12136的寡核苷酸组成的组的反义寡核苷酸并且其中(N’)y的所述序列包含选自由具有SEQ ID NO:3053-4152、5253-5545、8605-10318以及12033-12084的寡核苷酸组成的组的有义寡核苷酸。
97.一种组合物,其包含至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药和至少一种TLR4抑制剂或其药学上可接受的盐或前药;以及药学上可接受的载剂。
98.如权利要求97所述的组合物,其中各抑制剂独立选自由以下组成的组:小有机分子;蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。
99.如权利要求98所述的组合物,其中各抑制剂独立选自由以下组成的组:小有机分子;蛋白质;抗体或其片段;以及核酸分子。
100.如权利要求99所述的组合物,其中各抑制剂包含核酸分子。
101.如权利要求100所述的组合物,其中第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
102.如权利要求101所述的组合物,其中所述核酸分子串联地连接或形成RNAistar时退火。
103.如权利要求101所述的组合物,其中第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;并且
其中第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
104.如权利要求103所述的组合物,其中在所述组合物中各双链寡核苷酸的量的范围独立地为约0.05mg至约10.0mg。
105.如权利要求101所述的组合物,其中至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
106.如权利要求101所述的组合物,其中至少一种双链寡核苷酸化合物独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’(反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’(有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
107.如权利要求102至106中任一项所述的组合物,其中配制所述双链寡核苷酸以用于施用一次、至少一天一次或用于施用多次。
108.一种试剂盒,其包含至少两种治疗剂,其中至少一种药剂包含TLR2抑制剂并且第二药剂包含TLR4抑制剂;和任选地使用说明书。
109.如权利要求108所述的试剂盒,其中各治疗剂独立选自由以下组成的组:小有机分子、蛋白质、抗体或其片段、肽、肽模拟物以及核酸分子。
110.如权利要求109所述的试剂盒,其中至少一种治疗剂包含核酸分子。
111.如权利要求110所述的试剂盒,其中各治疗剂包含核酸分子。
112.如权利要求111所述的试剂盒,其中第一核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸,并且第二核酸分子是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
113.如权利要求112所述的试剂盒,其中所述双链寡核苷酸一个接另一个地串联地连接或形成RNAistar时退火。
114.如权利要求113所述的试剂盒,其中所述第一双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR24的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补;并且
其中所述第二双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
115.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于在同一制剂中对受体联合施用。
116.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于在不同制剂中对所述受体联合施用。
117.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于通过相同路径对所述受体联合施用。
118.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于通过不同路径对所述受体联合施用。
119.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体同时施用。
120.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述受体连续施用。
121.如权利要求114所述的试剂盒,其中配制所述第一双链寡核苷酸和所述第二双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次、至少一天一次或者以用于对所述受体施用多次。
122.如权利要求114所述的试剂盒,其中至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
123.如权利要求114所述的试剂盒,其中至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
124.一种包装,其包含:A)至少两种单独的选自以下的剂量单位:(i)包含TLR2抑制剂的至少一个剂量单位和(ii)包含TLR4抑制剂的至少一个剂量单位;以及任选地B)包含剂量单位的使用说明书的包装插页。
125.如权利要求124所述的包装,其中所述TLR2抑制剂是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸并且所述TLR4抑制剂是结合编码TLR4基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
126.如权利要求125所述的包装,其中所述TLR2抑制剂是包含以下的双链寡核苷酸:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补,并且;
其中所述TLR4抑制剂是包含以下的双链寡核苷酸:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR4的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
127.如权利要求124所述的包装,其中通过相同途径对患者联合施用所述剂量单位。
128.如权利要求124所述的包装,其中通过不同途径对患者联合施用所述剂量单位。
129.如权利要求124所述的包装,其中对患者同时或连续地施用所述剂量单位。
130.如权利要求132所述的包装,其中剂量单位用于对患者施用至少一天一次。
131.如权利要求124所述的包装,其中所述剂量单位用于对患者施用多次。
132.如权利要求124所述的包装,其中至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;
其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补;并且其中(N)x包含选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA的反义序列。
133.如权利要求124所述的包装,其中至少一种双链寡核苷酸独立地包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y-z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补并且(N)x与在选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与选自编码TLR2的mRNA和编码TLR4的mRNA的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
134.如权利要求108至142中任一项所述的试剂盒或包装,其中所述说明书或包装插页指示所述治疗剂或剂量单位适合用于治疗罹患选自由以下组成的组的肺疾病、损伤或病症的患者:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、与肺移植相关的病症以及肺气肿。
135.如权利要求134所述的试剂盒或包装,其中所述说明书或包装插页指示所述治疗剂或剂量单位适合用于治疗罹患与肺移植相关的病症的患者。
136.如权利要求135所述的试剂盒或包装,其中与肺移植相关的肺病症选自由以下组成的组:炎症、移植物排斥、原发性移植物衰竭、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、再灌注水肿、同种异体移植物功能障碍、急性移植物功能障碍、肺再移植反应、闭塞性细支气管炎以及原发性移植物功能障碍(PGD)。
137.一种预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状的方法,其包括对所述受体施用治疗有效量的至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药,由此预防或减轻所述受体的PGD症状。
138.如权利要求137所述的方法,其中肺移植的所述受体是正在治疗原发性移植物功能障碍(PGD)的人。
139.如权利要求138所述的方法,其用于预防或减轻冷缺血相关的PGD或热缺血相关的PGD的所述症状。
140.如权利要求137至139中任一项所述的方法,其中所述症状选自由以下组成的组:炎症、急性移植物排斥、移植物排斥、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、肺功能受损、闭塞性细支气管炎、血氧合作用受损、炎症性细胞因子的产生增加、移植物内和气道内粒细胞积累、肺水肿以及血氧不足。
141.如权利要求137至139所述的方法,其中治疗有效量的至少一种TLR2抑制剂或其药学上可接受的盐或前药的所述施用引起以下之一:所述受体的肺水肿减轻;所述受体的血氧合作用增加、所述受体的血氧合作得到保持、所述受体的肺功能得到改善、所述受体的肺功能得到保持、移植的肺的肺功能得到改善。
142.如权利要求141所述的方法,其中在肺移植之前、期间或之后对肺移植的所述受体施用所述至少一种TLR2抑制剂。
143.如权利要求137至142中任一项所述的方法,其进一步包括选自由以下组成的组的至少一种另外的治疗:手术、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗病毒疗法、抗真菌疗法、抗微生物疗法、免疫抑制剂疗法、抗感染疗法、抗高血压疗法、营养补充剂及其任意组合。
144.如权利要求143所述的方法,其中在施用至少一种TLR2抑制剂之前、之后或同时施用所述另外的治疗。
145.如权利要求143所述的方法,其中所述另外的治疗包括免疫抑制剂疗法。
146.如权利要求143所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括全身性施用或局部施用。
147.如权利要求146所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括选自以下的方法:静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、门脉内、皮下、直接注射、气管内滴注、吸入、鼻内、肺部以及经由泵施用到肺中。
148.如权利要求147所述的方法,其中对所述受体的所述施用包括吸入或气管内滴注。
149.如权利要求137所述的方法,其中所述抑制剂包含核酸分子。
150.如权利要求149所述的方法,其中所述双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
151.如权利要求150所述的方法,其中配制所述双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次、至少一天一次或者以用于对所述受体施用多次。
152.如权利要求151所述的方法,其中所述双链寡核苷酸包含结构(A1):
(A1) 5’ (N)x–Z 3’ (反义链)
3’ Z’-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N和N’各自是可能未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸;
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在(N’)y的5’端的封端部分;其中x和y各自独立地是17与40之间的整数;
其中(N’)y的序列与(N)x的序列互补;并且其中(N)x包含编码具有SEQ ID NO:1中所列出的序列的TLR2的mRNA的反义序列。
153.如权利要求152所述的方法,其中(N)x包含存在于SEQ IDNO:723-1440和2247-3052中的反义寡核苷酸并且其中(N’)y包含存在于SEQ ID NO:5-722和1441-2246中的有义链寡核苷酸。
154.如权利要求152至153中任一项所述的方法,其中x=y=19。
155.如权利要求151所述的方法,其中所述双链化合物包含结构(A2):
(A2) 5’ N1-(N)x-Z 3’ (反义链)
3’ Z’-N2-(N’)y–z” 5’ (有义链)
其中N2、N和N’各自独立地是未修饰或修饰的核糖核苷酸或非常规部分;
其中(N)x和(N’)y各自是其中各连续的N或N’通过共价键连接于相邻的N或N’的寡核苷酸;
其中x和y各自独立地是17与39之间的整数;
其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列互补并且其中(N)x与编码TLR2的mRNA中的连续序列互补;
其中N1共价结合于(N)x并且与编码TLR2的mRNA错配;
其中N1是选自由以下组成的组的部分:尿嘧啶核苷、修饰的尿嘧啶核苷、胸腺嘧啶核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、修饰的胸腺嘧啶核糖脱氧核糖、腺嘌呤核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核苷以及修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷,其中z”可以是存在或不存在的,但是如果存在,则是共价连接在N2-(N’)y的5’端的封端部分;并且
其中Z和Z’各自独立地是存在或不存在的,但是如果存在,则独立地是共价连接在其所存在于其中的链的3’端的1至5个连续核苷酸或非常规部分或其组合。
156.如权利要求155所述的方法,其中x=y=18。
157.如权利要求155所述的方法,其中(N)x的所述序列选自SEQID NO:4153-5252和5546-5838中的任一个并且其中(N’)y的所述序列选自SEQ ID NO:3053-4152和5253-5545中的任一个。
158.如权利要求155所述的方法,其中施用结合编码TLR2基因的核苷酸序列的所述至少一种双链寡核苷酸引起TLR2表达的下调。
159.一种试剂盒或包装,其包含:含有TLR2抑制剂的至少一个剂量单位;以及任选地使用说明书,其中所述说明书指示所述剂量单位适合用于治疗罹患选自由以下组成的组的肺疾病、损伤或病症的患者:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、与肺移植相关的病症以及肺气肿。
160.如权利要求159所述的试剂盒或包装,其中所述TLR2抑制剂包含核酸分子。
161.如权利要求160所述的试剂盒或包装,其中所述核酸分子是结合编码TLR2基因的核苷酸序列的双链寡核苷酸。
162.如权利要求161所述的试剂盒或包装,其中所述双链寡核苷酸包含:
(a)有义链和反义链;
(b)各链的长度独立地是17至40个核苷酸;
(c)所述反义链的17至40个核苷酸序列与编码TLR2的mRNA的序列互补;并且
(d)所述有义链的17至40个核苷酸序列与所述反义链互补。
163.如权利要求162所述的试剂盒或包装,其中配制所述双链寡核苷酸以用于对所述患者施用一次、至少一天一次或者以用于对所述患者施用多次。
164.如权利要求162所述的试剂盒或包装,其中所述双链寡核苷酸包含如本说明书所公开的结构(A1)或(A2)。
165.如权利要求97至107中任一项所述的组合物,其用于在疗法中使用。
166.如权利要求165所述的组合物,其中所述疗法包括治疗或预防或减轻肺移植受体的原发性移植物功能障碍(PGD)的症状,以用于预防或减轻冷缺血相关的PGD的症状、用于预防或减轻热缺血相关的PGD的症状。
167.如权利要求166所述的组合物,其中所述症状选自由以下组成的组:炎症、急性移植物排斥、移植物排斥、缺血再灌注损伤、再灌注损伤、肺功能受损、闭塞性细支气管炎、血氧合作用受损、炎症性细胞因子的产生增加、移植物内和气道内粒细胞积累、肺水肿以及血氧不足。
168.如权利要求97至107中任一项所述的组合物用于制备治疗或预防选自以下的肺疾病、病症或损伤的药剂的用途:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎以及肺气肿。
169.如权利要求97至107中任一项所述的组合物用于治疗或预防选自以下的肺疾病、病症或损伤的用途:急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性肺损伤、肺纤维化(特发性)、博来霉素诱发的肺纤维化、机械呼吸机诱发的肺损伤、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎以及肺气肿。
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