JP2008514647A - 二本鎖リボ核酸によって炎症性疾患を治療する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
開示の内容は、哺乳動物の炎症性疾患を治療し、哺乳動物における腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の産生を阻害する薬剤の製造において、二本鎖リボ核酸(dsRNA)を含む製剤を使用することである。
【選択図】なし
Description
本発明の一態様は、哺乳動物の炎症性疾患を治療し、哺乳動物の腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の産生を阻害する薬剤の製造に二本鎖リボ核酸(dsRNA)を含む製剤を使用することである。好ましくは、炎症性疾患は、全身性疾患である。より好ましくは、炎症性疾患は、関節リウマチである。本発明の実施形態においては、製剤は、哺乳動物の血液循環に、好ましくは静脈投与によって投与される。別の実施形態においては、siRNAは、白血球、好ましくは単核白血球に送達される。別の実施形態においては、製剤の投与により、哺乳動物の血液循環におけるTNF−αが低下する。好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:59);
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:165);
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:166);
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:167);
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:168);
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:169);
KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:170);
RKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:171);
SYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:172);
VYVYKVLKQ(SEQ ID NO:173);及び
YKVLKQ(SEQ ID NO:174);
からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む。関連する好ましい実施形態においては、dsRNAは:
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO:109);
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:110);
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO:111);
CCAGGGACCUCUCUCUAAU(SEQ ID NO:112);
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO:113);
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO:114);
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO:115);
CCCAGGGACCUCUCUCUAA(SEQ ID NO:116);
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO:117);
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO:118);
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:119);
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:120);
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO:121);
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO:122);
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO:123);
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO:124);
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO:125);
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO:126);
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO:127);
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO:128);
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO:129);
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:130);
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO:131);
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO:132);
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO:133);
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:134);
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO:135);
CUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:136);
AGGCGGUGCUUGUUCCUCA(SEQ ID NO:137);
CCACCACGCUCUUCUGCCU(SEQ ID NO:138);
AGGGACCUCUCUCUAAUCA(SEQ ID NO:139);
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO:140);
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:141);
UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ ID NO:142);
CCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:143);
CCAAUGGCGUGGAGCUGAG(SEQ ID NO:144);
GGCGUGGAGCUGAGAGAUA(SEQ ID NO:145);
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO:146);
GCCUGUACCUCAUCUACUC(SEQ ID NO:147);
CCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:148);
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO:149);
GCUGGAGAAGGGUGACCGA(SEQ ID NO:150);
GAGAAGGGUGACCGACUCA(SEQ ID NO:151);
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO:152);
GCAGGUCUACUUUGGGAUC(SEQ ID NO:153);
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO:154);
UGGGAUCAUUGCCCUGUGA(SEQ ID NO:155);
GGUCGGAACCCAAGCUUAG(SEQ ID NO:156);
CCAGAAUGCUGCAGGACUU(SEQ ID NO:157);
GAGAAGACCUCACCUAGAA(SEQ ID NO:158);
GAAGACCUCACCUAGAAAU(SEQ ID NO:159);
CCAGAUGUUUCCAGACUUC(SEQ ID NO:160);
CUAUUUAUGUUUGCACUUG(SEQ ID NO:161);
UCUAAACAAUGCUGAUUUG(SEQ ID NO:162);及び
GACCAACUGUCACUCAUU(SEQ ID NO:163);
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含む。最も好ましくは、dsRNAは:
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO:117);
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO:118);
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:119);
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:120);
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO:121);
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO:122);
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO:123);
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO:124);
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO:125);
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO:126);
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO:127);
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO:128);
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO:129);
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:130);
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO:131);
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO:132);
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO:133);
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:134);及び
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO:135);
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含む。
本発明は、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと組み合わせて、短干渉核酸(siNA:short interfering nucleic acid)又はその前駆体を用いる新規の組成物及び方法を提供することによって、これらの需要を満足し、更なる目的及び利点を実現させる。ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、siNA及びその前駆体を含むポリヌクレオチドの、細胞内送達又は取り込みを促進する能力のために選択した天然又は人工のポリペプチドである。
本明細書では、「細胞」という用語は、通常の生物学的意味で使用され、完全な多細胞生物、例えば、詳細にはヒトを指すものではない。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物、並びに、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、犬及びネコなどの哺乳動物に存在することができる。細胞は、原核細胞(例えば、細菌細胞)であってもよく、真核細胞(例えば、哺乳動物細胞又は植物細胞)であってもよい。細胞は、体細胞系又は生殖細胞系、全脳細胞又は多能性細胞、分裂性又は非分裂性であってよい。細胞は、配偶子若しくは胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来してもよく、それらを含んでもよい。
WWETWKPFQCMCMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQ ID NO:27);GKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:28),RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO:29),GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:30),GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQ ID NO:31),Poly Lys−Trp,4:1,MW20,000−50,000;及びPoly Orn−Trp,4:1,MW20,000−50,000。
本明細書の組成物及び方法の範囲で有用な追加のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、メリチンタンパク質配列の全て又は一部を含む。
本明細書で使用される「非対称ヘアピン」という用語は、アンチセンス領域と、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができるループ部と、センス領域とを含む線形のsiNA分子を意味する。ここで、センス領域は、アンチセンス領域より少ないがアンチセンス領域との塩基対に十分な相補的ヌクレオチドを有して、ループ部と二重鎖(duplex)を形成する程度のヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称ヘアピンsiNA分子は、T細胞内のRNAiを媒介するのに十分な長さ(例えば、約19から約22(例えば、約19,20,21又は22)のヌクレオチド)を有するアンチセンス領域と、約4から約8(例えば、約4,5,6,7又は8)のヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域を相補する約3から約18(例えば、約3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17又は18)のヌクレオチドを有するセンス領域とを含むことができる。非対称ヘアピンsiNA分子は、化学修飾することができる5’末端リン酸基を含むこともできる。非対称ヘアピンsiNA分子のループ部は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、又は共役分子含むことができる。
核酸分子及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、当業者に公知の様々な方法で細胞に投与することができる。それらの方法には、siNA及びポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドのみを含む製剤、又は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、乳化剤、緩衝剤、安定剤、保存剤等の、1つ又はそれ以上の追加の成分を更に含む製剤での投与が含まれるが、それらに限定されない。一部の実施形態においては、siNA及び/又はポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、リポソームに包む、イオントフォレーゼにより投与する、又は、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生物分解性ナノカプセル、生体接着性マイクロスフェア若しくはタンパク性ベクター等の他のビヒクルに組み込むことができる(例えばO’Hare and Normand,PCT国際公開番号WO00/53722号を参照)。或いは、核酸/ペプチド/ビヒクルの組み合わせを、直接注射することによって、又は輸液ポンプを用いることによって局所的に送達することができる。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下注射、筋肉注射、皮内注射のいずれにおいても、標準的な針とシリンジの方法によって、又は、Corny等,Clin.Cancer Res.,5:2330−2337(1999)and Barry等,PCT国際公開番号WO99/31262に記載の技術等の針を使わない技術によって、行うことができる。
実施例1
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合したsiRNAを含む組成物の生産及び特徴
本発明の候補siRNAとポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドとの複合体を形成するためには、十分な量のsiRNAを、例えば、Opti−MEM(登録商標)細胞培地(Invitrogen社)において、規定の割合で、所定の量のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと混ぜ合わせ、室温で約10分から30分培養する。次に、この混合物を、選択した体積、例えば50μlを標的細胞に接触させ、その細胞を、所定の培養時間、本実施例においては約2時間培養した。siRNA/ペプチド混合物は、任意で、細胞培養培地、又は、ウシ胎仔血清等の他の添加剤を含んでもよい。H3,H4及びH2bに関しては、これらのポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドをsiRNAと異なった割合で複合する一連の実験を行った。一般的に、これは、siRNA/ヒストン割合が、1:0.01から1:50で開始した。96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに、40pmのsiRNAを加えた。各ウエルは、50%の密集度でbeta−gal細胞を含んでいた。トランスフェクション効率の例示の最適化割合を次の表2に示す。
オリゴヌクレオチドの合成を、標準的な2−シアノエチルフォスフォアミダイト法を用いて、最適な5’−O−ジメチルトリチル−2’−O−t−ブチルジメチルシリル−3’−O−スクシニルリボヌクレオシド又は、適用できる場合には5’−O−ジメチルトリチル−2’−デオキシ−3’−O−スクシニルチミジン支持体で誘導体化された長鎖アルキルアミン細孔性ガラス上で行った。全てのオリゴヌクレオチドを、0.2又は1μmolスケールでABI3400DNA/RNAシンセサイザを用いて合成し、濃縮NH4OHを用いて固体支持体から切断し、55℃で、NH4OH:EtOH 3:1の混合物を用いて、脱保護した。2’−TBDMS保護基の脱保護は、塩基脱保護RNAをN−メチルピロリドン/トリエチルアミン/トリエチルアミントリス(フッ化水素塩)(体積比6:3:4)の溶液(600μL/μmol)を用いて65℃で2.5時間、培養することによって達成した。対応するビルディングブロックである、A、U、C及びGの5’−ジメトキシトリチル−N−(tac)−2’−O−(t−ブチルジメチルシリル)−3’−[(2−シアノエチル)−(N,N−ジイソプロピル)]−フォスフォアミダイト(Proligo,Boulder社)、及び修飾フォスフォアミダイトである、5’DMTr−5−メチル−U−TOM−CE−フォスフォアミダイト、5’−DMTr−2’−OMe−Ac−C−CEフォスフォアミダイト、5’−DMTr−2’−OMe−G−CEフォスフォアミダイト、5’−DMTr−2’−OMe−U−CEフォスフォアミダイト、5’−DMTr−2’−OMe−A−CEフォスフォアミダイト(Glen Research社)は、供給業者から直接購入した。トリエチルアミン−三フッ化水素塩、N−メチルピロリジノン及び濃縮水酸化アンモニウムは、Aldrich社から購入した。全てのHPLC分析及び精製は、Xterra(登録商標)カラムを用いて、Waters 2690で行った。他の試薬は全て、Glen Research社から購入した。オリゴヌクレオチドは、RP−HPLC判定で97%以上の純度に精製した。マウス注射用siRNAは、Qiagen社から購入し、in vivo注射に許容可能なエンドトキシンのレベルでアニーリングした後、HPLC精製した。
トランスフェクション手順の第1日目に、飽和9L/LacZ培養液をT75フラスコから取り出し、細胞を分離し、10mlの完全培地(DMEM、1×PS、1×ピルビン酸Na、1×NEAA)に希釈する。細胞を、更に1:15まで希釈し、この調製物100μlを96ウエルプレートのウエルに等分すると、翌日までにトランスフェクション用に一般的に約50%コンフルエントな細胞密度を産出する。ウエルの端を空にして、250μlの水で満たし、プレートを培養器(5%CO2培養器)中に、37℃で一晩、積み重ねずに置く。
C.U.A.C.A.C.A.A.A.U.C.A.G.C.G.A.U.U.U.dT.dT(センス)(SEQ ID NO:32)
A.A.A.U.C.G.C.U.G.A.U.U.U.G.U.G.U.A.G.dT.dT(アンチセンス)(SEQ ID NO:33)
カチオン脂質を、siRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド混合物、複合体又は共役体に加える効果を評価するために、リポフェクタミン(Invitrogen社)を、製造元の指示(0.2μl/100μl Opti−MEM)に従って、一定の濃度でsiRNA/ポリヌクレオチド送達製剤に加えた以外は、上記手順に従った。
TAT−HAポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したsiRNAを含む組成物の生産と特徴
本実施例は、siRNA二重鎖(duplex)の1本の鎖に共有結合により共役した特異的ペプチドの合成と取り込み活性を記載する。これらの共役体は効率的にsiRNAを細胞質に送達する。
9L/LacZ細胞におけるsiRNAの取り込みのためのsiRNA/送達ペプチド複合体のスクリーニング
本発明の合理的に設計したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの幅広い多様なアセンブリは、siRNAと複合すると、siRNA取り込みを促進するという、追加の証拠を本実施例は提供する。
siRNA/送達は、In Vitroにおいてポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進される。
本実施例は、LacZ細胞、マウス初代繊維芽細胞及びヒト単核白血球における、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによるsiRNA取り込みの促進を示す。9L/LacZ細胞及びマウス初代繊維芽細胞において行われる実験に用いる物質及び方法は、一般的に上述のものと同じであるが、マウスの実験には、9L/LacZ細胞をマウス尾繊維芽細胞に代えて使用する。マウス尾繊維芽(MTF)細胞で行ったトランスフェクションの結果を表5にまとめている。表5は、使用したペプチド及びsiRNAの濃度を、siRNA分子と共役した標識と共に示している。MTF細胞及び9L/LacZ細胞で行ったトランスフェクションの結果を表6にまとめてある。表6のデータは、異なった細胞型におけるペプチド/siRNA複合体のトランスフェクション効率を比較したものである。
siRNA/送達は、ペプチド−siRNA共役体により促進される。
本実施例は、siRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド共役体の、9L/LacZ培養細胞株と、マウス尾からの初代繊維芽細胞とにおけるsiRNAの取り込みを誘導又は促進する活性を評価するためのスクリーニングの結果を提供する。9L/LacZ細胞で行ったトランスフェクションの結果を、表7にまとめる。MTFで行ったトランスフェクションの結果を、表8にまとめる。
siRNAの遺伝子発現ノックダウンは、siRNAに複合したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進される。
本実施例は、本発明のsiRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド複合体による標的遺伝子発現の効果的なノックダウンを示す。この研究において、ヒト及び他の哺乳動物の対象において過剰発現するとき、RAの発生又は進行を媒介するとされているヒト腫瘍壊死因子−α(hTNF−α)遺伝子の発現を調節するペプチド/siRNA複合体の能力をテストした。
siRNA遺伝子発現ノックダウンは、siRNAと共役したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドによって促進される。
本実施例は、本発明のペプチド−siRNA共役体による標的遺伝子発現のノックダウンを示している。これらの研究に使用された物質及び方法は、上述のものと同じである。この実施例の結果を表13に示す。
siRNA遺伝子発現ノックダウンの時間的経過
本実施例は、siRNAが媒介する遺伝子発現ノックダウンの時間的経過に関する研究を示す。siRNA効果の持続期間をテストするために、eGFP発現マウス由来の繊維芽細胞を使用する以外は、上述のsiRNAトランスフェクション手順を採用した。ここで用いたトランスフェクション試薬はリポフェクタミンであった。細胞は、異常増殖のため、18日目にプレートを変えた。第2トランスフェクションは、第1トランスフェクション後19日目に行った。19日目に、トランスフェクション後、eGFPレベルを測定した。スクランブル又はナンセンスsiRNA(Qiagen社)を対照群として、GFPI siRNA(GFPI)及びヘアピンsiRNA(D#21)と共に使用した。ノックダウン活性は、スクランブルsiRNA(Qiagen社対照群)で較正した。
哺乳動物細胞のsiRNAノックダウン効果を延長する複数回投与プロトコル
複数回投与スケジュールによって、本発明のsiRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物が媒介する、哺乳動物細胞における遺伝子発現ノックダウン効果は有効に延長されることを、本実施例は実証する。この研究に用いられる物質及び方法は、表示の時にトランスフェクションを繰り返した以外は、上述の物質及び方法と同じである。スクランブルsiRNA(Qiagen社)を、比較対照群に使用した。表15に、ペプチド/siRNA複合体を用いる複数回のトランスフェクションのデータをまとめてある。TNF−α遺伝子のノックダウン活性パーセントは、遺伝子発現全体に対するパーセントを表す。
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを最適化する合理的設計
本実施例は、本発明のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドを最適化する例示の設計及びデータを提供する。対象の合理的設計操作は、ヒストンH2B由来のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドに関して行った。
MPEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQK−KDSKKRKRSRKESYSVYVYKVLKVHPDTGISSKAMGIMNSFVNDIFERIAGEASRLAHYNKRSTITSREIQTAVRLLLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTSSK(SEQ ID NO:164)
PN73(13から48)
NH2−KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−amide(SEQ ID NO:59)
PN360(13から35;PN73のN末端)
NH2−KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRK−amide(SEQ ID NO:57)
PN361(24から48;PN73のC末端)
NH2−KKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−amide(SEQ ID NO:58)
PN73(13から48)−siRNA(センス鎖)共役体
siRNA−KGSKXAVTKAQKKTJGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−amide(SEQ ID NO 59)
PN404(PN73の全てのリジンをアルギニンに交換)
NH2−RGSRRAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ−amide(SEQ ID NO:91)
PN509(ペグ化したPN73)
PEG− RGSREAVTRAQRRDGRRRRRSRRESYSVYVYRVLRQ−amide(SEQ ID NO:59).
アセチル化したポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドは、siRNAの安定性を向上させる。
本実施例の目的は、例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドPN73を修飾すると、ポリペプチトPN73の安定性が向上し、結果としてトランスフェクション活性が促進される否かを決定することであった。PN73の非修飾形態、N末端をペグ化した形態、及びN末端をアセチル化した形態の安定性を血漿中で比較した。PN73のC末端はアミド化した。血漿中で培養前と後に、紫外吸光検出器と共にサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、PN73の非修飾形態及び修飾形態の安定性を特徴付けた。
Ac−KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ−amide(SEQ ID NO:59)
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドはインターフェロン反応を引き出さない。
本実施例の目的は、リポフェクタミン・プラス・siRNA、又は、例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドであるPN73ペプチド・プラス・siRNAを用いてトランスフェクトした細胞のインターフェロン反応を比較することであった。インターフェロン反応性を、ELISA(タンパク質)及びbDNA(mRNAレベル)によって、アッセイを行った。
ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと共役したsiRNAは、ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドと複合したsiRNAより大きいノックダウン活性を提供する。
本実施例の目的は、例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドPN73と共役したsiRNA LC13及びLC20と、該PN73と複合したsiRNA LC13及びLC20とのヒト単核白血球におけるノックダウン活性を比較することであった。ヒト単核白血球の単離及びトランスフェクションと、ノックダウン活性を測定するのに用いた方法に関しては前述した。Qnegは、無作為なsiRNA配列を表し、これらの実験の陰性対照として機能する。観察されたQnegノックダウン活性は、100%(100%遺伝子発現レベル)に標準化し、LC20及びLC13の活性は、陰性対照に対する相対的なパーセンテージとして表す。LC20及びLC13は、ヒトTNF−α遺伝子を標的とするsiRNAである。PN73が存在しないとき、PN73と複合したとき、又はPN73と共役したときの、siRNA LC20及びLC13のノックダウン活性を、0nMから2.5nMの濃度範囲でテストした。PN73は、複合体及び共役体の実験において、1:1の割合とした。
例示のポリヌクレオチド送達促進ポリペプチドの欠失分析
本実施例の目的は、小分子及び高分子の細胞への送達を促進するPN73ペプチドの能力に必須の最小長を決定することであった。表17に示すように、ペプチドのN末端から一度に3残基ずつを順次、欠失することによって、PN73の先端を切り取った10の形態を作成した。下記は、PN73の1次構造と先端を切り取った形態を表しており、それらのトランスフェクション活性を調べる。本実施例でテストしたペプチドは全て、C末端FITC(フルオレセイン−5−イソチオシアン酸塩)標識をつけた(すなわち、−GK[EPSILON]G−amide)。
In VivoにおけるsiRNA媒介遺伝子発現ノックダウン活性
A.eGFPマウス
20gから25gの体重のeGFPトランスジェニックマウスをジャクソン研究所(Jackson Laboratory)より購入した。siRNA注射に関しては、siRNAを、siRNA/PN73を1:5の割合で、5mg/kgの用量で用いた。処置は全て、三日間、日に一度、尾静脈注射によって行った。組織を、第4日に採取した。実験プロトコルは、R&R Rabbitary(ワシントン州Standwood)で行い、その研究機関の動物管理使用委員会(IACUC:Institutional Animal Care and Use Committee)が承認した。
トランスジェニックマウスは、ペプチドPN73と複合したeGFPトランスジェニックマウスのsiRNA(siRNAとペプチドの割合1:5)で処置した(5mg/kg 3日間)。ノックダウン活性の決定に関しては、方法の項で述べたコラゲナーゼ処理後、細胞を筋細胞から単離した。単離細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。
トランスジェニックマウスは、ペプチドPN73と複合したeGFPトランスジェニックマウスのsiRNA(siRNAとペプチドの割合1:5)で処置した(5mg/kg 3日間)。ノックダウン活性の決定に関しては、方法の項で述べたコラゲナーゼ処理後、細胞を肝臓組織から単離した。単離細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。
ヒトTNF−α動物疾患モデルに関しては、2つのトランスジェニックモデルを使用した。tg197マウスは、ヘレニック・パスツール研究所(Pasteur Hellenic Institute)(ギリシャ、アテネ)から取得し、B6.SJL−Tg(TNF)N21マウスは、タコニック社(ニューヨーク州ジャーマンタウン)から購入した。両方のヒトTNF−αトランスジェニックマウスモデルの遺伝子型は、供給者によって特定された。tg197マウスに関しては、6週令のマウスを、インフリキシマブ、siRNA/PN73複合体、及び生理食塩水の3つの処置群に分けた。TNF−α中和抗体系薬物であるインフリキシマブ(Remicade等)は、一般の薬局で購入し、1週間に一度、10mg/kgの用量で使用した。siRNAは、siRNA/PN73を1:5の割合で、2mg/kgの用量で用いた。全ての処置は、1週間に2度、尾静脈注射によって行った。実験プロトコルは、SkeleTech 社(ワシントン州ボセル)で行い、その研究機関の動物管理使用委員会(IACUC)が承認した。類似の用法を、B6.SJL−Tg(TNF)N21マウスに使用した。臨床スコアは、前述のスコアシステム(stem)(2,3)に基づいた。すなわち、0(正常)、1(足関節又は後足首関節の浮腫又は変形)、2(足関節及び後足首関節の変形)又は3(前足首関節又は後足首関節の硬直)である。1週間に2度、4肢全てを合計し、マウス一匹あたり、12を最高スコアとする。
本実施例は、標的遺伝子発現を調節し、治療的方法で細胞の表現型を変更するのに有効な、siRNAによる全身への送達及び治療的遺伝子ノックダウンを媒介する本発明のsiRNA/ポリヌクレオチド送達促進ポリペプチド組成物の有効性を示すin vivoにおけるデータを提供する。
0: 正常
1: 足関節又は後足首関節の浮腫又は変形
2: 足関節及び後足首関節の変形
3: 前足首関節又は後足首関節の硬直
正常な(マウスタイプ)マウスを、様々なLPS濃度で腹腔内注射又は静脈注射によって処置した。LPS反応性は、LPS注射後、様々な時間に採取した血液中のTNF−αのレベルを測定することによって決定した。TNF−α誘導の線形の範囲は、IP投与におけるLPS注射に関しては10ngと100ngとの間、IV注射による場合は最高25ngであった。最高TNF−α誘導の平均時間は、LPS注射後70分である。これらの結果に基づいて、更なる実験のために、IP投与に関しては25ng、IV投与に関しては10ngのLPS用量を選択した。
Claims (18)
- 哺乳動物の腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の産生を阻害することによって、哺乳動物における炎症性疾患を治療する薬剤の製造において、二本鎖リボ核酸(dsRNA)を具えることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項1に記載の製剤の使用において、前記炎症性疾患が、全身性疾患であることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項1に記載の製剤の使用において、前記炎症性疾患が、関節リウマチであることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項1に記載の製剤の使用において、前記製剤が、哺乳動物の血液循環に投与されることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項4に記載の製剤の使用において、前記製剤が、静脈内投与されることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項4に記載の製剤の使用において、siRNAが、血液の白血球に送達されることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項6に記載の製剤の使用において、前記白血球が、単核白血球であることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項1に記載の製剤の使用において、前記製剤の投与が、前記哺乳動物の前記血液循環におけるTNF−αのレベルを低下させることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項1に記載の製剤の使用において、前記哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする製剤の使用。
- 請求項1に記載の製剤の使用において、前記製剤が、送達促進ペプチドを更に含むことを特徴とする製剤の使用。
- 請求項10に記載の製剤の使用において、前記ペプチドが、
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:59);
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:165);
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:166);
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:167);
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:168);
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:169);
KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:170);
RKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:171);
SYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:172);
VYVYKVLKQ(SEQ ID NO:173);及び
YKVLKQ(SEQ ID NO:174);
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする製剤の使用。 - 請求項1に記載の製剤の使用において、前記dsRNAが、
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO:109);
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:110);
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO:111);
CCAGGGACCUCUCUCUAAU(SEQ ID NO:112);
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO:113);
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO:114);
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO:115);
CCCAGGGACCUCUCUCUAA(SEQ ID NO:116);
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO:117);
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO:118);
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:119);
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:120);
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO:121);
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO:122);
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO:123);
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO:124);
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO:125);
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO:126);
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO:127);
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO:128);
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO:129);
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:130);
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO:131);
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO:132);
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO:133);
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:134);
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO:135);
CUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:136);
AGGCGGUGCUUGUUCCUCA(SEQ ID NO:137);
CCACCACGCUCUUCUGCCU(SEQ ID NO:138);
AGGGACCUCUCUCUAAUCA(SEQ ID NO:139);
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO:140);
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:141);
UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ ID NO:142);
CCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:143);
CCAAUGGCGUGGAGCUGAG(SEQ ID NO:144);
GGCGUGGAGCUGAGAGAUA(SEQ ID NO:145);
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO:146);
GCCUGUACCUCAUCUACUC(SEQ ID NO:147);
CCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:148);
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO:149);
GCUGGAGAAGGGUGACCGA(SEQ ID NO:150);
GAGAAGGGUGACCGACUCA(SEQ ID NO:151);
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO:152);
GCAGGUCUACUUUGGGAUC(SEQ ID NO:153);
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO:154);
UGGGAUCAUUGCCCUGUGA(SEQ ID NO:155);
GGUCGGAACCCAAGCUUAG(SEQ ID NO:156);
CCAGAAUGCUGCAGGACUU(SEQ ID NO:157);
GAGAAGACCUCACCUAGAA(SEQ ID NO:158);
GAAGACCUCACCUAGAAAU(SEQ ID NO:159);
CCAGAUGUUUCCAGACUUC(SEQ ID NO:160);
CUAUUUAUGUUUGCACUUG(SEQ ID NO:161);
UCUAAACAAUGCUGAUUUG(SEQ ID NO:162);及び
GACCAACUGUCACUCAUU(SEQ ID NO:163);
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含むことを特徴とする製剤の使用。 - 請求項7に記載の製剤の使用において、前記dsRNAが、
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO:117);
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO:118);
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:119);
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:120);
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO:121);
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO:122);
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO:123);
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO:124);
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO:125);
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO:126);
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO:127);
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO:128);
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO:129);
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:130);
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO:131);
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO:132);
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO:133);
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:134);及び
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO:135);
からなる群より選択されるリボ核酸配列を含むことを特徴とする製剤の使用。 - 二本鎖リボ核酸(dsRNA)を具え、前記dsRNAが、前記哺乳動物の細胞における腫瘍壊死因子−α(TNF−α)の発現を阻害することができることを特徴とする医薬製剤。
- 請求項14に記載の製剤において、前記製剤が、送達促進ペプチドを更に具えることを特徴とする製剤。
- 請求項15に記載の製剤において、前記ペプチドが、
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:59);
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:165);
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:166);
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:167);
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:168);
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:169);
KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:170);
RKESYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:171);
SYSVYVYKVLKQ(SEQ ID NO:172);
VYVYKVLKQ (SEQ ID NO:173)及び
YKVLKQ (SEQ ID NO:174)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を具えることを特徴とする製剤。 - 請求項14に記載の製剤において、前記dsRNAが、
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO:109);
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:110);
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO:111);
CCAGGGACCUCUCUCUAAU(SEQ ID NO:112);
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO:113);
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO:114);
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO:115);
CCCAGGGACCUCUCUCUAA(SEQ ID NO:116);
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO:117);
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO:118);
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:119);
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:120);
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO:121);
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO:122);
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO:123);
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO:124);
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO:125);
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO:126);
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO:127);
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO:128);
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO:129);
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:130);
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO:131);
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO:132);
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO:133);
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:134);
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO:135);
CUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:136);
AGGCGGUGCUUGUUCCUCA(SEQ ID NO:137);
CCACCACGCUCUUCUGCCU(SEQ ID NO:138);
AGGGACCUCUCUCUAAUCA(SEQ ID NO:139);
UGACAAGCCUGUAGCCCAU(SEQ ID NO:140);
GCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:141);
UAGCCCAUGUUGUAGCAAA(SEQ ID NO:142);
CCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:143);
CCAAUGGCGUGGAGCUGAG(SEQ ID NO:144);
GGCGUGGAGCUGAGAGAUA(SEQ ID NO:145);
GCGUGGAGCUGAGAGAUAA(SEQ ID NO:146);
GCCUGUACCUCAUCUACUC(SEQ ID NO:147);
CCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:148);
GGUAUGAGCCCAUCUAUCU(SEQ ID NO:149);
GCUGGAGAAGGGUGACCGA(SEQ ID NO:150);
GAGAAGGGUGACCGACUCA(SEQ ID NO:151);
GCCCGACUAUCUCGACUUU(SEQ ID NO:152);
GCAGGUCUACUUUGGGAUC(SEQ ID NO:153);
GGUCUACUUUGGGAUCAUU(SEQ ID NO:154);
UGGGAUCAUUGCCCUGUGA(SEQ ID NO:155);
GGUCGGAACCCAAGCUUAG(SEQ ID NO:156);
CCAGAAUGCUGCAGGACUU(SEQ ID NO:157);
GAGAAGACCUCACCUAGAA(SEQ ID NO:158);
GAAGACCUCACCUAGAAAU(SEQ ID NO:159);
CCAGAUGUUUCCAGACUUC(SEQ ID NO:160);
CUAUUUAUGUUUGCACUUG(SEQ ID NO:161);
UCUAAACAAUGCUGAUUUG(SEQ ID NO:162);及び
GACCAACUGUCACUCAUU (SEQ ID NO:163);
からなる群より選択されるリボ核酸配列を具えることを特徴とする製剤。 - 請求項17に記載の製剤において、前記dsRNAが、
AAUCGGCCCGACUAUCUCGACUU(SEQ ID NO:117);
AAUGGCGUGGAGCUGAGAGAU(SEQ ID NO:118);
AACCUCCUCUCUGCCAUCAAG(SEQ ID NO:119);
AACUGAAAGCAUGAUCCGGGA(SEQ ID NO:120);
AAUCUCGACUUUGCCGAGUCU(SEQ ID NO:121);
AAGGGUGACCGACUCAGCGCU(SEQ ID NO:122);
AAUCAGCCGCAUCGCCGUCUC(SEQ ID NO:123);
AACCCAUGUGCUCCUCACCCA(SEQ ID NO:124);
AAGCUCCAGUGGCUGAACCGC(SEQ ID NO:125);
AAGUCAGAUCAUCUUCUCGAA(SEQ ID NO:126);
AAGGGACCUCUCUCUAAUCAG(SEQ ID NO:127);
CCUCAGCCUCUUCUCCUUCCUGA(SEQ ID NO:128);
AAUCCUCAGCCUCUUCUCCUU(SEQ ID NO:129);
AACCAAUGCCCUCCUGGCCAA(SEQ ID NO:130);
CUGAUUAAGUUGUCUAAACAA(SEQ ID NO:131);
CCGACUCAGCGCUGAGAUCAA(SEQ ID NO:132);
CUUGUGAUUAUUUAUUAUUUA(SEQ ID NO:133);
AAGCCUGUAGCCCAUGUUGUA(SEQ ID NO:134);及び
UAGGGUCGGAACCCAAGCUUA(SEQ ID NO:135);
からなる群より選択されるリボ核酸配列を具えることを特徴とする製剤。
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