KR20080066987A - ｓｉＲＮＡ에 대한 전달 운반체로서의 펩티드-다이서 기질ＲＮＡ 접합체들 - Google Patents

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Abstract

이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자와 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며, 상기 dsRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 조성물들이 개시된다. dsRNA의 가닥들은 동일하거나 상이할 수 있는 약 25 내지 약 30 염기쌍의 길이들을 가질 수 있다. siRNA는 또한, 적어도 3 개의 가닥들(즉, 적어도 두 개의 센스 가닥들과 한 개의 안티센스 가닥 또는 적어도 두 개의 안티센스 가닥들과 한 개의 센스 가닥 중 어느 하나)을 포함할 수 있으며, 적어도 두 개의 센스 가닥들이나 적어도 두 개의 안티센스 가닥들은 적어도 하나의 뉴클레오티드의 하나의 틈새 또는 하나의 간격만큼 분리된다.
펩티드-다이서 기질, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA), 접합체, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드, A:B1B2 가닥

Description

ｓｉＲＮＡ에 대한 전달 운반체로서의 펩티드-다이서 기질 ＲＮＡ 접합체들{PEPTIDE-DICER SUBSTRATE RNA CONJUGATES AS DELIVERY VEHICLES FOR SIRNA}
본 개시는 일반적으로 RNA 간섭(RNAi)을 수단으로 질환의 치료에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 개시는 유전자 발현에 대항하는 RNAi를 매개할 수 있는 유전자 발현에 대항하는 RNAi를 매개할 수 있는 소 억제 핵산 분자들(small inhibitory nucleic acid molecules: siRNA) 및 그 변이체들의 표적 전달에 관한 것이다. 여기에 기술된 siRNA는 하나 이상의 펩티드들과 접합되어, 접합된 펩티드(들)이 siRNA의 전달을 촉진시키고, 안정도를 높이고/높이거나 독성을 감소시킬 수 있다.
동물과 인간(식물)으로의 핵산 전달은 분자 생물학과 임상 연구의 중요한 목적이다. 특이적으로, 유전자 치료, 안티센스 치료 및 RNA 간섭(RNAi) 치료의 분야에서 최근의 발전은 핵산들의 세포로의 도입에 더 효과적인 수단을 개발하려는 수요를 창출하였다.
현재까지, 핵산의 세포들로의 인공적인 전달의 가장 흔한 방법은 기계적 또는 생화학적 막 분열(disruption) 및/또는 침투를 이용하는 수많은 방법(예컨대, 세제, 미량주입 또는 입자총의 사용)들뿐만 아니라 양이온 지질, 전기천공법 및 바 이러스 형질도입을 이용한다. 이러한 방법들은 수많은 단점들이 있다. 예를 들어, DNA 및 소 간섭 RNA(siRNA)의 시험관 내 전달에 흔히 양이온 지질들이 사용되는 경우에, 이들은 일반적으로 독성이 강해서 질병 치료와 같은 생체 내 응용에 부적절하다. 바이러스 형질도입에서, 전달 운반체로 사용되는 복제 결핍 바이러스(deficient virus)는 야생형으로 격세 유전하여 병원성이 될 수 있다. 전기천공법은 낮은 유전자 전달 효율과 세포 손상을 겪게 되어 임상 응용의 폭이 제한되어 있다.
RNA 간섭(RNAi)은 식물과 동물 세포들 내에서 특이적인 유전자들의 발현을 변형시키는 유망한 기술로 부상하고 있어서, 내생적 유전자 발현의 변형에 의한 치료에 적합한 광범위한 질병과 장애를 치료하는 유용한 치료제들(도구들)을 제공하는 것으로 기대된다. RNA 간섭은 주로 표적 전령 RNA(mRNA)의 일부분과 서열상 상동인 dsRNA인 단 간섭 RNA들(siRNA들)에 의하여 매개되는 동물들 내에서의 서열-특이적 전사 후 유전자 침묵의 과정을 의미한다. Fire, et al., Nature 391:806, 1998 및 Hamilton, et al., Science 256:950-951, 1999 참조. 식물들 내에서의 해당 과정은 흔히 전사 후 유전자 침묵 또는 RNA 침묵으로 불려지며, 균류 내에서의 퀄링(quelling)으로도 불려진다. 전사 후 유전자 침묵 과정은 외부 유전자들의 발현을 방지하는 데 이용되는 진화적으로-보존된 세포 방어 메커니즘으로 생각되며 다양한 식물상과 문(flora and phyla)에 의하여 공유되는 것으로 여겨진다(Fire, et al., Trends Genet . 15:358, 1999).
적절한 dsRNA을 세포들로 형질도입하게 되면 내생성인 동족(cognate) mRNA 들(즉, 형질도입된 dsRNA와 실질적인 서열 동일성을 공유하는 mRNA들)의 파괴로 이어진다. dsRNA 듀플렉스들이 표적 유전자-침묵을 매개하는 메커니즘은 2 단계 과정인 것으로 여겨진다. 우선, dsRNA들은 다이서(dicer)라고 칭하는 리보뉴클레아제 III 효소에 의하여 소 간섭 RNA들(siRNA들)로 단편화 된다(분해된다)(Hamilton, et al., supra; Bertein, et al., Nature 409:363, 2001). 다이서 활성으로부터 유도된 단 간섭 RNA들은 통상적으로 2 개의 3' 오버행(overhang)들이 있는 길이가 약 21 내지 약 23 개의 뉴클레오티드들이다(Kim, et al., Nature Biotech. 23(2):222, 2005). 최근에 발표된 증거에 의하면 dsRNA들의 길이가 길면 길수록(길이가 25 내지 30 뉴클레오티드) 동일한 표적 사이트에 방향을 둔 더 짧은 대응물들(21 량체)보다 더 큰 유전자 침묵 활성을 가질 수 있다는 것을 제시한다(Kim, et al., Nature Biotech. 23(2):222, 2005). 또한, 21 량체 RNA들에 의한 siRNA 매개 유전자 침묵에 무반응인 몇몇 표적 사이트들은 길이가 더 긴 27 량체 siRNA 듀플렉스들에 의하여 효과적으로 침묵될 수 있다. 이러한 길이가 더 긴 siRNA 듀플렉스들의 증가된 역가(potency)는 상기 듀플렉스들이 다이서 엔도뉴클레아제의 기질들이라는 사실에 기인한다(Kim, et al., Nature Biotech. 23(2):222, 2005). 따라서, 치료제라는 맥락에서, 이러한 길이가 더 긴 dsRNA들은 다이서에 의하여 처리될 경우 RISC 복합체로 들어가서 표적 유전자 침묵의 매개자들로서 기능하는 전구체들로서 작용한다.
제 2 단계는 siRNA를 RNA-유도성 침묵 복합체 또는 "RISC"로 알려진 다능성 뉴클레아제 복합체로의 혼입을 포함한다. RISC는 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥 에의 그 상보성을 통하여 mRNA 기질들을 확인하고, 표적 mRNA와의 결합과 표적 mRNA의 파괴(쪼개짐)를 개시하여 유전자 발현의 침묵을 달성한다. 표적 RNA의 쪼개짐은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 영역에 중간에서 발생한다(Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188, 2001).
특히, 기존의 세포 전달 기법들은 전달 시약들의 낮은 효율 및/또는 높은 독성에 제한받는다는 사실을 고려하여, 핵산들, 펩티들 및 다른 약학제들을 세포들로 전달하는 더 나은 도구들과 방법들에 대한 업계의 오래된 요구가 상존한다. 활성 및 지속 상태에서 유효량을 전달하며, 표적 세포들의 표현형이나 질병 상태를 변경시킬 방식으로 유전자 발현의 조절을 매개하는 선별된 세포들, 조직들 또는 구획들로 비-독성 전달 운반체들을 사용하는 관련된 요구가 존재한다.
본 개시는 특히(inter alia), 질병의 치료를 위한 치료 약물의 전구체 전달 시스템들로서 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들/다이서 기질 dsRNA 접합체들을 제공함으로써 이러한 것과 다른 관련된 요구들을 다룬다. 세포들로 폴리펩티드에 의한 전달시에, 전구체 siRNA는 다이서에 의하여 쪼개어져서, 전달 펩티드로부터 방출시켜, 이후 siRNA가 전사 후 유전자 침묵을 위하여 RISC 복합체와 표적 특이적 유전자들로 들어가게 된다. 여기에 개시된 펩티드-dsRNA 접합체들은 내생적 유전자 발현의 변형에 의한 치료에 적합한 다양한 범위의 질병들과 장애들의 치료를 위하여 dsRNA 치료 전구체들의 세포들로의 전달을 개선시키는 유망한 새로운 접근법을 제공한다. 여기에 개시된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들/다이서 기질 dsRNA 접합체들은 dsRNA의 생체 내 수명을 연장시켜 dsRNA의 보호 및/또는 예방 능력을 증진시킨다.
일 태양에서, 본 개시는 동물에 하나 이상의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자의 투여에 적절한 약학적 조성물들을 포함하는 조성물들을 제공하며, 상기 조성물들은 하나 이상의 dsRNA 분자 및 하나 이상의 펩티드를 포함하며, 각각의 dsRNA 분자는 약 25 내지 약 30 염기쌍들을 포함하며, 각각의 펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하며 아미노산 서열 KVLKQ(서열 번호: 51)를 포함하며, 상기 dsRNA 분자는 상기 펩티드에 접합된다. 몇몇 실시예들 내에서, 펩티드의 아미노산 서열은 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:
KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 33);
KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 42);
VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 43);
AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 44);
KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 45);
KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 46);
KRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 47);
RKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 41); SYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 48);
VYVYKVLKQ (서열 번호: 49); YKVLKQ (서열 번호: 50); 및
KVLKQ (서열 번호: 51).
다른 실시예들에서, dsRNA는 둘 이상의 염기쌍의 5' 오버행 또는 둘 이상의 3' 오버행을 가지며, 상기 오버행은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 한쪽 또는 양쪽 모두 상에 존재할 수 있다. 또 다른 실시예들에서, dsRNA는 오버행을 가지지 않는다. 그외 다른 실시예들에서, dsRNA는 약 25 염기쌍 내지 약 29 염기쌍들의 길이를 가지는 가닥들을 가진다. 또 다른 실시예들에서, dsRNA 분자는 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥을 포함하며 펩티드는 상기 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합된다.
다른 태양들에서, 본 개시는 동물에 하나 이상의 siRNA 분자의 투여에 적절한 약학적 조성물들을 포함하는 조성물들을 제공하며, 상기 조성물들은 하나 이상의 siRNA 분자 및 하나 이상의 펩티드를 포함하며, 각각의 dsRNA 분자는 약 25 내지 약 30 염기쌍들 사이의 이중-가닥 리보뉴클레오티드를 포함하며, 각각의 펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들이며 아미노산 서열 KVLKQ(서열 번호: 51)를 포함하며, 상기 펩티드는 dsRNA에 접합된다. 일 실시예에서, 상기 펩티드는 동물 내의 세포와 결합하는 분자에 접합된다. 다른 실시예에서, 상기 siRNA 분자는 TNF-알파 유전자의 일부분의 서열과 상동인 서열을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 개시는 siRNA 분자들과 그러한 siRNA의 폴리펩티드 접합체들을 포함하며, 상기 siRNA는 여기서 A, B1 및 B2(A:B1B2)로 지정된 3 가닥들을 포함하며, B1 및 B2는 A의 비-중복 영역들과 상보적이며, 이들과 염기쌍들(bp)을 형성한다. 따라서, 이러한 실시예들 내에서의 siRNA 분자들에 대하여, B1 및 A의 결합(annealing)에 의하여 형성된 이중-가닥 영역은 B2 및 A의 결합에 의하여 형성된 이중-가닥 영역과는 상이하다. A:B1 듀플렉스는 A:B1 듀플렉스와 A:B2 듀플렉스 사이에 위치하고, A, B1 및/또는 B2의 어느 하나 또는 양쪽 모두의 3' 말단에 있는 임의의 하나 이상의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드와는 상이한 A 가닥의 적어도 하나의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드로부터 발생한 "간격(gap)"에 의하여 A:B2 듀플렉스로부터 분리될 수 있다. 또한, A:B1 듀플렉스는 "틈새(nick)"에 의하여 A:B2 듀플렉스와 분리되어 있으며, A:B1 듀플렉스와 A:B2 듀플렉스 사이에 위치하는 A 가닥 내에 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드들은 존재하지 않으며, 존재한다고 하더라도 유일한 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드는 A, B1 및/또는 B2 가닥의 어느 하나 또는 양쪽 모두의 3' 말단에 있다.
통상적으로, 본 개시의 이러한 태양들에 따른 siRNA는 결국, 약 15 개 염기쌍들 내지 약 40 개 염기쌍들 사이를; 더 통상적으로는 약 18 개 염기쌍들 내지 약 35 개 염기쌍들 사이를; 좀 더 통상적으로는 약 20 내지 30 개의 염기쌍들을; 그리고 가장 통상적으로는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29 개의 염기쌍들을 포함한다. 상기 siRNA는 선택적으로 1 개 뉴클레오티드와 5 개 뉴클레오티드들 사이의 단일-가닥 3' 오버행을 포함할 수 있다. 가장 통상적으로, 그러한 단일-가닥 3' 오버행은 1, 2, 3 또는 4 개의 뉴클레오티드들이다.
따라서, 본 개시의 그러한 세-가닥 siRNA는 A 센스 가닥 또는 A 안티센스 가닥 중 어느 하나를 포함하며, 상기 A 가닥의 길이는 약 15 뉴클레오티드들 내지 약 50 뉴클레오티드들 사이이며; 더 통상적으로는 상기 A 가닥의 길이는 약 18 뉴클레오티드들 내지 약 40 뉴클레오티드들 사이이며; 더욱 더 통상적으로는 상기 A 가닥의 길이는 약 20 뉴클레오티드들 내지 약 32 뉴클레오티드들 사이이며; 가장 통상적으로는 A 가닥의 길이는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 뉴클레오티드들이다.
본 개시의 세-가닥 siRNA는 예를 들어, 여기에 B1과 B2로 지정된 둘 이상의 B 가닥들을 또한 포함하며, 각각의 B 가닥은 동족 A 가닥의 비-중복 영역에 상보적이며 제 1 B 가닥(B1)은 한 개 틈새 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 간격으로 제 2 B 가닥(B2)와 분리되어 있다. 상기 동족 A 가닥이 센스 가닥인지 안티센스 가닥인지의 여부는 각각의 B 가닥이 각각 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 중 어느 하나이냐에 달려있다. 여기에 기술된 각각의 B 가닥(B1, B2 등)은 개별적으로 길이가 약 1 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드들 사이에 있으며; 더 통상적으로는 길이가 약 4 뉴클레오티드들 내지 약 20 뉴클레오티드들 사이에 있으며; 더욱 더 통상적으로는 길이가 약 5 뉴클레오티드들 내지 약 16 뉴클레오티드들 사이에 있으며; 가장 통상적으로는 길이가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 뉴클레오티드들이다.
고려된 정확한 응용에 따라서, 제 1 B 가닥(B1)은 한 개 틈새 또는 한 개 간격으로 제 2 B 가닥과 분리될 수 있다. 그러한 실시예들에서, B1과 B2는 한 개 간격으로 분리되며, 상기 간격은 통상적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드들 사이에 있으며; 더 통상적으로 상기 간격은 약 1 뉴클레오티드 내지 약 10 뉴클레오티드들 사이에 있으며; 더욱 더 통상적으로 상기 간격은 약 1 뉴클레오티드 내지 약 10 뉴클레오티드들 사이에 있으며; 가장 통상적으로 상기 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 뉴클레오티드(들)이다. 각각의 B 가닥은 개별적으로 5'히드록실(즉, 5'-OH)과 종결되거나 5' 인산염(즉, 5'-PO4)과 종결될 수 있다.
본 개시의 다른 태양들 내에 하나 이상의 간격을 두거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자(들)을 채용하는 방법들과 하나 이상의 간격을 두거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자(들)을 포함하는 조성물들이 제공된다.
몇몇 실시예들 내에서, 여기에 개시된 방법들은 (a) 표적 유전자가 표적 바이러스 유전자인 표적 유전자를 선택하는 단계; (b) 표적 바이러스 유전자의 siRNA 매개 유전자 침묵에 대한 적절한 siRNA 분자(들)을 설계하고/하거나 합성하여, 상기 siRNA 분자가 한 개 간격 또는 틈새가 있는 듀플렉스를 포함하며 상기 간격 또는 틈새는 센스 가닥 또는 안티 센스 가닥 내의 어느 하나에서 나타나는 단계; (c) 상기 표적 바이러스 유전자를 발현하는 세포에 siRNA 분자를 투여하여, 상기 siRNA가 해당 표적 바이러스 mRNA와 특이적으로 결합하여 상기 세포 내에서 그 발현 수준을 감소시킬 수 있는 단계를 포함한다.
다른 실시예들 내에서, 여기에 개시된 방법들은 siRNA-매개 유전자 침묵에 대한 표적 유전자를 선택하여, 상기 표적 유전자는 내생성 유전자이며 선택적으로는 상기 표적 유전자는 해당 야생형 내생성 유전자의 하나 이상의 변이(들)을 포함하는 단계; (b) 상기 내생성 표적 유전자의 siRNA 매개 유전자 침묵에 대한 적절한 한 개 간격 또는 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자(들)을 설계하고/하거나 합성하여, 상기 siRNA 분자가 한 개 간격 또는 틈새가 있는 듀플렉스를 포함하고 상기 간격 또는 틈새는 상기 센스 가닥 또는 상기 안티-센스 가닥 중 어느 하나 내에 나타나는 단계; 및 (c) 상기 내생성 표적 유전자를 발현하는 세포에 상기 siRNA 분자를 투여하여, 상기 siRNA가 해당 내생성 표적 mRNA와 특이적으로 결합하여 상기 세포 내에서 그 발현 수준을 감소시킬 수 있는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법들은 상기 간격 또는 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA에 의하여 표적되는 모든 가능한 유전자 변이체(들)의 뉴클레오티드 서열의 선험적 지식을 필요로 하지 않음을 이해해야 할 것이다. 최초에, 상기 siRNA의 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자의 보존된 영역으로부터 선택될 수 있다.
여기에 개시된 조성물들과 방법들은 인간 호흡기 합포체 바이러스, 인간 메타폐렴바이러스(metapneumovirus), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 인간 파리인플루엔자 바이러스 2, 인간 파라인플루엔자 바이러스 3, 인간 파라인플루엔자 바이러스 4a, 인간 인플루엔자 바이러스 4b, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 리노바이러스 및 인플루엔자 C 바이러스와 같은 호흡기 바이러스들뿐만 아니라 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)와 같은 레트로바이러스들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 광범위한 표적 바이러스들의 역가를 감소시키는 데 유용하다.
본 개시의 다른 태양 내에서, 하나 이상의 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자들의 약학적 조성물들을 포함하는 조성물들을 동물에게의 투여를 포함하여 동물 내의 유전자 발현을 억제하는 방법이 제공되며, 상기 약학적 조성물들은 상기 dsRNA 분자와 펩티드를 포함하며, 각각의 dsRNA 분자는 약 25 내지 약 30 염기쌍들 사이에 있으며, 각각의 펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들 사이에 있으며, 통상적으로 아미노산 서열 KVLKQ(서열 번호: 51)을 포함하며, 각각의 dsRNA 분자는 펩티드에 접합된다.
도 1: siRNA N163에 접합된 폴리펩티드 PN277을 가지는 접합체들 dsCoP277nfR952와 dsCoP277nfR950에 대한 시험관 내 다이서를 소화(digestion)시킨 생성물들의 겔 전기영동.
도 2: 비접합된 siRNA N163 듀플렉스에 대한 다이서 뉴클레아제 처리 반응과정의 RP-HPLC 분석. (A) 미처리된 N163 듀플렉스, (B) 다이서 엔도뉴클레아제와의 1 시간 동안 배양, (C) 다이서 엔도뉴클레아제와의 2.5 시간 동안 배양, (D) 다이서 엔도뉴클레아제와의 5 시간 동안 배양, 및 (E) 다이서 엔도뉴클레아제와의 7 시간 동안 배양.
도 3: 도 2에 도시된 비접합된 siRNA N163 듀플렉스에 대한 다이서 엔도뉴클레아제 처리 반응과정의 RP-HPLC 분석의 차트.
도 4: 비접합된 N163의 7 시간 다이서 소화의 ESI-MS 분석.
도 5: siRNA N163과 접합된 폴리펩티드 PN857을 가지는 접합된 siRNA에 대한 다이서 엔도뉴클레아제 처리의 ESI-MS 분석. (a) 다이서 엔도뉴클레아제의 존재 없이 8 시간 대조 및 (b) 접합체의 8 시간 다이서 엔도뉴클레아제 소화.
서열 번호: 1은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KRRQRRR이다.
서열 번호: 2는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK이다.
서열 번호: 3은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD이다.
서열 번호: 4는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP이다.
서열 번호: 5는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 AAVLLPVLLPVLLAAP이다.
서열 번호: 6은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 VTVLALGALAGVGVG이다.
서열 번호: 7은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GALFLGWLGAAGSTMGA이다.
서열 번호: 8은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 MGLGLHLLVLAAALQGA이다.
서열 번호: 9는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP이다.
서열 번호: 10은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL이다.
서열 번호: 11은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 TPPKKKRKVEDPKKKK이다.
서열 번호: 12는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 RRRRRRR이다.
서열 번호: 13은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KLALKLALKALKAALKLA이다.
서열 번호: 14는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GLFGAIAGFIENGWEG이다.
서열 번호: 15는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 FFGAVIGTIALGVATA이다.
서열 번호: 16은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 FLGFLLGVGSAIASGV이다.
서열 번호: 17은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GVFVLGFLGFLATAGS이다.
서열 번호: 18은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GAAIGLAWIPYFGPAA이다.
서열 번호: 19는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC이다.
서열 번호: 20은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC이다.
서열 번호: 21은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC이다.
서열 번호: 22는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC이다.
서열 번호: 23은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC이다.
서열 번호: 24는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC이다.
서열 번호: 25는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCS VPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC이다.
서열 번호: 26은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC이다.
서열 번호: 27은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR이다.
서열 번호: 28은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GKINLKALAALAKKIL이다.
서열 번호: 29는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 RVIRVWFQNKRCKDKK이다.
서열 번호: 30은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ이다.
서열 번호: 31은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK이다.
서열 번호: 33은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 35는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 5'-AUGGUGUGGGUGAGGAGCACAUGGGUG-3'이다.
서열 번호: 36은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3'이다.
서열 번호: 37은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 41은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 RKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 42는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적 합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 43은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 44는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 45는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 46은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 47은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 48은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 SYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 49는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 VYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 50은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 YKVLKQ이다.
서열 번호: 51은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KVLKQ이다.
서열 번호: 52는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적 합한 대표적인 펩티드의 아미노산 서열 KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ이다.
서열 번호: 53은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCUU-3'이다.
서열 번호: 54는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 3'-UUCGGACAUGGAGUAGAUGAG-5'이다.
서열 번호: 55는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GCCUCUUCUCCUUCCUGAUCGUGdGdC-3'이다.
서열 번호: 56은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 3'-GUCGGAGAAGAGGAAGGACUAGCACCG-5'이다.
서열 번호: 57은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GCCUGCUGCACUUUGGAGUGAUCdGdG-3'이다.
서열 번호: 58은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 3'-GACGGACGACGUGAAACCUCACUAGCC-5'이다.
서열 번호: 59는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3'이 다.
서열 번호: 60은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 3'-GUGGGUACACGAGGAGUGGGUGUGGUA-5'이다.
서열 번호: 61은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-ACCUCAUCUACUCCCAGGUCCUCdTdT-3'이다.
서열 번호: 62는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 3'-CAUGGAGUAGAUGAGGGUCCAGGAGAA-5'이다.
서열 번호: 63은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC-3'이다.
서열 번호: 64는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU-3'이다.
서열 번호: 65는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-AGACAGCGACCAAAAGAAUUCGGdAdU-3'이다.
서열 번호: 66은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적 합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-AUCCGAAUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT-3'이다.
서열 번호: 67은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-AUGAAGAUCUGUUCCACCAUUGAdAdG-3'이다.
서열 번호: 68은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-CUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT-3'이다.
서열 번호: 69는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GAUCUGUUCCACCAUUGAAGAACdUdC-3'이다.
서열 번호: 70은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GAGUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT-3'이다.
서열 번호: 71은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-UUGAGGAGUGCCUGAUUAAUGAUdCdC-3'이다.
서열 번호: 72는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GGAUCAUUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT-3'이다.
서열 번호: 73은 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG-3'이다.
서열 번호: 74는 여기에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 펩티드의 뉴클레오티드 서열 5'-CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT-3'이다.
서열 번호: 75는 표 2에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 25량체 B 가닥 서열 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3'의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호: 76은 표 2에 기술된 siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 데 적합한 대표적인 27량체 A 가닥 서열 3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC-5'의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호: 77 내지 132는 표 2에 기술된 간격이 있는(gapped) siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 대표적인 폴리뉴클레오티드들의 A, B1 및 B2 가닥들의 뉴클레오티드 서열들이다.
서열 번호: 34, 38 내지 40, 133 및 166은 여기에 기술된 틈새가 있는(nicked) siRNA-펩티드 접합체들을 발생시키는 대표적인 폴리뉴클레오티드들의 A, B1 및 B2 가닥들의 뉴클레오티드 서열들이다.
본 개시는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 조합하여 채용하는 단 간섭 핵산(siNA) 또는 그 전구체는 인간과 같은 포유류에 생체 내로 투여되는 경우에 개선된 전달을 보이며, 안정성을 증진시키고/증진시키거나 독성을 감소시켰다는 관찰 상에 기초를 둔다. 따라서, 여기에 개시된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 특히, siNA들을 포함하는 폴리뉴클레오티드들과 그 전구체들의 세포간 전달 또는 섭취를 증진시키는 능력으로 인하여 선택되는 천연 폴리펩티드들 또는 인공 폴리펩티드들일 수 있다.
상기 siNA와 본 발명의 조성물들은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들과 혼합되거나 복합되거나 또는 접합되어 나출된(naked) siNA(즉, 전달-증진 폴리펩티드의 존재가 없는 siNA)와 표적 세포들을 접촉시켜서 발생하는 전달과 비교하여 상기 siNA의 세포간 전달을 증진시키는 조성물을 형성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 선택과 설계
본 발명의 몇몇 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 히스톤 단백질 또는 그 펩티드 단편, 유도체, 유사체 또는 접합체이다. 몇몇 실시예들 내에서, siNA는 예를 들어, 하나 이상의 하기 히스톤들 중 하나의 히스톤 단백질의 부분 서열에 적어도 부분적으로 해당하는 하나 이상의 전장 히스톤 단백질(들) 또는 폴리펩티드(들)과 혼합, 복합되거나 접합된다: 히스톤 H1, 히스톤 H2A, 히스톤 H2B, 히스톤 H3 또는 히스톤 H4 또는 통상적으로 천연 히스톤 단백질의 적어도 5 내지 10 또는 10 내지 20 개의 인접한 잔기들인 히스톤 단백질의 적어도 부분 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 단편들 또는 그 유도체들.
더 상세한 실시예들에서, siRNA/히스톤 혼합물, 복합체 또는 접합체는 실질 적으로 양친매성 화합물들이 존재하지 않는다. 다른 상세한 실시예들에서, 히스톤 단백질 또는 폴리펩티드와 혼합, 복합되거나 접합된 siNA는 예를 들어, 30 개 이하의 뉴클레오티드들을 가지는 이중-나선의 RNA인 이중-나선 RNA를 포함할 것이다. 대표적인 실시예들에서, 히스톤 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 여기 아래에 기술된 PN73으로 지정된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드가 예시하는 바와 같이 히스톤 H2B의 단편을 포함한다. 또 다른 상세한 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 페질화되어(pegylated) 특히, 생체 내 투여의 맥락에서 안정성 및/또는 효능을 개선할 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 양친매성 아미노산 서열을 포함하도록 선택되거나 합리적으로 설계된다. 예를 들어, 유용한 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 대전된 서열 구역 또는 모티프(motif)를 형성하는 복수개의 대전된 아미노산 잔기들에 연결되는 소수성 서열 구역이나 모티프를 형성하는 복수개의 비-극성 또는 소수성 아미노산 잔기들을 포함하여 양친매성 펩티드를 배출하도록 선택될 수 있다.
다른 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 단백질 형질도입 구역 또는 모티프 및 융합생성(fusogenic) 펩티드 구역 또는 모티프를 포함하도록 선택된다. 단백질 형질도입 구역은 세포막으로 삽입되고 바람직하게는 세포막을 관통할 수 있는 펩티드 서열이다. 융합생성 펩티드는 낮은 pH에서 증진될 수 있는 예를 들어, 원형질막 또는 엔도솜을 둘러싸는 막과 같은 지질 막을 불안정하게 하는 펩티드이다. 대표적인 융합생성 구역이나 모티프들은 광범위한 바이러스 융합 단백질들과 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 4(FGF-4)과 같은 다른 단백질들 내에서 발견된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 합리적으로 설계하기 위하여, 단백질 형질도입 구역은 세포막을 통하여 세포로의 핵산의 입장을 용이하게 할 모티프로서 채용된다. 몇몇 실시예들에서, 수송된 핵산은 엔도솜 내에 캡슐화될 것이다. 엔도솜들의 내부는 낮은 pH를 가지고 있어서 융합생성 펩티드 모티프가 엔도솜의 막을 불안하게 한다. 엔도솜 막의 불안정과 파손은 세포질로의 siNA의 방출이 일어나게 하여 상기 siNA가 RISC 복합체와 결합하고 그 표적 mRNA로 방향을 지을 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들로의 선택적 혼입을 위한 단백질 형질도입 구역들의 예들은 하기를 포함한다:
1. TAT 단백질 형질도입 영역(PTD)(서열 번호: 1) KRRQRRR;
2. 페네트라틴(penetratin) PTD(서열 번호: 2) RQIKIWFQNRRMKWKK;
3. VP22 PTD(서열 번호: 3) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;
4. 카포시(Kaposi) FGF 신호 서열들(서열 번호: 4) AAVALLPAVLLALLAP 및 서열 번호: 5) AAVLLPVLLPVLLAAP
5. 인간 β3 인테그린 신호 서열(서열 번호: 6) VTVLALGALAGVGVG;
6. gp41 융합 서열(서열 번호: 7) GALFLGWLGAAGSTMGA;
7. 카이만 크로코딜러스(Caiman crocodylus) Ig(v) 경사슬(서열 번호: 8) MGLGLHLLVLAAALQGA;
8. hCT-유도된 펩티드(서열 번호: 9) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;
9. 트랜스포탄(서열 번호: 10) GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL;
10. 롤리고머(Loligomer)(서열 번호: 11) TPPKKKRKVEDPKKKK;
11. 아르기닌 펩티드(서열 번호: 12) RRRRRRR; 및
12. 양친매성 모델 펩티드(서열 번호: 13) KLALKLALKALKAALKLA.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들로의 선택적 혼입을 위한 바이러스 융합 펩티드 융합생성 구역들의 예들은 하기를 포함한다:
1. 인플루엔자 HA2(서열 번호: 14) GLFGAIAGFIENGWEG;
2. 센다이 F1(서열 번호: 15) FFGAVIGTIALGVATA;
3. 호흡기 합포체 바이러스 F1(서열 번호: 16) FLGFLLGVGSAIASGV;
4. HIV gp41(서열 번호: 17) GVFVLGFLGFLATAGS; 및
5. 에볼라 GP2 (서열 번호: 18) GAAIGLAWIPYFGPAA.
본 발명의 또 다른 실시예들 내에서, 본 발명의 방법들과 조성물들 내에서 폴리펩티드-siNA 복합체 형성을 용이하게 하고/하거나 siNA들의 전달을 증진시키는 DNA-결합 구역 또는 모티프를 혼입시키는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들이 제공된다. 이러한 문맥 내에서 대표적인 DNA 결합 구역들은 하기 표 1에서 확인된 DNA-결합 조절 단백질들 및 다른 단백질들에 대하여 기술된 바와 같은 다양한 "징크 핑거(zinc finger)" 구역들을 포함한다(예컨대, Simpson, et al., J. Biol . Chem. 278:28011-28018, 2003).
하기 표 1은 다양한 DNA-결합 특성들의 대표적인 징크 핑거 모티프들을 나타 낸다.
Figure 112008040121202-PCT00001
*상기 표는 본 발명에 의하여 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 선택하고 설계하는 데 사용될 수 있는 C-x(2,4)-C-x(12)-H-x(3)-H(서열 번호: 32) 모티프 패턴에 의하여 특성화되는 이중 가닥 DNA 결합에 대한 보존적인 징크 핑거 모티프를 실증한다.
**표 1에서 Sp1, Sp2, Sp3, Sp4, DrosBtd, DrosSp, CeT22C8.5 및 Y4pB1A.4에 대하여 보이고 있는 서열들은 여기에 각각 서열 번호: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및 26으로 지정되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들을 구성하는 데 유용한 다른 DNA 결합 구역들은 예를 들어, HIV Tat 단백질 서열의 부분들을 포함한다(하기 예들 참조).
하기에 기술된 본 발명의 대표적인 실시예들 내에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 siNA들의 표적 세포들로의 증진된 전달을 매개하는 데 효과적인 단일 폴리펩티드로의 선행 구조적 구성요소들, 구역들 또는 모티프들 중 임의의 것을 조합하여 합리적으로 설계되고 구성될 수 있다. 예를 들어, TAT 폴리펩티드의 단백질 형질도입 구역은 HA2라고 명명된 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 단백질의 N-말단 20 개 아미노산들에 융합되어 여기의 하나의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 배출한다. 다양한 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 구조체들이 당해 개시 내에 제공되어, 본 발명의 개념들이 siNA 전달을 증진시키기 위하여 효과적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들의 다양한 결합체를 창출하고 사용할 수 있도록 광범위하게 응용될 수 있다는 것을 이끌어 내고 있다.
본 발명 내의 또 다른 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 하기의 펩티드들로부터 선택될 수 있다: WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (서열 번호: 27); GKINLKALAALAKKIL (서열 번호: 28), RVIRVWFQNKRCKDKK (서열 번호: 29), GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (서열 번호: 30), GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (서열 번호: 31), 폴리 Lys-Trp, 4:1, 분자량 20,000 내지 50,000; 및 폴리 Orn-Trp, 4:1, 분자량 20,000 내지 50,000. 여기의 조성물들과 방법들 내에서 유용한 다른 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 멜리틴 단백질 서열의 전부 또는 일부를 포함한다.
또 다른 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들이 하기 예들에서 확인되었다. 이러한 펩티드들 중 하나 또는 조합을 선택하거나 조합하여 본 발명의 방법들과 조성물들 내에서 siNA들의 세포간 전달을 유도하거나 용이하게 하는 효과적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 시약들을 생성할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드, siRNA 및 지질을 포함하는 조성물들
더 상세한 태양들에서, 하나 이상의 siRNA와 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드를 포함하는 혼합물들, 복합체들 및/또는 접합체들은 LIPOFECTIN
Figure 112008040121202-PCT00002
과 같은 양이온 지질과 선택적으로 조합(예컨대, 혼합되거나 복합된다)될 수 있다. 이러한 맥락에서 siRNA와 단독으로 복합되거나 접합되는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 RNAi에 의한 유전자 침묵을 매개하는 데 충분한 siNA의 전달을 달성하게 될 것이라는 것이 여기서 뜻하지 않게 개시된다. siRNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 복합체 또는 접합체는 리포펙틴과 같은 양이온 지질과 혼합되거나 복합되는 경우에, siNA 전달 및 유전자 침묵의 매개를 위한 더 나은 활성을 보일 것이라는 것도 여기에 더 개시된다.
폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드, siRNA 및 양이온 지질로 구성된 이러한 조성물들을 생성하기 위하여, siRNA와 펩티드는 세포 배양 배지와 같은 적절한 배지 내에 우선 혼합될 수 있으며, 이후 상기 양이온 지질은 상기 혼합물에 첨가되어 siRNA/전달 펩티드/양이온 지질 조성물을 형성한다. 선택적으로, 펩티드와 양이온 지질은 세포 배양 배지와 같은 적절한 배지 내에 우선 혼합될 수 있으며, 이후 siRNA가 첨가되어 siRNA/전달 펩티드/양이온 지질 조성물을 형성할 수 있다.
본 발명의 이러한 태양들 내에서 유용한 양이온 지질들의 예들은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판(1,2-bis(oleoyloxy)-3-3-(trimethylammonium)propane), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드(1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium bromide)와 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄 트리플루오르아세테이트(2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoracetate), 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스페르밀)-프로필아미드(1,3-dioleoyloxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid), 5-카복시스페르밀글리신 디옥타데실아미드(5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide), 테트라메틸테트라팔미토일 스페르민(tetramethyltetrapalmitoyl spermine), 테트라메틸테트라올레일 스페르민(tetramethyltetraoleyl spermine), 테트라메틸테트라라우릴 스페르민(tetramethyltetralauryl spermine), 테트라메틸테트라미리스틸 스페르민(tetramethyltetramyristyl spermine) 및 테트라메틸디올레일 스페르민(tetramethyldioleyl spermine)을 포함한다. DOTMA(N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드), DOTAP(1,2-비스(올레오일옥시)-3-3-(트리메틸암모늄)프로판), DMRIE(1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드) 또는 DDAB(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드). 다가 양이온 지질들은 구체적으로 DOSPA(2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르미네카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄 트리플루오르아세테이트) 및 DOSPER(1,3-디올레오일옥시-2-(6-카복시스페르밀)-프로필아미드)와 TMTPS(테트라메틸테트라팔미토일 스페르민), TMTOS(테트라메틸테트라올레일 스페르민), TMTLS(테트라메틸테트라라우릴 스페르민), TMTMS(테트라메틸테트라미리스틸 스페르민) 및 TMDOS(테트라메틸디올레일 스페르민)DOGS(디옥타데실-아미도글리실스페르민(TRANSFECTAM
Figure 112008040121202-PCT00003
)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 리포스페르민들을 포함한다. 다른 유용한 양이온 지질들은 예를 들어, U.S. Patent No. 6,733,777; U.S. Patent No. 6,376,248; U.S. Patent No. 5,736,392; U.S. Patent No. 5,686,958; U.S. Patent No. 5,334,761 및 U.S. Patent No. 5,459,127에 기술되어 있다.
양이온 지질들은 DOPE(디올레오일포스파티딜에탄올아민), DPhPE(디피타노일포스파티딜에탄올아민) 또는 콜레스테롤과 같은 지질들인 특히 중성 지질들인 비-양이온 지질들과 선택적으로 조합된다. DOSPA와 DOPE의 3:1(w/w) 혼합물 또는 DOTMA와 DOPE(LIPOFECTIN
Figure 112008040121202-PCT00004
, Invitrogen)의 1:1(w/w) 혼합물로 구성된 양이온 지질 조성물은 본 발명의 조성물들을 형질감염시키는 데 일반적으로 유용하다. 바람직한 형질감염 조성물들은 고등 진핵 세포 계통의 실질적인 형질감염을 유도하는 조성물들이다.
단 간섭 핵산들( siNAs )의 선택, 설계 및 설계
대표적인 실시예들에서, 당해 개시는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 혼합되거나 복합되거나 또는 접합되는 단 간섭 핵산(siNA), 단 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(mRNA), 또는 단 헤어핀 RNA와 같은 소 핵산 분자를 포함하는 조성물들을 특징으로 한다.
여기에 사용된 "단 간섭 핵산", "siNA", "단 간섭 RNA", "siRNA", "단 간섭 핵산 분자", "단 간섭 올리고뉴클레오티드 분자" 또는 "화학적으로 변형된 단 간섭 핵산 분자"는 예를 들어, 서열 특이적 방식으로 RNA 간섭 "RNAi" 또는 유전자 침묵을 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제하거나 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 의미한다. 대표적인 실시예들 내에서, siNA는 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역들을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자이며, 상기 안티센스 영역은 발현을 하향 조절하기 위한 표적 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이나 그 부분을 포함하며, 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 그 부분에 해당하는(즉, 서열상 실질적으로 동일한) 뉴클레오티드을 포함한다.
"siNA"는 예를 들어 길이가 짧은 이중 가닥 핵산(또는 선택적으로는 그것의 길이가 더 긴 전구체)이기도 하고 표적 세포들 내의 수용할 수 없을 정도로 독성을 지니지 않은 소 간섭 핵산을 의미한다. 본 발명 내의 유용한 siNA들의 길이는 몇몇 실시예들에서 약 21 내지 23 bp 길이로 최적화될 것이다. 그러나, siRNA들을 포함하여 유용한 siNA들의 길이에는 특정한 제한이 없다. 예를 들어, siNA들은 표적 세포에 전달 시 또는 전달 후에 존재하며 유전자 침묵 활성을 가할 수 있을 siNA의 최종 또는 가공된 형태와는 실질적으로 상이한 전구체 형태로 세포들에게 최초에 제시될 수 있다. siNA들의 전구체 형태들은 예를 들어, 유전자 침묵을 매개하는 세포 내에서 활성인 siNA를 생성해 내는 전달 시 또는 전달 후에 가공, 분해, 변경 또는 쪼개지는 전구체 서열 구성요소들을 포함할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시예들에서, 본 발명의 유용한 siNA들은 예를 들어, 표적 세포 내에서 활성이며 가공된 siNA를 생성해 낼 수 있는 약 100 내지 200 개의 염기쌍, 50 내지 100 개의 염기쌍 또는 약 50 개 미만의 염기쌍의 전구체 길이를 가질 것이다. 다른 실시예들에서, 유용한 siNA 또는 siNA 전구체는 길이가 약 10 내지 49 bp, 15 내지 35 bp 또는 약 21 내지 30 bp일 것이다.
본 개시의 대표적인 siNA 분자들은 화학적으로 합성된다. 올리고뉴클레오티드들은 예를 들어, Caruthers, et al., Methods in Enzymology 211:3-19, 1992; Thompson, et al., International PCT Publication No. WO 99/54459; Wincott, et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995; Wincott, et al., Methods Mol . Bio. 74:59, 1997; Brennan, et al., Biotechnol Bioeng. 61:33-45, 1998; 및 Brennan, U.S. Patent No. 6,001,311에 기술된 업계에 알려진 프로토콜들을 이용하여 합성된다. 화학적으로 변형될 수 있는, 본 발명의 siNA 분자의 합성은:(a) siNA 분자의 두 개의 상보적 가닥들의 합성; (b) 이중-가닥 siNA 분자들을 얻기에 적합한 환경 하에서 상기 두 개의 상보적 가닥들의 결합을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기siNA 분자의 상기 상보적인 가닥들의 합성은 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것이다. 또 다른 실시예에서, 상기 siNA 분자의 상기 두 개의 상보적인 가닥들의 합성은 고체상 직렬(tandem) 올리고뉴클레오티드 합성에 의한 것이다.
올리고뉴클레오티드들(예컨대, 리보뉴클레오티드들이 부족한 몇몇 변형된 올리고뉴클레오티드들 또는 올리고뉴클레오티드들의 부분들)은 예를 들어, Caruthers, et al., Methods in Enzymology 211:3-19, 1992; Thompson, et al., International PCT Publication No. WO 99/54459; Wincott, et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995; Wincott, et al., Methods Mol . Bio. 74:59, 1997; Brennan, et al., Biotechnol Bioeng. 61:33-45, 1998; 및 Brennan, U.S. Patent No. 6,001,311에 기술된 바와 같이 업계에 알려진 프로토콜들을 이용하여 합성된다. 본 발명의 몇몇 siNA 분자들을 포함하는 RNA의 합성은 예를 들어, Usman, et al., J. Am . Chem . Soc. 109:7845, 1987; Scaringe, et al., Nucleic Acids Res. 18:5433, 1990; and Wincott, et al., Nucleic Acids Res. 23:2677-2684, 1995; Wincott, et al., Methods Mol Bio. 74:59, 1997에 기술된 바와 같은 일반적인 절차들을 따른다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 몇몇 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 siNA들의 큰 핵산 전구체들을 포함하여 통상적인 siNA들보다 더 큰 핵산 분자들의 전달을 용이하게 하는 데 사용된다. 예를 들어, 여기의 방법들과 조성물들은 원하는 siNA들에 "전구체들"을 제시하는 큰 핵산들의 전달을 증진시키기 위하여 채용될 수 있으며, 전구체 아미노산들은 쪼개지거나 그렇지 않으면 표적 세포에 전달 전, 전달되는 동안 또는 전달 후에 가공되어 표적 세포 내에서 유전자 발현을 조절하는 활성 siNA를 형성할 수 있다. 예를 들어, siNA 전구체 폴리뉴클레오티드는 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역들을 포함하는 두 개이상의 루프 구조들과 하나의 줄기를 가지는 원형의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드로서 선택될 수 있으며, 상기 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열이나 그 일부를 포함하며, 상기 원형 폴리뉴클레오티드는 생체 내 또는 시험관 내 중 어느 하나에서 가공되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siNA 분자를 발생시킬 수 있다.
포유류 세포들 내에서, 30 염기쌍의 길이를 초과하는 dsRNA들은 주로 인터페론에 의하여 유도되는 dsRNA-의존성 키나아제 PKR과 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타아제(oligoadenylate synthase)를 활성화할 수 있다. 활성화된 PKR은 번역 인자인 진핵 개시(initiation) 인자 2α(eIF2α)의 인산화에 의한 일반적인 번역을 억제하는 반면에, 2'-5'-올리고아데닐레이트 신타아제는 RNA가수분해효소 L.의 활성화를 통한 비특이적 mRNA 분해를 유발한다. 주로 30 염기쌍 미만이고, 가장 흔하게는 약 17 내지 19, 19 내지 21 또는 21 내지 23 염기쌍인 작은 크기(특히 비-전구체 형태들이라 칭함)로 인하여, 본 발명의 siNA들은 인터페론 반응의 활성화를 회피한다.
길이가 긴 dsRNA의 비특이적 효과와는 현저히 다르게, siRNA는 포유류 시스템 내의 선택적 유전자 침묵을 매개할 수 있다. 줄기 내의 짧은 루프와 19 내지 27 염기쌍의 헤어핀 RNA들도 이중-가닥 줄기 내의 서열과 상동인 유전자들의 발현을 선택적으로 침묵시킨다. 포유류 세포들은 짧은 헤어핀 RNA를 siRNA로 변환시켜 선택적인 유전자 침묵을 매개할 수 있다.
RISC는 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 가지는 단일 가닥 RNA의 쪼개짐을 매개한다. 표적 RNA의 쪼개짐은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 가운데에서 발생한다. 연구에 의하면 21 뉴클레오티드 siRNA 듀플렉스들은 2 뉴클레오티드 3'-오버행을 포함하는 경우에 가장 활성이 있는 것을 보여준다. 또한, 하나 또는 양쪽 siRNA 가닥들을 2'-디옥시(2'-H) 또는 2'-O-메틸 뉴클레오티드들로 완전히 치환하게 되면 RNAi 활성을 실질적으로 감소시키는 반면에, 3'-말단 siRNA 오버행 뉴클레오티드들을 디옥시 뉴클레오티드들(2'-H)로 치환하게 되면 견뎌내는 것으로 보고되었다.
연구에 의하면 두 개의 뉴클레오티드 3' 오버행들을 가지는 21량체 siRNA 듀플렉스의 3'-오버행 세그먼트들을 디옥시리보뉴클레오티드들로 교체하면 RNAi 활성에 미치는 악성 효과(adverse effect)를 가지지 않는 것으로 보고되었다. siRNA의 각각의 말단 상의 최대 4 개의 뉴클레오티드들을 디옥시리보뉴클레오티드들로 교체하면 잘 견뎌내는 것으로 보고된 반면에, 디옥시리보뉴클레오티드들로 완전히 치환하게 되면 RNAi 활성을 전혀 일으키지 않는다.
본 발명의 몇몇 실시예들에서, dsRNA는 둘 이상의 bp의 5' 오버행 또는 2 이상의 bp의 3' 오버행을 가지며, 상기 오버행은 센스 또는 안티센스 가닥 중 어느 하나 상에 존재할 수 있다. 몇몇 실시예들에서, dsRNA는 오버행을 전혀 가지지 않는다. 몇몇 실시예들에서, dsRNA는 27 내지 29 bp의 길이를 가진다. 몇몇 실시예들에서, dsRNA 분자는 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥을 포함하며, 펩티드는 상기 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합된다.
또한, siNa들은 표적 세포들 내에서 단일 또는 다중 siNA들을 엔코딩하며 그 발현을 지시하는 폴리뉴클레오티드 벡터에 의하여 발현되는 단일 또는 다중 전사 생성물들로 전달될 수 있다. 이러한 실시예들에서, 표적 세포 내에서 발현되는 siRNA들의 최종 전사 생성물의 이중 가닥 부분은 예를 들어, 길이가 15 내지 49 bp, 15 내지 35 bp 또는 약 21 내지 30 bp일 수 있다. 대표적인 실시예들 내에서, 두 개 가닥들이 쌍을 이루는 siNA들의 이중-가닥 부분들은 완전히 쌍을 이루는 뉴클레오티드 세그먼트들에 한정되지 않으며, 부정합(해당 뉴클레오티드들이 상보적이지 않음), 부풀음(한 가닥 상에 해당 상보적인 뉴클레오티드가 부족함), 오버행 등으로 인하여 쌍을 이루지 않은(nonpairing) 부분들을 포함할 수 있다. 쌍을 이루지 않은 부분들은 siNA 형성에 간섭하지 않을 정도로 포함될 수 있다. 더 상세한 실시예들에서, "부풀음"은 1 내지 2 개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드들을 포함할 수 있으며, 두 가닥들이 쌍을 이루는 siNA들의 이중 가닥 영역은 약 1 내지 7 개 또는 약 1 내지 5 개의 부풀음을 포함할 수 있다. 또한, siNA들의 이중-가닥 영역 내에 포함된 "부정합" 부분들은 약 1 내지 7 또는 약 1 내지 5의 숫자로 존재할 수 있다. 부정합의 경우 가장 흔하게는 상기 뉴클레오티드들의 하나는 구아닌이며, 다른 하나는 우라실이다. 그러한 부정합은 예를 들어, 센스 RNA를 코딩하는 해당 DNA 내에서의 C가 T로, G가 A로의 돌연변이 또는 그 혼합으로 원인을 돌릴 수 있지만, 다른 원인들도 고려된다. 또한, 본 발명에서, 두 가닥들이 쌍을 이루는 siNA들의 이중-가닥 영역은 특정된 근사한 수치 범위에서 부풀음과 부정합된 부분들 양쪽 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 siNA들의 터미널 구조는 siNA가 표적 유전자들의 발현을 침묵시키는 활성을 유지하는 한 무디거나(blunt) 응집성(cohesive)(오버행)일 수 있다. 상기 응집성(오버행) 말단 구조는 다른 이들이 보고한 바와 같이 3' 오버행에만 한정되지 않는다. 오히려, RNAi에 의한 것과 같이 유전자 침묵 효과를 유도할 수 있는 한 5' 오버행 구조는 포함될 수 있다. 또한, 오버행 뉴클레오티드들의 숫자는 2 또는 3 개의 뉴클레오티드들의 보고된 제한들에 한정되지 않지만, 상기 오버행이 siNA의 유전자 침묵 활성을 손상하지 않는 한 임의의 숫자일 수 있다. 예를 들어, 오버행들은 약 1 내지 8 개의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있지만, 더 흔하게는 약 2 내지 4 개의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.
응집성(오버행) 말단 구조를 가지는 siNA들의 길이는 쌍을 이루는 듀플렉스 부분과 각각의 말단의 임의의 오버행하는 부분으로 표시될 수 있다. 예를 들어, 2-bp 3' 오버행이 있는 25/27량체 siNA 듀플렉스는 25량체 센스 가닥과 27량체 안티센스 가닥을 가지며, 상기 쌍을 이루는 부분은 25 bp의 길이를 가진다.
또한, 상기 오버행 서열은 표적 유전자에 낮은 특이성을 가질 수 있으므로, 상기 표적 유전자 서열에 반드시 상보적(안티센스) 또는 동일(센스) 하지는 않다. 또한, 상기 siNA가 상기 표적 유전자상에 유전자 침묵 효과를 유지할 수 있는 한, 예를 들어, 일 말단의 오버행하는 부분에서 저 분자량 구조(예를 들어, tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA 같은 천연 RNA 분자 또는 인공 RNA 분자)를 포함할 수 있다.
또한, siNA들의 터미널 구조는 이중-가닥 핵산의 한쪽 면의 말단부들이 예컨대, 링커 RNA와 같은 링커 핵산에 의해 연결되는 줄기-루프(stem-loop) 구조를 가질 수 있다. 상기 이중-가닥 영역(줄기-루프 부분)의 길이는 예를 들어, 15 내지 49 bp, 종종 15 내지 35 bp, 및 더 흔하게는 약 21 내지 30 bp 길이일 수 있다. 또한, 표적 세포 내에서 발현되는 siNA들의 최종 전사 생성물인 이중-가닥 영역의 길이는 예를 들어, 약 15 내지 49 bp, 15 내지 35 bp, 또는 약 21 내지 30 bp 길이일 수 있다. 링커 세그먼트들을 이용하면, 링커가 줄기 부분의 쌍 이룸을 방해하지 않는 한 링커의 길이에 특정한 제한은 없다. 예를 들어, 줄기 부분의 안정한 쌍 이룸과 이 부분을 코딩하는 DNA들 사이의 재조합을 억제하기 위하여, 상기 링커 부분은 클로버-잎(clover-leaf) tRNA 구조를 가질 수 있다. 상기 링커가 줄기 부분의 쌍 이룸을 방해하게 될 길이를 가진다 해도, 예를 들어, 전구체 RNA의 성숙한 RNA로의 가공 도중에 인트론들이 절제되도록 상기 링커 부분이 인트론들을 포함하도록 구성하는 것이 가능하며, 이로 인하여 상기 줄기 부분이 쌍을 이루게 된다. 줄기-루프 siRNA의 경우에, 루프 구조를 가지지 않는 RNA의 어느 한쪽 말단(머리 또는 꼬리)은 저 분자량 RNA를 가질 수 있다. 상술한 바와 같이, 이러한 저 분자량 RNA들은 tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA와 같은 천연 RNA 분자 또는 인공 RNA 분자를 포함할 수 있다.
상기 siNA는 또한 표적 핵산 분자 또는 그 일 부분의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며(예를 들어, 그러한 siNA 분자는 상기 표적 핵산 서열 또는 그 일 부분에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 siNA 분자 내에서 그 존재를 필요로 하지 않는다), 상기 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 5'-인산염(예를 들어, Martinez, et al., Cell. 110:563-574, 2002, 및 Schwarz, et al., Molecular Cell 70:537-568, 2002 참조)또는 5',3'-이인산염(diphosphate)과 같은 터미널 인산염 기(group)를 더 포함할 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, siNA 분자라는 용어는 자연발생적 RNA 또는 DNA만 포함하는 분자들에 한정되는 것이 아니고, 화학적으로-변형된 뉴클레오티드들과 비-뉴클레오티드들도 포함한다.
몇몇 실시예들에서, 본 발명의 짧은 간섭 핵산 분자들은 뉴클레오티드들을 포함하는 2'-히드록시(2'-OH)가 부족하다. 몇몇 실시예들에서, 단 간섭 핵산들은 RNAi를 매개하기 위한 2'-히드록시 기를 가지는 뉴클레오티드들의 존재를 필요로 하지 않으며, 본 발명의 단 간섭 핵산 분자들은 선택적으로 임의의 리보뉴클레오티드들(예컨대, 2'-OH 기를 가지는 뉴클레오티드들)을 포함하지 않는다. 그러나, RNAi를 지원하는 siNA 분자 내에서 리보뉴클레오티드들의 존재를 필요로 하지 않는 그러한 siNA 분자들은 부착된 링커나 링커들 또는 2'-OH 기들을 가지는 하나 이상의 뉴클레오티드들을 포함하는 다른 부착 또는 결합된 기들, 모이어티들(moieties) 또는 사슬들을 가질 수 있다. 선택적으로, siNA 분자들은 뉴클레오티드 위치들의 약 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50 %에서 리보뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, siNA라는 용어는 예를 들어, 단 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(mRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 단 간섭 올리고뉴클레오티드, 단 간섭 핵산, 단 간섭 변형된 올리고뉴클레오티드, 화학적으로-변형된 siRNA, 전사 후 유전자 침묵 RNA(ptgsRNA) 등과 같은 서열 특이적 RNAi를 매개할 수 있는 핵산 분자들을 설명하는 데 사용되는 다른 용어들과 동등함을 의미한다.
다른 실시예들에서, 본 발명 내에서 사용되는 siNA 분자들은 분리된 센스 및 안티센스 서열들 또는 영역들을 포함할 수 있으며, 상기 센스 및 안티센스 영역들은 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커 분자들에 의해 공유적으로 연결되거나 또한 이온 상호작용, 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용 및/또는 쌓임 상호작용(stacking interaction)에 의해 비공유적으로 연결된다.
"안티센스 RNA"는 표적 유전자 mRNA에 상보적인 서열을 가지는 RNA 가닥이며 상기 표적 유전자 mRNA와 결합하여 RNAi를 유도하는 것으로 생각된다. "센스 RNA"는 안티센스 RNA에 상보적이며 그 상보적 안티센스 RNA에 결합되어 siRNA를 형성하는 서열을 가진다. 이러한 안티센스 및 센스 RNA들은 통상적으로 RNA 합성기로 합성되었다.
여기에 사용된 "RNAi 구조체(construct)"는 명세서 전반에 걸쳐서 소 간섭 RNA들(siRNAs), 헤어핀 RNA들 및 생체 내에서 쪼개어져 siRNA들을 형성할 수 있는 다른 RNA 종들을 포함하는 데 사용되는 일반적인 용어이다. 여기의 RNAi 구조체들은 또한 세포들 내에서 dsRNA들 또는 헤어핀 RNA들을 형성하는 전사체들 및/또는 생체 내에서 siRNA들을 생성할 수 있는 전사체들을 발생시킬 수 있는 발현 벡터들(RNAi 발현 벡터들이라고도 칭함). 선택적으로, 상기 siRNA는 siRNA의 단일 가닥들 또는 이중 가닥들을 포함한다.
siHybrid 분자는 siRNA에 유사한 기능을 가지는 이중-가닥 핵산이다. 이중-가닥 RNA 분자 대신에, siHybrid는 RNA 일 가닥과 DNA 일 가닥으로 구성되어 있다. 바람직하게는, 상기 RNA 가닥은 표적 mRNA와 결합하는 가닥과 같은 안티센스 가닥이다. 상기 DNA와 RNA 가닥들의 혼성화로 발생되는 siHybrid는 혼성화된 상보적 부분과 바람직하게는 적어도 하나의 3'오버행하는 말단을 가진다.
본 발명 내에서 사용되는 siNA들을 두 개의 분리된 올리고뉴클레오티드들로부터 조립될 수 있으며, 한 가닥은 센스 가닥이고 나머지는 안티센스 가닥으로서 상기 안티센스 및 센스 가닥들은 자기-상보적이다(즉, 각각의 가닥은 나머지 가닥에 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하며; 상기 안티센스 가닥 및 센스 가닥은 듀플렉스 또는 이중 가닥 구조를 형성하며, 예를 들어 상기 이중 가닥 영역은 약 19 염기쌍들이다). 상기 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 그 일 부분에 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 센스 가닥은 상기 표적 핵산 서열 또는 그 일 부분에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 siNA는 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있으며, 상기 siNA의 자기-상보적 센스 및 안티센스 영역들은 핵산계(nucleic acid-based) 또는 비-핵산계 링커(들)에 의하여 연결된다.
추가적인 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 따른 세포간의 전달을 위한 siNA들은 듀플렉스, 비대칭 듀플렉스, 헤어핀 또는 대칭적인 헤어핀 이차 구조를 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있는데, 이러한 폴리뉴클레오티드는 자기 상보적인(self-complementary) 센스 및 안티센스 영역을 가지며, 상기 안티센스 영역은 분리된 표적 핵산 분자 또는 그의 영역에 있는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그의 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 실시예들 내에서, 본 개시는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 혼합 또는 복합되거나 접합되는 세-가닥의 siNA 및 그 조성물들을 제공한다. 여기에 기술된 siRNA 분자들은 A, B1 및 B2(A:B1B2)의 세 가닥들을 포함하며, B1과 B2 가닥들은 동족 A 가닥의 비-중복 영역들과 상보적이고 염기쌍(bp)을 이루며, B1 가닥은 한 개 틈새 또는 하나 간격으로 해당 B2 가닥으로부터 분리되어 있다. 여기에 기술된 siRNA 분자들은 RNA 간섭 캐스케이드(cascade)를 개시할 수 있어 표적 전령 RNA(mRNA)의 발현이 변형된다.
여기에 기술된 siRNA 분자들은 예를 들어, A, B1 및 B2(A:B1B2)와 같은 셋 이상의 가닥들을 포함하며, B1과 B2는 A의 비-중복 영역들과 상보적이고 염기쌍(bp)을 형성하며; B1과 A의 결합으로 형성된 이중-가닥 영역은 B2와 A의 결합으로 형성된 이중-가닥 영역과 상이하고, 비-중복하며; 그리고 상기 A:B1 듀플렉스는 A:B1 듀플렉스와 A:B2 듀플렉스 사이에 위치되고, A, B1 및/또는 B2 가닥의 어느 하나 또는 양쪽 모두의 3' 말단에 있는 임의의 하나 이상의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드와는 상이한 A 가닥 내의 적어도 하나의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드로부터 발생하는 하나의 "간격"만큼 A:B2 듀플렉스와 분리되어 있다.
또한, 본 개시에 기술된 siRNA 분자들은 A, B1 및 B2(A:B1B2)와 같은 셋 이상의 가닥들을 포함하며 B1과 B2는 A의 비-중복 영역들과 상보적이고 염기쌍(bp)을 형성하며; B1과 A의 결합으로 형성된 이중-가닥 영역은 B2와 A의 결합으로 형성된 이중-가닥 영역과 상이하고, 비-중복하며; 그리고 상기 A:B1 듀플렉스는 A:B1 듀플렉스와 A:B2 듀플렉스 사이에서 하나의 "틈새"만큼 A:B2 듀플렉스와 분리되어 있다.
일 실시예에서, A:B1B2는 요컨대 약 14 염기쌍 내지 약 40 염기쌍 사이를 포함한다. 본 실시예에서, A는 센스 가닥을 나타내고 B1B2는 안티센스 가닥을 나타낸다. A는 길이가 15 내지 50 뉴클레오티드들이며 B1과 B2는 각각 개별적으로 1 내지 20 뉴클레오티드들이며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 8 뉴클레오티드들 내지 약 40 뉴클레오티드들 사이에 있다.
다른 실시예에서, A:B1B2는 요컨대 약 16 염기쌍 내지 약 40 염기쌍 사이에 있다. 본 실시예에서, A는 센스 가닥을 나타내고 B1B2는 안티센스 가닥을 나타낸다. A는 길이가 20 내지 40 뉴클레오티드들이며 B1과 B2는 각각 개별적으로 1 내지 15 뉴클레오티드들이며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 10 뉴클레오티드들 내지 약 30 뉴클레오티드들 사이에 있다.
다른 실시예에서, A:B1B2는 요컨대 약 14 염기쌍 내지 약 40 염기쌍 사이에 있다. 본 실시예에서, A는 안티센스 가닥을 나타내고 B1B2는 센스 가닥을 나타낸다. A는 길이가 15 내지 50 뉴클레오티드들이며 B1과 B2는 각각 개별적으로 1 내지 20 뉴클레오티드들이며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 8 뉴클레오티드들 내지 약 40 뉴클레오티드들 사이에 있다.
다른 실시예에서, A:B1B2는 요컨대 약 16 염기쌍 내지 약 40 염기쌍 사이를 포함한다. 본 실시예에서, A는 안티센스 가닥을 나타내고 B1B2는 센스 가닥을 나타낸다. A는 20 내지 40 뉴클레오티드들이며 B1과 B2는 각각 개별적으로 1 내지 15 뉴클레오티드들이며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 10 뉴클레오티드들 내지 약 30 뉴클레오티드들 사이에 있다.
상술한 바와 같이, 여기에 개시된 세-가닥 siRNA는 요컨대 약 15 염기쌍 내지 약 40 염기쌍 사이를 통상적으로 포함하며; 더 통상적으로는, 약 18 내지 약 35 염기쌍 사이를 포함하며; 좀 더 통상적으로는 약 20 내지 30 염기쌍 사이를 포함하며; 그리고 가장 통상적으로는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29 염기쌍 중 어느 하나를 포함한다. 몇몇 실시예들 내에서, siRNA는 1 뉴틀레오티드 내지 5 뉴클레오티드 사이의 단일 가닥 3' 오버행을 선택적으로 포함할 수 있다. 가장 통상적으로는, 그러한 단일-가닥 3' 오버행은 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오티드이다.
그러한 siRNA는 A 센스 가닥 또는 A 안티센스 가닥 중 어느 하나를 포함하며 상기 A 가닥의 길이는 약 15 뉴클레오티드 내지 약 50 뉴클레오티드 사이에 있으며; 더 통상적으로 상기 A 가닥의 길이는 약 18 뉴클레오티드 내지 약 40 뉴클레오티드 사이에 있으며; 좀 더 통상적으로 상기 A 가닥의 길이는 약 20 내지 약 32 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 가장 통상적으로 상기 A 가닥의 길이는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 뉴클레오티드이다.
본 개시의 siRNA도 예를 들어 여기에 B1과 B2로 지정된 둘 이상의 B 가닥들을 포함하며, 각각의 B 가닥은 동족 A 가닥의 비-중복 영역과 상보적이며 제 1 B 가닥(B1)은 제 2 B 가닥(B2)과는 틈새 하나 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 간격만큼 분리되어 있다. 상기 동족 A 가닥이 센스 가닥이냐 안티센스 가닥이냐의 여부에 따라서, 각각의 B 가닥은 각각 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 중 어느 하나일 것이다. 여기에 기술된 각각의 B 가닥(B1, B2 등)은 개별적으로 길이가 약 1 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드 사이에 있으며; 더 통상적으로는 길이가 약 4 뉴클레오티드 내지 약 20 뉴클레오티드 사이에 있으며; 더욱 더 통상적으로는 약 5 뉴클레오티드 내지 약 16 뉴클레오티드 사이에 있으며; 가장 통상적으로는 길이가 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 뉴클레오티드이다.
일단 합성된 A, B1 및 B2 가닥들은 결합되어 siRNA 분자들을 형성한다. 결합 반응은 상보성에 의하여 결정된다. 제 1 B 가닥(B1)은 제 2 B 가닥과 틈새 하나 또는 간격 하나만큼 분리될 수 있다. 따라서, B 가닥 상에 어떠한 동족 뉴클레오티드도 존재하지 않는 A 가닥 상의 뉴클레오티드들은 쌍을 이루지 않은 채로 유지하며 siRNA 분자 내에서 하나의 간격으로 나타난다. 상기 간격의 크기는 상기 B1과 B2 가닥들 사이에 위치된 A 가닥 내의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드들의 숫자에 의존할 것이다. 만약 A 가닥이 B1 가닥과 B2 가닥과 염기쌍을 이루어 상기 A 가닥 상의 어떠한 뉴클레오티드들도 상기 B1 가닥과 B2 가닥 사이의 영역에서 쌍을 이루지 않은 채 유지된다면 하나의 틈새가 형성된다.
B1과 B2가 하나의 간격만큼 분리되어 있는 그러한 실시예들에서, 상기 간격은 통상적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드 사이에 있으며; 더 통상적으로 상기 간격은 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드 사이에 있으며; 더욱 더 통상적으로 상기 간격은 1 뉴클레오티드 내지 10 뉴클레오티드 사이에 있으며; 가장 통상적으로 상기 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 뉴클레오티드(들)이다.
각각의 B 가닥은 개별적으로 5'히드록실(즉, 5'-OH)과 종결될 수 있거나 5'인산염(즉, 5'PO4)와 종결될 수 있다. 통상적으로, 합성 RNA 분자들은 터미널 3' 및 5' 히드록실들을 포함한다. 따라서 제 1 B 가닥의 3'-OH는 제 2 B 가닥의 5'-OH에 바로 인접하여 병치될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, 제 1 B 가닥의 3'-OH가 제 2 B 가닥의 5'-PO4에 바로 인접하여 병치되도록 5'터미널이 5'-PO4를 포함하는 제 2 B 가닥을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 그런 예들에서, B 가닥의 5' 말단들에 인산염의 첨가는 업계에 잘 알려져 있고 용이하게 이용가능한 방법을 이용한 RNA 키나아제의 촉매 활성을 이용하여 단일-가닥 (ss)RNA 분자에 PO4 기를 첨가하여 달성될 수 있다. 키나아제 반응을 수행한 이후에, A, B1 및 B2 가닥들은 서로 결합되어 상기 B 가닥들이 5'B1 pB2 3'지향이 된다.
하기의 siRNA 분자들은 여기 상술한 하나 이상의 폴리펩티드와 적절하게 접합될 수 있는 간격이 있거나 틈새가 있는 siRNA 분자들의 특이적인 비-한정적 대표적인 실시예들을 나타낸다.
i. 간격이 있는 듀플렉스 siRNA 분자들
여기에 기술된 몇몇 대표적인 간격이 있는 siRNA 분자들은 25량체 센스 B 가닥 서열 5'- GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3' (서열 번호: 75) 및 27량체 안티센스 A 가닥 서열 3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC-S' (서열 번호: 76)에 근거한다. 다른 대표적인 간격이 있는 듀플렉스 siRNA 분자들은 25량체 안티센스 B 가닥 서열 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3' (서열 번호: 75) 및 27량체 센스 A 가닥 서열 3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC-5' (서열 번호: 76)에 근거한다.
그러한 대표적인 siRNA 분자들은 A, B1 및 B2(A:B1B2)의 세 가닥들을 포함하며, B1 및 B2는 A의 비-중복 영역들과 상보적이고 염기쌍(bp)들을 형성하며; B1과 A의 결합으로 형성된 이중-가닥 영역은 B2와 A의 결합으로 형성된 이중-가닥 영역과 상이하고, 비-중복하며; 그리고 A:B1 듀플렉스는 A:B1 듀플렉스와 A:B2 듀플렉스의 사이에 있고, 상기 A, B1 및/또는 B2 가닥의 어느 하나 또는 양쪽 모두의 3' 말단에 있는 임의의 하나 이상의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드와는 상이한 A 가닥 내의 하나 이상의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드로부터 발생하는 하나의 "간격"만큼 A:B2 듀플렉스와 분리되어 있다.
이러한 실시예들의 몇몇 태양들 내에서, A:B1B2는 약 14 내지 약 24 개 사이의 전체 염기쌍으로 구성되어 있으며; A 가닥(센스)은 약 19 뉴클레오티드 내지 약 27 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1(안티센스) 가닥과 B2(안티센스) 가닥은 각각 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 18 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 13 뉴클레오티드 내지 약 23 뉴클레오티드 사이에 있다.
이러한 실시예들의 다른 태양들 내에서, A:B1B2는 약 16 내지 약 22 개 사이의 전체 염기쌍으로 구성되어 있으며; A 가닥(센스)은 약 19 뉴클레오티드 내지 약 23 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1(안티센스) 가닥과 B2(안티센스) 가닥은 각각 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 13 뉴클레오티드 내지 약 23 뉴클레오티드 사이에 있다.
이러한 실시예들의 더욱 다른 태양들 내에서, A:B1B2는 약 14 내지 약 24 개 사이의 전체 염기쌍으로 구성되어 있으며; A 가닥(안티센스)은 약 14 뉴클레오티드 내지 약 27 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1(센스) 가닥과 B2(센스) 가닥은 각각 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 18 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 18 뉴클레오티드 내지 약 24 뉴클레오티드 사이에 있다.
이러한 실시예들의 또 다른 태양들 내에서, A:B1B2는 약 14 내지 약 22 개 사이의 전체 염기쌍으로 구성되어 있으며; A 가닥(안티센스)은 약 16 뉴클레오티드 내지 약 22 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1(센스) 가닥과 B2(센스) 가닥은 각각 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드 사이에 있으며; 그리고 B1+B2의 결합된 길이는 약 18 뉴클레오티드 내지 약 22 뉴클레오티드 사이에 있다.
이러한 실시예들에 따른 대표적인 siRNA는 표 2에 제시되어 있다.
A:B1B2 서열 식별기호 서열
6-nuc B1(센스) 18-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 77 서열 번호: 78 서열 번호: 76 5'GGAUCU3' 5'AUUUCUUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
8-nuc B1(센스) 16-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 79 서열 번호: 80 서열 번호: 76 5'GGAUCUUA3' 5'UUCUUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
10-nuc B1(센스) 14-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 81 서열 번호: 82 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUU3' 5'CUUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
12-nuc B1(센스) 12-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 83 서열 번호: 84 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUC3' 5'UCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
14-nuc B1(센스) 10-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 85 서열 번호: 86 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUU3' 5'GGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
16-nuc B1(센스) 8-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 87 서열 번호: 88 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCG3' 5'AGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
18-nuc B1(센스) 6-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 89 서열 번호: 90 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCGGA3' 5'ACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
6-nuc B1(센스) 17-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 2-nuc 간격 서열 번호: 91 서열 번호: 92 서열 번호: 76 5'GGAUCU3' 5'UUUCUUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
8-nuc B1(센스) 15-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 2-nuc 간격 서열 번호: 93 서열 번호: 94 서열 번호: 76 5'GGAUCUUA3' 5'UCUUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
10-nuc B1(센스) 13-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 2-nuc 간격 서열 번호: 95 서열 번호: 96 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUU3' 5'UUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
12-nuc B1(센스) 11-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 1-nuc 간격 서열 번호: 97 서열 번호: 98 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUC3' 5'CGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
14-nuc B1(센스) 9-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 2-nuc 간격 서열 번호: 99 서열 번호: 100 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUU3' 5'GAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
16-nuc B1(센스) 7-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 2-nuc 간격 서열 번호: 101 서열 번호: 102 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCG3' 5'GACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
A:B1B2 서열 식별기호 서열
18-nuc B1(센스) 5-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 2-nuc 간격 서열 번호: 103 서열 번호: 104 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCGGA3' 5'CAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
6-nuc B1(센스) 15-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 105 서열 번호: 106 서열 번호: 76 5'GGAUCU3' 5'UCUUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
8-nuc B1(센스) 13-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 107 서열 번호: 108 서열 번호: 76 5'GGAUCUUA3' 5'UUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
10-nuc B1(센스) 11-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 109 서열 번호: 110 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUU3' 5'CGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
12-nuc B1(센스) 9-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 111 서열 번호: 112 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUC3' 5'GAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
14-nuc B1(센스) 7-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 113 서열 번호: 114 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUU3' 5'GACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
16-nuc B1(센스) 5-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 115 서열 번호: 116 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCG3' 5'CAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
18-nuc B1(센스) 3-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 4-nuc 간격 서열 번호: 117 서열 번호: 118 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCGGA3' 5'AUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
6-nuc B1(센스) 13-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 119 서열 번호: 120 서열 번호: 76 5'GGAUCU3' 5'UUCGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
8-nuc B1(센스) 11-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 121 서열 번호: 122 서열 번호: 76 5'GGAUCUUA3' 5'CGGAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
10-nuc B1(센스) 9-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 123 서열 번호: 124 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUU3' 5'GAGACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
12-nuc B1(센스) 7-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 125 서열 번호: 126 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUC3' 5'GACAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
14-nuc B1(센스) 5-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 127 서열 번호: 128 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUU3' 5'CAAUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
A:B1B2 서열 식별기호 서열
16-nuc B1(센스) 3-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 129 서열 번호: 130 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCG3' 5'AUG3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
18-nuc B1(센스) 1-nuc B2(센스) 27-nuc A(안티센스) 6-nuc 간격 서열 번호: 131 서열 번호: 132 서열 번호: 76 5'GGAUCUUAUUUCUUCGGA3' 5'G3' 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'
A, B1 및 B2 가닥들의 정확한 뉴클레오티드 서열들은 siRNA 분자가 연속적인 염기쌍들의 두 가지 확장들(stretches)을 포함하며 연속적인 염기쌍들의 각각의 확장은 상기 단독 안티센스 A 가닥이나 상기 센스 A 가닥 내에서의 하나 이상의 쌍을 이루지않는 염기에 해당하는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 하나의 간격으로 분리되어 있다는 조건으로 변화될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
ii. 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자들
하기에 설명된 서열들에서 "p"는 B2 가닥에 부착된 5'인산염이 있는 RNA 가닥에서의 틈새를 나타낸다. 하기에 설명된 서열들에서 "*"는 B2 가닥에 부착된 5'인산염이 없는 RNA 가닥에 있는 틈새를 나타낸다. 모든 경우에, A 가닥은 손상되지 않은 채로 남아 있다(틈새가 없음)--A 가닥에 나타나는 간격은 siRNA 분자들의 적절한 서열 정렬(서열 상동성으로 인한)을 보존한다. 하기에 설명된 서열들에서 " T" (이탤릭 볼드체)는 그 위치에서의 리보티미딘(rT) 분자의 존재를 나타낸다. 하기에 설명된 서열들에서 "T"(볼드체)는 그 위치에서의 디옥시리보티미딘(dT) 분자의 존재를 나타낸다. 연속적인 가닥들, 즉, 간격들이나 틈새가 없는 가닥들은 밑줄이 쳐져 있다.
1. 대조 dsRNA
SEN GGAUCUUAUUUCUUCGGAG TT -3 ' (서열 번호: 133)
ASN CUCCGAAGAAAUAAGAUCC TT -3 ' (서열 번호: 134)
2. 5' 인산염이 없는 틈새가 있는 센스 가닥
Bl B2
SEN GGAUCUUAUUU* C UUCGGAG TT -3' (서열 번호들: 135 및 136 )
ASN CUCCGAAGAAA UAAGAUCC TT -3' (서열 번호: 137 )
A
3. 5' 인산염이 있는 틈새가 있는 센스 가닥
Bl B2
SEN GGAUCUUAUUUp C UUCGGAG TT -3' (서열 번호들: 138 및 139)
ASN CUCCGAAGAAA UAAGAUCC TT -3' (서열 번호: 140)
A
4. 5' 인산염이 있는 틈새가 있는 센스 가닥, 양쪽 가닥들이 rT 분자들로 충분히 변형됨
Bl B2
SEN GGA T C TT A TTT p C TT CGGAG TT -3' (서열 번호들: 141 및 142 )
ASN C T CCGAAGAAA T AAGA T CC TT -3' (서열 번호: 143 )
A
5. 5' 인산염이 없는 틈새가 있는 센스 가닥, 양쪽 가닥들이 rT 분자들로 충분히 변형됨
Bl B2
SEN GGA T C TT A TTT * CTT CGGAG TT -3' (서열 번호들: 144 및 145 )
ASN C T CCGAAGAAA T AAGA T CC TT -3' (서열 번호: 146 )
A
6. 5' 인산염이 없는 틈새가 있는 안티센스 가닥, 안티센스 가닥은 rT 분자들로 충분히 변형되고, 센스 가닥은 변형되지 않음(대조)
A
SEN GGA T C TT K TT TCTT CGGAG TT -3' (서열 번호: 147 )
ASN C T CCGAAGAA*A T AAGA T CC TT -3' (서열 번호들: 148 및 149 )
Bl B2
7. 5' 인산염이 있는 틈새가 있는 안티센스 가닥, 안티센스 가닥은 rT 분자들로 충분히 변형되고, 센스 가닥은 변형되지 않음(대조)
A
SEN GGA T C TT A TT T CTT CGGAGTT-3' (서열 번호: 150 )
ASN C T CCGAAGAApA T AAGA T CC TT -S ' (서열 번호들: 151 및 152 )
Bl B2
8. ID: 틈새가 있는 S-WT: 틈새가 있는 센스 가닥의 듀플렉스
Bl B2
SEN GGAUCUUAUUU*CUUCGGAG TT -3' (서열 번호들: 153 및 154)
ASN CUCCGAAGAAA UAAGAUCC TT -3 ' (서열 번호: 155)
A
9. ID: 틈새가 있는 S-WT: 틈새가 있는 센스 가닥의 듀플렉스; B2는 5' 인산화된다
Bl B2
SEN GGAUCUUAUUUpCUUCGGAG TT -3' (서열 번호들: 156 및 157)
ASN CUCCGAAGAAA UAAGAUCC TT -3 ' (서열 번호: 158)
A
10. ID: 틈새가 있는 S-RT: 틈새가 있는 센스 가닥의 듀플렉스; 충분히 rT 변형됨
Bl B2
SEN GGA T C TT A TTT *C TT CGGAG TT -3' (서열 번호들: 159 및 160)
ASN C T CCGAAGAAA T AAGA T CC TT - 3' (서열 번호: 161)
A
11. ID: 틈새가 있는 S-RT: 틈새가 있는 센스 가닥의 듀플렉스; B2는 5' 인산화된다; 충분히 rT 변형됨
Bl B2
SEN GGA T C TT A TTT pC TT CGGAG TT -3' (서열 번호들: 162 및 163 )
ASN C T CCGAAGAAA T AAGA T CC TT - 3 ' ( 서열 번호 : 164 )
A
12. ID: 틈새가 있는 A-RT: 틈새가 있는 안티센스 가닥의 듀플렉스; 충분히 rT 변형됨
A
SEN GGA T C TT A TT T C TT CGGAG TT -3' (서열 번호: 165)
ASN C T CCGAAGAA*A T AAGA T CC TT -3' (서열 번호들: 166 및 34)
Bl B2
13. ID: 틈새가 있는A-RT: 틈새가 있는 안티센스 가닥의 듀플렉스; B2는 5' 인산화된다; 충분히 rT 변형됨
A
SEN GGA T C TT A TT T C TT CGGAG TT - 3' (서열 번호: 38)
ASN C T CCGAAGAApA T AAGA T CC TT -3 ' (서열 번호들: 39 및 40)
Bl B2
iii. 링커들로 폐쇄된 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자들
다른 실시예에서, 본 개시에 따른 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자들은 링커 분자로 "폐쇄(close)"될 수 있다. 그렇게 나온 분자는 훨씬 더 안정하여야 한다, 즉, Tm이 더 높고 숙주 세포 내에서의 분해에 더 내성이 있다.
본 개시에 따른 그러한 링커의 예들은 예컨대, 무염기성 뉴클레오티드들, 무염기성 프로판디올들(propanediols) 및 다수의 작은 C6-형 링커들을 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
비-뉴클레오티드 링커는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리하이드로카본 또는 다른 고분자 화합물들(예컨대, 2 내지 100 사이의 에틸렌 글리콜 단위들을 가지는 폴리에틸렌 글리콜들)로 구성될 수 있다. 특이적인 예들은 Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990 and Nucleic Acids Res. 15:3113, 1987; Cload and Schepartz, J. Am. Chem . Soc. 113:6324, 1991; Richardson and Schepartz, J Am . Chem . Soc. 113:5109, 1991; Ma, et al., Nucleic Acids Res. 21:2585, 1993 and Biochemistry 32:1751, 1993; Durand, et al., Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990; McCurdy, et al., Nucleosides & Nucleotides 10:287, 1991; Jschke, et al., Tetrahedron Lett. 34:301, 1993; Ono, et al., Biochemistry 30:9914, 1991; Arnold, et al., International Publication No. WO 89/02439; Usman, et al., International Publication No. WO 95/06731; Dudycz, et al., International Publication No. WO 95/11910 and Ferentz and Verdine, J Am . Chem . Soc. 113:4000, 1991에서 기술된 예들을 포함한다. "비뉴클레오티드"는 당 및/또는 인산염 치환을 포함하여, 하나 이상의 뉴클레오티드 단위들을 대신하여 핵산 체인으로 혼입될 수 있는 임의의 기 또는 화합물을 더 의미하며, 나머지 염기들이 그 효소 활성을 보이도록 한다. 상기 기 또는 화합물은 예를 들어 당의 C1 위치에서 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티미딘과 같은 흔히 알려져 있는 뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는다는 점에서 무염기성일 수 있다.
상기 링커의 이러한 존재는 RISC 활성을 상당히 간섭하여서는 안 된다. 바람직하게는, 본 개시의 링커-포함 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자들을 투여하면, 해당하는 연결되지 않은 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자들을 채용하는 경우에 보게 되는 RNA 간섭의 레벨이 높아질 것이다.
소 억제 핵산들( siNA )의 화학적 변형
비한정적 예에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드들을 핵산 분자들로 도입하게 되면 외생적으로 전달되는 천연 RNA 분자들에 고유한 생체 내 안정성과 생체 이용도의 잠재적인 제한들을 극복하는 강력한 도구를 제공한다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 핵산 분자들을 사용하면 화학적으로 변형된 핵산 분자들이 혈청 내에서 더 오랜 반감기를 가지는 경향이 있기 때문에 주어진 치료 효과에 대한 특정한 핵산 분자의 더 낮은 투여량을 가능하게 할 수 있다. 또한, 몇몇 화학적인 변형들은 특정 세포들이나 조직들을 표적하고/하거나 핵산 분자의 세포 섭취를 개선함으로써 핵산 분자들의 생체이용도를 개선시킬 수 있다. 그러므로, 화학적으로 변형된 핵산 분자의 활성이 예를 들어, 전체-RNA 핵산 분자와 비교할 경우와 같이 천연 핵산 분자와 비교할 경우에 감소된다 하더라도, 변형된 핵산 분자의 전체 활성은 분자의 개선된 안정성 및/또는 전달로 인하여 천연 분자의 전체 활성보다 훨씬 클 수 있다. 천연의 변하지 않은 siNA와는 달리, 화학적으로 변형된 siNA는 인간 내에서 인터페론 활성을 활성활시킬 가능성을 최소화시킬 수도 있다.
본 발명의 siNA 분자의 안티센스 영역인 여기에 기술된 siNA 분자들은 상기 안티센스 영역의 3'-말단에 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 인터뉴클레오티드 연쇄를 포함할 수 있다. 여기에 기술된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 안티센스 영역은 상기 안티센스 영역의 5'-말단에서 약 1 내지 약 5 개의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 여기에 기술된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 본 발명의 siNA 분자의 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들은 핵산 당, 염기 또는 골격에서 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드들이나 디옥시리보뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 여기에 기술된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들은 하나 이상의 보편적인 염기 리보뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. 여기에 기술된 siNA 분자들의 실시예들 중 임의의 것에서, 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들은 하나 이상의 비고리형(acyclic) 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.
예를 들어, 비한정적인 예에서, 본 발명은 하나의 siNA 가닥에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 가지는 화학적으로 변형된 단 간섭 핵산(siNA)를 특징으로 한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 양쪽 siNA 가닥들에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 개별적으로 가지는 화학적으로 변형된 단 간섭 핵산(siNA)을 특징으로 한다. 상기 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들은 예를 들어, 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥들에 있는 siNA 듀플렉스의 하나 또는 양쪽 모두의 올리고뉴클레오티드 가닥들에서 존재할 수 있다. 본 발명의 siNA 분자들은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥 모두의 3'-말단, 5'-말단 또는 3'- 및 5'-말단들 양쪽 모두에서 하나 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 대표적인 siNA 분자는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 모두 가닥들의 5'-말단에서 약 1 개 내지 약 5 개 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5 이상) 연속적인 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 다른 비한정적 예에서, 본 발명의 대표적인 siNA 분자는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥 모두에서 하나 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상) 피리미딘 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다. 또 다른 비한정적 예에서, 본 발명의 대표적인 siNA 분자는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥 모두에서 하나 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상) 퓨린 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포함할 수 있다.
siNA 분자는 원형의 핵산 분자로 구성될 수 있으며, 상기 siNA는 약 18 내지 약 23(예컨대, 약 18, 19, 20, 21, 22 또는 23) 개의 염기쌍들을 가지는 길이가 약 38 내지 약 70(예컨대, 약 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70) 개의 뉴클레오티드들이며, 상기 원형의 올리고뉴클레오티드는 약 19 염기쌍들과 2 루프들을 가지는 아령형 구조를 형성한다.
원형의 siNA 분자는 2 개의 루프 모티프들을 포함하며, 상기 siNA 분자의 하나 또는 양쪽 루프 부분들은 생분해성이다. 예를 들어, 본 발명의 원형 siNA 분자는 상기 siNA 분자의 루프 부분들이 생체 내에서 분해되면 약 2 개의 뉴클레오티드들을 포함하는 3'-터미널 뉴클레오티드 오버행들과 같은 3'-터미널 오버행들이 있는 이중-가닥 siNA 분자를 발생시킬 수 있도록 설계되어 있다.
siNA 분자들에, 바람직하게는 siNA 분자들의 안티센스 가닥뿐만 아니라 선택적으로는 센스 및/또는 안티센스 및 센스 가닥들 양쪽 모두에 존재하는 변형된 뉴클레오티드들은 자연발생적인 리보뉴클레오티드들과 유사한 특성이나 특징들을 가지는 변형된 뉴클레오티드들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 노던 형태(Northern conformation)(예컨대, 노던 유사회전 사이클, 예를 들어, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984 참조)를 가지는 변형된 뉴클레오티드들을 포함하는 siNA 분자들을 특징으로 한다. 그래서, 본 발명의 siNA 분자들에, 바람직하게는 본 발명의 siNA 분자들의 안티센스 가닥뿐만 아니라 선택적으로는 센스 및/또는 안티센스 및 센스 가닥들 양쪽 모두에 존재하는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드들은 뉴클레아제 분해에 내성을 가지면서 동시에 RNAi를 매개하는 능력을 유지한다. 노던 형태를 가지는 뉴클레오티드들의 비한정적 예들은 잠겨진 핵산(LNA) 뉴클레오티드들(예컨대, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실)뉴클레오티드들); 2'-메톡시에톡시(MOE) 뉴클레오티드들; 2'-메틸-티오에틸, 2'-디옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드들, 2'-디옥시-2'-클로로 뉴클레오티드들, 2'-아지도 뉴클레오티드들 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드들을 포함한다.
이중 가닥 siNA 분자의 센스 가닥은 센스 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 3' 및 5'-말단 양쪽 모두에서 역위(inverted) 무염기 모이어티와 같은 터미널 캡 모이어티를 가질 수 있다.
접합체들의 비한정적 예들은 도면들을 포함하여 여기에 그대로 참고로 포함된 2003 년 4 월 30 일에 출원된 Vargeese, et al., U.S. Application Serial No. 10/427,160에 기술된 접합체들과 리간드들을 포함한다. 다른 실시예에서, 접합체는 생분해성 링커를 통하여 화학적으로 변형된 siNA 분자에 공유적으로 부착된다. 일 실시예에서, 접합체 분자는 화학적으로 변형된 siNA 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥 모두의 3'-말단 모두에 부착된다. 다른 실시예에서, 접합체 분자는 화학적으로 변형된 siNA 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥 모두의 5'-말단에 부착된다. 또 다른 실시예에서, 접합체 분자는 화학적으로 변형된 siNA 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥 모두의 3'-말단 및 5'-말단에 또는 그 임의의 조합에 부착된다. 일 실시예에서, 본 발명의 접합체 분자는 화학적으로 변형된 siNA 분자의 세포와 같은 생물학적 시스템으로의 전달을 용이하게 하는 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 화학적으로 변형된 siNA 분자에 부착된 접합체 분자는 세포 섭취를 매개할 수 있는 세포 수용체를 위한 폴리에틸렌글리콜, 인간 혈청 알부민 또는 리간드이다. 화학적으로 변형된 siNA 분자들에 부착될 수 있으며, 당해 발명에 의하여 고려되는 특이적인 접합체 분자들의 예들은 Vargeese, et al., 2003 년 7 월 10 일에 공개된 U.S. Patent Application Publication No. 20030130186 및 2004 년 6월 10 일에 공개된 U.S. Patent Application Publication No. 20040110296에 기술되어 있다. 사용된 접합체들의 유형과 본 발명의 siNA 분자들의 접합 정도는 RNAi를 매개하는 siNA의 능력을 동시에 유지하면서 siNA 구조체들의 개선된 약동학적 프로파일들, 생체이용도 및/또는 안정성에 대하여 평가될 수 있다. 그래서, 당업자는 다양한 접합체들로 변형된 siNA 구조체들을 스크리닝하여 siNA 접합 복합체가 예를 들어, 업계에 일반적으로 알려진 바와 같은 동물 모델들에서 RNAi를 매개하는 능력을 유지하면서 개선된 특성들을 소유하고 있는 지의 여부를 결정할 수 있다.
siNA는 siNA의 센스 영역을 siNA 안티센스 영역과 결합하는 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드 또는 혼합된 뉴클레오티드/비-뉴클레오티드 링커로 더 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 뉴클레오티드 링커는 예를 들어, 길이가 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 뉴클레오티드들인 길이가 2 뉴클레오티드들을 초과하는 링커일 수 있다. 다른 실시예에서, 뉴클레오티드 링커는 핵산 앱타머(aptamer)일 수 있다. 여기에 사용된 "앱타머" 또는 "핵산 앱타머"는 표적 분자와 특이적으로 결합하는 핵산 분자로서, 자연적 세팅(setting)에서 표적 분자에 의해 인식되는 서열을 포함하는 서열을 가지는 핵산 분자를 의미한다. 또한, 앱타머는 표적 분자가 자연적으로 핵산과 결합하지 않는 그러한 표적 분자와 결합하는 핵산 분자일 수 있다. 표적 분자는 중요한 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 단백질의 리간드-결합 구역과 결합하여 자연발생적 리간드의 단백질과의 상호작용을 방지하는 데 사용될 수 있다. 이는 비한정적인 예이며 당업자는 다른 실시예들이 업계에서 일반적으로 알려진 기법들을 이용하여 용이하게 발생될 수 있다는 것을 알게 될 것이다(예를 들어, Gold, et al., Annu . Rev . Biochem. 64:763, 1995; Brody and Gold, J. Biotechnol. 74:5, 2000; Sun, Curr . Opin . MoI . Ther. 2:100, 2000; Kusser, J. Biotechnol. 74:27, 2000; Hermann and Patel, Science 287:820, 2000; 및 Jayasena, Clinical Chemistry 45:1628, 1999 참조).
비-뉴클리오티드 링커는 무염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질, 폴리하이드로카본 또는 다른 고분자 화합물들(예컨대, 2 내지 100 개 사이의 에틸렌 글리콜 단위들을 가지는 폴리에틸렌 글리콜들)로 구성될 수 있다. 특이적인 예들은 Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990, and Nucleic Acids Res. 15:3113, 1987; Cload and Schepartz, J. Am. Chem . Soc. 113:6324, 1991; Richardson and Schepartz, J. Am . Chem . Soc. 113:5109, 1991; Ma, et al., Nucleic Acids Res. 21:2585, 1993, and Biochemistry 32:1751, 1993; Durand, et al., Nucleic Acids Res. 18:6353, 1990; McCurdy, et al., Nucleosides & Nucleotides 10:281, 1991; Jschke, et al., Tetrahedron Lett. 34:301, 1993; Ono, et al., Biochemistry 30:9914, 1991; Arnold, et al., International Publication No. WO 89/02439; Usman, et al., International Publication No. WO 95/06731; Dudycz, et al., International Publication No. WO 95/11910 and Ferentz and Verdine, J. Am . Chem . Soc. 113:4000, 1991에 기술된 예들을 포함한다. "비-뉴클레오티드"는 당 및/또는 인산염 치환을 포함하여 하나 이상의 뉴클레오티드 단위들 대신에 핵산 체인으로 혼입될 수 있는 임의의 기 또는 화합물을 더 의미하며, 나머지 염기들이 그 효소적 활성을 보이도록 한다. 상기 기 또는 화합물은 예를 들어, 당의 C1 위치에서 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티미딘과 같은 흔히 알려져 있는 뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는다는 점에서 무염기성일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드/ siNA 접합체들을 포함하는 조성물들의 투여
본 개시의 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 여기에서 토론되거나 업계에서 알려진 질병 또는 상태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정한 질병 또는 상태를 치료하기 위하여, 본 발명의 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 치료에 적합한 조건하에서 개별적으로 하나 이상의 화합물과 조합하여 환자에게 투여되거나 당업자에게 명백한 다른 적절한 세포들에 투여될 수 있다.
예를 들어, 여기에 기술된 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 특히, 바이러스 감염과 같은 광범위한 상태들을 치료하는 데 알려진 다른 치료법들 및/또는 치료제들과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체와 용이하게 조합될 수 있는 다른 치료제들의 비한정적인 예들은 예를 들어, 효소 핵산 분자들; 알로스테릭(allosteric) 핵산 분자들; 안티센스, 유인물(decoy) 또는 앱타머 핵산 분자들; 단일클론성 항체들과 같은 항체들; 작은 분자들; 및 다른 유기 및/또는 금속, 염 및 이온들을 포함하는 무기 화합물들을 포함한다.
따라서, 본 개시는 안정화제, 완충액 등과 같은 수용가능한 담체 내에 하나 이상의 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체(들)을 포함하는 조성물들을 기술한다. 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체는 안정화제, 완충액 등을 포함하거나 포함하지 않고 치료에 적합한 조성물을 형성하는 임의의 표준적인 수단에 의하여 환자에게 투여될 수 있다. 리포솜 전달 메커니즘의 이용을 원하는 경우에, 리포솜들의 형성을 위한 표준 프로토콜들을 따를 수 있다. 본 발명의 조성물들은 경구 투여용의 정제들(tablets), 캡슐들(capsules) 또는 일릭서들(elixirs), 직장 투여용의 좌약들, 주사식 투여용 살균액들, 현탁액들 및 업계에 알려진 다른 조성물들 사용하거나 사용하지 않고 제형되고 사용될 수도 있다. 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체 제형들은 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 아세트산 및 벤젠 술폰산의 염과 같은 산 첨가 염과 같은 상기 화합물들의 염들을 포함한다.
약학적 조성물들 또는 제형들은 예컨대, 전신성 투여와 같은 투여에 적합한 형태로 세포 또는 인간과 같은 환자에게로 투여하는 조성물들 또는 제형들을 의미한다. 적합한 형태들은 예를 들어, 구강, 경피 또는 주사의 사용이나 이입 경로에 부분적으로 의존한다. 그러한 형태들은 상기 조성물 또는 제형이 표적 세포(즉, 음으로 대전된 핵산이 전달에 바람직한 세포)에 이르지 않도록 해서는 안 된다. 예를 들어, 혈류에 주사되는 약학적 조성물들은 가용성이어야 한다. 다른 인자들은 업계에 알려져 있으며, 상기 조성물이나 제형들이 그 효과를 발휘하지 않도록 하는 독성과 형태들과 같은 고려사항들을 포함한다.
개별적인 보고 유전자발현 구조체들은 하나 이상의 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체로 공동 형질감염(co-transfect)될 수 있다. 주어진 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체의 고려되는(contemplated) 유전자 변이체들 각각의 발현 레벨을 감소시키는 능력은 변형된 siNA로 형질감염되고 변형된 siNA 없이 형질감염된 세포들로부터 측정된 보고 유전자 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다.
핵산 분자들의 전달을 위한 방법들은 Akhtar, et al., Trends Cell Bio. 2:139, 1992; "Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics" (ed. Akhtar, 1995); Maurer, et al., Mol . Membr . Biol 16:129-140, 1999; Hofland and Huang, Handbook Exp . Pharmacol. 137:165-192, 1999; and Lee, et al,ACS Symp. Ser. 752:184-192, 2000에 기술되어 있다. Sullivan, et al., PCT WO 94/02595는 효소 핵산 분자들의 전달을 위한 일반적인 방법들을 더 기술한다. 이러한 프로토콜들은 실질적으로 모든 핵산 분자의 전달에 이용될 수 있다.
여기에 사용된 "전신성 투여"라는 용어는 혈류 내에 약물을 생체 내 전신 흡수 또는 축적하고 신체 전체를 통한 분산이 뒤따르는 것을 의미한다. 전신 흡수되는 투여 경로들은 제한 없이 정맥 내(intravenous), 피하(subcutaneous), 복강 내(intraperitoneal), 흡입(inhalation), 구강, 폐내(intrapulmonary) 및 근육 내(intramuscular)를 포함한다. 이러한 투여 경로들의 각각은 예를 들어, 핵산들과 같이 원하는 음으로 대전된 고분자들을 접근가능한 병든 조직으로 노출시킨다. 약물이 입수되어 순환되는 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것을 보여준다.
핵산 분자들은 리포솜 내에서 캡슐화 되거나, 이온영동법(iontophoresis)에 의하거나, 히드로겔들(hydrogels), 사이클로덱스트린들, 생분해성 나노캡슐들, 생접착성 미세구들(bioadhesive microsphere) 같은 다른 운반체들 내로 혼입에 의하거나; 또는 단백성 벡터들에 의한 것을 포함하지만, 여기에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의하여 세포들에 투여될 수 있다(O'Hare and Normand, International PCT Publication No. WO 00/53722 참조). 또한, 핵산/운반체 조합은 직접 주사 또는 주입 펌프를 사용하여 국소적으로 전달될 수 있다. 피하(subcutaneous), 근육 내(intramuscular), 또는 피내(intradermal)에 의하든 본 발명의 핵산 분자들의 직접 주사는 표준 바늘 및 주사기 방법을 이용하거나 Conry, et al, Clin . Cancer Res. 5:2330-2337, 1999, 및 Barry, et al, International PCT Publication No. WO 99/31262에 기술된 무바늘(needle-free) 방법들을 이용하여 주사될 수 있다.
여기에 개시된 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 약학적 제제로 사용될 수 있다. 약학적 제제들은 환자의 질병 상태를 방지하거나 발생을 조절하거나 치료(하나의 증세를, 바람직하게는 모든 증세들을 어느 정도까지 완화시킴)한다.
여기에 사용된 "약학적으로 수용가능한 제형"이라는 의미는 당해 발명의 핵산 분자들을 그 바람직한 활성에 매우 적합한 신체적 위치에 효과적으로 분산시키게 하는 조성물들 또는 제형들을 포함하는 것을 의미한다. 당해 발명의 핵산 분자들과의 제형에 적합한 제제들의 비한정적 예들은 중추 신경계로 약물들의 입수를 증진시킬 수 있는 P-당단백질(glycoprotein) 억제제들(플루로닉(pluronic) P85 등)(Jolliet-Riant and Tillement, Fundam . Clin . Pharmacol. 13:16-26, 1999); 뇌내 이식 후 서방성 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜리드(coglycolide)) 미세구들과 같은 생분해성 고분자들(Emerich, D.F., et al., Cell Transplant 8:47-58, 1999) (Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); 및 혈액 뇌관문(blood brain barrier)을 관통하여 약물을 전달하고 뉴런성 섭취 메커니즘들을 변경시킬 폴리부틸사이아노아크릴레이트(polybutylcyanoacrylate)로 구성된 것과 같은 혼합된 나노파티클들(loaded nanoparticles)을 포함한다(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 23:941-949, 1999).
리포솜 또는 당해 발명의 조성물들을 포함하는 다른 약물 담체를 사용하면 예를 들어, 세망 내피계(RES)의 조직들과 같은 몇몇 조직 유형들 내에서 약물을 잠재적으로 국소화할 수 있다. 림프구들과 대식세포들과 같은 세포들의 표면과 약물의 결합을 용이하게 할 수 있는 리포솜 제형도 유용하다. 이러한 접근은 암 세포들과 같은 이상 세포들의 대식세포 및 림프구 면역 인식의 특이성을 이용하여 표적 세포들로의 약물의 증진된 전달을 제공할 수 있다.
당해 발명의 핵산 분자들에 대한 전달 전략들의 다른 비한정적 예들은 Boado, et al., J. Pharm . Sci. 87:1308-1315, 1998; Tyler, et al., FEBS Lett. 421:280-284, 1999; Pardridge, et al., PNAS USA 92:5592-5596, 1995; Boado, Adv. Drug Delivery Rev. 15:73-107, 1995; Aldrian-Herrada, et al., Nucleic Acids Res. 26:4910-4916, 1998; and Tyler, et al., PNAS USA. 96:1053-1058, 1999에 기술된 물질을 포함한다.
본 개시는 또한 폴리(에틸렌 글리콜)지질들(PEG-변형되거나 긴-순환하는 리포솜들 또는 스텔스 리포솜들)을 포함하는 표면-변형된 리포솜들을 포함하는 조성물의 사용을 특징으로 한다. 이러한 제형들은 표적 조직들 내에서 약물들의 축적을 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 분류의 약물 담체들은 단핵 식세포 시스템(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌화(opsonization)와 제거를 저항하여 더 긴 혈액 순환 시간과 캡슐화된 약물에 대한 증진된 조직 노출을 가능하게 한다. Lasic, et al., Chem . Rev. 95:2601-2621, 1995; Ishiwata, et al., Chem . Pharm . Bull. 43:1005-1011, 1995 참조. 그러한 리포솜들은 아마도 신생혈관생성된 표적 조직들 내에서의 혈관외 유출(extravasation)과 포획(capture)에 의하여 종양들 내에서 선택적으로 축적하는 것으로 보였다. Lasic, et al., Science 267:1215-1216, 1995; Oku, et al., Biochim . Biophys . Acta 1238:86-90, 1995 참조. 오래 순환하는 리포솜들은 MPS의 조직들 내에서 축적하는 것으로 알려진 통상적인 양이온 리포솜들과 특히 비교해 본다면, DNA와 RNA의 약동학과 약력학을 증진시킨다. Liu, et al., J. Biol. Chem. 42:24864-24870, 1995; Choi, et al., International PCT Publication No. WO 96/10391 ; Ansell, et al., International PCT Publication No. WO 96/10390; and Holland, et al., International PCT Publication No. WO 96/10392 참조. 오래 순환하는 리포솜들은 또한 간과 비장과 같은 대사적으로 공격적인 MPS 조직들 내에서의 축적을 회피하는 그 능력으로 인하여 양이온 리포솜들과 비교하여 더 큰 정도로 약물들을 뉴클레아제 분해로부터 보호할 것 같다.
본 개시는 약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제 내에서 원하는 화합물들의 약학적 유효량을 포함하는 저장이나 투여를 위해 제조된 화합물들을 포함하기도 한다. 치료용의 수용가능한 담체들이나 희석제들은 약학 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro ed., 1985에 기술되어 있다. 예를 들어, 보존제들, 안정화제들, 염료들 및 향미료들이 제공된다. 이것들은 벤조산 나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르들을 포함한다. 또한, 항산화제들과 현탁제들이 사용될 수 있다.
약학적 유효 투여량은 질병 상태를 방지, 발생을 억제하거나 치료(하나의 증세를, 바람직하게는 모든 증세들을 어느 정도까지 완화시킴)하는 데 필요한 투여량이다. 약학적 유효 투여량은 질병의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유류의 유형, 고려중인 특이적 포유류의 신체적 특징들, 공동작용 약제 및 약학 업계의 당업자들이 알고 있는 다른 인자들에 의존한다. 일반적으로, 활성 성분을 매일 kg 체중당 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎ 사이의 양이 음으로 대전된 고분자의 역가에 의존하여 투여된다.
본 개시는 약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제 내에 원하는 화합물들의 약학적 유효량을 포함하는 저장 또는 투여를 위해 제조된 조성물들을 포함하기도 한다. 핵산 분자들의 전달을 위한 보충적 또는 보완적인 방법들은 예를 들어, Akhtar, et al., Trends Cell Bio. 2:139, 1992; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Maurer, et al., Mol Membr. Biol. 16:129-140, 1999; Holland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol. 137:165-192, 1999; and Lee, et al., ACS Symp . Ser. 752:184-192, 2000에 기술되어 있다. Sullivan, et al., International PCT Publication No. WO 94/02595는 효소 핵산 분자들의 전달을 위한 일반적인 방법들을 더 기술한다. 이러한 프로토콜들은 본 발명 내에서 고려되는 거의 모든 핵산 분자의 전달을 보충 또는 보완하는 데 이용될 수 있다.
핵산 분자들과 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들은 siNA와 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 단독을 포함하는 제형들 또는 약학적으로 수용가능한 담체, 희석제, 부형제, 보조제, 유화제, 완충액, 안정화제, 보존제 등과 같은 하나 이상의 추가적인 구성요소들을 더 포함하는 제형들 내의 투여를 포함하지만 여기에 한정되지 않는 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의하여 세포들에 투여될 수 있다. 몇몇 실시예들에서, siNA 및/또는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드는 리포솜 내에서 캡슐화 되거나, 이온영동법에 의하여 투여되거나, 히드로겔들, 사이클로덱스트린들, 생분해성 나노캡슐들, 생접착성 미세구들 또는 단백성 벡터들 같은 다른 운반체들 내로 혼입될 수 있다(O'Hare and Normand, International PCT Publication No. WO 00/53722 참조). 또한, 핵산/펩티드/운반체 조합은 직접 주사 또는 주입 펌프의 사용에 의하여 국소적으로 전달될 수 있다. 피하, 근육 내, 또는 피내에 의하든 본 발명의 핵산 분자들의 직접 주사는 표준 바늘 및 주사기 방법을 이용하거나 Conry, et al, Clin . Cancer Res. 5:2330-2337, 1999, 및 Barry, et al, International PCT Publication No. WO 99/31262에 기술된 무바늘 방법들을 이용하여 주사될 수 있다.
당해 발명의 조성물들은 약학적 제제들로 효과적으로 채용될 수 있다. 약학적 제제들은 환자의 질병 상태 또는 다른 바람직하지 않은 조건을 방지하거나 발생 또는 심화를 조절하거나 치료(하나 이상의 증세(들)을 검출 또는 측정 가능할 정도로 완화시킴)한다.
따라서, 추가적인 실시예들 내에서 본 발명은 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 조합, 복합되거나 접합되어, 희석제, 안정화제, 완충액 등과 같은 약학적으로-수용 가능한 담체와 선택적으로 제형된 통상적으로 하나 이상의 siNA들인 하나 이상의 폴리핵산(들)의 존재 또는 투여를 특징으로 하는 약학적 조성물들 및 방법들을 제공한다.
본 발명은 피검물의 특정한 질병 상태 또는 다른 바람직하지 않은 조건과 관련된 유전자들의 발현을 조절하는 단 간섭 핵산(siNA) 분자들을 제공함으로써 다른 목적들 및 장점들을 충족시킨다. 통상적으로, siNA는 피검물의 질병 상태 또는 바람직하지 않은 조건과 관련된 유발(causal) 또는 기여 인자(contributing factor)로서 격상된(elevated) 레벨에서 발현되는 유전자를 표적으로 할 것이다. 이러한 맥락에서, siNA는 하나 이상의 관련된 질병 증세들이 심화되거나 재발되는 것을 방지, 완화 또는 감소시킬 레벨들로까지 유전자의 발현을 효과적으로 하향 조절할 것이다. 또한, 표적 유전자의 발현이 질병 또는 다른 바람직하지 않은 조건의 결과 또는 계속(sequel)으로서 언제나 격상되는 것은 아닌 다양한 질병 모델들에 대하여, 표적 유전자의 하향 조절은 그럼에도 유전자 발현을 하향함으로써(즉, 선택된 mRNA 및/또는 표적 유전자의 단백질 산물의 레벨을 낮추어서) 치료되는 결과로 나타날 것이다. 또한, 본 발명의 siNA들은 유전자의 발현을 낮추어서, 그러한 표적 유전자의 산물 또는 활성에 의하여 그 발현이 억제적으로(negatively) 조절되는 "하위(downstream)" 유전자의 상향조절로 결과가 나타날 수 있다.
대표적인 실시예들 내에서, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 류마티스성 관절염 증세를 치료하거나 방지하기 위하여 종양 괴사 인자-α(TNF-α)의 발현을 조절하는 치료적 도구로서 유용하다. 이러한 맥락에서, 본 발명은 소 핵산 분자들을 사용한 RNA 간섭(RNAi)에 의해 TNF-α의 발현 및 활성을 조절하는 데 유용한 화합물들, 조성물들 및 방법들을 더 제공한다. 더 상세한 실시예들에서, 본 발명은 포유류 피검물들의 류마티스성 관절염 증세를 방지하거나 완화시킬 TNF-α 및/또는 TNF-α 유전자들의 표현을 조절하는 데 효과적인 단 간섭 핵산(siNA), 단 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(mRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 관련 방법들을 제공한다. 이러한 것들 및 관련된 치료 조성물들과 방법들 내에서, 화학적으로-변형된 siNA들을 사용하면 예를 들어, 생체 내 뉴클레아제 분해에 내성을 증가시키고/증가시키거나 세포 섭취의 개선을 통하여 천연 siNA 분자들의 특성과 비교하여 변형된 siNA들의 특성을 종종 개선 시킬 것이다. 본 개시에 따라서 용이하게 결정될 수 있는 바와 같이, 다수의 화학적 변형들을 가지는 유용한 siNA들은 그 RNAi 활성을 유지할 것이다. 따라서 당해 발명의 siNA 분자들은 다양한 치료, 진단, 표적 효과검증(target validation), 유전적 발견, 유전 공학 및 약제유전학적(pharmacogenomic) 응용들을 위한 유용한 시약들과 방법들을 제공한다.
본 발명의 이러한 siNA들은 예를 들어, 경피적으로 또는 국소 주사(예컨대, 건선(poriasis)을 치료하기 위하여 건선 플라크(psoriatic plaques)의 부위에 또는 건선 관절염(psoriatic arthritis) 또는 류마티스성 관절염으로 고통받는 환자들의 관절들 내로 국소 주사)와 같은 임의의 형태로 투여될 수 있다. 더 상세한 실시예들에서, 본 발명은 TNF-α의 mRNA에 대하여 siNA들의 치료상 유효량을 투여하여 TNF-α RNA를 효과적으로 하향-조절함으로써 하나 이상의 TNF-α- 관련 염증 상태(들)을 감소시키거나 방지하도록 제형들과 방법들을 제공한다. 그 발현이 선택된 질병 조건과 관련된 유발 또는 기여 인자로서 비정상적으로 증대되는 것으로 알려져 있는 수많은 유전자들 중 임의의 것을 포함하여, 동물 피검물들의 선택된 질병 조건과 관련된 하나 이상의 상이한 유전자들의 발현을 표적하는 필적할만한 방법들과 조성물들이 제공된다.
본 발명의 siNA/폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 혼합물들이 예를 들어, 류마티스성 관절염 또는 건선과 같은 염증성 질병들에 대해 효과적인 치료제들과 함께하는 것과 같이, 표적된 질병 조건에 대한 다른 표준 치료제들과 함께 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 병용적으로 유용하고 효과적인 제제들의 예들은 비-스테로이드성 소염제들(NSAID들), 메토트렉세이트(methotrexate), 금 화합물들, D-페니실라민(penicillamine), 항말라리아제들(antimalarials), 설파살라진(sulfasalazine), 글루코코르티코이드들(glucocorticoids) 및 인플릭시맵(infliximab)과 엔트라셉트(entracept)와 같은 다른 TNF-α 중화제들을 포함한다.
본 발명의 음으로 대전된 폴리뉴클레오티드들(예컨대, RNA 또는 DNA)은 약학적 조성물을 형성하도록 안정화제들과 완충제들 등을 사용하거나 사용하지 않는 임의의 표준 수단들에 의하여 환자에게 투여될 수 있다. 리포솜 전달 메커니즘의 이용이 바람직한 경우에, 리포솜들의 형성을 위한 표준 프로토콜들을 따를 수 있다. 본 발명의 조성물들은 또한 경구 투여용의 정제들, 캡슐들 또는 일릭서들, 직장 투여용의 좌약들, 주사식 투여용 살균액들, 현탁액들 및 업계에 알려진 다른 조성물들로서 제형되고 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 조성물들의 약학적으로 수용가능한 제형들을 포함한다. 이러한 제형들은 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 아세트산 및 벤젠 술폰산의 염들처럼 산 첨가 염들과 같은 상기 화합물들의 염들을 포함한다.
약리학적 조성물 또는 제형은 예를 들어, 인간을 포함하는 세포 또는 환자 내로 예컨대, 전신성 투여와 같은 투여에 적합한 형태로의 조성물 또는 제형을 칭한다. 적절한 형태들이란 예를 들어, 경구, 경피 또는 주사에 의한 사용 및 입수 경로에 부분적으로 의존한다. 그러한 형태들은 조성물 또는 제형이 표적 세포(즉, 음으로 대전된 핵산이 바람직하게 전달되는 세포)에 이르지 못하도록 해서는 안 된다. 예를 들어, 혈류 내로 주사되는 약학적 조성물들은 가용성이어야 한다. 다른 인자들이 업계에 알려져 있으며, 독성과 같은 고려사항들을 포함한다.
"전신성 투여"라고 하면 혈류 내에 약물을 생체 내 전신 흡수 또는 축적하고 신체 전체를 통한 분산이 뒤따르는 것을 의미한다. 전신 흡수되는 투여 경로들은 제한 없이 정맥 내, 피하, 복강 내, 흡입, 구강, 폐내 및 근육 내를 포함한다. 이러한 투여 경로들의 각각은 예컨대, 핵산들과 같이 원하는 음으로 대전된 고분자들을 접근가능한 병든 조직으로 노출시킨다. 약물이 입수되어 순환되는 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것을 보여준다. 당해 발명의 화합물들을 포함하는 리포솜 또는 다른 약물 담체를 사용하게 되면 예를 들어, 망상 내피 계통(RES)의 조직들과 같은 몇몇 조직 유형들 내에 약물을 잠재적으로 국소화할 수 있다. 림프구들 및 대식세포들과 같은 세포들의 표면과 약물의 결합을 용이하게 할 수 있는 리포솜 형성도 유용하다. 이러한 접근법은 암 세포들과 같은 비정상 세포들의 대식 세포 및 림프구 면역 인식의 특이성을 이용함으로써 표적 세포들에 약물의 향상된 전달을 제공할 수 있다.
"약학적으로 수용가능한 제형"이라는 의미는 당해 발명의 핵산 분자들을 그 원하는 활성에 가장 적합한 신체적 부위에 효과적으로 분산시키게 하는 조성물 또는 제형을 의미한다. 당해 발명의 핵산 분자들과의 제형에 적합한 제제들의 비한정적 예들은 중추 신경계로 약물들의 입수를 향상시킬 수 있는 P-당단백질 억제제들(플루로닉 P85 등)(Jolliet-Riant and Tillement, Fundam . Clin . Pharmacol. 13:16-26, 1999); 뇌내 이식 후 서방성 전달을 위한 폴리(DL-락티드-코글리콜리드) 미세구들과 같은 생분해성 고분자들(Emerich, D.F., et al., Cell Transplant 8:47-58, 1999) (Alkermes, Inc. Cambridge, Mass.); 및 혈액 뇌관문을 관통하여 약물을 전달하고 뉴런성 섭취 메커니즘들을 변경시킬 폴리부틸사이아노아크릴레이트로 구성된 것과 같은 혼합된 나노파티클들을 포함한다(Prog . Neuropsychopharmacol Biol . Psychiatry 23:941-949, 1999). 당해 발명의 핵산 분자들에 대한 전달 전략들의 다른 비한정적 예들은 Boado, et al., J. Pharm . Sci. 87:1308-1315, 1998; Tyler, et al., FEBS Lett. 421:280-284, 1999; Pardridge, et al., PNAS USA. 92:5592-5596, 1995; Boado, Adv . Drug Delivery Rev. 15:73-107, 1995; Aldrian-Herrada, et al., Nucleic Acids Res. 26:4910-4916, 1998; 및 Tyler, et al., PNAS USA. .96:7053-7058, 1999에 기술된 물질을 포함한다.
본 발명은 또한 약학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제 내에 원하는 화합물들의 약학적 유효량을 포함하는, 저장 또는 투여를 위해 제조된 조성물들을 포함한다. 치료용의 수용가능한 담체 또는 희석제들은 약학 업계에 잘 알려져 있으며 예를 들어, 여기에 참고로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro ed., 1985에 기술되어 있다. 예를 들어, 보존제들, 안정화제들, 염료들 및 향미료들이 제공될 수 있다. 이러한 것들은 벤조산 나트륨, 소르브산 및 p-하이드록시 벤조산의 에스테르들을 포함한다. 또한, 항산화제들 및 현탁제들이 사용될 수 있다.
약학적으로 유효한 투여량은 질병 상태의 발생을 방지, 억제하거나 치료(증세를 어느 정도로, 바람직하게는 모든 증세들을 완화시킴)하는 데 필요한 투여량이다. 약학적으로 유효한 투여량은 질병 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유류의 유형, 고려되는 특이적 포유류의 신체적 특징, 공동작용 약제 및 의약 업계의 당업자들이 인식할 다른 요인들에 의존한다. 일반적으로, 음으로 대전된 고분자의 약효에 의존하여 활성 성분들의 0.1 mg/kg 체중/일(body weight/day)에서 100 mg/kg 체중/일 사이의 양이 투여된다.
본 개시와 그 제형들의 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 통상적인 비독성의 약학적으로 수용가능한 담체들, 보조제들 및/또는 운반체들을 포함하는 투여 단위 제형으로 구강, 국소, 비경구적으로, 흡입 또는 스프레이에 의하거나 직장으로 투여될 수 있다. 여기에 사용된 비경구적이라는 용어는 경피, 피하, 혈관 내(예컨대, 정맥 내), 근육 내 또는 척수강 내 주사 또는 주입 기법들 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자와 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학적 제형이 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자들은 하나 이상의 비독성의 약학적으로 수용가능한 담체들 및/또는 희석제들 및/또는 보조제들 및 원한다면 다른 활성 성분들과 공동으로 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자들을 포함하는 약학적 조성물들은 예를 들어, 정제들, 트로키제들(troches), 함당정제들(lozenges), 수용성 또는 유성 현탁액들, 분산성 분말들 또는 과립제들, 유탁액들, 경질 또는 연질 캡슐들, 또는 시럽들 또는 일릭서들과 같은 경구용으로 적합한 형태일 수 있다.
경구용으로 의도된 조성물들은 약학적 조성물들의 제조를 위해 업계에 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며 그러한 조성물들은 약학적으로 뛰어나고 입맛에 맞는 제제들을 제공하기 위하여 하나 이상의 그러한 감미료들, 향미료들, 착색제들 또는 보존제들을 포함할 수 있다. 정제들은 이들의 제조에 적합한 비독성의 약학적으로 수용가능한 부형제들과 혼합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 부형제들은 예를 들어, 탄산 칼슘, 탄산 나트륨, 젖당, 인산 칼슘 또는 인산 나트륨과 같은 비활성 희석제들; 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립화제들 또는 붕해제들; 예를 들어, 전분, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제들; 및 예를 들어 스테아린산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제들일 수 있다. 정제들은 코팅되지 않을 수 있으며, 알려진 기법들에 의하여 코팅될 수 있다. 몇몇 경우에 그러한 코팅들은 위장관 내에서 붕해와 흡수를 지연시키는 알려진 기법들에 의하여 제조될 수 있으며 이로 인하여 더 오랜 기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트(glyceryl monostearate) 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 채용될 수 있다.
경구용 제형들은 그 활성 성분이 예를 들어, 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 고령토와 같은 비활성 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐들로서 제시되거나 그 활성 성분이 예를 들어, 낙화생 기름, 액체 파라핀 또는 올리브 기름과 같은 수성 또는 유성 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐들로 제시될 수 있다.
수용성 현탁액들은 수용성 현탁액들의 제조에 적합한 부형제들과 혼합된 활성 성분들을 포함한다. 그러한 부형제들은 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 메틸셀룰로오스, 하이드로프로필-메틸셀룰로오스(hydropropyl-methylcellulose), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 트라가칸트 검(gum tragacanth) 및 아카시아 검(gum acacia)과 같은 현탁제들이며; 분산제들 또는 습윤제들(dispersing or wetting agents)은 예를 들어, 레시틴과 같은 자연발생적 인지질(phosphatide) 또는 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트(polyoxyethylene stearate)와 같은 지방산들과의 알킬렌 산화물의 축합물들(condensation products) 또는 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같은 장쇄(long chain) 지방족 알코올들과의 에틸렌 산화물의 축합물들 또는 지방산들 및 폴리에틸렌 소르비톨 모노올레에이트(polyethylene sorbitol monooleate)와 같은 헥시톨(hexitol)로부터 유도된 일부 에스테르들과 에틸렌 산화물의 축합물들 또는 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(polyethylene sorbitan monooleate)와 같은 지방산들 및 헥시톨 안하이드라이드들(hexitol anhydrides)로부터 유도된 일부 에스테르들과 에틸렌 산화물의 축합물들일 수 있다. 수용성 현탁액들은 또한 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트(hydroxybenzoate)와 같은 하나 이상의 보존제들, 하나 이상의 착색제들, 하나 이상의 향미료들 및 설탕 또는 사카린과 같은 하나 이상의 감미료들을 포함할 수 있다.
유성 현탁액들은 예를 들어, 낙화생 기름(arachis oil), 올리브 기름, 참기름, 또는 코코넛 기름과 같은 식물성 기름 또는 액체 파라핀과 같은 미네랄유(mineral oil)에 활성 성분들을 현탁시켜 제형될 수 있다. 상기 유성 현탁액들은 예를 들어, 밀랍, 경파라핀 또는 세틸 알코올(cetyl alcohol)과 같은 증점제를 포함할 수 있다. 입에 맞는 경구 제제들을 제공하기 위하여 감미료들 및 향미료들이 첨가될 수 있다. 이러한 조성물들은 아스코르브산과 같은 항-산화제를 첨가하여 보존될 수 있다.
물을 첨가하여 수용성 현탁액의 제제에 적합한 분산성 분말들 및 과립들은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제들과 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제들 또는 습윤제들 또는 현탁제들은 상기에서 이미 언급된 제제들에 의해 예시된다. 예를 들어, 감미료, 향미료 및 착색제들과 같은 다른 부형제들도 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물들은 또한 수중유적형(oil-in-water) 유탁액들의 형태일 수 있다. 유상(oily phase)은 식물성 기름 또는 미네랄유 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제들은 예를 들어, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검과 같은 자연발생적 검들, 예를 들어 대두, 레시틴 및 지방산들 및 헥시톨로부터 유도된 에스테르들 또는 일부 에스테르들과 같은 자연발생적 인지질들, 예를 들어 소르비탄 모노올레이트와 같은 무수물들, 및 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은 에틸렌 산화물과의 상기 일부 에스테르들과의 축합물들일 수 있다. 상기 유탁액들은 감미료 및 향미료들도 포함할 수 있다.
시럽들과 일릭서들은 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 포도당 또는 글루코스 또는 수크로스와 같은 감미제들과 제형될 수 있다. 그러한 제형들은 완화제(demulcent), 보존제 및 향미료들 및 착색제들을 포함할 수도 있다. 약학적 조성물들은 살균 주사용 수용성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상기에 언급된 적절한 분산제들 또는 습윤제들 및 현탁제들을 이용하는 알려진 기술에 따라서 제형될 수 있다. 주사용 제제는 예를 들어, 1,3-부탄디올 내의 용액과 같은 비독성이며 비경구적으로 수용가능한 희석제나 용매의 살균된 주사용 용액 또는 현탁액일 수도 있다. 채용될 수 있는 수용가능한 운반체들과 용매들은 물, 링거액 및 등장성 염화 나트륨 용액이다. 또한, 살균 고정유(fixed oil)들이 용매 또는 분산 매체로 통상적으로 채용된다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노 또는 디글리세라이드들을 포함하는 임의의 완화성 지방유(bland fixed oil)가 채용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산들이 주사용 제제에 사용된다.
여기에 개시된 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 예컨대, 약물의 직장 투여를 위하여 좌약 형태로 투여될 수도 있다. 이러한 조성물들은 상온에서 고체이지만 직장 온도에서는 액체로서 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적합한 비자극성 부형제와 약물을 혼합하여 제조될 수 있다. 그러한 물질들은 코코아 버터와 폴리에틸렌 글리콜들을 포함한다.
여기에 개시된 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 살균 매질내에 비경구적으로 투여될 수 있다. 운반체와 사용된 농도에 의존하는 약물은 운반체 내에 현탁되거나 용해될 수 있다. 유리하게도, 국소 마취제, 보존제들 및 완충제들이 운반체 내에 용해될 수 있다.
매일 체중 1 킬로그램당 약 0.1 ㎎ 내지 약 140 ㎎ 정도의 투여량 레벨들이 상기 지시된 상태들의 치료에 유용하다(매일 환자 한 명당 약 0.5 ㎎ 내지 약 7 g). 단일한 투여 형태를 생성하는 담체 물질들과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주와 특정한 투여 방식에 의존하여 다양하다. 투여량 단위 형태들은 일반적으로 활성 성분의 약 1 ㎎ 내지 약 500 ㎎ 사이를 포함한다.
임의의 특정한 환자에 대한 특이적인 투여량 수준은 채용된 특이적인 화합물의 활성, 연령, 체중, 총체적 건강, 성별, 식사, 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도, 약물 조합 및 치료법을 경험하는 특정 질병의 심화를 포함하는 다양한 인자들에 의존한다는 것을 알아야 한다.
인간이 아닌 동물들에의 투여를 위하여, 조성물이 동물 사료 또는 마시는 물에 첨가될 수 있다. 동물이 그 식사와 함께 치료상 적절한 양의 조성물을 섭취하도록 동물 사료와 마시는 물 조성물들을 제형하는 것이 간편할 수 있다. 사료 또는 마시는 물에 첨가하기 위한 예비혼합물(premix)로서 조성물을 제공하는 것도 간편할 수도 있다.
전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들은 다른 치료성 화합물들과 조합하여 환자에게 투여되어 전체 치료 효과를 증가시킬 수도 있다. 전조(indication)를 처리하는 다양한 화합물들을 사용하면 유익한 효과를 증가시키면서 부작용들이 발생하는 것을 줄일 수 있다.
일 실시예에서, 발명의 조성물들은 간세포들과 같은 특이적인 세포 유형들에 전달-증진 폴리펩티드/siNA 접합체들을 투여하는 데 적합하다. 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)은 간세포들에 특유하며 아시알로오로소뮤코이드(ASOR)과 같은 가지친 갈락토스-터미널 당단백질들을 결합시킨다. WuThe siNA들은 광범위하게 변형되어 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-H와 같은 뉴클레아제 내성이 있는 기들과의 변형에 의하여 안정성을 증진시킬 수 있다(검토를 위하여 Usman and Cedergren, TIBS 17:34, 1992; Usman, et al., Nucleic Acids Symp . Ser. 31:163, 1994 참조). siNA 구조체들은 일반적인 방법들을 이용하는 겔 전기영동법에 의하여 정제될 수 있거나 고압 액체 크로마토그래피에 의하여 정제 정제되고 물에 재 현탁될 수 있다.
변형된 핵산 분자들(염기, 당 및/또는 인산염)을 화학적으로 합성하면 그 역가를 증가시킬 수 있는 혈청 리보뉴클레아제들에 의한 그 분해를 방지할 수 있다. 예컨대, Eckstein, et al., International Publication No. WO 92/07065; Perrault, et al., Nature 344:565, 1990; Pieken, et al., Science 253:314, 1991; Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 17:334, 1992; Usman, et al., International Publication No. WO 93/15187; and Rossi, et al., International Publication No. WO 91/03162; Sproat, U.S. Patent No. 5,334,711; Gold, et al., U.S. Patent No. 6,300,074 참조. 상기 모든 참고자료들은 여기에 기술된 핵산 분자들의 염기, 인산염 및/또는 당 모이어티들에 가해질 수 있는 다양한 화학적 변형들을 기술한다.
업계에서는 그 뉴클레아제 안정성과 효능에서 상당히 증진된 핵산 분자들로 도입될 수 있는 당, 염기 및 인산염 변형들을 기술하는 몇몇 예들이 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드들은 변형되어 안정성을 증진시키고/시키거나 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-H와 같은 뉴클레아제 내성이 있는 변형과 같은 뉴클레오티드 염기 변형들에 의한 생물학적 활성을 증진시킨다. 검토를 위하여, Usman and Cedergren, TIBS 17:34, 1992; Usman, et al., Nucleic Acids Symp . Ser. 31:163, 1994; Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996을 참조. 핵산 분자들의 당 변형은 업계에서 광범위하게 기술되어 있다. Eckstein, et al., International Publication PCT No. WO 92/07065; Perrault, et al., Nature 344:565-56%, 1990; Pieken, et al., Science 253:314-317, 1991; Usman and Cedergren, Trends in Biochem . Sci. 17:334-339, 1992; Usman, et al., International Publication PCT No. WO 93/15187; Sproat, U.S. Patent No. 5,334,711 and Beigelman, et al., J. Biol . Chem. 270:25702, 1995; Beigelman, et al., International PCT Publication No. WO 97/26270; Beigelman, et al., U.S. Patent No. 5,716,824; Usman, et al., U.S. Patent No. 5,627,053; Woolf, et al., International PCT Publication No. WO 98/13526; Thompson, et al., Karpeisky, et al., Tetrahedron Lett. 39:1131, 1998; Earnshaw and Gait, Biopolymers ( Nucleic Acid Sciences ) 48:39-55, 1998; Verma and Eckstein, Annu . Rev. Biochem. 67:99-134, 1998; and Burlina, et al., Bioorg . Med . Chem. 5:1999-2010, 1997 참조. 그러한 발간물들은 촉매작용 조절 없이 당, 염기 및/또는 인산염 변형들 등의 핵산 분자들로의 혼입 위치를 결정하는 일반적인 방법들과 전략들을 기술한다. 그러한 가르침들을 고려하여, 세포 내에서 RNAi를 촉진하는 siNA의 능력이 상당히 억제되지 않기만 하면 당해 발명의 siNA 핵산 분자들을 변형시키기 위하여 여기에 기술된 바와 같이 유사한 변형들이 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 인터뉴클레오티드 연쇄들을 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및/또는 5'-메틸포스포네이트 연쇄들로 화학적 변형시키면 안정성을 개선시키는 반면에, 과도한 변형들은 어느 정도 독성이나 활성 감소를 유발시킬 수 있다. 그러므로, 핵산 분자들을 설계하는 경우, 이러한 인터뉴클레오티드 연쇄들의 양을 최소화하여야 한다. 이러한 연쇄들의 농도 감소는 독성을 감소시켜, 효능이 증가하여야 하며, Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432, 1987 참조. 그러한 당단백질들이나 합성 당접합체들을 수용체와의 결합은 예를 들어, 이중촉각(biatennarry) 또는 단일촉각(monoatennary) 사슬들보다 삼중촉각 구조들이 더 큰 친화도로 결합되는 것과 같이 올리고당 사슬의 가지치기 정도에 강력히 의존하는 친화도를 지닌 채로 발생한다. Baenziger and Fiete, Cell 22:611-620, 1980, and Connolly, et al., J. Biol . Chem. 257:939-945, 1982 참조. Lee와 Lee는 갈락토스에 비하여 수용체에 대하여 더 높은 친화도를 가진 탄수화물 모이어티로서 N-아세틸-D-갈락토사민의 사용을 통하여 이러한 높은 특이성을 얻었다. Glycoconjugate J. 4:317-328, 1987 참조. 이러한 "클러스터링 효과"는 마노실-종결하는 당단백질들 또는 당접합체들(glycoconjugates)의 결합과 섭취에 대하여 기술되었다. Ponpipom, et al., J. Med . Chem. 24:1388-1395, 1981 참조. 세포막들을 관통하여 외생성 화합물들을 수송하는 갈락토스와 갈락토사민 뉴클레오티드된 접합체들을 사용하면 HBV 감염이나 간세포 암종과 같은 간 질병의 치료에 표적 전달 접근법을 제공할 수 있다. 생접합체들(bioconjugates)을 사용하면 치료에 필요한 치료성 화합물들의 필요한 투여량에 감소를 제공할 수도 있다. 또한, 치료성 생체이용도, 약역학 및 약동학 파라미터들은 본 발명의 핵산 생접합체들의 사용을 통하여 조절될 수 있다. 이러한 분자들의 더 높은 특이성.
일 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 모르폴리노, 카르바민산 아미데이트, 카르복시메틸, 아세트아미드, 폴리아미드, 설포네이트, 설포아미드, 설파메이트, 포르마세탈, 티오포르마세탈 및/또는 알킬실릴 치환들을 포함하는 인산염 골격 변형들을 지닌 변형된 siNA 분자들을 특징으로 한다. 올리고뉴클레오티드 골격 변형들의 검토를 위하여, Hunziker and Leumann, "Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods," VCH, 331-417, 1995, and Mesmaeker, et al., "Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research," ACS, 24-39, 1994 참조.
핵산 분자들의 전달에 대한 방법들은 Akhtar, et al., Trends Cell Bio. 2:139, 1992; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Maurer, et al., Mol . Membr . Biol. 16:129-140, 1999; Hofland and Huang, Handb . Exp . Pharmacol. 137:165-192, 1999; and Lee, et al., ACS Symp. Ser. 752:184-192, 2000에 기술되어 있다. Beigelman, et al., U.S. Patent No. 6,395,713 and Sullivan, et al., PCT WO 94/02595는 핵산 분자들의 전달에 대한 일반적인 방법들을 더 기술한다. 이러한 프로토콜들은 거의 모든 핵산 분자의 전달에 대하여 이용될 수 있다. 핵산 분자들은 리포솜 내에서 캡슐화 되거나, 이온영동법에 의하거나, 생분해성 고분자들, 히드로겔들, 사이클로덱스트린들(예를 들어, Gonzalez, et al., Bioconjugate Chem. 70:1068-1074, 1999; Wang, et al., International PCT Publication Nos. WO 03/47518 and WO 03/46185 참조), 폴리(락틱-코-글리콜)산(PLGA) 및 PLCA 미세구들(예를 들어, U.S. Patent No. 6,447,796 and U.S. Patent Application Publication No. US 2002130430 참조), 생분해성 나노캡슐들 및 생접착성 미세구들, 또는 단백성 벡터들(O'Hare and Normand, International PCT Publication No. WO 00/53722)에 의한 것을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 당업자에게 알려진 다양한 방법들에 의하여 세포들에 투여될 수 있다. 또한, 핵산/운반체 조합은 직접 주사에 의하거나 주입 펌프의 사용에 의하여 국소적으로 전달된다. 피하, 근육 내, 또는 피내에 의하든 본 발명의 핵산 분자들의 직접 주사는 표준 바늘 및 주사기 방법을 이용하거나 Conry, et al, Clin . Cancer Res. 5:2330-2337, 1999, 및 Barry, et al, International PCT Publication No. WO 99/31262에 기술된 무바늘 방법들을 이용하여 주사될 수 있다. 당해 발명의 분자들은 약학적 제제들로 사용될 수 있다. 약학적 제제들은 피검물의 질병 상태를 방지, 발생을 조절 또는 치료(증세를 어느 정도로, 바람직하게는 모든 증세들을 완화시킴)한다.
"리간드"라는 용어는 수용체와 같은 다른 화합물과 직접 또는 간접으로 상호작용할 수 있는 약물, 펩티드, 호르몬 또는 신경전달 물질과 같은 임의의 화합물 또는 분자를 의미한다. 리간드와 상호작용하는 수용체는 세포의 표면상에 존재할 수 있거나 다르게는 세포간 수용체일 수 있다. 리간드의 수용체와의 상호작용은 생화학적 반응으로 나타날 수 있거나 단순히 물리적 상호작용 또는 결합일 수 있다.
여기에 사용된 "비대칭 헤어핀"이란 안티센스 영역, 뉴클레오티드들 또는 비-뉴클레오티드들을 포함할 수 있는 루프 부분, 및 센스 영역이 안티센스 영역과 염기쌍에서 충분한 상보적 뉴클레오티드들 가지고 있어 루프를 지닌 듀플렉스를 형성할 정도로 안티센스 영역보다 더 적은 수의 뉴클레오티드들을 포함하는 센스 영역을 포함하는 선형 siNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 T-세포 내에서 RNAi를 매개하기에 충분한 길이를 가지는 안티센스 영역(예컨대, 약 19 내지 약 22 개(예컨대, 약 19, 20, 21 또는 22 개)의 뉴클레오티드들) 및 약 4 개 내지 약 8 개(예컨대, 약 4, 5, 6, 7 또는 8 개)의 뉴클레오티드를 포함하는 루프 영역 및 상기 안티센스 영역에 상보적인 약 3 개 내지 약 18 개(예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개)의 뉴클레오티드들을 가지는 센스 영역을 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 화학적으로 변형될 수 있는 5'-터미널 인산염 기도 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자의 루프 부분은 여기에 기술된 바와 같이 뉴클레오티드들, 비-뉴클레오티드들, 링커 분자들, 또는 접합체 분자들을 포함할 수 있다.
여기에 사용된 "비대칭 듀플렉스"는 센스 영역과 안티센스 영역을 포함하는 두 개의 분리된 가닥을 가지는 siNA 분자로서, 상기 센스 영역이 상기 안티센스 영역과 염기쌍에서 충분한 상보적 뉴클레오티드들 가지고 있어 듀플렉스를 형성할 정도로 안티센스 영역보다 더 적은 수의 뉴클레오티드들을 포함하는 siNA 분자를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 비대칭 siNA 분자는 T-세포 내에서 RNAi를 매개하기에 충분한 길이를 가지는 안티센스 영역(예컨대, 약 19 내지 약 22 개(예컨대, 약 19, 20, 21 또는 22 개)의 뉴클레오티드들) 및 안티센스 영역에 상보적인 약 3 개 내지 약 18 개(예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개)의 뉴클레오티드들을 가지는 센스 영역을 포함할 수 있다.
"유전자 발현을 조절하다"라는 것은 세포 내에 존재하는 mRNA 레벨들의 상향조절(upregulation)이나 하향조절 또는 mRNA 번역의 상향조절이나 하향조절 또는 상기 표적 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질 또는 단백질 서브유니트들(subunits)들의 합성의 상향조절이나 하향조절을 포함할 수 있는 표적 유전자의 발현이 상향조절 또는 하양조절되는 것을 의미한다. 상기 피검물 단백질 또는 서브유니트의 발현, 레벨 또는 활성이 조절자(예컨대, siRNA)의 부재시에 관찰되는 것보다 초과하거나 미달하도록 상기 표적 유전자에 의해 상향조절되거나 하향조절되도록 엔코딩되는 하나 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유니트들의 존재, 수량 또는 활성에 대하여 유전자 발현의 조절을 결정할 수 있다. 예를 들어, "조절하다"라는 용어는 "억제하다"를 의미할 수 있지만, "조절하다"라는 단어의 사용은 이러한 정의에 한정되지 않는다.
발현을 "억제하다", "하향조절하다" 또는 "감소시키다"라는 것은 유전자의 발현 또는 하나 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유니트들을 엔코딩하는 RNA 분자들 또는 동등한(equivalent) RNA 분자들의 레벨이나 표적 유전자에 의해 엔코딩되는 하나 이상의 단백질들 또는 단백질 서브유니트들의 레벨 또는 활성이 본 발명의 핵산 분자들(예컨대, siNA)이 부재시에 관찰되는 것 미만으로 감소되는 것을 의미한다. 일 실시예에서, siNA 분자로의 억제, 하향조절 또는 감소는 비활성이나 약독화된(attenuated) 분자가 존재시에 관찰되는 레벨 미만이다. 다른 실시예에서, siNA 분자들로의 억제, 하향조절 또는 감소는 예를 들어, 뒤섞인(scrambled) 서열 또는 부정합들을 지닌 siNA 분자가 존재시에 관찰되는 레벨 미만이다. 다른 실시예에서, 당해 발명의 핵산 분자로의 유전자 발현의 억제, 하향조절 또는 감소는 상기 핵산 분자가 부존재시 보다는 존재시에 더 크다.
유전자 "침묵"은 세포 내에서 유전자 발현의 표적된 억제를 통하여 기능의 부분적 또는 전체적 손실을 의미하며 또한 "녹다운(knock down)"으로도 불릴 수 있다. 해결해야 할 상황 및 생물학적 문제에 따라 유전자 발현을 부분적으로 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 유전자 발현을 가능한 최대로 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 침묵의 정도는 International Publication No. WO 99/32619에 그 일부가 요약되어 있는 업계에 알려진 방법들에 의하여 결정될 수 있다. 시험법에 따라서, 유전자 발현의 정량화는 특정한 질병 상태들 또는 치료를 표적으로 하는 다른 조건들과 연관될 수 있는 격상된 발현 레벨들을 포함하여, mRNA 레벨들 또는 단백질 레벨들 또는 활성으로 환산해 보건대 예를 들어, 기준(즉, 정상)의 10 %, 30 %, 50 %, 75 %, 90 %, 95 % 또는 95 % 이상 또는 다른 대조 레벨들로 표적 유전자 발현을 녹다운할 수 있는 예방 및 치료 방법들을 포함하여, 본 발명의 몇몇 실시예들에서 원하는 만큼의 다양한 억제량을 검출할 수 있게 한다.
"표적 유전자의 발현을 억제하는"이라는 어귀는 표적 유전자의 유전자 침묵을 개시하는 본 발명의 siNA의 능력을 의미한다. 유전자 침묵의 정도를 검사하기 위하여, 중요한 기관 또는 배지 내에서 특정한 구조체를 발현하는 세포들의 표본들이나 시험법들을 상기 구조체의 발현이 부족한 대조 표본들과 비교한다. 대조 표본들(구조체 발현이 부족함)은 100 %의 상대 수치로 지정된다. 상기 대조와 비교한 시험 수치가 약 90 %, 종종 50 % 그리고 몇몇 실시예들에서 25 내지 0 %일 경우 표적 유전자의 발현의 억제가 달성된다. 적합한 시험법들은 표현형 시험법들(phenotypic assays)뿐만 아니라 예컨대, 도트 블롯(dot blots), 노던 블롯(Northern blots), 제자리 혼성화(in situ hybridization), ELISA, 면역침강반응(immunoprecipitation), 효소 기능(enzyme function)과 같은 당업자에게 알려진 기법들을 이용한 단백질 또는 mRNA 레벨들의 검사를 포함한다.
"피검물"라는 것은 피검물 또는 외식된 세포들 또는 스스로 siNA 전달에 대한 피검물들인 세포들의 공여자 또는 피이식자로서의 유기체를 포함할 수 있는 유기체, 조직 또는 세포를 의미한다. 그러므로, "피검물"은 본 발명의 핵산 분자들이 여기에 서술된 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드들에 투여되고 증진될 수 있는 생체 외(in vitro or ex vivo) 기관, 조직 또는 세포 피검물들을 포함하는 유기체, 기관, 조직 또는 세포를 의미할 수 있다. 대표적인 피검물들은 예를 들어, 인간 환자들 또는 세포들과 같은 포유류 개체들 또는 세포들을 포함한다.
여기에 사용된 "세포"는 일상적인 생물학적 의미로 사용되고, 예컨대, 특이적으로는 인간을 뜻하지 않는 것과 같이 완전한 다세포 유기체를 뜻하는 것이 아니다. 상기 세포는 예컨대, 조류(birds), 식물 및 인간, 암소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개 및 고양이와 같은 포유류처럼 유기체 내에 존재할 수 있다. 상기 세포는 원핵성(예컨대, 박테리아 세포) 또는 진핵성(예컨대, 포유류 또는 식물 세포)일 수 있다. 상기 세포는 체세포 또는 생식 계통 기원, 분화 전능(totipotent) 또는 분화 다능(pluripotent), 분할 또는 비-분할일 수 있다. 상기 세포는 또한 배우체(gamete) 또는 배아, 줄기 세포 또는 완전히 분화된 세포로부터 유도될 수도 있고 이들을 포함할 수 있다.
"벡터들"은 원하는 핵산을 전달하는 데 이용된 임의의 핵산-계 및/또는 바이러스-계 기법을 의미한다.
"포함하는(comprising)"은 "포함하는"이라는 단어를 따르는 것은 어느 것이나 포함하지만, 거기에 한정되지 않음을 의미한다. 따라서, "포함하는"이라는 용어의 사용은 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적이지만 다른 요소들은 선택적이고 존재 또는 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. "구성된(consisting of)"은 "구성된"이라는 어귀를 따르는 것은 어느 것이나 포함하고, 거기에 한정됨을 의미한다. 따라서, "구성된"이라는 어귀는 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적이지만 다른 요소들은 전혀 존재할 수 없는 것을 나타낸다. "필수적으로 구성된(consisting essentially of)"은 상기 어귀 다음에 나열된 임의의 요소들을 포함하고, 본 개시에서 상기 나열된 요소들을 위하여 명시된 활성 또는 행동에 간섭하거나 기여하지 않는 다른 요소들에 한정되는 것을 의미한다. 따라서, "필수적으로 구성된"이라는 어귀는 나열된 요소들이 필수적이거나 강제적이지만, 다른 요소들은 선택적이고 나열된 요소들의 활성 또는 행동에 영향을 주느냐의 여부에 따라 존재할 수도 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다.
"RNA"는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 .베타.-D-리보푸라노즈(ribofuranose) 모이어티의 2' 위치에서 하이드록시 기를 지닌 뉴클레오티드를 의미한다. 상기 "RNA"라는 용어는 하나 이상의 뉴클레오티드들의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변성(alteration)에 의하여 자연발생적 RNA와는 다른 변성된 RNA뿐만 아니라 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합으로 생산된 RNA와 같은 분리된 RNA를 포함한다. 그러한 변성들은 예를 들어, RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드들에서 siNA의 말단(들) 또는 내부적으로 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNA 분자들에서의 뉴클레오티드들은 자연발생적 뉴클레오티드들이나 화학적으로 합성된 뉴클레오티드들 또는 디옥시뉴클레오티드들과 같은 비-표준 뉴클레오티드들도 포함할 수 있다. 이러한 변성된 RNA들은 유사체 또는 자연발생적 RNA의 유사체라 칭할 수 있다.
"고도로 보존된 서열 영역(highly conserved sequence region)"은 한 세대로부터 다른 세대로 또는 하나의 생물학적 시스템으로부터 다른 시스템으로 상당히 변하지 않는 표적 유전자 내에서의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"센스 영역"은 siNA 분자의 안티센스 영역에 상보성을 가지는 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 또한, siNA 분자의 상기 센스 영역은 표적 핵산 서열과 상동성을 지닌 핵산 서열을 포함할 수 있다.
"안티센스 영역"은 표적 핵산 서열에 상보성을 가지는 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 또한, siNA 분자의 안티센스 영역은 siNA 분자의 센스 영역에 상보성을 가지는 핵산 서열을 선택적으로 포함할 수 있다.
"표적 핵산"은 그 발현 또는 활성이 조절될 수 있는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
"상보성"은 통상적인 왓슨-크리크 유형들 또는 다른 비-통상적인 유형들 중 어느 하나에 의하여 다른 핵산 서열과 핵산이 수소 결합(들)을 형성할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 핵산 분자들을 참조하면, 그 상보적 서열과 핵산 분자에 결합 자유 에너지는 예컨대, RNAi 활성과 같은 핵산 분자의 적절한 기능이 처리되게 하기에 충분하다. 핵산 분자들에 대한 결합 자유 에너지들의 측정은 업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Turner, et al., CSH Symp . Quant . Biol., LII, 1987, pp. 123-133; Frier, et al., Proc . Nat . Acad . Sd . USA 83:9373-9377, 1986; Turner, et al., J Am . Chem . Soc. 109:3783-3785, 1987 참조). 퍼센트 상보성은 제 2 핵산 서열과 수소 결합들(예컨대, 왓슨-크리크 염기쌍 지음)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내에서 인접한(contiguous) 잔기들들의 백분율을 나타낸다(예컨대, 10 개의 뉴클레오티드들을 가지는 제 2 핵산 서열에 제 1 올리뉴클레오티드의 전체 10 개의 뉴클레오티드들 중 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 뉴클레오티드들이 염기쌍을 이루는 경우 각각 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 및 100 % 상보성을 나타낸다). "완전히 상보적"이라는 것은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기들이 제 2 핵산 서열 내의 동일한 수의 인접한 잔기들과 수소 결합을 이루는 것을 의미한다.
여기에 사용된 "유니버셜 염기(universal base)"라는 용어는 천연 DNA/RNA 염기들 각각과 그들 사이에 차이가 거의 없이 염기쌍들을 형성하는 뉴클레오티드 염기 유사체들을 의미한다. 유니버셜 염기들의 비한정적 예들은 C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족 유도체들, 이노신(inosine), 아졸 카복사마이드들(azole carboxamides) 및 업계에 알려진 3-니트로피롤(nitropyrrole), 4-니트로인돌(nitroindole), 5-니트로인돌 및 6-니트로인돌과 같은 니트로아졸(nitroazole) 유도체들을 포함한다(예를 들어, Loakes, Nucleic Acids Research 29:2437-2447, 2001 참조).
여기에 사용된 "비사이클릭 뉴클레오티드(acyclic nucleotide)"라는 용어는 예를 들어, 리보오스 탄소들의 임의의 것(C1, C2, C3, C4 또는 C5)이 뉴클레오티드로 개별적으로 또는 조합하여 부재하는 곳의 비사이클릭 리보오스 당을 가진 임의의 뉴클레오티드를 의미한다.
여기에 사용된 "생분해성"이라는 용어는 예를 들어, 효소적 분해 또는 화학적 분해와 같이 생물학적 시스템 내에서의 분해를 의미한다.
여기에 사용된 "생물학적 활성 분자"라는 용어는 시스템 내에서 생물학적 반응을 이끌어 내거나 변형시킬 수 있는 화합물들 또는 분자들을 의미한다. 단독으로 또는 당해 발명에 의해 고려되는 다른 분자들과 조합된 생물학적 활성 siNA 분자들의 비한정적 예들은 항체들, 콜레스테롤, 호르몬들, 항바이러스제들, 펩티드들, 단백질들, 화학요법제들, 소분자 물질들, 비타민들, 보조인자들, 뉴클레오시드들, 뉴클레오티드들, 올리고뉴클레오티드들, 효소적 핵산들, 안티센스 핵산들, 트리플렉스(triplex) 형성 올리고뉴클레오티드들, 2,5-A 키메라들, siNA, dsRNA, 알로자임들, 앱타머들, 유인물들 및 그 유사체들과 같은 치료상 활성 분자들을 포함한다. 본 발명의 생물학적 활성 분자들은 기타 생물학적 분자들, 예를 들어, 지질들 및 폴리아민들, 폴리아미드들, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 폴리에테르들과 같은 고분자들과 같은 다른 생물학적 활성 분자들의 약동학 및/또는 약역학을 조절할 수 있는 분자들도 포함한다.
여기에 사용된 "인지질"이라는 용어는 적어도 하나의 인 기(phosphorus group)를 포함하는 소수성 분자를 의미한다. 예를 들어, 인지질은 OH, COOH, 옥소(oxo), 아민 또는 치환 또는 비치환된 아릴 기들로 선택적으로 치환된 인-함유기 및 포화 또는 불포화된 알킬기를 포함할 수 있다.
"캡 구조(cap structure)"는 올리고뉴클레오티드의 어느 한쪽 터미널에서 혼입될 수 있는 화학적 변형물들을 의미한다(예를 들어, 여기에 참고로 포함된 Adamic, et al., U.S. Patent No. 5,998,203 참조). 이러한 터미널 변형물들은 엑소뉴클레아제(exonuclease) 분해로부터 핵산 분자를 보호하고 세포 내에서 전달 및/또는 편재화(localization)에 도움이 될 수 있다. 상기 캡은 5'-터미널(5'-캡) 또는 3'-터미널(3'-캡) 중 어느 하나 또는 양쪽 터미널상에 존재할 수 있다. 비한정적 예들에서, 상기 5'-캡은 글리세릴, 역위 디옥시 무염기 잔기(모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실(erythrofuranosyl))뉴클레오티드, 4'-티오(thio) 뉴클레오티드; 카보사이클릭 뉴클레오티드(carbocyclic nucleotide); 1,5-안하이드로헥시톨(anhydrohexitol) 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드들; 알파-뉴클레오티드들; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연쇄; 트레오-펜토푸라노실(threo-pentofuranosyl) 뉴클레오티드; 비사이클릭 3',4'-세코(seco) 뉴클레오티드; 비사이클릭 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 비사이클릭 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역위 무염기 모이어티; 3'-2'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역위 무염기 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포라미데이트(phosphoramidate); 헥실포스페이트(hexylphosphate); 아미노헥실포스페이트; 3-인산염; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티(bridging or non-bridging methylphosphonate moiety)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
상기 3'-캡의 비한정적 예들은 글리세릴, 역위 디옥시 무염기 잔기(모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드;1-(베타-D-에리트로푸라노실)뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드; 카보사이클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트; 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실(aminododecyl) 포스페이트; 하이드록시프로필(hydroxypropyl) 포스페이트; 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비사이클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드; 5'-5'-역위 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역위 무염기 모이어티; 5'-포스포라미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비가교 5'-포스포라미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트, 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토(mercapto) 모이어티들(더 상세한 부분들을 보려면 여기에 참고로 포함된 Beaucage and Lyer, Tetrahedron 49:1925, 1993을 참조).
"비-뉴클레오티드"라는 용어는 당 및/또는 인산염 중 어느 하나의 치환을 포함하여 하나 이상의 뉴클레오티드 유니트들을 대신하여 핵산 사슬에 혼입될 수 있으며, 나머지 염기들이 그 효소적 활성을 보이도록 하는 임의의 기 또는 화합물을 의미한다. 상기 기 또는 화합물은 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민과 같은 흔히 알려져 있는 뉴클레오티드 염기를 함유하지 않아서 1'-위치에서 염기가 부족하다는 점에서 무염기성이다.
여기에 사용된 "뉴클레오티드"는 천연 염기들(표준) 및 업계에 잘 알려진 변형된 염기들을 포함하는 것으로 업계에 알려져 있다. 그러한 염기들은 일반적으로 뉴클레오티드 당 모이어티의 1'-위치에 위치한다. 뉴클레오티드들은 일반적으로 염기, 당 및 인산염 기를 포함한다. 상기 뉴클레오티드들은 당, 인산염 및/또는 염기 모이어티에서 변형되지 않거나 변형될 수 있다(또한 뉴클레오티드 유사체들, 변형된 뉴클레오티드들, 비-천연 뉴클레오티드들, 비-표준 뉴클레오티드들 등으로 서로 혼용해서 칭해지며; 예를 들어, 여기에 모두 참고로 포함된 Usman and McSwiggen, supra; Eckstein, et al., International PCT Publication No. WO 92/07065; Usman, et al., International PCT Publication No. WO 93/15187; Uhlman & Peyman, supra를 참조). Limbach, et al., Nucleic Acids Res. 22:2183, 1994에서 요약된 업계에 알려진 변형된 핵산 염기들의 몇몇 예들이 있다. 핵산 분자들 내로 도입될 수 있는 염기 변형들의 일부 비한정적 예들은 이노신, 퓨린, 피리딘-4-원(pyridin-4-one), 피리딘-2-원, 페닐, 수도우라실(pseudouracil), 2, 4, 6-트리메톡시 벤젠(2, 4, 6-trimethoxy benzene), 3-메틸 우라실, 디하이드로우리딘(dihydrouridine), 나프틸(naphthyl), 아미노페닐(aminophenyl), 5-알킬시티딘들(alkylcytidines) (예컨대, 5-메틸시티딘(methylcytidine)), 5-알킬우리딘들(alkyluridines) (예컨대, 리보티미딘(ribothymidine)), 5-할로우리딘(halouridine) (예컨대, 5-브로모우리딘(bromouridine)) 또는 6-아자피리미딘들(azapyrimidines) 또는 6-알킬피리미딘들(alkylpyrimidines) (예컨대, 6-메틸우리딘(methyluridine)), 프로핀 등(Burgin, et al., Biochemistry 35:14090, 1996; Uhlman & Peyman, supra)을 포함한다. 이러한 태양에서 "변형된 염기들"은 1' 위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신 및 구아닌이 아닌 뉴클레오티드 염기들 또는 그 동등물들을 의미한다.
"표적 사이트"는 표적 서열에 상보적인 안티센스 영역 내에서 서열들을 포함하는 siNA 구조체에 의해 매개되는 쪼개짐을 위해 "표적되는" 표적 RNA 내에서의 서열을 의미한다.
"쪼개짐의 검출가능한 레벨(detectable level of cleavage)"은 표적 RNA의 무작위 분해에 의해 생성된 RNA들의 백그라운드(background)를 초과하여 쪼개짐 생성물들을 구별하기에 충분한 정도로의 표적 RNA의 쪼개짐(및 쪼개진 RNA 생성물들의 형성)을 의미한다. 표적 RNA의 1 내지 5 %로부터 쪼개짐 생성물들의 생성은 대부분의 검출 방법들에 대하여 백그라운드를 초과하여 검출하기에 충분하다.
"생물학적 시스템"은 인간, 동물, 식물, 곤충, 박테리아, 바이러스 또는 다른 원천을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 시스템이 RNAi 활성에 필요한 성분들을 포함하는 생물학적 원천들로부터 정제되거나 정제되지 않은 형태의 물질을 의미한다. "생물학적 시스템"이라는 용어는 예를 들어, 세포, 조직, 또는 유기체 또는 그 추출물을 포함한다. 생물학적 시스템이라는 용어는 생체 외 세팅에서 사용될 수 있는 재구성된 RNAi 시스템들도 포함한다.
여기에 사용된 "생분해성 링커"라는 용어는 예를 들어, 생물학적 활성 분자를 본 발명의 siNA 분자에 생물학적 활성 분자 또는 본 발명의 siNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥들로 연결하는 것과 같이, 하나의 분자를 다른 분자들로 연결하는 생분해성 링커로 지정되는 핵산 또는 비핵산 링커 분자를 의미한다. 생분해성 링커는 그 안정성이 특정한 조직 또는 세포 유형에 전달되는 것과 같이 특정한 목적을 위하여 조절될 수 있도록 설계된다. 핵산계 생분해성 링커 분자의 안정성은 예를 들어, 리보뉴클레오티드들, 디옥시리보뉴클레오티드들 및 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-O-아미노, 2'-C-알릴, 2'-O-알릴, 및 다른 2'-변형 또는 염기 변형 뉴클레오티드들과 같은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드들의 조합과 같은 다양한 화학종들을 이용하여 조절될 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 다이머, 트리머, 테트라머 또는 길이가 더 긴 핵산 분자, 예를 들어, 길이가 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드들의 올리고뉴클레오티드일 수 있거나 예를 들어, 포스포라미데이트 또는 포스포디에스테르 연쇄와 같은 포스포러스계 연쇄를 지닌 단일 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 핵산 골격, 핵산 당, 또는 핵산 염기 변형물들도 포함할 수 있다.
"무염기성(abasic)"은 1' 위치에서 염기가 부족하거나 1' 위치에서의 염기 대신에 다른 화학기들을 가지는 당 모이어티들을 의미하며, 예를 들어, Adamic, et al., U.S. Patent No. 5,998,203를 참조.
"변형되지 않은 뉴클레오시드"는 베타.-D-리보-푸라노즈(beta.-D-ribo-furanose)의 1' 탄소에 결합되는 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민 또는 우라실의 염기들 중 하나를 의미한다.
"변형된 뉴클레오시드"는 변형되지 않은 뉴클레오티드 염기, 당 및/또는 인산염의 화학 구조에서 변형을 포함하는 임의의 뉴클레오티드 염기를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드들의 비한정적 예들은 공식 I 내지 VII 및/또는 여기에 설명된 다른 변형들에 의해 보여진다.
본 발명을 위하여 기술된 2'-변형된 뉴클레오티드들과 연계하여, "아미노"는 변형되거나 변형될 수 있는 2'-NH2 또는 2'-O--NH2를 의미한다. 그러한 변형된 기들은 예를 들어, Eckstein et al., U.S. Patent No. 5,672,695 및 Matulic-Adamic, et al., U.S. Patent No. 6,248,878에 기술되어 있다.
siNA 분자들은 양이온 지질들과 복합되거나, 리포솜들 내에 패키지 되거나 그렇지 않으면 표적 세포들 또는 조직들에 전달될 수 있다. 핵산 또는 핵산 복합체들은 주사, 주입 펌프 또는 스텐트(stent)를 생고분자들 내에 혼입되거나 혼입되지 않으면서 국소적으로 투여될 수 있다. 다른 실시예에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 본 발명의 siNA 화합물들, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 또는 양쪽 모두에 공유적으로 부착될 수 있다. 부착된 PEG는 바람직하게는 약 2,000 내지 약 50,000 돌턴(daltons: DA)의 임의의 분자량일 수 있다.
센스 영역은 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커와 같은 링커 분자를 통해 안티센스 영역에 연결될 수 있다.
"역위 반복배열(inverted reapeat)"은 반복배열이 전사되는 경우 이중 가닥 siRNA를 형성할 수 있도록 위치되는 센스 및 안티센스 요소를 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 역위 반복배열은 반복배열의 두 요소들 사이에서 링커 또는 자가-분열(self-cleaving) 리보자임과 같은 비상동성 서열을 선택적으로 포함할 수 있다. 역위 반복배열의 요소들은 이중 가닥 RNA를 형성하기에 충분한 길이를 가진다. 통상적으로, 역위 반복배열의 각각의 요소는 길이가 약 15 내지 약 100 뉴클레오티드들, 바람직하게는 약 20 내지 30 염기 뉴클레오티드들, 예컨대 길이가 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드들과 같이 바람직하게는 약 20 내지 25 뉴클레오티드들이다.
"핵산"은 디옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들 및 단일- 또는 이중-가닥 형태로 된 이들의 중합체들을 의미한다. 상기 용어는 합성, 자연발생적 및 비자연발생적이며, 기준 핵산과 유사한 결합 특성들을 가지며, 기준 뉴클레오티드들과 유사한 방식으로 물질대사 되는 알려진 뉴클레오티드 유사체들 또는 변형된 골격 잔기들 또는 연쇄들을 포함하는 핵산들을 포함한다. 그러한 유사체들의 예들은 제한 없이 포스포로티오에이트들, 포스포라미데이트들, 메틸 포스포네이트들, 카이랄-메틸 포스포네이트들, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드들, 펩티드-핵산들(PNA들)을 포함한다.
"큰 이중-가닥 RNA"는 약 40 염기쌍(bp) 보다 더 큰 크기를 가지며, 예를 들어, 100 bp 보다 더 크며, 더 구체적으로는 300 bp 보다 더 큰 임의의 이중-가닥 RNA를 의미한다. 큰 dsRNA의 서열은 mRNA의 세그먼트 또는 전체 mRNA를 나타낼 수 있다. 큰 dsRNA의 최대 크기는 여기에 한정되지 않는다. 이중-가닥 RNA는 인산염 당 골격 또는 뉴클레오시드에 변형될 수 있는 변형된 염기들을 포함할 수 있다. 그러한 변형들은 질소 또는 황 헤테로원자 또는 업계에 알려진 임의의 다른 변형을 포함할 수 있다.
이중-가닥 구조는 헤어핀 또는 마이크로 RNA에 대해 발생하는 것과 같은 자기-상보적 RNA 가닥에 의하거나 두 개의 상이한 상보적 RNA 가닥들을 결합하여 형성될 수 있다.
"중복(overlapping)"은 두 개의 RNA 단편들이 하나의 가닥 상에서 다수의 뉴클레오티드들에 의하여 중첩되는 서열들을 가지는 경우를 칭하는 것으로서, 여기서 다수의 뉴클레오티드들(nt)의 수는 2 내지 5 뉴클레오티드들만큼 되거나 또는 5 내지 10 뉴클레오티드들 이상이다.
"하나 이상의 dsRNA들"은 서열을 기본으로 서로 다른 dsRNA들을 의미한다.
"표적 유전자 또는 mRNA"는 중요한 임의의 유전자 또는 mRNA를 의미한다. 유전학에 의하거나 순서결정(senquecing)에 의해 이전에 확인된 임의의 유전자들은 표적을 의미할 수 있다. 표적 유전자들 또는 mRNA는 대사 또는 구조 유전자들 또는 효소들을 엔코딩하는 유전자들뿐만 아니라 발달 유전자들 및 조절 유전자들을 포함할 수 있다. 표적 유전자는 표현형이 조사되고 있는 세포들 내에서나 표현형 특징을 직접 또는 간접으로 부여하는 방식으로 유기체 내에서 발현될 수 있다. 표적 유전자는 내생성 또는 외생성일 수 있다. 그러한 세포들은 불멸성 세포주(immortal cell line) 또는 원시 세포 배양(primary cell culture) 내에서 발생하는 배우체 또는 임의의 분리된 세포를 포함하여 성체 또는 배아 상태 동물 또는 식물의 몸체 내에 있는 임의의 세포를 포함한다.
본 명세서 및 동봉된 청구항들에서 "하나" 및 "상기"의 단수 형태들은 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수형의 언급을 포함한다.
여기에 주어진 예들은 예시의 목적으로만 위한 것이며 청구항에 기술된 본 발명의 범위를 한정하는 의도는 아니다. 특이적인 용어들과 수치들이 여기에 사용되었지만, 그러한 용어들과 수치들은 예시적인 것이지 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되지 않을 것이다.
본 개시에 인용된 모든 발간물들과 참고문헌들은 모든 목적들을 위하여 여기에 그대로 참고로 포함된다.
예
상기 개시는 일반적으로 하기의 예들에 의해 더 예시되는 바와 같이 일반적으로 본 발명을 기술한다. 이러한 예들은 예시의 목적으로만 기술되는 것이며, 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다. 특이적인 용어들과 수치들이 여기에 사용되었지만, 그러한 용어들과 수치들은 마찬가지로 예시적이고 발명의 범위에 비한정적으로 이해될 것이다.
예
이용된 프로토콜들과 방법들
siRNA/폴리펩티드 접합체들의 합성
표준 고체상 합성 방법들을 이용하여 폴리펩티드들과 RNA 양쪽 모두가 제조된다. 폴리펩티드와 RNA 분자들은 서로간에 공유 부착이 일어나도록 특이적인 모이어티들로 작용기화되어야 한다. 폴리펩티드에 대하여, N-터미널은 3-말레이미도프로피온산으로 작용기화된다. 그러나, 브롬이나 요오드아세틸 모이어티들과 같은 다른 작용기들도 잘 작용한다는 것을 알아야 한다. RNA 분자에 대하여 센스 가닥의 5' 말단이나 안티센스 가닥의 5' 말단은 1-O-디메톡시트리틸-헥실-디설파이드 링커로 작용기화된다.
RNA 올리고는 완충액 A(20 mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 6.8, 50 % 포름아미드) 2 ㎖가 첨가되는 0.5 ㎖의 물에서 용해된다. 폴리펩티드 PN277은 후속적으로 첨가되어 침전이 형성하게 되고 여기에 2 M TEAA 완충액을 추가로 1 ㎖ 첨가하여 용해되었다. 반응이 완료되면, 감압하에서 용매를 제거하고 이렇게 생성하는 고체는 완충액 A(20 mM 트리스-염산, pH 6.8, 50 % 포름아미드)에 용해되었다. 상기 물질을 Amersham Resource Q 칼럼으로 옮겨 넣고 6 ㎖/min 유속으로 완충액 A의 5 칼럼 부피로 세척하였다. 분리는 6 ㎖/min 유속으로 15 칼럼 부피들에 대하여 15 내지 60 %로부터 완충액 B(20 mM 트리스-염산, pH 6.8, 50 % 포름아미드, 1 M NaCl)의 선형 구배를 가동하여 이루어졌다. 정제된 접합체는 PBS에 대한 슬라이달라이저(slidalyzer) 투석 카세트들(3.5 K MWCO)에 의하여 탈염되었다. 접합체의 양은 λ=260 ㎚에서 계산된 몰 흡수 계수를 근거로 분광광도계로 측정되었다. RP-HPLC에 의한 이러한 접합체의 순도 분석은 하기에 나타나 있다.
폴리펩티드에 접합된 안티센스 RNA 가닥은 50 mM 아세트산 칼륨, 1 mM 아세트산 마그네슘과 15 mM HEPES pH 7.4에서 그 상보적 센스 RNA 가닥과 결합되어 90 ℃에서 2 분 동안 가열되어 이후에 37 ℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 이중 가닥 RNA 접합체의 형성은 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인되었다.
본 발명의 siRNA/폴리펩티드 접합체의 예는 예 3에 나타나 있다.
접합체 제조 예 1: 펩티드 PN277(H2B 13-48)(서열 번호: 37)과 안티센스 가닥 CN950asen(N163asen)(서열 번호: 60) 사이의 접합체로서 하기의 구조를 가진다:
Figure 112008040121202-PCT00005
올리고 CN950asen은 2 ㎖의 완충액 A(20 mM 트리스-염산, pH 6.8, 50 % 포름아미드)가 첨가되는 0.5 ㎖의 물에서 용해되었다. 펩티드(PN0277)은 후속적으로 첨가되어 침전이 형성하게 되고 여기에 2 M TEAA 완충액을 추가로 1 ㎖ 첨가하여 용해되었다. 반응이 완료되면, 감압하에서 용매를 제거하고 이렇게 생성하는 고체는 완충액 A(20 mM 트리스-염산, pH 6.8, 50 % 포름아미드)에 용해되었다. 상기 물질을 Amersham Resource Q 칼럼으로 옮겨 넣고 6 ㎖/min 유속으로 완충액 A의 5 칼럼 부피로 세척하였다. 분리는 6 ㎖/min 유속으로 15 칼럼 부피들에 대하여 15 내지 60 %로부터 완충액 B(20 mM 트리스-염산, pH 6.8, 50 % 포름아미드, 1 M NaCl)의 선형 구배를 가동하여 이루어졌다. 정제된 접합체는 PBS에 대한 슬라이달라이저 투석 카세트들(3.5 K MWCO)에 의하여 탈염되었다. 접합체의 양은 λ=260 ㎚에서 계산된 몰 흡수 계수를 근거로 분광광도계로 측정되었다. 접합체의 순도는 RP-HPLC에 의하여 확인되었다. 펩티드 접합체 안티센스 가닥과 상보적 안티센스 가닥은 50 mM 아세트산 칼륨, 1 mM 아세트산 마그네슘과 15 mM HEPES pH 7.4에서 결합되어 90 ℃에서 2 분 동안 가열되어 이후에 37 ℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 이중 가닥 RNA 접합체의 형성은 비변성(15 %) 폴리아크릴아미드 겔 이온영동법과 브롬화 에티듐 염색에 의하여 확인되었다.
접합체 제조 예 2: 하기의 접합체들은 상기 접합체 제조 예 1에서 기술된 방법들과 절차들을 이용하여 합성되었다.
펩티드 PN277(서열 번호: 37)과 올리고 CN952sen(N163sen)(서열 번호: 59) 사이의 접합체로서 하기의 구조를 가진다:
Figure 112008040121202-PCT00006
펩티드 PN277과 올리고 CN740sen(서열 번호: 63) 사이의 다이서 기질 27량체 접합체로서 하기의 구조를 가진다:
Figure 112008040121202-PCT00007
펩티드 PN277과 올리고 CN741asen(서열 번호: 64) 사이의 다이서 기질 29량체로서 하기의 구조를 가진다:
Figure 112008040121202-PCT00008
세포들 및 세포 배양
쥐 꼬리 섬유아세포 세포들은 C57BL/6J 쥐들 또는 tg197hTNF-α 형질전환 쥐들의 꼬리로부터 유래하였다. 꼬리들을 제거하며, 면도날로 절단하여 작은 절편들로 나누었다. 절편들을 PBS로 3 회 세척하고 이후 PBS로 3 회 세척한 후에 0.5 mg/㎖ 콜라게나아제(collagenase), 100 units/㎖ 페니실린 및 100 ug/㎖ 스트렙토마이신과 함께 교반기에서 37 ℃로 배양하여 조직을 분열시켰다. 이후 꼬리 절편들을 보충제들(상기 기술됨)로 보충된 DMEM 배지 내에서 배양시켰다. 9L/LacZ 세포들은 LacZ를 성분으로 발현하는 쥐 신경교육종 섬유아세포 세포들(rat gliosarcoma fibroblast cells)이며 ATCC(#CRL-2200)으로부터 입수하며 또한 보충제들(상기 기술됨)로 보충된 DMEM 배지 내에서 배양시켰다.
분리된 인간 단구세포들은 4 mM L-글루타민, 비필수 아미노산들 및 10 % 우태 혈청으로 보충된 Iscove's modified Dulbecco's 배지 내에서 보존되었다. 쥐 꼬리 섬유아세포들(MTF)은 1 mM 피루브산 나트륨, 비필수 아미노산들 및 20 % 우태 혈청의 보충제로 보충된 Dulbecco's Modified Essential Medium(DMEM) 내에서 보존되었다. 모든 세포들은 37 ℃ 및 100 units/㎖ 페니실린, 100 ug/㎖ 스트렙토마이신 및 0.25 ㎎/㎖ 푼지존(Fungizone)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 항생제 혼합물로 보충된 5 % CO2에서 배양되었다.
인간 단핵세포 분리 및 순도
건강한 기증자들로부터 기증받은 신선한 인간 혈액 표본들을 Golden West Biologicals(Temecula, CA)로부터 구입하였다. 단구세포들의 분리를 위하여, 혈액 표본을 수취한 후 즉시 1:1의 비율로 PBS로 희석시켰다. 전혈로부터 피콜(Ficoll)(Amersham) 그래디언트(gradient)에 의해 말초 혈액 단핵 세포들(PBMC)을 우선 분리하였다. 제작자 지시사항을 따르면서 밀테니(Miltenyi) CD14 포지티브 선택 키트(MILTENYI BIOTEC GmbH, Germany)를 이용하여 PBMC들로부터 단구세포들을 더 정제하였다. 단구세포 제제의 순도는 세포들을 항-CD14 항체(BD Biosciences, San Jose, CA)로 염색한 후에 유동 세포계측법으로 판단한 바와 같이 95 %를 초과하였다. 정제된 인간 단구세포들은 도입과 녹다운 분석들을 하기 전에 완전 배지(상기 기술함) 내에서 하룻밤 동안 보전되었다.
인간 단구세포 활성화
인간 단구세포들의 활성화는 Liposaccharides, LPS(Sigma, St Louis, MO) 0.1 내지 1.0 ng/㎖를 세포 배양액에 첨가하여 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 생성을 자극시켜 수행되었다. 세포들은 LPS와 배양시킨 지 3 시간 후에 수거되었으며 mRNA 레벨은 제작자 지시사항에 따라 Quantigene 분석법(Genospectra, Fremnon, CA)에 의하여 측정되었다. TNF-α 레벨들에서 도입 후 변화들은 제작자 프로토콜을 따르는 ELISA(BD Biosciences, San Jose, CA)에 의하여 측정되었다.
mRNA ( bDNA ) 및 단백질( ELISA )에 대한 인간 TNF -α 녹다운 분석법들
TNF-α 녹다운 실험들을 위하여, 단구세포들은 OptiMEM(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 100 K cells/100ul/well로 96 웰 플레이트 내에 살포되었다. 펩티드와 siRNA는 OptiMEM 내에서 5 분 동안 복합되었으며, 이후 우태 혈청(FBS)을 상기 복합체에 첨가하여 3 % FBS 최종 농도를 이루었다. 세포들은 제작자 프로토콜을 따르면서 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 형질감염되었다. 모든 형질감염들은 37 ℃와 CO2에서 3 시간 동안 세포들을 배양시켜 수행되었으며, 이후 형질감염 시약을 제거하고, 세포들을 완전 배지로 보충하며 하룻밤 동안 배양시켰다. bDNA 분석들(Genospectra, Fremont, CA의 Quantigene 분석)은 제작자 지시사항을 따르면서 수행되었다. ELISA 분석을 위하여, 세포 배양 배지의 표본들이 직접 사용되었다. 형질전환된 쥐들과 관련된 실험들의 분석을 위하여, 혈장 표본들은 오비탈 블리딩(orbital bleeding)으로 채집된 전혈로부터 분리되었다. hTNF-α의 혈장 레벨들은 제작자 지시사항에 따라 1:2의 희석으로 ELISA에 의하여 측정되었다(R&D systems, Minneapolis, MN).
유동 세포계측
유동 세포계측 분석은 Beckman Colter FC500 세포 분석기(Fullerton, CA)를 사용하여 실시되었다. 상기 기구는 사용된 형광 프루브들(siRNA에 대하여 FAM 또는 Cy5 및 CD14에 대하여 FITC 또는 PE)에 따라 조절되엇다. 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)(Fluka, St Louis, MO)와 AnnexinV(BD Biosciences, San Jose, CA)를 세포 생존도및 세포독성의 지시약들로 사용되었다.
다이서 매개 siRNA 분해 분석
siRNA와 siRNA/폴리펩티드 접합체들은 다이서 뉴클레아제(Stratagene Cat. #240100)로 배양되어 이들이 분해에 감수성이 있는지의 여부를 결정하였다. 제작자 프로토콜을 따랐다. 간단히 말해서, 소화 반응이 10 ㎕의 총 부피 내에서 실시되었으며 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양되도록 하였다. 하룻밤 동안의 배양을 실시한 이후에, 상기 소환 혼합물의 2 ㎕ 표본은 2X 채움 염료와 혼합되었으며 Urea와 15 % TBE 비-변성 폴리아크릴아미드 겔로 보충된 15 % TBE상에 겔 전기영동법에 의하여 분석되었다.
LC - MS 에 의한 RNA 들의 다이서 분해 모니터링
65 ℃에서 유지된 XTerra C18 칼럼, 2.5 ㎛, 2.1x50 ㎜(Waters, Corp.)를 사용하여 LC-MS가 작동되었다. 이동상은 100 mM 헥사플루오로이소프로판올, 7 mM 트리에틸아민 및 100 % 메탄올로 보충된 용리였다. 구배는 40 분에 걸쳐서 5 내지 15 %였다. 상기 용리액은 PDA와 음이온 모드에서 작동된 Waters Micromass ZQ ESI 단일쿼드 질량 분석기로 나뉘어졌다. 모세관 전압은 3.0 kV였으며 콘 전압(cone voltage)은 45 V였다. 탈용매화는 600 L/hr N2로 보조된 300 ℃에서 발생하였다. 상기 소스는 90 ℃에서 유지되었다. 포착 스캔 속도(acquisition scan rate)는 1 초에 걸쳐서 1000 내지 2000 m/z였다.
예 2
hTNF -α 녹다운 활성에 대하여 스크리닝된 다이서 엔도뉴클레아제 기질 siRNA 들
본 예는 hTNF-α 유전자 발현 수준들의 효과적인 감소를 위하여 스크리닝된 본 발명의 대표적인 siRNA들을 보여주고 있다. hTNF-α 유전자를 표적하는 중요성은 인간 및 다른 포유류 피검물들에 과잉-발현되는 경우에 류마티스성 관절염(RA)의 발생과 진전을 매개하는 것에 연루되어 있다는 것이다. 그러므로, hTNF-α 유전자 발현의 표적 감소를 류마티스성 관절염에 대한 치료로서 이용될 수 있다.
최근의 증거에 따르면 길이가 25 내지 30 뉴클레오티드들인 RNA 듀플렉스들은 해당하는 길이가 더 짧은 RNA 듀플렉스들보다 표적 유전자의 발현 레벨들의 감소에 있어서 최대 100 배 더 효과적일 수 있다는 것을 제시하고 있다. 이러한 증진된 녹다운 활성은 이러한 길이가 더 긴 siRNA 듀플렉스들이 다이서 뉴클레아제(RNAse III)에 대한 기질이라는 사실에 기인한다. 하기 표 3은 길이가 21 내지 27 뉴클레오티드들에 이르는 siRNA 듀플렉스들을 보여준다. YC12와 N161-N164는 hTNF-α 유전자의 서열-특이적 전사후 유전자 침묵에 대하여 스크리닝 되었다. 이러한 최초 스크리닝 과정은 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)이 있는 표 3에 나열된 개별적인 siRNA들을 LPS 자극된 인간 단구세포들로 형질감염시키는 것을 포함하였다.
하기 표 3은 hTNF-α에 대항하여 표적된 siRNA들을 나타낸다.
siRNA 핵산 서열
YC12 서열 번호 53 5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCUU-3' 서열 번호 54 3'-UUCGGACAUGGAGUAGUAGAUGAG-5'
N161 서열 번호 55 5'-GCCUCUUCUCCUUCCUGAUCGUGdGdC-3' 서열 번호 56 3'-GUCGGAGAAGAGGAAGGACUAGCACCG-5'
N162 서열 번호 57 5'-GCCUGCUGCACUUUGGAGUGAUCdGdG-3' 서열 번호 58 3'-GACGGACGACGUGAAACCUCACUAGCC-5'
N163 서열 번호 59 5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3' 서열 번호 60 3'-GUGGGUACACGAGGAGUGGGUGUGGUA-5'
N164 서열 번호 61 5'-ACCUCAUCUACUCCCAGGUCCUCdTdT-3' 서열 번호 62 3'-CAUGGAGUAGAUGAGGGUCCAGGAGAA-5'
CN740 sen(5'-3') 서열 번호 63 5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC-3'
CN741 asen(5'-3') 서열 번호 64 5'-GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU-3'
YC12와 N161-N164 서열들은 5'-3' 센스(상부) 및 3'-5' 안티센스(하부)로 표 3에 나열되어 있다.
YC12와 N161-N164의 각각은 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, Ca)로 0.16 nM, 0.8 nM, 4 nM 및 20 nM의 농도로 형질감염되었다. 표 4는 각각의 siRNA에 대하여 백분율로 표시된 TNF-α 녹다운 활성을 요약하였다. Qneg는 무작위 siRNA 서열을 나타내며 음성 대조로 작용하였다. 관찰된 Qneg 녹다운 활성은 100 %(100 % 유전자 발현 레벨들)로 정규화되었으며 각각의 siRNA에 대한 녹다운 활성은 음성 대조의 상대적 백분율로 제시되었다. 표 4에 있는 데이터는 상기 siRNA들인 N161, N162 및 N164는 Qneg siRNA 음성 대조와 비교할 경우에 TNF-α mRNA 레벨들에 상당한 효과를 가지지 않았음을 보여준다. 이와 대조적으로, siRNA Y12는 TNF-α mRNA 레벨들을 Qneg 음성 대조의 66 %로 감소시킨 반면에, siRNA N163은 mRNA 레벨들을 Qneg 음성 대조의 57 %fh 감소시켰다.
표 4의 데이터는 다이서 기질 siRNA들인 N163과 YC12가 인간 단구세포들 내에서 hTNF-α mRNA 레벨들을 효과적으로 감소시켰다는 것을 보여준다. siRNA N163은 다른 특징화를 위하여 선택되었다.
하기 표 4는 리포펙타민 형질감염된 siRNA의 TNF-α 녹다운 활성을 나타낸다.
siRNA siRNA 농도 % TNF-α mRNA 발현 레벨
Qneg (음성 대조) 0.16 nM 100 %
0.8 nM
4 nM
20 nM
YC12 0.16 nM 70 %
0.8 nM 83 %
4 nM 66 %
20 nM 82 %
N161 0.16 nM 100 %
0.8 nM 99 %
4 nM 110 %
20 nM 123 %
N162 0.16 nM 89 %
0.8 nM 81 %
4 nM 91 %
20 nM 112 %
N163 0.16 nM 76 %
0.8 nM 66 %
4 nM 65 %
20 nM 57 %
N164 0.16 nM 86 %
0.8 nM 83 %
4 nM 71 %
20 nM 76 %
예 3
siRNA /폴리펩티드 접합체들은 인간 단구세포들 내에서 hTNF -α mRNA 레벨들을 효과적으로 감소시켰다
본 예는 본 발명의 대표적인 다이서 기질 siRNA가 본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드와 접합되는 경우에 hTNF-α mRNA 레벨들을 효과적으로 감소시켰다는 것을 증명한다. siRNA/폴리펩티드 접합체 녹다운 활성은 하기 표 5에 나타나 있다.
예 2의 표 4에 제시된 데이터는 siRNA N163이 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, Ca)로 형질감염되는 경우에 hTNF-α mRNA 레벨들을 효과적으로 감소시켰으며 따라서 하나 이상의 TNF-α 관련 염증 상태(들)의 치료 및/또는 방지에 대한 뛰어난 후보자이다는 것을 보여주었다. 그러나, 양이온 지질들은 세포독성이 있을 수 있으므로, 질병의 치료에서 생체 내 전달 응용에 적절하지 않을 수 있다. 따라서, 양이온 지질 매개 전달에서 이러한 부족한 점을 극복하기 위하여, 본 발명의 대표적인 N163 siRNA는 전달 운반체로 사용되는 경우에 최소 내지는 세포독성 효과가 전혀 없는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드로 접합되었다. siRNA 서열의 다이서 기질 형태(27량체)에 전달 폴리펩티드를 접합시키면 폴리펩티드가 RISC 로딩 이전에 siRNA로부터 제거되어, 상기 폴리펩티드가 RISC 활성을 억제시킬 가능성을 감소시킨다. 사실상, 이러한 접합체들은 일단 가공되면 원하는 표적 유전자의 효과적인 녹다운을 매개하는 전구체 siRNA를 세포질로 효과적으로 전달한다.
본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드(PN277)은 인간 히스톤 2B(H2B) 단백질의 아미노산 서열로부터 유래되었으며 그 1차 구조는 하기와 같다:
PN277
NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드 (서열 번호: 37)
접합체들은 본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN277을 본 발명의 대표적인 N163 siRNA의 센스 가닥의 5'-말단이나 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유적으로 연결시켜 발생되었다. siRNA/폴리펩티드 접합체들의 예들은 하기와 같다:
N163 siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단에 접합된 폴리펩티드 PN277(dsCoP277nfR950; 서열 번호들: 37 및 35). N163 siRNA의 센스 가닥은 미도시 되었다.
Figure 112008040121202-PCT00009
N163 siRNA의 센스 가닥의 5'-말단에 접합된 폴리펩티드 PN277(dsCoP277nfR952; 서열 번호들: 37 및 36). N163 siRNA의 안티센스 가닥은 미도시 되었다.
Figure 112008040121202-PCT00010
여기에 음성 대조로 사용된 Qneg siRNA의 센스 가닥의 5'-말단에 접합된 폴리펩티드 PN277은 미도시 되었다.
본 예에서, Qneg siRNA/폴리펩티드 접합체를 포함하는 상기 기술된 각각의 siRNA/폴리펩티드 접합체는 1 nM, 10 nM, 100 nM 및 200 nM의 농도에서 인간 단구세포들과 배양되었다. 표 5는 각각의 siRNA/폴리펩티드 접합체에 대하여 백분율로 표시된 TNF-α 녹다운 활성을 요약하였다. 관찰된 Qneg 녹다운 활성은 100 %(100 % 유전자 발현 레벨들)로 정규화되었으며 각각의 siRNA에 대한 녹다운 활성은 음성 대조의 상대적 백분율로 제시되었다.
표 5의 데이터는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 접합된 N163 siRNA 듀플렉스는 상기 폴리펩티드가 N163 siRNA 분자의 센스 가닥의 5'-말단 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유적으로 연결되느냐의 여부에 상관없이 hTNF-α 발현 레벨들을 효과적으로 감소시켰다는 것을 보여준다. 더 구체적으로는, siRNA/폴리펩티드 접합체 dsCoP277nfR952는 hTNF-α mRNA 레벨들을 Qneg/폴리펩티드 접합체 음성 대조 mRNA 레벨들의 62 %로 감소시킨 반면에, 상기 dsCoP277nfR950은 hTNF-α mRNA 레벨들을 Qneg/폴리펩티드 접합체 음성 대조 mRNA 레벨들의 38 %로 감소시켰다.
하기 표 5는 siRNA 다이서 기질 폴리펩티드 접합체 TNF-α 녹다운 활성을 나타낸다.
siRNA/폴리펩티드 접합체 siRNA/폴리펩티드 접합체 농도 % TNF-α mRNA 발현 레벨
Qneg/PN277 (음성 대조) 1 nM 100 %
10 nM
100 nM
200 nM
dsCoP277nfR950 1 nM 120 %
10 nM 95 %
100 nM 73 %
200 nM 38 %
dsCoP277nfR952 1 nM 80 %
10 nM 78 %
100 nM 62 %
200 nM 68 %
표 5에 제시된 데이터는 본 발명의 대표적인 다이서 기질 siRNA는 본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 접합되는 경우 hTNF-α mRNA 레벨들의 발현을 감소시켰다는 경이적인 발견을 보여준다. 또한, 접합체 녹다운 활성은 리포펙타민을 통하여 전달된 동일한 siRNA에 의하여 보여지게 된 녹다운 활성을 초과하였다.
예 4
폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 접합된 siRNA 는 다이서 엔도뉴클레아제 에 의하여 가공된다
본 예는 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 접합된 siRNA들은 다이서 엔도뉴클레아제(RNase III)에 의하여 분해된다는 것을 보여준다. 당해 예에서, 예 3에서 나타난 3 개의 siRNA/폴리펩티드 접합체들(Qneg, dsCoP277nfR950 및 dsCoP277nfR952)은 다이서 엔도뉴클레아제가 존재할 때 또는 존재하지 않을 때 배양되었다. 또한, 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드가 없는 N163 siRNA 듀플렉스는 다이서 엔도뉴클레아제가 존재할 때 또는 존재하지 않을 때 배양되었다. 그 목적은 siRNA가 다이서 매개 분해에 대한 표적인지 그리고 폴리펩티드가 siRNA RISC 로딩의 폴리펩티드 매개 억제를 방지하는 데 필수적인 공유적으로 연결된 siRNA 듀플렉스로부터 제거되었는지의 여부를 결정하는 것이었다. RISC 복합체의 억제는 표적 유전자의 전사후 유전자 침묵을 방지하게 된다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의한 비교가 도 1에 도시되어 있다. 도 1에서, 예상한 바와 같이 동일한 분자량의 "뚜렷한(sharp)" 밴드들로 이동된 비-다이서 배양된 것과 다이서 배양된 Qneg siRNA/폴리펩티드 접합체 양쪽 모두는 Qneg siRNA/폴리펩티드 접합체는 다이서 뉴클레아제가 존재할 때 또는 존재하지 않을 때 분해하지 않았다는 것을 나타내었다. 다이서 뉴클레아제가 없을 때의 본 발명의 대표적인 N163 siRNA(폴리펩티드 없음)는 폴리아크릴아미드 겔상의 "뚜렷한" 밴드로서 이동하였다. 그러나, 비배양된 N163 siRNA와 비교하여 크기가 약간 더 작은 분자량 밴드에 의하여 증명된 것과 같이 다이서로 배양되는 경우에 길이가 약간 더 짧은 N163 siRNA 듀플렉스가 관찰되었다. 안티센스 가닥(dsCoP277nfR950)의 5'-말단에 의하여 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 대표적인 N163 siRNA와 센스 가닥(dsCoP277nfR952)의 5'-말단에 의하여 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 공유적으로 연결된 대표적인 N163 siRNA 사이에 차등 분해(differential degradation)가 관찰되었다. 다이서가 존재하지 않는 경우에 이러한 siRNA/폴리펩티드 접합체 양쪽 모두는 예상한 바와 같이 분해가 일어나지 않은 것을 나타내는 동등한 분자량의 뚜렷한 밴드들로서 이동하였다. 그러나, dsCoP277nfR952(센스 가닥 연쇄)인 다이서 엔도뉴클레아제가 없는 경우에, 두 개의 다른 분자량 밴드들이 관찰되었다. 일 밴드의 분자량은 비분해된 dsCoP277nfR952와 동등하였으며 제 2 밴드는 다이서 분해된 N163 siRNA(폴리펩티드 없음)에 동등한 분자량을 가졌는데, 이는 공유적으로 연결된 N163 siRNA가 폴리펩티드로부터 분리되었음을 암시하였다. 더 높은 분자량 밴드(즉, 비분해된 N163 siRNA/폴리펩티드)의 세기는 더 낮은 분자량 밴드(즉, 분해된 N163 siRNA/폴리펩티드)의 약 2 배이상 더 강하였는데, 이는 dsCoP277nfR952(센스 가닥 연쇄)의 대부분이 분해되지 않았음을 나타내었다. 이와 대조적으로, dsCoP277nfR950(안티센스 가닥 연쇄)은 크기에서 비분해된 dsCoP277nfR950과 동등한 상대적으로 희미한 밴드에 의하여 증명된 바와 같이 다이서 매개 분해에 더 큰 감수성과 크기에서 다이서 분해된 N163 siRNA(폴리펩티드 없음)와 동등한 더 강한 분자량 밴드를 보였다. dsCoP277nfR952(센스 가닥 연쇄)와 비교하여 siRNA/폴리펩티드 dsCoP277nfR950(안티센스 가닥 연쇄)에 대하여 다이서 매개 분해에 대한 감수성의 상대적으로 더 높은 레벨은 dsCoP277nfR950(안티센스 가닥 연쇄; 예 2 참조)에 대하여 관찰된 더 높은 녹다운 활성과 강하게 상관한다. siRNA/폴리펩티드 다이서 감수성이 더 크다는 것은 RISC 복합체의 폴리펩티드 매개 간섭의 감소된 가능성을 나타내며 따라서 표적 유전자의 침묵이 더 크다는 것을 나타낸다.
이러한 데이터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드에 접합된 대포적인 siRNA는 다이서 매개 분해에 감수성이 있으며 표적 유전자 침묵의 목적을 위하여 치료성 전구체 siRNA들을 세포들로의 효과적인 전달을 위한 이상적인 후보가 됨을 나타낸다.
다이서 엔도뉴클레아제에 의한 siRNA N163의 소화는 21량체 RNA들로 나타나게 된다. 도 2는 비접합된 siRNA N163 듀플렉스에 대한 다이서 엔도뉴클레아제 처리 반응과정의 RP-HPLC 분석을 도시한다. 도 2(A)에서 처리되지 않은 N163 듀플렉스에 대한 RP-HPLC가 도시되어 있다. 도 2(B 내지 E)에서, 다이서 엔도뉴클레아제로 (B) 1 시간, (C) 2.5 시간, (D) 5 시간 및 (E) 7 시간 동안 배양시킨 N163 듀플렉스에 대한 RP-HPLC가 도시되어 있다. 이러한 데이터는 도 3의 도표에 도시되어 있다.
도 2(E)에 도시된 바와 같이 다이서 엔도뉴클레아제에 의한 siRNA N163의 7 시간 소화 이후에 RNA들의 동일성이 도 4에 도시된 ESI-MS 분석에 의하여 확인되었다. 도 4는 N163의 21량체 센스 가닥 다이서 쪼개짐 생성물에 해당하는 질량 6606.6에서의 피크와 N163의 21량체 안티센스 가닥 다이서 쪼개짐 생성물에 해당하는 질량 6965.7에서의 피크를 도시한다.
다이서 엔도뉴클레아제에 의한 접합된 siRNA N163의 소화 이후에 RNA들의 동일성은 표 5에 도시된 ESI-MS에 의하여 확인되었다. 도 5에서 siRNA N163에 접합된 폴리펩티드 PN857을 가진 접합된 siRNA에 대한 다이서 엔도뉴클레아제 처리의 ESI-MS가 도시되어 있다. 본 발명의 대표적인 폴리뉴클레오티드 전달-증진 폴리펩티드 PN857은 인간 히스톤 2B(H2B) 단백질의 아미노산 서열로부터 유래되었으며 그 1 차 구조는 하기와 같다:
PN857
Mal-KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-아미드 (서열 번호: 52)
폴리펩티드 PN857은 N163 siRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단에 접합되었다.
도 5a에서 다이서 엔도뉴클레아제가 존재하지 않는 접합체 듀플렉스의 대조 배양을 구하였다. 도 5a는 폴리펩티드 PN857이 있는 N163의 27-nt 안티센스 가닥의 복합체에 해당하는 질량 13436.2에서의 피크와 N163의 25-nt 센스 가닥에 해당하는 질량 7835.3에서의 피크를 도시한다.
도 5b에서, 다이서 엔도뉴클레아제가 존재한 채로 8 시간 동안 접합체 듀플렉스의 배양을 구하였다. 도 5b는 폴리펩티드 PN857이 있는 N163의 27-nt 안티센스 가닥 접합체에 해당하는 질량 13436.1에서의 피크, N163의 25-nt 센스 가닥에 해당하는 질량 7835.6에서의 피크, N163의 접합체 27량체의 21량체 안티센스 가닥 다이서 쪼개짐 생성물에 해당하는 질량 6966.3에서의 피크 및 N163의 25량체의 21량체 센스 가닥 다이서 쪼개짐 생성물에 해당하는 질량 6607.6에서의 피크를 도시한다.
예 5
다이서 기질 siRNA /폴리펩티드 접합체들은 인도페론 반응을 도출하지 않는다
본 예는 본 발명의 대표적인 siRNA/폴리펩티드 접합체들이 인간 단구세포들과 배양되는 경우에 인터페론 반응을 도출하지 않는다는 것을 증명한다. 인터페론 반응성은 세포들을 siRNA들로 형질감염시키는 잠재적인 부작용이다. 따라서, 연구는 시험관 내에서 실시되어 siRNA/폴리펩티드 dsCoP277nfR950(안티센스 가닥 연쇄)와 dsCoP277nfR952(센스 가닥 연쇄)가 인터페론 반응을 도출하는 지의 여부를 평가하였다. Qneg siRNA/폴리펩티드 접합체(CoP840)은 음성 대조로 역할한 반면에, 인터페론-1(IFN-1)은 양성 대조로 사용되었다. 각각의 접합체는 1 nM, 10 nM, 100 nM 및 200 nM 농도에서 시험되었다. 인터페론 반응성에 대한 분석을 위하여 분자 표지 MIP1α가 사용되었다. 예상한 바와 같이, Qneg siRNA/폴리펩티드 접합체는 MIP1α 발현을 유도하지 않았으며 양성 대조 IFN-1은 상당한 양의 MIP1α 발현을 유도하였다. 접합체들인 dsCoP277nfR950과 dsCoP277nfR952는 Qneg siRNA/폴리펩티드 음성 대조의 레벨에 필적할 만한 MIP1α 레벨들을 유도하였는데, 이는 이러한 접합체들이 TNF-α의 강력한 녹다운 활성을 보인 농도들에서 인터페론 반응성을 도출하지 않는다는 것을 나타낸다(표 5 참조, 예 3)
예 6
24 웰 플레이트에서의 베로 세포 형질감염
본 예는 siRNA를 표적 세포로 도입하는 방법을 개시한다.
베로 세포들은 10 % FBS, 2 ㎖ L-글루타민, 10 nM 헤페스(Hepes), 100 units/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지 내에서 성장된다. 형질감염 되기 전에, 모든 siRNA 투여량을 위한 L2K(LipofectamineTM 2000; Invitrogen)의 적절한 스탁 용액을 제조하라. L2K를 OptiMEM
Figure 112008040121202-PCT00011
세포 배양 배지(Invitrogen)에 천천히 혼합하고 희석된 siRNA에 첨가하라. 상기 혼합물을 상온에서 15 내지 30 분 동안 배양시켜 형질감염 복합체를 형성하라. 배양의 말미에, 배양 상청액을 뽑아내고 10 % FBS를 포함하는 150 ㎕ DMEM 배지가 각각의 웰에 첨가된다. 각각의 형질감염 복합체의 다음 150 ㎕이 각각의 웰 3 벌씩 첨가된다. 플레이트를 앞뒤로 천천히 흔들어 혼합되게 한다. 37 ℃에서 3 시간 동안 배양한 후에, 상청액을 제거하고 1 ㎖ 완전 배지가 웰 마다 첨가된다. Cy5-siRNA 검출을 위하여, 세포들을 하룻밤 동안 배양시키고 현미경으로 형광을 조사하라. 다음날 독성 검출을 위하여 웰 마다 Hoescht 스탁이 1.5 ㎕을 첨가하여 Hoescht DNA 염색으로 세포들을 염색하라. 웰들을 천천히 휘저어서 37 ℃에서 15 분 동안 배양시킨다. Cy5와 UV 필터들을 사용하는 형광 현미경을 사용하여 세포들이 즉시 검사될 수 있다. 형질감염 화합물의 독성에 대한 위상 대비를 이용하여 세포들을 검사하라.
예 7
적혈구응집소 분석( HA 분석)
본 예는 바이러스 감염된 세포들로부터 생성된 바이러스들의 역가를 계산하기 위하여 이용될 수 있는 적혈구 분석법을 개시한다.
세포 배양 상청액들 내의 바이러스들을 정량화하기 위하여 적혈구응집소 분석법들(HA)이 이용된다. 예컨대, 인플루엔자 바이러스와 같은 몇몇 바이러스 모임들(families)은 인간 또는 동물 적혈구 세포들(RBC)과 교착하고(들러붙고) RBC 표면상의 N-아세틸뉴라민산과 결합할 수 있는 표면 또는 엔벨로프(envelope) 단백질들을 가진다. 각각의 바이러스는 수많은 세포 표면 단백질들을 가지기 때문에, 하나의 바이러스는 하나 이상의 RBC와 들러붙을 수 있다. 이러한 결과는 바이러스 결합된 RBC들이 바이러스들에 의해 교차연결되어 한 유형의 RBC "격자"를 형성하게 된다. 격자가 일단 형성되면, 고착된 RBC들의 갯수를 세어서 바이러스 역가가 계산될 수 있다. siRNA로 형질감염되지 않은 세포들에서의 바이러스 역가에 대비하여 siRNA-형질감염된 세포들에서의 바이러스 역가가 감소하였다는 것은 siRNA 분자들이 표적 바이러스 유전자 또는 유전자들의 발현에 간섭하였다는 것을 나타낸다.
4 개의 플레이트들에 대하여 매 20 ㎖의 PBS 내에서 0.5 % 닭 적혈구 세포들을 제조하라. 각각의 표본의 배양 상청액 100 ㎕를 v-자형 바닥의 96 웰 플레이트의 첫번째 줄의 각각의 웰에 옮겨 넣는다. 살균이 필요하다면 조직 세포 후드 내에서 실행하라. 다채널 피펫을 사용하여 바이러스 상청액을 받았던 첫번째 줄을 제외하고, 상기 플레이트들의 나머지로 웰 마다 50 ㎕ PBS를 첨가하라. 다채널 피펫을 사용하여 첫번째 줄에서부터 50 ㎕ 배양 상청액을 빨아들이고 두번째 줄의 50 ㎕ PBS와 혼합하라. 상하로 피펫을 3 회 실시하라. 다채널 피펫을 사용하여 두번째 줄의 희석된 표본 50 ㎕를 빨아들여 세번째 줄의 50 ㎕ PBS와 혼합하라. 상하로 피펫을 3 회 실시하라. 최종 줄에 이를 때까지 네번째와 다섯번째 줄을 반복하라. 0.5 % 닭 적혈구 세포들 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하라. 플레이트들을 얼음 위에서 1 시간 동안 배양하라. HA 결과들을 판독하고 바이러스 역가를 계산하라.
예8
24-웰 베로 세포 형질감염/감염 역가 녹다운 스크리닝 분석
본 예는 본 발명의 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA가 하나 이상의 바이러스 표적 유전자들의 발현을 하향조절할 수 있는 지의 여부를 결정하는 데 이용될 수 있는 분석을 개시한다.
본 예에서, 포유류 세포들은 바이러스 RNA에 상동인 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA로 형질감염된다. 형질감염 이후에, 형질감염된 세포들은 본 발명에 따라서 형질감염된 siRNA 분자들과 상동인 서열들을 지닌 하나 이상의 유전자들을 포함하는 바이러스로 감염된다.
베로 세포들은 예 6의 방법에 따른 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA로 형질감염된다. siRNA와 베로 세포들의 배양 말미를 향하여, 바이러스 희석들이 감염 단계를 보충한다. 바이러스 표본들은 원하는 감염 중복지수(MOI)를 달성하기 위하여 희석된다. 바이러스 표본들은 PBS/BSA/PS 내에서 희석되며, 적절한 양의 바이러스 용액이 각각의 웰에 첨가된다. 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한 이후에, 감염 배지(0.3 % BSA, 2 ㎖ L-글루타민, 10 nM 헤페스 및 100 units/㎖ 페니실린/스트렙토마이신, 플러스 트립신을 포함하는 DMEM 배지)의 소정량이 각각의 웰에 첨가된다. 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하라. 배양의 말미에 상청액을 수거하여 4 ℃에서 저장한다. siRNA-지시된 바이러스 RNA 간섭은 예 7에 따른 HA 분석을 작동하여 측정된다.
예 9
인플루엔자-특이적 다이서 엔도뉴클레아제 기질 siRNA 들은 녹다운 활성에 대하여 스크리닝된다
본 예는 감염된 베로 세포들 내에서의 인플루엔자 바이러스 역가의 효과적인 감소를 위하여 스크리닝되어 여기에 제시된 대표적인 인플루엔자-특이적 siRNA들을 예시한다. 비-표적 대조 siRNA로 형질감염된 세포들 내에서의 바이러스 역가에 대한 인플루엔자 특이적 siRNA-형질감염된 세포들에서의 바이러스 역가 감소의 중요성은 인플루엔자-특이적 siRNA 분자들이 표적 바이러스 유전자 또는 유전자들의 발현을 간섭한다는 것을 나타낸다는 것이다.
하기 표 6은 5'-3' 센스(상부)와 5'-3' 안티센스(하부)로 나열되어 있는, 인플루엔자에 특이적인 siRNA 듀플렉스들을 보여준다. 하기 표 6은 인플루엔자-특이적 다이서 기질 siRNA들을 나타낸다.
27량체 DX # 25량체 대응물 siRNA 서열
DX2852 G3817 (DX2825) 서열 번호: 65 센스 5'-AGACAGCGACCAAAAGAAUUCGCdAdU-3' 서열 번호: 66 안티센스 5'-AUCCGAAUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT-3'
DX2855 G6124 (DX2820) 서열 번호: 67 센스 5'-AUGAAGAUCUGUUCCACCAUUGAdAdG-3' 서열 번호: 68 안티센스 5'-CUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT-3'
DX2858 G6129 (DX2819) 서열 번호: 69 센스 5'-GAUCUGUUCCACCAUUGAAGAACdUdC-3' 서열 번호: 70 안티센스 5'-GAGUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT-3'
DX2861 G8286 (DX2822) 서열 번호: 71 센스 5'-UUGAGGAGUGCCUGAUUAAUGAUdCdC-3' 서열 번호: 72 안티센스 5'-GGAUCAUUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT-3'
DX2956 G1498 (DX2744) 서열 번호: 73 센스 5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG-3' 서열 번호: 74 안티센스 5'-CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT-3'
베로 세포들은 96 웰 플레이트의 웰 마다 10 % FBS/DMEM 배지 100 ㎕에서 형질감염되기 전날에 96 웰 플레이트의 웰 마다 1.5 x 104 개의 세포들로 살포되었다. 각각의 인플루엔자 특이적 siRNA 또는 비표적 대조 siRNA, Qneg의 100, 20 또는 5 nM를 lipofectamine 2000(Invitrogen)의 0.3 ㎕(1 ㎎/㎖ 스탁)와 복합시켰고 25 ㎕ OptiMEM(총 부피)(Gibco)에서 20 분 동안 상온에서 배양하였다. 살포된 베로 세포들의 각각의 웰에서의 상청액을 제거하여 10 % DMEM 완전 배지 10 %를 첨가하였다. 이후 OptiMEM에서의 siRNA/lipofectamine 복합체의 25 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 조건에 대하여 세 벌의 세포들을 시험하였다. 형질감염 조건이 없는 다른 대조 웰을 제조하였다. 형질감염한지 3 시간 후에, 배지를 제거하였다. 각각의 웰을 0.3 % BSA/10 mM HEPES/PS를 포함하는 100 ㎕ 1 X PBS로 1 회 세척하였다. MOI = 0.1에서의 PR8 인플루엔자 바이러스 30 ㎕를 감염을 위하여 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 상온에서 1 시간 동안 흔들었다. 0.3 % BSA/10 mM HEPES/PS + 4 ug/㎖ 트립신을 포함하는 DMEM 100 ㎕를 웰의 측면 상으로 천천히 각각의 웰에 첨하는데, 이는 세포들이 감염된 이후에 탈착되기 시작하기 때문이다. 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2에서 48 시간 동안 배양하였다. 각각의 웰에서 50 ㎕ 상청액을 HA 분석에 의하여 두벌씩 시험하였다.
DX2852, DX2855, DX2861, DX2956 및 G1498 인플루엔자-특이적 다이서 기질 siRNA들과 비-표적 대조 siRNA인 Qneg의 5 nM, 20 nM 및 100 nM 농도에서의 각각을 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)과 복합하여 살포된 베로 세포들을 형질감염시키는 데 사용하였다. 형질감염 이후에, 세포들은 0.1의 MOI(감염 중복지수)에서의 PR8 인플루엔자 바이러스로 감염되었다. 생성된 바이러스를 정량화하기 위하여, 감염된 세포들을 포함하는 웰들의 상청액은 예 7에 기술된 적혈구응집소(HA) 분석에 의하여 시험되었다. 표 7은 바이러스 역가 감소의 백분율로 표시되는 각각의 siRNA에 대한 인플루엔자 유전자 발현 활성의 녹다운을 요약한 것이다(1 - (인플루엔자 siRNA 처리된 HA 유니트들/대조 siRNA 처리된 HA 유니트들)).
하기 표 7은 인플루엔자 바이러스로 감염된 siRNA-형질감염된 베로 세포들에서의 바이러스 역가 감소 백분율을 나타낸다.
siRNA 농도 DX2852 DX2855 DX2858 DX2861 DX2956 G1498
100 nM 0 25 0 15 50 50
20 nM 25 15 40 0 50 50
5 nM 40 25 0 40 50 50
표 7의 데이터는 인플루엔자-특이적 다이서 기질 siRNA DX2956은 인플루엔자 바이러스로 감염된 베로 세포들 내에서의 인플루엔자 역가들을 효과적으로 감소시켰다는 것을 보여준다. DX2956은 G1498과 유사한 활성을 보여주었던 반면에, 다른 4 개의 다이서 기질 siRNA들은 DX2956보다 더 낮은 활성을 보여주었다. 이러한 데이터는 siRNA DX2956이 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, Ca)로 형질감염 되는 경우에 인플루엔자 mRNA 레벨들을 효과적으로 감소시켰으며 따라서 인플루엔자 감염의 치료 및/또는 방지를 위한 뛰어난 후보자였다는 것을 증명하였다.
본 발명이 이해의 명확의 목적을 위하여 예의 방법으로 상세히 기술되었지만, 제한이 아닌 예시의 방법으로 제시된 첨부된 청구항들의 범위 내에서 몇몇 변경들과 변형들이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 맥락에서, 기술된 내용의 효율적인 사용을 위하여 본 개시 내에서 다양한 발간물들과 다른 참고문헌들이 인용되었다. 각각의 이러한 참고문헌들은 모든 목적들을 위하여 여기에 그대로 참고로 포함되어 있다. 그러나, 여기에 다루어진 다양한 발간물들은 본 출원의 제출일 이전에 본 개시만을 위하여 포함되었으며, 발명자들은 종래 발명의 효력에 의하여 그러한 개시보다 선행하는 권리를 보유함을 유념한다.
SEQUENCE LISTING <110> NASTECH PHARMACEUTICAL COMPANY INC. <120> PEPTIDE-DICER SUBSTRATE RNA CONJUGATES AS DELIVERY VEHICLES FOR SIRNA <130> 05-20PCT <140> <141> <150> 60/733,665 <151> 2005-04-08 <150> 60/822,896 <151> 2006-08-18 <160> 166 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Asp <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 20 <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala <210> 14 <211> 16 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Synthetic oligonucleotide <400> 38 ggatcttatt tcttcggagt t 21 <210> 39 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 ctccgaagaa 10 <210> 40 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ataagatcct t 11 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln 1 5 10 15 <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys 20 25 30 Gln <210> 43 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Val Thr Lys Ala Gln Lys 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of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 auuucuucgg agacaaug 18 <210> 79 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 ggaucuua 8 <210> 80 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 uucuucggag acaaug 16 <210> 81 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ggaucuuauu 10 <210> 82 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 cuucggagac aaug 14 <210> 83 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 ggaucuuauu uc 12 <210> 84 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 ucggagacaa ug 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Synthetic oligonucleotide <400> 130 aug 3 <210> 131 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 ggaucuuauu ucuucgga 18 <210> 132 <211> 1 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 g 1 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 ggaucuuauu ucuucggagt t 21 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 cuccgaagaa auaagaucct t 21 <210> 135 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 ggaucuuauu u 11 <210> 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Claims (65)

  1. (a) 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자로서, 상기 가닥들이 동일하거나 상이할 수 있는 약 25 내지 약 30 개의 염기쌍의 길이들을 가지는 이중 가닥 리보핵산 분자; 및
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드는 아미노산 서열 KVLKQ(서열 번호: 51)를 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 dsRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 dsRNA는 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 siRNA는 인간 TNF-알파 유전자의 서열 일부와 상동인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 siRNA는 바이러스 유전자의 서열 일부와 상동인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 바이러스 유전자의 원천(source)은 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 dsRNA는 2 염기쌍(bp) 3' 안티센스 가닥 오버행(overhang)을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 dsRNA는 2 염기쌍 3' 센스 가닥 오버행을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 dsRNA는 오버행을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 가닥들은 동일하거나 상이할 수 있는 약 25 내지 약 29 염기쌍의 길이들을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 dsRNA 분자는 센스 RNA 가닥과 안티센스 RNA 가닥으로 구성되며, 상기 펩티드는 상기 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 하기 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 33);
    KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 42);
    VIKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 43);
    AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 44);
    KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 45);
    KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 46);
    KRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 47);
    RKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 41); SYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 48);
    VYVYKVLKQ (서열 번호: 49); YKVLKQ (서열 번호: 50); 및
    KVLKQ (서열 번호: 51).
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 동물의 세포와 결합하는 분자에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 하나의 조성물의 개선시키는(ameliorating) 양을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 TNF-α와 관련된 염증을 개선시키는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 염증은 관절염으로 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서,
    상기 염증은 건선(psoriasis)으로 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자의 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 염증을 개선하기 위하여 동물의 유전자의 발현을 억제시키는 방법으로서, 약학적 조성물들은 상기 dsRNA와 펩티드를 포함하며, 상기 dsRNA 분자는 약 25 내지 30 염기쌍들을 포함하며, 상기 펩티드는 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하고 아미노산 서열 KVLKQ(서열 번호: 51)을 포함하며, 그리고 상기 dsRNA 분자가 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 염증은 관절염으로 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 17에 있어서,
    상기 염증은 건선으로 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 청구항 1의 조성물의 개선시키는 양을 동물에 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스와 관련된 감염을 개선시키는 방법.
  21. (a) 소 억제 핵산(siRNA) 분자로서,
    상기 siRNA 분자는 약 15 뉴클레오티드들 내지 약 50 뉴클레오티드들 사이의 제 1 RNA 가닥(A 가닥), 약 1 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드들 사이의 제 2 RNA 가닥(B1 가닥) 및 약 1 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드들 사이의 제 3 RNA 가닥(B2 가닥)을 포함하는 siRNA;
    상기 dsRNA 분자는 펩티드에 접합되어 있다.
    상기 B1 가닥과 상기 B2 가닥은 상기 A 가닥의 비-중복(non-overlapping) 영역들과 각각 상보적이다;
    제 1 이중 가닥 영역(A:B1)은 상기 B1 가닥과 상기 A 가닥을 결합(annealing)시켜 형성된다; 그리고
    제 2 이중 가닥 영역(A:B2)은 상기 B2 가닥과 상기 A 가닥을 결합시켜 형성된다; 그리고
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 siRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 A:B1 듀플렉스는 상기 A:B2 듀플렉스와 하나의 틈새(nick) 또는 하나의 간격(gap)만큼 분리되며, 상기 간격은 상기 A:B1 듀플렉스와 상기 A:B2 듀플렉스 사이에 위치된 A 가닥의 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드로 발생하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 청구항 22에 있어서,
    상기 A 가닥, 상기 B1 가닥 및/또는 상기 B2 가닥의 어느 하나 또는 양쪽 모두의 3' 말단에서의 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 더 포함하는 조성물.
  24. 청구항 22와 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 A 가닥은 약 18 뉴클레오티들 내지 약 40 뉴클레오티드들 사이인 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 A 가닥은 약 20 뉴클레오티드들 내지 약 32 뉴클레오티드들 사이에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 A 가닥은 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 32 뉴클레오티드들인 것을 특징으로 하는 조성물.
  27. 청구항 22 및 23중 어느 한 항에 있어서,
    상기 A;B1 듀플렉스 및 상기 A:B2 듀플렉스는 요컨대 약 15 염기쌍들 내지 약 40 염기쌍들 사이를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 A:B1 듀플렉스 및 상기 A:B2 듀플렉스는 요컨대 약 18 염기쌍들 내지 약 35 염기쌍들 사이를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 A:B1 듀플렉스 및 상기 A:B2 듀플렉스는 요컨대 약 20 염기쌍들 내지 약 30 염기쌍들 사이를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 A:B1 듀플렉스 및 상기 A:B2 듀플렉스는 요컨대 21, 22, 23, 24, 25, 25, 27, 28 또는 29 염기쌍 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 청구항 23에 있어서,
    상기 siRNA 분자는 1 뉴클레오티드 내지 5 뉴클레오티드들 사이의 하나 또는 둘의 단일 가닥 3' 오버행(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 청구항 22 및 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5' (서열 번호: 76)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 청구항 22에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGAUCU3'(서열 번호: 77)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 청구항 22에 있어서,
    상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'ACAAUG3'(서열 번호: 90)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 청구항 22에 있어서,
    상기 A;B1 듀플렉스는 상기 A:B2 듀플렉스와 하나의 틈새만큼 분리되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 청구항 35에 있어서,
    상기 B2 가닥은 5' 히드록실로 종결되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGAUCUUAUUU3'(서열 번호: 135)를 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUUCGGAGTT3'(서열 번호: 136)을 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(서열 번호: 137)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTT3'(서열 번호: 144)를 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTTCGGAGTT3'(서열 번호: 145)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(서열 번호: 146)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAA3'(서열 번호: 148)을 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'ATAAGATCCTT3'(서열 번호: 149)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(서열 번호: 147)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGAUCUUAUUU3'(서열 번호: 153)을 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUUCGGAGTT3'(서열 번호: 154)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(서열 번호: 155)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTT3'(서열 번호: 159)를 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTTCGGAGTT3'(서열 번호: 160)을 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(서열 번호: 161)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAA3'(서열 번호: 166)을 포함 하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'ATAAGATCCTT3'(서열 번호: 34)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(서열 번호: 165)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 청구항 35에 있어서,
    상기 B1 가닥은 5' 인산염과 종결되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 청구항 43에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGAUCUUAUUU3'(서열 번호: 138)을 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUUCGGAGTT3'(서열 번호: 139)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(서열 번호: 140)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 청구항 43에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTT3'(서열 번호: 141)을 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTTCGGAGTT3'(서열 번호: 142)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(서열 번호: 143)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 청구항 43에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAA3'(서열 번호: 151)을 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'ATAAGATCCTT3'(서열 번호: 152)를 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(서열 번호: 150)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 청구항 43에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGAUCUUAUUU3'(서열 번호: 156)을 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUUCGGAGTT3'(서열 번호: 157)을 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(서열 번호: 158)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 청구항 43에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTT3'(서열 번호: 162)를 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTTCGGAGTT3'(서열 번호: 163)을 포함하며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(서열 번호: 164)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 청구항 43에 있어서,
    상기 B1 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'CTCCGAAGAA3'(서열 번호: 39)를 포함하며, 상기 B2 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'ATAAGATCCTT3'(서열 번호: 40)을 포함하 며, 그리고 상기 A 가닥은 뉴클레오티드 서열 5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(서열 번호: 38)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. (a) 소 억제 핵산(siRNA) 분자로서, 상기 siRNA 분자는 3 개의 가닥 A, B1 및 B2(A:B1B2)를 포함하며;
    A:B1B2는 약 14 개의 전체 염기쌍 내지 약 24 개의 전체 염기쌍 사이를 포함한다;
    A는 센스 가닥을 나타내고 B1B2는 안티센스 가닥을 나타낸다;
    A는 약 19 뉴클레오티드들 내지 25 뉴클레오티드 사이에 있다;
    B1 및 B2는 각각, 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    B1+B2의 결합된 길이는 약 13 뉴클레오티드들 내지 약 23 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 siRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. (a) 소 억제 핵산(siRNA) 분자로서, 상기 siRNA 분자는 3 개의 가닥 A, B1 및 B2(A:B1B2)를 포함하며;
    A:B1B2는 약 16 개의 전체 염기쌍 내지 약 22 개의 전체 염기쌍 사이를 포함 한다;
    A는 센스 가닥을 나타내고 B1B2는 안티센스 가닥을 나타낸다;
    A는 약 19 뉴클레오티드들 내지 23 뉴클레오티드 사이에 있다;
    B1 및 B2는 각각, 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    B1+B2의 결합된 길이는 약 13 뉴클레오티드들 내지 약 23 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 siRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. (a) 소 억제 핵산(siRNA) 분자로서, 상기 siRNA 분자는 3 개의 가닥 A, B1 및 B2(A:B1B2)를 포함하며;
    A:B1B2는 약 14 개의 전체 염기쌍 내지 약 24 개의 전체 염기쌍 사이를 포함한다;
    A는 안티센스 가닥을 나타내고 B1B2는 센스 가닥을 나타낸다;
    A는 약 14 뉴클레오티드들 내지 24 뉴클레오티드 사이에 있다;
    B1 및 B2는 각각, 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    B1+B2의 결합된 길이는 약 18 뉴클레오티드들 내지 약 24 뉴클레오티드들 사 이에 있다; 그리고
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 siRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. (a) 소 억제 핵산(siRNA) 분자로서, 상기 siRNA 분자는 3 개의 가닥 A, B1 및 B2(A:B1B2)를 포함하며;
    A:B1B2는 약 14 개의 전체 염기쌍 내지 약 22 개의 전체 염기쌍 사이를 포함한다;
    A는 안티센스 가닥을 나타내고 B1B2는 센스 가닥을 나타낸다;
    A는 약 16 뉴클레오티드들 내지 22 뉴클레오티드 사이에 있다;
    B1 및 B2는 각각, 개별적으로 약 1 뉴클레오티드 내지 약 15 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    B1+B2의 결합된 길이는 약 18 뉴클레오티드들 내지 약 22 뉴클레오티드들 사이에 있다; 그리고
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 siRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. (a) 청구항 21 및 청구항 50 내지 53 중 어느 한 항의 siRNA 분자로서,
    상기 siRNA 분자는 레트로바이러스, 호흡기 바이러스, 인간 메타폐렴바이러스(metapneumovirus), 인간 파라인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 표적 바이러스의 역가를 감소시키는 데 효과적인 siRNA 분자; 및
    (b) 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 siRNA 분자는 상기 펩티드에 접합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 청구항 21 및 청구항 50 내지 53 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드는 KRRQRRR (서열 번호: 1),
    RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호: 2),
    DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD (서열 ID NO: 3),
    AAVALLPAVLLALLAP (서열 번호: 4),
    AAVLLPVLLPVLLAAP (서열 번호: 5),
    VTVLALGALAGVGVG (서열 번호: 6),
    GALFLGWLGAAGSTMGA (서열 번호: 7),
    MGLGLHLLVLAAALQGA (서열 번호: 8),
    LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (서열 번호: 9),
    GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL (서열 번호: 10),
    TPPKKKRKVEDPKKKK (서열 번호: 11),
    RRRRRRR (서열 번호: 12),
    KLALKLALKALKAALKLA (서열 번호: 13),
    GLFGAIAGFIENGWEG (서열 번호: 14),
    FFGAVIGTIALGVATA (서열 번호: 15),
    FLGFLLGVGSAIASGV (서열 번호: 16),
    GVFVLGFLGFLATAGS (서열 번호: 17),
    GAAIGLAWIPYFGPAA (서열 번호: 18),
    ACTCPYCKDSEGRGSGDP GKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC (서열 번호: 19),
    ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC
    (서열 번호: 20),
    ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC
    (서열 번호: 21),
    ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC
    (서열 번호: 22),
    RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC
    (서열 번호: 23),
    TCDCPNCQEAERLGP AGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC
    (서열 번호: 24),
    RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC (서열 번호: 25),
    PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC
    (서열 번호: 26),
    WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR (서열 번호: 27),
    GKINLKALAALAKKIL (서열 번호: 28), RVIRVWFQNKRCKDKK (서열 번호: 29),
    RKKRRQRRRPPQGRKKJtRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ (서열 번호: 30),
    GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK (서열 번호: 31),
    KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 33),
    KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 37),
    RKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 41), KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 42),
    VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 43),
    AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 44),
    KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 45),
    KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 46),
    KRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 47), SYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 48),
    VYVYKVLKQ (서열 번호: 49), YKVLKQ (서열 번호: 50), KVLKQ (서열 번호: 51) 및 KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ (서열 번호: 52)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 바이러스의 역가를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) siRNA-매개 유전자 침묵을 위하여 표적 유전자를 선택하는 단계로서, 상기 표적 유전자는 표적 바이러스 유전자인 것을 특징으로 하는 단계;
    (b) 상기 표적 바이러스 유전자의 siRNA 매개 유전자 침묵을 위한 적합한 siRNA 분자(들)을 설계하고/하거나 합성하는 단계로서, 상기 siRNA 분자(들) 각각은 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스를 포함하며 상기 간격이나 틈새는 상기 siRNA 듀플렉스의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 어느 하나에서 발생하는 것을 특징으로 하는 단계;
    (c) 상기 siRNA를 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드와 접합시키는 단계; 및
    (d) 상기 siRNA 분자(들)을 상기 표적 바이러스 유전자를 발현시키는 세포로 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 siRNA 분자 펩티드 접합체는 해당 표적 바이러스 mRNA와 특이적으로 결합하여 상기 세포 내의 그 발현 레벨을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 내생성 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) siRNA-매개 유전자 침묵을 위하여 표적 유전자를 선택하는 단계로서, 상기 표적 유전자는 내생성 유전자인 것을 특징으로 하는 단계;
    (b) 상기 내생성 표적 유전자의 siRNA 매개 유전자 침묵을 위한 적합한 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스 siRNA 분자(들)을 설계하고/하거나 합성하는 단계로서, 상기 siRNA 분자는 간격이 있거나 틈새가 있는 듀플렉스를 포함하며 상기 간 격이나 틈새는 상기 siRNA 분자의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 어느 하나에서 발생하는 것을 특징으로 하는 단계;
    (c) 상기 siRNA를 약 5 내지 약 40 개의 아미노산들을 포함하는 펩티드와 접합시키는 단계; 및
    (d) 상기 siRNA 분자를 상기 내생성 표적 유전자를 발현시키는 세포로 투여하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 siRNA 분자 펩티드 접합체는 해당 내생성 표적 mRNA와 특이적으로 결합하여 상기 세포 내의 그 발현 레벨을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF-α와 관련된 염증을 개선시키는 약제로서의 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  59. 청구항 58에 있어서,
    상기 염증은 관절염으로 발생하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  60. 청구항 58에 있어서,
    상기 염증은 건선으로 발생하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  61. 청구항 1에 있어서,
    인플루엔자 바이러스와 관련된 감염을 개선시키는 약제로서의 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  62. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
    TNF-α와 관련된 감염을 개선시키는 약제의 제조를 특징으로 하는 조성물의 사용.
  63. 청구항 62에 있어서,
    상기 염증은 관절염으로 발생하는 것을 특징으로 하는 사용.
  64. 청구항 62에 있어서,
    상기 염증은 건선으로 발생하는 것을 특징으로 하는 사용.
  65. 청구항 1에 있어서,
    인플루엔자 바이러스오 관련된 감염을 개선시키기 위하여 약제의 제조를 특징으로 하는 조성물의 사용.
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