JPH08301791A - 機能性分子輸送体 - Google Patents
機能性分子輸送体Info
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- JPH08301791A JPH08301791A JP7114770A JP11477095A JPH08301791A JP H08301791 A JPH08301791 A JP H08301791A JP 7114770 A JP7114770 A JP 7114770A JP 11477095 A JP11477095 A JP 11477095A JP H08301791 A JPH08301791 A JP H08301791A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生体内で安定な機能性オリゴヌクレオチド用
ヒストンキャリヤーを提供する。 【構成】 ヒストンサブユニットをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ
３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒストンを再構築する
ことを特徴とする機能性オリゴヌクレオチド用ヒストン
キャリヤーの製造方法、ならびに上記ヒストンサブユニ
ットの混合によるキャリアーの再構築過程において、機
能性オリゴヌクレオチドを共存させることによって得ら
れる機能性オリゴヌクレオチドとヒストンキャリヤーと
の複合体。
ヒストンキャリヤーを提供する。 【構成】 ヒストンサブユニットをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ
３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒストンを再構築する
ことを特徴とする機能性オリゴヌクレオチド用ヒストン
キャリヤーの製造方法、ならびに上記ヒストンサブユニ
ットの混合によるキャリアーの再構築過程において、機
能性オリゴヌクレオチドを共存させることによって得ら
れる機能性オリゴヌクレオチドとヒストンキャリヤーと
の複合体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、機能性オリゴヌクレオ
チド用のキャリアーに関する。さらに詳しくは、本発明
は各種疾患の原因となる遺伝子から転写されるｍＲＮＡ
に対して配列特異的な抑制機能を有するオリゴヌクレオ
チドを、安定にかつ効率よく標的細胞へ運搬する新規キ
ャリアーに関する。
チド用のキャリアーに関する。さらに詳しくは、本発明
は各種疾患の原因となる遺伝子から転写されるｍＲＮＡ
に対して配列特異的な抑制機能を有するオリゴヌクレオ
チドを、安定にかつ効率よく標的細胞へ運搬する新規キ
ャリアーに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、オリゴヌクレオチドを医薬品とし
て用いるための基礎研究が活発に展開されてきており、
ようやくその可能性を具体的に探索する段階にはいって
きた。実際に、試験管レベルの実験においては、オリゴ
ヌクレオチドの対溶媒安定性や標的塩基配列の選択等に
関する化学的研究、細胞株を使用したオリゴヌクレオチ
ドの膜透過性、安定性、細胞内分布等に関する基礎的研
究の成果が数多く報告されている。
て用いるための基礎研究が活発に展開されてきており、
ようやくその可能性を具体的に探索する段階にはいって
きた。実際に、試験管レベルの実験においては、オリゴ
ヌクレオチドの対溶媒安定性や標的塩基配列の選択等に
関する化学的研究、細胞株を使用したオリゴヌクレオチ
ドの膜透過性、安定性、細胞内分布等に関する基礎的研
究の成果が数多く報告されている。
【０００３】オリゴヌクレオチドはそれ自身の安定性が
低い理由ために、ヌクレアーゼなどによって生体内で分
解されやすい。そこで、これを安定に効率良く目的の部
位へ送達するためのキャリアーの開発は、オリゴヌクレ
オチドを医薬品として有効に利用するためには不可欠で
あり、極めて重要であると指摘されている。具体的に
は、キャリヤーによる機能性オリゴヌクレオチドの細胞
膜透過性向上を含めた効率の良いターゲティングシステ
ムの確立、キャリアーによる薬物オリゴヌクレオチドの
安定性向上および細胞への取り込み効率の増加等が重要
な課題とされている。
低い理由ために、ヌクレアーゼなどによって生体内で分
解されやすい。そこで、これを安定に効率良く目的の部
位へ送達するためのキャリアーの開発は、オリゴヌクレ
オチドを医薬品として有効に利用するためには不可欠で
あり、極めて重要であると指摘されている。具体的に
は、キャリヤーによる機能性オリゴヌクレオチドの細胞
膜透過性向上を含めた効率の良いターゲティングシステ
ムの確立、キャリアーによる薬物オリゴヌクレオチドの
安定性向上および細胞への取り込み効率の増加等が重要
な課題とされている。
【０００４】従来の技術としては、生体膜類似の脂質二
分子膜構造を有する構造体であるリポソームを利用した
システムが多く見られる。例えば、リポソームにオリゴ
ヌクレオチド薬物を封入して安定性の向上をはかると同
時に、リポソームを化学修飾することにより標的細胞に
対する親和性を増したという報告例がある（Alain R.Th
ierry and Anatoly Dritschilo, Nucleic Acids Resear
ch 20, 5691-5698 (1992)）。
分子膜構造を有する構造体であるリポソームを利用した
システムが多く見られる。例えば、リポソームにオリゴ
ヌクレオチド薬物を封入して安定性の向上をはかると同
時に、リポソームを化学修飾することにより標的細胞に
対する親和性を増したという報告例がある（Alain R.Th
ierry and Anatoly Dritschilo, Nucleic Acids Resear
ch 20, 5691-5698 (1992)）。
【０００５】さらに、オリゴヌクレオチド薬物が負電荷
を有することを利用し、正電荷を有する合成高分子との
間で複合体を形成させることにより、標的となる細胞も
しくは細胞内へ送達させることを試みた研究報告もある
（Nature 271, 130-135 (1978)、J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987), J. Biol. Chem. 263, 14621-14624
(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414
(1990)）。
を有することを利用し、正電荷を有する合成高分子との
間で複合体を形成させることにより、標的となる細胞も
しくは細胞内へ送達させることを試みた研究報告もある
（Nature 271, 130-135 (1978)、J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987), J. Biol. Chem. 263, 14621-14624
(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414
(1990)）。
【０００６】一方、生体由来のタンパク質をキャリアー
として利用する試みもある。例えば、下記文献において
は、キャリアーとして核タンパク質であるヒストン等を
用い、それをプラスミドＤＮＡ用のキャリアーとした研
究を行なっている。
として利用する試みもある。例えば、下記文献において
は、キャリアーとして核タンパク質であるヒストン等を
用い、それをプラスミドＤＮＡ用のキャリアーとした研
究を行なっている。
【０００７】1）Masaru Yamaizumi, et al., Nature 27
3, 782-784 (1978). 2）Yasufumi Kaneda, et al., SCIENCE 243, 375-378
(1989). 3）Mirjam Breeuwer and David S. Goldfarb, Cell 6
0，999-1008 (1990). 4）Jian Chen, et al., Human Gene Therapy 5, 429-4
35 (1994). 文献（1）においては、ヒストンの細胞核への移行が非
常にスムーズに生じることが示されており、文献（２）
においては、プラスミドＤＮＡを封入したリポソームに
核タンパク質を導入することにより、培養細胞への取り
込みの向上をはかっている。文献（３）においては、ヒ
ストンＨ１へチトクロムＣを導入することにより、細胞
核内への取り込みの向上をはかっている。文献（４）に
おいては、ガラクトシル化したヒストンへプラスミドＤ
ＮＡを結合させることにより、細胞内への取り込みおよ
び遺伝子発現の向上について検討している。
3, 782-784 (1978). 2）Yasufumi Kaneda, et al., SCIENCE 243, 375-378
(1989). 3）Mirjam Breeuwer and David S. Goldfarb, Cell 6
0，999-1008 (1990). 4）Jian Chen, et al., Human Gene Therapy 5, 429-4
35 (1994). 文献（1）においては、ヒストンの細胞核への移行が非
常にスムーズに生じることが示されており、文献（２）
においては、プラスミドＤＮＡを封入したリポソームに
核タンパク質を導入することにより、培養細胞への取り
込みの向上をはかっている。文献（３）においては、ヒ
ストンＨ１へチトクロムＣを導入することにより、細胞
核内への取り込みの向上をはかっている。文献（４）に
おいては、ガラクトシル化したヒストンへプラスミドＤ
ＮＡを結合させることにより、細胞内への取り込みおよ
び遺伝子発現の向上について検討している。
【０００８】真核生物において、染色体のＤＮＡはヒス
トンと結合し、クロマチンと呼ばれる複合体を形成して
いる。ヒストンは通常、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、
Ｈ４の５種類のサブユニットからなり、塩基性アミノ酸
の比率がきわめて高いことが知られている。ヒストンが
多くの正電荷を有することは、この分子の１つの主要な
特徴である。そのために、ＤＮＡ等負電荷を有する物質
との間で相互作用することが可能となっている。Ｈ１以
外のヒストンサブユニットの一次構造は、生物種が異な
っても非常によく保存されており、異種の生物のヒスト
ンサブユニットを組み合わせてもヒストン自体は再構成
されることが知られている。また、ヒストンがタンパク
質の一種であるにもかかわらず、特別な酵素活性をもた
ないことも広く知られており、これは、機能性オリゴヌ
クレオチド用キャリアーとしてヒストン利用する上で有
利な特徴であると考えられる。さらに、ヒストンサブユ
ニットのＨ１とＨ２ａの一次構造中には、細胞核移行性
シグナルとしての機能をもつアミノ酸配列が存在してい
るとの報告もある（Robert B. Moreland, et al.,Molec
ular and Cellular Biology 7, 4048-4057 (1987)）。
トンと結合し、クロマチンと呼ばれる複合体を形成して
いる。ヒストンは通常、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、
Ｈ４の５種類のサブユニットからなり、塩基性アミノ酸
の比率がきわめて高いことが知られている。ヒストンが
多くの正電荷を有することは、この分子の１つの主要な
特徴である。そのために、ＤＮＡ等負電荷を有する物質
との間で相互作用することが可能となっている。Ｈ１以
外のヒストンサブユニットの一次構造は、生物種が異な
っても非常によく保存されており、異種の生物のヒスト
ンサブユニットを組み合わせてもヒストン自体は再構成
されることが知られている。また、ヒストンがタンパク
質の一種であるにもかかわらず、特別な酵素活性をもた
ないことも広く知られており、これは、機能性オリゴヌ
クレオチド用キャリアーとしてヒストン利用する上で有
利な特徴であると考えられる。さらに、ヒストンサブユ
ニットのＨ１とＨ２ａの一次構造中には、細胞核移行性
シグナルとしての機能をもつアミノ酸配列が存在してい
るとの報告もある（Robert B. Moreland, et al.,Molec
ular and Cellular Biology 7, 4048-4057 (1987)）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】リポソームキャリヤー
の場合、生体内に投与されたリポソーム自体の安定性が
低いという大きな欠点がある。そこで最近では、様々な
手法を用いることにより、酸化安定性、化学的安定性、
生物的安定性およびコロイド化学的安定性の改良がなさ
れており、生体内半減期の長いステルスリポソームや、
抗体を表面に埋め込んで標的特異性の向上をはかったイ
ムノリポソーム等も開発されているが、未だ実用化には
至っていない。
の場合、生体内に投与されたリポソーム自体の安定性が
低いという大きな欠点がある。そこで最近では、様々な
手法を用いることにより、酸化安定性、化学的安定性、
生物的安定性およびコロイド化学的安定性の改良がなさ
れており、生体内半減期の長いステルスリポソームや、
抗体を表面に埋め込んで標的特異性の向上をはかったイ
ムノリポソーム等も開発されているが、未だ実用化には
至っていない。
【００１０】合成アミノ酸キャリヤーのような正電荷を
有する高分子は、高い細胞毒性を有することが以前から
指摘されている（Bio-conjugate Chem. 1, 149-153 (19
90)）。それと同時に、これら合成高分子が生体内へ投
与される場合は、異物として認識されることにより、ア
ナフェラキシーショック等の免疫系への影響も懸念され
る。
有する高分子は、高い細胞毒性を有することが以前から
指摘されている（Bio-conjugate Chem. 1, 149-153 (19
90)）。それと同時に、これら合成高分子が生体内へ投
与される場合は、異物として認識されることにより、ア
ナフェラキシーショック等の免疫系への影響も懸念され
る。
【００１１】天然タンパク質のヒストンの利用により先
の２つの問題回避は予想される。しかしながら、オリゴ
ヌクレオチドとヒストンとの単純な混合により形成され
る複合体は、生体内において非常に不安定であることが
知られている。後の実施例でも示されるが、両者の単純
な混合により形成した複合体は、高濃度の人血清中では
数十秒のオーダーで分解した。この種の複合体は、既成
の親ヒストンへオリゴヌクレオチドを添加することで形
成するものであり、両者は単純な静電気的相互作用によ
り表面的に結合していると考えられる。これはこ機能性
オリゴヌクレオチド用キャリアーを開発する上で解決す
べき課題として残されている。
の２つの問題回避は予想される。しかしながら、オリゴ
ヌクレオチドとヒストンとの単純な混合により形成され
る複合体は、生体内において非常に不安定であることが
知られている。後の実施例でも示されるが、両者の単純
な混合により形成した複合体は、高濃度の人血清中では
数十秒のオーダーで分解した。この種の複合体は、既成
の親ヒストンへオリゴヌクレオチドを添加することで形
成するものであり、両者は単純な静電気的相互作用によ
り表面的に結合していると考えられる。これはこ機能性
オリゴヌクレオチド用キャリアーを開発する上で解決す
べき課題として残されている。
【００１２】上述した従来技術をふまえ、本発明者らは
種々の検討を行い、ヒストンサブユニットから親ヒスト
ンが再構築される過程で機能性オリゴヌクレオチドを共
存させることにより、その安定性の向上が可能となるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち本
発明の目的は、核タンパク質であるヒストンをオリゴヌ
クレオチド薬物用キャリアーとして使用するにあたり、
オリゴヌクレオチド自身の安定性を向上させるための技
術を提供することである。
種々の検討を行い、ヒストンサブユニットから親ヒスト
ンが再構築される過程で機能性オリゴヌクレオチドを共
存させることにより、その安定性の向上が可能となるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち本
発明の目的は、核タンパク質であるヒストンをオリゴヌ
クレオチド薬物用キャリアーとして使用するにあたり、
オリゴヌクレオチド自身の安定性を向上させるための技
術を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】上述した目的を達成する
ため、鋭意研究した結果、本発明者らは特定の順序でヒ
ストンサブユニットを混合することにより安定な機能性
オリゴヌクレオチド用ヒストンキャリヤーが得られるこ
とを発見して本発明を完成した。
ため、鋭意研究した結果、本発明者らは特定の順序でヒ
ストンサブユニットを混合することにより安定な機能性
オリゴヌクレオチド用ヒストンキャリヤーが得られるこ
とを発見して本発明を完成した。
【００１４】すなわち、本発明は、ヒストンサブユニッ
トをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して
親ヒストンを再構築することを特徴とする機能性オリゴ
ヌクレオチド用ヒストンキャリヤーの製造方法を提供す
る。
トをＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して
親ヒストンを再構築することを特徴とする機能性オリゴ
ヌクレオチド用ヒストンキャリヤーの製造方法を提供す
る。
【００１５】本発明はまた、上記方法の過程において機
能性オリゴヌクレオチドを共存させて得られるヒストン
キャリヤーと機能性オリゴヌクレオチドとの複合体を提
供する。
能性オリゴヌクレオチドを共存させて得られるヒストン
キャリヤーと機能性オリゴヌクレオチドとの複合体を提
供する。
【００１６】以下に本発明を詳細に説明する。
【００１７】本発明の機能性オリゴヌクレオチド用ヒス
トンキャリヤーの製造方法は、ヒストンサブユニットの
混合順序に特徴を有する。上述したように、ヒストンは
Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３およびＨ４の５種類のサブ
ユニットからなっており、これらのサブユニットをＨ２
ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒスト
ンを再構築する。ただし、Ｈ２ａとＨ２ｂとの順序は逆
であってもよいが、まずＨ２ａとＨ２ｂとの混合物を作
成することが必要である。次いでこの混合物にＨ３、Ｈ
４、Ｈ１の順序でサブユニットを添加する。サブユニッ
トの混合方法としては、５の階乗すなわち１２０通りが
考えられるが、ヒストンの再構築においては本発明の方
法以外の順序で混合した場合には、白濁や沈殿を生じて
ヒストンの生成が観察されなかった。本発明のヒストン
キャリアーの製造方法を図１に模式図として示す。本発
明の方法により調製した再構築ヒストンが天然のヒスト
ンと同じ立体構造をとることを円偏光二色性（ＣＤ）測
定を用いて確認した。
トンキャリヤーの製造方法は、ヒストンサブユニットの
混合順序に特徴を有する。上述したように、ヒストンは
Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３およびＨ４の５種類のサブ
ユニットからなっており、これらのサブユニットをＨ２
ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒスト
ンを再構築する。ただし、Ｈ２ａとＨ２ｂとの順序は逆
であってもよいが、まずＨ２ａとＨ２ｂとの混合物を作
成することが必要である。次いでこの混合物にＨ３、Ｈ
４、Ｈ１の順序でサブユニットを添加する。サブユニッ
トの混合方法としては、５の階乗すなわち１２０通りが
考えられるが、ヒストンの再構築においては本発明の方
法以外の順序で混合した場合には、白濁や沈殿を生じて
ヒストンの生成が観察されなかった。本発明のヒストン
キャリアーの製造方法を図１に模式図として示す。本発
明の方法により調製した再構築ヒストンが天然のヒスト
ンと同じ立体構造をとることを円偏光二色性（ＣＤ）測
定を用いて確認した。
【００１８】本発明のヒストンキャリアーシステムを構
築するために用いるヒストンサブユニットの例として
は、ベーリンガーマンハイム社製のヒストンＨ１、ヒス
トンＨ２ａ、ヒストンＨ２ｂ 、ヒストンＨ３ 、ヒスト
ンＨ４が挙げられる。また、正しい構造のヒストンが再
構築されたかの確認に用いるため、同社製のヒストンズ
（構築済みヒストン）も比較のために用いた。
築するために用いるヒストンサブユニットの例として
は、ベーリンガーマンハイム社製のヒストンＨ１、ヒス
トンＨ２ａ、ヒストンＨ２ｂ 、ヒストンＨ３ 、ヒスト
ンＨ４が挙げられる。また、正しい構造のヒストンが再
構築されたかの確認に用いるため、同社製のヒストンズ
（構築済みヒストン）も比較のために用いた。
【００１９】本発明の方法でヒストンキャリアーを製造
するには、まず、各ヒストンサブユニットをイオン強度
０．０１〜０．１、好ましくは０．０２のリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）に溶解後、それぞれの濃度が約５×１０
-6〜１×１０-4Ｍ、好ましくは１×１０-5Ｍになるよう
に調整する。ヒストンの再構築は、Ｈ２ａ溶液とＨ２ｂ
溶液を混合した後、これに対してＨ３溶液を、それから
Ｈ４溶液を、最後にＨ１溶液を添加する順序で行う。こ
れらサブユニット溶液の混合に際しては、各サブユニッ
トが等モル数になるようにあらかじめ調製する必要があ
る。本発明により得られる再構築されたヒストンは機能
性オリゴヌクレオチドのキャリアーとして有用である。
するには、まず、各ヒストンサブユニットをイオン強度
０．０１〜０．１、好ましくは０．０２のリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）に溶解後、それぞれの濃度が約５×１０
-6〜１×１０-4Ｍ、好ましくは１×１０-5Ｍになるよう
に調整する。ヒストンの再構築は、Ｈ２ａ溶液とＨ２ｂ
溶液を混合した後、これに対してＨ３溶液を、それから
Ｈ４溶液を、最後にＨ１溶液を添加する順序で行う。こ
れらサブユニット溶液の混合に際しては、各サブユニッ
トが等モル数になるようにあらかじめ調製する必要があ
る。本発明により得られる再構築されたヒストンは機能
性オリゴヌクレオチドのキャリアーとして有用である。
【００２０】また、本発明のヒストンキャリアーと機能
性オリゴヌクレオチドとの複合体を製造するには、上述
したヒストンキャリアー製造の過程で機能性オリゴヌク
レオチドを添加する。機能性オリゴヌクレオチドの添加
はＨ２ａ、Ｈ２ｂを混合した後であって、かつＨ１を添
加する前に行うことが必要である。Ｈ２ａとＨ２ｂの混
合物に機能性オリゴヌクレオチドを添加し、次いでＨ
３、Ｈ４、Ｈ１の順序でサブユニットを添加するのが最
も好ましい。
性オリゴヌクレオチドとの複合体を製造するには、上述
したヒストンキャリアー製造の過程で機能性オリゴヌク
レオチドを添加する。機能性オリゴヌクレオチドの添加
はＨ２ａ、Ｈ２ｂを混合した後であって、かつＨ１を添
加する前に行うことが必要である。Ｈ２ａとＨ２ｂの混
合物に機能性オリゴヌクレオチドを添加し、次いでＨ
３、Ｈ４、Ｈ１の順序でサブユニットを添加するのが最
も好ましい。
【００２１】機能性オリゴヌクレオチドとは、生体内で
一定の生物学的機能を果たすべく設計されたオリゴヌク
レオチドをいい、例えば、各種疾患の原因となる遺伝子
から転写されるｍＲＮＡに対して配列特異的な抑制機能
を有するアンチセンスＤＮＡやリボヌクレオチドなどが
挙げられる。本発明で使用する機能性オリゴヌクレオチ
ドの長さは１５〜４０塩基が好ましい。これらの機能性
オリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて公知
の方法で合成することができる。
一定の生物学的機能を果たすべく設計されたオリゴヌク
レオチドをいい、例えば、各種疾患の原因となる遺伝子
から転写されるｍＲＮＡに対して配列特異的な抑制機能
を有するアンチセンスＤＮＡやリボヌクレオチドなどが
挙げられる。本発明で使用する機能性オリゴヌクレオチ
ドの長さは１５〜４０塩基が好ましい。これらの機能性
オリゴヌクレオチドは市販のＤＮＡ合成機を用いて公知
の方法で合成することができる。
【００２２】なお、一連の操作は室温付近で行う。
【００２３】機能性オリゴヌクレオチドとして用い得る
モデルオリゴヌクレオチドの合成とその標識を以下の方
法により行った。
モデルオリゴヌクレオチドの合成とその標識を以下の方
法により行った。
【００２４】［モデルオリゴヌクレオチドの合成］図２
に示した配列のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機
（アプライドバイオシステムズ社製タイプ３８０Ｂまた
はタイプ３９２）を用いて合成した。アミダイト試薬に
は、全て、ミリポア社のものを用いた。図２ではアデノ
シンンヌクレオチドをＡ、グアノシンンヌクレオチドを
Ｇ、シチジンヌクレオチドをＣ、ウリジンヌクレオチド
をＵと記載している。これらは、２’ー水酸基の保護基
としてｔーブチルジメチルシリル基を用いたホスホロア
ミダイト法（Nucleic Acid Res．vol．177059-7071 (19
89)）により合成した。
に示した配列のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機
（アプライドバイオシステムズ社製タイプ３８０Ｂまた
はタイプ３９２）を用いて合成した。アミダイト試薬に
は、全て、ミリポア社のものを用いた。図２ではアデノ
シンンヌクレオチドをＡ、グアノシンンヌクレオチドを
Ｇ、シチジンヌクレオチドをＣ、ウリジンヌクレオチド
をＵと記載している。これらは、２’ー水酸基の保護基
としてｔーブチルジメチルシリル基を用いたホスホロア
ミダイト法（Nucleic Acid Res．vol．177059-7071 (19
89)）により合成した。
【００２５】これは、３２塩基からなるリボヌクレオチ
ド（Ｒ３２）であり、部分的に特異な立体構造を形成す
ることが知られている（Nature, vol．372, 68-74 (199
4)）。また、オリゴヌクレオチドの精製は文献（Nuclei
c Acid Res. vol.19, 5125-5130(1991)）に記載された
方法に従った。
ド（Ｒ３２）であり、部分的に特異な立体構造を形成す
ることが知られている（Nature, vol．372, 68-74 (199
4)）。また、オリゴヌクレオチドの精製は文献（Nuclei
c Acid Res. vol.19, 5125-5130(1991)）に記載された
方法に従った。
【００２６】［オリゴヌクレオチドの標識］オリゴヌク
レオチドの標識は、オリゴヌクレオチド（１．８３ＯＤ
260ユニット，５ｐｍｏｌ）２７．３μｌ、オートクレ
ーブした精製水１５．７μｌ、１０×キナーゼ緩衝液
（２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液：ｐＨ７．６、１００ｍ
Ｍ DＴＴ、Ｔ４ポリヌクレアーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ
／μｌ)１μｌ、γー32ＰーＡＴＰ１μｌを混合後、３
７℃にて１時間反応させて行った。オリゴヌクレオチド
への32Ｐのラベルには宝酒造株式会社のＴ４-ポリヌク
レオチドキナーゼキット(Code No. 2030)を用いた。
レオチドの標識は、オリゴヌクレオチド（１．８３ＯＤ
260ユニット，５ｐｍｏｌ）２７．３μｌ、オートクレ
ーブした精製水１５．７μｌ、１０×キナーゼ緩衝液
（２５０ｍＭトリス塩酸緩衝液：ｐＨ７．６、１００ｍ
Ｍ DＴＴ、Ｔ４ポリヌクレアーゼ溶液（１００ｕｎｉｔ
／μｌ)１μｌ、γー32ＰーＡＴＰ１μｌを混合後、３
７℃にて１時間反応させて行った。オリゴヌクレオチド
への32Ｐのラベルには宝酒造株式会社のＴ４-ポリヌク
レオチドキナーゼキット(Code No. 2030)を用いた。
【００２７】
【実施例】実施例によって本発明をさらに具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるも
のではない。
するが、本発明はこれらの実施例によって制限されるも
のではない。
【００２８】
【００２９】実施例１：ヒストンキャリアーおよびヒス
トン複合体の調製 ５種類のヒストンサブユニットをイオン強度０．０２の
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解後、それぞれの濃度
が１×１０-5Ｍ／Ｌになるように調整する。各サブユニ
ットおよびオリゴヌクレオチド溶液（約５ｐｍｏｌ／μ
ｌ）を図３に示すように、様々な順序で混合した。
トン複合体の調製 ５種類のヒストンサブユニットをイオン強度０．０２の
リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解後、それぞれの濃度
が１×１０-5Ｍ／Ｌになるように調整する。各サブユニ
ットおよびオリゴヌクレオチド溶液（約５ｐｍｏｌ／μ
ｌ）を図３に示すように、様々な順序で混合した。
【００３０】得られる生成物の白濁、沈殿生成を３６０
ｎｍにおける吸光度測定により分光学的に行った。
ｎｍにおける吸光度測定により分光学的に行った。
【００３１】吸光度測定の結果を図３に示す。横軸はヒ
ストンサブユニットの混合順序を、縦軸はその混合にお
ける２８０ｎｍの吸光度すなわち系の濁りを示す。サブ
ユニットの混合方法としては、５の階乗すなわち１２０
通りが考えられるが、ヒストンの再構築において、Ｈ２
ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１以外の順序で混合した場
合、その系は白濁した。これに対し、先の規則性を基に
混合した場合、その系においては白濁、沈殿物の生成は
全く観測されなかった。また、上記濃度のオリゴヌクレ
オチドをＨ２ａとＨ２ｂの混合溶液に添加後、Ｈ３、Ｈ
４、Ｈ１の順で各サブユニットを混合することによりヒ
ストンキャリヤーとオリゴヌクレオチドとの複合体（オ
リゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体）の調製を行
ったが、その系においても白濁、沈殿物の生成は観測さ
れなかった。これらの結果から、本発明の規則的な順序
による混合により再構築ヒストンが得られることが示さ
れ、同時にそのオリゴヌクレオチド薬物用キャリアーシ
ステムとしての利用の可能性が示された。
ストンサブユニットの混合順序を、縦軸はその混合にお
ける２８０ｎｍの吸光度すなわち系の濁りを示す。サブ
ユニットの混合方法としては、５の階乗すなわち１２０
通りが考えられるが、ヒストンの再構築において、Ｈ２
ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１以外の順序で混合した場
合、その系は白濁した。これに対し、先の規則性を基に
混合した場合、その系においては白濁、沈殿物の生成は
全く観測されなかった。また、上記濃度のオリゴヌクレ
オチドをＨ２ａとＨ２ｂの混合溶液に添加後、Ｈ３、Ｈ
４、Ｈ１の順で各サブユニットを混合することによりヒ
ストンキャリヤーとオリゴヌクレオチドとの複合体（オ
リゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体）の調製を行
ったが、その系においても白濁、沈殿物の生成は観測さ
れなかった。これらの結果から、本発明の規則的な順序
による混合により再構築ヒストンが得られることが示さ
れ、同時にそのオリゴヌクレオチド薬物用キャリアーシ
ステムとしての利用の可能性が示された。
【００３２】
【００３３】実施例２：円偏向二色性（ＣＤ）測定 溶液中のヒストンタンパク質の立体構造はＣＤ測定によ
り検討した。ＣＤ測定装置には日本分光工業株式会社の
Ｊー７２０型を、セルには光路長１ｍｍの円筒型セルを
用い、２５℃の条件で２００〜２５０ｎｍの波長領域に
おいて４回のスキャンを行い、ＣＤスペクトルを求め
た。
り検討した。ＣＤ測定装置には日本分光工業株式会社の
Ｊー７２０型を、セルには光路長１ｍｍの円筒型セルを
用い、２５℃の条件で２００〜２５０ｎｍの波長領域に
おいて４回のスキャンを行い、ＣＤスペクトルを求め
た。
【００３４】αーヘリックス等の二次構造の含量は、Ya
hnらの参照スペクトルを使ったＣＤスペクトルのカーブ
・フィッティッング法により求めた。
hnらの参照スペクトルを使ったＣＤスペクトルのカーブ
・フィッティッング法により求めた。
【００３５】図４は、市販の構築済みヒストン（ａ）、
実施例１により調製した本発明のＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３
→Ｈ４→Ｈ１の順序で再構築された再構築ヒストン
（ｂ）、実施例１により調製したモデルオリゴヌクレオ
チド薬物のＲ３２を共存させた再構築ヒストンすなわち
オリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体（ｃ）のＣ
Ｄスペクトルを示す。３つのＣＤスペクトルは、この測
定装置の精度内で完全に一致した。この結果から、再構
築ヒストンの立体構造は、構築済みヒストンのそれと少
なくとも二次構造レベルで同じ立体構造であることが示
された。さらに、オリゴヌクレオチド／再構築ヒストン
複合体は、オリゴヌクレオチドを含まない再構築ヒスト
ンと同じ立体構造をとることも示された。この結果は、
再構築ヒストンが構築済みヒストンすなわち天然ヒスト
ンと似た生理活性機能を持つことを示唆するものであ
る。
実施例１により調製した本発明のＨ２ａ→Ｈ２ｂ→Ｈ３
→Ｈ４→Ｈ１の順序で再構築された再構築ヒストン
（ｂ）、実施例１により調製したモデルオリゴヌクレオ
チド薬物のＲ３２を共存させた再構築ヒストンすなわち
オリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体（ｃ）のＣ
Ｄスペクトルを示す。３つのＣＤスペクトルは、この測
定装置の精度内で完全に一致した。この結果から、再構
築ヒストンの立体構造は、構築済みヒストンのそれと少
なくとも二次構造レベルで同じ立体構造であることが示
された。さらに、オリゴヌクレオチド／再構築ヒストン
複合体は、オリゴヌクレオチドを含まない再構築ヒスト
ンと同じ立体構造をとることも示された。この結果は、
再構築ヒストンが構築済みヒストンすなわち天然ヒスト
ンと似た生理活性機能を持つことを示唆するものであ
る。
【００３６】
【００３７】実施例３：オリゴヌクレオチドの安定性 再構築ヒストンをキャリアーシステムとして利用した際
の、オリゴヌクレオチドの安定性への効果に関する検討
は、以下の方法によりヒト血清中で評価した。
の、オリゴヌクレオチドの安定性への効果に関する検討
は、以下の方法によりヒト血清中で評価した。
【００３８】まず、32Ｐで標識したＲ３２を実施例１に
記載した方法で共存させてヒストンキャリヤ-を再構築
した。次に、再構築ヒストン溶液の適当量を最終的に９
０％のヒト血清濃度になるように添加し、調製した。こ
の溶液は３７℃でインキュベート後、適時適量のサンプ
リングを行った。
記載した方法で共存させてヒストンキャリヤ-を再構築
した。次に、再構築ヒストン溶液の適当量を最終的に９
０％のヒト血清濃度になるように添加し、調製した。こ
の溶液は３７℃でインキュベート後、適時適量のサンプ
リングを行った。
【００３９】また、再構築ヒストンからのオリゴヌクレ
オチドＲ３２の遊離は次の操作により行った。ヒストン
サブユニットは透過せず、Ｒ３２のみを透過する分画能
を有する限外ろ過用チューブ（日本ミリポアリミテッド
製ウルトラフリーＣ３ーＧＣＵＦＣ３ＴＧＣ００）に、
あらかじめ32Ｐ−ＡＴＰで標識したＲ３２を薬物モデル
としたオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体溶液
の適量を添加した。そして、その溶液に対して終濃度が
７．２Ｍ以上になるように塩酸グアニジン（和光純薬工
業株式会社 075-2431）溶液を添加した後、３，０００
ｒｐｍで１５分間遠心した。この時、塩酸グアニジンの
添加によりＲ３２が遊離し、結果としてヒストンから遊
離したＲ３２のみがろ過される。ろ過したサンプル液は
分析するまでー８０℃にて保存した。分析時には、それ
らサンプルを室温にて溶解後、それを２０％のポリアク
リルアミドにアプライして電気泳動した。そして、フジ
写真フィルム社製のバイオイメージングアナライザＢＡ
Ｓ２０００により残存Ｒ３２を定量し、これから未分解
のＲ３２の量を算出した。これらの検討結果を図５に示
す。
オチドＲ３２の遊離は次の操作により行った。ヒストン
サブユニットは透過せず、Ｒ３２のみを透過する分画能
を有する限外ろ過用チューブ（日本ミリポアリミテッド
製ウルトラフリーＣ３ーＧＣＵＦＣ３ＴＧＣ００）に、
あらかじめ32Ｐ−ＡＴＰで標識したＲ３２を薬物モデル
としたオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体溶液
の適量を添加した。そして、その溶液に対して終濃度が
７．２Ｍ以上になるように塩酸グアニジン（和光純薬工
業株式会社 075-2431）溶液を添加した後、３，０００
ｒｐｍで１５分間遠心した。この時、塩酸グアニジンの
添加によりＲ３２が遊離し、結果としてヒストンから遊
離したＲ３２のみがろ過される。ろ過したサンプル液は
分析するまでー８０℃にて保存した。分析時には、それ
らサンプルを室温にて溶解後、それを２０％のポリアク
リルアミドにアプライして電気泳動した。そして、フジ
写真フィルム社製のバイオイメージングアナライザＢＡ
Ｓ２０００により残存Ｒ３２を定量し、これから未分解
のＲ３２の量を算出した。これらの検討結果を図５に示
す。
【００４０】最終濃度９０％のヒト血清中において、Ｒ
３２は非常に短い時間で分解した。また、ヒストンに共
存させていないＲ３２は、やはり、非常に短い時間で分
解した。構築済みヒストンもしくは再構築ヒストンの溶
液に対して、後からＲ３２の溶液を添加して形成させた
場合、Ｒ３２は、それら表面へ単純にイオン結合してい
た可能性の高いことが予想される。
３２は非常に短い時間で分解した。また、ヒストンに共
存させていないＲ３２は、やはり、非常に短い時間で分
解した。構築済みヒストンもしくは再構築ヒストンの溶
液に対して、後からＲ３２の溶液を添加して形成させた
場合、Ｒ３２は、それら表面へ単純にイオン結合してい
た可能性の高いことが予想される。
【００４１】これに対し、ヒストン再構築時にＲ３２を
共存させたオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体
におけるＲ３２の分解は、高濃度のヒト血清中でも全く
観測されず、その様子は２４時間後まで続いた。これ
は、ヒストンに共存したオリゴヌクレオチドが外部から
の影響（例えばリボヌクレアーゼによる分解等）を受け
にくくなったためと考えられる。
共存させたオリゴヌクレオチド／再構築ヒストン複合体
におけるＲ３２の分解は、高濃度のヒト血清中でも全く
観測されず、その様子は２４時間後まで続いた。これ
は、ヒストンに共存したオリゴヌクレオチドが外部から
の影響（例えばリボヌクレアーゼによる分解等）を受け
にくくなったためと考えられる。
【００４２】この結果から、本発明のタンパク質性ヒス
トンキャリアーシステムは、オリゴヌクレオチドと安定
な複合体を形成できるばかりでなく、生体内におけるオ
リゴヌクレオチドの安定化にも大きく寄与することが明
らかとなった。
トンキャリアーシステムは、オリゴヌクレオチドと安定
な複合体を形成できるばかりでなく、生体内におけるオ
リゴヌクレオチドの安定化にも大きく寄与することが明
らかとなった。
【００４３】
【発明の効果】以上、詳しく説明した通り、本発明によ
り、均一状態でオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形
成し、しかも複合体を形成したオリゴヌクレオチドを外
部条件から保護することが可能となる新規のオリゴヌク
レオチド薬物キャリアーシステムが提供される。
り、均一状態でオリゴヌクレオチドと安定な複合体を形
成し、しかも複合体を形成したオリゴヌクレオチドを外
部条件から保護することが可能となる新規のオリゴヌク
レオチド薬物キャリアーシステムが提供される。
【図１】サブユニットの混合によるヒストン再構築の概
念図である。
念図である。
【図２】モデル薬物として用いたオリゴヌクレオチドの
二次構造である。
二次構造である。
【図３】吸光度測定図である。
【図４】円偏向二色性スペクトルである。
【図５】オリゴヌクレオチドの安定性試験の結果図であ
る。
る。
フロントページの続き (72)発明者 多比良 和誠 茨城県つくば市東一丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 西川 諭 茨城県つくば市東一丁目１番３ 工業技術 院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 和田 晃 茨城県つくば市観音台１−25−11 久光製 薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 後藤 武 茨城県つくば市観音台１−25−11 久光製 薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 佐藤 秀次 茨城県つくば市観音台１−25−11 久光製 薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 山田 亮 茨城県つくば市和台48 日立化成工業株式 会社筑波開発研究所内 (72)発明者 嶋山 隆 茨城県つくば市和台48 日立化成工業株式 会社筑波開発研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒストンサブユニットをＨ２ａ→Ｈ２ｂ
→Ｈ３→Ｈ４→Ｈ１の順で混合して親ヒストンを再構築
することを特徴とする機能性オリゴヌクレオチド用ヒス
トンキャリヤーの製造方法。 - 【請求項２】 ヒストンサブユニットの混合によるキャ
リアーの再構築過程において、機能性オリゴヌクレオチ
ドを共存させることを特徴とする請求項１記載の製造方
法。 - 【請求項３】 機能性オリゴヌクレオチドをＨ２ａとＨ
２ｂの混合液に添加する請求項２記載の製造方法。 - 【請求項４】 請求項２または３の方法によって得られ
るヒストンキャリヤーと機能性オリゴヌクレオチドとの
複合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11477095A JP3581877B2 (ja) | 1995-05-12 | 1995-05-12 | 機能性分子輸送体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11477095A JP3581877B2 (ja) | 1995-05-12 | 1995-05-12 | 機能性分子輸送体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08301791A true JPH08301791A (ja) | 1996-11-19 |
| JP3581877B2 JP3581877B2 (ja) | 2004-10-27 |
Family
ID=14646260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11477095A Expired - Lifetime JP3581877B2 (ja) | 1995-05-12 | 1995-05-12 | 機能性分子輸送体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3581877B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000290291A (ja) * | 1999-03-31 | 2000-10-17 | Nippon Sanso Corp | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
| JP2007536253A (ja) * | 2004-05-04 | 2007-12-13 | ナステック・ファーマシューティカル・カンパニー・インコーポレーテッド | 細胞内への核酸の送達を増強し、細胞中の標的遺伝子の発現を修飾するための組成物及び方法 |
| JP2008514647A (ja) * | 2004-09-27 | 2008-05-08 | ナステック ファーマスーティカル カンパニー インク． | 二本鎖リボ核酸によって炎症性疾患を治療する方法 |
| JP2009514877A (ja) * | 2005-11-04 | 2009-04-09 | エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド | ｓｉＲＮＡの送達媒体としてのペプチド−ダイザ基質ＲＮＡ抱合体 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0432766A (ja) * | 1990-05-29 | 1992-02-04 | Morinaga & Co Ltd | 血清診断法 |
| JPH06507158A (ja) * | 1991-05-08 | 1994-08-11 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 糖蛋白質および核酸結合物質を含む新しい結合体 |
-
1995
- 1995-05-12 JP JP11477095A patent/JP3581877B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0432766A (ja) * | 1990-05-29 | 1992-02-04 | Morinaga & Co Ltd | 血清診断法 |
| JPH06507158A (ja) * | 1991-05-08 | 1994-08-11 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 糖蛋白質および核酸結合物質を含む新しい結合体 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000290291A (ja) * | 1999-03-31 | 2000-10-17 | Nippon Sanso Corp | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
| JP2007536253A (ja) * | 2004-05-04 | 2007-12-13 | ナステック・ファーマシューティカル・カンパニー・インコーポレーテッド | 細胞内への核酸の送達を増強し、細胞中の標的遺伝子の発現を修飾するための組成物及び方法 |
| JP2008514647A (ja) * | 2004-09-27 | 2008-05-08 | ナステック ファーマスーティカル カンパニー インク． | 二本鎖リボ核酸によって炎症性疾患を治療する方法 |
| JP2009514877A (ja) * | 2005-11-04 | 2009-04-09 | エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド | ｓｉＲＮＡの送達媒体としてのペプチド−ダイザ基質ＲＮＡ抱合体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3581877B2 (ja) | 2004-10-27 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040629 |
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|
| S533 | Written request for registration of change of name |
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|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |