JPH0432766A

JPH0432766A - 血清診断法

Info

Publication number: JPH0432766A
Application number: JP13914690A
Authority: JP
Inventors: Masanori Kamei; 優徳亀井; Shuichi Hashizume; 秀一橋爪; Masatoshi Kato; 正俊加藤
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1990-05-29
Publication date: 1992-02-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、ヒストンの旧、　Ｈ２Ａ、　Ｈ２Ｂ、　Ｈ３
，Ｈ４の少なくとも一つを用いて行うことを特徴とする
がんの血清診断法に関するものである。

［従来の技柘］従来、がんの血清診断に用いられてきた腫瘍マーカーと
しては、ＣＥＡ　（カルジノエンブリオニック・アンチ
ジエン）、ＡＦ、Ｐ（α−フェトプロティン）等の胎児
性タンパク賀、血液型物質、ホルモン、アイソエンザイ
ム等のヒト由来物質が挙げられる。特に肺がんにおいて
は、ＣＥＡ。

ＳＣＣ抗原（血中扁平上皮がん関連抗原）、ＮＳＥ　（
神経特異的エノラーゼ）などが用いられている。これら
の腫瘍マーカーによる血清診断法は、がんのスクリーニ
ングのみならず、がんの治療効果の判定や手術後のモニ
タリングの目的にも応用され、その重要性を増してきて
いる。また、この方法は簡便であること、−度に多数の
検体を測定できること等の利点をもっている。

［発明が解決しようとする課題］腫瘍マーカーを使ったがんの血清診断は現在までにも数
多くの種類のがんについてすでに試みられている。しか
しながら、陽性率及び偽陽性率とも満足すべきものが少
ないのが現状である。殊に、肺がんについては、ＣＥＡ
、ＳＣＣ，ＮＳＥなどの高い陽性率を与えるマーカーで
あっても、その陽性率は３０〜５０％にとどまり、また
偽陽性率は、１０〜２０％と比較的高い値を示すといっ
た不利な点があった。しかも、これらの方法は血液中の
抗原量を測定するため、血液中に存在する抗原量がまだ
少ない早期がんの診断においては、陽性率が低かった。

特に肺扁平上皮がんの診断にはＳＣＣが有効であると見
なされているが、陽性率が高くなるのはがんの進行が進
んでからであり、早期診断における陽性率は低い。更に
、これらの検査法で標準物質として用いられる腫瘍マー
カーはヒト由来物質であるために大量に入手することが
難しかった。

本発明は、このような従来技術における課題を解決しよ
うとして行われたものである。

［課題を解決するための手段コ本発明者らは、肺がん組織からがん特異的抗原としてヒ
ストンを見い出し、このヒストンに対重る血中抗体量を
測定することにより、がんの血清診断を有効に行い得る
ことを見い出し、この知見に基づいて本発明を完成した
。

この血清診断法の特徴は、従来のように血液中のマーカ
ー量を測定するのではなく、新たに見い出された腫瘍マ
ーカーであるヒストンを用いて、ヒストンに対する血中
の抗体量を測定することにある。即ち、血液内に検出限
度以下の微量のマーカーしか存在しない場合であっても
、そのマーカーに対する抗体量は、生体中で増幅されて
おり、その抗体量を測定することによってがんの早期診
断が可能となる。

以下に本発明について詳細に説明する。

（１）マーカ物質の検索肺がんに対して特異的に反応するヒト型モノクローナル
抗体ＨＢ４Ｃ５（インビトロ　セルラーアンド　デイベ
ロツブメンタル　バイオロジー（Ｉｎν１ｔｒｏ　Ｃｅ
１ｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ）互、５９３．（１９８５）　　（特開
平２−４９１６２号公報）を用いて、肺がん組織中のが
ん特異抗原を検索した。その方法を簡単に以下に記する
。

まず、肺がん組織を界面活性剤で可溶化し、５Ｏ８−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行った。

次いで、ゲル上の物質をニトロセルロース腰上に転写し
ＨＢ４Ｃ５抗体と特異的に反応するタンパク質の検出を
行った。そしてＨＢ４Ｃ５抗体と特異的に反応するタン
パク質のアミノ酸配列を決定した結果、ヒストンＨ２Ｂ
であることが明らかとなった。ところでヒストンにはＨ
ｌからＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ　Ｈ３Ｈ４までの５種類が存在す
ることが知られている。そこで、それぞれのヒストンの
ＨＢ４Ｃ５抗体との反応性を調べたところ、反応性に強
弱の差はあるものの、５種類全てのヒストンがＨＢ４Ｃ
５抗体と反応し、血清診断にも利用できることが明らか
となった。特に１１３に関しては、）１２Ｂと比べても
高い陽性率を示しており、血清診断に特に有効であった
。また、ヒストンは動物とヒトとの間でほとんど差異が
なく、本発明の血清診断法にはヒトのヒストン以外の安
価なウシ等の動物のヒストンも利用できる。

（２）血清診断法ヒストンを０１％牛脂児面清く以下、ｒＦｃｓＪと略す
、）添加炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で５０ｉ
／ｄの濃度に調整する。これを９６ウエルイムノプレー
トに１００成ずつ分注し、３７℃で１時間保温し、ヒス
トンをプレートにコートする。ヒストンに０．１％ＦＣ
８を添加するのは、Ｆｅ２の存在によりヒストンをコー
トしていないコントロールの測定値を低く抑えることが
可能であるためである。

リン酸緩衝化生理食塩水（以下、Ｉ’ＰＢＳＪと略す。

）でプレートを２回洗浄した後、プラスチック表面への
抗体の非特異的な吸着を抑えるために、１０％ＦＣ８／
ＰＢＳでブロッキングを１時間、３７℃で行う。その後
、プレートを洗浄することなく、０．１％牛血清アルブ
ミン（以下、ｒＢｓＡｊと略す。）と０．０５％トウイ
ーン２０を添加したＰＢＳで２００倍に稀釈した血清サ
ンプルを５０ｐｉずつ各ウェルに添加し、血清中の抗体
とヒストンとの反応を３７℃で１時間行う。ヒストンと
反応する抗体が血清中に存在する場合にはその抗体がウ
ェルにコートされたヒストンと結合し、固定される。

０．０５％トウィーン２０を含むＰＢＳ　（以下、ｒＰ
Ｂｓ・トウィーン２０」と略す。）でプレートを３回洗
浄した後、０１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ・トウィーン２０で
１〜２０埒／　ｄに稀釈したペルオキシダーゼ標識の抗
ヒトＩｑＧ抗体を各ウェルに　１００ｔＪｆ！ずつ添加
し、３７℃で１時間反応させる。ＰＢＳ・トウィーン２
０で３回洗浄した後、ＡＢＴＳ（２，２−アジノービス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ニア
ンモニウム塩）等を含む通常のペルオキシダーゼ用基質
溶液を１００成ずつ添加し、室温で１５分間発色反応を
行う。固定された抗体量が多い場合、すなわち血清中に
ヒストンと反応する抗体が多量に含まれている場合には
、強く発色する。１．５％シュウ酸溶液１００屏を添加
し反応を停止した後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定
する。なお、それぞれの血清サンプルの吸光度は、ヒス
トンをコートしたウェルの吸光度から、ヒストンをコー
トしていないウェル（コントロールウェル）の吸光度を
差し引くことにより求める。

このような方法を用いて、柿がん患者あるいは健常人の
血清サンプルの反応性を調べたところ、肺がん患者、特
に扁平上皮がん患者の血清と高率に反応し、健常人血清
とはほとんど反応しないことが明らかとなった。偽陽性
率は１９％であつた。

尚、本発明の血清診断法を実施する際には、例えば、以
下に示すキットを用いて行なうことが好ましい。

本キットは、４８回測定用で下記の構成品からなる。

■、キット構成品構　　成　　品１、マイクロプレート　　　　　　１枚２、ヒストン（
２■／ｄ）　　　　　２００戒入り１ビン３、炭酸緩衝
液（ｐＨ９，５）　　　　　１５〆入り１ビン５、トウ
ビーン２０溶液６、牛胎児血清７、標準血清８、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ９、ウシ血清アルブミンアンモニウム塩１１、クエン酸・リン酸緩衝液２ｍｌ入り１ビン５〆入り１ビン５成入り４ビン２０成入り１ビン６０ＩＩｔ９入り１ビン２０ｄ八り１ビン付　　属　　品１３、マイクロプレート用ふた　　　１枚以上の各構成
品は、当業者には公知の方法により入手ないし製造する
ことができる。

以下に本発明を実施例に則して詳記する。

ｍユウシのヒストンＨ２Ｂを抗原として、上述した方法によ
り、種々のがん患者、良性疾患及び健常人の血清診断を
行った。

肺がん、膵がん及び直腸がんが高い陽性率を示したく第
１表）。

特に肺がんについて注目し、組織型別に陽性率を調べた
（第２表）。

肺扁平上皮がんでは、４４％と高く、肺腺がんでは２６
％、肺小細胞がんでは３３％であった。良性疾患での偽
陽性は、１９％で従来の肺がん腫瘍マーカーとほとんど
変わらない値であった。肺扁平上皮がんの診断には、従
来のＳＣＣが有効とされているが、病態がかなり進まな
いと陽性にはならないという欠点があった。本ヒストン
は扁平上皮がんの診断で、陽性率はＳＣＣと比較しても
劣らず、しかもＳＣＣで陰性である肺扁平１皮がんにつ
いでもヒストンを用いることにより検出可能であつた。

更に血清中の抗体を測定するため早期診断が可能と思わ
れる。

支ｉ■１ウシのヒストンＨ３を抗原として肺がん思考血清の陽性
率を調べた（第３表）。

ヒストン８２Ｂと比べるとさらに陽性率が向上し扁平上
皮がんでは６１％、腺がんでは３９％と高い陽性率を示
し、その他作例数は少ないけれども、大細胞がん、ｔｕ
ｂｅｒｃｕ　Ｉｏｍａ及びｃｅｎｔｒａｌ　ｃａｒｃｉ
ｎｏｉｄｔｕｍｏｒについては１００％の陽性率であっ
た。

支胤■ユ５種類のウシのヒストン（旧、　Ｈ２Ａ、　１１２８．
　Ｈ３，８４）をそれぞれ単独で抗原として用いて上述
の方法によりがん患者及び健常人の血清との反応性を調
べた（第４表）。８２Ｂ、　Ｈ３に比べると反応性は少
し低いが、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ４でも同様にがん患者の血
清は陽性を示した。

第　　１　　表ヒストンＨ２Ｂを用いた場合のがんの血清診断第　　２
　　表第表ヒストン８２Ｂを用いた場合の肺がん組織型別陽性率

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒストンを用いることを特徴とする血清診断法。
（２）該ヒストンがＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３又はＨ
４の少なくともひとつである請求項１記載の血清診断法
。
（３）該ヒストンと結合する血液中の抗体量を測定する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の血清診断法。
（４）酵素抗体法を使用することを特徴とする請求項１
ないし３のいずれか一項に記載の血清診断法。