DE69415343T2 - 2'-amido-und 2'-peptido-modifizierte oligonukleotide - Google Patents
2'-amido-und 2'-peptido-modifizierte oligonukleotideInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft 2'-Modifikationen von Oligonukleotiden.
- Usman et al. beschreiben in der PCT-Anmeldung "Nucleozyme", Nr. WO93/15187 (PCT/US93/0833) eine Modifikation der 2'-Hydroxylgruppe von RNA, um modifizierte Nukleotide zu produzieren. Diese Nukleotide werden als Nukleinsäureanaloge bezeichnet und können einen "gut koordinierenden Liganden" mit divalenten Metallionen enthalten, beispielsweise ein Halogen oder eine Aminogruppe. Aliphatische Analoge werden ebenfalls vorgeschlagen.
- In der PCT-Anmeldung Nr. WO 92/07065 (PCT/EP91/0811) beschreibt Eckstein 2'-Hydroxylmodifikationen von RNA mit den nachstehenden Substitutionen anstelle der Hydroxylgruppe, nämlich: Halogen, Sulphydryl, Azido, Amino, monosubstituiertes Amino und disubstituiertes Amino.
- Die WO 91/06556 beschreibt Oligomere mit 2'-Modifikationen einschließlich der Substitution von 2'-Hydroxyl durch Aminoacylgruppen.
- Die WO 88/00201 beschreibt Oligomere mit 2'-Modifikationen, die ein substituiertes Amino enthalten.
- In J. Carb. Nucs. Nuct. 7(5), 297-313, 1980 beschrei ben Chladek et al. Oligomere mit 2'-Modifikationen, die Glyzin- und Glutamin-substituiertes Amino enthalten
- Die Erfindung betrifft den Ersatz der 2'-Hydroylgruppe oder mehrerer Ribonukleotidbausteine innerhalb eines Oligonnukleotids durch einen 2'-Amino- oder 2'-Peptidobaustein. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Oligonukleotids vorgesehen, das die allgemeine Strukturformel aufweist, wie sie durch die unten stehenden Formel 1 wiedergegeben ist:
- wobei B eine Nukleotidbase oder Wasserstoff; R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt ist, zu der Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit zwischen 2 und 10 Kohlenstoffatomen einschließlich, ein Amin, eine Aminosäure und ein Peptid mit 2 bis 5 Aminosäuren einschließlich gehören, ist und die Zickzacklinien unabhängig voneinander Was serstoff oder eine Bindungsstelle bei der Herstellung eines Medikamentes zum Spalten eines Zielgens darstellen.
- Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Oligonukleotid mit der Formel (1) geschaffen, wobei B, R&sub1; und R&sub2; sowie die Zickzacklinien dieselbe Bedeutung haben, wie dies oben angegeben ist, wobei, wenn B Uracil ist, R&sub1; und R&sub2; nicht beide gleichzeitig Wasserstoff sind, oder, wenn B ein Adenin und R&sub1; oder R&sub2; NH&sub2; ist, das andere nicht CH&sub2;-CH&sub2;-COOH ist, oder, wenn B Uracil oder Adenin und entweder R&sub1; oder R&sub2; NH&sub2; ist, das andere nicht H ist.
- Die Base (B) ist eine der Standardbasen oder eine modifizierte Nukleotidbase, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt ist, oder es kann sich um eine Wasserstoffgruppe handeln. Zusätzlich kann R&sub1; oder R&sub2; Wasserstoff oder eine Alkylgruppe zwischen 2 und 10 Kohlenstoffatomen, ein Amin (primäres, sekundäres oder tertiäres, beispielsweise R&sub3;NR&sub4; sein, wobei R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein Alkyl, Alken oder Alkin mit zwischen 2 und 10 Kohlenstoffatomen oder ein Rest einer Aminosäure ist, beispielsweise ein Amid), eine Aminosäure (D- oder L-Form) oder ein Peptid mit zwischen 2 und 5 Aminosäuren sein. Die Zickzacklinien repräsentieren Wasserstoff oder eine Bindung an eine andere Base oder einen anderen chemischen Baustein, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind. Vorzugsweise ist eines von R&sub1; und R&sub2; ein Wasserstoff und das andere eine Aminosäure oder ein Peptid.
- Die Anmelderin hat erkannt, dass eine RNA zufolge der Anwesenheit der 2'-Hydroxylgruppe in der RNA eine sehr viel komplexere Strukturform annehmen kann als DNA. Diese Gruppe ist in der Lage, eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung mit anderen Wasserstoffdonatoren, Akzeptoren und Metallionen innerhalb des RNA-Moleküls einzugehen. Die Anmelderin schafft nun Moleküle, die eine modifizierte Aminogruppe an der 2'-Stelle haben, so dass deutlich komplexere Strukturen durch das modifizierte Oligonukleotid gebildet werden können. Solche Modifikationen mit einer 2'-Amido- oder Peptidogruppe führen zu einer Erweiterung und Anreicherung des Seitenkettenwasserstoffbindungsnetzwerkes. Die Amid- und Peptidbausteine sind für die komplexe Strukturbildung des Oligonukleotids verantwortlich, können mit anderen Basen starke Komplexe bilden und mit Paarungsinteraktionen der Standardbasen interferieren. Solche Interferenzen gestatten die Bildung eines komplexen Konglomerats aus Nukleinsäure und Protein.
- Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind deutlich stabiler als die bisherigen Oligonukleotide und können potenziell biologisch aktive Biokunjugate bilden, die zuvor mit Oligonukleotiden nicht möglich waren. Sie können außerdem zur in vitro-Selektion eines typischen Aptamers verwendet werden, d.h. randomerzeugte Oligonukleotide, die zu einem wirksamen Liganden für ein Zielprotein, eine Nukleinsäure oder ein Polysaccharid gefaltet werden können.
- Somit zielt die Erfindung gemäß einem ersten Aspekt auf ein Oligonukleotid, das die modifizierte Base enthält, wie sie durch Formel I oben wiedergegeben ist.
- Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung erschließen sich aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und den Ansprüchen.
- Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind oben allgemein erläutert und die Struktur ist in Formel I wiedergegeben, wobei diese Modifikationen an der 2'-Hydroxylgruppe an einer oder mehreren Stellen eines RNA- oder DNA-Moleküls vorgenommen werden können. Vorzugsweise ist das Oligonukleotid einsträngig und enthält zwischen 10 und 50 Basen, von denen eine oder mehrere, vorzugsweise zwischen 1 und 10, wie gezeigt, modifiziert sein können. Zu diesen Oligonukleotiden können solche gehören, die eine enzymatische Aktivität zeigen, beispielsweise Ribozyme, die an der 2'- Stelle des Zuckerbausteins modifiziert sind, wie dies in der Formel I gezeigt ist, um die Stabilität für die enzymatische Aktivität herbeizuführen, ohne die Aktivität signifikant zu verändern.
- Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können einfach synthetisiert werden, indem Karbamatschutzgruppen, beispielsweise F-moc, in den Peptidbausteinen verwendet werden und indem diese unter milden basischen Bedingungen freigelegt werden. Solche Nukleotide können sodann unter Verwendung von standardmäßigen Festphasensynthesen unter Verwendung von Nukleosidphosphoramidit oder H-Phosphonat-Zwischenprodukten inkorporiert werden.
- Die obigen Nukleotide sind insbesondere als Ribozyme brauchbar. Ribozyme sind RNA-Moleküle mit einer enzymatischen Aktivität, die in der Lage ist, in einer für die Nukleotidbasensequenz spezifischen Weise andere getrennte RNA-Moleküle zu spalten. Solche enzymatischen RNA-Moleküle können auf praktisch jedes RNA-Transkript zielgerichtet werden und es wird ein effizientes Spalten in vitro erreicht. Siehe Kim et al. in 84 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8788, 1987; Haseloff und Gerlach in 334 Nature 585, 1988; Cech in 260 J. Med. Soc. 3030, 1988; und Jefferies et al. in Nucleic Acids Research 1371, 1989.
- Ribozyme wirken, indem sie zunächst an eine Ziel-RNA binden. Solch ein Binden geschieht über den Bindungsabschnitt eines Ribozyms für die jeweilige Ziel-RNA, der sich in unmittelbarer Nähe zu einem enzymatisch wirksamen Teil der RNA befindet, der das Spalten der Ziel-RNA bewirkt. Somit erkennt das Ribozym zunächst die Ziel-RNA und bindet sodann über eine komplementäre Basenpaarung an diese, wobei, sobald die Bindung an der richtigen Stelle stattgefunden hat, das Ribozym enzymatisch wirkt, um die Ziel-RNA zu spalten. Das strategische Spalten von einer derartigen Ziel-RNA zerstört ihre Fähigkeit, die Synthese eines codierten Proteins zu steuern. Nachdem das Ribozym angebunden und sein RNA-Ziel gespalten hat, wird trennt es sich von der RNA, um nach einem anderen Ziel zu suchen, womit es wiederholt binden und neue Ziele spalten kann.
- Die enzymatische Natur eines Ribozyms ist, verglichen mit anderen Techniken, vorteilhaft, beispielsweise der Antisinn-Technik (bei der ein Nukleinsäuremolekül sich einfach an ein Nukleinsäureziel bindet, um seine Translation zu blockieren), da die effektive Konzentration an Ribozymen, die notwendig ist, um eine therapeutische Behandlung zu bewirken, niedriger ist als die von Antisinn-Oligonukleotiden. Dieser Vorteil spiegelt die Fähigkeit des Ribozyms, enzymatisch zu wirken, wider. Auf diese Weise ist ein einziges Ribozymmolekül in der Lage, viele Ziel-RNA-Moleküle zu spalten. Außerdem ist das Ribozym ein sehr spezifischer Inhibitor, wobei die Inhibierungsspezifität nicht nur von dem Basenpaarungsmechanismus der Bindung, sondern auch von dem Mechanismus abhängig ist, mit dem das Molekül das Exprimieren der RNA, an die sie bindet, blockiert, d.h. die Inhibierung durch Spalten des RNA-Ziels verursacht und so ist die Spezifität definiert als das Verhältnis der Spaltrate der Ziel-RNA, bezogen auf die Rate von gespaltener RNA, die nicht ursprüngliches Ziel ist. Dieser Spaltmechanismus hängt von Faktoren ab, die zu jenen hinzukommen, die bei der Basenpaarung beteiligt sind. Somit wird angenommen, dass die Spezifität der Wirkung eines Ribozyms größer ist als die eines Antisinn-Oligonukleotids, das an derselben RNA-Stelle bindet.
- Unter "enzymatischem RNA-Molekül" wird ein RNA-Molekül verstanden, das an einem Substratbindenbereich komplementär zu einem spezifizierten Zielgehen ist und das ferner eine enzymatische Aktivität zeigt, die dazu führt, in diesem Target die RNA spezifisch zu spalten, d.h. das enzymatische RNA-Molekül ist in der Lage, intermolekular RNA zu spalten und hierdurch das Ziel-RNA-Molekül zu inaktivieren. Diese Komplementäreigenschaft bewirkt, dass eine ausreichende Hybridisierung des enzymatischen RNA-Moleküls mit der Ziel- RNA möglich ist, damit das Spalten stattfinden kann. Eine hundertprozentige Komplementarität wird bevorzugt, jedoch ist eine Komplementarität von zumindest 50-75% erfindungsgemäß auch verwendbar. Picornavirus äquivalente RNA soll auch solche RNA mit umfassen, zu der natürlich auftretende RNA-Moleküle gehören, die mit viral verursachten Krankheiten bei verschiedenen Tieren einschließlich dem Menschen oder anderen Primaten assoziiert sind. Diese viralen RNA's haben untereinander ähnliche Strukturen und äquivalente Gene.
- Bei den bevorzugten Ausführungsbeispielen wird das enzymatische RNA-Molekül zu einem Hammerkopf geformt, kann aber auch als Haarnadel, in der Gestalt eines Hepatitisdeltavirus, eines Gruppe I Introns oder RNaseP-RNA (assoziiert mit einer RNA-Führungssequenz) strukturiert sein. Beispiele für solche Hammerkopfiormen sind von Rossi et al. in 8 Aids Researchand Human Retroviruses 183, 1992 beschrieben; Haarnadelformen in der EP-A-0 360 257, von Hamel und Tritz in 28 Biochemistry 4949, 1989 sowie von Hampel et al. in 18 Nucleic Acids Research 299, 1990; ein Beispiel der Hepatitisdeltavirusform wird von Perrotta und Been in 31 Biochemistry 16, 1992 erläutert; der RNaseP-Form von Guerrier- Takado et al. in 35 Cell 849, 1983; und die des Gruppe I Introns von Cech et al., sowie dem US-Patent 4 987 081. Diese speziellen Formen sind für die Erfindung nicht beschränkend und der Fachmann sieht, dass alles, was für die enzymatische Wirkung des erfindungsgemäßen RNA-Moleküls wichtig ist, darin besteht, dass es eine spezifische Substratbindungsstelle aufweist, die zu einer oder mehreren Stellen der Zielgen-RNA komplementär ist, und dass es innerhalb oder um die Substratbindestelle herum Nukleotidsequenzen enthält, die dem Molekül eine RNA-Spaltungswirkung verleihen.
- Die für diese Erfindung brauchbaren Ribozyme können durch chemische Synthese produziert werden. Die chemische Synthese von RNA ist ähnlich der der DNA-Synthese. Die zusätzliche 2'-OH-Gruppe der RNA erfordert jedoch eine andere Strategie bei den Schutzgruppen, um die selektive 3'-5'- Internukleotidbindungsformation zu behandeln und die RNA- Empfindlichkeit gegenüber der Degradation in Anwesenheit von Basen. Das jüngst entwickelte Verfahren zur RNA-Synthese unter Verwendung der t-Butyldimethylsilylgruppe zum Schutz des 2'-Hydroxyls ist die zuverlässigste Methode zur Synthese von Ribozymen. Das Verfahren führt reproduzierbar zu RNA mit der richtigeri 3'-5' Internukleotidbindung, bei einer durchschnittlichen Bindungsausbeute von über 99% und es erfordert nur zwei Schritte zum Freilegen des Polymers.
- Ein auf einer H-Phosphonatchemie basierendes Verfahren führt zu einer verhältnismäßig niedrigeren Bindungseffizienz als ein Verfahren, das auf einer Phosphoramiditchemie basiert. Dies ist auch bei der Synthese von DNA ein Problem. Ein vielversprechender Lösungsansatz zum Verbessern einer automatischen Oligonukleotidsynthese wurde jüngst für H-Phosphonate beschrieben. Eine Kombination aus einer richtigen Bindungszeit und einem zusätzlichen Abdecken von "Fehler"-Sequenzen führt zu hohen Ausbeuten bei der Synthese von Oligodeoxynukleotiden in Skalen im Bereich von 14 umol bei höchstens 2 Äquivalenten eines Monomers in dem Bindungsschritt. Ein anderer alternativer Lösungsansatz ist die Verwendung von löslichen polymeren Trägern (beispielsweise Polyethylenglykolen) anstelle von konventionellen festen Trägern. Dieses Verfahren kann kurze Oligonukleotide in hundert Milligramm-Mengen pro Batch erzeugen, wobei etwa drei Äquivalente eines Monomers in dem Bindungsschritt verwendet werden.
- Verschiedene Modifikationen an der Ribozymstruktur können durchgeführt werden, um die Brauchbarkeit der Ribozyme zu steigern. Solche Modifikationen verbessern die La gerfähigkeit, die Halbwertszeit in vitro sowie die Stabilität, vereinfachen das Zuführen solcher Ribozyme zu der Zielstelle, beispielsweise um die Durchdringungsfähigkeit der Zellmembranen zu verbessern, und steigern die Fähigkeit, Zielzellen zu erkennen und an diese zu binden.
- Die exogene Zuführung der Ribozyme profitiert von der chemischen Modifikation ihres Rückgrats, d.h., indem die gesamte negative Ladung des Ribozymmoleküls vermindert ist, wird die Diffusion durch die Zellmembran erleichtert. Zu den vorliegenden Strategien zur Verminderung der Oligonukleotidladung gehören: die Modifikation der Internukleotidbindungen durch Ethylphosphonate, die Verwendung von Phosphoramiditen, die Bindung von Ogligonukleotiden an positiv geladene Moleküle und die Erzeugung von komplexen Paketen, die sich aus Oligonukleotiden, Lipiden und spezifischen Rezeptoren oder Effektoren für die Zielzellen zusammensetzen. Zu den Beispielen für solche Modifikationen gehören Schwefel enthaltende Ribozyme, Phosphorothioate und Phosphorodithioate als Internukleotidbrücken in der RNA. Die Synthese von solchen schwefelmodifizierten Ribozymen wird durch die Verwendung eines Schwefeltransferwirkstoffes 3H-1,2-Benzenedithiol-3-one 1,1-Dioxid erreicht. Die Ribozyme können auch ribosemodifizierte Ribonukleotide wie hier beschrieben enthalten. Die Ribozyme können außerdem entweder elektrisch oder covalent an polymere Kationen gekoppelt sein, um die Ladung zu vermindern. Das Polymer kann an das Ribozym durch einfaches Konvertieren des 3'-Endes an ein Ribonukleosiddialdehyd gebunden sein, das durch Periodatspaltung des terminalen 2',3'-Cisdiolsystems erhalten wird. Abhängig von den spezifischen Anforderungen an die Zuführsysteme können andere mögliche Modifikationen unterschiedliche Bindungsarme aufweisen, die Carboxyl-, Amino- oder Thio-Funktionalitäten enthalten. Noch andere Beispiele umfassen die Verwendung von Methylphosphonaten und 2'-O-Me- thylribose sowie die 5' oder 3' Abdeckung oder Blockierung mit m&sub7;GpppG oder m&sub3;2,2,7GpppG.
- Beispielsweise wird ein mit einer Kinase versehenes Ribozym mit einer Guanosintriphosphat oder Guanyltransferase in Berührung gebracht, um das Ribozym mit einer m³G-Kappe zu versehen. Nach dieser Synthese kann das Ribozym mittels Gel unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt werden. Um sicherzustellen, dass das Ribozym die gewünschte Aktivität hat, kann es mit oder ohne die 5' Kappe unter Verwendung von Standardverfahren getestet werden, um sowohl die enzymatische Aktivität als auch die Stabilität zu prüfen.
- Die synthetischen Ribozyme einschließlich solcher, die unterschiedliche Modifikatoren enthalten, können durch Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) gereinigt werden. Es können auch andere Flüssigkeitschromatografietechniken, die Umkehrphasensäulen und Anionentauscher auf Silica und polymere Träger verwenden eingesetzt werden.
- Es folgt nun ein Beispiel für die Synthese eines Ribozyms. Hierzu wird eine Festphasenphosphoramiditchemie verwendet. Die eingesetzten Monomere sind 2'-Tert-Butyl- Dimethylsilyl-Cyanoethylphosphoramidit von Uridin, N- Benzoyl-Cytosin, N-Phenoxiacetyladenosin und Guanosin (Glen Research, Sterling, VA). Die Festphasensynthese wird entweder auf einem ABI 394 oder einem 380B DNA/RNA-Synthetisierer ausgeführt, wobei das Standardprotokoll, das mit jeder Maschine ausgeliefert wird, verwendet wird. Die einzige Ausnahme besteht darin, dass der Bindungsschritt von 10 auf 12 Minuten ausgedehnt wird. Die Phosphoramidit-Konzentration beträgt 0,1 M. Die Synthese wird auf einer 1 umol-Skala unter Verwendung einer 1 umol RNA-Reaktionssäule (Glen Research) ausgeführt. Der durchschnittliche Bindungswirkungsgrad liegt zwischen 97% und 98% für das 394-Modell und zwischen 97% und 99% für das 380B-Modell, wie dies mittels kalorimetrischer Messungen der freigesetzten Tritylcationen bestimmt wurde.
- Die blockierten Ribozyme werden von dem festen Substrat (beispielsweise CPG) abgetrennt und die Basen und Diphosphoresterbausteine in einer sterilen Viole mittels trockenem ethanolischem Ammoniak (2 mL) 16 Stunden lang bei 55ºC freigelegt. Die Reaktionsmischung wird auf Trockeneis gekühlt. Später wird die kalte Flüssigkeit in eine sterile Viole mit Schraubkappe übertragen und lyophilisiert. Diese Bedingungen sind zum Entfernen der Carbamatschutzgruppen in der 2'-Modifikation, wie sie in Formel I gezeigt ist, geeignet, wobei die Amido- und Peptidoverbindungen intakt bleiben.
- Um die 2'-Tert-Butyl-Dimethylsilylgruppen von dem Ribozym zu entfernen, wird der Rest in 1 M Tetra-n-Butylammoniumfluorid in trockenem THF (TBAF) unter Verwendung des 20-fachen Überschusses des Wirkstoffes pro jede Silylgruppe 16 Stunden bei Umgebungstemperatur (etwa 15-25ºC) suspendiert. Die Reaktion wird durch Zufügen eines gleichen Volumenanteils von sterilem 1M Triethylaminacetat, pH-Wert 6,5 gequenched. Die Probe wird abgekühlt und auf einem Speed Vac® bis zur Hälfte des Anfangsvolumens konzentriert.
- Die Ribozyme werden in zwei Stufen mittels HPLC in einer C4 300 Å 5 mm DeltaPak®-Säule in einem Acetonitril gradienten gereinigt.
- Der erste Schritt oder der "Trityl-On"-Schritt besteht in einer Trennung der 5'-DMT-geschützten Ribozyme von fehlerhaften Sequenzen, bei denen die 5'-DMT-Gruppe fehlt. Die Lösungsmittel, die für diesen Schritt verwendet werden, sind: A (0,1 M Triethylammoniumacetat, pH-Wert 6,8) und B (Acetonitril). Das Eluierungsprofil sieht wie folgt aus: 20% B 10 Minuten lang, gefolgt von einem linearen Gradienten von 20% B bis 50% B 50 Minuten lang, 50% B 10 Minuten lang, ein linearer Gradient von 50% B bis 100% B 10 Minuten lang und ein linearer Gradient von 100% B bis 0% B 10 Minuten lang.
- Der zweite Schritt ist die Reinigung eines vollständig freigelegten Ribozyms durch eine Behandlung mit 2%-iger Trifluoressigsäure in einer C4 300 Å 5 mm DeltaPak®-Säule in einem Acetonitrilgradienten. Die Lösungsmittel, die für diesen zweiten Schritt verwendet werden sind: A (0,1 M Triethylammoniumacetat, pH-Wert 6,8) und B (80% Acetonitril, 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH-Wert 6,8). Das Eluierungsprofil sieht wie folgt aus: 5% B 5 Minuten lang, ein linearer Gradient von 5% B bis 15% B 60 Minuten lang, 15% B 10 Minuten lang und ein linearer Gradient von 15% B bis 0% B für 10 Minuten.
- Die das Ribozym enthaltende Fraktion wird gekühlt und auf einem SpeedVac lyophilisiert. Der feste Rest wird in einer minimalen Menge von Ethanol und Natirumperchlorat in Aceton gelöst. Das Ribozym wird durch Zentrifugieren gesammelt und drei Mal in Aceton gewaschen und lyophilisiert.
- Ausgewählte Ribozyme können prophylaktisch oder erkrankten Patienten verabreicht werden, beispielsweise durch exogenes Zuführen des Ribozyms zu einem infizierten Gewebe mittels einem geeigneten Transportvehikels, beispielsweise einem Liposom, einem gesteuerten Freisetzungsvehikels, durch die Verwendung von Iontophorese, Elektroporation oder ionengepaarten Molekülen oder kovalent gebundenen Additionsprodukten sowie anderen pharmakologisch erprobten Zuführungsverfahren. Zu den Verabreichungswegen gehören die intramuskuläre, die aerosole, die orale (Tabletten- oder Pillenform), die topische, die systemische, die occulare, die intraperitonale und/oder die intrathecale Route. Exprimierungsvektoren zur Immunisierung mit Ribozymen und/- oder Verteilung der Ribozyme sind ebenfalls geeignet.
- Die spezifische Zuführungsroute jedes ausgewählten Ribozyms hängt von der Verwendung des Ribozyms ab. Im Allgemeinen zielt ein spezifisches Zuführungsprogramm für jedes Ribozym auf eine nackte Ribozymaufnahme hinsichtlich der intrazellulären Lokalisation, gefolgt von einer Bestätigung der Wirksamkeit. Alternativ kann die Zuführung zu denselben Zellen in einem Organ oder Gewebe eines Tieres verfolgt werden. Zu den Aufnahmeuntersuchungen gehören Aufnahmeversuche, um die zelluläre Oligonukleotidaufnahme zu evaluieren, unabhängig von dem Transportvehikel oder der Strategie. Solche Untersuchungen bestimmen auch die intrazelluläre Lokalisation des Ribozyms nach der Aufnahme. Die endgültige Festlegung der Anforderungen an die Aufrechterhaltung einer stabilen Konzentration innerhalb des Zellvolumens, das die Zielsequenz enthält (Zellkern und/oder Zytoplasma). Wirksamkeit und Zytotoxizität können dann ge testet werden. Die Toxizität umfasst nicht nur die Lebensfähigkeit der Zelle, sondern auch die Zellfunktion.
- Einige Darreichungsverfahren, die Verwendet werden können, umfassen:
- a. Einkapseln in Liposomen,
- b. Transduktion durch retrovirale Vektoren,
- c. Konjugation mit Cholesterol,
- d. Lokalisation an dem Kernkompartment unter Verwendung von Antigenbindungsstellen, die auf den meisten snRNAs gefunden werden,
- e. Neutralisierung der Ladung des Ribozyms unter Verwendung von Nukleotidderivaten und
- f. Verwendung von Blutstammzellen, um die Ribozyme im gesamten Körper zu verteilen.
- Wenigstens drei Arten von Zuführungsstrategien sind bei der vorliegenden Erfindung brauchbar. Hierzu gehören: Ribozymmodifikationen, Übermittlervehikel in Gestalt von Carriermedikamenten sowie retrovirale Exprimierungsvektoren. Nichtmodifizierte Ribozyme werden ähnlich wie die meisten kleinen Moleküle durch die Zellen aufgenommen, jedoch langsam. Um die Zellaufnahme zu verbessern, können die Ribozyme im Wesentlichen zufällig modifiziert werden, und zwar in einer Weise, dass ihre Ladung vermindert wird, jedoch ihre spezifischen funktionalen Gruppen erhalten bleiben. Dies führt zu einem Molekül, das in der Lage ist, durch die Zellmembran zu diffundieren und so die Permeabilitätsbarriere aufhebt.
- Die Modifikation der Ribozyme, um die Ladung zu vermindern, ist nur eine Lösung, um die Zellaufnahme dieser größeren Moleküle zu verbessern. Die Randomlösung ist jedoch nicht erstrebenswert, da Ribozyme strukturell und funktionell komplexer sind als kleine Wirkstoffmoleküle. Die strukturellen Anforderungen, die erforderlich sind, um die katalytische Wirkung der Ribozyme zu erhalten, sind dem Fachmann wohlbekannt. Diese Anforderungen werden berücksichtigt, wenn Modifikationen entworfen werden, um die Zuführung zu den Zellen zu verbessern. Die Modifikationen sind außerdem so angelegt, dass sie die Empfindlichkeit gegenüber einer Nukleasedegradation vermindern. Beide Charakteristiken sollten die Wirksamkeit des Ribozyms deutlich steigern. Die zelluläre Aufnahme kann um mehrere Größenordnungen gesteigert werden, ohne die Phosphordiesterbindungen zu verändern, die für die Ribozymspaltungsaktivität notwendig sind.
- Chemische Modifikationen an dem Phosphatrückgrat verändern die negative Ladung und gestatten eine freie Diffusion durch die Membrane. Dieses Prinzip wurde erfolgreich für die Antisinn-DNA-Technik nachgewiesen. Die Ähnlichkeiten der chemischen Zusammensetzungen zwischen DNA und RNA machen dies zu einer brauchbaren Lösung. Im Körper ist die Aufrechterhaltung einer externen Konzentration notwendig, um die Diffusion des modifizierten Ribozyms in die Zellen des Gewebes anzutreiben. Es werden die Zuführrouten bevorzugt, die es gestatten, dass das erkrankte Gewebe einer vorübergehend hohen Konzentration des Medikamentes ausgesetzt sind, das durch systemische Adsorption langsam verschwindet. Die intravenöse Verabreichung mit einem Medikamententräger, der dazu bestimmt ist, die Zirkulationshalbwertszeit des Ribozyms zu steigern, kann eingesetzt werden. Die Größe und die Zusammensetzung des Medikamententrägers begrenzen eine schnelle Beseitigung aus dem Blutstrom. Der Träger, der dazu dient, an der Infektionsstelle zu akkumulieren, kann das Ribozym gegen Degradationsprozesse schützen.
- Medikamentenzuführvehikel sind sowohl für systemische als auch für topische Verabreichung brauchbar. Sie können so ausgelegt werden, dass sie als langsames Freisetzungsreservoir dienen oder ihre Inhalte umgehend an der Zielzelle abliefern. Ein Vorteil der Verwendung von Vehikeln zur unmittelbaren Medikamentenzufuhr besteht darin, dass pro Aufnahme viele Moleküle zugeführt werden. Es wurde gezeigt, dass diese Vehikel die Zirkulationshalbwertszeit der Medikamente steigern, die sonst sehr schnell aus dem Blutstrom beseitigt würden. Einige Beispiele für solche spezialisierten Medikamentenzuführvehikel, die in diese Kategorie fallen, sind Liposome, Hydrogele, Cyclodextrine, bioabbaubare Nanokapseln und bioadhäsive Mikrokugeln.
- Aus dieser Aufzählung von Zuführsystemen werden Liposome bevorzugt. Liposome steigern die intrazelluläre Stabilität, die Aufnahmewirksamkeit und verbessern die biologische Aktivität.
- Liposome sind hohle kugelförmige Versikel, die aus Lipiden zusammengesetzt sind, die in ähnlicher Weise angeordnet sind wie die Lipide, die die Zellmembran bilden. Sie enthalten einen inneren wassergefüllten Raum, um wasserlösliche Zusammensetzungen im Größenbereich zwischen 0,05u bis zu einigen u Durchmesser aufzunehmen. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass Liposomen RNA an Zellen ausliefern können und dass die RNA biologisch aktiv bleibt.
- Beispielsweise ließ sich zeigen, dass ein Liposomen zuführungsvehikel, das ursprünglich als Untersuchungswerkzeug gedacht war, nämlich Lipofektin, intakte mRNA-Moleküle an Zellen liefern konnte, so dass es zu der Produktion des entsprechenden Proteins kam.
- Liposome bieten verschiedene Vorteile: sie sind nicht toxisch und in der Zusammensetzung bioabbaubar; sie zeigen eine lange Zirkulationshalbwertszeit und die Erkennungsmoleküle können leicht an ihrer Oberfläche angeheftet werden, um sich auf die betreffenden Gewebe zielgerichtet zu verhalten. Schließlich hat die kosteneffektive Herstellung von Pharmazeutika, die auf Liposomen basieren, und zwar entweder in einer flüssigen Suspension oder als lyophilisiertes Produkt, die Brauchbarkeit dieser Technik als einsetzbares Medikamentenzuführsystem gezeigt.
- Andere kontrollierte Verteilersysteme zur Medikamentenfreisetzung, wie Nonopartikel und Hydrogele, sind potenzielle Transportvehikel für ein Ribozym. Diese Carrier wurden für chemotherapeutische Wirkstoffe und proteinbasierende Pharmazeutika entwickelt und können folglich an die Ribozymverteilung angepasst werden.
- Die topische Verabreichung von Ribozymen ist vorteilhaft, da sie die lokalisierte Konzentration an der Verabreichungsstelle bei minimaler systemischer Adsorption gestatten. Dies vereinfacht die Zuführuntsstrategie des Ribozyms zu der erkrankten Stelle und vermindert das Ausmaß der toxikologischen Charakterisierung. Ferner ist die zugeführte Materialmenge weit geringer als die, die für andere Verabreichungsrouten erforderlich ist. Die effektive Zufuhr erfordert es, dass das Ribozym in die infizierte Zelle diffundiert. Die chemische Modifikation im Sinne einer Neutra lisierung der negativen Ladung des Ribozyms ist alles, was für das Eindringen notwendig ist. Falls jedoch die Ladungsneutralisierung nicht genügt, kann das Ribozym mit Permeabilitätsverbesserern co-formuliert werden, wie Azon oder Oleinsäure in einem Liposom. Die Liposomen können entweder ein Präsentationsvehikel zur langsamen Freisetzung bilden, bei dem das modifizierte Ribozym und der Permeabilitätsverbesserer aus dem Liposom in die infizierte Zelle übergehen oder die Liposomenphosopholipide können unmittelbar zum Erleichtern des Transports zu der Zelle mit dem modifizierten Ribozym oder dem Permeabilitätsverbesserer beitragen. In einigen Fällen können sowohl das Ribozym als auch der Permeabilitätsverbesserer in einer Suppositorienformulierung zur langsamen Freisetzung vorliegen.
- Ribozyme können auch systemisch verabreicht werden. Die systemische Absorption führt zu der Akkumulation von Medikamenten in dem Blutstrom, gefolgt von einer Ausbreitung im gesamten Körper. Zu den Verabreichungsrouten, die zu einer systemischen Absorption führen, gehören die intravenös, die subkutane, die intraperitoneale, die intranasale, die intrathecale und die ophthalmische. Jede dieser Verabreichungsrouten präsentiert das Ribozym einem zugänglichen erkrankten Gewebe. Die subkutane Verabreichung gelangt in einen lokalen Lymphknoten, von wo aus es über das lymphatische Gefäßnetz in den Kreislauf gelangt. Die Art, mit der es in den Kreislauf eintritt, ist nachgewiesenermaßen eine Funktion des Molekulargewichts oder der Größe. Die Verwendung eines Liposoms oder anderer Medikamententräger lokalisiert das Ribozym in dem Lymphknoten. Das Ribozym kann modifiziert werden, um in die Zelle zu diffundieren oder das Liposom kann unmittelbar an der Verteilung des entweder unmodifizierten oder des modifizierten Ribozyms zu der Zelle teilnehmen.
- Eine Liposomformulierung, die die Ribozyme zu den Lymphozyten und Macrophagen schafft, ist außerdem an die Initialisierungsstelle für die Replikation des Influenzavirus in den Geweben des Nasenpharynxbereichs und des Atmungssystems brauchbar. Die Beschichtung der Lymphozyten mit Liposomen, die die Ribolyme enthalten, bringt die Ribozyme gezielt zu den infizierten Zellen, die die viralen Oberflächenantigene exprimieren. Vollblutuntersuchungen zeigen, dass die Formulierung nach 8 Stunden bei 37ºC zu 90% von den Lymphozyten aufgenommen wurde. Vorläufige Bioverteilung und pharmacokinetische Untersuchungen ergaben 70% der injizierten Dosis/gm Gewebe in der Milz innerhalb einer Stunde nach der intravenösen Verabreichung.
- Die Intraperitoneale Verabreichung führt auch zu einer Zufuhr in den Kreislauf, wobei wiederum das Molekulargewicht oder die Größe die Zuführrate steuert.
- Liposomen, die intravenös injiziert werden, zeigen eine Akkumulierung in der Leber, der Lunge und der Milz. Die Zusammensetzung und die Größe können so eingestellt werden, dass diese Akkumulation 30 bis 40% der injizierten Dosis ausmacht. Der Rest zirkuliert weiterhin bis zu 24 Stunden in dem Blutstrom.
- Das ausgewählt Verfahren zum Zuführen führt zu einer zytoplasmatischen Akkumulation und die Moleküle sollten zwecks optimaler Dosierung eine gewisse Nuklease-Widerstandsfähigkeit aufweisen. Zellkernzufuhr kann auch verwendet werden, ist jedoch weniger bevorzugt. Zu den am meisten bevorzugten Zuführverfahren gehören Liposome (10-400 nm), Hydrogele, Polymere zur kontrollierten Freisetzung, Mikroinjektion oder Elektroporation (zur ex vivo-Behandlung) sowie andere pharmazeutisch verträgliche Vehikel. Die Dosierung hängt von der Indikation der Krankheit und der Verabreichungsroute ab und sollte zwischen 100-200 mg/kg Körpergewicht/Tag liegen. Die Dauer der Behandlung erstreckt sich über die Dauer der Krankheitssymtome, für gewöhnlich wenigstens 14-16 Tage und möglichst ununterbrochen. Bei topischer, occularer oder vaginaler Anwendung werden mehrere Dosen täglich bevorzugt. Die Anzahl der Dosen hängt von dem Krankheitstransportvehikel und den Wirksamkeitsdaten aus klinischen Tests ab.
- Das Schaffen von therapeutischen Werten des Ribozyms innerhalb der Zelle hängt von der Geschwindigkeit der Aufnahme und der Degradation ab. Eine Verminderung des Degradationsmaßes Verlängert die intrazelluläre Halbwertszeit des Ribozyms. Deswegen können chemisch modifizierte Ribozyme, beispielsweise mit einer Modifikation des Phosphatrückgrats oder Abdeckung der 5'- und 3'-Enden des Ribozyms mit Nukleotidanalogen unterschiedliche Dosierungen erfordern. Die Beschreibung brauchbarer Systeme findet sich in der oben angegebenen Literatur, auf die hier insgesamt Bezug genommen ist.
- Die beanspruchten Ribozyme sind auch als diagnostische Werkzeuge zu verwenden, um spezifisch oder nicht spezifisch das Vorhandensein einer Ziel-RNA in einer Probe zu erkennen, d.h. die Ziel-RNA wird, wenn sie in der Probe vorhanden ist, durch das Ribozym speziell gespalten und kann so einfach und spezifisch als kleinere RNA-Spezies erkannt werden. Das Vorhandensein einer solchen kleineren RNA-Spezies ist ein Anzeichen für das Vorliegen der Ziel-RNA in der Probe.
Claims (9)
1. Verwendung eines Oligonukleotids mit einer
enzymatischen Aktivität, wobei ein Nukleotid mit der Formel
beteiligt ist:
wobei B eine Nukleotidbase oder Wasserstoff ist; R&sub1; und R&sub2;
unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt sind, zu
der Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit zwischen 2 und 10
Kohlenstoffatomen einschließlich, ein Amin, eine Aminosäure
und ein Peptid gehören, das zwischen 2 und 5 Aminosäuren
enthält; und die Zickzacklinien unabhängig voneinander
Wasserstoff oder eine Bindung bei der Herstellung eines
Medikaments zum Spalten eines Zielgens darstellt.
2. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1,
bei der das Oligonukleotid in der Lage ist, wiederholt in
einer für eine Nukleotidbasissequenz spezifischen Weise zu
spalten.
3. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem der
Ansprüche 1 oder 2, bei der das Oligonukleotid eine
Phosphorthioat- oder eine
Phosphordithioatinternukleotidbindung enthält.
4. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 1,
wobei das Oligonukleotid das Bild eines Hammerkopfes
bildet.
5. Oligonukleotid mit der Formel:
wobei B eine Nukleotidbase oder Wasserstoff ist; R&sub1; und R&sub2;
unabhängig voneinander aus einer Gruppe ausgewählt sind, zu
der Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit zwischen 2 und 10
Kohlenstoffatomen einschließlich, ein Amin, eine Aminosäure
und ein Peptid mit 2 und 5 Aminosäuren gehören; und die
Zickzacklinien unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine
Bindung bedeuten;
vorausgesetzt, dass, wenn B Uracil ist, R&sub1; und R&sub2; nicht
beide H sind oder, wenn B Adenin ist, entweder R&sub1; oder R&sub2;
NH&sub2; ist, während der andere nicht -CH&sub2;-CH&sub2;-COOH ist oder,
wenn B Uracil oder Adenin ist, entweder R&sub1; oder R&sub2; NH&sub2; und
der andere H ist.
6. Oligonukleotid nach Anspruch 5, wobei das
Oligonukleotid ein enzymatisches RNA-Molekül aufweist.
7. Oligonukleotid nach Anspruch 6, wobei das
Oligonukleotid in der Lage ist, in einer für die
Nukleotidbasensequenz spezifischen Weise wiederholt zu spalten.
8. Oligonukleotid nach Anspruch 5 oder 6, wobei das
Oligonukleotid eine Phosphorthioat- oder eine
Phosphordithioat-Internukleotidbindung aufweist.
9. Oligonukleotid nach Anspruch 6, wobei das
Oligonukleotid das Bild eines Hammerkopfes bildet.
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