CN103140582A - 含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂 - Google Patents

Abstract

提供了包含一个或多个内部非核苷酸间隔子的单链RNA分子，所述间隔子与所述分子的核苷酸部分共价连接。该单链RNAi分子起引导或反义链的作用，所述引导或反义链能够经由RNA干扰机制抑制基因表达，并且因此，代表单链RNAi试剂。该单链RNAi分子可用于多种治疗、诊断、目标验证、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的方法中。

Description

含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年8月24日提交的美国临时申请号61/376,471(此处通过引用并入本文)的权益。

发明背景

RNA干扰(RNAi)通路是基因调控的进化上保守的模式。RNAi过程是由从各种外源性或内源性来源(例如，实验引入，病毒感染)产生的双链RNA(dsRNA)起始的。dsRNA被Dicer切割以产生20-25核苷酸小干扰RNA(siRNA)双链体。然后这些双链体被装载至RNA诱导的沉默复合物(RISC)上，在RISC被激活之前，双链体的过客/有义链被除去。单引导/反义链保持与RISC结合并引导目标mRNA的裂解。因此，双链siRNA已经变为研究和基于核酸的疗法的重要工具。

RNAi基因沉默可以经由单链或双链RNA分子发生。在最近十年中，已经报道，单链反义siRNA和siRNA双链体几乎是一样有效的 (参见，例如Schwarz等人, 2002, Mol. Cell. 10:537-548；Martinez等人, 2002, Cell 110:563-574；Amarzguioui等人, 2003, Nucleic Acids Res. 31:589-595；和Holen等人, 2003, Nucleic Acids Res. 31:2401-2407)。与双链的版本相比，利用单链RNA分子用于基因沉默有一些好处。它们更低的分子量可以使它们更容易穿过细胞膜。单链RNA分子也是双链siRNA的质量和体积的一半，这暗示了制造成本优势。因此，在制定适用于单链RNA干扰分子的新的且有利的设计特征中仍然具有高度的兴趣。

发明概述

本发明提供单链RNA分子，所述单链RNA分子包含： (a)核酸部分，其包含两个或更多个核苷酸部分，和(b)内部(与“末端”相比)间隔子部分，其包含一个或多个非核苷酸间隔子部分，其中非核苷酸间隔子部分共价连接所述分子的两个核苷酸部分。本发明的单链RNA分子的核苷酸部分不是彼此互补的，因此，所述部分不形成碱基对。本发明的单链RNA分子起引导或反义链的作用，所述引导或反义链能够通过RNA干扰机制抑制基因表达，因此，代表单链RNAi试剂。

本发明的单链RNAi分子具有单链寡核苷酸结构，并且介导针对目标RNA的RNA干扰。单链RNAi分子包含：(a)核酸部分，包含第一核苷酸部分(N1)和第二核苷酸部分(N2)，其中所述核酸部分包含可与目标RNA碱基配对的至少8个核苷酸，其中所述核酸部分内的核苷酸总数为8-26个核苷酸；和，(b)内部间隔子部分，包含至少一个第一非核苷酸间隔子部分(S1)，所述第一非核苷酸间隔子部分(S1)共价连接第一和第二核苷酸部分。第一和第二核苷酸部不是自我互补的。本发明的单链RNAi分子的核苷酸总数(例如，8-26个)分布在分子的核苷酸部分之间，其中每个核苷酸部分包含至少一个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含两个核苷酸部分，被称为第一核苷酸部分(N1)和第二核苷酸部分(N2)。本发明的RNAi分子的第一和第二核苷酸部分共价连接至分子的非核苷酸间隔子部分。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含多于一个核苷酸部分(例如，3、4、或5个，分别被称为第三(N3)，第四(N4)或第五(N5)核苷酸部分)。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分仅仅包含一个非核苷酸间隔子部分，被称为第一非核苷酸间隔子部分(S1)。本发明的RNAi分子的第一非核苷酸间隔子部分(S1)共价连接至两个核苷酸和/或非核苷酸替代物，所述核苷酸和/或非核苷酸替代物每个位于单链分子的不同的核苷酸部分内。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分包含多于一个非核苷酸间隔子部分(例如，2、3、或4个，分别被称为第二(S2)、第三(S3)或第四(S4)非核苷酸间隔子部分)。

本发明的单链RNAi分子包含与细胞中的RNA目标位点部分、基本上或完全互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子包含与天然存在的miRNA的引导链部分、基本上或完全同源的核苷酸序列，因此起miRNA模拟物的作用。本发明的单链miRNA模拟物基于对应的天然存在的miRNA设计，其中至少一个非核苷酸间隔子部分或位于天然存在的miRNA引导链序列的两个相邻核苷酸之间，或将其取代天然存在的miRNA引导链序列的1-约12个内部(即，非末端的)核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子是单链siRNA或双链体siRNA的引导/反义链的类似物，其中所述单链RNAi分子包含与对应的单链siRNA或对应的双链体siRNA的引导链部分、基本上或完全同源的序列。可以已知对应的单链siRNA或双链体siRNA通过RNAi机制抑制基因表达。在该实施方案中，单链RNAi分子代表单链siRNA模拟物。本发明的单链siRNA模拟物基于对应的siRNA设计，其中至少一个非核苷酸间隔子部分或位于siRNA引导链序列的两个相邻核苷酸之间，或将其取代对应的siRNA引导链序列的1-约4个核苷酸。

本发明的单链RNAi分子可以包含取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸，包括骨架、糖、碱基或核苷的取代或修饰。在某些实施方案中，本发明的取代的或修饰的单链RNAi分子可以帮助在更低剂量实现给定的治疗效果，因为这些分子可以被设计为具有在受试者或生物样品(例如，血清)中增加的半衰期。此外，某些取代或修饰可用于通过针对特定细胞或组织或改进单链RNAi分子的细胞摄取而改进单链RNAi分子的生物利用度。

本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分可以包含一个或多??个非核苷酸间隔子部分。非核苷酸间隔子部分可以包括可进一步取代的任何脂族或芳族化学基团，其中所述间隔子部分不包含核苷酸。可以用为单链RNAi分子提供额外功能的化学部分取代间隔子部分。例如，可以用特异性结合感兴趣的目标分子或促进/增强分子的细胞递送的部分取代非核苷酸间隔子部分。在本发明的一个实施方案中，非核苷酸间隔子部分包括优选1-20个碳并且可以任选被取代的烷基、烯基或炔基链。

本发明的单链RNAi分子是有用的试剂，其可用于多种治疗、诊断、目标验证、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的方法中。因此，本发明进一步包括包含本发明的单链RNAi分子的组合物和用于抑制一种或多种对应的目标mRNA在细胞或生物体中的表达的方法。本发明提供了用于治疗受试者，包括人细胞、组织或个体的方法和单链RNAi分子组合物。

附图简要说明

图1显示使用RT-qPCR测定的包含C3间隔子的单链miR-124类似物抑制VAMP3目标表达的程度。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中，圆代表核苷酸，除了位于5'末端的黑色圆，其代表5'磷酸酯。空心圆代表2'-脱氧-2'-氟核苷酸。位于示意图3'末端的黑色圆代表2'-O-甲基核苷酸，“3”代表C3间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中，三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。图中更长的条表明更大的敲低，一式两份的条表明生物学重复。

图2显示使用RT-qPCR测定的包含C6间隔子的单链miR-124类似物抑制VAMP3目标表达的程度。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中，圆代表核苷酸，除了位于5'末端的黑色圆，其代表5'磷酸酯。空心圆代表2'-脱氧-2'-氟核苷酸。位于示意图3'末端的黑色圆代表2'-O-甲基核苷酸，“6”代表C6间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中，三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。图中更长的条表明更大的敲低，一式两份的条表明生物学重复。

图3显示对于图1和2中测试的类似物的亚组的VAMP3表达的剂量依赖性反应。VAMP3表达沿y轴表示。测试的miR-124类似物的剂量(对于结构和序列参见下述表2)沿x轴表示，范围从左侧的最低剂量至右侧的最高剂量。

图4显示使用报道分子测定的包含C3间隔子的单链miR-124类似物的抑制的程度，其测量共转染的荧光素酶报道分子的敲低，所述报道分子携带与miR-124的种子区域匹配的两个目标位点。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中，圆代表核苷酸，除了位于5'末端的黑色圆，其代表5'磷酸酯。空心圆代表2'-脱氧-2'-氟核苷酸。位于示意图3'末端的黑色圆代表2'-O-甲基核苷酸，“3”代表C3间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中，三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。图表的一式两份的条表明生物学重复，更长的条表明更大的抑制。

图5显示使用报道分子测定的包含C6间隔子的单链miR-124类似物的抑制的程度，其测量共转染的荧光素酶报道分子的敲低，所述报道分子携带与miR-124的种子区域匹配的两个目标位点。类似物的结构和序列具体描述在下述表2中。在miR-124类似物的示意图中，圆代表核苷酸，除了位于5'末端的黑色圆，其代表5'磷酸酯。空心圆代表2'-脱氧-2'-氟核苷酸。位于示意图3'末端的黑色圆代表2'-O-甲基核苷酸，“6”代表C6间隔子的位置。在“124(21)-8p-16rrr”类似物的示意图中，三个内部黑色圆代表未修饰的核糖核苷酸。一式两份的条表明生物学重复，更长的条表明更大的抑制。

图6A和6B显示对于图3中测试的单链miR-124类似物的亚组的两种不同的荧光素酶报道分子的目标表达抑制的剂量依赖性反应。在图6A中，显示的抑制活性针对具有与miR-124种子区域的两个匹配的荧光素酶报道分子，其代表测试的类似物的miRNA活性。在图6B中，显示的抑制活性针对具有与miR-124的两个全长匹配的荧光素酶报道分子，其代表测试的类似物的siRNA活性。

图7在两个不同的浓度(100 nM和10 nM)用具有在15("485 c3pos15")、16 ("485 c3pos16")、17 ("485 c3pos17")、18 ("485 c3pos185")或19 ("485 c3pos19")位(相对于寡核苷酸的5')引入的C3间隔子的ApoB靶向的单链(引导链)寡核苷酸与相应的没有间隔子的单链寡核苷酸(“485”)比较ApoB mRNA的敲低。所有单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2'-脱氧-2'-氟核苷酸、5'磷酸酯和在3'末端处的两个2'-O-甲基核苷酸构成。

图8和9在两个浓度(100 nM和10 nM)比较了在18位(图8)或19位(图9)具有C3间隔子的30个靶向ApoB的不同的单链序列的ApoB mRNA的敲低。单链由在x-轴上ApoB mRNA内它们靶向的位置表示。所有单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2'-脱氧-2'-氟核苷酸、5'磷酸酯和在3'末端处的两个2'-O-甲基核苷酸构成。

图10比较了使用靶向图8和图9中测试的30个不同的ApoB目标位点中每一个的单链分子在100nM浓度的ApoB mRNA敲低 – 无C3间隔子的单链(“all-flu-p”)、在18位具有C3间隔子的单链("all-flu-c3-18-p")和在19位具有C3间隔子的单链("all-flu-c3-19-p")。所有单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2'-脱氧-2'-氟核苷酸、5'磷酸酯和在3'末端处的两个2'-O-甲基核苷酸构成。

发明详述

A. 术语和定义

下述术语和定义如在本申请中使用地应用。

如本说明书中和随附的权利要求中所使用的，单数形式“(a)一”，“(an)一”和“(the)该”包括复数对象，除非上下文另有清楚指明。因此，例如，提到“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。

任何浓度范围、百分比范围、比值范围或整数范围应理解为包括在引用的范围内的任何整数的值，和在适当时的其分数(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有指明。

如本文所使用的，关于数的“约”或“近似”通常认为包括落在该数的任一方向(大于或小于)的5％的范围的数，除非另有指明，或否则从上下文是明显的(除了其中这个数将超过可能值的100％)。当规定范围时，端点包括在范围内，除非另有指明，或否则从上下文是明显的。

如本文所使用的，术语“包括”(及其任何形式，如“包括”和“包括”)，“包含”(和其任何形式，如“包含”和“包含”)，“具有“(和其任何形式，如“具有”或“具有”)，或“含有”(和其任何形式，如“含有”或“含有”)是具有包括性的和开放式的，不排除额外的、未描述的元素或方法步骤。

如本文所使用的，术语“类似物”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指在结构上类似于母体化合物或分子(例如，核苷酸，天然存在的miRNA)但在组成上(例如，一个原子或官能团是不同的，添加的，或去除的)略有不同的化合物或分子。与初始的母体化合物或分子相比，类似物可能具有或可能不具有不同的化学或物理特性，并且可能具有或可能不具有改进的生物或化学活性。例如，类似物可能亲水性更强，或者它可能已经改变母体化合物/分子的活性。类似物可以是初始母体化合物/分子的天然的或非天然存在的(例如，化学修饰的或重组的)变体。RNA类似物的一个实例是包含核苷酸类似物的RNA分子。核苷酸类似物是本领域公认的在糖、碱基或核苷处化学修饰的核苷酸。

如本文所使用的，术语“模拟物”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指结构上不同于参考分子的分子。例如，用于本发明的某些实施方案的目的的参考分子可以是不含有非核苷酸内部间隔子的天然存在的miRNA分子或单链siRNA分子。该模拟物能够行使参考分子的能力之内的生物学、生理学和/或化学功能的一种或多种或所有。模拟物和参考分子不必是功能等效物，但是模拟物应当能够行使一种或多种功能，并且如使用适合代表共有的一种或多种功能的测定或参数所测量并比较的，表现出至少5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、或90％或更多的参考分子的活性。当描述结构上不同于参考RNAi分子的本发明的RNAi分子时，术语“类似物”和“模拟物”可以互换使用。

术语“核苷酸”是指其如本领域公认的意义。核苷酸一般包含核碱基、糖和核苷间键，例如磷酸酯。碱基可以是如本领域众所周知的天然碱基(标准)、修饰的碱基或碱基类似物。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位置处。另外，核苷酸可以是未修饰的或在糖、核苷间键和/或碱基部分处修饰的(也可互换地称为核苷酸类似物，修饰的核苷酸，非天然核苷酸，和非标准核苷酸等)；参见例如，美国申请号12/064,014。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指核苷酸链。“核酸”和“核酸分子”是核苷酸的聚合物。因此，“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文是互换的。本领域技术人员具有如下常识：核酸是可以水解成单体核苷酸的多核苷酸。单体核苷酸可以进一步水解成核苷。

“一段连续的核苷酸”是指至少2个核苷酸的连续系列。在该段内连接核苷酸的键是磷酸二酯键。

如本文所使用的，术语“RNA” 是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指包含至少一个呋喃核糖核苷(ribofuranoside)残基的分子，如核糖核苷酸。术语“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。该术语是指双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA、或通过其中一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，例如在RNA分子的一个或多个非末端核苷酸处。因此，本发明的单链RNA分子中的核苷酸可以包含非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸、化学合成的核苷酸和/或修饰的核苷酸、或脱氧核苷酸。所述改变的RNA被称为“修饰的RNA”或“RNA类似物”。

如本文所使用的，术语“嘧啶”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指常规的嘧啶碱基，包括标准的嘧啶碱基尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。此外，术语嘧啶被认为包括非标准嘧啶碱基或酸，如5-甲基尿嘧啶、2-硫代-5-甲基尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、二氢尿嘧啶、乳清酸盐、5-甲基胞嘧啶等，以及化学修饰的碱基或“通用碱基”，其可以被用于取代本发明的核酸分子内的标准嘧啶。

如本文所使用的，术语“嘌呤”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指常规的嘌呤碱基，包括标准的嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤。此外，术语“嘌呤”被认为包括非标准嘌呤碱基或酸，如N₂-甲基鸟嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤等，以及化学修饰的碱基或“通用碱基”，其可以被用于取代本文的标准嘌呤。

如本文所述，在两个核苷酸、核苷酸和修饰的核苷酸、两个修饰的核苷酸、核苷酸和核苷酸类似物、两个核苷酸类似物、核苷酸和非核苷酸取代部分或两个非核苷酸取代部分之间可以形成“碱基对”。在一个特定的实施方案中，非核苷酸取代物可以包含能够与细胞RNAi机制的组分结合的任何化学部分，如，例如，PAZ结构域、PIWI结构域和/或与RISC相关的其他Argonaute蛋白结构域。非常规沃森克里克碱基对也被理解为“非规范碱基对”，意指任何非沃森克里克碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，包括翻转错配(flipped mismatches)、单氢键错配、反式类型错配、三碱基相互作用、和四碱基相互作用。此种非规范碱基对的非限制性实例包括但不限于，AC反Hoogsteen、AC摆动、AU反Hoogsteen、GU摆动、AA N7氨基、CC 2-羰基-氨基(H1)-N3-氨基(H2)、GA剪切、UC 4-羰基-氨基、UU亚氨基-羰基、AC反摆动、AU Hoogsteen、AU反沃森克里克、CG反沃森克里克、GC N3-氨基-氨基N3、AA N1-氨基对称、AA N7-氨基对称、GA N7-N1氨基-羰基、GA+ 羰基-氨基 N7-N1、GG N1-羰基对称、GG N3-氨基对称、CC羰基-氨基对称、CC N3-氨基对称、UU 2-羰基-亚氨基对称、UU 4-羰基-亚氨基对称、AA氨基-N3、AA N1-氨基、AC氨基2-羰基、AC N3-氨基、AC N7-氨基、AU氨基-4-羰基、AU N1-亚氨基、AU N3-亚氨基、AU N7-亚氨基、CC羰基-氨基、GA氨基-N1、GA氨基-N7、GA羰基-氨基、GA N3-氨基、GC氨基-N3、GC羰基-氨基、GC N3-氨基、GC N7-氨基、GG氨基-N7、GG羰基-亚氨基、GG N7-氨基、GU氨基-2-羰基、GU羰基-亚氨基、GU亚氨基-2-羰基、GU N7-亚氨基、psiU亚氨基-2-羰基、UC 4-羰基-氨基、UC亚氨基-羰基、UU亚氨基-4-羰基、AC C2-H-N3、GA 羰基-C2-H、UU亚氨基-4-羰基2羰基-C5-H、AC氨基(A)N3(C)-羰基、GC亚氨基氨基-羰基、Gpsi亚氨基-2-羰基氨基-2-羰基和GU亚氨基氨基-2-羰基碱基对。

如本文所使用的，术语“互补”(或“互补性”) 是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指通过常规沃森-克里克或如本文所述的其他非常规键的类型在一种核酸序列和另一种核酸序列之间形成或存在一个或多个氢键。关于本发明的示例性核酸分子，在本发明的单链RNAi和RNA目标分子之间可以发现互补性。关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能得以进行，例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周知的(参见，例如，Turner等人,1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133；Frier等人,1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377；Turner等人,1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785)。

如本文所用的，术语第一种核酸分子(例如，本发明的单链RNAi分子)与第二种核酸分子(例如，目标RNA分子)之间的“完全互补”(或“完全互补性”)意指第一种核酸序列的所有连续残基将与第二种核酸序列中相同数量的连续残基氢键合。例如，两条或更多的完全互补的核酸链可以具有相同数量的核苷酸(即，具有相同的长度并形成有或没有突出端的一个双链区域)，或具有不同数量的核苷酸(例如，一条链可以更短，但完全包含在第二条链内)。作为实例，如果本发明的单链RNAi分子具有只有1个核苷酸的第一核苷酸部分和10个连续核苷酸的第二核苷酸部分，其中分子的第二核苷酸部分中的所有10个核苷酸都与RNA目标序列碱基配对，那么RNAi分子与RNA目标序列完全互补。当测定互补程度时，不包括第一核苷酸部分中包括的单核苷酸，因为它不在一条连续链的核苷酸内。然而，在这个实例中，如果第一核苷酸部分包含2个核苷酸，如果第一核苷酸部分的2个核苷酸和第二核苷酸部分的10个核苷酸与目标RNA序列碱基配对，那么RNAi分子与目标RNA序列完全互补。

互补核酸酸分子可能具有错误的配对碱基，即不能形成常规的沃森克里克碱基对(即，形成氢键)或其他非常规类型的碱基对(即，通过不是氢键的非常规力一起形成或结合的“错配”碱基)的碱基。术语第一种核酸分子(例如，本发明的单链RNAi分子)与第二种核酸分子(例如，目标RNA分子)之间的“部分互补”(或“部分互补性”)意指在核苷酸序列之间存在各种错配或或非碱基配对的核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多错配或非碱基配对的核苷酸)，其可以导致，例如，凸起或环。这种部分互补性可以通过由相对于涉及的核苷酸的总数的碱基配对的核苷酸的数量测定的百分比(%)互补性来代表，例如，约50％，60％，70％，80％，90％等。例如，第一种核酸分子可以具有10个核苷酸，第二种核酸分子可以具有10个核苷酸，然后第一种和第二种核酸分子之间5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对，其可能形成或可能不形成连续的双链区域，分别代表50％、60％、70％、80％、90％、或100％的互补性。关于本发明，这样的部分互补性允许的程度是，本发明的单链RNAi分子保持其功能，例如介导序列特异性RNAi的能力。

第一种核酸分子可以与第二种核酸“基本上互补”。“基本上互补”是指，第一种核酸序列(例如，本发明的单链RNAi分子)与第二种核酸序列(例如，RNA目标序列)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补。如本文所使用的，第一种核酸分子可以与第二种核酸分子既“部分互补”又“基本上互补”。

如本文所使用的，术语“同源的”(或“同源性”)是指其如本领域公认的意义。该术语通常是指已经与参考核酸序列的相同核苷酸匹配的主题核酸序列的核苷酸的数量，通常通过序列分析程序(例如，Karlin和Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268；Karlin和Altschul, 1993, PNAS 90:5873-5877)，或通过目视检查确定。如本文所使用的，术语“完全同源性”(或“完全同源的”)是指在参考序列和主题核酸序列之间的完全(100％)同源性或“同一性”。如本文所使用的，术语“基本上同源的”(或“基本上同源性”)是指，主题序列与参考序列中相同核苷酸位置的核苷酸共有至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％ 、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的同源的核苷酸。

如本文所使用的，短语“化学修饰”是指其如本领域公认的意义。关于本发明的示例性核酸分子，该术语指与天然RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含如本文所描述的或如本领域其他方面已知的天然RNA在糖、碱基或核苷酸间键上的添加、取代或修饰。在某些实施方案中，术语“化学修饰”可以是指在某些生物系统中天然存在的RNA的某些形式，例如2'-O-甲基修饰或肌苷修饰。

如本文所使用的，短语“修饰的核苷酸” 是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指本领域一般已知的在未修饰的(或天然)核苷酸的碱基、糖和/或磷酸酯的化学结构中包含修饰的核苷酸。修饰的核苷酸的非限制性实例在本文和美国申请号12/064,014中描述。

“百分比修饰”是指其如本领域公认的意义。如本文所使用的，该术语通常是指本发明的单链RNA分子中已经被修饰的核苷酸的数量。化学修饰的程度将取决于本领域技术人员众所周知的各种因素(例如，目标RNA、脱靶沉默、核酸内切酶降解的程度)。

术语“硫代磷酸酯”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指包含一个或多个硫原子代替氧原子的核苷酸间磷酸键。因此，术语硫代磷酸酯是指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。

如本文所使用的，术语“锁定核酸”(LNA)具有通式Ⅰ的结构：

X和Y独立地选自–O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-CH₂-、或–CH-(如果是双键的部分)、-CH₂-O-、CH₂-S-、CH₂-N(H)-、-CH₂-N(R)-、-CH₂-CH₂-、和CH₂-CH-(如果是双键的部分), -CH=CH-，其中R选自氢和C_1-4-烷基；Z和Z*独立地选自核苷酸间键、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然的核碱基；并且不对称基团可以以任一方向存在。

所示式I的四个手性中心是固定构型，但是它们构型不必是固定的。因此，手性中心可以以不同构型存在，如式II(下面)中代表的那些。因此，式1中的每个手性中心可以以R或S构型存在。R (直的(rectus))和S (左旋(sininster))的定义描述于IUPAC 1974 Recommendations, Section E, Fundamental Stereochemistry中：该规则可以在Pure Appl. Chem. 45, 13-30 (1976)和在"Nomenclature of Organic Chemistry" Pergamon, New York, 1979中发现。

末端基团独立地选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C_1-6-烷硫基、氨基、Prot-N(R^H)-、Act-N(R^H)-、单-或双(C_1-6-烷基)氨基、任选取代的C_1-6-烷氧基、任选取代的C_1-6-烷基、任选取代的C_2-6-烯基、任选取代基的C_2-6-烯基氧基、任选取代的C₂.₆-炔基、任选取代的C_2-6-炔基氧基、单磷酸酯、单硫代磷酸酯、二磷酸酯、二硫代磷酸酯、三磷酸酯、三硫代磷酸酯、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团、配体、羧基、磺基(sulphono)、羟甲基、Prot- O-CH₂-、Act-O-CH₂-、氨基甲基、Prot-N(R^H)-CH₂-、Act-N(R^H)-CH₂-、羧基甲基、磺基甲基，其中Prot是-OH、-SH和-NH(R^H)分别的保护基团，Act是-OH、-SH和-NH(R^H)分别的活化基团，和R^H选自氢和C_1-6-烷基。

羟基取代基的保护基团包括取代的三苯甲基，如4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基(DMT)、4-单甲氧三苯甲基氧基(MMT)和三苯甲基氧基、任选取代的9-(9-苯基) 呫吨基氧基(pixyl)、任选取代的甲氧基四氢-吡喃基氧基(mthp)、甲硅烷基氧基如三甲基甲硅烷基氧基(TMS)、三异丙基甲硅烷基氧基(TIPS)₇、叔丁基二甲基甲硅烷氧基(TBDMS)、三乙基甲硅烷基氧基、和苯基二甲基甲硅烷氧基、叔丁基醚、缩醛(包括两个羟基)、酰氧基如乙酰基或卤素取代的乙酰基。

“Act”指定-OH、-SH和-NH(R^H)分别的活化基团。这样的活化基团，例如，选自任选取代的O-亚磷酰胺、任选取代的O-磷酸三酯(phosphortriester)、任选取代的O-磷酸二酯(phosphordiester)、任选取代的H-膦酸酯和任选取代的O-膦酸酯。

B构成天然或非天然的核碱基，选自腺嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、7-丙炔-7-脱氮腺嘌呤、7-丙炔-7-脱氮鸟嘌呤、和2-氯-6-氨基嘌呤。

优选地，本发明的单链RNAi分子中使用的锁定核酸(LNA)包含式Ⅱ中任一个的LNA结构：

其中Y是-O-、-S-、-NH-或N(R^H)；Z和Z *独立地选自核苷酸间键、末端基团或保护基团；和B构成自然的或非天然的核碱基。这些示例性的LNA单体和其他LNA单体，以及它们的制备方法描述在下列中：WO 99/14226和随后的申请，WO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 00/125248、WO 02/28875、WO 2002/094250和WO 2003/006475；其所有公开内容通过引用并入本文。

术语“通用碱基”是指其如本领域公认的意义。该术语通常是指与每个标准DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，而在它们之间只有很少的区别，被细胞内酶所识别。参见，例如Loakes等人, 1997, J. Mol. Bio. 270:426-435。通用碱基的非限制性实例包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、唑甲酰胺和硝基唑衍生物例如如本领域已知的3'-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚。参见例如Loakes，2001，Nucleic Acids Res. 29：2437。

如本文所用，短语“RNA干扰”(本文也称为“RNAi”)是指其如本领域公认的意义。该术语通常是指由短干扰核酸分子介导的抑制、降低或下调细胞中的基因表达的生物过程(例如，siRNAs, miRNAs, shRNAs)，参见例如Zamore和Haley, 2005, Science 309:1519-1524；Vaughn和Martienssen, 2005, Science 309:1525-1526；Zamore等人, 2000, Cell 101:25-33；Bass, 2001, Nature 411:428-429；Elbashir等人,2001, Nature 411:494-498；和Kreutzer等人,国际PCT公开号 WO 00/44895；Zernicka-Goetz等人, 国际PCT公开号WO 01/36646；Fire, 国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等人, 国际PCT公开号WO 00/01846；Mello和Fire, 国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette, 国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等人, 国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire, 2002, Science 297:1818-1819；Volpe等人, 2002, Science 297:1833-1837；Jenuwein, 2002, Science 297:2215-2218；和Hall等人, 2002, Science 297:2232-2237；Hutvagner和Zamore, 2002, Science 297:2056-60；McManus等人,2002, RNA 8:842-850；Reinhart等人, 2002, Gene & Dev. 16:1616-1626；和Reinhart & Bartel, 2002, Science 297:1831)。此外，术语“RNA干扰”(或“RNAi”)意欲等价于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学(epigenetics)。例如，本发明的单链RNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传地沉默基因。在非限制性实例中，基因表达经由本发明的单链RNA分子的表观遗传调节可以起因于染色质结构的修饰或甲基化模式以改变基因表达(参见，例如，Verdel等人, 2004, Science 303:672-676；Pal-Bhadra等人, 2004, Science 303:669-672；Allshire, 2002, Science 297:1818-1819；Volpe等人, 2002, Science 297:1833-1837；Jenuwein, 2002, Science 297:2215-2218;和Hall等人, 2002, Science 297:2232-2237)。在另一个非限制性实例中，基因表达经由本发明的单链RNA分子的调节可以起因于经由RISC或经由转录抑制的RNA(编码或非编码RNA)切割，这是本领域已知的，或者调节可以起因于转录抑制(参见例如Janowski等人, 2005, Nature Chemical Biology 1:216-222)。

如本文所使用的，术语“抑制”、“下调”或“减少”是指其如本领域公认的意义。关于本发明的示例性单链RNAi分子，该术语一般是指(i)基因或目标基因的表达和/或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子的水平，和/或(ii)一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性的减少，低于在不存在本发明的单链RNAi分子的情况下观察到的那种。下调还可以与转录后沉默相关，例如RNAi介导的切割或通过DNA甲基化模式或DNA染色质结构中的改变。用RNAi试剂的抑制、下调、减少或敲低可以关于无活性分子、减弱的分子、具有杂乱序列的RNAi试剂或具有错配的RNAi试剂。短语“基因沉默”是指通过细胞中内源目标基因的靶向抑制的部分或完全的功能损失(loss-of-function)。因此，该术语可以与目标基因表达的RNAi、“敲低”、“抑制”、“下调”或“减少”互换使用。

为了确定抑制程度，测试样品(例如，来自表达一种或多种目标基因或一种或多种目标序列的感兴趣的生物体的生物样品或表达目标基因/序列的培养物中的细胞样品)可以与沉默、降低或抑制目标基因或序列的表达的RNAi分子接触。将测试样品中目标基因/序列的表达和不与RNAi分子接触的对照样品(例如，来自表达目标基因或序列的感兴趣的生物体的生物样品或表达目标基因/序列的培养物中的细胞样品)中目标基因/序列的表达进行比较。对照样品(即，表达目标基因/序列的样品)被分配为100％的值。当测试样品相对于对照样品的值为约95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、或10%时，实现了目标基因/序列的表达的沉默、抑制或降低。合适的测定包括，例如，使用本领域技术人员已知的技术检查蛋白或mRNA水平，所述技术如本领域技术人员已知的斑点印迹、Northern印迹、原位杂交、ELISA、微阵列杂交、免疫沉淀、酶功能以及表型测定。

短语 “改善的RNAi活性”一般是指在体外和/或体内测量的RNAi活性的增加，其中RNAi活性是RNAi试剂介导RNAi的能力和/或RNAi试剂的稳定性的反映。

如本文所使用的，术语“调节”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指当基因表达、或一种或多种RNA分子(编码或非编码的)的水平、或一种或多种RNA分子或蛋白或蛋白亚基的活性得到上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在不存在影响调节的分子的情况下观察到的那种。例如，在一些实施方案中，术语“调节”可以是指例如基因表达的抑制，在其他实施方案中，可以是指例如基因表达的增强作用或上调。

术语“RNAi试剂”或“RNAi分子”是指能够通过以序列特异性的方式介导RNA干扰(“RNAi”)或基因沉默抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。RNAi试剂可以是包含自我互补的有义(过客)和反义(引导)链的双链核酸分子，其中所述反义链包含与目标核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，并且所述有义链包含对应于目标核酸序列或其部分的核苷酸序列。RNAi试剂可以是单链多核苷酸。虽然不希望被理论所束缚，RNAi试剂可以通过多种机制中的一种或多种起作用，包括目标mRNA的转录后裂解，或转录前或翻译前机制。

术语“单链RNAi”或“ssRNAi”试剂或分子是RNAi试剂，所述RNAi试剂是单链的源自核酸的分子，其具有与目标核酸分子中的核苷酸序列或其部分部分、基本上或完全互补的核苷酸序列。不存在与单链RNAi试剂形成碱基对的第二核苷酸序列。单链RNAi分子还可以包含位于一个或两个末端的末端磷酸酯基团，如5'-磷酸酯或5',3'-二磷酸酯。ssRNAi分子/试剂可以包括miRNA或miRNA模拟物。本发明的单链RNAi试剂可以装载至RISC或以其他方式与RISC结合，并经由RNAi机制参与基因沉默。本发明的单链RNAi分子可以包含取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。本发明的单链RNAi分子可以包含一个或多个或所有的核糖核苷酸。本发明的某些实施方案包括单链RNAi分子，所述单链RNAi分子包含骨架、糖、碱基或核苷中的取代或修饰。

术语“miRNA”或“微RNA”根据其在本领域中的通常意义在本文中使用，是指在多种真核生物包括哺乳动物中表达并参与基于RNA的基因调控的小的、非蛋白编码RNA分子。成熟的完全加工的miRNA是约15至约30个核苷酸长度。一组代表性的已知的内源性miRNA种类描述于公共可获得的miRBase序列数据库，描述于Griffith-Jones等人, Nucleic Acids Research, 2004, 32:D109-D111和Griffith-Jones等人, Nucleic Acids Research, 2006, 34:D 140-D144，以及在Wellcome Trust Sanger Institute网站的万维网上可访问。在miRBase序列数据库上可公开获得的成熟的完全加工的miRNA通过引用并入本文。一组代表性的miRNA也包括在本文下面的表1中。每个成熟miRNA与一种或多种信使RNA(mRNA)分子部分互补，所述信使RNA是该miRNA的目标，从而调节与目标相关的基因的表达。

如本文所使用的，术语“miRNA模拟物”是指单链RNA分子，所述单链RNA分子是细胞中天然存在的miRNA的模拟物。通常基于相应的内源性miRNA设计miRNA模拟物。miRNA模拟物能够调节目标mRNA的表达，所述目标mRNA的表达也受相应的天然存在的miRNA的调控。也是miRNA模拟物的本发明的单链RNAi分子可以装载至RISC或以其他方式与RISC结合，并经由RNAi机制参与基因沉默。本发明的miRNA模拟物可以包含取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。本发明的miRNA模拟物可以包含一种或多种或所有核糖核苷酸。本发明的某些实施方案包括miRNA模拟物，所述miRNA模拟物包含骨架、糖、碱基或核苷中的取代或修饰。细胞中天然存在的miRNA在本文被称为“相应的miRNA”、“内源性miRNA”或“天然存在的miRNA”。提供给细胞的本发明的单链miRNA模拟物也被理解为靶向也被相应的天然存在的miRNA所靶向的一种或多种目标mRNA。可以设想，引入细胞的本发明的miRNA模拟物能够在适当条件下作为天然存在的miRNA起作用。

如本文所使用的，术语“种子区域”(本文中也称为“种子序列”)是指其如本领域公认的意义。该术语通常是指天然存在的成熟miRNA的5'-末端的核苷酸位置1至10内的至少6个连续核苷酸，如选自自本申请申请日起在公开获得的miRBase序列数据库(http://www.mirbase.org/)中列举的那些的miRNA和/或选自表1中列出的那些的miRNA。在表1的序列中1到8位的种子序列核苷酸用大写表示。在天然存在的miRNA中，种子区域通常确定miRNA可以结合和提供基因调控的目标mRNA序列。因此，多个天然存在的miRNA可以共有种子区域或在种子区域中共有基本上的同源性，这些miRNA是相同miRNA家族的成员。

术语“siRNA”(也是“短干扰RNA”或“小干扰RNA”)给出其本领域中接受的通常含义，一般是指互补RNA寡核苷酸的双链体(有义和反义链)，其可能包含或可能不包含约1至约4个核苷酸的3'突出端，并介导RNA干扰。

如本文所使用的，术语“siRNA模拟物”或“单链siRNA模拟物”是指单链RNAi分子，所述单链RNAi分子是相应siRNA(单链或双链的)的引导或反义链的模拟物。siRNA模拟物能够调节也受相应siRNA调节的目标RNA的表达，因此，可以装载进RISC或以其他方式与RISC结合，并经由RNAi机制参与基因沉默。本发明的单链siRNA模拟物可以包含取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。本发明的siRNA模拟物可以包含一种或多种或所有核糖核苷酸。本发明的某些实施方案包括siRNA模拟物，所述siRNA模拟物包含骨架、糖、碱基或核苷中的取代或修饰。

如本文所使用的，术语“基因”，尤其在对于RNAi试剂的“目标基因”的上下文中，是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指包含对于多肽生产必需的部分长度或整个长度的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。目标基因还可以包括核酸序列的UTR (即，非翻译区) 或非编码区。基因或目标基因还可以编码功能RNA(fRNA)或非编码RNA(ncRNA)，例如小时序RNA(stRNA)、微RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、核仁小RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)及其前体RNAs。此种非编码RNAs可以充当在调节涉及功能或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性中RNA干扰的目标核酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可以通过本发明的RNAi试剂进行调节。靶向fRNA和ncRNA的RNAi试剂也可以用于操作或改变受试者、生物或细胞的基因型或表型，其通过干预细胞过程例如遗传印记、转录、翻译或核酸加工(例如，转氨基作用、甲基化等)实现。目标基因可以是衍生自细胞、内源基因、转基因或外源基因的基因，所述外源基因例如在感染其后存在于细胞中的病原体例如病毒的基因。包含目标基因的细胞可以衍生自或包含在任何生物中，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限制性实例包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限制性实例包括脊椎动物或无脊椎动物。真菌的非限制性实例包括霉菌或酵母。关于综述，参见例如Snyder和Gerstein，2003，Science，300：258-260。

如本文所使用的，短语“目标位点”、“目标序列”和“目标区域”是指其如本领域公认的意义。该术语通常是指被“靶向”的目标核酸分子(例如，mRNA)内的序列，例如对于RNAi分子(所述RNAi分子在其引导/反义区域中包含与该目标序列部分、基本上或完全互补的序列)介导的裂解。对于本发明的单链RNAi分子的“目标位点”是指与单链RNAi试剂部分、基本上或完全互补的核酸序列。目标位点可以在目标RNA的编码或非编码(即，非翻译)区域内。目标位点可以是对于内源性miRNA的目标位点，对于内源性miRNA而言，单链RNAi分子是模拟物，在这种情况下，“目标位点”也可以被称为“miRNA目标位点”或“相应的miRNA目标位点”。

如本文所使用的，短语“有义区”是指其如本领域公认的意义。该术语是指与RNAi分子的反义区具有互补性的RNAi分子的核苷酸序列。此外，RNAi分子的有义区可以包含与目标核酸序列具有同源性或序列同一性的核酸序列。RNAi分子的有义区也被称为有义链或过客链(the passenger strand)。

如本文所使用的，短语“反义区”是指其如本领域公认的意义。该术语是指与目标核酸序列具有互补性的RNAi分子的核苷酸序列。此外，RNAi分子的反义区可以任选包含与RNAi分子的有义区具有互补性的核酸序列。RNAi分子的反义区也被称为反义链或引导链。

如本文所使用的，术语“间隔子”是指能够连接两个核苷酸和/或非核苷酸取代部分的任何一种或多种化学基团。如本发明中所使用的，术语“间隔子”可以通过常规磷酸二酯键或非磷酸二酯连接子连接两个核苷酸和/或非核苷酸取代部分。间隔子通常是有机实体，所述有机实体共价结合至每个核苷酸或非核苷酸取代物，并且不同于形成骨架的核苷酸间键(即，形成互补杂合体的核碱基)。

如本文所使用的，术语“烷基”意在包括具有指定数量碳原子的饱和脂族烃基，分枝的和直链的。术语“烷基”还指非芳族环烷基。优选地，烷基具有1-12个碳(即，C1-C20)。例如，如“C1-C10烷基”中的C1-C10被定义为包括具有直链的、分枝的或环状排列(即环烷基)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳的基团。术语“环烷基”是指具有指定数量碳原子的单环饱和的脂族烃基。例如，“烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等等，以及环烷基，包括环丙基、甲基-环丙基、2,2-二甲基-环丁基、2-乙基-环戊基、环己基等等。如果指明，烷基可以是取代的。

如本文所使用的，术语“烯基”是指含有2个或更多个碳原子和至少1个碳-碳双键的直链或支链的非芳族烃基。术语“烯基”也是指非芳族环烯基。优选地，烯基具有1个 - 20个碳(即，C1-C20)。烯基包括，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。烯基可以含有双键，并且，如果指明，可以是取代的。

如本文所使用的，术语“炔基”是指含有2个或更多个碳原子和至少1个碳-碳三键的直链或支链的非芳族烃基。术语“炔基”也是指非芳族环炔基。可能存在最多达3个碳-碳三键。优选地，炔基具有1个 - 20个碳(即，C1-C20)。炔基包括，例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基和环辛炔基(cyclooctynl)。炔基可以含有三键，并且，如果指明，可以是取代的。

如本文所使用的，关于化学基团的术语“脂族的”是指不含有芳族环的碳和氢构成的有机基团。脂族结构可以是环状的和/或饱和的。在直链、支链或非芳族环中，碳原子可以连接在一起。它们也可以通过单键(烷烃)、双键(烯烃)或三键(炔烃)连接。除了氢，其他元素可以连接至碳链或取代链内的碳，最常见的是氧、氮、硫和氯。

如本文所使用的，关于化学基团的术语“芳族的”含有一组共价结合的原子的有机基团，其具有下列特定特征：(1)离域共轭的π系统，最常见的是单键和双键交替的排列；(2)共面结构，所有起作用的原子在相同平面；(3)起作用的原子排列在一个或多个环中；和(4)离域π电子的数量甚至是4，但不是4的倍数。芳族结构可以仅仅由烃类(例如，芳基)构成。其他元素可以连接至芳族结构的碳或取代芳族结构的碳，最常见的是氧、氮、硫和氯(例如，杂芳基、取代的芳基、取代的杂芳基)。

如本文所使用的，关于脂族或芳族有机结构(例如，烷基、烯基、炔基、芳基)的术语“取代的”是指与碳链结合的额外的化学部分和/或官能团的存在。例如，取代的烃链可以包括具有与之结合的杂原子(例如，N、O或S)的烃链。取代的烃链也可以包括被杂原子中断的烃链。当取代时，一个或多个取代的基团优选是羟基、卤素、氰基、C1-C4烷氧基、=O、=S、NO₂、SH、NH₂或NR₁R₂，其中R₁和R₂独立地为H或C₁-C₄烷基。取代的烷基包括环氧乙烷的寡聚物或聚合物，包括但不限于聚乙二醇(“PEG”)。

术语“非核苷酸”或“非核酸”是指不是核苷酸的任何化学分子、部分、基团或化合物。

如本文所使用的，术语“取代非核苷酸部分”(或“非核苷酸取代部分”)是指能够取代本发明的单链RNAi分子中一个或多个核苷酸的化学部分。取代非核苷酸部分通常是允许非常规碱基配对(即，没有形成常规氢键)的那些。在某些实施方案中，本发明的取代非核苷酸部分是能够与细胞RNAi机制的一个或多个组分结合或以其他方式与之相互作用的那些，包括，例如，PAZ结构域、PIWI结构域和/或与RISC相关的其他Argonaute蛋白结构域。

在本文的某些实施方案中，术语“合成的”是指不是在细胞中天然产生的核酸分子。本发明的单链RNAi分子通常是合成的。

在某些实施方案中，可以分离本发明的单链RNAi分子。如本文所使用的，关于寡核苷酸的术语“分离的”一般是指以不同于自然界中发现的相同序列的任何核酸分子的物理形式存在的核酸分子。“分离的”并不需要，尽管它并没有禁止，核酸分子从其自然环境物理分离。例如，当核酸包括自然界中未发现的核苷酸和/或核苷间键时，它可以被说成是“分离的”。当核酸以自然中未发现的纯度存在(其中可以就其他序列的核酸的存在而言、就蛋白的存在而言、就脂质的存在而言或就生物细胞的任何其他组分而言判断纯度)时，或当该核酸缺乏在生物体中否则相同的序列侧翼的序列时，或当该核酸具有不相同地存在于自然中的序列时，该核酸被说成是“分离的”。可以凭借其已在体外合成而分离本发明的单链RNAi分子。然而，将被理解的是，分离的核酸可以随后混合或合并在一起。

如本文所使用的，“内源的”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般是指来自生物体、细胞、组织或系统或其内部产生的任何材料。如本文所使用的，“内源的miRNA”是细胞、组织、生物体包括哺乳动物如例如人中天然存在的miRNA。“外源的”一般是指引出自生物体、细胞、组织或系统或其外部产生的任何材料。

如本文所使用的，术语“表达”是指其如本领域一般接受的意义。该术语一般被定义为特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。

在一些实施方案中，知道细胞是否内源表达特定miRNA或这样的表达在特定条件下是否被影响或其何时在特定疾病状态中可以是有用的。因此，在本发明的一些实施方案中，方法包括测定细胞或包含细胞的样品中指示目的基因的表达水平的一种或多种标记基因或mRNA或其他分析物的存在。因此，在一些实施方案中，方法包括对于样品生成RNA特征的步骤。术语“RNA特征”或“基因表达特征”是指关于样品中一种或多种基因或遗传标记(例如，鉴定一种或多种标记的多种核酸探针)的表达模式的一组数据。

“能够”是指，当通过合适的体内或体外测定或方法测量RNAi活性时，与在没有一种或多种内部非核苷酸间隔子部分的相应单链RNAi分子实现的敲低效果相比，本发明的单链RNAi分子显示针对目标序列的至少5％或5％以上的敲低效果。优选地，与针对相同目标的相应RNAi分子(例如，天然存在的miRNA或以前鉴定的siRNA引导链)相比，本发明的单链RNAi分子能够实现25％或更多，35％或更多，50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，99％或更多，或甚至100％或更多(即，相等或更强有力的RNAi活性)的目标的敲低。

“载体”是复制子，如质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其他细菌、酵母或病毒载体，其中可以可操作地插入另一种核酸片段以带来插入片段的复制或表达。“表达载体”是指包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列的载体。表达载体包含用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中已知的所有表达载体，如粘粒，质粒(例如，裸的或包含在脂质体中的)，和病毒(如，慢病毒载体、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所使用的，“组合物”或“制剂”是指其如本领域公认的意义。这些术语一般是指以适合于施用，例如全身或局部施用到细胞或受试者内的形式的组合物或制剂如在药学可接受的载体或稀释剂中的组合物或制剂，所述受试者包括例如人。合适的形式部分依赖用途或进入途径，例如经口、经皮、吸入或通过注射。此类形式不应阻止组合物或制剂达到目标细胞(即，需要给其递送带负电荷核酸的细胞)。例如，注射到血流内的组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，且包括考虑因素，如阻止组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。如本文所使用的，药物制剂包括用于人和兽医学用途的制剂。适合于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性实例包括：脂质纳米颗粒(参见例如Semple等人, 2010, Nat Biotechnol. 28(2):172-6.)；P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)；生物可降解聚合物，例如用于持续释放递送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物小球体(Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58)；和装载的纳米颗粒，例如由聚丁基氰基丙烯酸酯制成的那些。关于本发明的核酸分子的递送策略的其他非限制性实例包括在下述参考文献中描述的材料：Boado等人，1998，J. Pharm. Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv. Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS，96，7053-7058。“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的制剂”指允许本发明的核酸分子有效分布于最适合于其所需活性的身体位置中的组合物或制剂。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中互换使用，并且是指无论在体外或在原位适于本文所述方法的任何动物或其细胞或组织。它们通常是指是本发明的单链RNA分子的供体或受体的生物体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是哺乳动物或哺乳动物细胞。在其他非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或人细胞。

如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指足以导致在待施用的受试者(例如，哺乳动物或人)中疾病症状的严重度降低、无疾病症状期间的频率或持续时间增加或由于疾病导致的损伤或残疾的预防的本发明的单链RNAi分子的量。本领域普通技术人员可以基于这样的因素如受试者的大小、症状的严重度和选择的特定组合物或施用途径确定这样的治疗有效量。例如，可以在适于治疗以，例如，在受试者中降低肿瘤大小或以其他方式改善与特定病症相关的症状的条件下以对受试者的治疗有效量或通过施用于特定细胞而单独地、组合地或与其他药物一起使用或施用治疗有效量的本发明的单链RNAi分子。

如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗和/或预防。通过疾病状态的抑制、缓解或消除而获得治疗效果。如本文所使用的，术语“治疗”是指包括疾病或病症的治疗性处理以及预防或抑制措施。因此，例如，术语“治疗”包括在疾病或病症开始之前或之后施用试剂从而防止或消除疾病或病症的所有迹象。作为另一个实例，术语“治疗”还包括在疾病的临床表现后使用试剂以打击疾病的症状。

如本文所使用的，术语“肠胃外”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指以除通过消化道外的方式施用分子、药物、试剂或化合物的方法或技术，并且包括表皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌内、或鞘内注射或输注技术等。

如本文所使用的，短语“全身施用”是指其如本领域公认的意义。该术语一般是指药物在血流中的体内全身性吸收或积累随后分布遍及整个身体。

本发明的其他目的、特征和优点从下列详细描述将变得显而易见。然而，应该理解的是，该详细描述和特定实施例，尽管指明了本发明的特定实施方案，仅仅只是以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和改变对于本领域技术人员而言从下列详细描述将是显而易见的。

B. 本发明的单链RNAi分子

本发明提供了单链RNA分子，其包含至少一个将分子的两个核苷酸部分连接在一起的内部非核苷酸间隔子。因此，本发明的单链RNA分子不是一段连续的核苷酸，但是包含多于一个被一个或多个非核苷酸间隔子分开的核苷酸部分，其中所述核苷酸部分包含一个或多个核苷酸、非核苷酸替代部分，或其组合。本发明的单链RNAi分子起引导或反义链的作用，所述引导或反义链能够通过RNA干扰机制抑制基因表达，因此，代表RNAi试剂。本发明的单链RNAi分子包含与细胞中的一个或多个RNA目标位点部分、基本上或完全互补的序列。

本发明的单链RNAi分子具有单链寡核苷酸结构，包含(a)被分为两个或更多个核苷酸部分的核酸部分，和(b)内部(与“末端”相比)间隔子部分，其包含至少一个非核苷酸间隔子部分，其中一个或多个非核苷酸间隔子部分共价连接两个核苷酸，所述核苷酸每一个在分子的不同核苷酸部分中。本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分被非核苷酸间隔子部分分开，其中每个核苷酸部分包含至少一个核苷酸。

在本发明的每一个实施方案中，单链RNAi分子的核酸部分包含至少两个核苷酸部分，第一核苷酸部分(N1)(例如，5'-核苷酸部分)和第二核苷酸部分(N2) (例如，3'-核苷酸部分)。本发明的单链RNAi分子的核酸部分可以包含多于两个核苷酸部分(例如，第三核苷酸部分(N3)，第四核苷酸部分(N4)等)。在本发明的RNAi分子的每个核苷酸部分中，核苷酸和/或非核苷酸部分由磷酸二酯键和/或非磷酸二酯连接子连接。重要的是，本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分不是彼此互补的，因此，所述部分不形成明显的碱基配对。

在本发明的每一个实施方案中，单链RNAi分子的内部间隔子部分包含至少一个非核苷酸间隔子部分(S1)，本文被称为第一非核苷酸间隔子部分。在本发明的一个实施方案中，单链RNAi分子包含一个内部非核苷酸间隔子部分。本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分可以包含多于一个第一非核苷酸间隔子部分(例如，第二非核苷酸间隔子部分(S2)，第三非核苷酸间隔子部分(S3)等)。在另一个实施方案中，单链RNAi分子包含两个内部非核苷酸间隔子部分。

本发明的单链RNAi分子的核酸部分内的核苷酸部分的数量取决于所述分子内非核苷酸间隔子部分的数量，且反之亦然。例如，如果单链RNAi分子包含两个非核苷酸间隔子部分，它通常包含如下三个核苷酸部分：5'-(第一核苷酸部分)-(第一非核苷酸间隔子部分)-(第二核苷酸部分)-(第二非核苷酸间隔子部分)-(第三核苷酸部分)-3'。本发明的单链RNAi分子的每个非核苷酸间隔子部分可以包含一个或多个非核苷酸间隔子。

本发明的单链RNAi分子具有单链寡核苷酸结构，并且介导针对目标RNA的RNA干扰。本发明的单链RNAi分子可以包含：(a)核酸部分，包含第一核苷酸部分(N1)和第二核苷酸部分(N2)，并且其中所述核酸部分包含可与目标RNA内的目标位点碱基配对的至少8个核苷酸，其中核酸部分内的核苷酸总数为8-26个核苷酸；和，(b)内部间隔子部分，包含至少一个第一非核苷酸间隔子部分(S1)，所述第一非核苷酸间隔子部分(S1)共价连接第一和第二核苷酸部分。第一和第二核苷酸部不是自我互补的。本发明的单链RNA分子的所有核苷酸(例如，8-26个)，全部位于核酸部分内，分布在分子的核苷酸部分之间，其中每个核苷酸部分包含至少一个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子包含分布在寡核苷酸的核苷酸部分之间的核酸部分，所述核酸部分包含总共8-26个核苷酸或非核苷酸替代部分(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个核苷酸或非核苷酸替代部分)，其中分子中的核苷酸的至少8个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个)可以与目标RNA内的目标位点碱基配对。例如，本发明的单链RNAi分子可以包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个总核苷酸，其中那些核苷酸中的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个与目标RNA碱基配对。在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含总共15-21个(例如，15、16、17、18、19、20、或21个)核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含总共18-20个(例如，18、19、或20个)核苷酸。在进一步的实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含总共19或20个核苷酸。

构成本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分的核苷酸或非核苷酸部分或其组合的总数以任何数量的方式分布在分子的那些部分之间。作为实例，包含仅一个非核苷酸间隔子部分和两个核苷酸部分(即，第一核苷酸部分和第二核苷酸部分)的单链RNAi分子可具有总共12个核苷酸。如果分子的第一核苷酸部分包含单一核苷酸(例如，在分子的5'-末端)，分子的第二核苷酸部分将包含11个连续核苷酸。或者，如果分子的第一核苷酸部分包含5个连续核苷酸，分子的第二核苷酸部分将包含7个连续核苷酸。在每个实例中，分子中核苷酸总数为12。本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分内的核苷酸不是彼此互补的，因此，所述部分不可以形成明显的碱基配对。在分子的每个核苷酸部分内，核苷酸和/或非核苷酸部分由磷酸二酯键和/或非磷酸二酯连接子连接。

本发明的单链RNAi分子的核酸部分内至少8个核苷酸可以与目标RNA内的目标序列碱基配对。因此，本发明的单链RNAi分子包含连续核苷酸的序列，所述序列与RNA目标位点(包括天然存在的RNA目标位点)部分、基本上或完全互补。在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分内的所有连续核苷酸与目标RNA内的目标序列碱基配对(即，完全互补)。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分内的至少50%的连续核苷酸与目标RNA内的目标序列碱基配对(即，基本上互补)。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分内8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个核苷酸与目标RNA内的目标序列碱基配对。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子具有单链寡核苷酸结构，其包含：(a)两个核苷酸部分，第一核苷酸部分(N1)和第二核苷酸部分(N2)；和(b)一个内部非核苷酸间隔子部分(S1)；其中所述寡核苷酸包含总共8-26个核苷酸或非核苷酸替代部分(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个核苷酸或非核苷酸替代部分)；并且其中分子的至少8个核苷酸可以与目标RNA内的目标位点碱基配对。该实施方案的单链RNAi分子的两个核苷酸部分总共包含8-26个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个)核苷酸或非核苷酸部分或其组合，其以任何数量的方式(如上所述)分布在两个核苷酸部分之间。在一个实施方案中，非核苷酸间隔子部分包含一个非核苷酸间隔子。在另一个实施方案中，非核苷酸间隔子部分包含多于一个非核苷酸间隔子(例如，2、3、4或更多个)。间隔子部分连接单链RNAi分子的第一和第二核苷酸部分。因此，间隔子部分共价连接至分子的第一核苷酸部分的3'-末端核苷酸或非核苷酸替代部分和分子的第二核苷酸部分的5'-末端核苷酸或非核苷酸替代部分。通过常规磷酸二酯键或非磷酸二酯连接子，分子的间隔子部分可以共价连接至核苷酸部分的磷酸酯骨架(即，通过两个连接的核苷酸的游离磷酸酯)。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子包含与天然存在的miRNA的引导链部分、基本上或完全同源的连续核苷酸序列，因此起miRNA模拟物的作用。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子包含与单链siRNA或双链体siRNA的引导/反义链部分、基本上或完全同源的连续核苷酸序列，因此起siRNA模拟物的作用。可以已知单链siRNA或双链体siRNA通过RNAi机制抑制基因表达。

如果本发明的单链RNAi分子是天然存在的miRNA的类似物，所述天然存在的miRNA在本文被称为“对应的miRNA”，所述单链RNAi分子代表对应的miRNA的模拟物。本发明的单链miRNA模拟物基于对应的天然存在的miRNA设计，其中至少一个非核苷酸间隔子部分或插入miRNA引导链序列的两个核苷酸之间，或将其取代miRNA引导链序列的一个或多个核苷酸。本发明的单链miRNA模拟物可以是在miRBase数据库中的公开获得的和/或下文表1(SEQ ID NO:1-1090)内包括的成熟miRNA序列的模拟物。

在一个实施方案中，本文所述的单链RNAi分子代表miRNA模拟物，其中所述RNAi分子包含两个或更多个核苷酸部分的核酸部分和包含至少一个非核苷酸间隔子部分的内部间隔子部分。如上所述，如果分子的核酸部分仅包含两个核苷酸部分(即，第一核苷酸部分和第二核苷酸部分)，将仅存在一个非核苷酸间隔子部分。如果分子的核酸部分包含三个核苷酸部分，将存在两个非核苷酸间隔子部分。每个非核苷酸间隔子部分可以包含多于一个非核苷酸间隔子(例如，2、3、4或更多个)。在一个实施方案中，本发明的miRNA模拟物的核酸部分由8-26个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个)核苷酸或非核苷酸部分或其组合组成，其中所述核苷酸中至少8个可以与天然存在的miRNA目标位点碱基配对。本发明的miRNA模拟物的核酸部分内连续的核苷酸序列与天然存在的miRNA引导链核苷酸序列部分、基本上或完全同源。在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分内连续的核苷酸序列包含5-8个(即，5、6、7或8个)连续的核苷酸，所述连续的核苷酸与天然存在的miRNA的种子序列的全部或部分是相同的(或完全同源的)。例如，在一个实施方案中，单链RNAi分子的核苷酸部分内的8个连续的核苷酸序列与天然存在的miRNA(见下文表Ⅰ)的种子区域的全部或部分是相同的。

在一个实施方案中，本发明的miRNA模拟物具有一个非核苷酸间隔子部分和两个核苷酸部分，其中所述非核苷酸间隔子部分插入对应的天然存在的miRNA序列的两个核苷酸之间，将全长的天然存在的miRNA分为两个不同的核苷酸部分。在另一个实施方案中，多于一个非核苷酸间隔子部分存在于本发明的miRNA模拟物中，使得miRNA模拟物的核酸部分被分为多于两个核苷酸部分。在这种情况下，miRNA模拟物的总的核苷酸序列与对应的天然存在的miRNA核苷酸序列是完全同源的。天然存在的miRNA和本实施方案中的miRNA模拟物之间的差异是非核苷酸间隔子部分的存在。

在另一个实施方案中，本发明的miRNA模拟物包含替代天然存在的miRNA的引导链序列的一个或多个核苷酸的非核苷酸间隔子部分。例如，可以首先从天然存在的miRNA的引导链序列缺失一个或多个核苷酸，在序列中留下缺口并产生至少两个不同的核苷酸部分。然后将非核苷酸间隔子部分插入缺口，共价连接不同的核苷酸部分。因此，在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子代表miRNA模拟物，其中一个或多个内部非核苷酸间隔子部分代替了对应的天然存在的miRNA序列(参见SEQ ID NO:1-1090)的1-12个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个)核苷酸。miRNA模拟物可以包含多于一个非核苷酸间隔子部分。在一个实施方案中，本发明的单链miRNA模拟物包含替代天然存在的miRNA核苷酸序列的1-4个(例如，1、2、3、或4个)核苷酸的至少一个非核苷酸间隔子部分。在另一个实施方案中，本发明的单链miRNA模拟物包含替代对应的miRNA核苷酸序列的1或2个核苷酸的至少一个内部非核苷酸间隔子部分。非核苷酸间隔子部分桥联由从miRNA引导链序列去除一个或多个核苷酸而导致的缺口，通过常规磷酸二酯键或非磷酸二酯连接子连接至分子的核苷酸部分的磷酸酯骨架。

本发明的单链RNAi分子也可以代表双链体或单链siRNA的引导或反义链的类似物。可以已知双链体或单链siRNA通过RNAi机制抑制目标基因表达或具有抑制目标基因表达的潜能。在这样的情况下，siRNA对应物，和具体地siRNA的引导链(无论单链或双链的)，在本文中被称为“对应的siRNA”或“对应的siRNA引导链”，和单链RNAi分子代表对应的siRNA引导链的模拟物(即，“单链siRNA模拟物”)。单链siRNA模拟物基于对应的siRNA的核苷酸序列而设计，其通过在对应的siRNA核苷酸序列的核苷酸序列内插入一个或多个内部非核苷酸间隔子部分，或用一个或多个非核苷酸间隔子部分取代对应的siRNA核苷酸序列的一个或多个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子代表siRNA模拟物，其中单链RNAi分子的核酸部分包含两个或更多个核苷酸部分，内部间隔子部分包含至少一个非核苷酸间隔子部分。如上所述，如果RNAi分子的核酸部分仅包含两个核苷酸部分(即，第一核苷酸部分和第二核苷酸部分)，将仅存在一个非核苷酸间隔子部分。如果RNAi分子的核酸部分包含三个核苷酸部分，将存在两个非核苷酸间隔子部分。非核苷酸间隔子部分可以包含多于一个非核苷酸间隔子(例如，2、3、4或更多个)。在一个实施方案中，siRNA模拟物的核酸部分由8-26个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个)核苷酸或非核苷酸部分或其组合组成，其中所述核苷酸中的至少8个可以与RNA目标位点碱基配对。本发明的siRNA模拟物的核酸部分包含连续的核苷酸序列，所述连续的核苷酸序列与对应的siRNA引导链核苷酸序列部分、基本上或完全同源。

在一个实施方案中，本发明的siRNA模拟物具有一个非核苷酸间隔子部分和两个核苷酸部分，其中所述非核苷酸间隔子部分插入对应的siRNA核苷酸序列的两个相邻核苷酸之间，将对应的siRNA核苷酸序列分为两个不同的核苷酸部分。在另一个实施方案中，本发明的siRNA模拟物可以具有多于一个非核苷酸间隔子部分，使得对应的siRNA核苷酸序列被分为多于两个核苷酸部分。在这种情况下，siRNA模拟物的总的核苷酸序列与对应的siRNA核苷酸序列是完全同源的。对应的siRNA和本实施方案的miRNA模拟物之间的差异是一个或多个非核苷酸间隔子区域的存在。

在另一个实施方案中，本发明的siRNA模拟物包含替代对应的siRNA的引导链核苷酸序列的一个或多个核苷酸的一个或多个非核苷酸间隔子部分。例如，可以首先从对应的siRNA的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸，在序列中留下缺口并产生至少两个不同的核苷酸部分。然后将非核苷酸间隔子部分插入缺口以连接不同的核苷酸部分。因此，在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子代表包含至少一个内部非核苷酸间隔子部分的siRNA模拟物，其中所述非核苷酸间隔子部分替代对应的siRNA核苷酸序列的1-4个(例如，1、2、3、或4个)核苷酸。siRNA模拟物可以包含多于一个非核苷酸间隔子部分。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子代表包含至少一个内部非核苷酸间隔子部分的siRNA模拟物，其中所述非核苷酸间隔子部分替代对应的siRNA核苷酸序列的1或2个核苷酸。一个或多个非核苷酸间隔子部分桥联由从siRNA引导链序列去除一个或多个核苷酸而导致的缺口，通过常规磷酸二酯键或非磷酸二酯连接子连接至分子的核苷酸部分的磷酸酯骨架。

在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以从头设计，用于敲低(knocking down)特定目标RNA(包括天然存在的RNA目标)的表达。在这种情况下，首先选择目标基因。然后本领域技术人员鉴别所述基因的部分(即，目标位点)(一般约8-约26个核苷酸长度)来针对单链RNAi分子而用于基因沉默。在本发明的一个实施方案中，本文所述的单链RNAi分子的核酸部分内的连续的核苷酸序列与鉴别的目标位点序列部分、基本上或完全互补，并且与对应的目标位点序列的互补序列是部分、基本上或完全同源的。在这种情况下的单链RNAi分子的对应序列(即，作为目标位点序列的互补序列的核苷酸序列)在本文中被称为“对应的目标位点序列的互补序列”。如上述一个或多个实施方案中所述，单链RNAi分子包含两个或更多个核苷酸部分和至少一个内部非核苷酸间隔子部分。

本发明的单链RNAi分子能够产生RNA干扰结果。在本发明的单链miRNA模拟物的情况下，所述分子能够调节目标mRNA的表达，所述目标mRNA的表达也受对应的天然存在的miRNA的调控。

本发明的单链RNAi分子还可以包含位于一个或两个末端的末端磷酸酯基团，如5'-磷酸酯或5',3'-二磷酸酯。在一些实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以包含取代、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些其他实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以包含一个或多个或所有的核糖核苷酸。本发明的某些实施方案包括单链RNAi分子，所述单链RNAi分子包含骨架、糖、碱基或核苷中的取代或修饰。

本发明的单链RNAi分子的一个或多个内部非核苷酸间隔子部分，特别是在其中产生的RNAi分子中的核苷酸的总数相比于单链RNAi分子是类似物的对应RNAi试剂(例如，天然存在的miRNA；具有基因敲低能力的siRNA的引导链)降低的情况下，降低了单链RNAi分子对核酸内切酶的敏感性。一个或多个内部非核苷酸间隔子部分也可以限制核酸外切酶的损伤，最终帮助保存单链RNAi试剂的完整性。间隔子部分也代表用于将一个或多个感兴趣的部分连接至RNAi分子的容易接近的区域(例如，帮助细胞递送的化学部分)。因此，即使与没有间隔子部分的对应的单链RNAi分子(例如，天然存在的miRNA；以前鉴别的具有基因敲低能力的siRNA的引导链)相比本发明的单链RNAi分子的活性有所降低(例如，降低低于约20％，或30％，或甚至40％)，由于分子的改进的稳定性或递送，类似物的总的活性可以高于其对应物的总的活性。此外，由于较短的RNA链合成的产率通常更高，使用本发明的单链RNAi分子也可以显著降低与治疗性应用相关的大规模合成的成本。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以通过式III代表或表示：

5'  N1 – S1 – N2  3'

其中N1，代表第一核苷酸部分，由一个核苷酸或一段连续的核苷酸组成；S1，代表非核苷酸间隔子部分，由一个或多??个非核苷酸间隔子组成；和N2，代表第二核苷酸部分，由一个核苷酸或一段连续的核苷酸组成。N1和N2中的核苷酸总数为8-26个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个)核苷酸，所述分子中的至少8个核苷酸可以与目标RNA内的目标位点碱基配对。N1和N2 内的“一个或多个核苷酸”是核苷酸、修饰的核苷酸、核苷酸类似物、或非核苷酸替代部分，或其组合。在一个实施方案中，单独地，N1和N2可以由1-25个核苷酸组成，其中N1和N2的总和为8-26个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个)核苷酸。N1和N2不是自我互补的，因此，不能参与相互显著的碱基配对。在分子的一段连续的核苷酸内，核苷酸由磷酸二酯键和/或非磷酸二酯连接子连接。间隔子部分(S1)共价连接至分子的第一核苷酸部分的3'-末端核苷酸(N1)和第二核苷酸部分的5'-末端核苷酸(N2)。例如，间隔子部分可以包含通过磷酸二酯键连接至相邻核苷酸的游离磷酸酯基团的一个或多个亚磷酰胺间隔子。分子的间隔子部分(S1)可以由一个单一的非核苷酸间隔子或连接在一起的多于一个非核苷酸间隔子组成。如果在分子的S1部分内有多于一个非核苷酸间隔子，所述间隔子可以是相同的(即，具有相同的结构)或不同的(即，具有不同的结构)。在其中两个非核苷酸间隔子连接在分子的S1部分内的情况下，每个间隔子分别共价连接至分子的N1和N2部分内的一个核苷酸。如果三个非核苷酸间隔子连续地连接在寡核苷酸的S1部分内，内部的(第二)间隔子不与分子的N1或N2部分形成共价键。相反，内部间隔子共价连接至第一和第三间隔子，将它们连接在一起。

在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以通过式IV代表或表示：

5'  N1 – S1 – N2 – S2– N3  3'

其中N1，代表第一核苷酸部分，由一个核苷酸或一段连续的核苷酸组成；S1，代表第一非核苷酸间隔子部分，由一个或多??个非核苷酸间隔子组成；N2，代表第二核苷酸部分，由一个核苷酸或一段连续的核苷酸组成；S2，代表第二非核苷酸内部间隔子部分，由一个或多??个非核苷酸间隔子组成；和N3，代表第三核苷酸部分，由一个核苷酸或一段连续的核苷酸组成。在一个实施方案中，N1、N2和N3中的核苷酸总数为8-约26个(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个)核苷酸，所述分子中的至少8个核苷酸可以与目标RNA内的目标位点碱基配对。N1、N2 和N3内的“一个或多个核苷酸”是核苷酸、修饰的核苷酸、核苷酸类似物、或非核苷酸替代部分、或其组合。在一个实施方案中，单独地，核苷酸部分(N1、N2、N3)可以由1-24个核苷酸组成，其中所述分子内的核苷酸总和为8-26个核苷酸。RNAi分子的核苷酸部分不是自我互补的，因此，不能参与相互显著的碱基配对。在每段连续的核苷酸内，核苷酸由磷酸二酯键和/或非磷酸二酯连接子连接。间隔子部分共价连接至分子的核苷酸部分的末端核苷酸。在一个实施方案中，间隔子部分包含通过磷酸二酯键连接至相邻核苷酸的游离磷酸酯基团的一个或多个亚磷酰胺间隔子。分子的每个间隔子部分可以由一个单一的非核苷酸间隔子或连接在一起的多于一个非核苷酸间隔子组成。如果在分子的间隔子部分内有多于一个非核苷酸间隔子，所述间隔子可以是相同的(即，具有相同的结构)或不同的(即，具有不同的结构)。当两个非核苷酸间隔子连接在分子的间隔子部分内时，每个间隔子共价连接至分子的相邻核苷酸部分内的末端核苷酸。如果三个非核苷酸间隔子连续地连接在分子的间隔子部分内，内部的(第二)间隔子不与分子的核苷酸部分形成共价键。相反，内部间隔子共价连接至第一和第三间隔子，将它们连接在一起。

在本发明的一个方面，本文所述的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分(例如，式III和/或IV中描述的N1、N2或N3)是一段连续的核苷酸，所述一段连续的核苷酸由1-20个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)核苷酸，5-20个(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)核苷酸，10-20个(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个)个核苷酸，13-20个(例如，13、14、15、16、17、18、19、或20个)核苷酸，5至15个核苷酸(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个)核苷酸，或1-14个(例如，1、2、3、4、5 、6、7、8、9、10、11、12、13、或14个)核苷酸组成。在另一个方面，本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分的长度选自18个连续核苷酸、19个连续核苷酸或20个连续核苷酸。在仍进一步的方面，本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分的长度选自13个连续核苷酸、14个连续核苷酸或15个连续核苷酸。本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分的长度可以是18个核苷酸。本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分的长度可以是19个核苷酸。本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分的长度可以是20个核苷酸。本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分的长度可以是21个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子由式Ⅲ代表，其中N1由18个连续核苷酸组成；S1由一个非核苷酸间隔子组成；和N2由2个连续的核苷酸组成。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子由式Ⅲ代表，其中N1由19个连续核苷酸组成；S1由一个非核苷酸间隔子组成；和N2由一个核苷酸组成。在这些实施方案中，S1可以是C3-或C6-烷基间隔子。

在本发明的另一个方面，单链RNAi分子的核苷酸部分(例如，由式III和/或IV所述的N1、N2或N3)是一段连续的核苷酸，所述一段连续的核苷酸包含与RNA目标区域基本上或完全互补的至少10个(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等)核苷酸的序列。在另一个方面，单链RNAi分子的核苷酸部分包含与RNA目标区域基本上或完全互补的5-8个连续的核苷酸的序列。在本发明的该部分中，分子的所述核苷酸部分是一段连续的核苷酸，所述一段连续的核苷酸由1-20个核苷酸，5-20个核苷酸，10-20个核苷酸，13-20个核苷酸，5-15个核苷酸，或1-14个核苷酸组成。在另一个方面，所述核苷酸部分为18、19、或20个连续核苷酸长度。在仍进一步的方面，所述核苷酸部分为13、14、或15个连续核苷酸长度。在另一个方面，所述核苷酸部分的长度选自18个连续核苷酸、19个连续核苷酸或20个连续核苷酸。在仍进一步的方面，所述核苷酸部分的长度选自13个连续核苷酸、14个连续核苷酸或15个连续核苷酸。所述核苷酸部分的长度可以是18个核苷酸。所述核苷酸部分的长度可以是19个核苷酸。所述核苷酸部分的长度可以是20个核苷酸。所述核苷酸部分的长度可以是21个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核酸部分包含5-8个(即，5、6、7或8个)连续的核苷酸，所述连续的核苷酸与天然存在的miRNA序列的种子序列的全部或部分是相同的(或完全同源的)。在一个实施方案中，天然存在的miRNA序列是下文表1中所述的序列。例如，在一个实施方案中，单链RNAi分子的核苷酸部分内的6-核苷酸序列与天然存在的miRNA序列(包括选自表1的天然存在的miRNA序列)的种子区域的全部或部分是相同的。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以通过式III或式IV代表或表示。应当理解的是，式III和IV代表本发明的单链RNAi分子的特定实例。本发明的涵盖的额外实例包括但不限于，具有多于三个核苷酸部分的RNAi分子。

在本发明的一个方面，单链RNAi分子的核酸部分内的连续的核苷酸序列与天然存在的内源miRNA或与siRNA的引导链是部分、基本上或完全同源的。在本发明的另一个方面，单链RNAi分子的核酸部分内的连续的核苷酸序列与RNA目标序列内的目标位点部分、基本上或完全互补。在另一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子的至少一个核苷酸部分与天然存在的内源miRNA或siRNA的引导链的区域是部分、基本上或完全同源的和/或与RNA目标序列内的目标位点部分、基本上或完全互补。

本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分包含至少一个第一非核苷酸间隔子部分。所述非核苷酸间隔子部分包含共价结合并且因此连接至少两个核苷酸的化学基团，通常是有机实体。两个核苷酸在分子的不同的核苷酸部分内。非核苷酸间隔子部分的长度没有特别限制，只要它没有严重影响分子与RNA目标序列形成常规或非常规沃森克里克碱基配对和/或介导RNAi的能力。非核苷酸间隔子部分可以通过常规磷酸二酯键和/或非磷酸二酯连接子连接两个核苷酸和/或非核苷酸替代部分。包含将核苷酸和/或非核苷酸连接至间隔子的基于非磷酸二酯的连接子的本发明的单链RNAi分子包括，例如，基于肽的连接子，如连接寡聚肽核酸(PNA)的单元的连接子(参见Boffa等人, 2000, Gene Ther. Mol. Biol. 5:47-53)。

如本文所提供的或本领域中另外已知的各种非核苷酸部分可以包括在本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分内。本发明的单链RNAi分子的内部间隔子部分内包含的非核苷酸间隔子可以包括能够通过常规的磷酸二酯键和/或非磷酸二酯连接子连接两个核苷酸和/或非核苷酸替代部分的任何非核酸间隔子。间隔子通常是脂族或芳族有机实体，不同于形成寡核苷酸骨架的核苷酸间键(即，形成互补的杂合体的核碱基)。

非核苷酸间隔子的非限制性实例包括如下：聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃、或其他聚合化合物(例如聚乙二醇，如具有2－100个乙二醇单元的那些)。特定实例包括由下述参考文献描述的那些：Seela和Kaiser, 1990, Nucleic Acids Res. 18:6353；Seela和Kaiser, 1987, Nucleic Acids Res. 15:3113；Cload和Schepartz, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:6324；Richardson和Schepartz, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:5109；Ma等人,1993, Nucleic Acids Res. 27:2585；Ma等人, 1993, Biochemistry 32:1751；Durand等人, 1990, Nucleic Acids Res. 18:6353；McCurdy等人, 1991, Nucleosides & Nucleotides 70:287；Jaschke等人, 1993, Tetrahedron Lett. 34:301；Ono等人, 1991, Biochemistry 30:9914;等。

在本发明的一个实施方案中，间隔子是1-20个碳(即，C1-C20)、优选1-12个碳(即，C1-C12)并且任选被取代的烷基、烯基或炔基链。可以用额外的化学和/或官能团(例如，特异性结合感兴趣的目标分子的部分)取代烃链。

为单链RNAi分子提供额外的功能性(例如，特异性结合感兴趣的目标分子或促进/增强分子的细胞递送)的化学部分可以是间隔子的一部分或与之共价结合或连接(例如，取代)。例如，额外的官能团可以通过协助RNAi分子化合物转移通过细胞膜、改变药代动力学和/或调节本发明的RNAi分子的定位而赋予单链RNAi分子治疗活性。

可以包含进非核苷酸间隔子本身内和/或与之共价连接并且被本发明考虑的特定缀合物的实例是小分子、脂质或亲脂性物质、萜、磷脂、抗体、毒素、胆固醇、蛋白结合剂(例如，可以帮助细胞摄取的细胞受体的配体)、维生素、负电荷聚合物和其他聚合物，例如蛋白(例如人血清白蛋白)、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺，以及如下所述的那些，例如美国专利公开号2005/0196781和美国专利公开号2006/0293271，其公开内容通过引用而并入本文。这些化合物预期改善本发明的单链RNAi分子在血清的存在或不存在下在源于不同组织的许多细胞类型内的递送和/或定位(参见Sullenger和Cech，US 5,854,038)。例如，缀合物成员可以是萘普生、硝基吲哚(或另一种有助于堆积相互作用的缀合物)、叶酸、异丁苯丙酸或C5嘧啶接头。在其他实施方案中，缀合物成员是甘油酯脂质缀合物(例如，二烷基甘油酯衍生物)、维生素E缀合物、或硫代-胆固醇。在另一个实施方案中，缀合物分子是肽，当所述肽缀合于单链RNAi分子时，其起作用以帮助分子递送进入目标细胞，或者另外增强当与生物样品接触时分子的递送、稳定性或活性。用于本发明的这些方面内的用途的示例性肽缀合物成员包括肽PN27、PN28、PN29、PN58、PN61、PN73、PN158、PN159、PN173、PN182、PN202、PN204、PN250、PN361、PN365、PN404、PN453、和PN509，其描述于，例如，在美国专利申请公开号2006/0040882和2006/0014289，以及美国临时专利申请号60/939,578，它们全部通过引用并入本文。

在一个实施方案中，非核苷酸间隔子包含特异性结合目标分子的部分。目标分子可以是任何感兴趣的分子。例如，目标分子可以是蛋白的配体结合结构域，从而防止或竞争天然存在的配体与蛋白的相互作用。这是非限制性实例，本领域技术人员将认识到，使用本领域一般已知的技术可以容易产生其他实施方案(参见，例如，Gold等人, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:163；Brody和Gold, 2000, J. Biotechnol. 74:5；Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:100；Kusser, J., 2000, Biotechnol.74:21；Hermann和Patel, 2000, Science 257:820;和Jayasena, 1999, Clinical Chem.45:1628)。本发明的单链RNAi分子的间隔子部分也可以方便地用于将官能化学基团引入RNAi分子以提高与细胞递送相关的特性。

在一个实施方案中，通过单链RNAi分子的间隔子区域连接的缀合物分子或官能化学部分提供了将所述RNAi分子施用于特定细胞类型如肝细胞的能力。例如，去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)(Wu和Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429)对于肝细胞是独特的，其结合分枝的半乳糖末端糖蛋白，如去唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)。这样的糖蛋白或合成的糖缀合物与受体的结合以一定亲和力发生，所述亲和力强烈依赖于寡糖链的分枝的程度，例如，与二分枝或单分枝链相比，三分枝结构以更高的亲和力结合(Baenziger和Fiete, 1980, Cell 22:611；Connolly等人, 1982, J. Biol. Chem. 257:939)。Lee和Lee (1987, Glycoconjugate J.4:317)通过使用N-乙酰基-D-半乳糖胺作为糖部分获得这种高特异性，与半乳糖相比，其对于受体具有更高的亲和力。也已经描述了对于甘露糖封端的糖蛋白或糖缀合物的结合与摄取的这种“集簇效应”(Ponpipom等人,1981, J.Med.Chem.24:1388)。使用基于半乳糖和半乳糖胺的缀合物将外源化合物转运穿过细胞膜可以为肝病的治疗提供靶向的递送方法。生物缀合物的使用也可以提供对于治疗所需的治疗性化合物的所需剂量的降低。此外，可以通过使用本发明的生物缀合物调节治疗生物利用度、药效动力学和药代动力学参数。

可以通过生物可降解的非核酸接头将本文所述的缀合物分子连接至单链RNAi分子。如本文上下文中所使用的，术语“生物可降解的接头”指非核酸接头分子，其被设计为生物可降解的接头，以使一种分子与另一种分子连接，例如，将缀合物分子与本发明的单链RNAi分子连接。生物可降解的接头被这样设计，使得它的稳定性可以就特定目的进行调节，如递送给特定组织或细胞类型。如本文所使用的，术语“生物可降解的”是指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。

在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子包含内部间隔子部分，所述内部间隔子部分包含一个或多??个非核苷酸间隔子部分，其中所述一个或多个非核苷酸间隔子部分(例如，在通式III和IV中的S1或S2)包含选自C3、C6、C9和C12脂族间隔子的非核苷酸间隔子或由其组成。“C”之后的数字表示核心间隔子结构中的碳原子的数量(例如，如果没有用额外化学部分取代)。所述间隔子可以是烷基、烯基或炔基。所述间隔子还可以包含亚磷酰胺部分以促进与分子的核苷酸部分的磷酸酯骨架的共价连接。在一个实施方案中，间隔子(S)部分是C3亚磷酰胺间隔子。在另一个实施方案中，间隔子是C6亚磷酰胺间隔子。在进一步的实施方案中，C3、C6、C9或C12间隔子是任选地取代的(例如，用靶向部分)。

本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分内的一个或多个或所有核苷酸可以是核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸或合适的核苷酸类似物。核苷酸类似物如各种已知的糖、碱基和骨架修饰以及LNA单体单元掺入进破坏的链可以显著增强血清稳定性并延长目标敲低或表达调节效果。本发明的单链RNA分子可以在不同程度上功能上容纳各种化学修饰并与各种化学修饰相容。例如，本发明的单链RNA分子的5％-100％的核糖核苷酸可以被修饰(例如，本发明的单链RNAi分子的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40 ％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％的核糖核苷酸可以被化学修饰或用核苷酸类似物残基所替代)。由对糖、碱基和/或骨架的功能上相容的化学修饰或由包括合适的核苷酸类似物残基所赋予的改进的特性对于这些单链RNAi分子在体内的应用，例如，用作治疗剂或用作功能基因组学工具，是特别重要的。

在进一步的方面，根据本文的实施方案中的任一个，本发明的单链RNAi分子能够参与针对RNA目标(包括内源RNA目标)的RNAi。在一个实施方案中，内源RNA目标是天然存在的miRNA的目标。可以通过标准的RNA特异性干扰机制(包括miRNA依赖的RNA干扰)实现RNA目标的抑制。例如，通过与非翻译mRNA区域(其与对应的内源miRNA相互作用)的相互作用(例如，碱基配对，结合等)抑制miRNA目标，这完成了一种或多种下游基因的翻译调控。或者，可以通过siRNA样干扰机制实现miRNA目标的抑制，其中本发明的单链RNAi分子(是miRNA模拟物)与miRNA目标的结合导致非翻译miRNA目标的裂解。本发明的单链RNAi分子也可以通过siRNA样干扰机制抑制miRNA目标，其中本发明的单链RNAi分子与序列编码区域中(而不是非编码非翻译区中)的mRNA目标的结合导致mRNA目标编码序列的裂解。

C. 取代的和/或修饰的单链RNAi分子

将取代的和修饰的核苷酸引入本发明的单链RNAi分子为克服外源递送的天然RNA分子(即，具有标准的核苷酸)固有的体内稳定性和生物利用度的潜在限制提供了工具。在某些实施方案中，本发明的取代的或修饰的单链RNAi分子的使用可以帮助在更低剂量实现给定的治疗效果，因为这些分子可以被设计为具有在受试者或生物样品(例如，血清)中增加的半衰期。此外，某些取代或修饰可用于通过针对特定细胞或组织或改进单链RNAi分子的细胞摄取而改进单链RNAi分子的生物利用度。因此，即使与相同结构的未修饰的或未取代的RNAi分子相比本发明的单链RNAi分子的活性有所降低(例如，降低小于约20％，或30％，或甚至40％)，由于分子的改进的稳定性或递送，修饰的或取代的RNAi分子的总的活性可以高于其天然对应物的总的活性。取代的和/或修饰的单链RNAi分子还可以使在，例如，人中激活干扰素响应的可能性最小化。

在某些实施方案中，本发明的单链RNAi分子在约5％-约95％的核苷酸位置包含核糖核苷酸。例如，本发明的单链RNAi分子的从一个到所有(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、或27个)核糖核苷酸可以被修饰。

在相关实施方案中，本发明的单链RNAi分子包含一个或多个天然或合成的非标准核苷。在相关的实施方案中，非标准核苷是一个或多个脱氧尿嘧啶、L-或D-锁定核酸(LNA)分子(例如，5-甲基尿嘧啶LNA)或取代的LNA(例如，具有芘)，或通用结合核苷酸，或G夹钳(G clamp)，或其任何组合。在某些实施方案中，通用结合核苷酸可以是C-苯基、C-萘基、肌苷、唑甲酰胺，l-β-D-呋喃核糖基-4-硝基吲哚、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚、l-β-D-呋喃核糖基-6-硝基吲哚、或l-β-D-呋喃核糖基- 3-硝基吡咯。

可以存在于本发明的单链RNAi分子中的取代的或修饰的核苷酸包含具有与天然的或标准的核糖核苷酸相似特征的修饰的或取代的核苷酸。例如，本发明的特征在于包含具有Northern构型(参见，例如，Northern pseudorotation cycle, Saenger, Springer-Verlag ed., 1984)的核苷酸的单链RNAi分子，已知其可能赋予对核酸酶降解的抗性，同时保持介导RNAi的能力，至少在应用于siRNA分子时。具有Northern构型的示例性核苷酸包括锁定核酸(LNA)核苷酸(例如，2'-O，4'-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)、2'-甲氧基乙基(MOE)核苷酸、2'-甲基-硫代-乙基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧-2'-氯核苷酸、2'-叠氮核苷酸、5-甲基尿嘧啶、或2'-O-甲基核苷酸)。在这些实施方案中的任一个中，一个或多个取代的或修饰的核苷酸可以是G夹钳(G clamp)(例如，对鸟嘌呤形成一个额外的氢键的胞嘧啶类似物，如9-(氨基乙氧基)吩噁嗪)。参见，例如，Lin和Mateucci, 1998, J. Am. Chem. Soc. 720:8531。

在某些实施方案中，本发明的单链RNAi分子的5'-末端是磷酸化的。在本文所述的单链RNAi分子的实施方案中的任一个中，所述分子可以进一步包含末端磷酸酯基团，如5'-磷酸酯(参见，Martinez等人, 2002, Cell 110:563；Schwarz等人, 2002, Mole.Cell 70:537)或5',3'-二磷酸酯。

另一个方面，本发明的单链RNAi分子在分子的末端包含一个或多个5'-和/或3'-帽结构。“帽结构”意指化学修饰，其已掺入寡核苷酸的末端(参见例如通过引用并入本文的Matulic-Adamic等人, US 5,998,203)。这些末端修饰可以保护某些核酸分子不受核酸外切酶降解，且可以赋予递送和/或细胞定位的某些优点。在非限制性实例中，合适的5'-帽可以选自反向脱碱基残基(部分)；4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基(erythrofuranosyl))核苷酸，4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3',4'-断裂核苷酸；无环3,4-二羟基丁基核苷酸；无环3,5-二羟基戊基核苷酸；3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向脱碱基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3'-磷酰胺酯；己基磷酸酯；磷酸氨基己基酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。

在另一个非限制性实例中，合适的3'-帽可以选自4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃型赤藓糖基)核苷酸；4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；磷酸5'-氨基-烷基酯；磷酸1,3-二氨基-2-丙基酯；磷酸3-氨基丙基酯；磷酸6-氨基己基酯；磷酸1,2-氨基十二烷基酯；磷酸羟基丙基酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3',4'-断裂核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸；5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向脱碱基部分；5'-磷酰胺酯；5'-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；桥连或非桥连5'-磷酰胺酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥连甲基膦酸酯和5'-巯基部分。关于更多细节参见Beaucage和Iyer, 1993, Tetrahedron 49:1925；其通过引用并入本文。

在某些实施方案中，本发明的特征在于包含磷酸酯骨架修饰的修饰的单链RNAi分子，所述磷酸骨架修饰包括，例如，一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺化(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛或烷基甲硅烷基、取代。关于寡核苷酸骨架修饰的综述，参见Hunziker和Leumann, 1995, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, 在Modern Synthetic Methods, VCH, 331；Mesmaeker等人,1994, ACS 24-39。

在进一步的实施方案中，单链RNAi分子包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个)2'-糖取代，如2'-脱氧、2'-O-2-甲氧基乙基、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-卤素(如，2'-氟)、2'-O-烯丙基等，或其任何组合。在更进一步的实施方案中，单链RNAi分子在一个或两个末端包含末端帽取代基，如，例如，烷基、脱碱基、脱氧脱碱基、丙三基、二核苷酸、无环核苷酸、反向脱氧核苷酸部分，或其任何组合。在某些实施方案中，至少一个5'-末端-末端核糖核苷酸具有2'-糖取代。

在其他实施方案中，单链RNAi分子包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个)糖骨架中的取代，包括核糖基、2'-脱氧核糖基、四呋喃糖基(例如，L-α-四呋喃糖基)、六吡喃糖基(例如，β-全喃糖基、β-阿卓吡喃糖基和β-吡喃葡萄糖基)、五吡喃糖基(例如，β-吡喃核糖基、α-吡喃来苏糖基、β-吡喃木糖基和α-吡喃阿拉伯糖基)、碳环类似物、吡喃糖、呋喃糖、吗啉代或它们的类似物或衍生物的任何组合。

在又其他实施方案中，单链RNAi分子包含至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或26个)修饰的核苷间键，独立地如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯、膦酸烷酯、3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代膦酰基乙酸酯、次膦酸酯(phosphinate)、氨基磷酰酯(phosphoramidate)、3'-氨基氨基磷酰酯(3'-amino aminophosphoramidate)、氨基烷基磷酰胺酯、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒磷酸酯、硼磷酸酯键或其任何组合。

单链RNAi分子在分子的3'-末端、5'-末端或3'-末端和5'-末端可以包含一个或多??个修饰的核苷酸间键。在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子在3'-末端具有一个修饰的核苷酸间键，如硫代磷酸酯键。示例性的单链RNAi分子包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。进一步的示例性单链RNAi分子在，例如，分子的5'-末端包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续的硫代磷酸酯核苷酸间键。在又一个示例性的单链RNAi分子中，可以有一个或多个嘧啶硫代磷酸酯核苷酸间键。在进一步的示例性单链RNAi分子中，可以有一个或多个嘌呤硫代磷酸酯核苷酸间键。

可用于本发明的单链RNAi分子中的许多示例性的修饰的核苷酸碱基或其类似物包括5-甲基胞嘧啶；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；6-甲基、2-丙基、或腺嘌呤和鸟嘌呤的其他烷基衍生物；8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤(例如，8-氮杂、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基等)；7-甲基、7-脱氮、和3-脱氮腺嘌呤和鸟嘌呤；2-硫代尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶；2-硫代胞嘧啶；5-甲基、5-丙炔基、5-卤代(例如，5-溴代或5-氟代)、5-三氟甲基，或其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；和6-偶氮尿嘧啶(6-azouracil)。进一步有用的核苷酸碱基可见Kurreck, 2003, Eur. J. Biochem. 270:1628；Herdewijn, 2000, Guide Nucleic Acid Develop. 10:297；Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pp. 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990；U.S. Patent 3,687,808，和类似参考文献，所有这些都通过引用并入本文。

也考虑某些取代的或修饰的核苷酸碱基部分。这些包括5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶；和N-2、N-6、或O-6取代的嘌呤(例如，2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。进一步地，例如，已知5-甲基尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶取代增加核酸双链体的稳定性，其可以与为修饰的或取代的单链RNAi分子提供期望的核酸酶抗性的2'-糖修饰(如，2'-O-甲基或2'-甲氧基乙基)或核苷间键(例如，硫代磷酸酯)组合。

在进一步的实施方案中，本发明的单链RNAi分子的至少一个嘧啶是双环糖形式的锁定核酸(LNA)。在相关实施方案中，LNA包含碱基取代，如5-甲基尿嘧啶LNA或2-硫代-5-甲基尿嘧啶LNA。在进一步的实施方案中，嘧啶核苷或核苷间键的核糖可以任选地修饰。

在这些实施方案中的任一个中，一个或多个取代的或修饰的核苷酸可以是G夹钳(G clamp)(例如，对鸟嘌呤形成一个额外的氢键的胞嘧啶类似物，如9 - (氨基乙氧基)吩噁嗪)。参见，例如，Lin和Mateucci, 1998, Nucleic Acids Res. 19:3111。

在本文所述的实施方案的任一个中，单链RNAi分子可以包括多种类型的修饰。例如，具有至少一个核糖胸苷或2-硫代核糖胸苷的单链RNAi分子可以进一步包含至少一个LNA、2'-甲氧基、2'-氟代、2'-脱氧、硫代磷酸酯键、反向碱基末端帽，或其任何组合。在某些示例性实施方案中，单链RNAi分子可以包含一个或多个或所有用核糖胸苷取代的尿嘧啶并具有最多达约75％的LNA取代。在其他示例性实施方案中，单链RNAi分子可以包含一个或多个或所有用核糖胸苷取代的尿嘧啶并具有最多达约25%的2'-甲氧基取代。在仍其他示例性实施方案中，单链RNAi分子可以包含一个或多个或所有用核糖胸苷取代的尿嘧啶并具有最多达约100%的2'-氟取代。

在某些方面内，本发明还提供了包含一个或多??个通用碱基核苷酸的单链RNAi分子。本文所用的术语“通用碱基”是指与多于一种类型的核苷酸形成碱基对或氢键键合的核苷酸对的核苷酸碱基类似物。通用碱基的非限制性实例包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、唑甲酰胺和硝基唑衍生物如本领域已知的3-硝基唑、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚(参见例如Loakes, 2001, Nucleic Acids Research 29:2437-2447)。在某些方面，本文公开的单链RNAi分子可以包括约1-约10个通用碱基核苷酸，只要获得的RNAi分子保持能够调节一种或多种其内源性目标。

D. 单链RNAi分子的合成

本发明的示例性分子可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得。例如，本发明的RNAi分子可以是化学合成的，重组产生的(例如通过质粒编码)或其组合。

寡核苷酸或个别段连续的核苷酸(例如，某些修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分)是使用本领域已知的方案合成的，例如如下述参考文献中所述：Caruthers等人, 1992, Methods in Enzymol. 211:3；Thompson等人,PCT公开号 WO 99/54459；Wincott等人, 1995, Nucleic Acids Res. 23:2677；Wincott等人, 1997, Methods Mol. Bio. 74:59；Brennan等人, 1998, Biotechnol. Bioeng. 67:33；和Brennan, 美国专利号 6,001,311。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基团，如在5'-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3'-末端处的亚磷酰胺。不含修饰的RNA(包括本发明的其某些单链RNAi分子)的合成可以使用如下所述的方案进行：Usman等人, 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:7845；Scaringe等人, 1990, Nucleic Acids Res. 18:5433；和Wincott等人, 1995, Nucleic Acids Res. 23:2677；和Wincott等人,1997, Methods Mol. Bio. 74:59。在某些实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分可以分开合成并在合成后，例如，通过连接与非核苷酸间隔子部分连接在一起(Moore等人,1992, Science 256:9923；Draper等人, PCT公开号 WO 93/23569；Shabarova等人,1991, Nucleic Acids Res. 19:4247；Bellon等人,1997, Nucleosides & Nucleotides 16:951；Bellon等人,1997, Bioconjugate Chem. 8:204)。在进一步的实施方案中，本发明的单链RNAi分子的核苷酸部分可以制备为由多核苷酸(DNA或RNA)载体表达的单一或多种转录产物，所述多核苷酸载体编码一段或多段连续的RNA并引导它们在宿主细胞中的表达。然后分离核苷酸部分并通过连接与非核苷酸间隔子部分连接。

在一些实施方案中，基于pol III的构建体用于表达本发明的核酸分子，单链RNAi分子序列的转录可以由用于真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)、或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动。(参见例如，Thompson,美国专利号5,902,880和6,146,886)。(还参见，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 83，399；Scanlon等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res. Dev.，2，3-15；Dropulic等人，1992，J. Virol.，66，1432-41； Weerasinghe等人，1991，J. Virol.，65，5531-4； Ojwang等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89，10802-6； Chen等人，1992， Nucleic Acids Res.，20，4581-9； Sarver等人，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等人，1997，Gene Therapy，4，45。来自pol II或pol III启动子的转录物在所有细胞中以高水平表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默基因等)的性质。原核RNA聚合酶启动子也可以使用，只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，87，6743-7；Gao和Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72； Lieber等人，1993，Methods Enzymol.， 217，47-66； Zhou等人，1990，Mol. Cell. Biol.，10，4529-37)。几位研究者已证实由这样的启动子表达的核酸分子可以在哺乳动物细胞中起作用(例如，Kashani-Sabet等人，1992， Antisense Res. Dev.， 2，3-15； Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，89，10802-6； Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9； Yu等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，90，6340-4； L'Huillier等人，1992，EMBO J.，11，4411-8； Lisziewicz等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A，90，8000-4；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger & Cech，1993，Science，262，1566)。更具体而言，转录单元如衍生自编码U6小核(snRNA)、转移RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的那些在产生高浓度的所需RNA分子方面是有用的(Thompson等人，同上；Couture和Stinchcomb，1996,同上；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg等人，美国专利号5,624,803；Good等人，1997，Gene Ther.，4，45；Beigelman等人，国际PCT公开号WO 96/18736。上述转录单元可以掺入多种载体内用于引入哺乳动物细胞内，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如，腺病毒或腺相关病毒载体)、或病毒RNA载体(例如逆转录病毒或甲病毒载体)(关于综述参见Couture和Stinchcomb，1996，同上)。

化学合成具有取代或修饰(碱基、糖、磷酸酯或其任何组合)的核酸分子可以赋予对血清核糖核酸酶降解的抗性，这可能导致增加的效力及其他药理学和治疗的益处。参见，例如， Eckstein等人,PCT公开号 WO 92/07065；Perrault等人,1990, Nature 344:565；Pieken等人, 1991, Science 253:314；Usman和Cedergren, 1992, Trends inBiochem. Sci. 77:334；Usman等人,1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31:163；Beigelman等人, 1995, J. Biol Chem. 270:25702；Burlina等人,1997, Bioorg. Med. Chem. 5:1999；Karpeisky等人, 1998, Tetrahedron Lett. 39:1131；Earnshaw和Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences) 48:39；Verma和Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem. 67:99；Herdewijn, 2000, Guide Nucleic Acid Drug Dev. 10:291；Kurreck, 2003, Eur. J. Biochem. 270:1628；Dorsett和Tuschl, 2004, Nature Rev. Drug Discov. 3:318；Rossi等人, PCT公开号 WO 91/03162；Usman等人, PCT公开号 WO 93/15187；Beigelman等人, PCT公开号 WO 97/26270；Woolf等人, PCT公开号 WO 98/13526；Sproat, 美国专利号 5,334,711；Usman等人, 美国专利号 5,627,053；Beigelman等人, 美国专利号 5,716,824；Otvos等人, 美国专利号 5,767,264；Gold等人, 美国专利号 6,300,074。上述参考文献中的每一个都公开了对核酸分子的碱基、磷酸酯或糖部分的各种取代和化学修饰，这可以用于本文所述的单链RNAi分子中。

E. 用于设计单链RNAi分子的方法

如本文所述，本发明的单链RNA分子能够通过RNAi机制抑制目标序列的表达。在一个实施方案中，可以根据先前鉴别的具有期望的敲低功能的RNAi试剂(例如，siRNA，miRNA)设计单链RNAi分子。例如，如果本发明的单链RNAi分子是miRNA模拟物，其源自对应的天然存在的miRNA分子(参见表1)或其类似物(例如，化学修饰的形式)。截至本申请的申请日，在公共可获得的数据库中可以发现对于多个物种内源的超过3000种miRNA分子(参见，例如，如Griffith-Jones等人, 2004, Nucleic Acids Research 32:D109-D111和Griffith-Jones等人, 2006, Nucleic Acids Research 34:D 140-D144中所述的公共可获得的miRBase序列数据库，在万维网上的Wellcome Trust Sanger Institute网站访问)。本文表1包含了1090种成熟的人miRNA序列(SEQ ID NO：1-1090)的列表。在另一个实例中，本发明的单链RNAi分子可以源自先前鉴别的已知抑制选择的目标序列的表达或具有抑制目标mRNA序列的表达的能力的siRNA。具体而言，可以通过将一个或多个内部非核苷酸间隔子部分引入参考RNAi分子的引导链内而设计源自先前鉴别的RNAi分子(即，参考RNAi分子)的单链RNAi分子。在另一个实施方案中，单链RNAi分子可以从头设计(即，不基于已知的RNAi试剂)，用于敲低(knocking down)特定目标序列的表达。

可以使用已知的方法测量本发明的给定单链RNAi分子的RNAi活性，如在Fire等人，PCT公开号WO99/32619和如下文实施例部分中描述的那些。在一些实施方案中，本说明书提供了用于选择更有效的单链RNAi分子设计的方法，所述方法通过使用包含可操作地融合于并且能够改变一种或多种报道基因如荧光素酶、氯霉素(CAT)或β-半乳糖苷酶(所述报道基因依次可操作地同框融合于一部分目标基因，所述一部分目标基因与待测试的ssRNAi完全或部分互补)的组成型启动子如巨细胞病毒(CMV)或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的一种或多种报道基因构建体而实现。这些报道基因表达构建体可以与一种或多种ssRNAi分子和对照(例如，不包含内部非核苷酸间隔子的对应的miRNA模拟物)共转染。可以通过将用ssRNAi分子转染的细胞中测定的报道基因活性和阴性对照(即，在未用ssRNAi分子转染的细胞中)和阳性对照(例如，在用不包含内部非核苷酸间隔子的对应的miRNA模拟物转染的细胞中)转染的细胞中的活性相比较而确定给定ssRNAi分子介导目标mRNA的RNAi的能力。选择具有它们对应的RNAi分子(例如，不包含内部非核苷酸间隔子的RNAi分子)的活性的至少20％或更高、优选至少40％或更高、或60％或更高、或80％或更高的ssRNAi分子。

在例如如本文所述或本领域中通常已知的动物模型中，本领域技术人员可以筛选本发明的包含各种非核苷酸间隔子的单链RNAi分子以确定哪些分子具有改进的特性(例如，药代动力学、生物利用度、稳定性)并且同时保持介导RNAi的能力。相似地，本领域技术人员还可以筛选本发明的具有各种缀合物的单链RNAi分子以确定哪些RNAi分子-缀合物复合物具有改进的特性并且同时保持介导RNAi的能力。

F. 组合物和使用方法

如本文所述，本发明的单链RNA分子是RNAi试剂，所述RNAi试剂优选能够参与细胞RNAi通路或者能够以其他方式调节相同或相关的一条或多条通路并导致与病理或疾病状况相关的目标基因的抑制。在代表miRNA模拟物的单链RNA分子的情况下，设计ssRNAi分子以补充或代替对应的天然存在的miRNA，所述对应的天然存在的miRNA的减少或另外不合适的低水平已经与病理或疾病状况相关。因此，本发明的单链RNAi分子是有用的试剂，其可用于多种治疗、诊断、目标验证、基因组发现、基因工程和药物基因组学应用的方法中。

可以将本发明的单链RNA分子引入细胞、组织、生物体、体外系统或体内系统以介导针对目标序列的RNAi。该目标序列可以是内源的目标基因或序列。在一个实施方案中，本发明的单链RNAi分子可用于治疗具有特征为蛋白的不期望的产生的疾病的生物体。

在本发明的单链RNAi分子是miRNA模拟物的情况下，目标序列是对应的天然存在的miRNA的目标。在这样的情况下，单链miRNA模拟物可以调节多种基因，例如，其mRNA目标下游的基因，表达水平与对应的天然存在的miRNA相关或以其他方式受其调节的基因。因为某些天然存在的miRNA的异常表达水平已经牵涉在各种人疾病中(所述人疾病包括但不限于过度增生的、血管生成的或炎性疾病、状态或不利状况)，本发明的单链miRNA模拟物可以提供有价值的治疗机会。在这个背景中，本发明的单链miRNA模拟物可以调节(例如，敲低或上调)其对应的内源miRNA的一种或多种下游基因的表达，使得可以实现一种或多种相关的疾病症状的严重性或复发的预防、减轻或降低。或者，尽管如此，对于各种不同的疾病模型(其中一种或多种目标mRNA的表达不必作为疾病或其他不利状况的结果而减少或低于正常水平)，引入外源miRNA模拟物如本发明的一种或多种单链miRNA模拟物可以通过影响与疾病途径相关的基因的表达水平而导致治疗结果。

本发明的单链RNAi分子在靶向目标基因的编码区、抑制该基因的表达并因此减少蛋白产生中可以充当与siRNA分子类似的作用。如果不是对于引入单链RNAi分子，已经产生的蛋白可以与病理的或疾病状况(例如，肿瘤)相关。

根据本文的该公开内容，提供了本发明的单链RNAi分子、其组合物和用于在细胞或生物体中抑制一种或多种对应目标mRNA的表达的方法。本发明提供了用于治疗受试者，包括人细胞、组织或个体的方法和单链RNAi分子组合物。

(i) 药物组合物和制剂

本发明包括制备用于储存或施用的单链RNAi分子组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的药学上有效量的期望的RNAi分子。本发明的单链RNAi分子可以有效地用作药学上可接受的制剂。药学上可接受的制剂在受试者中防止、改变疾病状态或其他不利状况的发生或严重度，或治疗(在可检测或可测量的程度上缓解一种或多种症状)疾病状态或其他不利状况。因此，药物组合物或制剂是指以适合于施用(例如全身施用)进细胞或受试者如人的形式的组合物或制剂。本发明的药物组合物被配制成使其中包含的一种或多种单链RNAi分子在施用于受试者后是生物可利用的。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以任选地包括防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、染料、调味剂或其任何组合。示例性的防腐剂包括苯甲酸钠、对羟基苯甲酸的酯和山梨酸。药学上可接受的制剂包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是在药学领域中众所周知的，描述于，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R.Gennaro编, 第21版, 2005。

在某些实施方案中，包含一种或多种本发明的单链RNAi分子的水性悬浮液可以制备在与合适的赋形剂(如悬浮剂或分散或湿润剂)的混合物中。示例性的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶。代表性的分散或湿润剂包括天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物(例如硬脂酸聚氧乙烯酯)，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如十七乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。在某些实施方案中，水性悬浮液可以任选地包含一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯(w-propyl-p- hydroxybenzoate))，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂(例如蔗糖或糖精)。在另外的实施方案中，可以通过加入包含单链RNAi分子的水和分散剂或润湿剂、悬浮剂和任选的一种或多种防腐剂、着色剂、调味剂或甜味剂的混合物而制备适合用于制备包含本发明的一种或多种单链RNAi分子的水性悬浮液的可分散的粉末和颗粒。

在进一步的实施方案中，可以通过将ssRNAi悬浮于，例如，植物油(例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如，液状石蜡)中而将本发明的单链RNAi分子配制为油状悬浮液或乳剂(例如，水包油)。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶(例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶)，天然存在的磷脂(例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯(partial ester))，酸酐(例如山梨糖醇酐单油酸酯)，或偏酯与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。在某些实施方案中，油状悬浮液或乳剂可以任选地包含增稠剂如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。在相关的实施方案中，可以任选地添加甜味剂和调味剂以提供可口的经口制剂。在其他实施方案中，这些组合物可以通过任选地添加抗氧化剂如抗坏血酸进行保藏。

在进一步的实施方案中，单链RNAi分子可以与甜味剂(例如，甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖)配制为糖浆和酏剂。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂、调味剂、着色剂或其任何组合。

在其他实施方案中，包含本发明的单链RNAi分子的药物组合物可以是无菌可注射的水性或含油悬浮液的形式。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液(例如，作为1,3-丁二醇中的溶液)。在可以用于本发明的组合物中的示例性的可接受的媒介物和溶剂中有水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油可用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸在肠胃外制剂的制备中找到用途。

本发明的单链RNAi分子可以直接施用，或可以例如与阳离子脂质复合，或包装在脂质体内，或以其他方式递送给目标细胞或组织。用于递送核酸分子的方法在下述参考文献中得到描述：Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio.，2，139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，Akhtar编，1995，Maurer等人，1999，Mol. Membr. Biol.，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb. Exp. Pharmacol.，137，165-192；和Lee等人，2000，ACS Symp. Ser.，752，184-192。Beigelman等人，美国专利号6,395,713和Sullivan等人，PCT WO 94/02595进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。这些方案可以用于递送事实上任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，被囊化在脂质体中，通过离子电渗，或通过掺入其他媒介物内，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精(参见例如Gonzalez等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等人，国际PCR公开号WO 03/47518和WO 03/46185)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(参见例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US 2002130430)、生物可降解纳米胶囊(nanocapsule)和生物粘附微球，或通过蛋白样载体(O'Hare和Normand，国际PCT公开号WO 00/53722)。

(ii) 载体/递送系统

在一个方面，本发明提供了包含本文所述的单链RNAi分子的载体系统。在一些实施方案中，载体系统是基于脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、脂质体、胶粒、病毒体、脂质纳米颗粒或其混合物。在其他实施方案中，载体系统是基于聚合物的载体系统，例如阳离子聚合物-核酸复合物。在另外的实施方案中，载体系统是基于环糊精的载体系统，例如环糊精聚合物-核酸复合物。在进一步的实施方案中，载体系统是基于蛋白的载体系统，例如阳离子肽-核酸复合物。优选地，载体系统是脂质纳米颗粒(“LNP”)制剂。

在某些实施方案中，本发明的单链RNAi分子与脂质纳米颗粒组合物如美国专利申请号11/353,630, 11/586,102, 61/189,295, 61/204,878, 61/235,476, 61/249,807和61/298,022中所述的那些共同配制。在某些优选实施方案中，本发明的ssRNAi分子与包含40/48/2/10比例的阳离子脂质/胆固醇/PEG-C-DMA/DSPC或40/48/2/10比例的阳离子脂质/胆固醇/PEG-DMG/DSPC的脂质纳米颗粒组合物共同配制。在某些其他实施方案中，本发明的特征在于包含与美国专利申请号61/189,295, 61/204,878, 61/235,476, 61/249,807和61/298,022中所述的阳离子脂质制剂中任一种共同配制的本发明的ssRNAi分子的组合物。

在本发明的某些实施方案中，提供了药物组合物和方法，其特征在于存在或施用一种或多种单链RNAi分子，其与功能部分组合、复合或缀合，其任选地与药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂、缓冲剂等共同配制。这样的缀合物和/或复合物可以用于促进RNAi分子递送到生物系统如细胞内。由本发明提供的缀合物和复合物可以赋予治疗活性，其通过将治疗化合物转移经过细胞膜，改变药代动力学和/或调节本发明的核酸分子的定位而实现。这样的缀合物的非限制性实例描述在下述参考文献中：美国公开号US2008/0152661 A1和US 2004/0162260 A1 (例如，CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG等) 和美国专利申请号10/427,160和10/201,394；和美国专利号6,528,631；6,335,434；6,235,886；6,153,737；5,214,136；和5,138,045。

本发明的单链RNAi分子在分子的一个或多个核苷酸上、一个或多个末端和/或内部的位置和/或间隔子部分上可以包括缀合物成员。缀合物成员可以是，例如，亲脂物质、萜、蛋白结合剂、维生素、碳水化合物或肽。例如，缀合物成员可以是萘普生、硝基吲哚(或另一个有助于堆积相互作用的缀合物)、叶酸、异丁苯丙酸或C5嘧啶间隔子。在其他实施方案中，缀合物成员是甘油酯脂质缀合物(例如，二烷基甘油酯衍生物)、维生素E缀合物、或硫代-胆固醇。在各个实施方案中，聚乙二醇(PEG)可以与本发明的RNAi分子共价连接。连接的PEG可以是任何分子量，优选约100-约50,000道尔顿(Da)。

在本发明的某些实施方案中，提供了药物组合物和方法，其特征在于存在或施用一种或多种单链RNAi分子，其与多肽或肽组合、复合或缀合，其任选地与药学上可接受的载体如稀释剂、稳定剂、缓冲剂等共同配制。在某些实施方案中，当肽缀合物伴侣用于增强一种或多种本发明的单链RNAi分子递送进入目标细胞，或者另外增强分子当与生物样品接触时的稳定性或活性。用于本发明的这些方面内的用途的示例性肽缀合物成员包括肽PN27、PN28、PN29、PN58、PN61、PN73、PN158、PN159、PN173、PN182、PN202、PN204、PN250、PN361、PN365、PN404、PN453、和PN509，其描述于，例如，在美国专利申请公开号2006/0040882和2006/0014289，以及美国临时专利申请号60/939,578，它们全部通过引用并入本文。

在一个实施方案中，本发明提供了适合用于将本发明的单链RNAi分子施用于特定细胞类型如肝细胞的组合物。例如，去唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)(Wu和Wu, 1987, J. Biol. Chem.262:4429)对于肝细胞是独特的，其结合分枝的半乳糖末端糖蛋白，如去唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)。这样的糖蛋白或合成的糖缀合物与受体的结合以一定亲和力发生，所述亲和力强烈依赖于寡糖链的分枝的程度，例如，与二分枝或单分枝链相比，三分枝结构以更高的亲和力结合(Baenziger和Fiete, 1980, Cell 22:611；Connolly等人, 1982, J.Biol.Chem.257:939)。Lee和Lee (1987, Glycoconjugate J.4:317)通过使用N-乙酰基-D-半乳糖胺作为糖部分获得这种高特异性，与半乳糖相比，其对于受体具有更高的亲和力。也已经描述了对于甘露糖基封端的糖蛋白或糖缀合物的结合与摄取的这种“集簇效应”( Ponpipom等人, 1981, J. Med. Chem. 24:1388)。使用基于半乳糖和半乳糖胺的缀合物将外源化合物转运穿过细胞膜可以为肝病的治疗提供靶向性的递送方法。生物缀合物的使用也可以提供对于治疗所需的治疗性化合物的所需剂量的降低。此外，可以通过使用本发明的生物缀合物调节治疗生物利用度、药效动力学和药代动力学参数。

在又一实施方案中，本发明的单链RNAi分子可以缀合于多肽并与一种或多种非阳离子脂质或非阳离子脂质和阳离子脂质的组合相混合以形成组合物，与目标细胞与没有脂质的裸RNAi分子的接触所导致的递送相比，所述组合物增强了RNAi分子的细胞内递送。在本发明的更详细的方面，包含单链RNAi分子和多肽的混合物、复合物或缀合物可以任选地与阳离子脂质如Lipofectine?组合(例如，混合或复合)。为了产生这些由多肽组成的组合物，单链RNAi分子和阳离子脂质、RNAi分子和多肽可以首先一起混合在合适的培养基如细胞培养基中，此后将阳离子脂质加入该混合物以形成RNAi分子/递送肽/阳离子脂质组合物。任选地，肽和阳离子脂质可以首先一起混合在合适的培养基如细胞培养基中，随后加入单链RNAi分子以形成RNAi分子/递送肽/阳离子脂质组合物。

本发明的特征还在于包含表面修饰的脂质体的单链RNAi分子组合物的用途，所述表面修饰的脂质体包含聚(乙二醇)脂质(PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形脂质体)。这些制剂可以提供药物在目标组织中增加的积累(Lasic等人, 1995, Chem. Rev. 95:2601；Ishiwata等人, 1995, Chem. Pharm. Bull. 43:1005)。这样的脂质体已显示在肿瘤中选择性积累，推测是通过在新血管形成的目标组织中的外渗和捕获(Lasic等人,1995, Science 267:1215；Oku等人,1995, Biochim. Biophys. Acta 1238:86)。与常规阳离子脂质体相比，长循环脂质体增强核酸分子的药代动力学和药效动力学，这已知在单核巨噬细胞系统(MPS)的组织中积累(Liu等人, 1995, J. Biol. Chem. 42:24864；Choi等人, PCT公开号 WO 96/10391；Ansell等人, PCT公开号 WO 96/10390；Holland等人, PCT公开号 WO 96/10392)。理论上由于避免在代谢攻击性MPS组织如肝和脾中积累，与阳离子脂质体相比，长循环脂质体还可以提供不受核酸酶降解的额外保护。

在一些实施方案中，本发明的RNAi分子也可以与聚乙烯亚胺和其衍生物(如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物)一起配制或复合。在一个实施方案中，本发明的核酸分子如美国专利申请公开号20030077829中所述进行配制。

在其他实施方案中，本发明的单链RNAi分子与膜破裂试剂例如美国专利申请公开号20010007666中描述的那些复合。在仍其他实施方案中，一种或多种膜破裂试剂和RNAi分子还与阳离子脂质或辅助脂质分子例如美国专利号6,235,310中描述的那些脂质复合。

在某些实施方案中，本发明的单链RNAi分子与如下述专利中描述的递送系统复合：美国专利申请公开号2003077829；20050287551；20050164220；20050191627；20050118594；20050153919；20050085486；和20030158133；以及国际PCT公开号WO 00/03683和WO 02/087541。

在一些实施方案中，本发明的脂质体制剂包含与下述专利中描述的化合物和组合物配制或复合的RNAi分子：美国专利号6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；6,815,432；6,586,001；6,120,798；6,977,223；6,998,115；5,981,501；5,976,567；5,705,385；以及美国专利申请公开号2006/0019912；2006/0019258；2006/0008909；2005/0255153；2005/0079212；2005/0008689；2003/0077829，2005/0064595，2005/0175682，2005/0118253； 2004/0071654；2005/0244504；2005/0265961和2003/0077829。

本发明的特征还在于用于制备单链RNAi分子纳米颗粒的方法。将含有三聚氰胺衍生物的第一种溶液溶解于已添加酸如HCl的有机溶剂如二甲亚砜或二甲基甲酰胺中。对于每摩尔三聚氰胺衍生物，HCl的浓度是约3.3摩尔HCl。然后，将第一种溶液与第二种溶液混合，其包括在极性或亲水性溶剂中溶解或悬浮的核酸(例如，含有例如，乙二胺四乙酸(EDTA)或三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其组合的水性缓冲液。混合物形成第一种乳液。可以使用任何标准技术，如，例如，超声处理，涡旋，或者在微流化床中进行混合。可以纯化获得的核酸颗粒，使用大小排阻色谱法或透析法或两者除去有机溶剂。然后可以在水溶液中将复合的核酸纳米颗粒与含有聚精氨酸或Gln-Asn聚合物或两者的水溶液混合。每种聚合物的优选的分子量是约5000至约15,000道尔顿。这形成了含有与三聚氰胺衍生物和聚精氨酸和Gln-Asn聚合物复合的核酸的纳米颗粒的溶液。混合步骤进行的方式使得核酸的剪切最小化，同时产生平均直径小于约200纳米的纳米颗粒。据信，聚精氨酸与核酸的小沟内磷酸酯基团的负电荷复合，聚精氨酸环绕在三聚体核酸复合物的周围。在聚精氨酸的任一末端，其他部分，如TAT多肽、甘露糖或半乳糖可以与聚合物共价结合以引导核酸复合物结合至特定组织，如当使用半乳糖时的肝脏。尽管不被理论所束缚，申请人相信Gln-Asn聚合物通过与核酸的碱基的氢键合而与核酸的大沟内的核酸复合物相复合。聚精氨酸和Gln-Asn聚合物应当以2摩尔/每摩尔具有20个碱基对的核酸的浓度存在。对于具有超过20个碱基对的核酸，浓度应当成比例增加。例如，如果核酸有25个核苷酸对，聚合物的浓度应为2.5-3摩尔/每摩尔双链核酸。可以通过标准方法如大小排阻色谱法以及随后的透析法纯化获得的纳米颗粒。然后可以使用本领域众所周知的技术冻干纯化的复合的纳米颗粒。本发明的一个实施方案提供了包含单链RNAi分子的小于100纳米(nm)的纳米颗粒。

(iii) 治疗

适于使用本发明的单链RNAi分子(任选取代的或修饰的或缀合的)、其组合物和本发明的方法治疗的受试者(例如，哺乳动物、人)包括患有一种或多种由目标基因或序列的异常表达水平至少部分介导的疾病或状况的那些受试者，具有发展由目标基因/序列的异常水平引起或与之相关的疾病的风险的那些受试者，或者适于通过由补充或增加相应ssRNAi分子介导的RNAi的水平而治疗的那些受试者，包括过度增殖的(例如，癌症)、血管生成的、代谢的或炎症的(例如，关节炎)的疾病或病症或状况。

本文公开的组合物和方法可用于治疗广泛种类的目标病毒，包括逆转录病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、冠状病毒以及呼吸道病毒，包括人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、人副流感病毒、鼻病毒和流感病毒。

在其他实例中，本发明的组合物和方法可用于作为治疗工具来治疗或预防，例如，过度增殖病症的症状。示例性的过度增殖病症包括肿瘤、癌、肉瘤、肿瘤或癌症。更多示例性的过度增殖病症包括口腔癌、咽喉癌、喉头癌、食道癌、咽癌、鼻咽癌、口咽癌、胃肠道癌、胃肠道间质瘤(GIST)、小肠癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肛门癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、外阴癌、阴道癌、尿道癌、膀胱癌、肾癌、肾上腺皮质癌、胰岛细胞癌、胆囊癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、滋养细胞肿瘤、睾丸癌、阴茎癌、骨癌、骨肉瘤、肝癌、肝外胆管细胞癌、皮肤癌、基底细胞癌(BCC)、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑癌、黑色素瘤、卡波济氏肉瘤、眼癌、头颈部癌、头颈部鳞状细胞癌、tymoma、胸腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、Hippel-Lindau综合征、白血病、急性髓细胞白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性胸膜间皮瘤、Barrett氏腺癌、肾母细胞瘤等。在其他实例中，本发明的组合物和方法可用于作为治疗工具来调节一种或多种目标基因的表达以治疗或预防，例如，炎症病症的症状。示例性炎症病症包括糖尿病、类风湿关节炎、在发炎的滑膜衬中的血管翳生长、胶原诱导的关节炎、脊椎关节炎、强直性脊柱炎、多发性硬化、脑脊髓炎、炎症性肠疾病、Chron氏病、牛皮癣或银屑病性关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、动脉粥样硬化和过敏。

可以用本发明的单链RNAi分子、组合物和方法治疗的其他示例性病症包括代谢性病症、心脏疾病、肺部疾病、新血管形成、缺血性病症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、肾小球性肾炎、糖尿病、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、淋巴管生成和动脉粥样硬化。

在额外的方面，提供了组合制剂和方法，其包含与一种或多种第二或辅助活性剂组合的有效量的一种或多种单链RNAi分子，所述第二或辅助活性剂与本发明的单链RNAi分子一起配制或与之协同施用以控制本文所述的一种或多种目标基因相关疾病或状况。在这些组合制剂和协同治疗方法中有用的辅助治疗剂包括，例如，酶核酸分子，变构核酸分子，引导、诱饵或适配子核酸分子，抗体如单克隆抗体，小分子和其他有机或无机化合物包括金属、盐和离子，和其他药物和活性剂，其指定用于治疗一种或多种目标基因相关的疾病或状况，包括用于治疗癌症的化疗剂，类固醇，非甾体类抗炎药(NSAID)等。示例性的化疗剂包括烷基剂(例如，顺铂、奥沙利铂、卡铂、白消安、亚硝基脲、氮芥、乌拉莫司汀、替莫唑胺)、抗代谢物(例如，氨基喋呤、氨甲喋呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷)、紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他赛) 、蒽环类霉素(例如，阿霉素、柔红霉素、表柔比星、idaruicin、米托蒽醌、戊柔比星)、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素、羟基脲、拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷)、单克隆抗体(例如，阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗)、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨)、环磷酰胺、强的松、亚叶酸、奥沙利铂。

为了实施本发明的协同施用方法，在协同治疗方案中与本文所述或本领域已知的一种或多种第二或辅助治疗剂同时或依次施用单链RNAi分子。可以以任一种顺序来进行协同施用，可以有时间期间，而只有一种或两种(或所有)活性治疗剂单独或共同地发挥其生物活性。所有这样的协同治疗方法的一个区别方面在于，组合物中存在的一种或多种单链RNAi分子引起一些有利的临床反应，其可能与或可能不与第二治疗剂提供的第二临床反应相结合。例如，本文设想的单链RNAi分子与第二治疗剂的协同施用可以产生比纯化的单链RNAi分子和第二治疗剂单独地任一种或两种引发的治疗反应增强的(例如，协同的)治疗反应。

药学有效剂量是预防、抑制发生、或治疗(在某种程度上减轻症状，优选所有症状)疾病状态所需的那种剂量。药学有效剂量取决于疾病类型、使用的组合物、施用途径、待治疗的受试者的类型、正在考虑的用于治疗的特定受试者的身体特征(例如，年龄、体重、总体健康、性别、膳食)、并存的药物、排泄速率、药物组合、经历治疗的特定疾病的严重性以及医学领域技术人员将认识到的其他因素。例如，取决于本发明的单链RNAi分子的功效，可以施用约0.1 mg/kg－约100 mg/kg体重/天的活性成分的量(约0.5 mg－约7 g/患者/天)。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于治疗的宿主和具体施用方式而变化。剂量单位形式通常包含约1 mg－约500 mg活性成分。

可以通过本领域技术人员已知的各种方法将核酸分子施用于细胞或生物体，包括施用包含单链RNAi分子的制剂，或进一步包含一种或多种额外组分如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、辅助剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等的制剂。在某些实施方案中，可以将本发明的单链RNAi分子和/或多肽封装在脂质体中，通过离子电渗疗法施用，或并入其他媒介物如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、生物粘附性微球或蛋白性载体(参见，例如，PCT公开号WO 00/53722)。或者，通过直接注射或通过使用的输液泵局部递送核酸/肽/媒介物组合物。可以使用标准针和注射器方法，或通过无针的技术，如Conroy等人, (1999, Clin.Cancer Res.5:2330)和PCT公开号WO 99/31262中所述的那些进行本发明的核酸分子的直接注射，无论皮下的、肌内的或皮内的。

本发明的制剂(其具有足以治疗或预防与目标基因的表达相关的疾病的足够量的单链RNAi分子)例如，适合用于局部(例如，乳膏、软膏、皮肤贴剂、滴眼剂、滴耳液)应用或施用。其他施用途径包括经口、肠胃外、舌下、膀胱冲洗、阴道、直肠、肠、栓剂、鼻和吸入。如本文使用的，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、腹腔内、腹膜内、关节内、眼内或眼球后、耳内、鞘内、腔内、体腔内、椎管内、肺内或经肺、滑液内和尿道内注射或输注技术。本发明的组合物也可以配制并使用为用于口服施用的片剂、胶囊剂或酏剂，用于直肠施用的栓剂，用于注射施用的无菌溶液或悬浮液，有或没有本领域中已知的其他化合物。对于给非人动物的施用，组合物也可以加入动物饲料或饮用水中。配制动物饲料和饮用水组合物可以是方便的，以便动物连同其饮食接受治疗合适量的组合物。将组合物呈现为预混合料用于加入饲料或饮用水中也可以是方便的。

用于递送核酸分子如本发明的单链RNAi分子的进一步的方法已经描述于，例如 Boado等人, 1998, J. Pharm.Sci 87:1308；Tyler等人, 1999, FEBS Lett. 421:2m；Pardridge等人, 1995, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:5592；Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev. 15:73；Aldrian-Herrada等人. 1998, Nucleic Acids Res. 26:4910；Tyler等人, 1999, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:7053；Akhtar等人, 1992, Trends Cell Bio. 2:139；"Delivery Strategies for Guide Oligonucleotide Therapeutics," ed. Akhtar, 1995, Maurer等人, 1999 MoI. Membr. Biol. 16:129；Lee等人, 2000, ACS Symp. Ser. 752:184。除了体内和治疗应用，本领域技术人员将理解，本发明的单链RNAi分子可用于多种体外应用中，如在科学和商业研究(例如，阐明生理途径、药物发现和开发)以及医疗和兽医诊断中。

本说明书中提到的所有美国专利、美国专利公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请、非专利出版物、图和网站完整地通过引用并入本文。

表1列出了某些内源人miRNA序列，其中验证的或预测的种子序列用大写表示。表1中的所有miRNA序列以5'至3'方向显示。本发明的其他miRNA序列可以从miRBase数据库(其内容通过引用并入本文)发现。

表1：

实施例1

通过单链miR-124类似物抑制VAMP3表达

RT-qPCR测定-在补充10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的McCoy's 5A培养基(Mediatech Inc.)中培养HCT-116细胞。在转染前24小时以6000细胞/孔的密度将这些细胞铺在96孔培养板中。

使用Opti-MEM I低血清培养基(Gibco)和Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) 进行转染，使用10nM的最终miRNA浓度的数据见图1和2中，使用沿12点滴定曲线从30 nM下降至0.01 nM的数据见图3中。

转染后24小时，细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤并用TaqMan?基因表达细胞-至-CT?试剂盒(Applied Biosystems/Ambion)处理以提取RNA，合成cDNA，并在ABI Prism 7900HT序列检测仪上使用VAMP3-特异性探针(Applied Biosystems)进行RT-qPCR。

逆转录条件如下：在37℃ 60分钟，随后在95℃ 5分钟。RT-qPCR条件如下：在50℃ 2分钟，在95℃ 10分钟，随后在95℃ 15秒和在60℃ 1分钟的40个循环。使用GUSB mRNA水平用于数据均一化。将VAMP3的敲低计算为实验处理的细胞中测量的VAMP3 cDNA相对于未靶向的对照处理的细胞中测量的VAMP3 cDNA的2倍变化。

报道分子测定-在补充10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的McCoy's 5A培养基(Mediatech Inc.)中培养HCT-116细胞。在转染前24小时以25,000细胞/孔的密度将这些细胞铺在96孔培养板中。

使用Opti-MEM I低血清培养基(Gibco)和Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 进行转染，使用10nM的最终miRNA浓度的数据显示在图4和图5中，使用沿6点滴定曲线从30 nM下降至0.01 nM的数据显示在图6中。miRNA与包含克隆的目标插入物的siCHECK2载体(Genscript)共转染，所述目标插入物由与miR-124的种子匹配序列(2x;图6A)或与miR-124的全长匹配序列(2xFL；图6B)的串联重复序列组成。

转染后24小时，用新鲜生长培养基更换转染培养基。转染后48小时，裂解细胞，在Wallac EnVision 2103多标记读数仪(PerkinElmer)上使用Dual-GloTM荧光素酶测定系统(Promega)测定萤火虫和海肾荧光素酶活性。用萤火虫荧光素酶使海肾荧光素酶活性均一化，最终的数据被计算为实验处理的细胞中相对于未靶向的对照处理的细胞中海肾荧光素酶信号的2倍变化。

寡核苷酸合成-使用本领域众所周知的方案(固相合成)采用商业上可获得的亚磷酰胺合成寡核苷酸，随后通过反相固相萃取(SPE)进行纯化。C3 (C₃₃H₄₃N₂O₅P)和C6 (C₃₆H₄₉N₂O₅P) 亚磷酰胺购自ChemGenes。

简言之，使用本领域通常已知的操作使用亚磷酰胺化学法在自动化固相合成仪上合成单链寡核苷酸(参见例如作为US 20090176725公开的美国申请号12/064,014)。用第一个核苷残基(天然的或化学修饰的)衍生的固体支持体包装合成柱。通过酸不稳定的5'-O-二甲氧基三苯甲基的脱三苯甲基作用以释放5'-羟基来起始合成。将乙腈中的合适保护的亚磷酰胺和合适的活化剂同时递送给合成柱，从而导致亚酰胺与5'-羟基的偶联。随后用溶剂如乙腈洗涤柱。将氧化溶液如碘溶液泵过柱以使亚磷酸三酯键P(III)氧化成其磷酸三酯P(V)类似物。在2,6-二甲基吡啶和N-甲基咪唑存在的情况下，使用试剂例如乙酸酐对未反应的5'-羟基加帽。延伸循环由脱三苯甲基作用步骤重新开始用于下一次亚磷酰胺掺入。重复这个过程直至合成所需序列。用最后的5'-末端保护基团(三苯甲基或5’-O-二甲氧基三苯甲基)终止合成。

合成结束后，在氩压力或真空下干燥固体支持体和结合的寡核苷酸。添加水性碱且使混合物加热，以切割琥珀酰键，去除磷酸氰乙酯保护基团并且使环外胺保护脱保护。

对不包含核糖核苷酸的单链进行下述过程。用水性碱处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用DMSO漂洗固体支持体，将其与滤液组合。所得到的碱性溶液允许保有5’-O-二甲氧基三苯甲基基团，以保留在5'末端位置上(三苯甲基存在(trityl-on))。

对包含核糖核苷酸的单链，进行下述过程。用水性碱处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用二甲亚砜(DMSO)漂洗固体支持体，将其与滤液组合。将氟化物试剂如三氢氟酸三乙胺加入混合物中，并使溶液加热。用合适的缓冲液猝灭反应，以提供在最后的5'末端位置上具有5’-O-二甲氧基三苯甲基的粗制单链的溶液。

每种粗制单链的三苯甲基存在溶液使用层析纯化例如SPE RPC纯化进行纯化。三苯甲基基团的疏水性质允许所需全长寡核苷酸相比于非三苯甲基化的截短的失败序列的更强保留。失败序列用合适溶剂例如低百分比的乙腈从树脂选择性洗涤。保留的寡核苷酸随后用三氟乙酸在柱上进行脱三苯甲基，以去除酸不稳定的三苯甲基基团。从柱中洗涤残留酸，进行盐交换，并且开始材料的最后脱盐。全长寡核苷酸用水性-有机溶剂以纯化的形式回收。最终产物随后就纯度(HPLC)、身份(Maldi-TOF MS)和得率(UV A₂₆₀)进行分析。寡核苷酸经由冻干或真空浓缩进行干燥。

结果 – 测试单链miR-124类似物抑制已知目标VAMP3表达的能力，其中miR-124类似物在沿链的不同位置包含取代一个核苷酸的C3间隔子，或取代两个核苷酸的C6间隔子。

本研究中所用的miR-124的过客链序列是5'-GCAUUCACCGCGUGCCUUAAAU-3' (SEQ ID NO:1091)，和引导链序列是5'-UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA-3' (SEQ ID NO:1092)。测试的miR-124类似物以及对照分子如表2和下文所述。

表2:

* A、U、C、和G = 2'-脱氧-2'-氟A、U、C、和G

A、U、C、和G = 2'-O-甲基(2'-OMe) A、U、C、和G

a、g、c和u = 脱氧A、U、C、和G

t = 胸腺嘧啶

A、C、G、和U = 核糖A、C、G、或U

B =反向脱碱基的。

表2中的所有单链分子包含5'磷酸酯帽。

“G/P”代表双链miR-124，其中所述双链体在过客链和引导链的3'末端具有两个核苷酸突出端。G/P双链体的引导链是22个核苷酸长度。

SEQ ID NO:1093-1124代表单链miR-124引导链的类似物。这些分子中的每一个是G/P双链体中存在的miR-124引导链的21-核苷酸版本，其缺少22-核苷酸G/P miR-124引导链中存在的5'-尿嘧啶核苷酸。这些21-mer类似物中的所有核苷酸(除了3'腺苷，和相邻的胞嘧啶(如果存在的话))都是在核糖部分上用2'-氟化学修饰的(在表2中表示为斜体核苷酸) 。3'腺苷，和相邻的胞嘧啶(如果存在的话)是在核糖部分上用2'-O-甲基化学修饰的(在表2中表示为下划线的核苷酸) 。最后，miR-124引导链的21-mer类似物在沿链的各个指定位置包含取代一个核苷酸的C3间隔子("c3spacer"类似物)，或取代两个核苷酸的C6间隔子("c6spacerdel2"类似物)。例如，“21-8p-c3spacer-20”代表21-mer miR-124引导链类似物，其在21-核苷酸miR-124引导链内20位的核苷酸的地方包含乙二醇间隔子，所述乙二醇间隔子连接19位和21位的核苷酸。作为另一个实例，标记为“21-8p-c6spacerdel2-19”的类似物代表在21-核苷酸miR-124引导链内19位和20位的核苷酸的地方包含己烷间隔子，所述己烷间隔子连接18位和21位的核苷酸。如表2中所示，一些21-核苷酸miR-124引导链类似物在附图中具有不同的名称。例如，SEQ ID NO:1116代表的21-mer miR-124引导链类似物在图1和图3中被称为“21-8p-c6spacerdel2-15”，在图2中则被称为“c6del2pos15spacer”。

“UC3”代表非靶向的化学修饰的双链体。

“124(21)-8p-16rrr”代表miR-124引导链的21-核苷酸版本的类似物。该分子不包含内部间隔子。所有的核苷酸用2'-氟代修饰，除了是RNA的核苷酸16-18和用2'-O-甲基修饰的核苷酸21和22。

“124(21)-8p”代表miR-124引导链的21-核苷酸版本，其中核苷酸1-20用2'-氟代修饰，核苷酸20和21用2'-O-甲基修饰。“124(21)-8P”是该类似物在图1中的名称；“G-全氟代(G-all Fluoro)”是该类似物在图2中的名称；和“pG-氟代(pG-Fluoro)”是该类似物在图4中的名称。

“miR-124”是G/P双链体的单链引导链。它是22个核苷酸长度并且是未修饰的。

“C6delpos15spacer/P”代表双链miR-124双链体，其中所述引导链具有“21-8p-c6spacerdel2-15”的结构(SEQ ID NO:1116)，且过客链是22-核苷酸miR-124过客链(SEQ ID NO:1091)。

图1和图2显示使用上述RT-qPCR测定的表2中所述的单链miR-124类似物抑制VAMP3目标表达的程度。图1显示了包含C3间隔子的单链miR-124类似物的抑制程度。图2显示了包含C6间隔子的单链miR-124类似物的抑制程度。每个图中更长的条表明VAMP3的更大的敲低。一式两份的条表明生物学重复，每个代表来自用指定的核酸分子转染的细胞(在两个单独的板上)的单独孔的数据。间隔子似乎在miR-124类似物的19位和在15位附近是耐受性最好的。

图3中的图表示对图1和2中测试的类似物的亚组(序列参见表2)的VAMP3表达的剂量依赖性反应。VAMP3表达沿y轴表示，因此具有沿该轴更低值的数据点表示更大的VAMP3表达敲低。测试的miR-124类似物的剂量沿x轴表示，范围从左侧的最低剂量至右侧的最高剂量。尽管双链版本(G/P和c6del2pos15spacer/P)比单链类似物更有效，值得注意的是，单链的“G-全氟代”类似物(没有内部间隔子，核苷酸1-20是2'-氟代的，核苷酸20和21是2'-O-甲基的)的表现与用C3间隔子替代15位(c3pos15spacer)或19位(c3pos19spacer)的可比较的单链类似物几乎相同。

图4和图5显示来自图1和图2中测试的相同单链miR-124类似物的筛选的数据，其测量共转染的荧光素酶报道分子的敲低，所述报道分子携带与miR-124的种子区域匹配的两个目标位点。因此，来自该测定的数据代表测试的类似物的miRNA活性。图4显示了包含C3间隔子的单链miR-124类似物的抑制程度。图5显示了包含C6间隔子的单链miR-124类似物的抑制程度。一式两份的条表明生物学重复，每个代表来自用指定的分子转染的细胞(在两个单独的板上)的单独孔的数据。再次，更长的条表示更大的抑制，其显示在19位或在15位附近包含间隔子的类似物具有最大的敲低活性。

图6中的图表示对图3中测试的类似物的亚组的两种不同的荧光素酶报道分子的目标表达抑制的剂量依赖性反应。在图6A中，显示的抑制活性针对具有与miR-124种子区域的两个匹配的荧光素酶报道分子。因此，其代表测试的类似物的miRNA活性。在图6B中，显示的抑制活性针对具有与miR-124的两个全长匹配的荧光素酶报道分子，因此，代表测试的类似物的siRNA活性。在A和B中，G/P曲线代表完全由RNA构成的miR-124双链体的活性。pG-Fluoro/Pshort曲线代表与全RNA过客链形成双链的主要用2'-氟核苷酸修饰的引导链的活性。pG-Fluoro曲线代表主要用2'-氟核苷酸修饰的单链miR-124引导链类似物的活性。c3pos14和c3pos19曲线代表pG-Fluoro类似物的活性，其与pG-Fluoro不同在于包含取代14位(“c3pos14”)或19位(“c3pos19”)的3-碳间隔子(C3-间隔子)。所有单链类似物比任一种双链体都显示出针对仅具有种子匹配的报道分子的更低的效力，但是它们在所有浓度彼此有效地等价，并在最高浓度显示出与双链体相似的活性(图6A)。针对具有全长匹配的报道分子，所有RNA双链体(“G/P”)仍然表现最强，但是包含间隔子的单链类似物与具有2'-氟代引导链(“pG-Fluoro/Pshort”)和单链(“pG-Fluoro”)的双链体具有一样强或更强的活性。

实施例2

ApoB mRNA的单链RNAi敲低

RT-qPCR测定(初始筛选和剂量-响应曲线)-在补充10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和1％碳酸氢钠的Dulbecco's Modified Eagle培养基中培养Hepa1-6细胞。在转染前24小时以3000细胞/孔的密度将这些细胞铺在96孔培养板中。

根据制造商说明书使用Opti-MEM I低血清培养基和Lipofectamine RNAiMAX进行转染。最终的单链siRNA浓度为100 nM和10 nM。

转染后24小时，细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤并根据制造商说明书用TaqMan基因表达细胞-至-CT?试剂盒处理以提取RNA，合成cDNA，并在ABI Prism 7900HT序列检测仪上使用ApoB特异性Taqman引物/探针组进行RT-qPCR。

逆转录条件如下：在37℃ 60分钟，随后在95℃ 5分钟。RT-qPCR条件如下：在50℃ 2分钟，在95℃ 10分钟，随后为在95℃ 15秒和在60℃ 1分钟的40个循环。使用GAPDH mRNA水平用于数据均一化。

将ApoB的敲低计算为实验处理的细胞中测量的ApoB cDNA相对于未靶向的对照处理的细胞中测量的ApoB cDNA的2倍变化。

结果–以两个不同的浓度(100 nM和10 nM)用在15、16、17、18或19位(相对于寡核苷酸的5')具有引入的C3间隔子的单链(引导链)寡核苷酸测量ApoB mRNA的敲低。结果显示于图7中。所有测试的单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2'-脱氧-2'-氟核苷酸与5'磷酸酯构成。每个分子的两个3'末端核苷酸是2'-O-甲基核苷酸。单链分子“485”(参见图7；5'-UUAAGAGAAGCCUUACUGGUU-3' (SEQ ID NO:1135))是不包含C3间隔子的21-核苷酸分子，且靶向ApoB mRNA的核苷酸位置485。C3间隔子被引入分子485的位置15 ("485 c3pos15"；SEQ ID NO:1136)、16 ("485 c3pos16"；SEQ ID NO:1137)、17 ("485 c3pos17"；SEQ ID NO:1138)、18 ("485 c3pos18"；SEQ ID NO:1139)或19 ("485 c3pos19"；SEQ ID NO:1140) (即，间隔子代替485分子的指定核苷酸)。例如，信号链分子"485 c3pos15"由5'-UUAAGAGAAGCCUU(C3-spacer)CUGGUU-3'；SEQ ID NO:1136)表示。如图7中所示，在18或19位引入C3间隔子在两个不同的浓度(100nM和10nM)既被很好耐受，又改善mRNA敲低。该数据表明，在单链RNA干扰寡核苷酸的3'末端引入非核苷酸C3碳间隔子改善了mRNA敲低的效力(图7)。

为了评价在单链中引入C3间隔子是否更广泛地适用，在两个浓度(100nM和10nM)评价靶向ApoB的30个不同的单链序列，每个序列在18位(图8)或19位(图9)具有C3间隔子。在图8和图9中，单链分子由ApoB mRNA内它们靶向的位置表示。所有测试的单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2'-脱氧-2'-氟核苷酸与5'磷酸酯构成。每个分子的两个3'末端核苷酸是2'-O-甲基核苷酸。在图8和图9中评价的单链RNAi分子的序列标识符(SEQ ID NO:)列于表3中。

表3：

在图8和图9中，将数据针对没有C3间隔子的相应的单链分子均一化。与单链对照(无C3间隔子)相等的敲低量在0处居中，而正值表示C3间隔子的引入赋予mRNA敲低的改善。负值表示C3间隔子包含的不利影响。注意，由于体外测定的实验变异，只有大于+0.5或小于-0.5的值被认为是显著的。例如，在ApoB分子485的18位包含C3间隔子相对于单链对照没有显著改善，因为图8中的敲低的差异小于0.5。但是，在相同单链引导分子的19位处包含C3间隔子具有敲低的显著改善(参见图9)。总体而言，在19位处包含C3间隔子是优选的，因为对于测试的30个不同的序列的大多数而言，在该位置的引入似乎改善了mRNA敲低的效力(73%)。

在图10中，比较使用靶向图8和图9中测试的30个不同的ApoB靶向位点中的每一个的单链分子在100nM浓度的ApoB mRNA敲低 – 无C3间隔子的单链(“all-flu-p”)、在18位具有C3间隔子的单链("all-flu-c3-18-p")和在19位具有C3间隔子的单链("all-flu-c3-19-p")。所有测试的单链分子由在嘧啶和嘌呤核苷酸处的2'-脱氧-2'-氟核苷酸与5'磷酸酯构成。每个分子的两个3'末端核苷酸是2'-O-甲基核苷酸。在图10和图9中评价的单链RNAi分子的序列标识符(SEQ ID NO:)列于表3中。图10显示了对于不同的单链序列的mRNA敲低的总体功效的范围。例如，靶向ApoB目标位点485的单链分子是最大限度地有效的，而其他的如靶向ApoB目标位点780或10219的那些具有有限的基因敲低。对于30个不同序列中的每一个，将图10中所示的mRNA敲低针对不包含C3间隔子的相应链("all-flu-p")进行均一化。

Claims (22)

1.单链RNA分子，其介导针对目标RNA的RNA干扰，其中所述单链RNA包含：

(a) 核酸部分，包含不是自我互补的第一核苷酸部分(N1)和第二核苷酸部分(N2)，其中所述核酸部分包含可以与所述目标RNA的目标位点碱基配对的至少8个核苷酸，并且其中所述核酸部分内的核苷酸总数为8-26个核苷酸；和

(i) 内部间隔子部分，其中所述间隔子部分包含至少一个第一非核苷酸间隔子部分(S1)，所述第一非核苷酸间隔子部分(S1)共价连接所述第一和第二核苷酸部分。

2.权利要求1的核苷酸，其包含下述结构：

5'  N1–S1–N2  3'

其中：

(a) N1含有一个核苷酸或一段连续的核苷酸；

(b) S1含有一个或多个共价连接N1和N2的非核苷酸间隔子；和

(c) N2含有一个核苷酸或一段连续的核苷酸。

3.权利要求1或2的分子，其中S1是脂族或芳族有机基团。

4.权利要求1-3中任一项的分子，其中S1是任选取代的C₁-C₁₂烷基链。

5.权利要求4的分子，其中所述烷基链任选地用胆固醇取代。

6.权利要求1-5中任一项的分子，其中S1选自C3烷基、C6烷基和聚乙二醇。

7.权利要求1-6中任一项的分子，其中N1是13至20个核苷酸长。

8.权利要求1-7中任一项的分子，其中所述核酸部分内的核苷酸总数为约19至约21个核苷酸。

9.权利要求1-8中任一项的分子，其中所述目标位点在所述目标RNA的非翻译区域内。

10.权利要求9的分子，其中所述可以与所述目标位点碱基配对的至少8个核苷酸是天然存在的内源miRNA核苷酸序列的种子序列的全部或部分。

11.权利要求10的分子，其中S1代替所述天然存在的内源miRNA核苷酸序列的1至4个内部核苷酸。

12.权利要求9-11中任一项的分子，其中所述分子的所述核酸部分与所述天然存在的内源miRNA核苷酸序列至少50%同源。

13.权利要求1-8中任一项的分子，其中所述目标位点在所述目标RNA的基因编码区域内。

14.权利要求1-13中任一项的分子，其中所述分子的所述核酸部分与所述目标位点至少90%互补。

15.权利要求1-14中任一项的分子，其中所述核酸部分包含可以与所述目标位点碱基配对的至少20个核苷酸。

16.权利要求1-15中任一项的分子，其中所述核酸部分进一步包含第三核苷酸部分(N3)，并且所述内部间隔子部分进一步包含第二非核苷酸间隔子部分(S2)。

17.权利要求1-16中任一项的分子，其中至少一个核苷酸具有修饰的糖。

18.权利要求1-17中任一项的分子，其中至少一个核苷酸具有修饰的核苷间键。

19.权利要求1-18中任一项的分子，其在5'-末端、3'-末端或5'-和3'-末端具有末端帽。

20.组合物，其包含权利要求1-19中任一项的单链RNA分子和药学上可接受的载体。

21.权利要求20的组合物，其进一步包含脂质体、水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、生物粘附性微球或蛋白性载体。

22.降低细胞中内源RNA目标基因的表达的方法，其包括施用权利要求20或权利要求21的组合物。

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