JP2020074788A - 内部非核酸スペーサーを含む一本鎖ＲＮＡｉ剤 - Google Patents

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Abstract

【課題】新規な一本鎖ＲＮＡｉ分子の提供。【解決手段】標的ＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介する一本鎖ＲＮＡ分子であって、前記一本鎖ＲＮＡが：（ａ）自己相補的でない第１のヌクレオチド部分（Ｎ１）と第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）を含む核酸部分（ここで、当該核酸部分は、標的ＲＮＡの標的部位と塩基対形成し得る少なくとも８個のヌクレオチドを含むものであり、該核酸部分内のヌクレオチドの総数は８〜２６ヌクレオチドである）；および、（ｉ）内部スペーサー部分（ここで、当該スペーサー部分は、第１のヌクレオチド部分と第２のヌクレオチド部分を共有結合によって連結する少なくとも第１の非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ１）を含むものである）、を含む一本鎖ＲＮＡ分子。【選択図】図９

Description

関連出願の相互参照：本出願は、２０１０年８月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／３７６，４７１号の恩典を主張し、該仮出願は引用により本明細書に組み込まれる。
本発明は、内部非核酸スペーサーを含む一本鎖ＲＮＡｉ剤に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路は、進化的に保存された遺伝子調節様式である。ＲＮＡｉ
プロセスは、種々の外来性または内在性の供給源（例えば、実験による導入、ウイルス感
染）により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。ｄｓＲＮＡがダ
イサーによって切断されると、２０〜２５ヌクレオチドの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ
）二本鎖が生成される。このような二本鎖は、次いで、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合
体（ＲＩＳＣ）に負荷され、ＲＩＳＣが活性化される前に該二本鎖のパッセンジャー／セ
ンス鎖が外れる。単独のガイド／アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したままであり、標的
ｍＲＮＡの切断を指令する。したがって、二本鎖ｓｉＲＮＡは、研究および核酸系治療薬
の両方に対して重要なツールとなっている。
ＲＮＡｉ遺伝子サイレンシングは、一本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子によって
行われ得る。ここ１０年間に、一本鎖アンチセンスｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡ二本鎖をほぼ
同程度に効力があることが報告されている（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特
許文献３；および非特許文献４を参照のこと）。二本鎖型とは対照的に、遺伝子サイレン
シングのための一本鎖ＲＮＡ分子の使用にはメリットがある。その分子量が小さいことに
より、細胞膜を通過することがより容易となり得る。また、一本鎖ＲＮＡ分子は、質量と
体積が二本鎖ｓｉＲＮＡの半分であり、製造コストの利点も示唆される。したがって、依
然として、一本鎖ＲＮＡｉ分子に適した新規で好都合な設計上の特徴の設定における関心
が高まっている。
Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：５３７−５４８ Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｅｌｌ １１０：５６３−５７４ Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５ Ｈｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２４０１−２４０７
本開示により、
（ａ）２つ以上のヌクレオチド部分を含む核酸部分、および（ｂ）１つ以上の非ヌクレオ
チドスペーサー部分を含む内部（「末端」と対照的）スペーサー部分を含み、該非ヌクレ
オチドスペーサー部分が該分子の２つのヌクレオチド部分を共有結合によって連結してい
る一本鎖ＲＮＡ分子を提供する。本発明の一本鎖ＲＮＡ分子のヌクレオチド部分は互いに
相補的でなく、したがって、前記部分は塩基対を形成しない。本発明の一本鎖ＲＮＡ分子
は、ＲＮＡ干渉機構によって遺伝子発現を阻害し得るガイド鎖またはアンチセンス鎖とし
ての機能を果たすものであり、したがって一本鎖ＲＮＡｉ剤である。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、一本鎖オリゴヌクレオチド構造を有し、標的ＲＮＡに
対するＲＮＡ干渉を媒介する。該一本鎖ＲＮＡｉ分子は：（ａ）第１のヌクレオチド部分
（Ｎ１）と第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）を含む核酸部分（前記核酸部分は、標的ＲＮ
Ａと塩基対形成し得る少なくとも８個のヌクレオチドを含み、該核酸部分内のヌクレオチ
ドの総数は８〜２６ヌクレオチドである）；および（ｂ）第１のヌクレオチド部分と第２
のヌクレオチド部分を共有結合によって連結する少なくとも第１の非ヌクレオチドスペー
サー部分（Ｓ１）を含む内部スペーサー部分を含むものである。第１のヌクレオチド部分
と第２のヌクレオチド部分は自己相補的でない。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子のすべての
数（例えば、８〜２６個）のヌクレオチドは該分子のヌクレオチド部分間に分布しており
、各ヌクレオチド部分は少なくとも１個のヌクレオチドを含むものである。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は、第１のヌクレオチド
部分（Ｎ１）および第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）と称する２つのヌクレオチド部分を
含むものである。本発明のＲＮＡｉ分子の第１のヌクレオチド部分と第２のヌクレオチド
部分は、該分子の非ヌクレオチドスペーサー部分に共有結合によって結合されている。別
の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は、１つより多くのヌクレオチ
ド部分（例えば、３、４または５つ、それぞれ、第３（Ｎ３）、第４（Ｎ４）または第５
（Ｎ５）のヌクレオチド部分と称する）を含むものである。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部スペーサー部分は、第１の非
ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ１）と称する非ヌクレオチドスペーサー部分を１つだけ
含むものである。本発明のＲＮＡｉ分子の第１の非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ１）
は、共有結合によって、２個のヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド代替部（各々
は、該一本鎖分子の相違するヌクレオチド部分内に存在している）に結合されている。別
の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部スペーサー部分は、１つより多くの
非ヌクレオチドスペーサー部分（例えば、２、３または４つ、それぞれ、第２（Ｓ２）、
第３（Ｎ３）または第４（Ｎ４）の非ヌクレオチドスペーサー部分と称する）を含むもの
である。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、細胞内のＲＮＡ標的部位に一部、実質的に、または完
璧に相補的な配列ヌクレオチドを含むものである。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、天然に存在するｍｉＲＮＡのガ
イド鎖に一部、実質的に、または完璧に相同なヌクレオチド配列を含むものであり、した
がって、ｍｉＲＮＡ模倣物としての機能を果たす。本発明の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は天
然に存在する対応ｍｉＲＮＡを基にして設計され、このとき、少なくとも１つの非ヌクレ
オチドスペーサー部分は、天然に存在するｍｉＲＮＡガイド鎖配列の２個の隣接ヌクレオ
チド間に存在しているか、または天然に存在するｍｉＲＮＡガイド鎖配列の１〜約１２個
の内部（すなわち、非末端）ヌクレオチドの代わりに置き換えられているかのいずれかで
ある。
別の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、一本鎖ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓ
ｉＲＮＡのガイド／アンチセンス鎖のいずれかの類似体であり、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は
、対応する一本鎖ｓｉＲＮＡまたは対応する二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド鎖に一部、実質的
に、または完璧に相同な配列を含むものである。対応する一本鎖ｓｉＲＮＡまたは二本鎖
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機構によって遺伝子発現を阻害することが知られたものであり得
る。この実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は一本鎖ｓｉＲＮＡ模倣物である。本
発明の一本鎖ｓｉＲＮＡ模倣物は対応ｓｉＲＮＡを基にして設計され、このとき、少なく
とも１つの非ヌクレオチドスペーサー部分は、ｓｉＲＮＡガイド鎖配列の２個の隣接ヌク
レオチド間に存在しているか、または対応ｓｉＲＮＡガイド鎖配列の１〜約４個のヌクレ
オチドの代わりに置き換えられているかのいずれかである。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、置換、化学修飾ヌクレオチド、および非ヌクレオチド
（例えば、主鎖、糖鎖、塩基またはヌクレオシドにおける置換または修飾）を含むもので
あってもよい。一部の特定の実施形態において、置換または修飾された本開示の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子の使用により、この分子は被検体または生物学的試料中（例えば、血清中）に
おいて半減期が増大するように設計されたものであり得るため、低用量で所与の治療効果
の達成が可能となり得る。さらに、特定の細胞もしくは組織を標的化することによって、
または一本鎖ＲＮＡｉ分子の細胞内取込みを改善することによって、一本鎖ＲＮＡｉ分子
のバイオアベイラビリティを改善するために特定の置換または修飾が使用され得る。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部スペーサー部分は、１つ以上の非ヌクレオチドスペ
ーサー部分を含むものであってもよい。非ヌクレオチドスペーサー部分は、任意の脂肪族
または芳香族の化学基（さらに置換されていてもよい）を含むものであってもよく、前記
スペーサー部分にはヌクレオチドが含まれていない。該スペーサー部分は、該一本鎖ＲＮ
Ａｉ分子にさらなる官能部を提供する化学部分で置換されたものであり得る。例えば、非
ヌクレオチドスペーサー部分は、対象の標的分子に特異的に結合する部分、または該分子
の細胞内送達を助長／増進する部分で置換されたものであり得る。本発明の一実施形態に
おいて、非ヌクレオチドスペーサー部分としては、好ましくは炭素数が１〜２０のアルキ
ル、アルケニルまたはアルキニル鎖（これらは置換されていてもよい）が挙げられる。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、さまざまな治療的、診断的、標的確認、ゲノム知得、
遺伝子操作および薬理ゲノミクスの適用用途のための方法において使用され得る有用な試
薬である。したがって、本発明は、さらに、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む組成物、
および細胞または生物体において１種類以上の対応する標的ｍＲＮＡの発現を阻害するた
めの方法を含む。本開示により、被検体（ヒト細胞、組織または個体を包含する）を処置
するための方法および一本鎖ＲＮＡｉ分子組成物を提供する。
ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用し、Ｃ３スペーサーを含む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体によるＶＡＭＰ３標的の発現の阻害度合いを示す。該類似体の構造および配列は、表２（後述）に具体的に示している。このｍｉＲ−１２４類似体の模式図において、丸印は、５’末端に存在する黒丸が５’リン酸基を表すこと以外、ヌクレオチドを表す。白丸は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを表す。この模式図の３’末端に存在する黒丸は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表し、「３」はＣ３スペーサーの位置を表す。「１２４（２１）−８ｐ−１６ｒｒｒ」類似体の模式図において、３つの内部の黒丸は非修飾リボヌクレオチドを表す。グラフにおいてバーが長いほどノックダウンが大きいことを示し、二連のバーは生物学的同型体を示す。 ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用し、Ｃ６スペーサーを含む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体によるＶＡＭＰ３標的の発現の阻害度合いを示す。該類似体の構造および配列は、表２（後述）に具体的に示している。このｍｉＲ−１２４類似体の模式図において、丸印は、５’リン酸基に存在する黒丸が５’リン酸基を表すこと以外、ヌクレオチドを表す。白丸は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを表す。この模式図の３’末端に存在する黒丸は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表し、「６」は、Ｃ６スペーサーの位置を表す。「１２４（２１）−８ｐ−１６ｒｒｒ」類似体の模式図において、３つの内部の黒丸は非修飾リボヌクレオチドを表す。グラフにおいてバーが長いほどノックダウンが大きいことを示し、二連のバーは生物学的同型体を示す。 図１と２の試験類似体のサブセットのＶＡＭＰ３発現の用量依存性応答を示す。ＶＡＭＰＳ発現をｙ軸上に示している。試験したｍｉＲ−１２４類似体（構造および配列については表２（後述）参照）の用量をｘ軸上に、左側に最小用量から右側に最大に用量までの範囲で示す。 レポーターアッセイを使用し、Ｃ３スペーサーを含む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体による阻害度合いを示す。このアッセイは、ｍｉＲ−１２４のシード（ｓｅｅｄ）領域とマッチしている２つの標的部位を有するコトランスフェクトしたルシフェラーゼレポーターのノックダウンを測定するものである。該類似体の構造および配列は、表２（後述）に具体的に示している。このｍｉＲ−１２４類似体の模式図において、丸印は、５’末端に存在する黒丸が５’リン酸基を表すこと以外、ヌクレオチドを表す。白丸は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを表す。この模式図の３’末端に存在する黒丸は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表し、「３」はＣ３スペーサーの位置を表す。「１２４（２１）−８ｐ−１６ｒｒｒ」類似体の模式図において、３つの内部の黒丸は非修飾リボヌクレオチドを表す。グラフの二連のバーは生物学的同型体を示し、長いバーほど阻害が大きいことを示す。 レポーターアッセイを使用し、Ｃ６スペーサーを含む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体による阻害度合いを示す。このアッセイは、ｍｉＲ−１２４のシード領域とマッチしている２つの標的部位を有するコトランスフェクトしたルシフェラーゼレポーターのノックダウンを測定するものである。該類似体の構造および配列は、表２（後述）に具体的に示している。このｍｉＲ−１２４類似体の模式図において、丸印は、５’末端に存在する黒丸が５’リン酸基を表すこと以外、ヌクレオチドを表す。白丸は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを表す。この模式図の３’末端に存在する黒丸は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを表し、「６」はＣ６スペーサーの位置を表す。「１２４（２１）−８ｐ−１６ｒｒｒ」類似体の模式図において、３つの内部の黒丸は非修飾リボヌクレオチドを表す。二連のバーは生物学的同型体を示し、長いバーほど阻害が大きいことを示す。 図３の試験した一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体のサブセットでの２種類の異なるルシフェラーゼレポーターの標的発現阻害の用量依存性応答を示す。表示した阻害活性は、ｍｉＲ−１２４シード領域に対して２つのマッチを有するルシフェラーゼレポーターに対するものであり、試験類似体のｍｉＲＮＡ活性を表す。 図３の試験した一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体のサブセットでの２種類の異なるルシフェラーゼレポーターの標的発現阻害の用量依存性応答を示す。表示した阻害活性は、ｍｉＲ−１２４に対して２つの完全長マッチを有するルシフェラーゼレポーターに対するものであり、試験類似体のｓｉＲＮＡ活性を表す。 １５位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１５」）、１６位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１６」）、１７位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１７」）、１８位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１８５」）、または１９位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１９」）（該オリゴ体の５’を基準）のいずれかに組み込まれたＣ３スペーサーを有するＡｐｏＢ標的化一本鎖（ガイド鎖）オリゴヌクレオチドを使用し、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを、スペーサーのない対応一本鎖オリゴヌクレオチド（「４８５」）について、２つの異なる濃度（１００ｎＭおよび１０ｎＭ）において比較したものである。一本鎖分子はすべて、ピリミジンヌクレオチドとプリンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、５’リン酸基、および３’末端の２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されたものである。 １８位にＣ３スペーサーを有する３０種類の異なるＡｐｏＢ標的化一本鎖配列を用いて、２つの濃度（１００ｎＭおよび１０ｎＭ）でＡｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンを比較したものである。該一本鎖をｘ軸上に、標的化対象のＡｐｏＢ ｍＲＮＡ内の位置によって表記している。一本鎖分子はすべて、ピリミジンヌクレオチドとプリンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、５’リン酸基、および３’末端の２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されたものである。 １９位にＣ３スペーサーを有する３０種類の異なるＡｐｏＢ標的化一本鎖配列を用いて、２つの濃度（１００ｎＭおよび１０ｎＭ）でＡｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンを比較したものである。該一本鎖をｘ軸上に、標的化対象のＡｐｏＢ ｍＲＮＡ内の位置によって表記している。一本鎖分子はすべて、ピリミジンヌクレオチドとプリンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、５’リン酸基、および３’末端の２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されたものである。 図８と９で試験した３０種類の異なる各ＡｐｏＢ標的部位を標的化する一本鎖分子を用いた１００ｎＭ濃度でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンを、Ｃ３スペーサーなしの一本鎖（「全−ｆｌｕ−ｐ」）、１８位にＣ３スペーサーを有する一本鎖（「全−ｆｌｕ−ｃ３−１８−ｐ」）、および１９位にＣ３スペーサーを有する一本鎖（「全−ｆｌｕ−ｃ３−１９−ｐ」）を用いて比較したものである。一本鎖分子はすべて、ピリミジンヌクレオチドとプリンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、５’リン酸基、および３’末端の２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されたものである。
Ａ．用語および定義
本出願書類で用いる場合、以下の専門用語および定義を適用する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「
ｔｈｅ」は、本文中にそうでないことを明示していない限り、複数の指示対象物を包含し
ている。したがって、例えば「細胞」に対する言及は２個以上の細胞の組合せを包含して
いる、などである。
濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率の範囲、または整数の範囲はいずれも、特に記載
のない限り、記載の範囲内の任意の整数値ならびに、適切な場合は、その分数（整数の１
０分の１および１００分の１など）を含むと理解されたい。「約」または「およそ」は、
数値に関して本明細書で用いる場合、特に記載のない限り、または本文から自明でない限
り、一般的に、該数値のいずれかの方向（大きい方または小さい方）の５％の範囲内に含
まれる数値を包含していると理解されたい（かかる数値が可能な値の１００％を超えるこ
とがあり得る場合を除く）。範囲を記載している場合、特に記載のない限り、または本文
から自明でない限り、両端は該範囲に含まれる。
本明細書で用いる場合、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」（〜を含む）（およびその任意の
形態、例えば、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」）、「ｃｏｍｐｒｉｓｉ
ｎｇ」（〜を含む）（およびその任意の形態、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃ
ｏｍｐｒｉｓｅｓ」）、「ｈａｖｉｎｇ」（〜を有する）（およびその任意の形態、例え
ば、「ｈａｓ」もしくは「ｈａｖｅ」）、または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」（およびその
任意の形態、例えば、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎ」）は包括的でオー
プンエンドであり、記載していないさらなる要素またはプロセス工程を排除しない。
「類似体」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示
す。該用語は、一般的に、親化合物または分子（例えば、ヌクレオチド、天然に存在する
ｍｉＲＮＡ）と構造的に類似しているが、組成物が若干異なる（例えば、１個の原子また
は官能基が異なる、付加または除去されている）化合物または分子をいう。類似体は、原
型の親化合物または分子と異なる化学的特性または物性を有するものであっても、そうで
なくてもよく、改善された生物学的活性または化学的活性を有するものであっても、そう
でなくてもよい。例えば、類似体は、親化合物／分子よりも親水性であってもよく、親化
合物／分子の活性が改変されたものであってもよい。類似体は、原型の親化合物分子は、
天然のバリアントであっても天然に存在しない（例えば、化学修飾された、または組換え
）バリアントであってもよい。ＲＮＡ類似体の一例は、ヌクレオチド類似体を含むＲＮＡ
分子である。ヌクレオチド類似体は、糖鎖、塩基またはヌクレオシドが化学修飾されたヌ
クレオチドであり、当該技術分野で一般的に認識されている。
本明細書で用いる場合、用語「模倣物」は、当該技術分野で一般に認められたその意味
を示す。該用語は、一般的に、参照分子と構造的に異なっている分子をいう。例えば、本
発明の一部の特定の実施形態の目的のための参照分子は、天然に存在するｍｉＲＮＡ分子
、または非ヌクレオチド内部スペーサーが含まれていない一本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり得
る。模倣物は、参照分子の能力の範囲内である生物学的、生理学的および／または化学的
機能のうちの１つ以上または全部を発揮できるものである。模倣物と参照分子は機能的等
価体である必要はないが、模倣物は、共有された機能を示すのに適したアッセイまたはパ
ラメータを用いて測定および比較したとき、参照分子の１つ以上の機能を発揮でき、参照
分子の活性の少なくとも５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、
５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上を発現できるもの
であるのがよい。用語「類似体」と「模倣物」は、参照ＲＮＡｉ分子と構造的に異なる本
開示のＲＮＡｉ分子を説明する場合、は、互換的に用いていることがあり得る。
用語「ヌクレオチド」は、当該技術分野で一般的に認識されたその意味を示す。ヌクレ
オチドは、一般的に、核酸塩基、糖鎖およびヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート
）で構成されている。塩基は、天然塩基（標準）であっても修飾塩基であっても塩基類似
体であってもよく、これらは、当該技術分野でよく知られている。かかる塩基は、一般的
に、ヌクレオチドの糖鎖部分の１’位に存在している。さらに、ヌクレオチドは非修飾で
あってもよく、糖鎖、ヌクレオシド間結合および／または塩基部分が修飾されていてもよ
い（互換的にヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌク
レオチドとも称される）；例えば、米国特許出願第１２／０６４，０１４号を参照のこと
。
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、
当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的にヌクレオチド鎖を
いう。「核酸」および「核酸分子」はヌクレオチドのポリマーである。したがって、「核
酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において互換的
である。当業者は、核酸が、ヌクレオチドモノマーに加水分解され得るポリヌクレオチド
であるという一般知識を有している。ヌクレオチドモノマーは、さらにヌクレオシドに加
水分解され得る。
「連続ヌクレオチド鎖」により、一連の連続した少なくとも２個のヌクレオチドを意図
する。該鎖内のヌクレオチドを接続している結合はホスホジエステル結合である。
用語「ＲＮＡ」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味
を示す。該用語は、一般的に、少なくとも１つのリボフラノシド残基（リボヌクレオチド
など）を含む分子をいう。用語「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース部分の
２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。該用語は、二本鎖ＲＮＡ、一
本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、一部精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成
ＲＮＡ、組換え作製されたＲＮＡ、または天然に存在するＲＮＡと１つ以上のヌクレオチ
ドの付加、欠失、置換および／または改変によって異なる改変ＲＮＡをいう。かかる改変
としては、例えば、ＲＮＡ分子の１個以上の非末端ヌクレオチドへの非ヌクレオチド物質
の付加が挙げられ得る。したがって、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、天
然に存在しないヌクレオチド、化学合成ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドあ
るいはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含むものであってもよい。改変
ＲＮＡは「修飾ＲＮＡ」または「ＲＮＡ類似体」と称される。
用語「ピリミジン」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその
意味を示す。該用語は、一般的に慣用的なピリミジン塩基、例えば、標準ピリミジン塩基
であるウラシル、チミジンおよびシトシンをいう。また、ピリミジンという用語には、非
標準ピリミジン塩基または酸、例えば、５−メチルウラシル、２−チオ−５−メチルウラ
シル、４−チオウラシル、プソイドウラシル、ジヒドロウラシル、オロト酸（ｏｒｏｔａ
ｔｅ）、５−メチルシトシンなど、ならびに化学修飾塩基または「ユニバーサル塩基」が
包含されることを想定しており、これらは、本開示の核酸分子において標準ピリミジンの
代わりに置き換えて使用され得る。
用語「プリン」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味
を示す。該用語は、一般的に、慣用的なプリン塩基、例えば、標準プリン塩基であるアデ
ニンおよびグアニンをいう。また、用語「プリン」には、非標準プリン塩基または酸、例
えば、Ｎ２−メチルグアニン、イノシン、ジアミノプリンなど、ならびに化学修飾塩基ま
たは「ユニバーサル塩基」が包含されることを想定しており、これらは、本明細書におい
て標準プリンの代わりに置き換えて使用され得る。
本明細書に記載のように、「塩基対」は、２個のヌクレオチド間、ヌクレオチドと修飾
ヌクレオチド間、２個の修飾ヌクレオチド間、ヌクレオチドとヌクレオチド類似体間、２
個のヌクレオチド類似体間、ヌクレオチドと非ヌクレオチド代替部分間、または２つの非
ヌクレオチド代替部分間で形成され得る。具体的な実施形態では、非ヌクレオチド代替部
は、細胞内ＲＮＡｉ機構の成分（例えば、ＰＡＺドメイン、ＰＩＷＩドメインおよび／ま
たはＲＩＳＣと結合している他のアルゴノートタンパク質ドメインなど）と関連し得る任
意の化学部分を含むものであり得る。また、従来型でないワトソンクリック塩基対は、「
非規範的な塩基対」と理解されている。非規範的な塩基対は、ミスマッチおよび／または
ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）塩基対などの任意の非ワトソンクリック塩基対、例えば、フリッ
プド（ｆｌｉｐｐｅｄ）ミスマッチ、単一水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、
三重塩基相互作用、および四重塩基相互作用を意図する。かかる非規範的な塩基対の非限
定的な例としては、限定されないが、ＡＣ逆フーグスティーン型、ＡＣゆらぎ、ＡＵ逆フ
ーグスティーン型、ＧＵゆらぎ、ＡＡ Ｎ７アミノ、ＣＣ ２−カルボニル−アミノ（Ｈ
１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ剪断型、ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＵイミノ
−カルボニル、ＡＣ逆ゆらぎ、ＡＵフーグスティーン型、ＡＵ逆ワトソンクリック、ＣＧ
逆ワトソンクリック、ＧＣ Ｎ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ対称型、Ａ
Ａ Ｎ７−アミノ対称型、ＧＡ Ｎ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−ア
ミノＮ７−Ｎ１、ＧＧ Ｎ１−カルボニル対称型、ＧＧ Ｎ３−アミノ対称型、ＣＣカル
ボニル−アミノ対称型、ＣＣ Ｎ３−アミノ対称型、ＵＵ ２−カルボニル−イミノ対称
型、ＵＵ ４−カルボニル−イミノ対称型、ＡＡ アミノ−Ｎ３、ＡＡ Ｎ１−アミノ、
ＡＣ アミノ２−カルボニル、ＡＣ Ｎ３−アミノ、ＡＣ Ｎ７−アミノ、ＡＵ アミノ
−４−カルボニル、ＡＵ Ｎ１−イミノ、ＡＵ Ｎ３−イミノ、ＡＵ Ｎ７−イミノ、Ｃ
Ｃカルボニル−アミノ、ＧＡ アミノ−Ｎ１、ＧＡ アミノ−Ｎ７、ＧＡ カルボニル−
アミノ、ＧＡ Ｎ３−アミノ、ＧＣ アミノ−Ｎ３、ＧＣ カルボニル−アミノ、ＧＣ
Ｎ３−アミノ、ＧＣ Ｎ７−アミノ、ＧＧ アミノ−Ｎ７、ＧＧ カルボニル−イミノ、
ＧＧ Ｎ７−アミノ、ＧＵ アミノ−２−カルボニル、ＧＵ カルボニル−イミノ、ＧＵ
イミノ−２−カルボニル、ＧＵ Ｎ７−イミノ、ｐｓｉＵ イミノ−２−カルボニル、
ＵＣ ４−カルボニル−アミノ、ＵＣ イミノ−カルボニル、ＵＵ イミノ−４−カルボ
ニル、ＡＣ Ｃ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡ カルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵ イミノ−４−カルボ
ニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣ アミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣ イミ
ノアミノ−カルボニル、Ｇｐｓｉ イミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニルおよ
びＧＵ イミノアミノ−２−カルボニル塩基対が挙げられる。
本明細書で用いる場合、用語「相補的な」（または「相補性」）は、当該技術分野で一
般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、ある核酸配列と別の核酸配列間で
の、従来のワトソン−クリック型または本明細書に記載の他の非従来型の結合のいずれか
による水素結合の形成または存在をいう。本発明の例示的な核酸分子に関しては、相補性
は本発明の一本鎖ＲＮＡｉとＲＮＡ標的配列との間に見られ得る。核酸分子のその相補配
列との結合自由エネルギーは、該核酸の該当する機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）が進行す
ることを可能にするのに充分なものである。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は当該
技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．
Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒら，１９８６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒら
，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）
。
本明細書で用いる場合、用語「完璧に相補的な」（または「完璧な相補性」）は、第１
の核酸分子（例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子）と第２の核酸分子（例えば、標的Ｒ
ＮＡ配列）との間において、第１の核酸配列の連続している残基のすべてが、第２の核酸
配列内の同じ数の連続している残基と水素結合することを意味する。例えば、２つ以上の
完璧に相補的な核酸鎖は、同じ数のヌクレオチドを有するものであっても（すなわち、同
じ長さを有し、突出端を有する、もしくは有しない１つの二本鎖領域を形成している）、
異なる数のヌクレオチドを有するものであってもよい（例えば、第１の鎖は、第２の鎖よ
りも短いが第２の鎖内に完全に内包されるものであり得る）。一例として、本発明の一本
鎖ＲＮＡｉ分子が、ヌクレオチド１個だけの第１のヌクレオチド部分と１０個の連続した
ヌクレオチドの第２のヌクレオチド部分を有するものであり、該分子の第２のヌクレオチ
ド部分の１０個全部のヌクレオチドがＲＮＡ標的配列と塩基対形成する場合、該ＲＮＡｉ
分子はＲＮＡ標的配列と完璧に相補的である。第１のヌクレオチド部分に含まれた単一の
ヌクレオチドは、連続したヌクレオチド鎖に存在するものでないため、相補性の度合いを
判定する際に含めない。しかしながら、この例において、第１のヌクレオチド部分が２個
のヌクレオチドを含むものである場合、第１のヌクレオチド部分の該２個のヌクレオチド
と第２のヌクレオチド部分の１０個のヌクレオチドがＲＮＡ標的配列と塩基対形成するの
であれば、該ＲＮＡｉ分子はＲＮＡ標的配列に完璧に相補的である。
相補的な核酸分子は、誤対合塩基−すなわち、従来のワトソンクリック塩基対の形成（
すなわち、水素結合の形成）の形成ができない塩基、または他の非従来型の塩基対（すな
わち、水素結合でない非従来型の力によって形成もしくは保持されて一体になった「ミス
マッチ」塩基）を有するものであってもよい。用語「一部相補的な」（または「一部相補
性」）は、第１の核酸分子（例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子）と第２の核酸分子（
例えば、標的ＲＮＡ配列）との間において、種々のミスマッチまたは塩基対を形成しない
ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の
ミスマッチまたは塩基対を形成しない形成ヌクレオチド）がヌクレオチド配列間に生じる
（これにより、例えば隆起部またはループがもたらされ得る）ことを示す。かかる一部相
補性は相補性パーセント（％）で表され得、これは、関与しているヌクレオチドの総数に
対する塩基対形成したヌクレオチドの数によって求められ、例えば、約５０％、６０％、
７０％、８０％、９０％などである。例えば、第１の核酸分子が１０個のヌクレオチドを
有するものであり得、第２の核酸分子が１０個のヌクレオチドを有するものであり得、そ
のとき、第１および第２の核酸分子間（これは、連続した二本鎖領域を形成していても形
成していなくてもよい）での５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドの塩基対形
成は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の相補性を示
すものである。本発明との関連において、かかる一部相補性は、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ
分子がその機能（例えば、配列特異的ＲＮＡｉを媒介する能力）を維持している範囲で許
容される。
第１の核酸分子は第２の核酸に「実質的に相補的な」ものであり得る。「実質的に相補
的な」により、第１の核酸配列（例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子）が第２の核酸配
列（例えば、ＲＮＡ標的配列）に、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％
、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補
的であることを意図する。本明細書で用いる場合、第１の核酸分子は第２の核酸分子に、
「一部相補的」かつ「実質的に相補的」であり得る。
本明細書で用いる場合、用語「相同な」（または「相同性」）は、当該技術分野で一般
に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、典型的には配列解析プログラムによ
って（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，ＰＮＡＳ ８７：２２
６４−２２６８；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，ＰＮＡＳ ９０：５
８７３−５８７７）または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオ
チドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。用語「完璧な相同性」（ま
たは「完璧に相同な」）は、本明細書で用いる場合、参照配列と主題の核酸配列間の完全
な（１００％）相同性または「同一性」をいう。本明細書で用いる場合、用語「実質的に
相同な」（または「実質的な相同性」）は、主題の配列が参照配列の同じヌクレオチド位
置のヌクレオチドと、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、
７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％）相同なヌクレオチドを共有していることを意図する。
語句「化学修飾」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意
味を示す。本発明の例示的な核酸分子に関しては、該用語は、天然ＲＮＡのヌクレオチド
と異なるヌクレオチドの化学構造の任意の修飾をいう。用語「化学修飾」は、本明細書に
記載の、あるいは当該技術分野で知られているような、糖鎖、塩基またはヌクレオチド間
結合における天然ＲＮＡの付加、置換または修飾を包含する。一部の特定の実施形態にお
いて、用語「化学修飾」は、特定の生物学的系内に天然に存在しているＲＮＡの特定の形
態（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾またはイノシン修飾）をいう場合があり得る。
語句「修飾ヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められ
たその意味を示す。該用語は、一般的に、当該技術分野で一般的に知られた非修飾（また
は天然）ヌクレオチドの塩基、糖鎖および／またはリン酸基の化学構造内に修飾を含むヌ
クレオチドをいう。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書および米国特許出願第
１２／０６４，０１４号に記載されている。
「修飾割合」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本明細書で用いる
場合、該用語は、一般的には、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子内の修飾されたヌクレオチドの
数をいう。化学修飾の程度は、当業者によく知られた種々の要素（例えば、標的ＲＮＡ、
オフターゲットサイレンシング、エンドヌクレアーゼ分解の度合い）に依存する。
用語「ホスホロチオエート」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該
用語は、一般的に、酸素原子の代わりに１個以上のイオウ原子を含むヌクレオチド間リン
酸結合をいう。したがって、ホスホロチオエートという用語は、ホスホロチオエートヌク
レオチド間結合およびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合のどちらも指す。
本明細書で用いる場合、用語「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、一般式Ｉ：
Figure 2020074788
の構造を有するものであり、ＸおよびＹは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、
−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−または−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ２−Ｏ
−、ＣＨ２−Ｓ−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、
およびＣＨ２−ＣＨ−（二重結合の一部である場合）、−ＣＨ＝ＣＨ−（ここで、Ｒは、
水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される）からなる群より選択され；ＺおよびＺ＊
は、独立して、ヌクレオチド間結合、末端基または保護基から選択され；Ｂは、天然また
は非天然の核酸塩基を構成しており；不斉基は、どちらの向きで見られるものであっても
よい。
図示した式Ｉの４つのキラル中心は固定された立体配置に存在しているが、その立体配
置は固定されている必要はない。したがって、キラル中心は、式ＩＩ（下記）に示したも
のなどの異なる立体配置で見られるものであってもよい。したがって、式１の各キラル中
心は、Ｒ配置またはＳ配置のいずれで存在するものであってもよい。Ｒ（右：ｒｅｃｔｕ
ｓ）およびＳ（左：ｓｉｎｉｎｓｔｅｒ）の定義は、ＩＵＰＡＣ １９７４ Ｒｅｃｏｍ
ｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅ ｒｕｌｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｐｕｒｅ
Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．４５，１３−３０（１９７６）および「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ
ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９７９に記載されている。
末端基は、独立して、水素、アジド、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｐｒｏ
ｔ−Ｏ−、Ａｃｔ−Ｏ−、メルカプト、Ｐｒｏｔ−Ｓ−、Ａｃｔ−Ｓ−、Ｃ１〜６−アル
キルチオ、アミノ、Ｐｒｏｔ−Ｎ（ＲＨ）−、Ａｃｔ−Ｎ（ＲＨ）、モノ−またはジ（Ｃ
１〜６−アルキル）アミノ、置換されていてもよいＣ１〜６−アルコキシ、置換されてい
てもよいＣ１〜６−アルキル、置換されていてもよいＣ２〜６−アルケニル、置換されて
いてもよいＣ２〜６−アルケニルオキシ、置換されていてもよいＣ２〜６−アルキニル、
置換されていてもよいＣ２〜６−アルキニルオキシ、モノホスフェート、モノチオホスフ
ェート、ジホスフェート、ジチオホスフェート トリホスフェート、トリチオホスフェー
ト、ＤＮＡインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート基、レポー
ター基、リガンド、カルボキシ、スルホノ、ヒドロキシメチル、Ｐｒｏｔ−Ｏ−ＣＨ２−
、Ａｃｔ−Ｏ−ＣＨ２−、アミノメチル、Ｐｒｏｔ−Ｎ（ＲＨ）−ＣＨ２−、Ａｃｔ−Ｎ
（ＲＨ）−ＣＨ２−、カルボキシメチル、スルホノメチルの中から選択され、ここで、Ｐ
ｒｏｔは、−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（ＲＨ）のそれぞれの保護基であり、Ａｃｔは、
−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（ＲＨ）のそれぞれの活性化基であり、ＲＨは、水素および
Ｃ１〜６−アルキルから選択される。
ヒドロキシ置換基の保護基は、置換トリチルを含むもの、例えば、４，４’−ジメトキ
シトリチルオキシ（ＤＭＴ）、４−モノメトキシトリチルオキシ（ＭＭＴ）、およびトリ
チルオキシ、置換されていてもよい９−（９−フェニル）キサンテニルオキシ（ｐｉｘｙ
ｌ）、置換されていてもよいメトキシテトラヒドロ−ピラニルオキシ（ｍｔｈｐ）、シリ
ルオキシ（トリメチルシリルオキシ（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシ（ＴＩＰ
Ｓ）７ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ（ＴＢＤＭＳ）、トリエチルシリルオキシ
、およびフェニルジメチルシリルオキシなど）、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アセタール
（例えば、２つのヒドロキシ基）、アシルオキシ（アセチルまたはハロゲン置換アセチル
など）である。
「Ａｃｔ」は、−ＯＨ、−ＳＨおよび−ＮＨ（ＲＨ）のそれぞれの活性化基を示す。か
かる活性化基は、例えば、置換されていてもよいＯ−ホスホルアミダイト、置換されてい
てもよいＯ−ホスホルトリエステル、置換されていてもよいＯ−ホスホルジエステル、置
換されていてもよいＨ−ホスホネート、および置換されていてもよいＯ−ホスホネートか
ら選択される。
Ｂは、天然または非天然の核酸塩基を構成しており、アデニン、シトシン、５−メチル
シトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−ブ
ロモウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニル−６−フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ
ｌ）ウラシル、５−メチルチアゾールウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、
イノシン、ジアミノプリン、７−プロピン−７−デアザアデニン、７−プロピン−７−デ
アザグアニン、および２−クロロ−６−アミノプリンの中から選択される。
好ましくは、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子に使用されるロックド核酸（ＬＮＡ）は、式
ＩＩ：
Figure 2020074788
のいずれかによるＬＮＡ構造を含むものであり、式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−
、またはＮ（ＲＨ）であり；ＺおよびＺ＊は、独立して、ヌクレオチド間結合、末端基ま
たは保護基の中から選択され；Ｂは、天然または非天然の核酸塩基を構成している。この
ような例示的なＬＮＡモノマーおよび他のもの、ならびにその調製は、国際公開第９９／
１４２２６号パンフレットおよび後続出願、国際公開第００／５６７４６号パンフレット
、同第００／５６７４８号パンフレット、同第００／６６６０４号パンフレット、同第０
０／１２５２４８号パンフレット、同第０２／２８８７５号パンフレット、同第２００２
／０９４２５０号パンフレット、および同第２００３／００６４７５号パンフレットに記
載されており；これらすべての開示は引用により本明細書に組み込まれる。
用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用
語は、一般的に、標準ＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞
内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう。例えば、Ｌｏａｋｅｓら，１
９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７０：４２６−４３５を参照のこと。ユニバーサル塩基
の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族の誘導体、イノ
シン、アゾールカルボザミド（ｃａｒｂｏｚａｍｉｄｅ）、ならびにニトロアゾール誘導
体（３’−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−
ニトロインドールなど）が挙げられ、当該技術分野で知られている。例えば、Ｌｏａｋｅ
ｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２４３７を参照のこと。
本明細書で用いる場合、語句「ＲＮＡ干渉」（また、本明細書では「ＲＮＡｉ」とも称
する）は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に、細胞
内での遺伝子発現を阻害、低減または下方調節する生物学的プロセスであって、低分子干
渉核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）によって媒介されるものを
いう。例えば、ＺａｍｏｒｅおよびＨａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１
５１９−１５２４；ＶａｕｇｈｎおよびＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ３０９：１５２５−１５２６；Ｚａｍｏｒｅら，２０００，Ｃｅｌｌ １０１：２
５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈ
ｉｒら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒ
ら，ＰＣＴ国際公開第００／４４８９５号パンフレット；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ
ら，ＰＣＴ国際公開第０１／３６６４６号パンフレット；Ｆｉｒｅ，ＰＣＴ国際公開第９
９／３２６１９号パンフレット；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら，ＰＣＴ国際公開第００／０１８
４６号パンフレット；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ，ＰＣＴ国際公開第０１／２９０５８号
パンフレット；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，ＰＣＴ国際公開第９９／
０７４０９号パンフレット；およびＬｉら，ＰＣＴ国際公開第００／４４９１４号パンフ
レット；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８１８−１８１９；
Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅ
ｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：２２１５−２２１８；ならびにＨａｌｌら，
２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：２２３２−２２３７；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺ
ａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓら，
２００２，ＲＮＡ ８：８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔら，２００２，Ｇｅｎｅ ＆
Ｄｅｖ．１６：１６１６−１６２６；およびＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ，２
００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８３１）を参照のこと。さらに、用語「ＲＮＡ干渉
」（または「ＲＮＡｉ」）は、配列特異的ＲＮＡ干渉を示すために用いている他の用語、
例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、または後成学などと等価で
あることを意図する。例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前
レベルのいずれかで、後成的遺伝子サイレンシングを行うために使用され得る。非限定的
な例において、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子による遺伝子発現の後成的モジュレーションは
、遺伝子発現を改変するためのクロマチン構造またはメチル化パターンの改良によりもた
らされるものであり得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３
：６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：６６
９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８１８−１８１
９；Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕ
ｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：２２１５−２２１８；およびＨａｌｌら
，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：２２３２−２２３７を参照のこと）。別の非限定
的な例では、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子による遺伝子発現のモジュレーションは、ＲＩＳ
Ｃもしくは翻訳阻害によるＲＮＡ（コードＲＮＡもしくは非コードＲＮＡのいずれか）の
切断によりもたらされるものであり得るか（当該技術分野で知られている）、または該モ
ジュレーションは、転写阻害によりもたらされるものであり得る（例えば、Ｊａｎｏｗｓ
ｋｉら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １：２１６−２
２２を参照のこと）。
用語「阻害する」、「下方調節する」、「低減させる」または「ノックダウンする」は
、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。本発明の例
示的な一本鎖ＲＮＡｉ分子に関しては、該用語は、一般的に、（ｉ）遺伝子もしくは標的
配列の発現および／または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコ
ードしているＲＮＡ分子のレベルの低減、および／または（ｉｉ）１種類以上のタンパク
質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の非存在下で
観察される活性より下まで低減されることをいう。また、下方調節は、転写後サイレンシ
ング（ＲＮＡｉ媒介性切断など、またはＤＮＡのメチル化パターンもしくはＤＮＡのクロ
マチン構造の改変により）と関連していてもよい。ＲＮＡｉ剤での阻害、下方調節、低減
またはノックダウンは、不活性な分子、弱毒化分子、スクランブル配列を有するＲＮＡｉ
剤、またはミスマッチを有するＲＮＡｉ剤に関するものであってもよい。語句「遺伝子サ
イレンシング」は、細胞内の内在性標的遺伝子の標的化阻害による一部または完全な機能
喪失をいう。したがって、該用語は、標的遺伝子の発現のＲＮＡｉ、「ノックダウン」、
「阻害」、「下方調節」または「低減」と互換的に使用される。
阻害の程度を調べるためには、試験試料（例えば、標的遺伝子（１つもしくは複数）ま
たは標的配列（１つもしくは複数）を発現している対象生物体由来の生物学的試料、また
は標的遺伝子／配列を発現している培養状態の細胞の試料を、標的遺伝子または配列の発
現をサイレンシング、低減または阻害するＲＮＡｉ分子と接触させ得る。試験試料におけ
る標的遺伝子／配列の発現を、ＲＮＡｉ分子と接触させていない対照試料（例えば、標的
遺伝子／配列を発現している対象生物体由来の生物学的試料、または標的遺伝子／配列を
発現している培養状態の細胞の試料）における標的遺伝子／配列の発現と比較する。対照
試料（すなわち、標的遺伝子／配列が発現されている試料）に１００％の値を割り付ける
。対照試料に対する試験試料の値が約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％
、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％
または１０％である場合、標的遺伝子／配列の発現のサイレンシング、阻害または低減が
なされている。好適なアッセイとしては、例えば、当業者に知られた手法、例えば、ドッ
トブロット、ノザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、マイ
クロアレイハイブリダイゼーション、免疫沈降、酵素機能、当業者に知られたならびに表
現型分類アッセイを用いたタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの検査が挙げられる。
語句「改善されたＲＮＡｉ活性」は、一般的に、インビトロおよび／またはインビボで
測定されたＲＮＡｉ活性の増大をいい、ここで、ＲＮＡｉ活性は、ＲＮＡｉ剤がＲＮＡｉ
を媒介する能力およびＲＮＡｉ剤の安定性のいずれかまたは両方の反映である。
用語「モジュレートする」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められ
たその意味を示す。該用語は、一般的に、遺伝子の発現、または１種類以上のＲＮＡ分子
（コードもしくは非コード）のレベル、あるいは１種類以上のＲＮＡ分子またはタンパク
質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、該発現、レベルまたは活性が、モジュレー
ションをもたらす分子の非存在下で観察されるものよりも大きくなる、または小さくなる
ように上方調節または下方調節する場合をいう。例えば、用語「モジュレートする」は、
一部の実施形態では、例えば遺伝子発現の阻害を指すものであり得、他の実施形態では、
その増強または上方調節を指すものであり得る。
用語「ＲＮＡｉ剤」または「ＲＮＡｉ分子」は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または遺
伝子サイレンシングを配列特異的様式で媒介することにより遺伝子発現またはウイルス複
製を阻害または下方調節し得る任意の核酸分子をいう。ＲＮＡｉ剤は、自己相補性のセン
ス（パッセンジャー）鎖とアンチセンス（ガイド）鎖を含む二本鎖核酸分子であり得、こ
の場合、アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的
なヌクレオチド配列を含むものであり、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部分に対
応するヌクレオチド配列を含むものである。ＲＮＡｉ剤は一本鎖ポリヌクレオチドであっ
てもよい。理論に拘束されることを望まないが、ＲＮＡｉ剤は、いくつかの機構（例えば
、標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前機構）のうちの１つ以上によ
って作用するものであり得る。
用語「一本鎖ＲＮＡｉ」または「ｓｓＲＮＡｉ」剤または分子は、標的核酸分子または
その一部分内のヌクレオチド配列に一部、実質的に、または完璧に相補的なヌクレオチド
配列を有する一本鎖の核酸由来分子であるＲＮＡｉ剤である。一本鎖ＲＮＡｉ剤が塩基対
を形成する対象の第２のヌクレオチド配列は存在しない。該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、さら
に、終末端の一方または両方に存在する末端リン酸基（５’リン酸基または５’，３’二
リン酸基など）を含むものであってもよい。ｓｓＲＮＡｉ分子／剤は、ｍｉＲＮＡまたは
ｍｉＲＮＡ模倣物を含むものであってもよい。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣ内
に負荷されるか、あるいはＲＩＳＣと結合し、ＲＮＡｉ機構による遺伝子サイレンシング
に関与する。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、置換、化学修飾ヌクレオチド、および非ヌ
クレオチドを含むものであってもよい。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１つ以上のリボ
ヌクレオチドを含むもの、またはすべてリボヌクレオチドで構成されたものであってもよ
い。本発明の一部の特定の実施形態は、主鎖、糖鎖、塩基またはヌクレオシドに置換また
は修飾を含む一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む。
用語「ｍｉＲＮＡ」または「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」は、本明細書において、当該技術分野
における通常の意味に従って用いており、多種多様な真核生物（例えば、哺乳動物）にお
いて発現され、ＲＮＡ系遺伝子調節に関与している低分子の非タンパク質コードＲＮＡ分
子をいう。充分にプロセッシングされた成熟ｍｉＲＮＡは約１５〜約３０ヌクレオチド長
である。代表的な一連の既知の内在性ｍｉＲＮＡ種は、公衆に利用可能なｍｉＲＢａｓｅ
配列データベースに示されており、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１およびＧｒｉｆｆ
ｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３
４：Ｄ １４０−Ｄ１４４に記載されており、ワールドワイドウェブにおいてＷｅｌｌｃ
ｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトでアクセス可能
である。ｍｉＲＢａｓｅ配列データベースにおいて公衆に利用可能な充分にプロセッシン
グされた成熟ｍｉＲＮＡは各々、引用により本明細書に組み込まれる。また、代表的な一
連のｍｉＲＮＡを本明細書の表１（後述）に示す。各成熟ｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡの
標的である１種類以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に一部相補的であり、そ
れにより、標的と関連している遺伝子の発現が調節される。
用語「ｍｉＲＮＡ模倣物」は、本明細書で用いる場合、細胞内の天然に存在するｍｉＲ
ＮＡの模倣物である一本鎖ＲＮＡ分子をいう。ｍｉＲＮＡ模倣物は、典型的には、対応内
在性ｍｉＲＮＡを基にして設計される。ｍｉＲＮＡ模倣物は、天然に存在する対応ｍｉＲ
ＮＡによっても調節される標的ｍＲＮＡの発現をモジュレートし得るものである。ｍｉＲ
ＮＡ模倣物でもある本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、ＲＩＳＣ内に負荷されるか、あるい
はＲＩＳＣと結合し、ＲＮＡｉ機構による遺伝子サイレンシングに関与する。本発明のｍ
ｉＲＮＡ模倣物は、置換、化学修飾ヌクレオチド、および非ヌクレオチドを含むものであ
ってもよい。本発明のｍｉＲＮＡ模倣物は１つ以上のリボヌクレオチドを含むものであっ
てもよく、すべてリボヌクレオチドで構成されたものであってもよい。本発明の一部の特
定の実施形態は、主鎖、糖鎖、塩基またはヌクレオシドに置換または修飾を含むｍｉＲＮ
Ａ模倣物を含む。細胞内の天然に存在するｍｉＲＮＡを本明細書において、「対応ｍｉＲ
ＮＡ」、「内在性ｍｉＲＮＡ」または「天然に存在するｍｉＲＮＡ」と称する。また、細
胞に提供される本発明の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、天然に存在する対応ｍｉＲＮＡによ
っても標的化される１種類以上の標的ｍＲＮＡを標的化するものであると理解されたい。
細胞に導入された本発明のｍｉＲＮＡ模倣物は、適切な条件下で天然に存在するｍｉＲＮ
Ａとしての機能を果たし得るものであることが想定される。
本明細書で用いる場合、用語「シード領域」（また、本明細書において「シード配列」
とも称する）は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。該用語は、一般的に
、天然に存在する成熟ｍｉＲＮＡの５’末端のヌクレオチド位置１〜１０の範囲内の少な
くとも６個の連続するヌクレオチド、例えば、本出願の出願日現在において公衆に利用可
能なｍｉＲＢａｓｅ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ
／）に示されたものから選択されるもの、および／または表１に示したものから選択され
るものをいう。表１の配列において、１位〜８位のシード配列のヌクレオチドを大文字で
示す。天然に存在するｍｉＲＮＡでは、典型的には、シード領域により、ｍｉＲＮＡが結
合して遺伝子調節がもたらされ得る標的ｍＲＮＡ配列が決定される。したがって、数多く
の天然に存在するｍｉＲＮＡは、シード領域を共有しているか、またはシード領域におい
て実質的な相同性を共有したものであり得、このようなｍｉＲＮＡは、同じｍｉＲＮＡフ
ァミリーの構成員である。
用語「ｓｉＲＮＡ」（また、「低分子干渉ＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」）は、
当該技術分野で認められたその通常の意味で示しており、一般的に、相補的なＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドの二本鎖（センス鎖とアンチセンス鎖）をいい、約１〜約４個のヌクレオ
チドの３’突出端を含むものであっても含まないものであってもよく、ＲＮＡ干渉を媒介
するものである。
用語「ｓｉＲＮＡ模倣物」または「一本鎖ｓｉＲＮＡ模倣物」は、本明細書で用いる場
合、対応ｓｉＲＮＡ（一本鎖または二本鎖のいずれか）のガイド鎖またはアンチセンス鎖
の模倣物である一本鎖ＲＮＡｉ分子をいう。ｓｉＲＮＡ模倣物は、対応ｓｉＲＮＡによっ
ても調節される標的ＲＮＡの発現をモジュレートし得るものであり、したがって、ＲＩＳ
Ｃ内に負荷されるか、あるいはＲＩＳＣと結合し、ＲＮＡｉ機構による遺伝子サイレンシ
ングに関与する。本発明の一本鎖ｓｉＲＮＡ模倣物は、置換、化学修飾ヌクレオチド、お
よび非ヌクレオチドを含むものであってもよい。本発明のｓｉＲＮＡ模倣物は、１つ以上
のリボヌクレオチドを含むものであってもよく、すべてリボヌクレオチドで構成されたも
のであってもよい。本発明の一部の特定の実施形態は、主鎖、糖鎖、塩基またはヌクレオ
シドに置換または修飾を含むｓｉＲＮＡ模倣物を含む。
用語「遺伝子」は、本明細書で用いる場合、特に、ＲＮＡｉ剤の「標的遺伝子」との関
連において、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、一般的に、ポリペ
プチドの生成に必要な一部分の長さまたは全長のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ
またはＲＮＡ）配列をいう。また、標的遺伝子は、その核酸配列のＵＴＲ（すなわち、非
翻訳領域）または非コード領域を含むものであってもよい。また、遺伝子または標的遺伝
子は、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、小分子
一本鎖（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉ
ＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小
体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲ
ＮＡ）およびその前駆体ＲＮＡをコードするものであってもよい。かかる非コードＲＮＡ
は、機能性または調節性の細胞プロセスに関与しているｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性
のモジュレーションにおけるＲＮＡ干渉の標的核酸分子のとしての機能を果たすものであ
り得る。したがって、疾患をもたらす異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性は、本発明
のＲＮＡｉ剤によってモジュレートされ得る。また、ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的化
するＲＮＡｉ剤は、遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ）インプリンティング、転写、翻訳、または
核酸プロセッシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介在
することにより、被検体、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作または改変す
るために使用され得る。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内在性遺伝子、導入遺伝
子、または外来性遺伝子（感染後の細胞内に存在する病原体（例えば、ウイルス）の遺伝
子など）であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物体、例えば、植物、動物、原
生動物、ウイルス、細菌または真菌に由来するもの、またはこれらに含まれているもので
あり得る。植物の非限定的な例としては、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物が挙
げられる。動物の非限定的な例としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。真菌
の非限定的な例としては、カビまたは酵母が挙げられる。概説については、例えば、Ｓｎ
ｙｄｅｒおよびＧｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００；２５８−２６０
を参照のこと。
語句「標的部位」、「標的配列」および「標的領域」は、本明細書で用いる場合、当該
技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、一般的に、例えば、標的配列に一部
、実質的に、または完璧に相補的なそのガイド／アンチセンス領域内の配列を含むＲＮＡ
ｉ分子によって媒介される切断のために「標的化される」標的核酸分子（例えば、ｍＲＮ
Ａ）内の配列をいう。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子「標的部位」は、該一本鎖ＲＮＡｉ剤
に一部、実質的に、または完璧に相補的な核酸配列をいう。標的部位は、標的ＲＮＡのコ
ード領域内に存在していても、または非コード（すなわち、非翻訳）領域内に存在してい
てもよい。標的部位は、一本鎖ＲＮＡｉ分子が模倣物である対応の内在性ｍｉＲＮＡの標
的部位であってもよく、その場合、「標的部位」は、「ｍｉＲＮＡ標的部位」または「対
応ｍｉＲＮＡ標的部位」と称されることもあり得る。
語句「センス領域」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその
意味を示す。該用語は、一般的に、該ＲＮＡｉ分子のアンチセンス領域に対して相補性を
有するＲＮＡｉ分子のヌクレオチド配列をいう。また、ＲＮＡｉ分子のセンス領域は、標
的核酸配列と相同性または配列同一性を有する核酸配列を含むものであってもよい。ＲＮ
Ａｉ分子のセンス領域はセンス鎖またはパッセンジャー鎖とも称される。
語句「アンチセンス領域」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められ
たその意味を示す。該用語は、一般的に、標的核酸配列に対して相補性を有するＲＮＡｉ
分子のヌクレオチド配列をいう。また、ＲＮＡｉ分子のアンチセンス領域は、該ＲＮＡｉ
分子のセンス領域に対して相補性を有する核酸配列を含むものであってもよい。ＲＮＡｉ
分子のアンチセンス領域はアンチセンス鎖またはガイド鎖とも称される。
本明細書で用いる場合、用語「スペーサー」は、いずれかの２つのヌクレオチドおよび
／または非ヌクレオチド代替部分を連結することができる任意の化学基をいう。本明細書
で用いる場合、「スペーサー」は、２つのヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド代
替部分を従来のホスホジエステル結合または非ホスホジエステル接続部によって接続する
ことができるものである。スペーサーは、典型的には、各ヌクレオチドまたは非ヌクレオ
チド代替部に共有結合によって結合されており、主鎖（すなわち、相補的ハイブリッドを
形成している核酸塩基）を形成しているヌクレオチド間結合以外である有機存在体である
。
本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する脂肪族
飽和炭化水素基（分枝鎖および直鎖のどちらも）を包含することを意図する。また、用語
「アルキル」は、非芳香族シクロアルキル基も指す。好ましくは、アルキル基は、１〜２
０個の炭素を有するもの（すなわち、Ｃ１〜Ｃ２０）である。例えば、「Ｃ１〜Ｃ１０ア
ルキル」の場合のようなＣ１〜Ｃ１０は、線状、分枝または環状（すなわち、シクロアル
キル）の配置で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の炭素を有する基が包
含されることを規定している。用語「シクロアルキル」は、指定された数の炭素原子を有
する単環式の脂肪族飽和炭化水素基を意味する。例えば、「アルキル」としては、具体的
には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブ
チル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど、ならびにシクロ
アルキル、例えば、シクロプロピル、メチル−シクロプロピル、２，２−ジメチル−シク
ロブチル、２−エチル−シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。アルキル基
は、指示されていれば置換されていてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、２個以上の炭素原子と少なくとも１つ
の炭素間二重結合を含む直鎖または分枝鎖の非芳香族炭化水素原子団基をいう。また、用
語「アルケニル」は、非芳香族シクロアルケニル基も指す。好ましくは、アルケニル基は
１〜２０個の炭素を有するもの（すなわち、Ｃ１〜Ｃ２０）である。アルケニル基として
は、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。ア
ルケニル基は二重結合を含むものであり得、指示されていれば置換されていてもよい。
本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、２個以上の炭素原子と少なくとも１つ
の炭素間三重結合を含む直鎖または分枝鎖の非芳香族炭化水素原子団基をいう。また、用
語「アルキニル」は非芳香族シクロアルキニル基も指す。３つまでの炭素−炭素三重結合
が存在していてもよい。好ましくは、アルキニル基は１〜２０個の炭素を有するもの（す
なわち、Ｃ１〜Ｃ２０）である。アルキニル基としては、例えば、エチニル、プロピニル
、ブチニルおよびシクロオクチニル（ｏｃｔｙｎｌ）が挙げられる。アルキニル基は三重
結合を含むものであり得、指示されていれば置換されていてもよい。
用語「脂肪族」は、化学基に関して本明細書で用いる場合、炭素と水素で構成され、芳
香族環を含まない有機基をいう。脂肪族構造は環状および／または飽和型であり得る。炭
素原子は、連接されて直鎖、分枝鎖または非芳香族環に一体化され得る。また、炭素原子
は、単結合（アルカン）、二重結合（アルケン）または三重結合（アルキン）によって連
接されていてもよい。水素の他に、他の元素が炭素鎖に結合されていてもよく、該鎖内の
炭素の代わりに置き換えられていてもよく、最も一般的なものは酸素、窒素、イオウおよ
び塩素である。
用語「芳香族」は、化学基に関して本明細書で用いる場合、共有結合によって結合され
た一連の原子を含む有機基をいい、以下の具体的な特徴：（１）非局在化共役π系、最も
一般的には、単結合と二重結合が交互に存在する配置；（２）すべての寄与原子が同じ平
面上にあるコプラナー構造；（３）寄与原子が１個以上の環内に配置；ならびに（４）い
くつかの非局在化π電子（偶数であるが、４の倍数でない）を有するものである。芳香族
構造は、炭化水素だけで構成されたもの（例えば、アリール）であってもよい。他の元素
が芳香族構造の炭素に結合されていてもよく、該炭素の代わりに置き換えられていてもよ
く、最も一般的なものは酸素、窒素、イオウおよび塩素である（例えば、ヘテロアリール
、置換アリール、置換ヘテロアリール）。
用語「置換されている」は、脂肪族または芳香族の有機構造（例えば、アルキル、アル
ケニル、アルキニル、アリール）に関して用いる場合、炭素鎖に結合されたさらなる化学
部分および／または官能基の存在をいう。例えば、置換型炭化水素鎖としては、ヘテロ原
子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）が結合された炭化水素鎖が挙げられ得る。また、置換型炭
化水素鎖としては、ヘテロ原子で分断された炭化水素鎖も挙げられ得る。置換されている
場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ
、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ＳＨ、ＮＨ２、またはＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、独
立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。置換型アルキルとしては、エチレ
ンオキシドのオリゴマーまたはポリマー（例えば限定されないが、ポリエチレングリコー
ル（「ＰＥＧ」））が挙げられる。
用語「非ヌクレオチド」または「非核酸」は、ヌクレオチドでない任意の化学的分子、
部分、基または化合物をいう。
本明細書で用いる場合、用語「代替非ヌクレオチド部分」（または「非ヌクレオチド代
替部分」）は、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子内の１個以上のヌクレオチドの代わりに置き
換えられ得る化学部分をいう。代替非ヌクレオチド部分は、典型的には、非従来型塩基対
形成を可能にする（すなわち、従来の水素結合を形成しない）ものである。一部の特定の
実施形態において、本開示の代替非ヌクレオチド部分は、細胞内ＲＮＡｉ機構の１種類以
上の成分、例えば、ＰＡＺドメイン、ＰＩＷＩドメインおよび／またはＲＩＳＣと結合し
ている他のアルゴノートタンパク質ドメインなどと結合あるいは相互作用し得るものであ
る。
用語「合成の」は、本明細書の一部の特定の実施形態において、細胞内で天然に生成さ
れるものでない核酸分子をいう。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、典型的には合成のもの
である。
一部の特定の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は単離されたものであっ
てもよい。用語「単離された」は、オリゴヌクレオチドに関して本明細書で用いる場合、
一般的に、自然界に見られる同一配列の任意の核酸分子と異なる物理形態で存在する核酸
分子をいう。「単離された」は、核酸がその天然環境から物理的に取り出されたものであ
ることを必要としない（が、禁じるものでない）。例えば、核酸は、自然界に見られない
ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド間結合を含んでいる場合、「単離された」もの
ということができる。核酸は、自然界に見られない純度で存在する場合（このとき、純度
は、他の配列の核酸の存在に関して、タンパク質の存在に関して、脂質の存在に関して、
もしくは生体細胞の任意の他の成分の存在に関して調整され得る）、または核酸に、生物
体のゲノムにおいて別の場合では同一の配列にフランキングしている配列がない場合、ま
たは核酸が自然界に存在するものと同一でない配列を有する場合、「単離された」ものと
いうことができる。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、インビトロで合成されたものである
ため単離されたものであり得る。しかしながら、単離された核酸は、その後、一緒にして
混合またはプールされることがあり得ることは理解されよう。
本明細書で用いる場合、「内在性」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示
す。該用語は、一般的に、生物体、細胞、組織または系に由来する、またはその内部で生
成された任意の物質をいう。本明細書で用いる場合、「内在性ｍｉＲＮＡ」は、細胞、組
織、生物体、例えば哺乳動物（例えば、ヒトなど）に天然に存在するｍｉＲＮＡである。
「外来性」は、一般的に、生物体、細胞、組織または系の外部から導入された、または該
外部で生成された任意の物質をいう。
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味を
示す。該用語は、一般的に、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配
列の転写および／または翻訳と定義される。
一部の実施形態において、細胞が特定のｍｉＲＮＡを内因的に発現するかどうか、また
はかかる発現が特定の条件下で、もしくは特定の疾患状態である場合に影響を受けるかど
うかがわかることは有用であり得る。したがって、本発明の一部の実施形態では、該方法
は、細胞または細胞を含む試料を、１種類以上のマーカー遺伝子もしくはｍＲＮＡまたは
対象遺伝子の発現レベルを示す他の被検物の存在についてアッセイすることを含むもので
ある。そのため、一部の実施形態では、方法は、試料のＲＮＡプロフィールを作成する工
程を含むものである。用語「ＲＮＡプロフィール」または「遺伝子発現プロフィール」は
、試料中の１種類以上の遺伝子または遺伝子マーカーの発現パターンに関するデータセッ
トをいう（例えば、１種類以上のマーカーが同定される複数種の核酸プローブ）。
「〜し得る」により、ＲＮＡｉ活性を適当なインビボまたはインビトロでのアッセイま
たは方法によって測定したとき、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子が、標的配列に対して、内
部非ヌクレオチドスペーサー部分がない対応一本鎖ＲＮＡｉ分子によって得られるノック
ダウン効果と比べて少なくとも５％以上のノックダウン効果を示すことを意図する。好ま
しくは、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、同じ標的に対して、対応するＲＮＡｉ分子（例
えば、天然に存在するｍｉＲＮＡまたはこれまでに同定されたｓｉＲＮＡガイド鎖）より
も２５％以上、３５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％
以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、ま
たはさらに１００％以上（すなわち、同等またはより効力のあるＲＮＡｉ活性）の標的ノ
ックダウンを達成し得るものである。
「ベクター」は、別の核酸セグメントが作動可能に挿入されて該挿入セグメント複製ま
たは発現がもたらされ得るようにされたプラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロ
ウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ならびに
他の細菌系、酵母系またはウイルス系ベクターなどのレプリコンである。「発現ベクター
」は、発現対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含むベクター
をいう。発現ベクターは、充分なシス作用発現エレメントを含むものであり；他の発現エ
レメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系内で補給され得る。発現ベクタ
ーとしては、当該技術分野で知られたすべてのもの、例えば、コスミド、プラスミド（例
えば、裸のものまたはリポソームに内包されたもの）、ならびにウイルス（例えば、レン
チウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が挙げられ
る。
用語「組成物」または「製剤」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認め
られたその意味を示す。これらの用語は、一般的に、細胞または被検体（例えば、ヒトな
ど）への投与（例えば、全身投与または局所投与）に適した形態の、例えば、薬学的に許
容され得る担体または希釈剤との組成物または製剤をいう。好適な形態は、一部において
、用途または進入経路（例えば、経口、経皮、吸入もしくは注射）に依存する。かかる形
態は、該組成物または製剤が標的細胞（すなわち、負電荷を有する核酸が送達に望ましい
細胞）に到達するのを妨げないものであるのがよい。例えば、血流中に注射される組成物
は、可溶性であるのがよい。他の要素は、当該技術分野で知られており、毒性および該組
成物または製剤の奏功を妨げる形態などの考慮事項が挙げられる。本明細書で用いる場合
、医薬製剤は、ヒト使用および獣医学的使用のための製剤を包含する。本発明の核酸分子
との製剤化に適した薬剤の非限定的な例としては：脂質ナノ粒子（例えば、Ｓｅｍｐｌｅ
ら，２０１０，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（２）：１７２−６．参照）；Ｐ−
糖タンパク質阻害薬（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５など）；生分解性ポリマー、例えば、徐
放送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフィア（Ｅｍｅｒｉｃｈ
，ＤＦら，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ８：４７−５８）；および負荷
ナノ粒子（ポリブチルシアノアクリレートで作製されたものなど）が挙げられる。本発明
の核酸分子の送達ストラテジーの他の非限定的な例としては、としては、Ｂｏａｄｏら，
１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒら，１９９
９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２１：２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，１９９５，
ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９２：５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕ
ｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５：７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄ
ａら，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４９１０−４９１６；お
よびＴｙｌｅｒら，１９９９，ＰＮＡＳ ９６：７０５３−７０５８に記載された物質が
挙げられる。「薬学的に許容され得る組成物」または「薬学的に許容され得る製剤」は、
その所望の活性に最も適した身体位置への本発明の核酸分子の有効な分布を可能にする組
成物または製剤をいうものであり得る。
用語「患者」、「被検体」、「個体」などは、本明細書において互換的に用いており、
本明細書に記載の方法に適した（ａｍｅｎｄａｂｌｅ）任意の動物またはその細胞もしく
は組織（インビトロであれインサイチュであれ）をいう。該用語は、典型的には、本開示
の一本鎖ＲＮＡ分子のドナーまたはレシピエントである生物体をいう。一部の特定の非限
定的な実施形態では、患者、被検体または個体は哺乳動物または哺乳動物細胞である。他
の非限定的な実施形態では、患者、被検体または個体はヒトまたはヒト細胞である。
本明細書で用いる場合、用語「治療有効量」は、投与対象の被検体（例えば、哺乳動物
またはヒト）において疾患症状の重症度の低減、無疾患症状期間の頻度もしくは持続期間
の増大、または疾患による機能障害もしくは能力障害の抑制がもたらされるのに充分な本
発明の開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の量を意味する。当業者は、かかる治療有効量を、被検
体の体格、症状の重症度、および具体的な組成物または選択される投与経路などの要素に
基づいて決定することができよう。例えば、治療有効量の本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は
単独で、併用で、もしくは他の薬物とともに治療有効量で被検体に使用もしくは投与され
得るか、または特定の細胞に処置に適した条件下で、例えば、腫瘍サイズを低減させるた
め、あるいは被検体の特定の障害と関連している症状を改善するために投与することによ
り使用もしくは投与され得る。
用語「治療（の）」は、本明細書で用いる場合、処置および／または予防を意味する。
治療効果は、疾患状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。用語「処置」は、本明
細書で用いる場合、疾患または障害の治療的処置ならびに予防的もしくは抑制的措置を包
含することを意図する。したがって、例えば、用語「処置」は、疾患または障害の発生前
または後での薬剤を投与し、それにより該疾患または障害のすべての徴候を予防または除
去することを含む。別の例として、疾患の臨床徴候後に該疾患の症状に対処するための薬
剤の投与もまた用語「処置」に含まれる。
用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意味
を示す。該用語は、一般的に、消化管経由以外の様式で分子、薬物、薬剤または化合物を
投与する方法または手法をいい、皮膚上、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、ま
たは髄腔内注射または注入手法などが挙げられる。
語句「全身投与」は、本明細書で用いる場合、当該技術分野で一般に認められたその意
味を示す。該用語は、一般的に、全身へ分布する前の血流中の薬物のインビボでの全身性
の吸収または蓄積をいう。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細説明から自明となろう。しかしなが
ら、詳細説明および具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示したものであるが
、詳細説明から当業者には本発明の精神および範囲内において種々の変更および改良が自
明となるため、一例として示したものにすぎないことを理解されたい。
Ｂ．本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子
本開示により、少なくとも１つの内部非ヌクレオチドスペーサーを含む一本鎖ＲＮＡ分
子であって、該スペーサーにより該分子の２つのヌクレオチド部分が連結されて一体にな
っている一本鎖ＲＮＡ分子を提供する。したがって、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は連続し
たヌクレオチド鎖ではなく、１つ以上の非ヌクレオチドスペーサーによって分断された１
つより多くのヌクレオチド部分を含むものであり、該ヌクレオチド部分は１個以上のヌク
レオチド、非ヌクレオチド代替部分またはその組合せを含むものである。本発明の一本鎖
ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉機構によって遺伝子発現を阻害し得るガイド鎖またはアンチセ
ンス鎖としての機能を果たし、したがってＲＮＡｉ剤である。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分
子は、細胞内の１つ以上のＲＮＡ標的部位に一部、実質的に、または完璧に相補的な配列
を含むものである。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、（ａ）２つ以上のヌクレオチド部分に分断された核酸
部分、および（ｂ）少なくとも１つの非ヌクレオチドスペーサー部分を含む内部（「末端
」と対照的）スペーサー部分を含む一本鎖オリゴヌクレオチド構造を有し、非ヌクレオチ
ドスペーサー部分により、２個のヌクレオチド（各々は該分子内の相違するヌクレオチド
部分である）が共有結合によって連結されている。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレ
オチド部分は、非ヌクレオチドスペーサー部分によって分断されており、ここで、各ヌク
レオチド部分は少なくとも１個のヌクレオチドを含むものである。
本発明の各実施形態において、一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は少なくとも２つのヌク
レオチド部分、第１のヌクレオチド部分（Ｎ１）（例えば、５’−ヌクレオチド部分）と
第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）（例えば、３’−ヌクレオチド部分）を含むものである
。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は、２つより多くのヌクレオチド部分（例えば
、第３のヌクレオチド部分（Ｎ３）、第４のヌクレオチド部分（Ｎ４）など）を含むもの
であってもよい。本発明のＲＮＡｉ分子の各ヌクレオチド部分において、ヌクレオチド部
分および／または非ヌクレオチド部分は、ホスホジエステル結合および／または非ホスホ
ジエステル接続部によって接続されている。重要なことに、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子
のヌクレオチド部分は互いに相補的でなく、したがって、前記部分は有意な塩基対形成を
形成しない。
本発明の各実施形態において、一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部スペーサー部分は、少なくと
も１つの非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ１）（本明細書において第１の非ヌクレオチ
ドスペーサー部分と称する）を含む。本発明の一実施形態では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は
１つの内部非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものである。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分
子の内部スペーサー部分は、第１の非ヌクレオチドスペーサー部分より多く（例えば、第
２の非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ２）、第３の非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ
３）など）を含むものであってもよい。別の実施形態では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は２つ
の内部非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものである。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内のヌクレオチド部分の数は、該分子内の非ヌ
クレオチドスペーサー部分の数に依存し、逆も同様である。例えば、該一本鎖ＲＮＡｉ分
子が２つの非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものである場合、これは、一般的には、
以下のとおり：５’−（第１のヌクレオチド部分）−（第１の非ヌクレオチドスペーサー
部分）−（第２のヌクレオチド部分）−（第２の非ヌクレオチドスペーサー部分）−（第
３のヌクレオチド部分）−３’の３つのヌクレオチド部分を含むものである。本発明の一
本鎖ＲＮＡｉ分子の各非ヌクレオチドスペーサー部分は、１つ以上の非ヌクレオチドスペ
ーサーを含むものであってもよい。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は一本鎖オリゴヌクレオチド構造を有し、標的ＲＮＡに対
するＲＮＡ干渉を媒介する。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は：（ａ）第１のヌクレオチド
部分（Ｎ１）と第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）を含む核酸部分（前記核酸部分は、標的
ＲＮＡ内の標的部位と塩基対形成し得る少なくとも８個のヌクレオチドを含み、該核酸部
分内のヌクレオチドの総数は８〜２６ヌクレオチドである）；および（ｂ）第１のヌクレ
オチド部分と第２のヌクレオチド部分を共有結合によって連結する少なくとも第１の非ヌ
クレオチドスペーサー部分（Ｓ１）を含む内部スペーサー部分を含むものであり得る。第
１のヌクレオチド部分と第２のヌクレオチド部分は自己相補的でない。本発明の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子のすべてのヌクレオチド（例えば、８〜２６個）は、すべて核酸部分内に存在
し、該分子のヌクレオチド部分間に分布しており、各ヌクレオチド部分は少なくとも１個
のヌクレオチドを含むものである。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、該オリゴヌクレオチドのヌクレ
オチド部分間に分布した合計８〜２６個のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド代替部分（
例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０
、２１、２２、２３、２４、２５または２６個のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド代替
部分）を含む核酸部分を含むものであり、該分子内の該ヌクレオチドのうち少なくとも８
個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）が標的ＲＮＡ内の標的部位と塩基対
形成し得る。例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２
６個の総数のヌクレオチドを含むものであり得、該ヌクレオチドのうち８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、２５または２６個が標的ＲＮＡと塩基対形成する。一実施形態において、本発明の一本
鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は、合計１５〜２１個（例えば、１５、１６、１７、１８、１
９、２０または２１個）のヌクレオチドを含むものである。別の実施形態では、本発明の
一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は、合計１８〜２０個（例えば、１８、１９または２０個
）のヌクレオチドを含むものである。さらなる実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分
子の核酸部分は、合計１９個または２０個のヌクレオチドを含むものである。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分を構成するすべての数のヌクレオチド
または非ヌクレオチド部分またはその組合せは、該分子の該部分間に任意の数の様式で分
布している。一例として、非ヌクレオチドスペーサー部分を１つだけと２つのヌクレオチ
ド部分（すなわち、第１のヌクレオチド部分と第２のヌクレオチド部分）を含む一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子は、合計１２個のヌクレオチドを有するものであり得る。該分子の第１のヌク
レオチド部分が１個のヌクレオチド（例えば、該分子の５’末端に）を含むものである場
合、該分子の第２のヌクレオチド部分は１１個の連続したヌクレオチドを含むものである
。あるいはまた、該分子の第１のヌクレオチド部分が５個の連続したヌクレオチドを含む
ものである場合、該分子の第２のヌクレオチド部分は７個の連続したヌクレオチドを含む
ものである。各例において分子内のヌクレオチドの総数は１２である。本発明の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子のヌクレオチド部分内のヌクレオチドは互いに相補的でなく、したがって、前
記部分は実質的な塩基対形成を形成することができない。該分子の各ヌクレオチド部分に
おいて、ヌクレオチド部分および／または非ヌクレオチド部分は、ホスホジエステル結合
および／または非ホスホジエステル接続部によって接続されている。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内の少なくとも８個のヌクレオチドが、標的Ｒ
ＮＡ内の標的配列と塩基対形成し得る。したがって、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、Ｒ
ＮＡ標的部位（例えば、天然に存在するＲＮＡ標的部位）に一部、実質的に、または完璧
に相補的な連続ヌクレオチドの配列を含むものである。一実施形態において、本発明の一
本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内の連続したヌクレオチドのすべてが標的ＲＮＡ内の標的配
列と塩基対形成する（すなわち、完璧に相補的）。別の実施形態では、本発明の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子の核酸部分内の連続したヌクレオチドの少なくとも５０％が標的ＲＮＡ内の標
的配列と塩基対形成する（すなわち、実質的に相補的）。別の実施形態では、本発明の一
本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内の８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個のヌクレオチドが標的Ｒ
ＮＡ内の標的配列と塩基対形成する。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は：（ａ）２つのヌクレオチド部分
、第１のヌクレオチド部分（Ｎ１）と第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）；および（ｂ）１
つの内部非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ１）を含む一本鎖オリゴヌクレオチド構造を
有し；該オリゴヌクレオチドは、合計８〜２６個のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド代
替部分（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１
９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個のヌクレオチドまたは非ヌクレオ
チド代替部分）を含み；該分子のヌクレオチドのうち少なくとも８個が標的ＲＮＡ内の標
的部位と塩基対形成し得る。この実施形態の一本鎖ＲＮＡｉ分子の２つのヌクレオチド部
分は、合計で８〜２６個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）のヌクレオチ
ドまたは非ヌクレオチド部分またはその組合せを含み、これらは、該２つのヌクレオチド
部分間に任意の数の様式で分布している（上記のとおり）。一実施形態において、非ヌク
レオチドスペーサー部分は１つの非ヌクレオチドスペーサーを含むものである。別の実施
形態では、非ヌクレオチドスペーサー部分は、１つより多くの非ヌクレオチドスペーサー
（例えば、２、３、４つ、またはそれ以上）を含むものである。該スペーサー部分により
、該一本鎖ＲＮＡｉ分子の第１のヌクレオチド部分と第２のヌクレオチド部分が連結され
ている。したがって、該スペーサー部分は、該分子の第１のヌクレオチド部分の３’末端
ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド代替部分と、該分子の第２のヌクレオチド部分の５’
末端ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド代替部分の両方に共有結合によって連結されてい
る。該分子のスペーサー部分は、該ヌクレオチド部分のリン酸主鎖に（すなわち、連結さ
れた２個のヌクレオチドの遊離リン酸基を介して）、従来のホスホジエステル結合または
非ホスホジエステル接続部のいずれかによって共有結合によって接続されていてもよい。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、天然に存在するｍｉＲＮＡのガ
イド鎖に一部、実質的に、または完璧に相同な連続ヌクレオチドの配列を含むものであり
、したがって、ｍｉＲＮＡ模倣物としての機能を果たす。別の実施形態では、本発明の一
本鎖ＲＮＡｉ分子は、一本鎖ｓｉＲＮＡまたは二本鎖ｓｉＲＮＡのガイド／アンチセンス
鎖のいずれかに一部、実質的に、または完璧に相同な連続ヌクレオチドの配列を含むもの
であり、したがってｓｉＲＮＡ模倣物としての機能を果たす。一本鎖ｓｉＲＮＡまたは二
本鎖ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機構によって遺伝子発現を阻害することが知られているもの
であり得る。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子が天然に存在するｍｉＲＮＡの類似体である場合、この天
然に存在するｍｉＲＮＡを本明細書において「対応ｍｉＲＮＡ」と称し、該一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子は対応ｍｉＲＮＡの模倣物である。本発明の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は天然に存在
する対応ｍｉＲＮＡを基にして設計され、このとき、少なくとも１つの非ヌクレオチドス
ペーサー部分は、ｍｉＲＮＡガイド鎖配列の２個のヌクレオチド間に挿入されるか、また
はｍｉＲＮＡガイド鎖配列の１個以上のヌクレオチドと置換されるかのいずれかである。
本発明の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、ｍｉＲＢａｓｅデータベース内の公衆に利用可能な
、および／または表１（後述）（配列番号：１〜１０９０）に含まれた成熟ｍｉＲＮＡ配
列の類似体であってもよい。
一実施形態において、本明細書に記載の一本鎖ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡ模倣物であり
、該ＲＮＡｉ分子は、２つ以上のヌクレオチド部分と、少なくとも１つの非ヌクレオチド
スペーサー部分を含む内部スペーサー部分との核酸部分を含むものである。上記のように
、該分子の核酸部分が２つのヌクレオチド部分（すなわち、第１のヌクレオチド部分と第
２のヌクレオチド部分）のみを含むものである場合、非ヌクレオチドスペーサー部分は１
つだけ存在する。該分子の核酸部分が３つのヌクレオチド部分を含むものである場合、２
つの非ヌクレオチドスペーサー部分が存在する。各非ヌクレオチドスペーサー部分は、１
つより多くの非ヌクレオチドスペーサーを含んでいてもよい（例えば、２、３、４個また
はそれ以上）。一実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡ模倣物の核酸部分は、８〜２６
個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチ
ド部分またはその組合せからなり、該ヌクレオチドの少なくとも８個が、天然に存在する
ｍｉＲＮＡ標的部位と塩基対形成し得る。本発明のｍｉＲＮＡ模倣物の核酸部分内の連続
ヌクレオチドの配列は、天然に存在するｍｉＲＮＡガイド鎖のヌクレオチド配列に一部、
実質的に、または完璧に相同である。一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子
の核酸部分内の連続ヌクレオチドの配列は、天然に存在するｍｉＲＮＡのシード配列の全
部または一部と同一（または完璧に相同）である５〜８個（すなわち、５、６、７または
８個）の連続したヌクレオチドを含むものである。例えば、一実施形態において、該一本
鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分内の連続する８個のヌクレオチドの配列が、天然に存
在するｍｉＲＮＡのシード領域の全部または一部と同一である（表Ｉ（後述）参照）。
一実施形態において、本発明のｍｉＲＮＡ模倣物は非ヌクレオチドスペーサー部分と２
つのヌクレオチド部分を有し、非ヌクレオチドスペーサー部分は、天然に存在する対応ｍ
ｉＲＮＡ配列の２個のヌクレオチド間に挿入されており、天然に存在する完全長のｍｉＲ
ＮＡを２つの相違するヌクレオチド部分に分断している。別の実施形態では、本発明のｍ
ｉＲＮＡ模倣物内に１つより多くの非ヌクレオチドスペーサー部分が存在し、該ｍｉＲＮ
Ａ模倣物の核酸部分が２つより多くのヌクレオチド部分に分断されるようになっている。
かかる場合では、ｍｉＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列全体が、天然に存在する対応ｍｉ
ＲＮＡヌクレオチド配列に完璧に相同である。天然に存在するｍｉＲＮＡとこの実施形態
のｍｉＲＮＡ模倣物との違いは、非ヌクレオチドスペーサー部分の存在である。
別の実施形態では、本発明のｍｉＲＮＡ模倣物は、天然に存在するｍｉＲＮＡガイド鎖
配列の１個以上のヌクレオチドの代わりに置き換えられた非ヌクレオチドスペーサー部分
を含むものである。例えば、まず、１個以上のヌクレオチドを天然に存在するｍｉＲＮＡ
ガイド鎖配列から欠失させて該配列内にギャップをもたらすと、少なくとも２つの相違す
るヌクレオチド部分が作製され得る。次いで、このギャップ内に非ヌクレオチドスペーサ
ー部分を挿入し、該相違するヌクレオチド部分を共有結合によって連結させる。したがっ
て、一実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、天然に存在する対応ｍｉＲＮＡ配
列（配列番号：１〜１０９０参照）の１〜１２個（例えば、１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１または１２個）のヌクレオチドが１つ以上の内部非ヌクレオチドス
ペーサー部分に置き換えられたｍｉＲＮＡ模倣物である。ｍｉＲＮＡ模倣物は、１つより
多くの非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものであってもよい。一実施形態において、
本発明の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、天然に存在するｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の１〜
４個（例えば、１、２、３または４個）のヌクレオチドの代わりに少なくとも１つの非ヌ
クレオチドスペーサー部分を含むものである。別の実施形態では、本発明の一本鎖ｍｉＲ
ＮＡ模倣物は、対応ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の１個または２個のヌクレオチドの代わ
りに少なくとも１つの内部非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものである。非ヌクレオ
チドスペーサー部分は、ｍｉＲＮＡガイド鎖配列から１個以上のヌクレオチドを除去する
ことによってもたらされるギャップを橋絡し、従来のホスホジエステル結合または非ホス
ホジエステル接続部のいずれかによって該分子のヌクレオチド部分のリン酸主鎖に接続さ
れる。
また、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、二本鎖または一本鎖のｓｉＲＮＡのガイド鎖ま
たはアンチセンス鎖の類似体であってもよい。二本鎖または一本鎖のｓｉＲＮＡは、ＲＮ
Ａｉ機構によって、標的遺伝子の発現を阻害するか、または標的遺伝子の発現を阻害する
潜在能を有することが知られているものであり得る。かかるシナリオにおいて、ｓｉＲＮ
Ａの対応物、具体的にはｓｉＲＮＡのガイド鎖（一本鎖であれ二本鎖であれ）を本明細書
において「対応ｓｉＲＮＡ」または「対応ｓｉＲＮＡガイド鎖」と称し、該一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子は、対応ｓｉＲＮＡガイド鎖の模倣物（すなわち、「一本鎖ｓｉＲＮＡ模倣物」）
である。一本鎖ｓｉＲＮＡ模倣物は、対応ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を基にして、１
つ以上の内部非ヌクレオチドスペーサー部分を対応ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列ヌクレ
オチド配列内に挿入すること、または対応ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列の１個以上のヌク
レオチドを１つ以上の非ヌクレオチドスペーサー部分で置き換えることのいずれかによっ
て設計される。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡ模倣物であり、該一本
鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分は２つ以上のヌクレオチド部分を含むものであり、内部スペー
サー部分は少なくとも１つの非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものである。上記のよ
うに、該ＲＮＡｉ分子の核酸部分が２つのヌクレオチド部分（すなわち、第１のヌクレオ
チド部分と第２のヌクレオチド部分）のみを含むものである場合、非ヌクレオチドスペー
サー部分は１つだけ存在する。該ＲＮＡｉ分子の核酸部分が３つのヌクレオチド部分を含
むものである場合、２つの非ヌクレオチドスペーサー部分が存在する。非ヌクレオチドス
ペーサー部分は、１つより多くの非ヌクレオチドスペーサーを含むものであってもよい（
例えば、２、３、４個またはそれ以上）。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ模倣物の核酸
部分は８〜２６個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）のヌクレオチドまた
は非ヌクレオチド部分またはその組合せからなり、該ヌクレオチドの少なくとも８個がＲ
ＮＡ標的部位と塩基対形成し得る。本発明のｓｉＲＮＡ模倣物の核酸部分は、対応ｓｉＲ
ＮＡガイド鎖のヌクレオチド配列に一部、実質的に、または完璧に相同な連続ヌクレオチ
ドの配列を含むものである。
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ模倣物は、非ヌクレオチドスペーサー部分と
２つのヌクレオチド部分を有し、非ヌクレオチドスペーサー部分は、対応ｓｉＲＮＡヌク
レオチド配列の２個の隣接ヌクレオチド間に挿入されており、対応ｓｉＲＮＡヌクレオチ
ド配列を２つの相違するヌクレオチド部分に分断している。別の実施形態では、本発明の
ｓｉＲＮＡ模倣物は、対応ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列が２つより多くのヌクレオチド
部分に分断されるように１つより多くの非ヌクレオチドスペーサー部分を有するものであ
り得る。かかる場合では、ｓｉＲＮＡ模倣物のヌクレオチド配列全体が対応ｓｉＲＮＡヌ
クレオチド配列に完璧に相同である。対応ｓｉＲＮＡとこの実施形態のｓｉＲＮＡ模倣物
との違いは、非ヌクレオチドスペーサー領域の存在である。
別の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ模倣物は、対応ｓｉＲＮＡガイド鎖のヌクレオ
チド配列の１個以上のヌクレオチドの代わりに置き換えられた１つ以上の非ヌクレオチド
スペーサー部分を含むものである。例えば、まず、１個以上のヌクレオチドを対応ｓｉＲ
ＮＡヌクレオチド配列から欠失させて該配列内にギャップをもたらすと、少なくとも２つ
の相違するヌクレオチド部分が作製され得る。次いで、このギャップ内に非ヌクレオチド
スペーサー部分を挿入し、該相違するヌクレオチド部分を連結させる。したがって、一実
施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、少なくとも１つの内部非ヌクレオチド
スペーサー部分を含むｓｉＲＮＡ模倣物であって、対応ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列の１
〜４個（例えば、１、２、３または４個）のヌクレオチドが前記非ヌクレオチドスペーサ
ー部分に置き換えられたｓｉＲＮＡ模倣物である。ｓｉＲＮＡ模倣物は、１つより多くの
非ヌクレオチドスペーサー部分を含むものであってもよい。別の実施形態では、本発明の
一本鎖ＲＮＡｉ分子は、少なくとも１つの内部非ヌクレオチドスペーサー部分を含むｓｉ
ＲＮＡ模倣物であって、対応ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列の１個または２個のヌクレオチ
ドが前記非ヌクレオチドスペーサー部分に置き換えられたｓｉＲＮＡ模倣物である。非ヌ
クレオチドスペーサー部分は、ｓｉＲＮＡガイド鎖配列から１個以上のヌクレオチドを除
去することによってもたらされるギャップを橋絡し、従来のホスホジエステル結合または
非ホスホジエステル接続部のいずれかによって該分子のヌクレオチド部分のリン酸主鎖に
接続される。
別の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、特定のＲＮＡ標的（例えば、天然
に存在するＲＮＡ標的）の発現をノックダウンする目的でデノボ設計され得る。このシナ
リオでは、まず標的遺伝子を選択する。次いで、当業者は、遺伝子サイレンシングのため
に一本鎖ＲＮＡｉ分子で標的化する一般的に約８〜約２６ヌクレオチド長の前記遺伝子の
一部分（すなわち、標的部位）を特定する。本発明の一実施形態において、本明細書に記
載の一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内の連続ヌクレオチドの配列は、特定された標的部位
の配列に一部、実質的に、または完璧に相補的であり、標的部位の対応配列の相補鎖に一
部、実質的に、または完璧に相同である。このシナリオにおける一本鎖ＲＮＡｉ分子の対
応物の配列（すなわち、標的部位の配列の相補鎖であるヌクレオチド配列）を本明細書に
おいて「標的部位の対応配列の相補鎖」と称する。該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、上記の１つ
以上の実施形態に記載のような２つ以上のヌクレオチド部分と少なくとも１つの内部非ヌ
クレオチドスペーサー部分を含むものである。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉成果をもたらし得るものである。本発明の
一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物の場合、該分子は、天然に存在する対応ｍｉＲＮＡによっても調
節される標的ｍＲＮＡの発現をモジュレートし得るものである。
本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、さらに、終末端の一方または両方に存在する末端リン
酸基（５’リン酸基または５’，３’二リン酸基など）を含むものであってもよい。一部
の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、置換、化学修飾ヌクレオチド、お
よび非ヌクレオチドを含むものであってもよい。一部の特定の他の実施形態では、本発明
の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１つ以上のリボヌクレオチドを含むもの、またはすべてリボヌ
クレオチドで構成されたものであってもよい。本発明の一部の特定の実施形態は、主鎖、
糖鎖、塩基またはヌクレオシドに置換または修飾を含む一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む。
本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部非ヌクレオチドスペーサー部分により、特に、得ら
れるＲＮＡｉ分子内のヌクレオチドの総数が一本鎖ＲＮＡｉ分子が類似体である対応ＲＮ
Ａｉ剤（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ；遺伝子ノックダウン能を有するｓｉＲＮＡ
のガイド鎖）と比べて少なくなる状況において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子のエンドヌクレア
ーゼに対する感受性が低減される。また、内部非ヌクレオチドスペーサー部分により、エ
クソヌクレアーゼによる損傷も制限され得、最終的に、一本鎖ＲＮＡｉ剤の完全性の保持
が補助され得る。また、該スペーサー部分は、１つ以上の対象部分をＲＮＡｉ分子（例え
ば、細胞内送達を助長する化学部分）に接続するための容易に到達可能な領域でもある。
したがって、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の活性が、該スペーサー部分のない対応一本鎖
ＲＮＡｉ分子（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ；遺伝子ノックダウン能を有する事前
に特定されたｓｉＲＮＡのガイド鎖）と比べていくぶん低い場合であっても（例えば、約
２０％未満または３０％未満またはさらに４０％未満）、該類似体の全体活性は、該分子
の改善された安定性または送達により、その対応物よりも大きくなり得る。さらに、合成
収率は、通常、短いＲＮＡ鎖の方が高いため、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子を使用すると
、治療適用に関連する大規模合成のコストも相当低減され得る。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、
式ＩＩＩ：
５’ Ｎ１−Ｓ１−Ｎ２ ３’
で表される、または示されるものであり得、
式中、Ｎ１は、第１のヌクレオチド部分を表し、１個のヌクレオチドまたは連続ヌクレオ
チド鎖のいずれかからなり；Ｓ１は、非ヌクレオチドスペーサー部分を表し、１つ以上の
非ヌクレオチドスペーサーからなり；Ｎ２は、第２のヌクレオチド部分を表し、１個のヌ
クレオチドまたは連続ヌクレオチド鎖のいずれかからなる。Ｎ１とＮ２内のヌクレオチド
の総数は、８〜２６個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）のヌクレオチド
であり、該分子の少なくとも８個のヌクレオチドが標的ＲＮＡ内の標的部位と塩基対形成
し得る。Ｎ１とＮ２内の「ヌクレオチド（１個または複数）」は、ヌクレオチド、修飾ヌ
クレオチド、ヌクレオチド類似体もしくは非ヌクレオチド代替部分のいずれか、またはそ
の組合せである。一実施形態において、個々に、Ｎ１およびＮ２は１〜２５個のヌクレオ
チドからなるものであり得、ここで、Ｎ１とＮ２の和は８〜２６個（例えば、８、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、２５または２６個）のヌクレオチドである。Ｎ１とＮ２は自己相補的でなく、し
たがって、互いの実質的な塩基対形成に関与し得ない。該分子の連続ヌクレオチド鎖にお
いて、ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合および／または非ホスホジエステル接続部
によって接続されている。スペーサー部分（Ｓ１）は、共有結合によって、該分子の第１
のヌクレオチド部分（Ｎ１）の３’末端ヌクレオチドと第２のヌクレオチド部分（Ｎ２）
の５’末端ヌクレオチドに結合されている。例えば、該スペーサー部分は、隣接ヌクレオ
チドの遊離リン酸基にホスホジエステル結合によって結合された１つ以上のホスホルアミ
ダイトスペーサーを含むものであってもよい。該分子のスペーサー部分（Ｓ１）は、単一
の非ヌクレオチドスペーサーからなるものであってもよく、連結されて一体になった１つ
より多くの非ヌクレオチドスペーサーからなるものであってもよい。該分子のＳ１部分内
に１つより多くの非ヌクレオチドスペーサーが存在する場合、スペーサーは同じである（
すなわち、同じ構造を有する）か、または異なっている（すなわち、異なる構造を有する
）かのいずれかであり得る。２つの非ヌクレオチドスペーサーが該分子のＳ１部分内で連
結されている場合、各スペーサーは、共有結合によって、それぞれ該分子のＮ１部分とＮ
２部分内の１個のヌクレオチドに結合されている。３つの非ヌクレオチドスペーサーが該
オリゴヌクレオチドのＳ１部分内で連続的に連結されている場合、内部（第２の）スペー
サーは、該分子のＮ１部分またはＮ２部分のどちらとも共有結合を形成しない。その代わ
り、該内部スペーサーは、共有結合によって第１および第３のスペーサーに結合され、こ
れらを連結して一体にする。
別の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、式ＩＶ：
５’ Ｎ１−Ｓ１−Ｎ２−Ｓ２−Ｎ３ ３’
で表される、または示されるものであり得、
式中、Ｎ１は、第１のヌクレオチド部分を表し、１個のヌクレオチドまたは連続ヌクレオ
チド鎖のいずれかからなり；Ｓ１は、第１の非ヌクレオチドスペーサー部分を表し、１つ
以上の非ヌクレオチドスペーサーからなり；Ｎ２は、第２のヌクレオチド部分を表し、１
個のヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド鎖のいずれかからなり；Ｓ２は、第２の非ヌク
レオチド内部スペーサー部分を表し、１つ以上の非ヌクレオチドスペーサーからなり；Ｎ
３は、第３のヌクレオチド部分を表し、１個のヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド鎖の
いずれかからなる。一実施形態において、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３内のヌクレオチドの総数
は８〜約２６個（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）のヌクレオチドであり
、該分子の少なくとも８個のヌクレオチドが標的ＲＮＡ内の標的部位と塩基対形成し得る
。Ｎ１、Ｎ２およびＮ３内の「ヌクレオチド（１個または複数）」は、ヌクレオチド、修
飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体もしくは非ヌクレオチド代替部分のいずれか、また
はその組合せである。一実施形態において、個々に、該ヌクレオチド部分（Ｎ１、Ｎ２、
Ｎ３）は１〜２４個のヌクレオチドからなるものであり得、ここで、該分子内のヌクレオ
チドの合計は８〜２６個のヌクレオチドである。該ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分は自
己相補的でなく、したがって、互いとの実質的な塩基対形成に関与し得ない。各連続ヌク
レオチド鎖において、ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合および／または非ホスホジ
エステル接続部によって接続されている。該スペーサー部分は、共有結合によって該分子
のヌクレオチド部分の末端ヌクレオチドに結合されている。一実施形態において、該スペ
ーサー部分は、隣接ヌクレオチドの遊離リン酸基にホスホジエステル結合によって結合さ
れた１つ以上のホスホルアミダイトスペーサーを含むものである。該分子の各スペーサー
部分は、単一の非ヌクレオチドスペーサーからなるものであってもよく、連結されて一体
になった１つより多くの非ヌクレオチドスペーサーからなるものであってもよい。該分子
のスペーサー部分内に１つより多くの非ヌクレオチドスペーサーが存在する場合、スペー
サーは同じである（すなわち、同じ構造を有する）か、または異なっている（すなわち、
異なる構造を有する）かのいずれかであり得る。２つの非ヌクレオチドスペーサーが該分
子のスペーサー部分内で連結されている場合、各スペーサーは、共有結合によって、該分
子の隣接ヌクレオチド部分内の末端ヌクレオチドに結合されている。３つの非ヌクレオチ
ドスペーサーが該分子のスペーサー部分内で連続的に連結されている場合、内部（第２の
）スペーサーは該分子のヌクレオチド部分と共有結合を形成しない。その代わり、該内部
スペーサーは、共有結合によって第１および第３のスペーサーに結合され、これらを連結
して一体にする。
本発明の一態様において、本明細書に記載の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つのヌ
クレオチド部分（例えば、式ＩＩＩおよび／またはＩＶに示したＮ１、Ｎ２またはＮ３）
は、１〜２０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個）のヌクレオチド、５〜２０個
（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９もしくは２０個）のヌクレオチド、１０〜２０個（例えば、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個）のヌクレオチド、１３〜２
０個（例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個）のヌクレオ
チド、５〜１５個（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしく
は１５個）のヌクレオチド、または１〜１４個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４個）のヌクレオチドのいずれかからなる連
続ヌクレオチド鎖である。別の態様では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つ
のヌクレオチド部分の長さは、連続１８ヌクレオチド、連続１９ヌクレオチドまたは連続
２０ヌクレオチドからなる群より選択される。なおさらなる態様では、本発明の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子の少なくとも１つのヌクレオチド部分の長さは、連続１３ヌクレオチド、連続
１４ヌクレオチドまたは連続１５ヌクレオチドからなる群より選択される。本発明の一本
鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つのヌクレオチド部分の長さは１８ヌクレオチドであり得
る。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つのヌクレオチド部分の長さは１９ヌク
レオチドであり得る。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つのヌクレオチド部分
の長さは２０ヌクレオチドであり得る。本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つの
ヌクレオチド部分の長さは２１ヌクレオチドであり得る。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、Ｎ１が連続１８ヌクレオチドか
らなり；Ｓ１が非ヌクレオチドスペーサーからなり；Ｎ２が２個の連続したヌクレオチド
からなる式ＩＩＩで表されるものである。別の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分
子は、Ｎ１が連続１９ヌクレオチドからなり；Ｓ１が非ヌクレオチドスペーサーからなり
；Ｎ２が１個のヌクレオチドからなる式ＩＩＩで表されるものである。これらの実施形態
において、Ｓ１はＣ３−またはＣ６−アルキルスペーサーであり得る。
本発明の別の態様では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分（例えば、式ＩＩＩ
および／またはＩＶに示したＮ１、Ｎ２またはＮ３）は、ＲＮＡ標的領域に実質的または
完璧に相補的な少なくとも１０個（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６
、１７、１８、１９、２０個など）のヌクレオチドの配列を含む連続ヌクレオチド鎖であ
る。別の態様では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分は、ＲＮＡ標的領域に実質
的または完璧に相補的な５〜８個の連続したヌクレオチドの配列を含むものである。本発
明のこの部分において、該分子の前記ヌクレオチド部分は、１〜２０個のヌクレオチド、
５〜２０個のヌクレオチド、１０〜２０個のヌクレオチド、１３〜２０個のヌクレオチド
、５〜１５個のヌクレオチド、または１〜１４個のヌクレオチドのいずれかからなる連続
ヌクレオチド鎖である。別の態様では、前記ヌクレオチド部分は連続１８、１９または２
０ヌクレオチド長である。なおさらなる態様では、前記ヌクレオチド部分は連続１３、１
４または１５ヌクレオチド長である。別の態様では、前記ヌクレオチド部分の長さは、連
続１８ヌクレオチド、連続１９ヌクレオチド、または連続２０ヌクレオチドからなる群よ
り選択される。なおさらなる態様では、前記ヌクレオチド部分の長さは、連続１３ヌクレ
オチド、連続１４ヌクレオチドまたは連続１５ヌクレオチドからなる群より選択される。
前記ヌクレオチド部分の長さは１８ヌクレオチドであり得る。前記ヌクレオチド部分の長
さは１９ヌクレオチドであり得る。前記ヌクレオチド部分の長さは２０ヌクレオチドであ
り得る。前記ヌクレオチド部分の長さは２１ヌクレオチドであり得る。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分は、天然に存在
するｍｉＲＮＡ配列のシード配列の全部または一部と同一（または完璧に相同）である５
〜８個（例えば、５、６、７または８個）の連続したヌクレオチドを含むものである。一
実施形態において、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列は表１（後述）に示した配列である。
例えば、一実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分内の６ヌクレオ
チド配列が、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列（例えば、表１から選択される天然に存在す
るｍｉＲＮＡ配列）のシード領域の全部または一部と同一である。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は式ＩＩＩまたは式ＩＶで表される
、または示されるものであり得る。式ＩＩＩおよびＩＶは、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子
の特定の例を代表していることを認識されたい。本発明に包含されるさらなる例としては
、限定されないが、３つより多くのヌクレオチド部分を有するＲＮＡｉ分子が挙げられる
。
本発明の一態様において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内の連続ヌクレオチドの配
列は、天然に存在する内在性ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのガイド鎖に一部、実質的に、
または完璧に相同である。本発明の別の態様では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子の核酸部分内の
連続ヌクレオチドの配列は、ＲＮＡ標的配列内の標的部位に一部、実質的に、または完璧
に相補的である。別の実施形態では、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１つのヌ
クレオチド部分が、天然に存在する内在性ｍｉＲＮＡのある領域もしくはｓｉＲＮＡのガ
イド鎖に一部、実質的に、または完璧に相同である、および／またはＲＮＡ標的配列内の
標的部位に一部、実質的に、または完璧に相補的である。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部スペーサー部分は、少なくとも第１の非ヌクレオチ
ドスペーサー部分を含むものである。前記非ヌクレオチドスペーサー部分は化学基（典型
的には、有機存在体）を含み、該化学基は少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合によ
って結合され、かくして該ヌクレオチドを連結している。該２つのヌクレオチドは該分子
の相違するヌクレオチド部分に存在している。非ヌクレオチドスペーサー部分の長さは、
該分子がＲＮＡ標的配列と従来型もしくは非従来型のワトソンクリック塩基対形成を形成
する能力および／またはＲＮＡｉを媒介する能力に深刻な影響を与えない限り、特に制限
はない。非ヌクレオチドスペーサー部分は、従来のホスホジエステル結合または非ホスホ
ジエステル接続部によって２つのヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド代替部分を
接続することができる。ヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドをスペーサーに連結
する非ホスホジエステル系接続部を含む本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、例えば、ペプチ
ド系接続部（例えば、オリゴペプチド核酸（ＰＮＡ）単位を連結するもの）を含むもので
ある（Ｂｏｆｆａら，２０００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ５：４７−５
３参照）。
本明細書に示した、あるいは当該技術分野で知られた種々の非ヌクレオチド部分が、本
発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の内部スペーサー部分に含有され得る。本発明の一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子の内部スペーサー部分内に含まれる非ヌクレオチドスペーサーとしては、２つのヌ
クレオチドおよび／または非ヌクレオチド代替部分を従来のホスホジエステル結合または
非ホスホジエステル接続部のいずれかによって連結することができる任意の非核酸スペー
サーが挙げられ得る。該スペーサーは、典型的には脂肪族または芳香族の有機存在体であ
り、該オリゴヌクレオチド（すなわち、相補的ハイブリッドを形成している核酸塩基）の
主鎖を形成しているヌクレオチド間結合以外である。
非ヌクレオチドスペーサーの非限定的な例としては、以下のもの：ポリエーテル、ポリ
アミン、ポリアミド、ペプチド、糖質、脂質、高分子炭化水素（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｃａ
ｒｂｏｎ）、または他の高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール２〜１００個の
エチレングリコール単位を有するものなど））が挙げられる。具体例としては、Ｓｅｅｌ
ａおよびＫａｉｓｅｒ，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６３５
３；ＳｅｅｌａおよびＫａｉｓｅｒ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１５：３１１３；ＣｌｏａｄおよびＳｃｈｅｐａｒｔｚ，１９９１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．１１３：６３２４；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＳｃｈｅｐａｒｔｚ，１９９
１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９；Ｍａら，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２５８５；Ｍａら，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ ７０：２８７；Ｊａｓｃｈｋｅら，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ ３４：３０１：Ｏｎｏら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：
９９１４；などに記載されたものが挙げられる。
本発明の一実施形態において、スペーサーは、炭素数１〜２０（すなわち、Ｃ１〜Ｃ２
０）、好ましくは炭素数１〜１２（すなわち、Ｃ１〜Ｃ１２）の置換されていてもよいア
ルキル、アルケニルまたはアルキニル鎖である。該炭化水素鎖は、さらなる化学基および
／または官能基（例えば、対象の標的分子に特異的に結合する部分）で置換されていても
よい。
該一本鎖ＲＮＡｉ分子にさらなる官能部を提供する（例えば、対象の標的分子に特異的
に結合する、または該分子の細胞内送達を助長／増進する）化学部分は、スペーサーの一
部であってもよく、スペーサーに共有結合によって結合または連結されて（例えば、置換
されて）いてもよい。例えば、さらなる官能基は、ＲＮＡｉ分子化合物が細胞膜を通過し
て移動するのを補助すること、薬物動態を改変すること、および／または本発明のＲＮＡ
ｉ分子の局在をモジュレートすることにより、該一本鎖ＲＮＡｉ分子に治療活性を付与す
るものであり得る。
非ヌクレオチドスペーサー自体に組み込まれ得るおよび／または該スペーサーに共有結
合によって結合され、本開示によって想定される具体的なコンジュゲート分子の例は、小
分子、脂質または脂肪親和性物質、テルペン、リン脂質、抗体、毒素、コレステロール、
タンパク質結合剤（例えば、細胞内取込みを助長し得る細胞受容体のリガンド）、ビタミ
ン、負電荷ポリマーおよび他のポリマー、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブ
ミン）、ペプチド、ホルモン、糖質、ポリエチレングリコール、またはポリアミン、なら
びに例えば、米国特許公開公報第２００５／０１９６７８１号および米国特許公開公報第
２００６／０２９３２７１号（これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる）に記
載されたものである。このような化合物により、血清の存在下または非存在下において、
異なる組織に由来するいくつかの細胞型への本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の送達および／
または局在が改善されることが予測される（ＳｕｌｌｅｎｇｅｒおよびＣｅｃｈ，米国特
許第５，８５４，０３８号参照）。例えば、コンジュゲート構成員は、ナプロキセン、ニ
トロインドール（またはスタッキング相互作用に寄与する別のコンジュゲート）、葉酸類
、イブプロフェン、またはＣ５ピリミジンリンカーであり得る。他の実施形態では、コン
ジュゲート構成員は、グリセリド脂質コンジュゲート（例えば、ジアルキルグリセリド誘
導体）、ビタミンＥコンジュゲート、またはチオコレステロールである。別の実施形態で
は、コンジュゲート分子は、該一本鎖ＲＮＡｉ分子にコンジュゲートさせたとき標的細胞
内への該分子の送達を助長する機能を果たす、あるいは生物学的試料と接触させたとき該
分子の送達、安定性または活性を向上する機能を果たすペプチドである。本開示のこのよ
うな態様における使用のための例示的なペプチドコンジュゲート構成員としては、例えば
、米国特許出願公開第２００６／００４０８８２号および同第２００６／００１４２８９
号ならびに米国特許仮出願第６０／９３９，５７８号（これらはすべて、引用により本明
細書に組み込まれる）に記載のペプチドＰＮ２７、ＰＮ２８、ＰＮ２９、ＰＮ５８、ＰＮ
６１、ＰＮ７３、ＰＮ１５８、ＰＮ１５９、ＰＮ１７３、ＰＮ１８２、ＰＮ２０２、ＰＮ
２０４、ＰＮ２５０、ＰＮ３６１、ＰＮ３６５、ＰＮ４０４、ＰＮ４５３、およびＰＮ５
０９が挙げられる。
一実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、標的分子に特異的に結合する部分
を含むものである。標的分子は任意の対象分子であり得る。例えば、標的分子は、タンパ
ク質のリガンド結合ドメインであり得、それにより該タンパク質と天然に存在するリガン
ドとの相互作用を抑制するか、または該相互作用と競合する。これは非限定的な例であり
、当業者には、当該技術分野で一般的に知られた手法を用いて他の実施形態が容易に作製
され得ることが認識されよう（例えば、Ｇｏｌｄら，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：１６３；ＢｒｏｄｙおよびＧｏｌｄ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌ ７４：５；Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：１
００；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｊ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２１；Ｈｅｒｍａ
ｎｎおよびＰａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：８２０；ならびにＪａｙａ
ｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．４５：１６２８を参照のこと）。ま
た、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の該スペーサー部分は、細胞内送達と関連する特性を向
上させるためにＲＮＡｉ分子に官能性化学基を導入するためにも簡便に使用され得る。
一実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子のスペーサー領域によって結合されたコン
ジュゲート分子または官能性化学部分は、特定の細胞型（肝細胞など）に前記ＲＮＡｉ分
子を投与できる能力をもたらすものである。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳ
ＧＰｒ）（ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９）は
肝細胞に特有であり、分枝ガラクトース末端糖タンパク質（アシアロオロソムコイド（Ａ
ＳＯＲ）など）に結合する。かかる糖タンパク質または合成複合糖質の該受容体への結合
は、該オリゴ糖鎖の分岐度に強く依存する親和性で起こり、例えば、トリアンテナ型（ｔ
ｒｉａｔｅｎｎａｒｙ）構造は、ビアンテナ型（ｂｉａｔｅｎａｒｒｙ）またはモノアン
テナ型（ｍｏｎｏａｔｅｎｎａｒｙ）鎖よりも大きな親和性で結合される（Ｂａｅｎｚｉ
ｇｅｒおよびＦｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：６１１；Ｃｏｎｎｏｌｌｙら，１
９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：９３９）。ＬｅｅおよびＬｅｅ（１９８７，
Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．４：３１７）により、ガラクトースと比べて該受容
体に対する親和性が高いＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを糖質部分として使用するこ
とによって、この高特異性が得られた。また、この「クラスタリング効果」は、マンノシ
ル末端糖タンパク質または複合糖質の結合および取込みでも報告されている（Ｐｏｎｐｉ
ｐｏｍら，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：１３８８）。外来性化合物を細胞膜
を通過して輸送するためのガラクトースおよびガラクトサミン系コンジュゲートの使用に
より、肝臓疾患の処置に対するターゲテッド送達アプローチが提供され得る。また、バイ
オコンジュゲートの使用により、処置に必要とされる治療用化合物の必要用量の低減がも
たらされ得る。さらに、治療的バイオアベイラビリティ、薬力学、および薬物動態パラメ
ータが、本開示のバイオコンジュゲートの使用によってモジュレートされ得る。
本明細書に記載のコンジュゲート分子は該一本鎖ＲＮＡｉ分子に、生分解性の非核酸リ
ンカーによって結合され得る。用語「生分解性リンカー」は、本文脈において用いる場合
、ある分子を別の分子に接続するため（例えば、コンジュゲート分子を本発明の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子に接続するため）の生分解性リンカーとして設計される非核酸リンカー分子を
いう。生分解性リンカーは、その安定性が特定の目的（特定の組織または細胞型への送達
など）のためにモジュレートされ得るように設計される。用語「生分解性の」は、本明細
書で用いる場合、生物学的系内での分解（例えば、酵素分解または化学分解）をいう。
一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１つ以上の非ヌクレオチドスペ
ーサー部分を含む内部スペーサー部分を含むものであり、前記１つ以上の非ヌクレオチド
スペーサー部分（例えば、式ＩＩＩおよびＩＶにおけるＳ１またはＳ２）は、Ｃ３、Ｃ６
、Ｃ９、およびＣ１２脂肪族スペーサーからなる群より選択される非ヌクレオチドスペー
サーを含むもの、または該非ヌクレオチドスペーサーからなるものである。「Ｃ」の後の
数字は、コアスペーサー構造（例えば、さらなる化学部分で非置換の場合）内の炭素原子
の数を示す。前記スペーサーは、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり得る。
また、前記スペーサーは、該分子のヌクレオチド部分のリン酸主鎖に対する共有結合を助
長するためのホスホルアミダイト部分を含むものであってもよい。一実施形態において、
スペーサー（Ｓ）部分はＣ３ホスホルアミダイトスペーサーである。別の実施形態では、
スペーサーはＣ６ホスホルアミダイトスペーサーである。さらなる実施形態では、Ｃ３、
Ｃ６、Ｃ９またはＣ１２スペーサーは置換されていてもよい（例えば、標的化部分で）。
本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子のヌクレオチド部分内のヌクレオチドの１個以上または全
部がリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、または適当なヌクレオチド類似体であり
得る。ヌクレオチド類似体（種々の既知の糖鎖、塩基および主鎖の修飾など）ならびにＬ
ＮＡモノマー単位が破壊された鎖に組み込まれることにより、血清安定性が有意に向上し
、標的ノックダウンまたは発現調節効果が長期化され得る。本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は
、機能的に適合され得、種々の化学修飾を種々の程度まで適合性がある。例えば、本発明
の一本鎖ＲＮＡ分子のリボヌクレオチドの５％〜１００％が修飾されたものであり得る（
例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子のリボヌクレオチドの５％、１０％、１５％、２０
％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％が化学修飾されたものであ
り得るか、またはヌクレオチド類似体残基で置き換えられるものである）。糖鎖、塩基お
よび／または主鎖に対する機能的に適合性の化学修飾によって付与された改善された特性
、あるいは適当なヌクレオチド類似体残基によって付与された改善された特性は、例えば
、治療用薬剤としての使用のため、または機能的ゲノムツールとしての、この一本鎖ＲＮ
Ａｉ分子のインビボでの適用に特に重要である。
さらなる態様において、本明細書における任意の実施形態による本発明の一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子は、ＲＮＡ標的、例えば内在性ＲＮＡ標的に対するＲＮＡｉに関与し得るものであ
る。一実施形態において、内在性ＲＮＡ標的は、天然に存在するｍｉＲＮＡ標的である。
ＲＮＡ標的の阻害は、標準的なＲＮＡ特異的干渉機構（例えば、ｍｉＲＮＡ依存性ＲＮＡ
干渉）によって行なわれ得る。例えば、ｍｉＲＮＡ標的の阻害は、内在性対応ｍｉＲＮＡ
と相互作用する非翻訳ｍＲＮＡ領域との相互作用（例えば、塩基対形成、結合など）（こ
れにより、１つ以上の下流遺伝子の翻訳調節が達成される）によるものであり得る。ある
いはまた、ｍｉＲＮＡ標的の阻害は、ｍｉＲＮＡ模倣物である本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分
子によるｍｉＲＮＡ標的の結合により非翻訳ｍｉＲＮＡ標的の切断がもたらされるｓｉＲ
ＮＡ様干渉機構によって行なわれ得る。また、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、本発明の
一本鎖ＲＮＡｉ分子によるｍＲＮＡ標的の（むしろ非コード非翻訳領域よりも）配列内の
コード領域での結合によりｍＲＮＡ標的コード配列の切断がもたらされるｓｉＲＮＡ様干
渉機構によってｍＲＮＡ標的を阻害するものであり得る。
Ｃ．置換型および／または修飾型一本鎖ＲＮＡｉ分子
置換ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子に導入するこ
とにより、外来的に送達される天然ＲＮＡ分子（すなわち、標準ヌクレオチドを有する）
に固有のインビボ安定性およびバイオアベイラビリティの潜在的限界を克服するためのツ
ールが提供される。一部の特定の実施形態において、本開示の置換型または修飾型一本鎖
ＲＮＡｉ分子の使用により、この分子は被検体または生物学的試料中（例えば、血清中）
において半減期が増大するように設計されたものであり得るため、低用量で所与の治療効
果の達成が可能となり得る。さらに、特定の細胞もしくは組織を標的化することによって
、または一本鎖ＲＮＡｉ分子の細胞内取込みを改善することによって、一本鎖ＲＮＡｉ分
子のバイオアベイラビリティを改善するために特定の置換または修飾が使用され得る。し
たがって、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の活性が、同じ構造の非修飾型または非置換型Ｒ
ＮＡｉ分子と比べていくぶん低い場合であっても（例えば、約２０％未満または３０％未
満またはさらに４０％未満）、置換型または修飾型ＲＮＡｉ分子の全体活性は、該分子の
改善された安定性または送達により、その天然対応物よりも大きくなり得る。また、置換
型およびまたは修飾型一本鎖ＲＮＡｉ分子により、例えばヒトにおいてインターフェロン
応答が活性化される可能性が最小限となり得る。
一部の特定の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、ヌクレオチド位置の
約５％〜約９５％にリボヌクレオチドを含むものである。例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子のリボヌクレオチドの１個〜全部（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、
２３、２４、２５、２６または２７個）が修飾されたものであり得る。
関連する実施形態において、本開示による一本鎖ＲＮＡｉ分子は１個以上の天然または
合成の非標準ヌクレオシドを含むものである。関連する実施形態において、非標準ヌクレ
オシドは、１個以上のデオキシウリジン、Ｌ−もしくはＤ−ロックド核酸（ＬＮＡ）分子
（例えば、５−メチルウリジンＬＮＡ）もしくは置換ＬＮＡ（例えば、ピレンを有する）
、またはユニバーサル結合ヌクレオチド、またはＧクランプ、またはその任意の組合せで
ある。一部の特定の実施形態において、ユニバーサル結合ヌクレオチドは、Ｃ−フェニル
、Ｃ−ナフチル、イノシン、アゾールカルボキサミド、１−β−Ｄ−リボフラノシル−４
−ニトロインドール、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、１−β−Ｄ
−リボフラノシル−６−ニトロインドール、または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニ
トロピロールであり得る。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子に存在し得る置換型または修飾型ヌクレオチドは、天然ま
たは標準リボヌクレオチドと類似した特徴を有する修飾型または置換型ヌクレオチドを含
むものである。例えば、本開示は、少なくともｓｉＲＮＡ分子に適用した場合にヌクレア
ーゼ分解に対する抵抗性が付与される可能性があるがＲＮＡｉを媒介する能力は維持され
ることが知られたノザンコンホメーション（例えば、ノザンプソイドロテーションサイク
ル，Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編，１９８４参照）を有するヌク
レオチドを含む一本鎖ＲＮＡｉ分子を特色とする。ノザン立体配置を有する例示的なヌク
レオチドとしては、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ
−メチレン−（Ｄ）−リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ
）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレ
オチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、５−
メチルウリジン、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド）が挙げられる。これらの任意の
実施形態において、１個以上の置換型または修飾型ヌクレオチドは、Ｇクランプ（例えば
、グアニンに対してさらなる水素結合を形成しているシトシン類似体、例えば、９−（ア
ミノエトキシ）フェノキサジン）であり得る。例えば、ＬｉｎおよびＭａｔｅｕｃｃｉ，
１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２０：８５３１を参照のこと。
一部の特定の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の５’終末端はリン酸化
されている。本明細書に記載の一本鎖ＲＮＡｉ分子の任意の実施形態において、該分子は
、さらに、５’リン酸基（Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００２，Ｃｅｌｌ １１０：５６３；
Ｓｃｈｗａｒｚら，２００２，Ｍｏｌｅ．Ｃｅｌｌ ７０：５３７参照）または５’３’
二リン酸基などの末端リン酸基を含むものであってもよい。
別の態様では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１つ以上の５’−および／または３’
−キャップ構造を該分子の終末端に含むものである。「キャップ構造」により、オリゴヌ
クレオチドの末端に組み込まれた化学修飾を意図する（例えば、Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａ
ｍｉｃら，米国特許第５，９９８，２０３号（引用により本明細書に組み込まれる）参照
）。このような末端修飾により、特定の核酸分子がエクソヌクレアーゼ分解から保護され
得、送達および／または細胞内局在において特定の利点が付与され得る。非限定的な例に
おいて：適当な５’−キャップは、逆位無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌク
レオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド
；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオ
チド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−
ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−
ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、
３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位無塩基部分；３’−２’−逆位ヌ
クレオチド部分；３’−２’−逆位無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；
３’−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’
リン酸基；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または橋絡もしくは非橋
絡メチルホスホネート部分を含む群から選択され得る。
別の非限定的な例において、適当な３’−キャップは、４’，５’−メチレンヌクレオ
チド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭
素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プ
ロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェー
ト；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−
アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基
ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式
３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジ
ヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆
位無塩基部分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタン
ジオールホスフェート；５’−アミノ；橋絡および／または非橋絡５’−ホスホルアミデ
ート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、橋絡または非橋絡メチ
ルホスホネートならびに５’−メルカプト部分を含む群から選択され得る。さらなる詳細
については、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４
９：１９２５（これは引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
一部の特定の実施形態において、本開示は、リン酸主鎖の修飾、例えば、１つ以上のホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、
モルホリノ、アミデート カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリア
ミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルム
アセタール、またはアルキルシリル置換などを含む修飾型一本鎖ＲＮＡｉ分子を特色とす
る。オリゴヌクレオチド主鎖の修飾の概説については、ＨｕｎｚｉｋｅｒおよびＬｅｕｍ
ａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ．ＶＣＨ，３３１；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，１９９４，ＡＣＳ ２４−３９を参
照のこと。
さらなる実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１個以上（例えば、１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）の２’−糖鎖置換、例えば、
２’−デオキシ、２’−Ｏ−２−メトキシエチル、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ
−メチル、２’−ハロゲン（例えば、２’−フルオロ）、２’−Ｏ−アリルなど、または
その任意の組合せを含むものである。なおさらなる実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ
分子は、末端キャップ置換基、例えば、アルキル、無塩基、デオキシ無塩基、グリセリル
、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、逆位デオキシヌクレオチド部分など、またはそ
の任意の組合せを一方または両方の終末端に含むものである。一部の特定の実施形態にお
いて、少なくとも１個の５’終末端リボヌクレオチドは２’−糖鎖置換を有する。
他の実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１個以上（例えば、１、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９
、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）の置換、例えば、リボシル、２’
−デオキシリボシル、テトロフラノシル（例えば、Ｌ−α−トレオフラノシル）、ヘキソ
ピラノシル（例えば、β−アロピラノシル、β−アルトロピラノシルおよびβ−グルコピ
ラノシル）、ペントピラノシル（例えば、β−リボピラノシル、α−リキソピラノシル、
β−キシロピラノシルおよびα−アラビノピラノシル）、炭素環式類似体、ピラノース、
フラノース、モルホリノ、またはその類似体もしくは誘導体の任意の組合せを糖鎖主鎖内
に含むものである。
また他の実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、少なくとも１個（例えば、１、
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６個）の修飾ヌクレオシド間
結合、例えば、独立して、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジ
チオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネ
ート、アルキルホスホネート、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホ
ネート、キラルホスホネート、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテート、ホスフィ
ネート、ホスホルアミデート、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホ
ルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキ
ルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ボラノホスフェート結合、またはその任意
の組合せを含むものである。
該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合を該分子の３’終末端、
５’終末端、または３’末端と５’終末端の両方に含むものであってもよい。一実施形態
において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、３’終末端にホスホロチオエート結合などの
修飾ヌクレオチド間を有する。例示的な一本鎖ＲＮＡｉ分子は、約１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０個またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む
ものである。さらなる例示的な一本鎖ＲＮＡｉ分子は、約１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０個またはそれ以上の連続するホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、例
えば該分子の５’終末端に含むものである。また別の例示的な一本鎖ＲＮＡｉ分子では、
１つ以上のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し得る。さらなる例
示的な一本鎖ＲＮＡｉ分子では、１つ以上のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結
合が存在し得る。
本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子において有用な多くの例示的な修飾ヌクレオチド塩基また
はその類似体としては、５−メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチ
ン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；６−メチル、２−プロピル、またはアデニン
およびグアニンの他のアルキル誘導体；８−置換アデニンおよびグアニン（例えば、８−
アザ、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルなど
）；７−メチル、７−デアザおよび３−デアザアデニンおよびグアニン；２−チオウラシ
ル；２−チオチミン；２−チオシトシン；５−メチル、５−プロピニル、５−ハロ（例え
ば、５−ブロモもしくは５−フルオロ）、５−トリフルオロメチル、または他の５−置換
ウラシルおよびシトシン；ならびに６−アゾウラシルが挙げられる。さらなる有用なヌク
レオチド塩基は、Ｋｕｒｒｅｃｋ，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１
６２８；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，２０００，Ｇｕｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐ．１０：２９７；Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐｐ．８５８−８５９，
Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ編．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０；米
国特許３，６８７，８０８、および同様の参考文献（これらはすべて、引用により本明細
書に組み込まれる）において知得され得る。
特定の置換型または修飾型ヌクレオチド塩基部分もまた想定される。このようなものと
しては、５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；ならびにＮ−２、Ｎ−６、またはＯ
−６置換プリン（例えば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび
５−プロピニルシトシン）が挙げられる。さらに、例えば、５−メチルウリジン置換およ
び５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を増大させることが知られており、こ
れを、２’−糖鎖修飾（例えば、２’−Ｏ−メチルもしくは２’−メトキシエチル）また
はヌクレオシド間結合（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせると、修飾型または
置換型の一本鎖ＲＮＡｉ分子に対して所望のヌクレアーゼ抵抗性がもたらされ得る。
さらなる実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の少なくとも１個のピリミジ
ンは、二環式の糖の形態のロックド核酸（ＬＮＡ）である。関連する実施形態において、
ＬＮＡは塩基置換を含む（５−メチルウリジンＬＮＡまたは２−チオ−５−メチルウリジ
ンＬＮＡなど）。さらなる実施形態において、ピリミジンヌクレオシドまたはヌクレオシ
ド間結合のリボースは修飾されていてもよい。
これらの任意の実施形態において、１個以上の置換型または修飾型ヌクレオチドは、Ｇ
クランプ（例えば、グアニンに対してさらなる水素結合を形成しているシトシン類似体、
例えば、９−（アミノエトキシ）フェノキサジン）であり得る。例えば、ＬｉｎおよびＭ
ａｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３１１１を参
照のこと。
本明細書に記載の任意の実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は多種類の型の修飾
を含むものであってもよい。例えば、少なくとも１個のリボチミジンまたは２−チオリボ
チミジンを有する一本鎖ＲＮＡｉ分子は、さらに、少なくとも１つのＬＮＡ、２’−メト
キシ、２’−フルオロ、２−デオキシ、ホスホロチオエート結合、逆位塩基末端キャップ
、またはその任意の組合せを含むものであってもよい。一部の特定の例示的な実施形態に
おいて、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、リボチミジンで置換されたウリジンを１個以上含むも
の、または全部置換されたウリジンで構成されたものであり、約７５％までのＬＮＡ置換
を有するものであり得る。他の例示的な実施形態では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、リボチ
ミジンで置換されたウリジンを１個以上含むもの、または全部置換されたウリジンで構成
されたものであり、約２５％までの２’−メトキシ置換を有するものであり得る。さらに
他の例示的な実施形態では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、リボチミジンで置換されたウリジ
ンを１個以上含むもの、または全部置換されたウリジンで構成されたものでありで構成さ
れており、約１００％までの２’−フルオロ置換を有するものであり得る。
また、一部の特定の態様において、本発明の開示により、１個以上のユニバーサル塩基
ヌクレオチドを含む一本鎖ＲＮＡｉ分子を提供する。用語「ユニバーサル塩基」は、本明
細書で用いる場合、１種類より多くの型のヌクレオチドと塩基対または水素結合ヌクレオ
チド対を形成するヌクレオチド塩基類似体をいう。ユニバーサル塩基の非限定的な例とし
ては、当該技術分野で知られたＣ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族の誘導体、
イノシン、アゾールカルボキシアミド、ならびにニトロアゾール誘導体（３−ニトロピロ
ール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなど
）が挙げられる（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ２９：２４３７−２４４７を参照のこと）。一部の特定の態様において、
本明細書に開示した一本鎖ＲＮＡｉ分子には、得られるＲＮＡｉ分子が１種類以上のその
内在性標的をモジュレートする能力が保持される限り、約１個〜約１０個のユニバーサル
塩基ヌクレオチドを含めることができる。
Ｄ．一本鎖ＲＮＡｉ分子の合成
本開示の例示的な分子は当業者に知られたいくつかの手法を用いて得ることができる。
例えば、本発明のＲＮＡｉ分子は、化学合成されるもの、組換え産生される（例えば、プ
ラスミドにコードされる）もの、またはその組合せであり得る。
オリゴヌクレオチドまたは個々の連続ヌクレオチド鎖（例えば、特定の修飾オリゴヌク
レオチドまたはリボヌクレオチドがないオリゴヌクレオチドの一部分）は、当該技術分野
で知られた、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ ２１１：３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＰＣＴ国際公開第９９／５４４５９号パン
フレット；Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：
２６７７；Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９７ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９
；Ｂｒｅｎｎａｎら，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７：３３；お
よびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載のプロトコルを用いて合成
される。オリゴヌクレオチドの合成では、一般的な核酸保護基およびカップリング基（５
’末端のジメトキシトリチル、および３’末端のホスホルアミダイトなど）が利用される
。修飾なしのＲＮＡ、例えば、本開示の特定の一本鎖ＲＮＡｉ分子のもの合成は、Ｕｓｍ
ａｎら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ
ら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３；ならびにＷｉｎ
ｃｏｔｔら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７；および
Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９に記載の手
順を用いて行われ得る。一部の特定の実施形態において、本発明の開示の一本鎖ＲＮＡｉ
分子のヌクレオチド部分は、別々に合成してもよく、合成後に非ヌクレオチドスペーサー
部分と、例えばライゲーションによって連接して一体にしてもよい。（Ｍｏｏｒｅら，１
９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：９９２３；Ｄｒａｐｅｒら，ＰＣＴ国際公開第９３／
２３５６９号パンフレット；Ｓｈａｂａｒｏｖａら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１９：４２４７；Ｂｅｌｌｏｎら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６：９５１；Ｂｅｌｌｏｎら，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８：２０４）。さらなる実施形態では、本開示の一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子のヌクレオチド部分は、１種類以上の連続ＲＮＡ鎖をコードし、宿主細胞内でのそ
の発現を指令するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）ベクターによって発現される
単一の転写産物として作製されるものであっても、多種類の転写産物として作製されるも
のであってもよい。次いで該ヌクレオチド部分を単離し、ライゲーションによって非ヌク
レオチドスペーサー部分と連接する。
一部の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩ系構築物を用いて本発明の核酸分子を発現させる
。該一本鎖ＲＮＡｉ分子配列の転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）
、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ
ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動され得る（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国
特許第５，９０２，８８０号および同第６，１４６，８８６号を参照のこと）。（また、
ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５；Ｍ
ｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ，ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら，１９９
２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら，１９
９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら，１９９１，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら，１９９２，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒら，１９９０ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｇｏｏｄら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ，４，４５も参照のこと。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターで
の転写物は、あらゆる細胞において高レベルで発現される；所与の細胞型における所与の
ｐｏｌ ＩＩプロモーターレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サ
イレンサーなど）の性質に依存する。また、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーター
も使用されるが、原核生物のＲＮＡポリメラーゼ酵素は適切な細胞において発現させるも
のとする（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ １９９３，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒら，１９９
３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕら，１９９０，Ｍ
ｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１０，４５２９−３７）。数名の研究者らにより、かかるプ
ロモーターにより発現される核酸分子は、哺乳動物細胞において機能を果たし得ることが
示されている（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら，１９９２，Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら，１９
９２，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら，１９９３，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅ
ｎｇｅｒ ＆ Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的
には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノ
ウイルスＶＡ ＲＮＡをコードしている遺伝子に由来するものなどの転写単位は、高濃度
の所望のＲＮＡ分子の作製に有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ
およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら，米国特許第５
，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，４５；Ｂｅｉ
ｇｅｌｍａｎら，ＰＣＴ国際公開第 ９６／１８７３６号パンフレット。上記の転写単位
は、哺乳動物細胞内への導入のためのさまざまなベクター、例えば限定されないが、プラ
スミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウ
イルスベクターなど）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスもしくはアルフ
ァウイルスベクターなど）に組み込まれ得る（概説については、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳ
ｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）を参照のこと）。
置換または修飾（塩基、糖鎖、リン酸基またはその任意の組合せ）を有する核酸分子の
化学合成により、血清リボヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性が付与され得、これに
より効力ならびに他の薬理学的および治療的有益性の増大がもたらされ得る。例えば、Ｅ
ｃｋｓｔｅｉｎら，ＰＣＴ国際公開第９２／０７０６５号パンフレット；Ｐｅｒｒａｕｌ
ｔら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５；Ｐｉｅｋｅｎら，１９９１，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２５３：３１４；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄ
ｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．７７：３３４；Ｕｓｍａｎら，１９９４，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，１９９
５，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２；Ｂｕｒｌｉｎａら，１９９７，Ｂｉ
ｏｏｒｇ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙら，１９９８，Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ３９：１１３１；ＥａｒｎｓｈａｗおよびＧａｉｔ，１９
９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：
３９；ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．６７：９９；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，２０００，Ｇｕｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０：２９１；Ｋｕｒｒｅｃｋ，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２７０：１６２８；ＤｏｒｓｅｔｔおよびＴｕｓｃｈｌ，２００４，Ｎａｔｕ
ｒｅ Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．３：３１８；Ｒｏｓｓｉら，ＰＣＴ国際公開第９
１／０３１６２号パンフレット；Ｕｓｍａｎら，ＰＣＴ国際公開第９３／１５１８７号パ
ンフレット；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，ＰＣＴ国際公開第９７／２６２７０号パンフレット
；Ｗｏｏｌｆら，ＰＣＴ国際公開第９８／１３５２６号パンフレット；Ｓｐｒｏａｔ，米
国特許第５，３３４，７１１号；Ｕｓｍａｎら，米国特許第５，６２７，０５３号；Ｂｅ
ｉｇｅｌｍａｎら，米国特許第５，７１６，８２４号；Ｏｔｖｏｓら，米国特許第５，７
６７，２６４号；Ｇｏｌｄら，米国特許第６，３００，０７４号を参照のこと。上記の各
参考文献には、本明細書に記載の一本鎖ＲＮＡｉ分子において使用され得る核酸分子の塩
基、リン酸または糖鎖部分に対する種々の置換および化学修飾が開示されている。
Ｅ．一本鎖ＲＮＡｉ分子の設計方法
本明細書に記載のように、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構によって標的配
列の発現を阻害し得るものである。一実施形態において、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、所望
のノックダウン機能を有する事前に特定されたＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲ
ＮＡ）を基にして設計され得る。例えば、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子がｍｉＲＮＡ模倣
物である場合、これは、天然に存在する対応ｍｉＲＮＡ分子（表１参照）またはその類似
体（例えば、化学修飾形態）から得られる。本出願の出願日の時点で、さまざまな種に内
在性の３０００種類を超えるｍｉＲＮＡ分子が公衆に利用可能なデータベースにおいて知
得され得る（例えば、公衆に利用可能なｍｉＲＢａｓｅ配列データベースを参照のこと（
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１およびＧｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓら，２００６，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４に記載，ワ
ールドワイドウェブにおいてＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅのウェブサイトでアクセス可能）。本明細書の表１に、１０９０種類の成熟ヒト
ｍｉＲＮＡ配列の一覧（配列番号：１〜１０９０）を示している。別の例では、本発明の
一本鎖ＲＮＡｉ分子は、選択した標的配列の発現を阻害することがわかっているか、また
は標的ｍＲＮＡ配列の発現を阻害する潜在性を有するかのいずれかである事前に特定され
たｓｉＲＮＡから得られ得る。具体的には、事前に特定されたＲＮＡｉ分子（すなわち、
参照ＲＮＡｉ分子）から得られる一本鎖ＲＮＡｉ分子は、１つ以上の内部非ヌクレオチド
スペーサー部分を参照ＲＮＡｉ分子のガイド鎖内に導入することにより設計され得る。別
の実施形態では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子は、特定の標的配列の発現をノックダウンする目
的のためにデノボ設計され得る（すなわち、既知のＲＮＡｉ剤を基にしない）。
本発明の所与の一本鎖ＲＮＡｉ分子のＲＮＡｉ活性は、既知の方法、例えば、Ｆｉｒｅ
ら，ＰＣＴ国際公開第９９／３２６１９号パンフレットに一般的に記載のもの、および後
述する実施例のセクションに記載のものを用いて測定され得る。一部の実施形態において
、本明細書により、構成的プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはホスホ
グリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなど）を含み、１種類以上のレポーター遺
伝子（ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）またはβ−ガラクトシダーゼな
ど）に作動可能に融合され（さらに、該レポーター遺伝子は、試験対象のｓｓＲＮＡｉに
完全にまたは一部相補的な標的配列の一部分にインフレームで作動可能に融合される）、
その発現を改変することができる１種類以上のレポーター遺伝子構築物を使用することに
より、より有効な一本鎖ＲＮＡｉ分子設計物を選択するための方法を提供する。このよう
なレポーター遺伝子発現構築物は、１種類以上のｓｓＲＮＡｉ分子および対照（例えば、
内部非ヌクレオチドスペーサーを含まない対応ｍｉＲＮＡ模倣物）とコトランスフェクト
され得る。所与のｓｓＲＮＡｉ分子が標的ｍＲＮＡのＲＮＡｉを媒介する能力は、ｓｓＲ
ＮＡｉ分子でトランスフェクトした細胞において測定されたレポーター遺伝子の活性と、
陰性対照でトランスフェクトした細胞（すなわち、ｓｓＲＮＡｉ分子でトランスフェクト
していない細胞）および陽性対照でトランスフェクトした細胞（例えば、内部非ヌクレオ
チドスペーサーを含まない対応ｍｉＲＮＡ模倣物でトランスフェクトした細胞）における
活性とを比較することにより測定され得る。例えば内部非ヌクレオチドスペーサーを含ま
ないその対応ＲＮＡｉ分子の活性の少なくとも２０％以上、好ましくは少なくとも４０％
以上、または６０％以上、または８０％以上を有するｓｓＲＮＡｉ分子を選択する。
当業者は、改善された特性（例えば、薬物動態プロフィール、バイオアベイラビリティ
、安定性）を有するがＲＮＡｉを媒介する能力は維持されている分子がどれであるかを判
定するために、例えば、本明細書に記載の、または当該技術分野で一般的に知られた動物
モデルにおいて、種々の非ヌクレオチドスペーサーを含む本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子を
スクリーニングすることができよう。また、同様に、当業者は、改善された特性を有する
がＲＮＡｉを媒介する能力は維持されているＲＮＡｉ分子−コンジュゲート複合体がどれ
であるかを判定するために、種々のコンジュゲートを有する本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子
をスクリーニングすることができよう。
Ｆ．組成物および使用方法
本明細書に示すように、本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は、好ましくは細胞内ＲＮＡｉ経路
に関与し得る、あるいは同じまたは関連経路をモジュレートして病的または疾患状態と関
連している標的遺伝子の阻害をもたらし得るＲＮＡｉ剤である。ｍｉＲＮＡ模倣物である
一本鎖ＲＮＡ分子の場合、該ｓｓＲＮＡｉ分子は、レベルの低下あるいはレベルが不適切
に低いことが病的または疾患状態と関連している天然に存在する対応ｍｉＲＮＡが補足さ
れるように、または置き換えられるように設計される。したがって、本発明の一本鎖ＲＮ
Ａｉ分子は、さまざまな治療的、診断的、標的確認、ゲノム知得、遺伝子操作および薬理
ゲノミクスの適用用途のための方法において使用され得る有用な試薬である。
本発明の一本鎖ＲＮＡ分子は細胞、組織、生物体、インビトロ系またはインビボ系に、
標的配列に対するＲＮＡｉを媒介するために導入され得る。該標的配列は、内在性の標的
遺伝子または配列であり得る。一実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、不
要なタンパク質産生を特徴とする疾患を有する生物体の処置に使用され得る。
ｍｉＲＮＡ模倣物である本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子の場合、標的配列は、天然に存在
する対応ｍｉＲＮＡ標的である。かかる場合において、一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、例え
ば、そのｍＲＮＡ標的の下流のいくつかの遺伝子を調節するものであり得、その発現レベ
ルは天然に存在する対応ｍｉＲＮＡと関連しているか、あるいは該対応ｍｉＲＮＡによっ
て調節される。天然に存在する特定のｍｉＲＮＡの異常な発現レベルは種々のヒトの病気
（例えば限定されないが、過剰増殖性、血管形成性または炎症性の疾患、状態、または有
害な病状）に関与しているため、本発明の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物により有益な治療機会
がもたらされ得る。これとの関連において、本開示の一本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物は、その対
応内在性ｍｉＲＮＡの１つ以上の下流遺伝子の発現を調節（例えば、ノックダウンまたは
上方調節）し得るものであり、そのため、１つ以上の関連疾患症状の重症度または再発の
予防、緩和または低減が達成され得る。あるいはまた、疾患または他の有害な病状の結果
として１種類以上の標的ｍＲＮＡの発現が必ずしも低下しない、または正常より低いレベ
ルでない種々の相違する疾患モデルであっても、本発明の１種類以上の一本鎖ｍｉＲＮＡ
模倣物などの外来性ｍｉＲＮＡ模倣物を導入すると、疾患経路と関連している遺伝子の発
現レベルに影響を及ぼすことにより治療成果がもたらされることがそれでもなおあり得る
。
また、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、標的遺伝子のコード領域を標的化し、該遺伝子
の発現を阻害し、したがってタンパク質産生を低減させることにおいて、ｓｉＲＮＡ分子
と同様の作用を行うことができるものである。該一本鎖ＲＮＡｉ分子の導入がなければ産
生されたであろうタンパク質は、病的または疾患状態（例えば、がん）と関連しているも
のであり得る。
本明細書における開示によれば、細胞内または生物体の１種類以上の対応する標的ｍＲ
ＮＡの発現を阻害するための本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子、その組成物および方法を提供
する。本開示により、被検体（例えば、ヒトの細胞、組織または個体）を処置するための
方法および一本鎖ＲＮＡｉ分子組成物を提供する。
（ｉ）医薬組成物および製剤
本開示は、保存または投与のために調製される一本鎖ＲＮＡｉ分子組成物であって、医
薬有効量の所望のＲＮＡｉ分子を薬学的に許容され得る担体または希釈剤中に含む一本鎖
ＲＮＡｉ分子組成物を含む。本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子組成物は薬学的に許容され得る
製剤として有効に使用され得る。薬学的に許容され得る製剤は、被検体の疾患状態または
他の有害な病状を予防、その発症もしくは重症度を改変、または該疾患状態または該病状
を処置（１つ以上の症状を検出可能もしくは測定可能な程度まで緩和する）するものであ
る。したがって、医薬組成物または製剤は、細胞内または被検体（ヒトなど）への投与（
例えば、全身投与）に適した形態の組成物または製剤をいう。本発明の開示の医薬組成物
は、内包された一本鎖ＲＮＡｉ分子（１種類または複数種）が被検体に投与するとバイオ
アベイラブルとなることが可能なように製剤化される。
一部の特定の実施形態において、本開示の医薬組成物に、保存料、酸化防止剤、安定剤
、色素、フレーバー剤またはその任意の組合せを含めてもよい。例示的な保存料としては
、安息香酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびソルビン酸が挙げら
れる。薬学的に許容され得る製剤としては、上記の化合物の塩、例えば、酸付加塩（塩酸
、臭化水素酸、酢酸またはベンゼンスルホン酸の塩など）が挙げられる。治療的使用のた
めの許容され得る担体または希釈剤は製薬技術分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍ
ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ，第２１版，２００５に
記載されている。
一部の特定の実施形態において、本発明の１種類以上の一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む水性
懸濁剤は、適当な賦形剤（懸濁化剤または分散化剤もしくは湿潤剤など）と混合物して調
製され得る。例示的な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチ
ルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル
ピロリドン、ガムトラガカントおよびガムアカシアが挙げられる。代表的な分散化剤また
は湿潤剤としては、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキ
シドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオ
キシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタ
ノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの
縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、またはエチレ
ンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合生成
物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。一部の特定の実施
形態において、該水性懸濁剤に、１種類以上の保存料（例えば、エチルまたはｗ−プロピ
ル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、１種類以上の着色剤、１種類以上のフレーバー剤、
または１種類以上の甘味剤（例えば、スクロース、サッカリン）を含有させてもよい。さ
らなる実施形態において、本発明の１種類以上の一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む水性懸濁剤の
調製に適した分散性の粉末剤および顆粒剤は、該一本鎖ＲＮＡｉ分子が分散化剤または湿
潤剤、懸濁化剤と混合された状態で（１種類以上の保存料、着色剤、フレーバー剤または
甘味剤が混合されていてもよい）水を添加することによって調製され得る。
さらなる実施形態では、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、ｓｓＲＮＡｉを、例えば、植
物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油）、または鉱油
（例えば、液状パラフィン）に懸濁させることにより、油性懸濁剤または乳剤（例えば、
水中油型）として製剤化され得る。好適な乳化剤は、天然に存在するガム（例えば、ガム
アカシアもしくはガムトラガカント）、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズ、
レシチン、脂肪酸とヘキシトールから得られるエステルもしくは部分エステル）、無水物
（例えば、ソルビタンモノオレエート）、または部分エステルとエチレンオキシドとの縮
合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。一部の
特定の実施形態において、油性懸濁剤または乳剤に、増粘剤（蜜蝋、硬質パラフィンまた
はセチルアルコールなど）を含有させてもよい。関連する実施形態において、口あたりの
よい経口調製物を得るために、甘味剤およびフレーバー剤を添加してもよい。また他の実
施形態では、このような組成物は、アスコルビン酸などの添加してもよい酸化防止剤によ
って保存され得る。
さらなる実施形態において、一本鎖ＲＮＡｉ分子は、甘味剤（例えば、グリセロール、
プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロース）を用いて、シロッ
プ剤およびエリキシル剤として製剤化され得る。また、かかる製剤に粘滑剤、保存料、フ
レーバー剤、着色剤、またはその任意の組合せを含有させてもよい。
他の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む医薬組成物は、滅菌された注射
用の水性または油性懸濁剤の形態であり得る。また、滅菌された注射用調製物は、無毒性
の非経口に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌された注射用の液剤または懸濁剤（例
えば、１，３−ブタンジオール中の液剤）であり得る。中でも、本開示の組成物に有用な
例示的な許容され得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液または等張性塩化ナトリウ
ム溶液である。また、滅菌された固定油も、溶媒または懸濁媒体として使用され得る。こ
の目的には、任意の無刺激性固定油（例えば、合成のモノ−またはジグリセリド）が使用
され得る。また、オレイン酸などの脂肪酸は、非経口製剤の調製に有用性が見い出されて
いる。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は直接投与してもよく、例えばカチオン性脂質と複合体形
成しても、リポソーム内に封入しても、別の方法で標的細胞もしくは組織に送達してもよ
い。核酸分子の送達方法は、Ａｋｈｔａｒら，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏ．，２：１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎ
ｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ編．Ａｋｈｔａｒ，
１９９５；Ｍａｕｒｅｒら，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ １６：１２９−
１４０；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ．１３７：１６５−１９２；ならびにＬｅｅら，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．
Ｓｅｒ．７５２：１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらの米国特許第
６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎらのＰＣＴ国際公開第９４／０２５９５号
パンフレットには、さらに、核酸分子の送達のための一般法が記載されている。このよう
なプロトコルは、事実上どのような核酸分子の送達にも使用することができる。核酸分子
は細胞に、当業者に知られたさまざまな方法、例えば限定されないが、リポソーム内への
封入、イオン導入、もしくは他の媒体、例えば、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロ
デキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃ
ｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇら，ＰＣＴ国際公開第０３／４７５１８
号パンフレットおよび同第０３／４６１８５号パンフレット参照）、ポリ（乳酸−コ−グ
リコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフィア（例えば、米国特許６，４４７
，７９６および米国特許出願公開第２００２１３０４３０号参照）、生分解性ナノカプセ
ル、ならびに生体接着性ミクロスフィアへの組込みによって、またはタンパク質性ベクタ
ー（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際公開第００／５３７２２号パンフレ
ット）によって投与され得る。
（ｉｉ）担体／送達系
一態様において、本発明は、本明細書に記載の一本鎖ＲＮＡｉ分子を内包する担体系を
提供する。一部の実施形態において、担体系は、脂質系担体系、カチオン性脂質もしくは
リポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子またはその混合
物である。他の実施形態では、担体系は、ポリマー系担体系（カチオン性ポリマー−核酸
複合体など）である。さらなる実施形態では、担体系は、シクロデキストリン系担体系（
シクロデキストリンポリマー−核酸複合体など）である。さらなる実施形態において、担
体系は、タンパク質系担体系（カチオン性ペプチド−核酸複合体など）である。好ましく
は、担体系は脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤である（ｉｎ）。
一部の特定の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、米国特許出願第１１
／３５３，６３０号、同第１１／５８６，１０２号、同第６１／１８９，２９５号、同第
６１／２０４，８７８号、同第６１／２３５，４７６号、同第６１／２４９，８０７号、
および同第６１／２９８，０２２号に記載されているような脂質ナノ粒子組成物を用いて
製剤化される。一部の特定の好ましい実施形態では、本発明のｓｓＲＮＡｉ分子は、カチ
オン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣを４０／４８／２／１０の
比で、またはカチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ／ＤＳＰＣを４０／４８
／２／１０の比で含む脂質ナノ粒子組成物を用いて製剤化される。一部の特定の他の実施
形態では、本発明は、米国特許出願第６１／１８９，２９５号、同第６１／２０４，８７
８号、同第６１／２３５，４７６号、同第６１／２４９，８０７号、および同第６１／２
９８，０２２号に記載のいずれかのカチオン性脂質配合物を用いて製剤化された本発明の
ｓｓＲＮＡｉ分子を含む組成物を特色とする。
本開示の一部の特定の実施形態では、官能性部分と合わせた、複合体形成した、または
コンジュゲートした１種類以上の一本鎖ＲＮＡｉ分子（例えば、希釈剤、安定剤、バッフ
ァーなどの薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化してもよい）の存在または投与を特
色とする医薬組成物および方法を提供する。かかるコンジュゲートおよび／または複合体
は、生物学的系（細胞など）へのＲＮＡｉ分子の送達を助長するために使用され得る。本
発明によって提供されるコンジュゲートおよび複合体は、治療用化合物を細胞膜を通過し
て移動させること、薬物動態を改変すること、および／または本発明の核酸分子の局在を
モジュレートすることにより、治療活性を付与するものであり得る。かかるコンジュゲー
トの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００８／０１５２６６１号および同第２００
４／０１６２２６０号（例えば、ＣＤＭ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐｉｐ−ＬＢＡ、ＣＤＭ−Ｐ
ＥＧ、ＣＤＭ−ＮＡＧなど）ならびに米国特許出願第１０／４２７，１６０号および同第
１０／２０１，３９４号；ならびに米国特許第６，５２８，６３１号；同第６，３３５，
４３４号；同第６，２３５，８８６号；同第６，１５３，７３７号；同第５，２１４，１
３６号および；同第５，１３８，０４５に記載されている。
本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子は、該分子の末端位置および／または内部位置（１つ以上
または複数）のヌクレオチドの１つ以上および／またはスペーサー部分にコンジュゲート
構成員を含むものである。コンジュゲート構成員は、例えば、脂肪親和性物質、テルペン
、タンパク質結合剤、ビタミン、糖質、またはペプチドであり得る。例えば、コンジュゲ
ート構成員は、ナプロキセン、ニトロインドール（もしくはスタッキング相互作用に寄与
する別のコンジュゲート）、フォレート、イブプロフェン、またはＣ５ピリミジンリンカ
ーであり得る。他の実施形態では、コンジュゲート構成員は、グリセリド脂質コンジュゲ
ート（例えば、ジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥコンジュゲート、またはチオ
コレステロールである。種々の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子に共有結合によって結合され得る。結合されるＰＥＧは、任
意の分子量（好ましくは、約１００〜約５０，０００ドルトン（Ｄａ））であり得る。
本開示の一部の特定の実施形態では、ポリペプチドまたはペプチドと合わせた、複合体
形成した、またはコンジュゲートした１種類以上の一本鎖ＲＮＡｉ分子（例えば、希釈剤
、安定剤、バッファーなどの薬学的に許容され得る担体を用いて製剤化してもよい）の存
在または投与を特色とする医薬組成物および方法を提供する。一部の特定の実施形態にお
いて、ペプチドコンジュゲートパートナーが、標的細胞への本開示の１種類以上の一本鎖
ＲＮＡｉ分子の送達を向上させるため、あるいは、生物学的試料を接触させた場合の該分
子の安定性または活性を向上させるために使用される場合。本開示のこのような態様にお
ける使用のための例示的なペプチドコンジュゲート構成員としては、例えば、米国特許出
願公開第２００６／００４０８８２号および同第２００６／００１４２８９号ならびに米
国特許仮出願第６０／９３９，５７８号（これらはすべて、引用により本明細書に組み込
まれる）に記載のペプチドＰＮ２７、ＰＮ２８、ＰＮ２９、ＰＮ５８、ＰＮ６１、ＰＮ７
３、ＰＮ１５８、ＰＮ１５９、ＰＮ１７３、ＰＮ１８２、ＰＮ２０２、ＰＮ２０４、ＰＮ
２５０、ＰＮ３６１、ＰＮ３６５、ＰＮ４０４、ＰＮ４５３およびＰＮ５０９が挙げられ
る。
一実施形態において、本開示により、肝細胞などへの特定の細胞型への本開示の一本鎖
ＲＮＡｉ分子の投与に適した組成物を提供する。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（
ＡＳＧＰｒ）（ＷｕおよびＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９
）は、は肝細胞に特有であり、分枝ガラクトース末端糖タンパク質（アシアロオロソムコ
イド（ＡＳＯＲ）など）に結合する。かかる糖タンパク質または合成複合糖質の該受容体
への結合は、該オリゴ糖鎖の分岐度に強く依存する親和性で起こり、例えば、トリアンテ
ナ型構造は、ビアンテナ型またはモノアンテナ型鎖よりも大きな親和性で結合される（Ｂ
ａｅｎｚｉｇｅｒおよびＦｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：６１１；Ｃｏｎｎｏｌ
ｌｙら，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：９３９）。ＬｅｅおよびＬｅｅ（
１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．４：３１７）により、ガラクトースと比
べて該受容体に対する親和性が高いＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを糖質部分として
使用することによって、この高特異性が得られた。また、この「クラスタリング効果」は
、マンノシル末端糖タンパク質または複合糖質の結合および取込みでも報告されている（
Ｐｏｎｐｉｐｏｍら，１９８１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：１３８８）。外来性化合
物を細胞膜を通過して輸送するためのガラクトースおよびガラクトサミン系コンジュゲー
トの使用により、肝臓疾患の処置に対するターゲテッド送達アプローチが提供され得る。
また、バイオコンジュゲートの使用により、処置に必要とされる治療用化合物の必要用量
の低減がもたらされ得る。さらに、治療的バイオアベイラビリティ、薬力学、および薬物
動態パラメータが、本開示のバイオコンジュゲートの使用によってモジュレートされ得る
。
さらに別の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子をポリペプチドにコンジュゲー
トさせ、１種類以上の非カチオン性脂質または非カチオン性脂質とカチオン性脂質の組合
せと混合すると、標的細胞を該脂質なしの裸のＲＮＡｉ分子と接触させることによる送達
と比べてＲＮＡｉ分子の細胞内送達が向上する組成物が形成され得る。本開示のより詳細
な態様では、該一本鎖ＲＮＡｉ分子とポリペプチドを含む混合物、複合体またはコンジュ
ゲートは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（商標）などのカチオン性脂質と合わされ（例えば、
混合または複合体形成され）てもよい。ポリペプチド、一本鎖ＲＮＡｉ分子およびカチオ
ン性脂質で構成されたこのような組成物を作製するためには、ＲＮＡｉ分子とポリペプチ
ドがまず適当な培地（例えば、細胞培養培地）中で一緒に混合され得、その後でカチオン
性脂質を混合物に添加し、ＲＮＡｉ分子／送達ペプチド／カチオン性脂質組成物を形成す
る。状況によっては、ペプチドとカチオン性脂質をまず適当な培地（例えば、細胞培養培
地）中で混合した後、一本鎖ＲＮＡｉ分子を添加し、ＲＮＡｉ分子／送達ペプチド／カチ
オン性脂質組成物を形成してもよい。
また、本開示は、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾型、または長期循環性
のリポソームまたはステルスリポソーム）を内包している表面修飾リポソームを含む一本
鎖ＲＮＡｉ分子組成物の使用を特色とする。このような製剤により、標的組織内での薬物
の蓄積の増大がもたらされ得る（Ｌａｓｉｃら，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２
６０１；Ｉｓｈｉｗａｔａら，１９９５，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４３：１０
０５）。かかるリポソームは、おそらく、新たに血管が形成された標的組織内での管外遊
出および捕捉により腫瘍内に選択的に蓄積されることが示されている（Ｌａｓｉｃら，１
９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１２１５；Ｏｋｕら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２３８：８６）。長期循環リポソームにより、単核食細胞系
（ＭＰＳ）の組織内に蓄積することがわかっている慣用的なカチオン性リポソームと比べ
て核酸分子の薬物動態と薬力学が向上する（Ｌｉｕら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．４２：２４８６４；Ｃｈｏｉら，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９１号パンフレット
；Ａｎｓｅｌｌら，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９０号パンフレット；Ｈｏｌｌａｎｄ
ら，ＰＣＴ国際公開第９６／１０３９２号パンフレット）。また、長期循環性のリポソー
ムにより、理論的には代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織（肝臓および脾臓など）への蓄積が回
避されるため、カチオン性リポソームと比べてヌクレアーゼ分解からのさらなる保護がも
たらされ得る。
また、一部の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ分子は、ポリエチレンイミンおよびその
誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコル−Ｎ−アセチルガラクトサ
ミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコル−ト
リ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）誘導体を用いて製剤化
または複合体形成され得る。一実施形態において、本発明の核酸分子は米国特許出願公開
第２００３００７７８２９号に記載のようにして製剤化される。
他の実施形態では、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子を、膜破壊剤（米国特許出願公開公報
第２００１０００７６６６号に記載のものなど）と複合体形成させる。また、さらに他の
実施形態では、膜破壊剤（１種類または複数種）と該ＲＮＡｉ分子を、カチオン性脂質ま
たはヘルパー脂質分子（米国特許第６，２３５，３１０号に記載のもののような脂質など
）と複合体形成させる。
一部の特定の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子を米国特許出願公開第２
００３０７７８２９号；同第２００５０２８７５５１号；同第２００５０１６４２２０号
；同第２００５０１９１６２７号；同第２００５０１１８５９４号；同第２００５０１５
３９１９号；同第２００５００８５４８６号；および同第２００３０１５８１３３号；な
らびにＰＣＴ国際公開第００／０３６８３号パンフレットおよび国際公開第０２／０８７
５４１号パンフレットに記載のような送達系と複合体形成させる。
一部の実施形態において、本発明のリポソーム製剤は、米国特許第６，８５８，２２４
号；同第６，５３４，４８４号；同第６，２８７，５９１号；同第６，８３５，３９５号
；同第６，５８６，４１０号；同第６，８５８，２２５号；同第６，８１５，４３２号；
同第６，５８６，００１号；同第６，１２０，７９８号；同第６，９７７，２２３号；同
第６，９９８，１１５号；同第５，９８１，５０１号；同第５，９７６，５６７号；同第
５，７０５，３８５号；ならびに米国特許出願公開第２００６／００１９９１２号；同第
２００６／００１９２５８号；同第２００６／０００８９０９号；同第２００５／０２５
５１５３号；同第２００５／００７９２１２号；同第２００５／０００８６８９号；同第
２００３／００７７８２９号、同第２００５／００６４５９５号、同第２００５／０１７
５６８２号、同第２００５／０１１８２５３号；同第２００４／００７１６５４号；同第
２００５／０２４４５０４号；同第２００５／０２６５９６１号および同第２００３／０
０７７８２９号に記載の化合物および組成物を用いて製剤化または複合体形成された本発
明のＲＮＡｉ分子を含むものである。
また、本開示は、一本鎖ＲＮＡｉ分子のナノ粒子の調製方法を特色とする。メラミン誘
導体を含む第１の溶液を、ＨＣｌなどの酸を添加しておいた有機溶媒（ジメチルスルホキ
シドまたはジメチルホルムアミドなど）に溶解させる。ＨＣｌの濃度は、メラミン誘導体
１モルに対して約３．３モルのＨＣｌであり得る。次いで、第１の溶液を、極性または親
水性の溶媒（例えば、エチレンジアミン四（ｔｒａ）酢酸（ＥＤＴＡ）またはトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）またはその組合せを含む水性バッファー溶液
など）に溶解または懸濁させた核酸を含む第２の溶液と混合する。この混合物は第１の乳
剤を形成している。混合は、任意の標準的な手法、例えば、超音波処理、ボルテックスま
たはマイクロフルイダイザーなどを用いて行われ得る。得られた核酸粒子を精製してもよ
く、有機溶媒は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは透析または両方を用いて除去する
ことができる。複合体形成された核酸ナノ粒子は、次いで、ポリアルギニンもしくはＧｌ
ｎ−Ａｓｎポリマーのいずれか、または両方を水溶液中に含む水溶液と混合され得る。各
ポリマーの好ましい分子量は約５０００〜約１５，０００ドルトンである。これにより、
メラミン誘導体と複合体形成された核酸のナノ粒子と、ポリアルギニンおよびＧｌｎ−Ａ
ｓｎポリマーとを含む溶液が形成される。混合工程は、核酸の剪断は最小限であるが平均
して約２００ナノメートルより小さい直径のナノ粒子が作製される様式で行われる。ポリ
アルギニンが核酸の副溝内でリン酸基の負電荷と複合体形成し、このポリアルギニンによ
って該三量体核酸複合体が覆われていると考えられる。ポリアルギニンのいずれかの末端
にＴＡＴポリペプチド、マンノースまたはガラクトースなどの他の部分を該ポリマーに共
有結合によって結合させ、特定の組織（ガラクトースを使用する場合は肝臓など）に核酸
複合体の結合を指向させてもよい。理論に拘束されることを望まないが、Ｇｌｎ−Ａｓｎ
ポリマーが核酸の主溝内で核酸複合体と、該核酸の塩基との水素結合形成によって複合体
形成すると考えられる。ポリアルギニンおよびＧｌｎ−Ａｓｎポリマーは、２０塩基対を
有する核酸１モルに対して２モルの濃度で存在させるのがよい。該濃度は、２０塩基対よ
り多くを有する核酸では比例して増大させるのがよい。例えば、核酸が２５塩基対を有す
る場合、該ポリマーの濃度は該二本鎖核酸１モルに対して２．５〜３モルにするのがよい
。得られたナノ粒子は、標準的な手段（サイズ排除クロマトグラフィーなど）によって精
製した後、透析され得る。精製された複合体形成ナノ粒子は、次いで、当該技術分野でよ
く知られた手法を用いて凍結乾燥され得る。本発明の開示の一実施形態では、一本鎖ＲＮ
Ａｉ分子を含む１００ナノメートル（ｎｍ）未満のナノ粒子を提供する。
（ｉｉｉ）処置
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子（置換されていても修飾されていてもコンジュゲートされ
ていてもよい）、その組成物、および本発明の開示の方法を用いた処置に適した被検体（
例えば、哺乳動物の、ヒト）としては、少なくとも一部において標的遺伝子もしくは配列
の異常な発現レベルによって媒介される１つ以上の疾患もしくは病状に苦しんでいる被検
体、標的遺伝子／配列の異常レベルによって引き起こされる疾患もしくは該異常レベルと
関連している疾患を発症するリスクがある被検体、または対応するｓｓＲＮＡｉ分子によ
って媒介されるＲＮＡｉレベルを補足もしくは増大させることによる処置に適した被検体
が挙げられる（例えば、過剰増殖性（例えば、がん）、血管形成性、代謝性または炎症性
（例えば、関節炎）の疾患または障害または病状）。
本明細書に開示した組成物および方法は、多種多様な標的ウイルス、例えば、レトロウ
イルス（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、コロ
ナウイルスなど）、ならびに呼吸器系ウイルス、例えば、ヒト呼吸器合抱体ウイルス、ヒ
トメタニューモウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ライノウイルスおよびイン
フルエンザウイルスの処置に有用である。
他の例において、本開示の組成物および方法は、例えば過剰増殖性障害の症状を処置ま
たは予防するための治療ツールとして有用である。例示的な過剰増殖性障害としては、新
生物、癌腫、肉腫、腫瘍、またはがんが挙げられる。より例示的な過剰増殖性障害として
は、口腔がん、咽喉（ｔｈｒｏａｔ）がん、喉頭がん、食道がん、咽頭（ｐｈａｒｙｎｇ
ｅａｌ）がん、鼻咽腔がん、口腔咽頭がん、消化器がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、
小腸のがん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、肛門がん、膵がん、乳がん、子宮頚が
ん、子宮がん、外陰がん、膣がん、尿路がん、膀胱がん、腎臓がん、副腎皮質がん、島細
胞がん、胆嚢がん、胃がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、絨毛性腫瘍、精巣が
ん、陰茎がん、骨のがん、骨肉腫、肝臓がん、肝外胆管がん、皮膚がん、基底細胞がん（
ＢＣＣ）、肺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、脳のがん、黒色腫、
カポジ肉腫、目のがん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮がん、胸腺腫（ｔｙｍｏｍａ）、
胸腺がん、甲状腺がん、上皮小体がん、ヒッペル‐リンダウ症候群、白血病、急性骨髄性
（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、急性リンパ
芽球性白血病、ヘアリーセル白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ
腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性胸膜中皮腫、バレット腺がん、ウィルムス腫瘍
などが挙げられる。他の例において、本開示の組成物および方法は、例えば炎症性障害の
症状を処置または予防するために１種類以上の標的遺伝子の発現を調節するための治療ツ
ールとして有用である。例示的な炎症性障害としては、真性糖尿病、関節リウマチ、炎症
滑膜表層のパンヌスの増殖、コラーゲン誘導性関節炎、脊椎関節炎、強直性脊椎炎、多発
性硬化症、脳脊髄炎、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬または乾癬性関節炎、重症筋無力
症、全身性エリテマトーデス、対宿主性移植片病、アテローム性動脈硬化、およびアレル
ギーが挙げられる。
本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子、組成物および方法で処置され得る他の例示的な障害とし
ては、代謝障害、心疾患、肺疾患、新生血管形成、虚血性障害、加齢性黄斑変性、糖尿病
性網膜症、糸球体腎炎、糖尿病、喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、リンパ脈管新
生、およびアテローム性動脈硬化が挙げられる。
さらなる態様において、本明細書に記載の１つ以上の標的遺伝子関連疾患または病状を
コントロールするために本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子と一緒に製剤化される、または協働
的に投与される１種類以上の二次的または補助的活性薬剤と併用された有効量の１種類以
上の一本鎖ＲＮＡｉ分子を含む併用製剤および方法を提供する。このようなコンビナトリ
アル製剤および協働的処置方法に有用な補助的治療用薬剤としては、例えば、酵素性核酸
分子、アロステリック核酸分子、ガイド、デコイまたはアプタマー核酸分子、抗体（モノ
クローナル抗体など）、小分子および他の有機または無機化合物、例えば、金属、塩およ
びイオン、ならびに１つ以上の標的遺伝子関連疾患または病状の処置のために指示される
他の薬物および活性薬剤、例えば、がんを処置するために使用される化学療法剤、ステロ
イド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）などが挙げられる。例示的な化学療法剤と
しては、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ブ
スルファン、ニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、ウラムスチン、テモゾロミド）
、代謝拮抗薬（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオ
ロウラシル、シタラビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、アン
トラサイクリン系（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビ
シン（ｉｄａｒｕｉｃｉｎ）、ミトザントロン、バルルビシン）、ブレオマイシン、マイ
トマイシン、アクチノマイシン、ヒドロキシ尿素、トポイソメラーゼ阻害薬（例えば、カ
ンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド）、モノクローナル
抗体（例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツム
マブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）、ビンカアルカロイド（例えば、
ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、シクロホスファミド、
プレドニゾン、ロイコボリン、オキサリプラチンが挙げられる。
本開示の協働的投与方法を実施するため、一本鎖ＲＮＡｉ分子を協働的処置プロトコル
において、本明細書に記載の、または当該技術分野で知られた１種類以上の二次的または
補助的治療用薬剤と同時に、または逐次投与する。協働的投与はいずれの順序で行っても
よく、１種類のみまたは両方（あるいは全部）の活性治療用薬剤が個々に、または総合的
にその生物学的活性を奏している間に時限があってもよい。かかるすべての協働的処置法
の特徴的な態様は、組成物中に存在する該一本鎖ＲＮＡｉ分子（１種類または複数種）に
よってある程度の好都合な臨床応答が誘起されるものであり、該臨床応答は、二次的治療
用薬剤によってもたらされる二次的臨床応答と併せたものであってもそうでなくてもよい
。例えば、一本鎖ＲＮＡｉ分子と本明細書において想定される二次的治療用薬剤との協働
的投与は、単独での精製された一本鎖ＲＮＡｉ分子および二次的治療用薬剤のいずれかま
たは両方によって誘起される治療応答を超える向上した（例えば、相乗的な）治療応答が
もたらされ得るものである。
医薬有効用量は、疾患状態を予防する、その発症を抑止する、または疾患状態を処置す
る（症状をある程度、好ましくはあらゆる症状を緩和する）ために必要とされる用量であ
る。医薬有効用量は、疾患の型、使用される組成物、投与経路、処置対象の被検体の類型
、処置の考慮対象の具体的な被検体の身体的特徴（例えば、年齢、体重、一般健康状態、
性別、食事）、並行薬物治療、排出速度、薬物併用、治療を行う具体的な疾患の重症度、
および医療技術分野の当業者に認識される他の要素に依存する。例えば、約０．１ｍｇ／
ｋｇ〜約１４０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量の活性成分が、本開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子の効
力に応じて投与され得る（患者１人について１日あたり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。単回投
薬形態を作製するために担体物質と合わされ得る活性成分の量は、処置される宿主および
具体的な投与様式に応じて異なる。単位投薬形態には、一般的に約１ｍｇ〜約５００ｍｇ
の活性成分が含有される。
核酸分子は細胞または生物体に、当業者に知られたさまざまな方法、例えば、一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子を含む製剤、またはさらに１種類以上のさらなる成分（例えば、薬学的に許容
され得る担体、希釈剤、賦形剤、佐剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、保存料など）を含む製
剤の投与によって投与され得る。一部の特定の実施形態において、本発明の一本鎖ＲＮＡ
ｉ分子および／またはポリペプチドは、リポソーム内に封入してもよく、イオン導入によ
って投与してもよく、他の媒体（ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセ
ル、生体接着性ミクロスフィア、またはタンパク質性ベクターなど）に組み込んでもよい
。（例えば、ＰＣＴ国際公開第００／５３７２２号パンフレットを参照のこと）。あるい
はまた、核酸／ペプチド／ビヒクルの組合せを、直接注射または注入ポンプの使用によっ
て局所送達してもよい。本開示の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内または皮内のいず
れであれ、標準的な針と注射器の方法論を用いて、または無針技術（Ｃｏｎｒｏｙら，（
１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：２３３０）およびＰＣＴ国際公開第９
９／３１２６２号パンフレットに記載のものなど）によって行なわれ得る。
標的遺伝子の発現と関連している障害が処置または予防されるのに充分な量の一本鎖Ｒ
ＮＡｉ分子を有する本発明の開示の製剤は、例えば、経表面（例えば、クリーム剤、軟膏
、皮膚貼付剤、点眼薬、点耳薬）適用または投与に適したものである。他の投与経路とし
ては、経口、非経口、舌下、膀胱洗浄、経膣、経直腸、腸内、座薬、経鼻、および吸入が
挙げられる。用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内
、腹内、腹腔内、関節内、眼内または球後、耳内、髄腔内、腔内、腔内、髄腔内、肺内ま
たは経肺、滑液嚢内、および尿管内注射または注入手法を包含する。また、本発明の開示
の組成物は、経口投与のための錠剤、カプセル剤またはエリキシル剤として、経直腸投与
のための座剤として、注射による投与のための滅菌された液剤または懸濁剤として、当該
技術分野で知られた他の化合物を用いて、またはなしのいずれかで製剤化され、使用され
得る。また、非ヒト動物への投与では、該組成物を動物用の飼料または飲料水に添加して
もよい。動物が治療に適切な量の該組成物を食餌とともに摂取するように動物用の飼料組
成物および飲料水組成物を製剤化することは簡便であり得る。また、該組成物を飼料また
は飲料水に添加するためのプレミックスとして提示することも簡便であり得る。
本発明の一本鎖ＲＮＡｉ分子などの核酸分子の送達のためのさらなる方法は、例えば、
Ｂｏａｄｏら，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ ８７：１３０８；Ｔｙｌｅｒら，１
９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２１：２ｍ；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，１９９５，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：５５９２；Ｂｏａｄｏ，１９９５，
Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１５：７３；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒ
ａｄａら １９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４９１０；Ｔｙｌｅ
ｒら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：７０５３；
Ａｋｈｔａｒら，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２：１３９；「Ｄｅｌｉ
ｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｕｉｄｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ａｋｈｔａｒ編，１９９５，Ｍａｕｒｅｒら，１９９
９ Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９；Ｌｅｅら，２０００，ＡＣＳ Ｓｙ
ｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４に記載されている。インビボ適用および治療適用に加え、
当業者には、本発明の開示の一本鎖ＲＮＡｉ分子が多種多様なインビトロ適用用途、例え
ば、科学的および商業的研究（例えば、生理学的経路の解明、創薬および薬物の開発）、
ならびに医学的および獣医学的診断に有用であることが認識されよう。
本明細書において言及している米国特許、米国特許公開公報、米国特許出願、外国特許
、外国特許出願、非特許刊行物、図面およびウェブサイトはすべて、明示的に引用により
その全体が本明細書に組み込まれる。
表１に、一部の特定の内在性ヒトｍｉＲＮＡ配列を示す。表中、シード配列（確認済ま
たは推定）を大文字で示している。表１のｍｉＲＮＡ配列はすべて、５’から３’の向き
に示している。本発明の他のｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲＢａｓｅデータベース（その内容
は引用により本明細書に組み込まれる）において知得され得る。
Figure 2020074788
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一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体によるＶＡＭＰ３発現の阻害
ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ−ＨＣＴ−１１６細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリ
ン−ストレプトマイシンを補給したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｄｉａｔ
ｅｃｈ Ｉｎｃ．）中で培養した。この細胞を９６ウェル培養プレート内で、６０００細
胞／ウェルの密度で２４時間平板培養した後、トランスフェクションした。
トランスフェクションはＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄ
ｉａ（Ｇｉｂｃｏ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）を用いて行ない、図１と２のデータでの最終ｍｉＲＮＡ濃度は１０ｎＭであり、図
３のデータの１２点滴定曲線では３０ｎＭから０．０１ｎＭまでの範囲とした。
トランスフェクションの２４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＴａｑＭ
ａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）Ｋ
ｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ）を用いて処理してＲＮＡ
を抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＶＡＭＰ３特異的プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅ
ｃｔｏｒでＲＴ−ｑＰＣＲを行った。
逆転写条件は以下のとおり：３７℃で６０分間、続いて９５℃で５分間とした。ＲＴ−
ｑＰＣＲ条件は以下のとおり：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で１
５秒間および６０℃で１分間を４０サイクルとした。ＧＵＳＢ ｍＲＮＡレベルをデータ
の標準化に使用した。ＶＡＭＰ３のノックダウンは、非標的化対照処理細胞で測定された
ＶＡＭＰ３ ｃＤＮＡと比べ、実験処理した細胞で測定されたＶＡＭＰ３ ｃＤＮＡの２
倍変化として計算した。
レポーターアッセイ−ＨＣＴ−１１６細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１％ペニシリン−
ストレプトマイシンを補給したＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｄｉａｔｅｃ
ｈ Ｉｎｃ．）中で培養した。この細胞を９６ウェル培養プレート内で、２５，０００細
胞／ウェルの密度で２４時間平板培養した後、トランスフェクションした。
トランスフェクションはＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄ
ｉａ（Ｇｉｂｃｏ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
を用いて行い、図４と５のデータでの最終ｍｉＲＮＡ濃度は１０ｎＭであり、図６のデー
タの６点滴定曲線では３０ｎＭから０．０１ｎＭまでの範囲とした。ｍｉＲＮＡを、ｍｉ
Ｒ−１２４に対するシードマッチ（２ｘ；図６Ａ）またはｍｉＲ−１２４に対する完全長
マッチ（２ｘＦＬ；図６Ｂ）のタンデムリピートからなるクローニングした標的挿入物を
含むｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）とコトランスフェクトした。
トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクション培地を新鮮増殖培地と交換
した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解させ、ホタルルシフェラーゼ活性
とウミシイタケルシフェラーゼ活性の両方を、Ｄｕａｉ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｃｉｆｅｒａ
ｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＷａｌｌａｃ ＥｎＶｉｓ
ｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で
測定した。ホタルルシフェラーゼ活性を用いてウミシイタケ−ルシフェラーゼ活性を標準
化し、最終データを、非標的化対照処理細胞と比べて、実験処理した細胞でのウミシイタ
ケ−ルシフェラーゼシグナルの２倍変化として計算した。
オリゴヌクレオチドの合成−オリゴヌクレオチドを、当該技術分野でよく知られたプロ
トコル（固相合成）を用いて市販のホスホルアミダイトを使用して合成し、次いで、逆相
固相抽出（ＳＰＥ）によって精製した。Ｃ３（Ｃ３３Ｈ４３Ｎ２Ｏ５Ｐ）およびＣ６（Ｃ
３６Ｈ４９Ｎ２Ｏ５Ｐ）ホスホルアミダイトをＣｈｅｍＧｅｎｅｓから購入した。
簡単には、１種類のオリゴヌクレオチド鎖を、ホスホルアミダイト化学反応を用いて自
動固相合成装置で、当該技術分野で一般的に知られた手順を用いて合成した（例えば、米
国特許出願第１２／０６４，０１４号（ＵＳ２００９０１７６７２５として公開）を参照
のこと）。合成カラムには、第１ヌクレオシド残基（天然または化学修飾体）で誘導体化
した固相支持体を充填した。合成は、酸不安定性５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を脱ト
リチル化して５’−ヒドロキシルを放出させることによって開始した。適切に保護された
ホスホルアミダイトと適当な活性化剤（アセトニトリル中）を合成カラムに同時に送達す
ると、５’−ヒドロキシルに対するアミダイトのカップリングがもたらされた。次いで、
カラムを溶媒（アセトニトリルなど）で洗浄した。酸化性溶液（ヨウ素溶液など）をカラ
ム中にポンプ輸送して亜リン酸トリエステル結合Ｐ（ＩＩＩ）を酸化させて、ホスホトリ
エステルＰ（Ｖ）類似体にした。未反応の５−ヒドロキシル基を、２，６−ルチジンとＮ
−メチルイミダゾールの存在下で無水酢酸などの試薬を用いてキャッピングした。伸長サ
イクルは、次のホスホルアミダイトが組み込まれる脱トリチル化工程により再開された。
このプロセスを、所望の配列が合成されるまで繰り返した。合成は、最後の５’末端保護
基（トリチルまたは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル）により終結させた。
合成が完了したら、固相支持体と結合オリゴヌクレオチドをアルゴン圧下または真空下
で乾燥させた。水性塩基を添加し、混合物を加熱してスクシニル結合の切断、シアノエチ
ルホスフェート保護基の除去、および環外アミン保護の脱保護をもたらした。
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含まない一本鎖に対して行った。固相支持体を
水性塩基で処理した後、混合物を濾過し、固相支持体を粗製の脱保護合成物質から分離し
た。次いで、固相支持体をＤＭＳＯですすぎ洗浄した（これを濾液と合わせる）。得られ
た塩基性溶液により、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基が５’末端位置に残存した状態（
トリチル−オン）を保持することが可能である。
リボヌクレオチドを含む一本鎖には、以下のプロセスを行った。固相支持体を水性塩基
で処理した後、混合物を濾過し、固相支持体を粗製の脱保護合成物質から分離した。次い
で、固相支持体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ですすぎ洗浄し、これを濾液と合わ
せた。フッ化物試薬（トリエチルアミントリヒドロフルオリドなど）を混合物に添加し、
この溶液を加熱した。反応液を適当なバッファーでクエンチし、最後の５’末端位置に５
−Ｏ−ジメトキシトリチル基を有する粗製の一本鎖の溶液を得た。
各粗製の一本鎖のトリチル−オン溶液を、クロマトグラフィー精製（ＳＰＥ ＲＰＣ精
製など）を用いて精製した。トリチル基の疎水性の性質により、所望の完全長オリゴ体が
非トリチル化切断型の不合格配列よりも強く保持されることが可能である。不合格配列は
、低率アセトニトリルなどの適当な溶媒で、樹脂から選択的に洗い流した。次いで、保持
されたオリゴヌクレオチドを、カラム上でトリフルオロ酢酸を用いて脱トリチルし、酸不
安定性のトリチル基を除去した。残留した酸をカラムから洗い流し、塩交換を行い、該物
質の最終脱塩を開始した。水性有機溶媒を用いて、完全長オリゴ体を精製形態で回収した
。次いで、最終生成物を、純度（ＨＰＬＣ）、実体（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ ＭＳ）および
収率（ＵＶ Ａ２６０）について解析した。オリゴ体を凍結乾燥または真空濃縮によって
乾燥させた。
結果−一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体が既知の標的ＶＡＭＰ３の発現を阻害する能力を試
験した。ここで、ｍｉＲ−１２４類似体は、１個のヌクレオチドの代わりに置き換えられ
たＣ３スペーサー、または２つのヌクレオチドの代わりに置き換えられたＣ６スペーサー
のいずれかを、鎖に沿った種々の位置に含むものである。
この試験で使用したｍｉＲ−１２４のパッセンジャー鎖配列は５’−ＧＣＡＵＵＣＡＣ
ＣＧＣＧＵＧＣＣＵＵＡＡＡＵ−３’（配列番号：１０９１）であり、ガイド鎖配列は５
’−ＵＵＡＡＧＧＣＡＣＧＣＧＧＵＧＡＡＵＧＣＣＡ−３’（配列番号：１０９２）であ
る。試験したｍｉＲ−１２４類似体ならびに対照分子を表２において以下に示す。
Figure 2020074788
Figure 2020074788

表２の一本鎖分子はすべて、５’リン酸基キャップを含む。
「Ｇ／Ｐ」は二本鎖ｍｉＲ−１２４を表し、ここで、該二本鎖は、２つのヌクレオチド
突出端をパッセンジャー鎖とガイド鎖の３’末端に有する。Ｇ／Ｐ二本鎖のガイド鎖は２
２ヌクレオチド長である。
配列番号：１０９３〜１１２４は、一本鎖ｍｉＲ−１２４のガイド鎖の類似体を表す。
これらの分子は各々、Ｇ／Ｐ二本鎖に存在しているｍｉＲ−１２４のガイド鎖の２１ヌク
レオチド型であり、２２ヌクレオチドＧ／Ｐ ｍｉＲ−１２４のガイド鎖には存在してい
る５’−ウラシルヌクレオチドがない。これらの２１量体類似体のヌクレオチドは、３’
アデノシンと隣接シトシン（存在する場合）以外はすべて、リボース部分が２’−フルオ
ロで化学修飾されている（表２にイタリック体のヌクレオチドで示す）。３’アデノシン
と隣接シトシン（存在する場合）は、リボース部分が２’−Ｏ−メチルで化学修飾されて
いる（表２に下線付ヌクレオチドで示す）。最後に、ｍｉＲ−１２４のガイド鎖の２１量
体類似体は、１個のヌクレオチドの代わりに置き換えられたＣ３スペーサー（「ｃ３スペ
ーサー」類似体）または２個のヌクレオチドの代わりに置き換えられたＣ６スペーサー（
「ｃ６スペーサーｄｅｌ２」類似体）をいずれかを鎖に沿った種々の表示位置に含む。例
えば、「２１−８ｐ−ｃ３スペーサー−２０」は、２１ヌクレオチドｍｉＲ−１２４のガ
イド鎖の２０位のヌクレオチドの代わりに、１９位と２１位のヌクレオチドを連結してい
るエチレングリコールスペーサーを含む２１量体ｍｉＲ−１２４のガイド鎖類似体を表す
。別の例として、「２１−８ｐ−ｃ６スペーサーｄｅｌ２−１９」と表示された類似体は
、２１ヌクレオチドｍｉＲ−１２４のガイド鎖の１９位と２０位のヌクレオチドの代わり
に、１８位と２１位のヌクレオチドを連結しているヘキサンスペーサーを含む２１量体ｍ
ｉＲ−１２４のガイド鎖類似体を表す。一部の２１ヌクレオチドｍｉＲ−１２４のガイド
鎖類似体は、表２に示されたように、添付の図面と異なる名称を有する。例えば、配列番
号：１１１６で表される２１量体ｍｉＲ−１２４のガイド鎖類似体は、図１と３では「２
１−８ｐ−ｃ６スペーサーｄｅｌ２−１５」と呼称し、図２では「ｃ６ｄｅｌ２ｐｏｓ１
５スペーサー」と呼称している。
「ＵＣ３」は、非標的化化学修飾二本鎖を表す。
「１２４（２１）−８ｐ−１６ｒｒｒ」は、ｍｉＲ−１２４のガイド鎖の２１ヌクレオ
チド型の類似体を表す。この分子には内部スペーサーが含まれていない。ヌクレオチドは
、ヌクレオチド１６〜１８（これらはＲＮＡである）およびヌクレオチド２１と２２（こ
れらは２’−Ｏ−メチルで修飾されている）以外はすべて、２’−フルオロで修飾されて
いる。
「１２４（２１）−８ｐ」は、ヌクレオチド１〜２０が２’−フルオロで修飾されてお
り、ヌクレオチド２０と２１が２’−Ｏ−メチルで修飾されているｍｉＲ−１２４ガイド
の２１ヌクレオチド型を表す。「１２４（２１）−８ｐ」は図１のこの類似体の名称であ
り；「Ｇ−全フルオロ」は図２のこの類似体の名称であり；「ｐＧ−フルオロ」は図４の
この類似体の名称である。
「ｍｉＲ−１２４」は、Ｇ／Ｐ二本鎖の一本鎖ガイド鎖である。これは、２２ヌクレオ
チド長であり、非修飾型である。
「Ｃ６ｄｅｌｐｏｓ１５スペーサー／Ｐ」は、ガイド鎖が「２１−８ｐ−ｃ６スペーサ
ーｄｅｌ２−１５」（配列番号：１１１６）の構造を有し、パッセンジャー鎖が２２ヌク
レオチドｍｉＲ−１２４パッセンジャー鎖（配列番号：１０９１）である二本鎖ｍｉＲ−
１２４の二本鎖を表す。
図１と２は、上記のＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用し、表２に示した一本鎖ｍｉＲ−１
２４類似体によるＶＡＭＰ３標的の発現の阻害度合いを示す。図１は、Ｃ３スペーサーを
含む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体による阻害度合いを示す。図２は、Ｃ６スペーサーを含
む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体による阻害度合いを示す。各図においてバーが長いほどＶ
ＡＭＰ３のノックダウンが大きいことを示す。二連のバーは生物学的同型体を示し、各々
は、表示した核酸分子でトランスフェクトした別々のウェルの細胞（２つの別々のプレー
トのもの）のデータを示す。スペーサーは、ｍｉＲ−１２４類似体の１９位、および１５
位の近傍で最も耐容性が良好なようである。
図３のグラフは、図１と２の試験類似体のサブセットでのＶＡＭＰ３発現の用量依存性
応答を示す（配列については表２参照）。ＶＡＭＰ３発現をｙ軸上に示しており、したが
って、この軸上で低い値のデータ点の方がＶＡＭＰ３発現のノックダウンが大きいことを
示す。試験したｍｉＲ−１２４類似体の用量をｘ軸上に、左側に最小用量から右側に最大
に用量までの範囲で示す。二本鎖型（Ｇ／Ｐおよびｃ６ｄｅｌ２ｐｏｓ１５スペーサー／
Ｐ）は、一本鎖類似体よりも強力であるが、一本鎖「Ｇ−全フルオロ」類似体（内部スペ
ーサーなしで、ヌクレオチド１〜２０は２’−フルオロであり、ヌクレオチド２０と２１
は２’−Ｏ−メチルである）が、１５位（ｃ３ｐｏｓ１５スペーサー）または１９位（ｃ
３ｐｏｓ１９スペーサー）と交換されたＣ３スペーサーを有する同等の一本鎖類似体とほ
ぼ同一の挙動を示していることは注目に値する。
図４と５は、ｍｉＲ−１２４のシード領域とマッチしている２つの標的部位を有するコ
トランスフェクトしたルシフェラーゼレポーターのノックダウンを測定した、図１と２の
同じ試験一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体のスクリーニングのデータを示す。したがって、こ
のアッセイのデータは、試験類似体のｍｉＲＮＡ活性を表す。図４は、Ｃ３スペーサーを
含む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体による阻害度合いを示す。図５は、Ｃ６スペーサーを含
む一本鎖ｍｉＲ−１２４類似体による阻害度合いを示す。二連のバーは生物学的同型体を
示し、各々は、表示した核酸分子でトランスフェクトした別々のウェルの細胞（２つの別
々のプレートのもの）のデータを示す。この場合も、長いバーの方であるほど阻害が大き
いことを示し、１９位または１５位の近傍にスペーサーを含む類似体は最も大きなノック
ダウン活性を有することを示す。
図６のグラフは、図３の試験類似体のサブセットでの２種類の異なるルシフェラーゼレ
ポーターの標的発現阻害の用量依存性応答を示す。図６Ａにおいて、表示した阻害活性は
、ｍｉＲ−１２４シード領域に対して２つのマッチを有するルシフェラーゼレポーターに
対するものである。したがって、これは、試験類似体のｍｉＲＮＡ活性を表す。図６Ｂに
おいて、表示した阻害活性は、ｍｉＲ−１２４に対して２つの完全長マッチを有するルシ
フェラーゼレポーターに対するものであり、したがって試験類似体のｓｉＲＮＡ活性を表
す。ＡおよびＢの両方において、Ｇ／Ｐ曲線は、完全にＲＮＡで構成されたｍｉＲ−１２
４二本鎖による活性を表す。ｐＧ−フルオロ／Ｐｓｈｏｒｔ曲線は、大部分が２’−フル
オロヌクレオチドで修飾されており、全−ＲＮＡパッセンジャー鎖と二本鎖を形成するガ
イド鎖による活性を表す。ｐＧ−フルオロ曲線は、大部分が２’−フルオロヌクレオチド
で修飾されている一本鎖ｍｉＲ−１２４のガイド鎖類似体の活性を表す。ｃ３ｐｏｓ１４
曲線およびｃ３ｐｏｓ１９曲線は、１４位（「ｃ３ｐｏｓ１４」）または１９位（「ｃ３
ｐｏｓ１９」）の代わりに置き換えられた３−炭素スペーサー（Ｃ３スペーサー）を含む
ことだけがｐＧ−フルオロと異なるｐＧ−フルオロ類似体の活性を表す。すべての一本鎖
類似体は、シードマッチのみを有するレポーターに対するいずれかの二本鎖よりも低い効
力を示すが、これらは、全濃度範囲において互いに有効に同等であり、最大濃度では該二
本鎖と同様の活性を示す（図６Ａ）。完全長マッチを有するレポーターに対しては、やは
り全−ＲＮＡ二本鎖（「Ｇ／Ｐ」）が最強の奏功体であったが、スペーサー含有一本鎖類
似体は、２’−フルオロガイド鎖を有する二本鎖（「ｐＧ−フルオロ／Ｐｓｈｏｒｔ」）
および一本鎖（「ｐＧ−フルオロ」）と同程度に強いか、またはこれらより強い活性を有
していた。
ＡｐｏＢ ｍＲＮＡの一本鎖ＲＮＡｉノックダウン
ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ（一次スクリーニングおよび用量応答曲線）−Ｈｅｐａｌ−６
細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１％重炭酸ナ
トリウムを補給したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。この細胞を９６ウェル培
養プレート内で、３０００細胞／ウェルの密度で２４時間平板培養した後、トランスフェ
クションした。
トランスフェクションは、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅ
ｄｉａおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸを製造業者の指示どおりに用
いて行った。一本鎖ｓｉＲＮＡ終濃度は１００ｎＭおよび１０ｎＭとした。
トランスフェクションの２４時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＴａｑＭ
ａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標）Ｋｉｔを製造
業者の使用説明書どおりに用いて処理してＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＡＢＩ
Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤｅｔｅｃｔｏｒにセットされたＡｐｏ
Ｂ特異的Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブを用いてＲＴ−ｑＰＣＲを行った。
逆転写条件は以下のとおり：３７℃で６０分間、続いて９５℃５分間とした。ＲＴ−ｑ
ＰＣＲ条件は以下のとおり：５０℃で２分間、９５℃で１０分間：続いて、９５℃で１５
秒間および６０℃で１分間を４０サイクルとした。ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡレベルをデータ
の標準化に使用した。
ＡｐｏＢのノックダウンは、非標的化対照処理細胞で測定されたＡｐｏＢ ｃＤＮＡと
比べ、実験処理した細胞で測定されたＡｐｏＢ ｃＤＮＡの２倍変化として計算した。
結果−ＡｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンは、Ｃ３スペーサーが１５、１６、１７、１
８または１９位（該オリゴ体の５’を基準）のいずれかに組み込まれた一本鎖（ガイド鎖
）オリゴヌクレオチドを、２つの異なる濃度（１００ｎＭおよび１０ｎＭ）を用いて測定
した。結果を図７に示す。試験した一本鎖分子はすべて、ピリミジンヌクレオチドとプリ
ンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび５’リン酸
基で構成されたものである。各分子の２つの３’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌ
クレオチドである。一本鎖分子「４８５」（図７参照；５’−ＵＵＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣ
ＵＵＡＣＵＧＧＵＵ−３’（配列番号：１１３５））は、Ｃ３スペーサーを含んでおらず
、ＡｐｏＢ ｍＲＮＡをヌクレオチド４８５位において標的化する２１ヌクレオチド分子
である。Ｃ３スペーサーは、分子４８５内の１５位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１５」；配
列番号：１１３６）、１６位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１６」；配列番号：１１３７）、
１７位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１７」；配列番号：１１３８）、１８位（「４８５ ｃ
３＠ｐｏｓ１８」；配列番号：１１３９）または１９位（「４８５ ｃ３＠ｐｏｓ１９」
；配列番号：１１４０）に組み込まれている（すなわち、４８５分子の表示したヌクレオ
チドが、該スペーサーに置き換えられている）。例えば、シグナル鎖分子「４８５ ｃ３
＠ｐｏｓ１５」は、５’−ＵＵＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＵＵ（Ｃ３スペーサー）ＣＵＧＧＵ
Ｕ−３’；配列番号：１１３６）で表される。図７に示されるように、Ｃ３スペーサーを
１８位または１９位に含めると、２つの異なる濃度（１００ｎＭおよび１０ｎＭ）におい
て、耐容性が両方とも良好であるとともにｍＲＮＡノックダウンも改善される。このデー
タは、非ヌクレオチドＣ３炭素スペーサーを一本鎖ＲＮＡ干渉オリゴヌクレオチドの３’
末端に組み込むと、ｍＲＮＡノックダウンの効力が改善されることを示す（図７）。
一本鎖へのＣ３スペーサーの組込みがより広範に適用可能であるかどうかを評価するた
め、各々、１８位（図８）または１９位（図９）のいずれかにＣ３スペーサーを有する３
０種類の異なるＡｐｏＢ標的化一本鎖配列を、２つの濃度（１００ｎＭおよび１０ｎＭ）
で評価した。図８と９において、一本鎖分子を、標的化対象のＡｐｏＢ ｍＲＮＡ内の位
置によって表記している。試験した一本鎖分子はすべて、ピリミジンヌクレオチドとプリ
ンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドおよび５’リン酸
基で構成されたものである。各分子の２つの３’末端ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルヌ
クレオチドである。評価した図８と９の一本鎖ＲＮＡｉ分子の配列識別名（配列番号：）
を表３に示す。
Figure 2020074788
Figure 2020074788

図８と９において、データを、Ｃ３スペーサーなしの対応一本鎖分子に対して標準化し
た。一本鎖対照（Ｃ３スペーサーなし）と同等であるノックダウン量が中心０とすると、
正の値は、Ｃ３スペーサーの組込みによりｍＲＮＡノックダウンの改善が付与されること
を示す。負の値は、Ｃ３スペーサーを含めることは有害な効果であることを示す。インビ
トロアッセイに伴う実験のばらつきにより、＋０．５より大きい値または−０．５未満の
値のみを有意とみなしていることに注意のこと。例えば、Ｃ３スペーサーをＡｐｏＢ分子
４８５の１８位に含めることは、図８に示されたノックダウンの差が０．５未満であるた
め、一本鎖対照と比べて有意な改善は得られない。しかしながら、Ｃ３スペーサーを同じ
一本鎖ガイド分子の１９位に含めると、ノックダウンの有意な改善が得られる（図９参照
）。総合的に、Ｃ３スペーサーを１９位に含めることは、この位置への組込みにより、試
験した３０種類の異なる配列の大部分（７３％）でｍＲＮＡノックダウンの効力が改善さ
れるようであるため好ましい。
図１０において、図８と９で試験した３０種類の異なる各ＡｐｏＢ標的部位を標的化す
る一本鎖分子を用いた１００ｎＭ濃度でのＡｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンを、Ｃ３スペ
ーサーなしの一本鎖（「全−ｆｌｕ−ｐ」）、１８位にＣ３スペーサーを有する一本鎖（
「全−ｆｌｕ−ｃ３−１８−ｐ」）、および１９位にＣ３スペーサーを有する一本鎖（「
全−ｆｌｕ−ｃ３−１９−ｐ」）を用いて比較した。試験した一本鎖分子はすべて、ピリ
ミジンヌクレオチドとプリンヌクレオチドの両方が２’−デオキシ−２’−フルオロヌク
レオチドおよび５’リン酸基で構成されたものである。各分子の２つの３’末端ヌクレオ
チドは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。評価した図１０の一本鎖ＲＮＡｉ分子の配
列識別名（配列番号：）を表３に示す。図１０は、異なる一本鎖配列のｍＲＮＡノックダ
ウンの全体的な有効性の範囲を示す。例えば、ＡｐｏＢ標的部位４８５を標的化する一本
鎖分子は最大に有効であるが、他のもの（ＡｐｏＢ標的部位７８０または１０２１９を標
的化するものなど）のｍＲＮＡノックダウンは限定的である。３０種類の異なる各配列に
ついて、図１０に示したｍＲＮＡノックダウンを、Ｃ３スペーサーを含んでいない対応鎖
（「全−ｆｌｕ−ｐ」）に対して標準化した。

Claims (22)

  1. 標的ＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介する一本鎖ＲＮＡ分子であって、前記一本鎖ＲＮ
    Ａが：
    （ａ）自己相補的でない第１のヌクレオチド部分（Ｎ１）と第２のヌクレオチド部分（
    Ｎ２）を含む核酸部分（ここで、当該核酸部分は、標的ＲＮＡの標的部位と塩基対形成し
    得る少なくとも８個のヌクレオチドを含むものであり、該核酸部分内のヌクレオチドの総
    数は８〜２６ヌクレオチドである）；および、
    （ｉ）内部スペーサー部分（ここで、当該スペーサー部分は、第１のヌクレオチド部分
    と第２のヌクレオチド部分を共有結合によって連結する少なくとも第１の非ヌクレオチド
    スペーサー部分（Ｓ１）を含むものである）、
    を含む一本鎖ＲＮＡ分子。
  2. 下記の構造：
    ５’ Ｎ１−Ｓ１−Ｎ２ ３’
    を含むものであり、
    式中：
    （ａ）Ｎ１は、１個のヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド鎖のいずれかを含むもので
    あり；
    （ｂ）Ｓ１は、Ｎ１とＮ２を共有結合によって連結する１つ以上の非ヌクレオチドスペ
    ーサーを含むものであり；
    （ｃ）Ｎ２は、１個のヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド鎖のいずれかを含むもので
    ある、
    請求項１に記載の分子。
  3. Ｓ１が脂肪族または芳香族の有機基である、請求項１または２に記載の分子。
  4. Ｓ１が、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ１２アルキル鎖である、請求項１〜３のいずれ
    か一項に記載の分子。
  5. 前記アルキル鎖がコレステロールで置換されていてもよい、請求項４に記載の分子。
  6. Ｓ１が、Ｃ３アルキル、Ｃ６アルキルおよびポリエチレングリコールからなる群より選
    択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
  7. Ｎ１が１３〜２０ヌクレオチド長である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分子。
  8. 前記核酸部分内のヌクレオチドの総数が約１９〜約２１ヌクレオチドである、請求項１
    〜７のいずれか一項に記載の分子。
  9. 前記標的部位が前記標的ＲＮＡの非翻訳領域内に存在している、請求項１〜８のいずれ
    か一項に記載の分子。
  10. 前記標的部位と塩基対形成し得る少なくとも８個のヌクレオチドが、天然に存在する内
    在性ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列のシード配列の全体または一部である、請求項９に記載
    の分子。
  11. Ｓ１が、前記天然に存在する内在性ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の１〜４個の内部ヌク
    レオチドと置き換えられたものである、請求項１０に記載の分子。
  12. 前記分子の核酸部分が、前記天然に存在する内在性ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列と少な
    くとも５０％相同である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の分子。
  13. 前記標的部位が前記標的ＲＮＡの遺伝子コード領域に存在している、請求項１〜８のい
    ずれか一項に記載の分子。
  14. 前記分子の核酸部分が前記標的部位に少なくとも９０％相補的である、請求項１〜１３
    のいずれか一項に記載の分子。
  15. 前記核酸部分が、前記標的部位と塩基対形成し得る少なくとも２０個のヌクレオチドを
    含むものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分子。
  16. 前記核酸部分が、さらに第３のヌクレオチド部分（Ｎ３）を含むものであり、前記内部
    スペーサー部分が、さらに第２の非ヌクレオチドスペーサー部分（Ｓ２）を含むものであ
    る、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分子。
  17. 少なくとも１個のヌクレオチドが修飾糖鎖を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に
    記載の分子。
  18. 少なくとも１個のヌクレオチドが修飾ヌクレオシド間結合を有する、請求項１〜１７の
    いずれか一項に記載の分子。
  19. ５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に末端キャップを有する、請求
    項１〜１８のいずれか一項に記載の分子。
  20. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の一本鎖ＲＮＡ分子および薬学的に許容され得る
    担体を含む組成物。
  21. リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、生体接着性ミ
    クロスフィアまたはタンパク質性ベクターをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 請求項２０または請求項２１に記載の組成物を投与することを含む、細胞内の内在性Ｒ
    ＮＡ標的遺伝子の発現を低減させる方法。
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