JP5059411B2 - 短鎖干渉ｒｎａの細胞トランスフェクティング処方物、関連する組成物および作製方法ならびに使用 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および脂質結合体化ポリアミド化合物を含む組成物、それらの作製方法、ならびに細胞へのｓｉＲＮＡの送達におけるそれらの使用方法に関する。本発明はまた、細胞へのポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡを含む）の送達における使用に適した新規クラスの脂質結合体化ポリアミド化合物に関する。

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願番号６０／５３０，９５３号（２００３年１２月１９日出願）（その全体が本明細書中に援用される）の利益を主張する。

（発明の背景）
ＲＮＡ干渉とは、細胞中の二本鎖ＲＮＡの存在が、他の無関係な遺伝子の発現には影響を及ぼさないが、同じ配列を有する遺伝子の発現を排除する現象をいう。「転写後遺伝子サイレンシング」または「ＲＮＡサイレンシング」としても公知であるこの現象は、植物においてここしばらくの間注目されてきているが、動物においてはごく最近になってようやく認識されてきている。Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６（１９９８）（非特許文献１）。この機能性の発見は、この機構によって特定のタンパク質の産生を停止させ、遺伝子特異的治療を行うための強力な研究手段の可能性を示唆している。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）機構の詳細は、最近解明された。細胞における長鎖ｄｓＲＮＡの存在は、ダイサーとして公知のリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として公知のｄｓＲＮＡの小片にプロセシングする工程に関与する（Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３（２００１）（非特許文献２））。ダイサーの活性によって得られる短鎖干渉ＲＮＡは、代表的には約２１〜２３ヌクレオチド長である。ＲＮＡｉ応答はまた、ＲＮＡ誘導性のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と通常呼ばれる、ｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特色とする。ＲＩＳＣ複合体は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８（２００１）（非特許文献３）。

哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉ現象の利用にとっての１つの潜在的な障害は、これらの細胞における長鎖ｄｓＲＮＡの存在が、リボヌクレアーゼによるｍＲＮＡの非特異的切断をもたらすインターフェロン応答をも刺激するということである。しかしながら、化学的に合成された２１量体の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）が、いくつかのヒト細胞株においてインターフェロン応答を誘発することなく有効に遺伝子発現を抑制することが示された。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４（２００１）（非特許文献４）。特に、合成のｓｉＲＮＡは、２つのＴＴヌクレオチド３’−オーバーハングを含む２１個のヌクレオチドの二重鎖を含む場合、最も活性であることが見出された。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７（２００１）（非特許文献５）。

ｓｉＲＮＡの特性である高い特異性、リボヌクレアーゼに対する耐性、非免疫原性および効力は、研究用途および治療用途のための細胞トランスフェクション薬剤としての非常に大きな可能性を示唆する。細胞への核酸組成物の送達についての種々のストラテジーが存在する。しかしながら、細胞へｓｉＲＮＡをトランスフェクトする際に、技術的困難に直面してきた。ウイルスベクターは、比較的効率的な送達をもたらすが、ある場合には、被験体の免疫学的混乱または望ましくない増殖の危険性により、安全性の問題を示す。アデノウイルスベクターは、細胞のゲノム中に組み込まれず、休止細胞に形質導入することができるという点で、特定の利点を示してきた。しかしながら、これらのベクターはすべて、時間のかかる組換えＤＮＡ技術によって調製されなければならない。オリゴヌクレオチドはまた、化学トランスフェクション薬剤（これらは、多くの最近の研究の対象であった）によって、細胞に送達され得る。これらの薬剤は、ポリカチオン性分子（例えば、ポリリシン）およびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）および中性リン脂質ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含むリポソーム組成物であるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｌｇｎｅｒら、ＰＮＡＳ ８４：７４１３，１９８７）が、広く用いられる。リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションのような他の方法は、報告された手順に従って、細胞にオリゴヌクレオチドを送達するために用いられ得る。しかしながら、使いやすく、多くの細胞型に適用可能な、有効で無毒のｓｉＲＮＡトランスフェクション薬剤の必要性がある。
Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，（１９９８）３９１，８０６ Ｂｅｒｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，（２００１）４０９，３６３ Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，（２００１）１５，１８８ Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，（２００１）４１１，４９４ Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，（２００１）２０，６８７７

（発明の概要）
上記を達成するために、本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および細胞へのポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡを含む）の送達に特に有用な特定の脂質結合体化ポリアミド化合物ベースの送達ビヒクルを含む組成物を提供する。

１つの局面において、本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および以下の一般式を有する脂質結合体化ポリアミド化合物を含む組成物を提供する：
（Ｉ）Ｒａ−［（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）ｎ］ｍ−Ｒｃ
式中、ｎは１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは約２〜約４８から選択される整数であり、
式中、各単量体単位「−（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）−」についてのＲ_１およびＲ_ａは、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、からなる群より独立して選択され、
式中、Ｒ_１は、少なくとも１つの単量体単位について水素原子ではなく、
式中、Ｒ_ｃは、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；ヒドラジン基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、から選択され、
式中、Ｒ_１、Ｒ_ａまたはＲ_ｃが骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリール基またはアリールアルキル基である場合、該骨格構造は、１つ以上の酸素原子および／または窒素原子をさらに含み、
式中、各単量体単位についてのＷは、１〜約５０個の原子を有し、そして、炭素を含みかつ必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格中に、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の２価部分から独立して選択され、ここで、該任意のＷの置換は、必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分であり得、
ここで、該脂質部分は、以下：
（ｉ）必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に約１４〜約５０個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル部分であって、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールまたはアリールアルキル部分；ならびに
（ｉｉ）必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に約１０〜約５０個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族部分であって、該脂肪族部分は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を含む、脂肪族部分
からなる群より選択される、疎水性または両親媒性部分であり、そして
式中、単一の単量体単位についての少なくとも１つのＲ_ａ、Ｒ_ｃ、Ｗおよび単一の単量体単位についてのＲ_１は、脂質部分を含む。

特定の実施形態において、本発明は、薬学的に許容可能なビヒクル中にｓｉＲＮＡを含む組成物を提供する。この組成物は、目的の遺伝子の発現を阻害するために、インビトロまたはインビボで細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに有用であり得る。ビヒクルは、１つ以上の下記式の脂質カチオン性ペプトイド結合体：

および位置異性体を含み、
式中、
Ｌは、約８炭素原子長と２４炭素原子長との間の少なくとも１つの脂肪族アルキル鎖またはアルケニル鎖を含む非ステロール脂質部分およびステロール部分から選択され；
各基Ｒは、アルキル、アミノアルキルおよびアラルキルから独立して選択され、そして
Ｘは、直接結合、オリゴペプチド、２〜約３０結合長の実質的に直鎖状のアルキル鎖、ならびにアルキル結合と、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ジスルフィド、ペプチドおよびエーテルからなる群より選択される１つ以上の結合とからなる、２〜約３０結合長の実質的に直鎖からなる群より選択される。

Ｌが非ステロール脂質部分（すなわち、ステロール基ではないかまたはステロール基を含まない脂質部分、例えば、リン脂質基（すなわち、ＲＯＯＣＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＲ）ＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）_２Ｏ−））である場合、脂質カチオン性ポリアミド結合体は、本明細書において「リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）」と呼ばれる。Ｌがステロール部分（すなわち、ステロール基であるかまたはステロール基を含む脂質部分、例えば、コレステロール基）である場合、脂質カチオン性ポリアミド結合体は、本明細書において「コレステロイド（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｉｄ）」と呼ばれる。本発明の組成物中の脂質カチオン性ペプトイド結合体は、リピトイド、コレステロイドであり得るか、または、１つの重要な実施形態において、これらの組み合わせであり得る。

特定の実施形態において、Ｒはイソプロピルまたは４−メトキシフェニルである。単一のリピトイドまたはコレステロイドは、この分子内に異なる基Ｒを含み得るか、または基Ｒはこの分子内で同一であり得る。

本発明の組成物は、標的遺伝子のｍＲＮＡをノックアウトするのに有効な、生物学的に活性なｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞への効率的な送達をもたらす。

別の局面において、被験体における標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、上記のような組成物を被験体に投与する工程を包含し、この組成物中のｓｉＲＮＡ二重鎖の１つの鎖は、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列を有する方法が提供される。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖の１つの鎖は、本明細書中に開示される配列番号１で表される配列を含み、標的遺伝子／ｍＲＮＡはＡｋｔ１である。

別の局面において、本発明は、少なくとも１つのリピトイドおよび１つのコレステロイドの混合物で構成されるポリヌクレオチド送達ビヒクルを提供する。組み合わせリピトイド／コレステロイド送達ビヒクルは、このようなポリヌクレオチドおよび組み合わせリピトイド／コレステロイド送達ビヒクルを含む組成物において、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡのような多様なポリヌクレオチドを細胞へ送達するのに適している。

本明細書中に記載の化合物および組成物の製造方法、ならびに本発明の方法で用いる医薬を製造するための方法におけるこの組成物の使用が提供され、かつ本発明の範囲内にあることが企図される。

本発明のこれらの目的および特徴ならびに他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明が添付の図面と共に読まれる場合、より完全に明らかになる。

（本発明の特定の実施形態の説明）
本発明の材料および関連技術および装置は、ここで、いくつかの実施形態に関して記載される。記載される実施形態の重要な特性および特徴は、本文中の構造において示される。本発明は、これらの実施形態と共に記載されるが、本発明はこれらの実施形態に限定されることを意図するものではないことが理解されるべきである。逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内に含まれ得るような、代替、改変および等価物を包含することが意図される。以下の記載において、多数の具体的な詳細が、本発明の完全な理解を提供するために示される。本発明は、いくつかまたは全てのこれらの具体的な詳細を用いることなく実施され得る。他の場合において、周知のプロセス操作は、本発明を不必要に不明瞭にすることのないように、詳細には記載されていない。

（導入）
本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および細胞へのｓｉＲＮＡの送達に特に有用な脂質結合体化ポリアミドベースの送達ビヒクルを含む組成物を提供する。別の局面において、本発明は、少なくとも１つのリピトイドおよび１つのコレステロイドの混合物で構成されるポリヌクレオチド送達ビヒクルを提供する。この送達ビヒクルは、多様なポリヌクレオチド（例えば、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ）の細胞への送達に適している。

１つの局面において、本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および以下の一般式を有する脂質結合体化ポリアミド化合物を含む組成物を提供する：
（Ｉ）Ｒａ−［（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）ｎ］ｍ−Ｒｃ
式中、ｎは１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは約２〜約４８から選択される整数であり、
式中、各単量体単位「−（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）−」についてのＲ_１およびＲ_ａは、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、からなる群より独立して選択され、
式中、Ｒ_１は、少なくとも１つの単量体単位について水素原子ではなく、
式中、Ｒ_ｃは、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；ヒドラジン基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、から選択され、
式中、Ｒ_１、Ｒ_ａまたはＲ_ｃが骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリール基またはアリールアルキル基である場合、該骨格構造は、１つ以上の酸素原子および／または窒素原子をさらに含み、
式中、各単量体単位についてのＷは、１〜約５０個の原子を有し、そして、炭素を含みかつ必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格中に、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の２価部分から独立して選択され、ここで、該任意のＷの置換は、必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分であり得、
ここで、該脂質部分は、以下：
（ｉ）必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に約１４〜約５０個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル部分であって、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールまたはアリールアルキル部分；ならびに
（ｉｉ）必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に約１０〜約５０個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族部分であって、該脂肪族部分は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を含む、脂肪族部分
からなる群より選択される、疎水性または両親媒性部分であり、そして
式中、単一の単量体単位についての少なくとも１つのＲ_ａ、Ｒ_ｃ、Ｗおよび単一の単量体単位についてのＲ_１は、脂質部分を含む。

特定の実施形態において、本発明は、薬学的に許容可能なビヒクル中にｓｉＲＮＡを含む組成物を提供する。この組成物は、目的の遺伝子の発現を阻害するために、インビトロまたはインビボで細胞にｓｉＲＮＡを送達するのに有用であり得る。ビヒクルは、以下の式の１つ以上の脂質カチオン性ペプトイド結合体：

および位置異性体を含み、
式中、
Ｌは、約８炭素原子長と２４炭素原子長との間の少なくとも１つの脂肪族アルキル鎖またはアルケニル鎖を含む非ステロール脂質部分およびステロール部分から選択され；
各基Ｒは、アルキル、アミノアルキルおよびアラルキルから独立して選択され、そして
Ｘは、直接結合、オリゴペプチド、２〜約３０結合長の実質的に直鎖状のアルキル鎖、ならびにアルキル結合と、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ジスルフィド、ペプチドおよびエーテルからなる群より選択される１つ以上の結合とからなる、２〜約３０結合長の実質的に直鎖からなる群より選択される。

Ｌが非ステロール脂質部分（すなわち、ステロール基ではないかまたはステロール基を含まない脂質部分、例えば、リン脂質基（すなわち、ＲＯＯＣＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＲ）ＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）_２Ｏ−））である場合、脂質カチオン性ポリアミド結合体は、本明細書において「リピトイド」と呼ばれる。Ｌがステロール部分（すなわち、ステロール基であるかまたはステロール基を含む脂質部分、例えば、コレステロール基）である場合、脂質カチオン性ポリアミド結合体は、本明細書において「コレステロイド」と呼ばれる。本発明の組成物中の脂質カチオン性ペプトイド結合体は、リピトイド、コレステロイドであり得るか、または、１つの重要な実施形態において、これらの組み合わせであり得る。

特定の実施形態において、Ｒはイソプロピルまたは４−メトキシフェニルである。単一のリピトイドまたはコレステロイドは、この分子内に異なる基Ｒを含み得るか、または同一であり得る。

本発明の組成物は、標的遺伝子のｍＲＮＡをノックアウトするのに有効な、ｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞への効率的な送達をもたらす。

別の局面において、被験体における標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、上記のような組成物を被験体に投与する工程を包含し、この組成物中のｓｉＲＮＡ二重鎖の１つの鎖は、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列を有する方法が提供される。別の実施形態において、被験体において標的遺伝子の発現を阻害するのに用いる、上記のような組成物の製造方法が提供される。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖の１つの鎖は、２つのヌクレオチド３’オーバーハングおよびホスホジエステル結合を全体にわたって含む、本明細書中に開示される配列番号１で表される配列を含むものが用いられ得、そして標的遺伝子／ｍＲＮＡはＡｋｔ１である。

別の局面において、本発明は、少なくとも１つのリピトイドおよび１つのコレステロイドの混合物で構成されるポリヌクレオチド送達ビヒクルを提供する。組み合わせリピトイド／コレステロイド送達ビヒクルは、このようなポリヌクレオチドおよび組み合わせリピトイド／コレステロイド送達ビヒクルを含む組成物において、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡのような多様なポリヌクレオチドを細胞へ送達するのに適している。

本発明に従う組成物および送達ビヒクルは、インビトロで（例えば、創薬、開発および活性試験を含む研究に関連して）、または哺乳動物（例えば、ヒト）被験体を含む動物における治療用途（例えば、疾患を処置するための薬物成分の薬物として）のためにインビボで、使用され得る。このようなインビボ用途のために、本発明に従う薬学的に許容可能なビヒクルが使用される。

（定義）
他に断らない限り、本明細書中で用いられる技術用語は、当業者によって理解されるようなその通常の意味が与えられるべきである。本発明についての理解を促進するために、多くの定義された用語が、本発明の特定の要素を指定するために本明細書中で使用される。そのように使用される場合、以下の意味が意図される：
用語「脂質結合体化ポリアミド」は、オリゴマーのアミド部分および１つ以上の脂質部分の両方を有する化合物をいうために本明細書中で使用される。脂質結合体化ポリアミド化合物のポリアミド成分は、例えば、ペプトイドであり得、この場合、脂質結合体化ポリアミドは「脂質結合体化ペプトイド」と呼ばれ得、特にカチオン性ペプトイドである場合、脂質結合体化ポリアミドは「脂質カチオン性ペプトイド結合体」と呼ばれ得る。

本明細書中で使用される場合、用語「脂質」とは、疎水性または両親媒性部分をいう。脂質部分は、オリゴマーアミド部分に直接的に、または必要に応じて、リンカー部分を介してオリゴマーアミド部分に間接的に結合体化され得る。脂質結合体化ポリアミドの脂質成分は、非ステロール部分またはステロール部分であり得るか、あるいは非ステロール部分またはステロール部分を含み得る。

本明細書中で使用される場合、用語「リピトイド」とは、以下の式：

の脂質結合体化ペプトイドをいい、式中、脂質部分（Ｌ）は非ステロール脂質部分である。本明細書および特許請求の範囲において用いられたとしても、本式は、位置異性体またはそのペプトイド部分（本式のペプトイド部分の任意の繰り返し３倍モチーフである位置異性体）を包含することを意図する。

本明細書中で使用される場合、用語「コレステロイド」とは、以下の式：

の脂質結合体化ペプトイドをいい、式中、脂質部分（Ｌ）はステロール脂質部分である。本明細書および特許請求の範囲において用いられたとしても、本式は、位置異性体またはそのペプトイド部分（本式のペプトイド部分の任意の繰り返し３倍モチーフである位置異性体）を包含することを意図する。

用語「オリゴマーの」および「オリゴマーアミド」は、本明細書中で交換可能に使用されて、アミド結合によって結合される２つ以上のモノマー単位、すなわち、
−［−（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）ｎ］ｍ−
をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「モノマー」または「モノマー」単位とは、以下の式
−（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）−
によって定義される単位をいう。

用語「オリゴマーの反応物」、「オリゴマー反応物」、「オリゴマーアミド反応物」および「脂質反応物」とは、本明細書中において、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物が合成される反応種をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「送達ビヒクル」とは、ポリヌクレオチドと複合体を形成し、細胞膜を介して標的部位へのポリヌクレオチドの送達を促進する、本明細書でさらに記載されるような脂質結合体化ポリアミド化合物をいう。本発明に従う送達ビヒクルは、「薬学的に受容可能」であり、「薬学的に受容可能」とは、本明細書中で使用される場合、例えば、インビボまたはインビトロのいずれかで、生細胞のような生体物質と接触する、薬学的処方物および他の用途に用いるための生体物質と送達ビヒクルとの適合性をいう。

本明細書中で使用される場合、用語「複合体」とは、２つ以上の化合物または構造物の間の相互作用によって形成される構造物をいう。このような相互作用は、化学的相互作用、例えば、共有結合、イオン結合または二次結合（例えば、水素結合）などを介し得るか、あるいは物理的相互作用、例えば、カプセル化、封入などを介し得る。

本発明の１つの局面に従って、脂質結合体化ポリアミド化合物は、内因性のタンパク質分解酵素による分解に感受性のアミノ酸の中間に配置された配列による共有結合を介して、ｓｉＲＮＡと複合体化され得る。従って、例えば、分解系酵素への複合体の曝露により、複合体からのｓｉＲＮＡの切断および引き続く遊離を生じる。本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物はまた、イオン結合または二次結合を介して、あるいはカプセル化または封入を介して、ｓｉＲＮＡと複合体化され得る。

用語「ポリヌクレオチド」および「ポリ核酸」は、本明細書中で交換可能に使用されて、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのアナログ、ペプチド−核酸、ならびに、リン酸を含まないヌクレオチドを有するＤＮＡまたはＲＮＡをいう。ｓｉＲＮＡは、本発明に従って特に用いられる。本発明のいくつかの局面の実施に用いられる他のポリヌクレオチドは、一本鎖分子、二本鎖分子またはキメラ一本鎖もしくは二本鎖分子であり得る。特定の例としては、プラスミドＤＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。

本明細書中で使用される場合、「置換される」とは、有機官能基上の１つ以上のペンダント水素の置換が、好ましくは、ハロゲン化物、低級アルキルまたは低級アルコキシ基、ハロメチル、あるいはハロエチルから選択される置換基で置換されることを意味する。

本明細書において言及されるすべての刊行物は、本発明の特徴（これに関連して刊行物が引用される）を開示および記載する目的で、参考として本明細書中に援用される。

（組成物）
１つの局面において、本発明は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および脂質結合体化ポリアミドベースの送達ビヒクルを含む組成物を提供する。これらの組成物は、細胞へのｓｉＲＮＡの送達に特に有用である。

（１．ｓｉＲＮＡ）
本発明の組成物は、正常な細胞機能（例えば、インターフェロン応答）に有害な任意の他の活性を誘発することなく、目的の遺伝子の発現を特異的に抑制するのに有効なｓｉＲＮＡを含む。有効なｓｉＲＮＡは、一般に（しかし、必ずしもそうであるとは限らないが）、化学的に合成される。特定の実施形態において、２つのヌクレオチド３’オーバーハングおよびホスホジエステル結合を全体にわたって含む、配列ＣＡＵＡＧＵＧＡＧＧＵＵＧＣＡＵＣＵＧＧＵＧ（配列番号１）を有するＡｋｔ１メッセンジャーＲＮＡに対して指向されるｓｉＲＮＡが用いられ得る。ある場合において、２つのヌクレオチド３’側オーバーハングは、ＴＴ（ＤＮＡ）ヌクレオチドである。別の場合において、２つのヌクレオチド３’側オーバーハングは、２’Ｏ−メチルＵＵ（ＲＮＡ）ヌクレオチドである。

以下の実施例１および３に記載のように、細胞中にトランスフェクトされた場合、これらのｓｉＲＮＡは、内因性Ａｋｔ１ ｍＲＮＡの非常に有効な分解を示し、対応するＡｋｔ１遺伝子の活性の減少を生じた。本明細書中に記載されるＡｋｔ１ ｓｉＲＮＡ配列が、本発明に従う組成物中の脂質結合体化ポリアミド化合物送達ビヒクルと組み合わされ得る無数の他の可能なｓｉＲＮＡ配列の単なる代表であることは、理解されるべきである。本明細書中に提供される開示について、他のｓｉＲＮＡ配列は、対応するｍＲＮＡおよび遺伝子に同じ影響を達成する、同じかまたは類似の容易に確認可能な様式で用いられ得ることが、当業者に理解される。

（２．脂質結合体化ポリアミド化合物）
本発明は、脂質結合体化ポリアミド化合物ベースの送達ビヒクルを含む組成物を提供する。これらの送達ビヒクル中での使用またはこれらの送達ビヒクルとしての使用に適した脂質結合体化ポリアミド結合体は、米国シリアル番号６０／０２３，８６７、同６０／０５４，７４３および同０９／１３２，８０８に基づく、共に権利を有するＰＣＴ公開ＷＯ９８／０６４３７およびＷＯ９９／０８７１１（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら）；ならびに米国シリアル番号６０／１５１，２４６に基づく、共に権利を有するＰＣＴ公開ＷＯ０１／１６３０６および米国シリアル番号０９／６４８，２５４（Ｉｎｎｉｓら）（その全体が、すべての目的のために、本明細書中に参考として援用される）に記載される。これらの脂質結合体化ポリアミド結合体は、以下の一般式を有する：
（Ｉ）Ｒａ−［（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）ｎ］ｍ−Ｒｃ
式中、ｎは１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは約２〜約４８から選択される整数であり、
式中、各単量体単位「−（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）−」についてのＲ_１およびＲ_ａは、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、からなる群より独立して選択され、
式中、Ｒ_１は、少なくとも１つの単量体単位について水素原子ではなく、
式中、Ｒ_ｃは、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；ヒドラジン基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、から選択され、
式中、Ｒ_１、Ｒ_ａまたはＲ_ｃが骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリール基またはアリールアルキル基である場合、該骨格構造は、１つ以上の酸素原子および／または窒素原子をさらに含み、
式中、各単量体単位についてのＷは、１〜約５０個の原子を有し、そして、炭素を含みかつ必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格中に、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の２価部分から独立して選択され、ここで、該任意のＷの置換は、必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分であり得、
ここで、該脂質部分は、以下：
（ｉ）必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に約１４〜約５０個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールまたはアリールアルキル部分であって、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールまたはアリールアルキル部分；ならびに
（ｉｉ）必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に約１０〜約５０個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族部分であって、該脂肪族部分は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族部分
からなる群より選択される、疎水性または両親媒性部分であり、そして
式中、単一の単量体単位についての少なくとも１つのＲ_ａ、Ｒ_ｃ、Ｗおよび単一の単量体単位についてのＲ_１は、脂質部分を含む。

本発明の脂質結合体化ポリアミドは、Ｒ_１およびＷの各々がモノマーからモノマーへとランダムに変化する（すなわち、式中ｎは１であり、ｍは約２〜約４８の整数である）、ランダムポリマーであり得る。あるいは、脂質結合体化ポリアミドは、繰り返しである（すなわち、各ｎ量体は同じである）か、ランダムに可変である（すなわち、各ｎ量体のモノマー組成はランダムである）かのいずれかである、ｍ個のｎ量体（すなわち、ｎは１よりも大きく、ｍは約２〜約４８の整数である）を有するポリマーであり得る。

代表的には、整数ｎは、約４０以下であり、より代表的には約２０以下であり、そしてさらにより代表的には約６以下である。好ましくは、ｎは約３である。整数ｍは、代表的には約４０以下であり、より代表的には約２５以下である。通常、整数ｍは、約１５以下であり、代表的には約１２以下であり、そしてさらにより代表的には約８以下である。

Ｒ_１、Ｒ_ａおよびＲ_ｃが脂肪族である場合、代表的には骨格構造中に少なくとも２個の炭素原子を含み、そしてより代表的には骨格構造中に少なくとも約３個の炭素原子を含む。アリールおよびアリールアルキルＲ_１基、Ｒ_ａ基およびＲ_ｃ基は、直鎖状または環状であり得る。骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリールおよびアリールアルキルＲ_１、Ｒ_ａおよびＲ_ｃはまた、骨格構造中に１個以上のヘテロ原子（例えば、窒素および／または酸素）を有する。代表的には、アリールおよびアリールアルキルＲ_１、Ｒ_ａおよびＲ_ｃは、骨格構造中に少なくとも約５個の炭素原子を有する。

Ｒ_ａは、代表的には−ＯＨ、−Ｈ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、スルホニルまたは必要に応じてリンカー部分に結合体化される脂質部分であり、Ｒ_ｃは、代表的には−ＯＨ、−Ｈ、−ＳＨ、−ＮＨ_２、スルホニル、ヒドラジンまたは必要に応じてリンカー部分に結合体化される脂質部分である。好ましくは、Ｒ_ａまたはＲ_ｃのいずれかは、必要に応じてリンカー部分に結合体化される脂質部分である。

Ｒ_１は、生理学的に適切なｐＨでカチオン性、アニオン性または中性の側鎖であり得る。代表的には、生理学的ｐＨは、少なくとも約５．５であり、そして代表的には少なくとも約６．０である。より代表的には、生理学的ｐＨは、少なくとも約６．５である。通常、生理学的ｐＨは約８．５未満であり、そして代表的には約８．０未満である。より代表的には、生理学的ｐＨは、約７．５未満である。

適切なカチオン性側鎖としては、例えば、アミノアルキル（例えば、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチル、アミノペンチルなど）およびそれらの誘導体；（Ｓ）−α−メチルエチレンジアミノおよびその誘導体；トリメチルアミノエチルおよびその誘導体；グアニジノアルキル（例えば、グアニジノエチル、グアニジノプロピル、グアニジノブチル、グアニジノペンチルなど）およびそれらの誘導体；アミノベンジルおよびその誘導体；ピリジニウムおよびその誘導体；ならびに当業者に公知の他のカチオン性部分などが挙げられる。

適切な中性側鎖としては、例えば、（Ｓ）または（Ｒ）−α−メチルベンジルおよびその誘導体；ベンジルおよびその誘導体；フェネチルおよびその誘導体；ナフチルメチルおよびその誘導体；（Ｓ）または（Ｒ）−α−メチルナフチルおよびその誘導体；Ｎ−プロピルピロリジノンおよびその誘導体；シクロヘキシルメチルおよびその誘導体；フルフリルおよびその誘導体；３，４，５−トリメトキシベンジルおよびその誘導体；メトキシエチルおよびその誘導体；ｐ−メトキシフェネチルおよびその誘導体；イソアミル（「ＩｓｏＡ」）およびその誘導体；ならびに当業者に公知の他の中性部分などが挙げられる。

適切なアニオン性側鎖としては、例えば、カルボキシメチル、カルボキシエチルなど、およびそれらの誘導体；安息香酸およびその誘導体；リン酸塩およびその誘導体；硫酸塩およびその誘導体；ならびに当業者に公知の他のアニオン性部分などが挙げられる。

必要に応じて、Ｒ_１は、天然に存在するかまたは天然に存在しないアミノ酸上に見出される部分であり得るか、あるいはＲ_１は、リンカー部分に必要に応じて結合される脂質部分であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「天然に存在するアミノ酸」とは、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒをいう。用語「天然に存在しないアミノ酸」とは、例えば、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体を含む、典型的には天然に見出されないアミノ酸をいう。

ｎ×ｍが３以上である場合、代表的には、Ｒ_１は、少なくとも２つの単量体単位について水素ではなく、さらに代表的には、Ｒ_１は、少なくとも３つの単量体単位について水素ではない。代表的には、モノマー単位の約７５％未満は、水素であるＲ_１を有する。より代表的には、モノマー単位の約５０％未満は、水素であるＲ_１を有する。さらにより代表的には、モノマー単位の約２５％未満は、水素であるＲ_１を有する。さらにより代表的には、Ｒ_１は、任意の単量体単位について水素ではない。

Ｗは、代表的には、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、ＣＨ_２−Ｃ_６Ｈ_４−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−（すなわち、トルイル酸）、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ−、あるいは
（ＩＩ）−ＣＲ_２ＣＲ_３−、
であり、
式中、各単量体単位についてのＲ_２およびＲ_３は、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄、リンなどを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄、リンなどを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄、リンなどを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに必要に応じてリンカー部分に結合される脂質部分、からなる群より独立して選択され、
式中、Ｒ_２およびＲ_３のいずれかは、骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリール基またはアリールアルキル基であって、該骨格構造は、１つ以上の酸素原子および／または窒素原子をさらに含む。

Ｒ_２およびＲ_３が脂肪族である場合、これらは、代表的には骨格構造中に少なくとも２個の炭素原子を含み、さらに代表的には骨格構造中に少なくとも約３個の炭素原子を含む。アリールおよびアリールアルキルＲ_２基およびＲ_３基は、直鎖状または環状であり得る。骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリールおよびアリールアルキルＲ_２およびＲ_３はまた、骨格構造中に１個以上のヘテロ原子（例えば、窒素および／または酸素）を有する。代表的には、アリールおよびアリールアルキルＲ_２およびＲ_３は、骨格構造中に少なくとも約５個の炭素原子を有する。

Ｒ_２およびＲ_３は、代表的には、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸上に見出される部分である。通常、Ｒ_２およびＲ_３の少なくとも１つは、水素原子である。最も代表的には、Ｒ_２およびＲ_３の両方は、すべての単量体単位について水素であり、その結果、化合物（Ｉ）は、脂質に結合体化され、Ｎ置換されたポリグリシン化合物である。

脂質部分は、１つ以上のモノマーについてＲ_ａ、Ｒ_ｃ、Ｒ_１に配置され得るか、または１つ以上のモノマーについてＷ中の置換位置に配置され得る。脂質部分は、単量体単位に直接的に結合され得るか、またはリンカー部分を介して単量体単位に間接的に結合され得る。

本明細書中で使用される用語「リンカー」とは、脂質部分およびオリゴマーアミド部分が互いに直接連結された場合よりも、これらの２つの部分の間の分子の距離がより大きいような様式で、オリゴマーアミド部分および脂質部分をともに連結するために機能する部分をいう。リンカー部分は、骨格中に１〜約２０個の原子を有する、比較的小さな部分であっても、あるいはポリマーの部分であってもよい。小さなリンカー部分は、置換されていてもよく、代表的には骨格中に１〜約２０個の原子（例えば、炭素、窒素、酸素、硫黄、リンなど）を有する。代表的には、小さなリンカー部分は、骨格中に約１８個未満の原子を有し、そしてより代表的には、骨格中に約１５個未満の原子を有する。通常、小さなリンカー部分は、骨格中に約１０個未満の原子を有し、そして必要に応じて、骨格中に約５個未満の原子を有する。

リンカー部分は、オリゴマー反応物および脂質反応物の両方と反応し得る二官能分子（例えば、６−アミノヘキサン酸、２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）酢酸など）から誘導され得る。リンカー部分はまた、例えば、アシル基および置換アシル基、スルホニル基および置換スルホニル基、ならびに化学合成の間に使用されてオリゴマー部分への脂質部分の結合体化を促進する他の反応性部分などのような基から誘導され得る。

ポリマーのリンカー部分は、必要に応じて置換され（例えば、ヒドロキシ−、カルボキシ−、ホスホ−、アミノ−、など）、炭素を含みかつ必要に応じて窒素、酸素、硫黄、リンなどを含む骨格を有する実質的に直鎖状のポリマーである。ポリマーのリンカー部分は、約３００ダルトンと約１５，０００ダルトン、代表的には約１０，０００ダルトン未満、より代表的には約５，０００ダルトン未満、そしてさらにより代表的には約３０００ダルトン未満、そして必要に応じて約１０００ダルトン未満との間の平均分子量を有する。適切なポリマーのリンカー部分としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。

脂質部分は、中性である（すなわち、電荷を有さないかまたはゼロの正味電荷を有する）かまたは荷電しているかのいずれかであり、かつ天然に誘導されるかまたは合成的に誘導されるかのいずれかである、疎水性部分または両親媒性部分である。代表的には、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物中の脂質部分は、両親媒性である。

適切な脂質部分は、以下を含む：（１）必要に応じて、窒素、酸素、硫黄、リンなどを必要に応じて含む骨格構造中に約１４〜約５０個の炭素原子を有するアリールまたはアリールアルキル部分であって、該アリールアルキル部分は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル部分；（２）必要に応じて、窒素、酸素、硫黄、リンなどを必要に応じて含み、かつ１つ以上の二重結合または三重結合を必要に応じて有する、骨格構造中に約１０〜約５０個の炭素原子を有する分岐鎖または直鎖の脂肪族部分。

代表的には、アリールおよびアリールアルキル脂質部分は、少なくとも約１６個の炭素原子を有し、代表的には少なくとも約２０個の炭素原子を有し、そしてさらにより代表的には少なくとも約３０個の炭素原子を有する。

本発明の化合物に使用される脂肪族脂質部分は、代表的には、少なくとも約１２個の炭素原子を有し、そしてより代表的には、少なくとも約１４個の炭素原子を有する。通常、脂肪族脂質部分は、少なくとも約１８の炭素原子、より通常少なくとも約２４個の炭素原子、そしてさらにより通常少なくとも約３０個の炭素原子を有する。

本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物中の脂質部分の数は、所望の疎水性の程度によって変動し得、かつオリゴマーの長さ（すなわち、ｎ×ｍ）および脂質部分の大きさによっても変動する。例えば、脂質部分が約３０個以下の炭素原子を有する場合、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物には、代表的に、モノマー基の総数（すなわち、ｎ×ｍ）の９０％として算出される数よりも少ない（すなわち、ｎが３であり、かつｍが３である場合、脂質結合体化ポリアミド化合物に結合体化される脂質部分の数は、代表的には約８個未満である）いくつかの脂質部分が結合体化している。より代表的には、脂質部分が約３０個以下の炭素原子を有する場合、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物には、モノマー基の総数の約８０％未満、より代表的にはモノマー基の総数の約７５％未満、そしてさらにより代表的にはモノマー基の総数の約６０％未満である、いくつかの脂質部分が結合体化している。

脂質部分が約３０個よりも多い炭素原子を有する場合、代表的には、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物には、モノマー基の総数の５０％未満として算出される数よりも少ない、いくつかの脂質部分が結合体化している。

適切な脂質部分としては、さらに窒素、酸素、硫黄、リンなどを必要に応じて含む骨格中に約８〜約３０個の炭素原子をそれぞれ独立して有する、置換されていてもよい脂肪族直鎖部分である、１つ以上の疎水性テールを有するものが挙げられる。代表的には、疎水性テールは、骨格中に少なくとも約１０個の炭素原子を有し、そしてより代表的には、骨格中に少なくとも約１２個の炭素原子を有する。本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物において用いられる疎水性テールは、代表的には、骨格中に約２６個よりも多い炭素原子を有さず、そしてより代表的には、骨格中に約２４個よりも多い炭素原子を有さない。

本発明の実施において使用される天然の脂質部分は、例えば、ホスホグリセリド（アシルホスホグリセリド（例えば、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸、ホスファチジルイノシトール二リン酸、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロールなど）およびエーテルホスホグリセリドの両方を含む）；グリセロ糖脂質（例えば、モノガラクトシルジアシルグリセロール、ジガラクトシルジアシルグリセロール、スルホキノボシルジアシルグリセロール、ジマンノシルジアシルグリセロール、ガラクトフラノシルジアシルグリセロール、ガラクトシルグルコシルジアシルグリセロール、ガラクトシルグルコシルジアシルグリセロール、グルコシルガラクトシルグルコシルジアシルグリセロールなど）；スフィンゴリピド（例えば、スフィンゴシン、グリコシルセラミド、ガングリオシドなど）；ならびに飽和および不飽和ステロール（例えば、コレステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、シトステロールなど）；ならびに他の天然の脂質などを含む、例えばリン脂質から誘導され得る。

適切な合成脂質部分は、例えば、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール、Ｔｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−テトラメチル−Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３−テトラパルミチルスペルミン（ＴＭ−ＴＰＳ）（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミノスペルミンなどから誘導され得る。

適切な脂質部分はまた、骨格中に約８〜約２４個の炭素原子を有する脂肪酸および脂肪アルコールから誘導されるものを含む。代表的には、脂肪酸および脂肪アルコールは、骨格中に少なくとも約１０個の炭素原子を有し、そしてより代表的には、骨格中に少なくとも約１２個の炭素原子を有する。通常、脂質部分が誘導される脂肪酸およびアルコールは、骨格中に約２０個未満の炭素原子を有する。

代表的には、Ｒ_ａは、脂質部分またはリンカー部分と結合体化した脂質部分である。特に有用な脂質部分含有Ｒ_ａ基は、以下の式：

を有するホスファチジルアルキルアミノ置換アシル部分であり、
式中、ｐは、２または３から選択される整数であり、そしてＲ_４は、それぞれ独立して、骨格中に約６個と約２５個との間の炭素原子を有するアルキルまたはアルケニル部分から選択される。代表的にはＲ_４は、骨格中に約２２個までの炭素原子、より代表的には約２０個までの炭素原子、さらにより代表的には約１８個までの原子を有する。代表的には、Ｒ_４は、骨格中に少なくとも約８個の炭素原子、より代表的には少なくとも約１０個の炭素原子、そしてさらにより代表的には少なくとも約１２個の炭素原子を骨格中に有する。例示的なＲ_４部分としては、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシルなどが挙げられる。好ましくは、ｐは２である。

本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、例えば、標的化能力、構造上の特徴および生物活性を付与する薬剤または分解部位を導入する薬剤などと、必要に応じてさらに結合体化または複合体化され得る。適切な薬剤としては、例えば、単糖、二糖および多糖、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば、リポタンパク質、糖タンパク質、抗体などを含む）、架橋剤、マーカー剤（例えば、フルオレセイン、ビオチン、^３２Ｐなどのような）などが挙げられる。

Ｒ_１、Ｒ_ｃ、Ｒ_ａ、Ｗおよび使用される特定の脂質部分が、特定の型のポリヌクレオチドの送達のために、脂質結合体化ポリアミド化合物の物理化学的性質を最適化するために容易に変更され得ることが、当業者に理解される。例えば、細胞へのｓｉＲＮＡの送達に用いるのに適した本発明のオリゴマー部分は、正味の正電荷を有し、ポリ核酸を縮合し得、その結果、これらのオリゴマー部分のサイズはより小型であり、従って、細胞への送達を促進する。

細胞へのｓｉＲＮＡの送達に用いるのに適した式（Ｉ）の化合物としては、繰り返しｎ量体単位（すなわち、ｎが１以上である）を有する脂質結合体化ポリアミド化合物が挙げられる。例えば、ｎが３である場合、式（Ｉ）の脂質結合体化ポリアミド化合物は、繰り返し三量体単位、すなわち、

を有し、式中、Ｒ_ａ、Ｒ_ｃ、ｍ、各Ｗおよび各Ｒ_１は、式（Ｉ）およびその位置異性体と同様に定義される。細胞へのｓｉＲＮＡの送達に用いるのに適した式（ＩＶ）を有する化合物としては、Ｒ_１ ^１がカチオン性側鎖であり、Ｒ_１ ^２およびＲ_１ ^３の両方が中性側鎖であり、各ＷがＣＨ_２であり、Ｒ_ｃがＮＨ_２であり、そしてＲ_ａが式（ＩＩＩ）によって定義される化合物が挙げられる。

本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物は、代表的には、溶液中において、濃度依存的な、２次元または３次元規則構造を形成する。このような構造としては、二次元配列（例えば、単荷電層または脂質二重層表面）および三次元構造（例えば、ミセル、小胞およびリポソーム）が挙げられる。代表的には、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物のみで形成された規則構造は、代表的には、十分に小さいので光を散乱させない。ポリヌクレオチドと複合体を形成した脂質結合体化化合物から調製されるミセル、小胞およびリポソームは、代表的には約１μｍ未満、より代表的には約５００ｎｍ未満、そしてさらにより代表的には約２００ｎｍ未満の平均粒径を有する。

特定の実施形態において、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物ベースの送達ビヒクルは、１つ以上の下記式の脂質カチオン性ペプトイド結合体：

および位置異性体を含み得、
式中、
Ｌは、約８炭素原子長と２４炭素原子長との間の少なくとも１つの脂肪族アルキル鎖またはアルケニル鎖を含む非ステロール脂質部分およびステロール部分から選択され；
各基Ｒは、アルキル、アミノアルキルおよびアラルキルから独立して選択され、そして
Ｘは、直接結合、オリゴペプチド、２〜約３０結合長の実質的に直鎖状のアルキル鎖、ならびにアルキル結合と、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ジスルフィド、ペプチドおよびエーテルからなる群より選択される１つ以上の結合とからなる、２〜約３０結合長の実質的に直鎖からなる群より選択される。

Ｌが非ステロール脂質部分（すなわち、ステロール基を含まない脂質部分、例えば、リン脂質基（すなわち、ＲＯＯＣＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＲ）ＣＨ_２ＯＰ（Ｏ）_２Ｏ−））である場合、脂質カチオン性ポリアミド結合体は、本明細書において「リピトイド」と呼ばれる。Ｌがステロール部分（すなわち、ステロール基を含む脂質部分、例えば、コレステロール基）である場合、脂質カチオン性ポリアミド結合体は、本明細書において「コレステロイド」と呼ばれる。本発明の組成物中の脂質カチオン性ポリアミド結合体は、リピトイド、コレステロイドであり得るか、または、１つの重要な実施形態において、これらの組み合わせであり得る。

特定の実施形態において、Ｒはイソプロピルまたは４−メトキシフェニルである。単一のリピトイドまたはコレステロイドは、この分子内に異なる基Ｒを含み得るか、または同一であり得る。

これらのビヒクルは、前述のＺｕｃｋｅｒｍａｎｎらに記載されるような、かつ以下にさらに詳述されるような、従来の溶液相または固相合成法によって調製され得る。１つのこのような手順において、樹脂に結合されたペプトイドのＮ末端は、Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸またはＦｍｏｃ−β−アラニンのようなスペーサーでアシル化される。Ｆｍｏｃ基の除去後、１級アミノ基は、例えば、図１のコレステロイド１および３に示されるように、脂質部分（例えば、コレステロールクロロホルメート）と反応してカルバメート結合を形成する。次いで、生成物はトリフルオロ酢酸を用いて樹脂から切断され、逆相ＨＰＬＣによって精製される。脂肪酸誘導性の脂質部分（例えば、リン脂質）は、ステロイド部分の代わりに用いられて、本明細書中に記載されかつ図１にも示されるようなリピトイドを形成し得る。

脂質部分はまた、任意の有効長の他の結合（当業者にとって容易に利用可能）によって、ポリアミド（例えば、ペプトイド）部分に連結され得る。リンカーは、約３０結合長以下、そしてより好ましくは約１５結合長以下の鎖であるが、任意の有効長が使用され得る。鎖は、代表的には直鎖状または実質的に直鎖状であるが、分枝鎖（オリゴペプチドを含む）および介在性の環式基を含むリンカーも使用され得る。リンカーは、一般に、アルキル（Ｃ−Ｃ）結合および１つ以上の官能基（例えば、エステル結合、アミド結合、カーボネート結合、カルバメート結合、ジスルフィド結合、ペプチド結合またはエーテル結合）を含む。リンカーは、コハク酸エステルまたはポリエーテルにおけるように複数の官能基を含み得るか、またはオリゴペプチド（好ましくは２〜１０量体、そしてより好ましくは２〜５量体）であり得る。ステロイドまたは脂質部分およびペプトイドセグメントもまた、直接結合によって連結され得る。

特定の実施形態において、リンカーは、インビボの適切な条件下で切断に感受性である、１つ以上の結合（例えば、加水分解可能なエステル結合、カーボネート結合、カルバメート結合またはペプチド結合；十分に還元性の環境を有する細胞区画中で切断可能である、ジスルフィド結合；および内因性ペプチダーゼによって切断可能なペプチド結合）を含む。後者に関して、１０個以下のペプチド結合を有するポリペプチドリンカー、またはさらなる実施形態において、５個以下のペプチド結合を有するポリペプチドリンカーが企図されるが、より長いリンカーも用いられ得る。

図１に示される、このクラスの代表的な構造は、本明細書中で以下の命名を受ける：

ここで、「Ｎｔｄ」は、Ｎ−テトラデシルグリシンであり；「Ｎｈｄ」は、Ｎ−ヘキサデシルグリシンであり；「Ｎｄｄ」は、Ｎ−ドデシルグリシンであり；「Ｎｏｌ」は、Ｎ−オレイルグリシンである。

前述の構造に示されるペプトイドモノマーは、以下である：

１つの局面において、本発明は、少なくとも１つのリピトイドおよび１つのコレステロイドの混合物で構成される、生物学的因子送達ビヒクルを提供する。送達ビヒクルは、多様なポリヌクレオチド（例えば、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ）の細胞への送達に適しており、ここで、送達ビヒクルは、本発明に従って組成物中でポリヌクレオチド（単数または複数）と組み合わされる。

本発明に従う組成物は、哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの有効な送達、標的遺伝子ｍＲＮＡの有効なノックアウトを生じる。本発明に従う組成物および送達ビヒクルは、インビトロで（例えば、創薬、開発および活性試験を含む研究に関連して）、または哺乳動物（例えば、ヒト）被験体を含む動物における治療用途（例えば、疾患を処置するための薬物成分の薬物として）のためにインビボで、使用され得る。このようなインビボ用途のために、本発明に従う薬学的に許容可能なビヒクルが使用される。

（脂質結合体化ポリアミド化合物の合成）
本発明の組成物における使用に適した脂質結合体化ポリアミド化合物は、固相法および溶液相法によって合成され得る。本発明はまた、脂質結合体化ポリアミド化合物を合成する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）（１）脂質反応物と（２）オリゴマー反応物を接触させる工程であって、ここで、該オリゴマー反応物は、以下の一般式：
（Ｖ）Ｔａ−［（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）ｎ］ｍ−Ｔｃ
を有し、
式中、ｎは１〜約４８から選択される整数であり、そしてｍは約２〜約４８の整数であり、
式中、Ｔ_ａおよびＴ_ｃは各々、末端基および前記脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分から独立して選択され、
式中、前記オリゴマー反応物中の各単量体単位「−（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）−」についてのＲ_１は、水素原子；ヒドロキシ基；アミノ基；カルボキシル基；スルホニル基；−ＳＨ；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に１〜８個の炭素原子を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖の脂肪族基であって、ここで、該脂肪族基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、脂肪族基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリール基；必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格構造中に３〜１２個の炭素原子を有する、置換されていてもよいアリールアルキル基であって、ここで、該アリールアルキルのアルキル基は、必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、アリールアルキル基；ならびに前記脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分、からなる群より選択され、
式中、Ｒ_１、Ｒ_ａまたはＲ_ｃが、骨格構造中に５個未満の炭素原子を有するアリール基またはアリールアルキル基である場合、該骨格構造は、１つ以上の酸素原子および／または窒素原子をさらに含み、
ここで、Ｒ_１は、少なくとも１つの単量体単位について水素原子ではなく、
式中、各単量体単位についてのＷは、炭素を含みかつ必要に応じて窒素、酸素、硫黄およびリンを含む骨格中に１〜約５０個の原子を有し、そして必要に応じて１つ以上の二重結合または三重結合を有する、置換されていてもよい、分岐鎖または直鎖２価部分から選択され、ここで、該任意のＷの置換は、前記脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分であり得、
式中、単一の単量体単位についての少なくとも１つのＴ_ａ、Ｔ_ｃ、Ｗまたは単一の単量体単位についてのＲ_１は、前記脂質反応物とさらに反応し得る反応性部分を含む、工程；次いで、
ｂ）前記脂質反応物を前記オリゴマー反応物と反応させて、該脂質反応物を該オリゴマー反応物に結合体化させる工程。

本明細書中で使用される用語「脂質反応物」とは、化学反応（例えば、求核置換、縮合など）に関与し得る脂質部分を有する反応種をいう。官能基（例えば、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＳＯ_２Ｃｌおよび−ＣＨＯ）を有する脂質反応物は、本発明の脂質結合体化化合物を合成するのに特に有用である。本発明の実施における使用に適した脂質反応物としては、オリゴマーの反応物またはリンカーと反応し得るか、またはオリゴマーの反応物またはリンカーと反応するように改変され得る、本明細書中に記載の脂質部分のいずれか１つを有する脂質反応物が挙げられる。代表的には、脂質反応物は、１級アミン、２級アミンまたは３級アミンである。本明細書における使用に適した具体的な脂質反応物は、ホスファチジルエタノールアミンである。

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴマー反応物」とは、化学反応（例えば、求核置換、縮合など）に関与し得るオリゴマーアミドをいう。オリゴマー反応物は代表的に、アミンのような、求核試薬による求核置換に感受性の脱離基でアシル化される。本発明の実施における使用に適したオリゴマー反応物は、本明細書において式（Ｉ）（すなわち、−［（ＮＲ_１−Ｗ−ＣＯ）_ｎ］_ｍ−）に記載されるすべてのオリゴマーアミド置換基を含む。

本明細書中で使用される場合、用語「反応性部分」とは、脂質反応物との反応に関与し得る部分をいう。代表的な反応性部分としては、例えば、−ＮＨ_２、−ＯＨ、−Ｈ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、アシル（例えば、アセチル）、ベンゾイル、スルホニル（例えば、ダンシル）、アミド、ヒドラジン（代表的に、Ｔｃ基）およびそれらの誘導体（アルキル置換誘導体を含む）などが挙げられる。代表的には、反応性部分は、アミンのような、求核試薬による求核置換に感受性の脱離基によって置換されるアシル部分である。

例示的な末端基は、生物活性剤、標的化剤（例えば、細胞レセプターリガンド、抗体、など）、マーカー剤、例えば内因性のタンパク質分解酵素に対する分解部位として機能するアミノ酸残基、などである部分を含む。これらの末端基は代表的に、脂質反応物とさらに反応性ではない。

オリゴマー反応物および脂質反応物は、リンカー部分（必要に応じて反応性部分から誘導され得る）を介して、必要に応じて互いに結合され得る。あるいは、リンカー部分（これは、オリゴマー反応物および脂質反応物の両方と反応し得る分子から誘導される）は、必要に応じて、脂質反応物とオリゴマー反応物との間の反応の前に、脂質反応物またはオリゴマー反応物のいずれかに結合体化され得る。従って、脂質反応物は、直接的に、またはリンカー部分を介して間接的にのいずれかで、オリゴマー反応物に結合体化され得る。

本明細書中で使用される用語「反応すること」とは、直接的に、またはリンカー部分を介して間接的にのいずれかで、脂質反応物とオリゴマー反応物との間の化学結合の形成を生じる、１つ以上の化学反応をいう。適切な反応としては、例えば、縮合（例えば、アシル化など）および求核置換が挙げられる。

一般式（ＩＶ）を有するオリゴマー反応物は、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ ＷＯ９４／０６４５１（１９９４年３月３１日公開）（本明細書中に参考として援用される）によって記載される、固相法による一連の求核置換反応によって調製され得る。この方法は、目的のオリゴマー反応物の迅速な合成を可能にするために、自動ペプチド合成計測器を利用して実施され得る。これらの機器は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。

具体的には、オリゴマー反応物中へのモノマーアセンブリは、増幅する鎖に対する「サブモノマー」単位の経時的な付加によって達成される。モノマーアセンブリの１つの方法において、モノマー付加の各サイクルは、以下の２つの工程からなる：
（１）脱離基（すなわち、アミンのような、求核試薬による求核置換に対して感受性の基）およびカルボニル基（例えば、カルボキシル基）を有するアシル化剤で固体支持体に結合された２級アミンのアシル化（すなわち、「アシル化工程」）；続いて
（２）側鎖を導入するのに十分な量のサブモノマー（１級アミノ基、２級アミノ基または３級アミノ基を有する）による脱離基の求核置換（すなわち、「求核置換工程」）。

例示的なアシル化剤は、ハロ酢酸、ハロメチル安息香酸などを含む。脱離基の置換の効率は、使用されるアシル化剤の型によって調節される。例えば、ハロ酢酸が使用される場合、ヨウ素は、塩素と比較して、脱離基の置換においてより効率的であることが観察された。適切なサブモノマーとしては、アルキルアミン、アルケニルアミン、芳香族アミン、アルコキシアミン、セミカルバジド、アシルヒドロジド（ａｃｙｌ ｈｙｄｒｏｚｉｄｅ）およびそれらの誘導体などが挙げられる。

サブモノマーアプローチを使用するオリゴマー合成は、カルボキシからアミノ方向に生じる。オリゴマーは、所望の長さまで合成され、次いで、例えば、ブロモアセトアミド基で終結される。本発明のオリゴマー反応物を構築するために固相サブモノマーアセンブリを使用することの１つの利点は、反応性側鎖官能性のみを保護する必要があるので、Ｎ−α−保護モノマーの必要性が排除されることである。

代表的には、オリゴマーの反応物は、一連の繰り返し２量体、３量体または４量体単位として合成される。例示的な３量体ベースのカチオン性オリゴマーは、カルボキシ末端（Ｔ_ｃ）方向にアミノ末端（Ｔ_ａ）中に以下のモノマー配列を有する：
（１）正に荷電したモノマー
（２）中性モノマー、および
（３）中性モノマー。

本明細書中で使用される用語「中性モノマー」および「正に荷電したモノマー」とは、単量体単位の正味電荷をいう。上記のように、本発明に従う他の例において、他の位置異性体モチーフが使用され得る（例えば、中性−陽性−中性；または中性−中性−陽性）。

さらに、オリゴマー反応物と脂質反応物とのさらなる反応は、アシル化および／または求核置換によって生じ得る。例えば、ハロアシル化されるオリゴマー反応物（例えば、Ｔ_ａがブロモアセチル基である場合）は、１級、２級または３級アミンである脂質反応物と反応させ得る。従って、臭素の求核置換によって結合が生じて、脂質結合体化ポリアミド化合物が形成される。

より具体的な詳細は、本発明の特定の実施形態に従って、リピトイドおよびコレステロイドを含む脂質カチオン性ペプトイド結合体のための以下の固相サブモノマー合成プロトコルに提供される：
（一般的実験）試薬用溶媒は、さらなる精製を行わずに用いられる。ブロモ酢酸はＡｌｄｒｉｃｈより入手され得（９９％等級）、そしてＤＩＣはＣｈｅｍｉｎｐｌｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手され得る。反応および洗浄はすべて、特に断りのない限り３５℃で行なわれる。樹脂の洗浄とは、樹脂に洗浄溶媒（通常、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）を添加し、均一なスラリーが得られるように樹脂を撹拌し（代表的には、約２０秒間）、続いて樹脂から溶媒を完全に排液させることをいう。溶媒は、樹脂が乾燥しているように見えるまで（代表的には、約１０秒）、反応槽のフリット底を通して減圧濾過を行うことによって、最も良く除去される。樹脂スラリーは、フリット容器の底を通してアルゴンをバブリングさせることによって撹拌する。試薬を溶解するために用いられる溶媒は、ハウスバキューム下で５分間の超音波処理によって、使用前に脱気されるべきである。洗浄溶媒については、調整可能な容量（１〜５ｍＬ）で利用可能なＤＭＦ、ＤＭＳＯおよび塩化メチレンを含むディスペンサーを所有していると非常に便利である。

合成が停止され、樹脂がある期間（一晩）保存される場合、樹脂は、保存の前にジクロロメタンで十分にリンスされことが推奨される。保存される樹脂は、高真空下でさらに乾燥され得る。合成を二量体の段階で止めないことが望ましい。なぜなら、二量体は、長期にわたる保存の際に環化してジケトピペラジンを形成し得るからである。

（最初の樹脂膨潤およびＦｍｏｃ脱保護）フリット反応容器を１００ｍｇのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂で満たす（０．５０ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）。この樹脂に２ｍＬのＤＭＦを添加し、この溶液を５分間攪拌して樹脂を膨潤させる。必要であれば、ガラス棒を用いて樹脂の塊を粉砕し得る。次いで、ＤＭＦを排液させる。次いで、２ｍＬのＤＭＦ中の２０％ピペリジンを樹脂に添加することによって、Ｆｍｏｃ基を除去する。これを１分間撹拌し、次いで、排液させる。さらに２ｍＬのＤＭＦ中の２０％ピペリジンを樹脂に添加し、２０分間撹拌し、次いで、排液させる。次いで、樹脂をＤＭＦ（５×２ｍＬ）で洗浄する。

（サブモノマー合成サイクル）ブロックされていないアミンを、樹脂に８５０μＬのＤＭＦ中の１．２Ｍ ブロモ酢酸を添加し、続いて１７５μＬの純粋なＮ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加することによって、アシル化する。この溶液を、３５℃で２０分間撹拌し、次いで、排液させる。次いで、樹脂を、ＤＭＦ（３×２ｍＬ）およびＤＭＳＯ（１×２ｍＬ）で洗浄する。

次いで、アシル化工程（工程１）の後に、一級アミンを用いる求核置換（工程２）が続く。洗浄した樹脂に、０．８５ｍＬのＤＭＳＯ中のアミンの２Ｍ溶液を添加する。この溶液を３５℃で３０分間攪拌し、次いで、排液させる。次いで、樹脂を、ＤＭＳＯ（３×２ｍＬ）およびＤＭＦ（１×２ｍＬ）で洗浄する。これにより、１つの反応サイクルが完了する。

アシル化／置換サイクルは、所望のオリゴマーが得られるまで繰り返される。サブモノマー合成反応スキームを、以下に示す：

（切断（５０μｍｏｌの樹脂について））合成反応および樹脂洗浄の後、樹脂をジクロロメタン（２×２ｍＬ）で洗浄し、減圧下で２時間乾燥させる。トリフルオロ酢酸の溶液（９５％、水溶液）を調製する。乾燥した樹脂を、テフロン（登録商標）ミクロ攪拌棒を含むガラスシンチレーションバイアル中に入れ、約５ｍＬの９５％ＴＦＡ水溶液を添加する。シンチレーションバイアルを、ヒュームフード中の攪拌プレート上に置く。１枚の攪拌プレートは、一度に４つまたは５つのバイアルを収容することができる。この溶液を２０分間撹拌する。切断混合物は、２０μｍポリエチレンフリットを取り付けた８ｍＬの固相抽出（ＳＰＥ）カラムを通して、５０ｍＬのポリプロピレン円錐遠心分離管中に、各サンプルについて濾過する。切断時間は、どの保護基が特定のライブラリーに存在するかによって、延長される必要があり得る。次いで、樹脂を１ｍＬの９５％ＴＦＡで洗浄し、その濾液を合わせる。次いで、この濾液を、遠心分離管中で等容量の水で希釈する。

次いで、この溶液を凍結し、そして凍結乾燥して乾燥させる。バイアルのキャップの小さな穴を刺すことによって、ポリプロピレンチューブから直接の凍結乾燥が行われ得る。次いで、乾燥した生成物を１０ｍＬの氷酢酸中に取り込み、再び凍結乾燥して乾燥させる。次いで、この２回乾燥した生成物を３ｍＬのアセトニトリル／水（１：１）中に取り込み、風袋を計った５ｍＬクライオバイアル（好ましくは、シリコーンＯリング付き）に移し、次いで、凍結乾燥して乾燥させて、一般に白色のふわふわした粉末を生成する。次いで、質量回収率（ｍａｓｓ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を算出し得、この生成物を冷蔵のためにクライオバイアル中に残したままでよい。収率を算出する目的のために、生成物がトリフルオロアセテート塩であると仮定し得る。最後の凍結乾燥前に、ＨＰＬＣサンプルおよび質量分析サンプルを調製するべきである。

材料が生物学的アッセイで試験するために使用される予定である場合、ＤＭＳＯを添加して、濃縮ストック溶液を作製する。化合物当たり１００μＭ以上の濃度の溶液が好ましい。この１００×ＤＭＳＯストックは、緩衝液中に１：１００に希釈され得、１％ＤＭＳＯおよび化合物当たり１μＭの濃度（代表的なスクリーニング濃度）のサンプル分子を含むアッセイ溶液が得られる。ＤＭＳＯは、このための優れた選択である。なぜなら、ＤＭＳＯはペプトイドを極めて良く溶解し、かつ、希釈された場合（濃度≦１％）にほとんどの生物学的アッセイに適合性であるからである。

（オリゴマー特徴づけ）個々のペプトイドオリゴマーを、Ｃ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ、５μｍ、３００Å、４．５×２５０ｍｍ）上の逆相ＨＰＬＣによって分析する。４０分で０〜８０％のＢの直線濃度勾配を、１ｍＬ／分の流速で用いる（溶媒Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）。主要なピークを収集し、エレクトロスプレーＭＳ分析に供して、分子量を決定する。

（リピトイド合成（５０μｍｏｌスケール））リピトイド１および２（Ｌ１およびＬ２）は、最終（Ｎ末端）残基がホスファチジルエタノールアミン（１級アミン）である、標準ペプトイドである。Ｌ１およびＬ２は、Ｎ末端の脂質部分としてジミリスチルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）を用いる。この基を組み込むために、Ｎ末端を、標準サブモノマー条件（上記）を用いて、ブロモアセチル化し、洗浄する。次いで、樹脂を１５％メタノール／クロロベンゼン（２×２ｍＬ）で洗浄する。

次いで、ＤＭＰＥの０．２Ｍ溶液を以下のように調製する。ＤＭＰＥ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を１５％メタノール／クロロベンゼン中に溶解して０．２Ｍの濃度にする。この化合物は双性イオンの形態であるので、アミン遊離塩基を得るために、この化合物を中和しなければならない。これは、迅速に攪拌しながら０．９２当量の５０％ＫＯＨ水溶液を添加することによって達成される。塩基付加により、少量の水が分離相として残り得るので、サンプルを遠心分離して（卓上遠心機、最大ｒｐｍで１分間）、いかなる水相をも除去すべきである。この段階で、ＤＭＰＥ溶液の純度を、ＴＬＣ（ＴＬＣ溶媒：８０／２０／０．５のＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ、ニンヒドリンで染色）によってチェックするべきである。生成物は約０．６のＲ_ｆを有するべきである。

次いで、ＤＭＰＥ（２ｍＬ）溶液を樹脂に添加する。この溶液の強力な泡立ちにより、反応物は非常に穏やかに混合される（通常、断続的なアルゴンバブリングによるかまたは回転振盪によって）。この反応物を、３５℃で一晩インキュベートする。次いで、この反応混合物を排液させ、１５％メタノール／クロロベンゼン（６×３ｍＬ）、ＤＣＥ（２×３ｍＬ）およびＤＣＭ（１×３ｍＬ）で洗浄する。切断を、標準ペプトイド条件下で行う（上記参照）。リピトイドの親油性の増加に起因して、ＨＰＬＣ分析はＣ４カラム上で行うべきである。

リピトイド３および４（Ｌ３およびＬ４）は、最後の２つのＮ末端残基が疎水性アミンで作製される標準ペプトイドである。これらのアミンを、１Ｍの濃度で１５％メタノール／クロロベンゼン中に溶解する。置換反応を、１ｍＬの溶液を用いて５０℃で２時間行い、続いて１５％メタノール／クロロベンゼン（３×２ｍＬ）およびＤＭＦ（３×２ｍＬ）で洗浄する。

（コレステロイド合成（５０μｍｏｌスケール））β‐アラニンリンカーをまず所望のペプトイド（Ｃ１について（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）_３およびＣ３について（ＮａｅＮｉａＮｉａ）_３）のＮ末端に付加し、続いてコレステロールクロロホルメートに結合させる２段階手順によって、コレステロール部分を付加する。Ｆｍｏｃ−β−アラニン（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）を、２．０ｍＬのＤＭＦ中のＦｍｏｃ−β−アラニン（０．４Ｍ）およびＨＯＢｔ（０．４Ｍ）の溶液の添加、続いて１．１当量の純粋なＤＩＣの添加によって、Ｎ末端に連結する。反応混合物を１時間撹拌し、その後、この反応混合物を排液させ、樹脂をＤＭＦ（２×３ｍＬ）で洗浄する。次いで、β−アラニン連結を繰り返し、その後に樹脂をＤＭＦ（３×３ｍＬ）およびＤＣＥ（１×３ｍＬ）で洗浄する。Ｆｍｏｃ除去の後、上記のように、次いで２．０ｍＬのＤＣＥ中のコレステロールクロロホルメート（Ａｌｄｒｉｃｈ）の０．４Ｍ溶液を添加し、続いて１当量の純粋なジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の添加によって、コレステロール部分を付加する。反応混合物を、３５℃で穏やかに一晩混合する。次いで、樹脂をＤＣＥ（５×３ｍＬ）およびＤＣＭ（２×３ｍＬ）で洗浄する。

形成されるカルバメートはわずかに酸不安定であるので、化合物の切断および取り扱いに注意するべきである。切断は、ＴＦＡ／ＤＣＥ １：１（５ｍＬ）の１０分間の添加によって行なわれる。濾液を収集し、そして樹脂を、さらなる２ｍＬの切断カクテルで洗浄する。次いで、合わせた濾液を減圧下で急速に乾燥させ、そして油状物をアセトニトリル／水（１：１）中に再懸濁する。これを直ちに凍結し（−８０℃）、凍結乾燥する。次いで、サンプルをもう一度、アセトニトリル／水（１：１）から凍結乾燥させるべきである。

（リピトイドおよびコレステロイド精製）リピトイドおよびコレステロイドを、使用前に逆相ＨＰＬＣで精製する。Ｃ４カラムが用いられ得る。１つの例において、化合物を、少量の２５％アセトニトリル／水の中に溶解し、内径５０×２０ｍｍのＩＤ ＤｕｒａＧｅｌ ＨＳ Ｃ４カラム（Ｐｅｅｋｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で精製する。４０分で３５〜８５％のＢの直線濃度勾配を、３０ｍＬ／分の流速で用いる（溶媒Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ＝アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）。合わせた生成物画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末を得る。

（脂質結合体化ポリアミド組成物の作製方法）
トランスフェクトする組成物を調製するために、脂質結合体化ポリアミド化合物ビヒクル（例えば、リピトイドまたはコレステロイドあるいは混合物）の水溶液を、実施例１に記載されるように、ｓｉＲＮＡとともに処方する。これらの成分は、好ましくは、ｓｉＲＮＡ負電荷ごとに少なくとも１．５、そして好ましくは２〜４の正のビヒクル電荷が存在するような相対量で使用される。ビヒクルに対するｓｉＲＮＡの正確な比率は、好ましくは、各細胞型について経験的に決定されるが、一般に、１．５〜２ｎｍｏｌビヒクル／μｇアンチセンスオリゴヌクレオチドの範囲である。細胞は、実施例１に記載されるように、本発明に従う組成物でトランスフェクトされ得る。本発明に従う組成物の使用に関するさらなる詳細は、以下に提供される。

（脂質結合体化ポリアミド組成物の使用）
別の局面において、細胞における標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、上記のような組成物を細胞に投与する工程を包含し、この組成物中のｓｉＲＮＡ二重鎖の１つの鎖は、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列を有する方法が提供される。細胞は、本明細書で定義されるような「被験体」に包含され得る。

脂質結合体化ポリアミド化合物（単数または複数）を含む本発明の組成物は、有効量のポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を細胞に送達し得る。本明細書中で使用される場合、用語「有効量」とは、例えば、シグナル伝達、転写、翻訳、リンパ球活性化（例えば、抗体産生などを含む）のような、生物学的応答を検出可能に誘導するのに十分であるか、または生物学的応答に関与するのに十分なポリヌクレオチドの量をいう。

ポリ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）に対する脂質結合体化ポリアミド化合物の相対量は、代表的には、組成物中のポリヌクレオチドに対する脂質結合体化ポリアミド化合物の＋／−電荷比が、約１．５以上でありかつ約１０未満であるように選択される。＋／−電荷比は、より代表的には約８未満であり、さらにより代表的には約４未満である。電荷比は、以下の式：
電荷比＝（ｎ_Ｌ×Ｍ_Ｌ）／（３．０３×Ｍ_{ｓｉＲＮＡ}）、
に従って算出され、
式中、ｎ_Ｌは、脂質結合体化ポリアミド化合物のモル数であり、Ｍ_Ｌは、脂質結合体化ポリアミド１モル当たりの正味の電荷数であり、ここで、Ｍ_{ｓｉＲＮＡ}は、ｓｉＲＮＡのマイクログラムである。

本発明の組成物は、液体または固体形態であり得、かつ、必要に応じて薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、充填剤、加工助剤、送達促進剤および重合調整剤などとして用いられ得る。適切な賦形剤としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、単糖、二糖、多糖、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、デキストロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジノン、低融点ワックス、イオン交換樹脂などおよびこれらの任意の２つ以上の組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の徹底的な議論は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＪ １９９１）において入手可能である。

さらなる薬剤、例えば、マーカー剤、栄養素などが、本組成物中に含まれ得る。例えば、生物学的に活性な薬剤がポリヌクレオチドである場合、所望の核酸のエンドサイトーシスを促進するかまたは細胞表面の核酸の結合を補助する薬剤、あるいはその両方の薬剤が、本発明の組成物中に含まれ得る。

本発明の液体組成物は、液体キャリアとの溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態であり得る。適切な液体キャリアとしては、例えば、水、生理食塩水、薬学的に許容可能な有機溶媒、薬学的に許容可能な油または脂肪、それらの混合物などが挙げられる。液体キャリアは、可溶化剤、乳化剤、栄養素、緩衝液、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、粘性調節剤、安定剤などのような、他の適切な薬学的に許容可能な添加物を含み得る。適切な有機溶媒としては、例えば、一価アルコール（例えば、エタノール）および多価アルコール（例えば、グリコール）が挙げられる。適切な油としては、例えば、大豆油、ココナッツ油、オリーブ油、ベニバナ油、綿実油などが挙げられる。非経口投与について、キャリアはまた、オレイン酸エチル、イソプロピルミリステートなどのような油性エステルであり得る。

本発明の実施における使用に適した細胞としては、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な哺乳動物細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト胚性腎臓細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスセルトリ細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳腺癌細胞、他の哺乳動物（ヒトを含む）細胞（例えば、幹細胞、特に造血細胞、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、腫瘍細胞など）などが挙げられる。

本発明におけるサンプルとしての使用に適した組織としては、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、血液、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、硬骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、目、腺、結合組織などのような、哺乳動物に由来する組織が挙げられる。

サンプルへの投与様式としては、例えば、被験体に由来するサンプルへのエキソビボ投与およびサンプルへのインビトロ投与が挙げられる。これらの投与様式を実行する方法は、当業者に周知である。例えば、被験体への形質転換細胞のエキソビボ送達および再移植は、例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１４７７８（１９９３年８月５日公開）に記載されるように達成され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「被験体」とは、細胞、細胞株（哺乳動物細胞および細胞株を含む）、無脊椎動物および鳥類および哺乳動物を含む脊椎動物（例えば、げっ歯類およびヒトなど）をいう。被験体への直接投与は、代表的には、注射（皮下に、腹腔内に、静脈内にまたは筋肉内にのいずれか）によって達成され得るか、あるいは組織の間隙に送達され得る。組成物はまた、腫瘍または病変へも投与され得る。他の投与様式としては、経口および経肺投与、坐剤および経皮適用、針および遺伝子銃またはハイポスプレーが挙げられる。

細胞へのｓｉＲＮＡ（または他のポリヌクレオチド）の送達に加えて、本発明の脂質結合体化ポリアミド化合物はまた、例えば、生物活性についてのペプチド様化合物のスクリーニング、オリゴマーの部分が標的リガンドに結合する能力を有するようにするためのバイオセンサー中への取り込みなどの用途に用いられ得る。薬物スクリーニング用途について、例えば、種々のＲ_１基を有する脂質結合体化ポリアミド化合物のライブラリーが合成され得、続いて、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１９７３５（１９９１年１２月２６日公開）（本明細書中に参考として援用される）に記載される改変ペプチドライブラリーを合成およびスクリーニングする方法に従って、生物活性についてスクリーニングされ得る。

以下の実施例は、本発明を例示はするが、いかなる様式においても限定することを意図しない。

（実施例１。標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ阻害）
Ａ．トランスフェクション混合物の調製
各トランスフェクション混合物（これらは、本発明に従う組成物の例である）については、リピトイドまたはリピトイド／コレステロイドの組み合わせ送達ビヒクルを、水中の０．５ｍＭの作業濃度に調製し、混合して均一溶液を得た。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとともに提供される緩衝液中に２０μＭの作業濃度に調製した。本実施例において、ｓｉＲＮＡは、Ａｋｔ１のｍＲＮＡに対して指向されるものであり、２つの２’Ｏ−メチルＵＵ（ＲＮＡ）ヌクレオチド３’−オーバーハングおよびホスホジエステル結合を全体にわたって含む配列ＣＡＵＡＧＵＧＡＧＧＵＵＧＣＡＵＣＵＧＧＵＧ（配列番号１）を有した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）。ｓｉＲＮＡを、マイクロチューブ中のＯｐｔｉＭＥＭ（商標）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で１μＭに希釈したか、または１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（商標）当たり約１５μｇのオリゴに希釈した。別個のマイクロチューブ中に、ビヒクル（代表的には、１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ当たり約３．７５ｎｍｏｌのビヒクルの量で）を、ｓｉＲＮＡを希釈するのに用いられた容量と同じ容量のＯｐｔｉＭＥＭ（商標）中に希釈した。本実施例において、用いられたｓｉＲＮＡおよびビヒクルの開始濃度は、結果として、用いられたｓｉＲＮＡ １μｌ当たり約１．５μｌのビヒクルになる。ビヒクルに対するｓｉＲＮＡの正確な比率は、各細胞型について経験的に決定されなければならないが、一般に、およそこの量であることに留意されたい。希釈したｓｉＲＮＡを、希釈したビヒクルに直ちに添加し、上下にピペッティングすることによって混合した。この混合物を室温で１０分間インキュベートさせた。

Ｂ．トランスフェクション
細胞を、血清を含む増殖培地中で、トランスフェクションの１日前に組織培養皿上にプレートして、トランスフェクション時に６０〜９０％の密集度を得た。ｓｉＲＮＡ／ビヒクル混合物を、標準の増殖培地容量の半分におけるｓｉＲＮＡの最終濃度が５０〜１００ｎＭになるように、混合およびインキュベーションの直後に細胞に添加した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で４〜２４時間、トランスフェクション混合物とともにインキュベートした。インキュベーションの後、トランスフェクション混合物を、血清を含む標準の増殖培地で２倍に希釈した。

図２は、Ａｋｔ１ ｍＲＮＡに対して指向されるｓｉＲＮＡが、上記のように調製したトランスフェクション組成物を用いてＭＤＡ４３５乳癌細胞へトランスフェクトされる場合の、Ａｋｔ１発現の減少を示す。３つの異なるリピトイド（Ｌ２、Ｌ３）またはリピトイド／コレステロイドの組み合わせ（Ｌ１／Ｃ１）ビヒクルと、一連の市販の送達ビヒクル（Ｘ＝リポフェクトアミン２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能；Ｙ＝ｓｉＰＯＲＴアミン、Ａｍｂｉｏｎから入手可能；およびＺ＝ｓｉＰＯＲＴリピド、Ａｍｂｉｏｎから入手可能）との有効性（すべて、トランスフェクションの間の血清の存在下または非存在下で）を比較する。コントロールは、同じビヒクルおよび条件を用いて、１００ｎＭ濃度で細胞にトランスフェクトしたｅｇ５ ｓｉＲＮＡであった。ｅｇ５ ｓｉＲＮＡは、さらなる２つのＴＴヌクレオチド３’−オーバーハングおよびホスホジエステル結合を全体にわたって含む、２本鎖のすべてのＲＮＡであって、ＤＮＡ配列ＡＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＧＴＴＡに対応する配列を有した。全ＲＮＡは、Ｒｏｃｈｅ高純度ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って抽出した。

これらの結果（正規化；ＨＰＲＴおよびＧＵＳＢの平均；Ａｋｔ１についてのメッセージレベルをハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴおよびＧＵＳＢ）のレベルの平均に対して正規化して、サンプル間の全ＲＮＡレベルにおける小さな変動を補正した）は、トランスフェクション薬剤および本発明の組成物が、血清の有無によって実質的に影響を受けず、標的遺伝子／ｍＲＮＡの発現の減少に非常に有効であることを示す。

（実施例２。ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性の減少）
トランスフェクション混合物を、ホタルルシフェラーゼ（ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ（配列番号２）；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４（２００１）より）に対するｓｉＲＮＡおよび本明細書中に記載されるような本発明に従ういくつかの異なる送達ビヒクル（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ１／Ｃ１、Ｌ４ １Ｌ１／３Ｃ１）を用いて、実質的に実施例１に記載されるように調製した。ルシフェラーゼ活性を、パッケージの指示に従ってＰｒｏｍｅｇａ二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて定量した。図３に示すように、安定にルシフェラーゼを発現するＭＤＡ２３１におけるルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡのトランスフェクションの後に、実質的に減少した。コントロールは、トランスフェクトされていない細胞株であった。この結果は、細胞へのｓｉＲＮＡの有効な送達のための本発明に従う組成物の能力の指標をさらに提供する。

（実施例３：ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞におけるＡｋｔ１メッセージのノックアウト）
表１は、本発明に従う組み合わせリピトイド／コレステロイド送達ビヒクルを含む組成物によって、かつ市販のトランスフェクション薬剤（Ｆｕｇｅｎｅ６、Ｒｏｃｈｅから入手可能）を用いることによって、ｓｉＲＮＡｓでトランスフェクトされた細胞におけるＡｋｔ１メッセージのノックアウトの有効性を比較するために行った実験についてのデータを示す。ＨＴ１０８０細胞を、実施例１に記載のトランスフェクション混合物の調製およびトランスフェクション手順に実質的に従う組み合わせリピトイド／コレステロイド送達ビヒクル（１Ｌ１／３Ｃ３）を含む組成物を用いて、１００ｎＭの２つの異なるｓｉＲＮＡ（２つのＴＴヌクレオチド３’−オーバーハングおよびホスホジエステル結合を全体にわたって含むかまたは２つの２’Ｏ−メチルＵＵ（ＲＮＡ）ヌクレオチド３’−オーバーハングおよびホスホジエステル結合を全体にわたって含む、配列ＣＡＵＡＧＵＧＡＧＧＵＵＧＣＡＵＣＵＧＧＵＧ（配列番号１）を有するＡｋｔ１メッセンジャーＲＮＡに対して指向されるｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。ｍＲＮＡレベルの約６９〜８３％の減少が、本発明に従う組成物について観察された。これらの結果は、本発明に従う組成物が、市販のＦｕｇｅｎｅ６薬剤よりもＡｋｔ１ ｍＲＮＡのノックアウトにはるかに有効であることを示す。
表１

前述の発明は、理解を明瞭にする目的のためにかなり詳細に記載されているが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内でなされ得ることは明白である。本発明のプロセスおよび組成物の両方を実施する多くの代替的方法が存在することに留意するべきである。従って、本実施形態は限定ではなく例示とみなされるべきであり、本発明は、本明細書中に記載される詳細に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲の範囲および等価物内で改変され得る。

上に引用された特許、特許出願およびジャーナル論文の各々の内容は、あたかもその全体が完全に示されるように、参考として、かつすべての目的のために、本明細書中に援用される。

図１は、本発明の組成物および方法におけるｓｉＲＮＡキャリアとして有用な脂質カチオン性ペプトイド結合体（「リピトイド」および「コレステロイド」）の選択を示す。 図２は、Ａｋｔ１ ｍＲＮＡに対して指向されるｓｉＲＮＡが、本発明によるトランスフェクション組成物を用いてＭＤＡ４３５乳癌細胞中にトランスフェクトされる場合に、Ａｋｔ１発現の減少を示すプロットである。 図３は、本発明に従ってホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡおよびいくつかの異なる送達ビヒクルを用いて調製したトランスフェクション混合物で処理した細胞における、ルシフェラーゼ活性を示すプロットである。

Claims (7)

1. 組成物であって、以下：
   少なくとも２つの脂質カチオン性ペプトイド結合体の混合物
   を含み、該少なくとも２つの脂質カチオン性ペプトイド結合体の各々が、以下の式：
   

   

   またはその位置異性体であって、
   式中、第１化合物において、Ｌは８炭素原子長と２４炭素原子長との間の少なくとも１つの脂肪族アルキル鎖または脂肪族アルケニル鎖を含む非ステロール脂質部分であり、かつ、
   第２化合物において、Ｌはステロール部分であり；
   各基Ｒは、アルキル、アミノアルキルおよびアラルキルから独立して選択され、そして
   Ｘは、
   直接結合、
   オリゴペプチド、
   ２〜３０結合長の直鎖状のアルキル鎖、ならびに
   アルキル結合と、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ジスルフィド、ペプチドおよびエーテルからなる群より選択される１つ以上の結合とからなる、２〜３０結合長の直鎖
   からなる群より選択される、
   組成物。
2. 前記組成物中の第１化合物 対 第２化合物の比が、５：１〜１：５である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物中の第１化合物 対 第２化合物の比が、１：１〜１：３である、請求項２に記載の組成物。
4. 前記組成物中の第１化合物 対 第２化合物の比が、１：１である、請求項１に記載の組成物。
5. 前記組成物中の第１化合物 対 第２化合物の比が、１：３である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記脂質カチオン性ペプトイド結合体が、以下：
   リピトイド１またはＬ１ ＤＭＰＥ（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）_３
   リピトイド２またはＬ２ ＤＭＰＥ（ＮａｅＮｉａＮｉａ）_３
   リピトイド３またはＬ３ ＮｔｄＮｈｄ（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）_３
   リピトイド４またはＬ４ ＮｄｄＮｏｌ（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）_３
   コレステロイド１またはＣ１ Ｃｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）_３
   コレステロイド３またはＣ３ Ｃｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｉａＮｉａ）_３
   およびこれらの組み合わせ
   として本明細書中に示される化合物からなる群より独立して選択される、請求項１に記載の組成物。
7. 前記組成物がＬ１およびＣ１からなる、請求項６に記載の組成物。

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