CN101538568B - 抑制人膜铁转运蛋白的rna、重组体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制人膜铁转运蛋白(FPN1)表达的小干扰性RNA。本发明进一步公开了编码所述小干扰性RNA的相应shRNA的DNA以及能表达所述RNA的重组体。本发明的小干扰性RNA、DNA以及重组体能够有效抑制体内人膜铁转运蛋白表达、抑制铁的释放与代谢，调节体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、生物医药及基因工程技术领域，具体涉及利用逆转录病毒(Retrovirus)介导的RNA干扰技术，构建针对人膜铁转运蛋白(FPN1)基因的逆转录病毒干扰体系(Retro-FPN)，并将其运用到铁代谢相关疾病的药物开发制备当中。
背景技术
RNAi指的是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。
RNA干扰过程主要有2个步骤：(1)长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA(small interfering RNA，siRNA)。(2)小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，该复合体可识别与小干扰性RNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。
1998年，安德鲁·法厄(Andrew Z.Fire)等在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正链或反链RNA显示出了更强的抑制效果(Fire et al.，1998)。从与靶mRNA的摩尔比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。随后，又相继发现具有RNase III活性的Dicer可将长的双链RNA加工成称之为siRNA(small interfering RNA)的21～23nt及3′端突出的短的双链RNA，siRNA与若干个蛋白组成称之为RISC复合物(RNA-induced silencing complex)的RNA蛋白复合物，并由该复合物主导RNAi效应。2001年，Tuschl等将短的siRNA导入到哺乳动物细胞中并由此解决了在哺乳细胞内导入长的双链RNA时引发的干扰素效应，由此拓展了RNAi在基因治疗上应用前景。RNAi机制普遍存在于生物种中，因此被认为是进化上相对保守的基因表达调控机制。一种假说为，RNAi机制是作为在RNA水平上抵御病毒入侵的防御机制而存在的。目前发现，RNAi机制中的相关一些因子如内源性
双链RNA及蛋白因子可以在多种层次上对基因表达进行调控，其范围已经超越了PTGS(post transcriptional gene silencing)，如RNAi机制同样参与了转录水平上的基因表达调控过程中。2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛(Craig C.Mello)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
由外界导入的长的双链RNA首先被称作Dicer并具有RNaseIII活性的RNA酶切割成21～23碱基对的小的双链RNA，这种RNA被称作smallinterfering RNA(siRNA)，其特征是3′端相对于互补链突出两个碱基。完成上述过程后，siRNA上结合RNAi蛋白因子，并形成称为RISC(RNA-induced silencing complex)的RNA-蛋白复合物。在RISC复合物中，siRNA依赖于ATP/或ATP非依赖性的转换为单链，进而RISC被活化。活化型RISC受已成单链的siRNA引导(guide strand)，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇(Drosophila melanogaster)RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性(slicer activity)，RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫(C.elegans)的RNAi中必须的因子有EGO1，这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。
RNAi在基因沉默方面的具有高效性和简单性，所以是基因功能研究的重要工具。大多数药物属于靶标基因(或疾病基因)的抑制剂，因此RNAi模拟了药物的作用，这功能丢失(LOF)的研究方法比传统的功能获得(GOF)方法更具优势。因此，RNAi在今天的制药产业中是药物靶标确认的一个重要工具。同时，那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身还可以被进一步开发成为RNAi药物。
在药物靶标发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。如可通过RNAi文库介导的肿瘤细胞生长来发现能抑制肿瘤的基因。一旦所发现的基因属于可用药的靶标(如表达的蛋白在细胞膜上或被分泌出细胞外)，就可以针对此靶标进行大规模的药物筛选。此外，被发现的靶标还可用RNAi技术在细胞水平或动物体内进一步确认。在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗，如老年视黄斑退化。然而要将RNA干扰技术运用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题。
shRNA即短发夹RNA(short hairpin RNA)。在RNAi感染过程中，产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA，这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分隔，组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工成siRNA，从而降解目的基因抑制其表达。
1831年，Fordisch证明缺铁性贫血患者血液中铁含量比健康人低，确认了铁是人体必需微量元素之一。铁广泛参与机体的代谢过程，如血红蛋白、肌红蛋白、激素以及DNA等的合成，还能增强中性粒细胞杀菌及吞噬功能，维护T、B细胞增殖、分化及抗体的产生(Folin等.1991)。长期以来，人们对铁与健康的关系，多着眼于铁缺乏的危害，如导致缺铁性贫血、缺铁吞咽困难综合征等疾病。然而，近年来有关铁过多引起的健康问题越来越引起人们的关注，研究发现，过多的铁会产生有毒性的自由基，继而损伤细胞，造成遗传性血色素病、神经退行性疾病等。因此，体内必需具有严格的调节机制，以保持铁代谢的平衡。膜铁转运蛋白(Ferroportin1，FPN1)，又称铁调节转运体1(Fe2regulated transporter1，IREG1)或金属转运蛋白(metaltransport protein1，MTP1)，是一种跨膜的铁输出蛋白。
2000年，三个研究小组几乎同时分离鉴定了编码该蛋白的基因。Donovan等首先采用定位克隆的方法从低血色素贫血的斑马鱼中分离鉴定出导致该症的基因，命名为Ferroportin1(FPN1)。与此同时，Abboud和McKie等分别用指数富集配体系统进化技术和消减杂交法鉴定了该基因，并分别命名为MTP1和REG1。目前对Ferroportin的研究已成为铁代谢研究的热点问题之一。
人的FPN基因定位于2号染色体上，长度20kb，含8个外显子，其mRNA的5’末端非翻译区含有一个典型的铁反应元件IRE。FPN mRNA编码的蛋白有571个氨基酸，分子量约62000，至少含有10个跨膜结构域，是一种膜蛋白。
FPN1广泛分布于机体多种组织中，其主要功能可能与机体的铁代谢有关，有可能是细胞内铁输出细胞的唯一通道，其在铁代谢中有着非常独持的重要地位。此外，FPN1也可能参与锌、铜等金属离子的转运。铁转运紊乱导致的疾病如斑马鱼的低血色素贫血，人的遗传性血色素沉着症等均与FPN异常有关。根据现有的研究资料，FPN1主要功能有以下几方面：
(一)铁离子转运功能
DMT1是哺乳动物细胞摄取铁的蛋白。那么铁的释放又是如何进行的呢？在一些已经进行的研究当中，将非洲爪蟾的卵母细胞预先负载55Fe，然后分别注射FPN1 cRNA和DMT1 cRNA，在铜蓝蛋白和转铁蛋白的存在下，注射FPN1 cRNA的卵母细胞将80％的55Fe释放出来，而注射DMT1cRNA的卵母细胞，则极少释放55Fe。Donovan等也证明了表达FPN1的卵母细胞释放铁的量比不表达FPN1的要高5倍。这些结果证明FPN1蛋白具有将铁从细胞内释放出来的功能。FPN1在与铁吸收密切相关的组织内的表达也进一步说明了它的铁转运功能。FPN1在十二指肠绒毛细胞的基底膜，特别是肠绒毛顶端吸收细胞的基底膜有表达，在空肠、回肠不表达。肝和脾也有较多的FPN1表达。小鼠免疫组化表明，FPN1表达在枯否细胞的细胞质，肝细胞表面靠近肝血窦一侧和脾的巨噬细胞。肝和脾在铁的再循环中发挥重要的作用，肝的枯否细胞、脾的巨噬细胞可吞噬衰老的红细胞，在溶酶体的作用下将红细胞裂解，血红蛋白降解后在血红素氧化酶的作用下释放铁。因此FPN1在这些部位的表达表明其可能与铁的贮存和重新利用有关。FPN1在胎盘合体滋养层细胞也有表达，并且在妊娠的最后三个月最高，这一时期也是胎儿需要铁较多的时期，这表明FPN1在铁从母体到发育的胎儿的转运中有着重要作用。急慢性肺病患者机体的铁都有高度积累，由铁引起的自由基产生将导致组织伤害，铁的正常转运对肺的防御功能很重要，因此，FPN1在肺和支气管上皮细胞也有表达，并受铁的正调控。
(二)其它功能
许多金属转运体并非专一的转运铁。如Gunshin等证明，在转染DMT1的爪蟾卵母细胞中，DMT1对Mg2+、Co2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+也有转运功能。因此，FPN转运其它离子的功能有待研究。FPN1还具有一个NADP/腺嘌呤结合位点序列IFVCGP，该结构域在NADH和NADPH还原酶家族(包括酵母铁还原酶和嗜中性白细胞氧化还原酶)中都存在，这表明FPN可能具有铁转运还原酶活性。二价和三价铁都存在于细胞复杂的平衡之中，这两种氧化还原价态之间的转化在铁的转运和螯合中有很重要的作用。
FPN1的发现对铁超载或铁缺乏疾病的诊断和治疗有重要的医学应用前景。例如，斑马鱼weh突变导致低血色素贫血症，人类也存在相似的由FPN1突变引起的疾病。最近，有研究表明，在第2号染色体上人的FPN1基因的第5个外显子内734位核苷酸突变，引起氨基酸的改变(Asp变为His)。这一改变可能引起过多的铁被转运进入血液循环，因此导致遗传性血色素病的病症。显然，FPN1的发现有助于相关疾病的诊断和治疗。
很多先天性或者后天性的铁相关疾病都与FPN1有关，传统的药物无法达到治疗效果，或者仅仅可以减轻患者的症状，因此，迫切需要开发新的给药形式。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供一种能够有效抑制体内人膜铁转运蛋白表达、从而调节体内铁水平的RNA。
本发明的另一目的在于提供编码上述RNA的DNA。
本发明的再一目的在于提供具有优良的靶向性、安全性以及持续表达上述RNA、进而抑制人膜铁转运蛋白(FPN1)表达的重组体。
本发明的再一目的在于提供上述RNA、DNA以及重组体在制备药物方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种抑制人膜铁转运蛋白(FPN1)表达的RNA，所述RNA含有以下序列：
Seq ID No.1：5’-AGACUAUAAUGAUAACACU-3’
在本发明的具体实施方式中，所述RNA为含有以下双链结构的siRNA：
5’-AGACUAUAAUGAUAACACU-3’
3’-UCUGAUAUUACUAUUGUGA-5’
优选地，所述siRNA具有以下结构：5’-AGACUAUAAUGAUAACACU□□-3’
3’-□□UCUGAUAUUACUAUUGUGA-5’
其中□□为3’端的两个突出碱基，可以为AA或UU，或本领域技术人员所熟知的其他形式。
或者，在本发明另外的实施方式中，所述RNA为同时含有Seq ID No.1以及Seq ID No.1的反向重复序列的短发夹RNA(shRNA)。
所述shRNA优选含有以下序列：
Seq ID No.2：
AGACUAUAAUGAUAACACUUUCAAGAGAGUGUUAUCAUUAU AGUCU
本发明还公开了编码所述RNA的DNA。
优选的，所述DNA含有序列表中Seq ID No.3和/或Seq ID No.4所示的序列。
本发明还公开了一种抑制人膜铁转运蛋白表达的重组体，所述重组体含有上述的DNA以及基因转移载体。
所述基因转移载体优选为病毒性载体，更优选为逆转录病毒载体。
本发明进一步公开了上述RNA、上述DNA以及上述重组体在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用。
所述铁代谢紊乱疾病是指血清铁水平高而导致的铁代谢紊乱疾病，或者是指FPN1过量表达而导致的铁代谢紊乱疾病。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备了以下有益效果：
本发明的RNA，特别是siRNA及shRNA，以及编码shRNA的DNA及重组体能够有效抑制体内人膜铁转运蛋白表达、抑制铁的吸收与代谢，并降低体内的血清铁水平，从而达到治疗铁代谢相关疾病的目的。
本发明设计的shRNA经过体内以及体外实验证明，能有效的抑制FPN1表达，有效的调节血清铁的水平。
附图说明
图1是Retrovirus逆转录病毒载体的多克隆位点图；
图2是Retro-FPN1i系统感染体细胞后，FPN1蛋白的表达情况图；
图3是利用retro-FPNi处理细胞的体外同位素实验结果图，显示同位素Fe55的释放出现明显的抑制。
图4是通过高铁饲料饲养SD大鼠，构建高血清铁动物模型，然后利用Retrovirus-FPN1i系统进行体内实验，降低血清铁水平结果图。
具体实施方式
本发明利用铁代谢相关疾病的发病机理，有针对性的调节FPN1的表达，设计特定的小干扰性RNA以及编码shRNA的DNA，从而降低血清铁对于细胞的损害。本发明的小干扰性RNA以及DNA所编码的shRNA，能特异性的识别序列：AGACTATAATGATAACACT，该序列位于FPN1(NM_014585.3)第2379-2397碱基处。
要将RNA干扰技术运用于临床治疗，就需要解决RNA干扰片段表达持续以及表达效率等重要问题。我们利用失活逆转录病毒载体携带RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成shRNA，完美的解决了RNA干扰基因治疗的靶向性、安全性以及表达持续性的问题。
在本发明中，我们采用逆转录病毒作为基因转移载体，逆转录病毒载体具有广泛的宿主细胞以及高的转导效率和持续且可控制的基因表达等特点，是一种非常适合用于生物药品开发的优良基因转移载体。通常而言，基因转移载体可分两大类：病毒性载体和非病毒性载体。非病毒性载体的方法包括裸DNA注射、基因枪法、多聚赖氨酸或阳离子脂质体包裹DNA法等。一般非病毒性载体毒性成分少，且较安全。但它们存在共同的弱点：效率低且携带基因表达时间短。所以目前研究仍是一些病毒性载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等。逆转录病毒应用最早，研究也相当成熟，目前仍被广泛应用。逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的上佳选择。最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。而另几种整合载体——例如腺相关病毒，以同源重组的方式整合，整合过程中病毒基因组发生重排，可能会影响到外源基因的结构与功能。因此，如果能实现有效的基因转移，基因治疗在对付遗传性疾病、减缓肿瘤发展、战胜病毒性感染和终止神经系统退行性病变等方面都会有广阔的应用前景。
本发明通过合成干扰片段，将片段连接至逆转录病毒载体当中。转染重组体入Phoenix细胞，获取病毒上清，体外以及体内实验证明能够有效抑制FPN1。
在本发明优选的实施方式中，构建了人膜铁转运蛋白(FPN1)的逆转录病毒干扰体系(Retro-FPN1i)，并取得了良好的抑制效果。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
根据人膜铁转运蛋白(FPN1)序列(NM_000617.1)，设计模板链与编码链。分别于5’端加上BglII与XhoI酶切位点，送Invitrogen公司合成序列。经过筛选，获得干扰效果最为显著的本发明的FPN1干扰片断序列如下：
模板链(Seq ID No.3)：
5’-GATCCCCAGACTATAATGATAACACTTTCAAGAGAGTGTTATCA TTATAGTCT TTTTTTA-3’
编码链(Seq ID No.4)：
5’-AGCTTAAAAA AGACTATAATGATAACACT TCTCTTGAAGTGTTATCATTATAGTCT GGGG-3’
实施例2
Retro-FPN1i系统构建
一、将合成的FPN1干扰片段(Seq ID No.3及Seq ID No.4)进行退火。具体步骤如下：
1.建立退火系统
5ul 10x 退火 buffer
2nmole 模板链Seq ID No.3
2nmole 编码链Seq ID No.4
用三蒸水补足至50ul。
2.放入PCR仪，95℃5分钟，75℃5分钟，55℃5分钟，42℃5分钟，37℃15分钟，之后逐步递减温度至室温。
3.制12％1x TAE聚丙烯酰胺胶，取10ul上述退火产物跑胶200V1h。银染观察退火条带。置于-80℃保存退货产物。
三、酶切(XbaI与XhoI)逆转录病毒载体(图1所示)，胶纯化回收后，用T4连接酶与退火产物室温连接24小时，经转化筛选之后，获得正确克隆。送Invitrogen公司测序鉴定，命名为Retro-FPN1i系统。具体操作步骤如下：
1.构建质粒酶切体系
Bgl II 10U
Xho I 10U
10x Buffer5ul
BSA 0.5ul
Retro质粒(pSUPER) 10ul
用水补足50ul，37℃，2h。
3.利用试剂盒(invitrogen)胶纯化上述酶切产物。
4.构建连接系统
10x Buffer 2ul
T4连接酶 1ul
Retro酶切产物 1ul
退火产物 5ul
用水补足20ul，16℃，16h。
4.取5ul连接产物转化感受态细胞，涂板后，氨苄青霉素筛选。
5.挑取阳性克隆，小量扩增质粒。
6.用EcoR I与Xho I酶切鉴定质粒，选择阳性结果质粒，测序保存。
实施例3
重组逆转录病毒Retro-FPN1i的生产流程
1、接种Phoenix细胞1.5X107个细胞于9cm培养皿(Corning)中，37℃，5％CO2培养过夜；
2、转染前20分钟换新鲜培养基；
3、取20ul上述Retro-FPN1i与DMEM培养基500ul混匀，标记为A管，另取20ul脂质体与500ul DMEM培养基混匀，标记为B管。将A管与B管混匀，室温放置30min，将混合物轻轻加入第1步中的9cm培养皿的培养基中，培养过夜；
5、24小时后加7.5ml培养基继续培养48小时；
6、收集细胞上清并用0.45um滤器过滤，细胞可以扩大培养，持续收取病毒上清。
7、测定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl调整细胞滴度至1000VP/ml。
8、包装入2ml西林瓶中(每瓶含1ml)，保存于-80℃。
9、对病毒进行热源检测、微生物检测，确保无热源，无细菌、真菌、野生病毒污染。
实施例4
重组逆转录病毒Retro-FPN1i体外实验
复苏神经元细胞株P12，接种于6孔板，每孔1X106个。取Retro-FPN1i慢病毒液，按照每毫升培养基加1ul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12细胞培养基中，轻轻左右混匀，以充分感染细胞株，分别处理0h、6h、12h、24h、48h，收集细胞，利用real-time PCR技术进行定量测定FPN1mRNA表达情况，以0h为对照组，可见FPN1的表达在12h之后受到明显的抑制。如图2。
实施例5
重组逆转录病毒Retro-FPN1i体外铁释放实验
复苏神经元细胞株P12，接种于6孔板，每孔1X106个。将细胞分成两组，一组加PBS，一组加Retro-FPN1i慢病毒液，按照每毫升培养基加1ul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12细胞培养基中，轻轻左右混匀，以充分感染细胞株。按照0h、12h、24h、48h的时间点进行Fe55同位素释放实验，发现在24小时后，铁的释放开始受到抑制，48小时后出现明显抑制。如图3.
实施例6
重组逆转录病毒Retro-FPN1i体内实验
选择3月龄SD大鼠雄雌各20只，高铁饲料喂养一个月，构建高铁模型，之后按照性别随机分为两组。
实验组注射retro-FPN1i病毒液，每次剂量为500ul病毒液(1000VP/ml)，每3天注射一次，3次为一疗程；对照组注射PBS等渗盐水；
一疗程结束后，分别于3、6、9、12、15、18天处死大鼠取脑组织测铁，并采集血清按常规方法利用血清生化仪测定血清铁浓度。
结果发现，与对照组比较，从第6天开始，由于铁的吸收以及释放受到抑制病毒组血清铁浓度开始下降，但是脑组织的铁含量有显著上升。如图4所示。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110>钱忠明，葛啸虎，柯亚
<120>抑制人膜铁转运蛋白的RNA、重组体及其应用
<130>081010
<160>4
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
<210>2
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>61
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
Claims (8)
1.一种抑制人膜铁转运蛋白FPN 1表达的RNA，其特征在于：所述RNA的序列为Seq ID No.1所示的序列，
Seq ID No.1：5’-AGACUAUAAUGAUAACACU-3’；
或者，所述RNA为siRNA，其序列为：
5’-AGACUAUAAUGAUAACACU-3’
3’-UCUGAUAUUACUAUUGUGA-5’；
或者，所述RNA为siRNA，其序列为：
5’-AGACUAUAAUGAUAACACU□□-3’
3’-□□UCUGAUAUUACUAUUGUGA-5’，其中□□为3’端的两个突出碱基，所述□□为AA或UU；
或者，所述RNA为同时含有Seq ID No.1及其反向互补序列的shRNA，且所述shRNA的序列为：
Seq ID No.2：
5’-AGACUAUAAUGAUAACACUUUCAAGAGAGUGUUAUCAUUA UAGUCU-3’。
2.编码权利要求1中任意一项所述RNA的DNA。
3.根据权利要求2所述的DNA，其特征在于：所述DNA为序列表中Seq ID No.3或Seq ID No.4所示的序列。
4.一种抑制人膜铁转运蛋白表达的重组体，其特征在于：所述重组体含有权利要求2或3所述的DNA以及基因转移载体。
5.根据权利要求4所述的重组体，其特征在于：所述基因转移载体为逆转录病毒载体。
6.权利要求1中任意一项所述的RNA在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用，所述铁代谢紊乱疾病是指血清铁水平高而导致的铁代谢紊乱疾病，或者是指FPN1过量表达而导致的铁代谢紊乱疾病。
7.权利要求2或3项所述的DNA在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用，所述铁代谢紊乱疾病是指血清铁水平高而导致的铁代谢紊乱疾病，或者是指FPN1过量表达而导致的铁代谢紊乱疾病。
8.权利要求4或5所述的重组体在制备用于治疗铁代谢紊乱疾病的药物中的应用，所述铁代谢紊乱疾病是指血清铁水平高而导致的铁代谢紊乱疾病，或者是指FPN1过量表达而导致的铁代谢紊乱疾病。
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- 2008-08-19 CN CN2008101419110A patent/CN101538568B/zh not_active Expired - Fee Related
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