CN103667286B

CN103667286B - 日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN103667286B
Application number: CN201210343029.0A
Authority: CN
Inventors: 傅志强; 吴秀娟; 林矫矫; 洪炀; 石耀军; 陆珂
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2032-09-14
Also published as: CN103667286A

Abstract

本发明公开了日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，该siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。本发明还公开了日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA的应用。本发明日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，可明显抑制Sj PGMRC2基因的转录，并能获得24％的减虫率，适用于制备治疗血吸虫病的药物。

Description

日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫PGMRC2(膜相关的孕酮受体组件2)基因的siRNA及其应用。

背景技术

日本血吸虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病。虽然我国在血吸虫病的防治上已经取得了巨大成就，但是由于中间宿主钉螺难以消灭及血吸虫重复感染现象严重，全面控制血吸虫病传播的前景仍不容乐观。吡喹酮自问世以来，以其高效、低毒、使用方便、价格低廉等优点在血吸虫病临床治疗和防治工作中得到广泛应用，并成为目前治疗血吸虫病的唯一药物，20多年来，未见有新的治疗血吸虫病的药物出现。然而，近年来在曼氏血吸虫上已经有了吡喹酮抗性虫株的报道，耐药虫株的出现引起了人们的不安与高度关注。因此，有必要寻找新的治疗血吸虫病的药物。

PGMRC2(膜相关的孕酮受体组件2)以及和其密切相关的PGMRC1属于膜相关的孕酮受体家族(MAPR)，该天然蛋白首次从猪的肝脏细胞中纯化得到，并随后证实存在于多种真核动物中，包括线虫、昆虫、酵母菌和拟南芥等，其氨基酸序列拥有一个信号横跨膜结构和潜在的细胞色素b5的结合位点。该蛋白对孕酮有高亲和力，这种亲和力是相对于睾酮或者糖皮质激素的2-10倍，而且还可以结合其他分子例如亚铁血红素、胆固醇等。对于PGMRC1功能的研究，有证据表明，其可能参与并调节了大鼠粒层细胞中孕酮介导的抗细胞凋亡的过程并且其可能是哺乳动物精子顶体反应中孕酮感应的中间物。

RNA干扰(RNAi)技术目前已经在功能基因组学、基因治疗、微生物学研究和药物研发等领域里取得了令人瞩目的进展。RNA干扰是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制，是双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异的靶基因转录后基因沉默的过程。将与靶基因转录的产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。所谓的小分子干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，是能够以同源互补序列mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片段双链RNA分子，通常由20多个核苷酸组成，能进行特异性的转录后基因沉默。SiRNA已经广泛应用于基因表达调控机制研究等领域。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，该siRNA可明显抑制SjPGMRC2基因的转录，可用于制备治疗血吸虫病的药物。

此外，还需要提供一种日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

优选的，所述siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗血吸虫病的药物，所述药物的活性成分为：通过RNA干扰抑制日本血吸虫PGMRC2基因表达的siRNA，该siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用，该siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA在制备预防血吸虫病的药物中的应用，该siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，可用于干扰日本血吸虫PGMRC2基因转录、表达及血吸虫的生长发育，小鼠的体内RNA干扰实验表明，该siRNA能获得24％的减虫率，适于制备治疗血吸虫病的药物。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1实时定量PCR分析体外干扰效果图；

图2是本发明实施例2实时定量PCR分析体内干扰效果图；

图3是本发明实施例2用Western-blotting分析体内蛋白表达的干扰效果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

实施例1体外RNA干扰

1.siRNA分子的设计

根据日本血吸虫PGMRC2基因序列(GeneBank：FN317689.1)设计四对siRNA分子(见下表1)，NC-RL siRNA分子为无关对照，siRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。

表1siRNA序列

1.2虫体的收集

采用腹部贴片攻击感染新西兰大白兔，每只感染5000条日本血吸虫尾蚴左右。感染第14天后剖杀，采用肝静脉灌注法收集到的虫体，先用含有双抗的温的PB S快速清洗一次，然后在超净台中用童虫培养基洗涤三次。

1.3兔红细胞的处理

①注射器吸取0.1ml肝素，从新西兰白兔耳缘静脉采血1ml，转移到灭菌EP管中；

②在超净台中将新鲜血液分装，每管0.5ml血液，然后各加0.5ml灭菌PBS，轻轻颠倒混匀。

③4℃5000rpm离心6min，弃上清；

④重复上述步骤，直至离心后上清清亮为止。

1.4体外干扰

采用浸泡培养的方法，筛选小RNA干扰分子，具体步骤如下：①将无菌清洗后的虫体迅速转移到6孔培养板中，每孔100条虫体为宜；②实验共分为5组，即S60、S117、S441、S485干扰组、无关干扰对照组及空白对照组。每组重复三个孔。③分别向不同的孔中加入相应siRNA分子，同时各加一滴1.3步骤中的红细胞；④每24h更换童虫培养基，并观察虫体的存活情况，干扰48小时后，收集虫体，提取总RNA，利用实时定量PCR检测基因干扰效果。

2.结果：收集体外浸泡的siRNA干扰组、无关干扰组、空白对照组的虫体，提取RNA，利用实时定量PCR检测SjPGMRC2基因被干扰的情况，结果如图1所示。由图1结果可知，编号为Sj60的siRNA干扰效果较好，SjPGMRC2基因转录受到了显著抑制，随后选择编号为Sj60的siRNA进行体内干扰试验。

实施例2体内RNA干扰

1.方法步骤

BALB/c小鼠分成三组，分别为空白对照组、无关干扰对照组和siRNA处理组，每组五只小鼠。采用腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染约100条。在感染后的第13天开始，空白对照组小鼠每天尾静脉注射0.1ml PBS溶液(pH＝7.4)，无关干扰对照组小鼠每天尾静脉注射0.1ml NC-RL(50ug)/PBS(pH＝7.4)溶液，siRNA处理组小鼠每天尾静脉注射0.1ml SjPGMRC2基因siRNA(50ug)/PBS(pH＝7.4)溶液。连续注射7次后，剖杀，肝门静脉灌注法冲虫，观察，计算虫体数。同上，运用Real-timePCR检测PGMRC2基因在转录水平的变化，Western-blot免疫印迹检测PGMRC2基因在蛋白表达水平的变化。

2.结果：体内干扰实验的结果表明，小鼠尾静脉注射编号为Sj60的siRNA后诱导了部分减虫率如表2所示。与空白对照组相比，编号为Sj60的siRNA分子干扰组获得24％的减虫率(P＜0.05)，而无关干扰组只有10.48％的减虫率(P＞0.05)。

表2体内干扰诱导的减虫效果

收集Sj60小分子干扰组、无关干扰组、空白对照组小鼠来源的日本血吸虫虫体，反转录提取RNA，利用实时定量PCR分析体内干扰的效果(图2)。结果可见，Sj60处理组小鼠来源的虫体中SjPGMRC2基因转录得到了抑制。

对收集到的虫体进行Western-blotting分析，结果表明应用编号为Sj60的siRNA处理的小鼠体内来源的血吸虫的天然PGMRC2蛋白的表达受到一定抑制(图3)，而在对照组虫体中，该蛋白表达无明显变化，其结果和Real-time PCR结果基本相符。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所

<120> 日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA及其应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcccaaucaa cuuaacucut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

agsguuaagu ugauugggct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggccauuauu gagaaggaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uuccuucuca auaauggcct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgagcguua cgaucauaut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

auaugaucgu aacgcucggt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccucaucgga uuuaugaaat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

uuucauaaau ccgaugaggt t 21

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcgacgaucu gccuaagaud tdt 23

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

aucuuaggca gaucgucgcd tdt 23

Claims

1.一种日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA选自下述的一对或任意两对以上的组合：

SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种治疗血吸虫病的药物，其特征在于，所述药物的活性成分为：通过RNA干扰抑制日本血吸虫PGMRC2基因表达的siRNA，该siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA在制备治疗血吸虫病的药物中的应用，所述siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.权利要求1所述日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA在制备预防血吸虫病的药物中的应用，所述siRNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。