CN114366755B - miRNAPC-3p-4759_93的应用 - Google Patents

miRNAPC-3p-4759_93的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114366755B
CN114366755B CN202210070208.5A CN202210070208A CN114366755B CN 114366755 B CN114366755 B CN 114366755B CN 202210070208 A CN202210070208 A CN 202210070208A CN 114366755 B CN114366755 B CN 114366755B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
virus
influenza
mice
mouse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210070208.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114366755A (zh
Inventor
李玲
马心悦
尹抗抗
朱梦晨
黄家望
卢芳国
陈雨露
程莉娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hunan University of Chinese Medicine
Original Assignee
Hunan University of Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan University of Chinese Medicine filed Critical Hunan University of Chinese Medicine
Priority to CN202210070208.5A priority Critical patent/CN114366755B/zh
Publication of CN114366755A publication Critical patent/CN114366755A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114366755B publication Critical patent/CN114366755B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了miRNAPC‑3p‑4759_93的激动剂在制备治疗肺损伤药物中的应用，所述miRNAPC‑3p‑4759_93的激动剂如SED ID NO1所示。本发明根据miRNA PC‑3p‑4759_93微小RNA制备出的模拟物能够治疗肺损伤，特别是由流感病毒感染包括人在内的哺乳动物引起的肺水肿、肺出血、急性肺损伤和严重呼吸窘迫综合症等肺损伤疾病。

Description

miRNAPC-3p-4759_93的应用
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是涉及miRNA PC-3p-4759_93微小RNA抵抗病毒性肺损伤中的应用前景。
背景技术：
microRNAs(miRNAs)是一组内源性非编码RNA，长度约为20～22个核苷酸，其主要功能是参与基因转录后的调控。miRNA在外泌体中稳定存在，随外泌体循环并被邻近或远处的细胞摄取，参与受体细胞的增殖、分化、迁移等活动，调控疾病的发生和进展。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。
甲型流感为常见流感病毒，对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。H1N1流感病毒通过激活NF-KB信号通路引起过度的免疫反应,释放TNF-α、IFN-α/ β、MIP-1、IP-10、IL-1β、IL-6等细胞因子，产生“细胞因子风暴”,导致肺损伤。而有研究表明H5N1流感病毒通过肺泡上皮细胞自噬性死亡、RAS系统紊乱、或者病毒感染后期的高细胞因子症状共同造成急性肺损伤。
已有研究证实，miRNA可以抑制流感病毒在宿主细胞中的传播。如miR-323、miR-491 和miR-654通过与A型流感病毒转录物(PB1)基因的保守区域结合来抑制感染了A型流感病毒的犬肾细胞(MDCK)中的病毒复制。非典型miRNA miR-2911显示出通过直接靶向A型流感病毒转录物(PB2)和非结构蛋白(NS1)的基因来显着抑制小鼠的H1N1、 H5N1和H7N9等病毒复制。此外，miR-485也被证明能够靶向宿主(RIG-I)和流感病毒转录物(PB1)以调节抗病毒免疫并限制病毒复制。但新发现的miRNA PC-3p-4759_93在抵抗流感病毒感染导致的肺损伤的效应及作用机制，目前尚未有研究。
发明内容：
本发明的目的在于提供miRNA PC-3p-4759_93微小RNA和/或miRNA PC-3p-4759_93微小RNA模拟物在制备治疗肺损伤药物中的应用，使的根据miRNA PC-3p-4759_93微小RNA制备出的模拟物能够治疗肺损伤，特别是由流感病毒感染包括人在内的哺乳动物引起的肺水肿、肺出血、急性肺损伤和严重呼吸窘迫综合症等肺损伤疾病。
本发明所述miRNA PC-3p-4759_93微小RNA是以miRNA PC-3p-4759_93为基础的一类具有miRNA PC-3p-4759_93相同或基本相同的微小RNA，或者能够形成这类RNA 的表达载体、多核苷酸，或这类RNA的激动剂，具体地，所述miRNA PC-3p-4759_93 微小RNA为：(1)miRNA PC-3p-4759_93；(2)miRNA PC-3p-4759_93衍生物；(3) 核心序列：cgggacggctgggaagggc(如SED ID NO1所示)，长度在18-26nt，功能与miRNA PC-3p-4759_93相同或基本相同的微小RNA或其衍生物；(4)能够在宿主或细胞内加工形成(1)-(3)任意一项所述微小RNA的前体miRNA；(5)能够被宿主或细胞内转录形成(4)中所述前体miRNA的多核苷酸；(6)含有(1)-(3)任意一项所述微小RNA； (4)中所述前体miRNA或(5)中所述多核苷酸的表达载体；(7)、(1)-(3)任意一项所述微小RNA的激动剂。
本发明通过实验验证，miRNA PC-3p-4759_93可靶向调控病毒性肺损伤关键蛋白KPNA6的表达，流感病毒感染引起的MLE-12细胞内miRNA PC-3p-4759_93表达上升，流感病毒感染引起小鼠肺部miRNA PC-3p-4759_93表达上升，降低KPNA6蛋白表达，表明miRNA PC-3p-4759_93在流感病毒引起的肺部损伤中具有重要作用。基于此研究结论，根据上述miRNAPC-3p-4759_93微小RNA即合成miRNA PC-3p-4759_93模拟物，进而通过抑制KPNA6的表达来降低炎症因子IL-6的表达，实现对流感病毒性肺损伤的治疗作用。
作为优选，所述miRNAPC-3p-4759_93来源于外泌体。
作为优选，所述流感病毒为H1N1流感病毒。
因此，本发明所述通过miRNA PC-3p-4759_93微小RNA模拟物(模拟物序列为：cgggacggctgggaagggc，如SED ID NO1所示)，证明通过上述miRNA PC-3p-4759_93模拟物可显著缓解A型流感病毒感染引起的肺损伤程度，可显著改善流感病毒感染引起的肺部病变，可显著提高流感病毒感染小鼠的生存率，小鼠体重可明显恢复，可显著降低小鼠肺部流感病毒的载量以及小鼠血浆IL-6的表达水平，这也印证了所述miRNA PC-3p-4759_93微小RNA模拟物能够治疗包括人在内的哺乳动物因流感病毒感染引起的肺水肿、肺出血、急性肺损伤和严重呼吸窘迫综合症等肺损伤疾病。
附图说明
图1所示为不同滴度的A型流感病毒(简称IAV)刺激肺上皮细胞的损伤差异。
图2所示为低滴度A型流感病毒(MOI＝0.1)刺激引起肺上皮细胞miRNA PC-3p-4759_93的miRNA表达变化。
图3所示为miRNA PC-3p-4759_93在拮抗高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)诱导的肺上皮细胞损伤的情况。
图4所示为给予miRNA PC-3p-4759_93可抑制高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激后肺上皮细胞中KPNA6(图4A)和IL-6(图4B)的mRNA表达。
图5所示为给予miRNA PC-3p-4759_93可抑制高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激后肺上皮细胞中KPNA6和IL-6蛋白的表达。
图6所示为miRNA PC-3p-4759_93模拟物可靶向结合KPNA6的3'-UTR靶向调节KPNA6的表达。
图7所示为给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物治疗感染A型流感病毒的野生型C57BL/6小鼠肺组织的病理检测结果及统计结果，图7A为对照模拟物结果，图7B为miRNAPC-3p-4759_93模拟物结果。
图8所示为PC-3p-4759_93模拟物显著降低小鼠肺部流感病毒载量结果图。
图9所示为给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物治疗感染A型流感病毒的野生型C57BL/6小鼠肺组织的病毒载量及统计结果。
图10所示为给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物治疗感染A型流感病毒的野生型C57BL/6小鼠的生存率变化结果。
图11所示为给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物治疗感染A型流感病毒的野生型C57BL/6小鼠的体重变化结果。
具体实施方式
发明公开了miRNA PC-3p-4759_93微小RNA模拟物在制备治疗肺损伤药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：不同滴度的A型流感病毒刺激对肺上皮细胞的损伤有显著差异。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液枪、移液管、96孔板、台式常温离心机、酶标仪等。
2)主要实验试剂：CCK8试剂盒等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)细胞：小鼠肺上皮细胞(MLE-12)。
实验方法：
1)准备肺上皮细胞(MLE-12)：消化悬浮肺上皮细胞，分别按每孔约5000-6000个细胞铺于96孔板中，置于CO2培养箱中37℃温育12小时待细胞贴壁；
2)病毒攻毒处理：分别给予低滴度(MOI＝0.1)和高滴度(MOI＝0.5)的A型流感病毒干预肺上皮细胞2小时后，更换成维持液培养8小时，同步设给予等体积的鸡胚尿囊液的空白组(CON)；
3)CCK8检测细胞活性：弃去孔板中细胞上清，分别加入CCK8工作液，1-4小时内检测 OD值，分析细胞活性。
实验结果：
如图1所示，与空白组比较，低滴度病毒组的肺上皮细胞细胞活性下降，但无统计学差异(P>0.05)，高滴度病毒组的MLE-12细胞活性显著下降，差异有统计学意义 (P<0.0001)。
此结果说明，肺上皮细胞能一定程度上抵抗低滴度的A型流感病毒感染。
实施例2：低滴度的A型流感病毒刺激可引起肺上皮细胞miRNA PC-3p-4759_93的miRNA 表达增加。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液枪、移液管、台式常温及低温高速离心机、普通PCR仪器、实时定量PCR仪器等。
2)主要实验试剂：Trizol细胞裂解液，逆转录试剂盒，实时定量PCR试剂盒，氯仿，异丙醇，乙醇等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)细胞：小鼠肺上皮细胞(MLE-12)。
5)所用引物：均合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。
引物列表1
实验方法：
1)准备肺上皮细胞(MLE-12)：消化悬浮肺上皮细胞，分别按每孔约104个细胞铺于6 孔板中，置于CO2培养箱中37℃温育12小时待细胞贴壁；
2)病毒攻毒处理：病毒组(IAV)给予低滴度的A型流感病毒(MOI＝0.1)干预肺上皮细胞2小时后，更换成维持液培养8小时，同步设给予等体积的鸡胚尿囊液的空白组 (CON)；
3)细胞RNA样品收集：分别收取两组细胞，每组用1ml TRIzol裂解液收取细胞RNA样品到1.5ml离心管中；
4)总RNA的提取：采用TRIzol法提取细胞总RNA，每管加入200μl氯仿，震荡混匀后室温静置5分钟，10000rpm离心10min，收集上层液体，加入500μl异丙醇冰箱静置过夜，10000rpm 4℃离心10min，收取RNA沉淀，再用75％冷乙醇洗涤两遍，保留RNA沉淀，晾干后用无RNA酶的水溶解RNA；
5)逆转录：按逆转录试剂盒操作步骤进行，逆转录引物为U6及miRNA PC-3p-4759_93 特异的茎环引物；
6)miRNA PC-3p-4759_93的检测：利用qPCR荧光定量技术对不同样品中miRNA PC-3p-4759_93的表达量进行测定，计算miRNA PC-3p-4759_93的相对表达量。
实验结果：
如图2所示，与空白组比较，感染低滴度A型流感病毒(MOI＝0.1)的肺上皮细胞miRNA PC-3p-4759_93的表达量显著升高，且差异有统计学意义(P<0.001)。
此结果说明，低滴度的A型流感病毒(MOI＝0.1)刺激可激活肺上皮细胞miRNA PC-3p-4759_93的表达，结合实施例1，推测miRNA PC-3p-4759_93可能在肺上皮细胞抵抗A型流感病毒感染的过程中起着重要作用。
实施例3：miRNA PC-3p-4759_93可拮抗高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)诱导的肺上皮细胞损伤，提高细胞活性。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、96孔板、台式常温离心机、酶标仪等。
2)主要实验试剂：miRNA PC-3p-4759_93模拟物、miRNA PC-3p-4759_93抑制物以及相应的阴性对照物、细胞转染试剂盒、CCK8试剂盒。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)细胞：小鼠肺上皮细胞(MLE-12)。
5)模拟物、抑制剂及转染试剂盒：均合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。
引物列表3
实验方法：
1)准备肺上皮细胞(MLE-12)：消化悬浮肺上皮细胞，分别按每孔约5000-6000个细胞铺于96孔板中，置于CO2培养箱中37℃温育12小时待细胞贴壁；
2)实验分组及干预方式：实验主要分为miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、miRNAPC-3p-4759_93模拟物-NC组、miRNA PC-3p-4759_93抑制剂组、miRNA PC-3p-4759_93抑制剂-NC组、模型组和正常组；分别对miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、miRNA PC-3p-4759_93模拟物-NC组、miRNA PC-3p-4759_93抑制剂组、miRNA PC-3p-4759_93抑制剂-NC组给予相应的转染处理后，置于CO2培养箱中37℃温育24小时；
3)病毒攻毒处理：将上述细胞，除正常组外，其他组均给予高滴度的A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激细胞2小时，更换成维持液培养8小时；
4)CCK8检测细胞活性：弃去孔板中细胞上清，分别加入CCK8工作液，1-4小时内检测 OD值，分析细胞活性。
实验结果：
如图3所示，与模型组比较，miRNA PC-3p-4759_93模拟物组的细胞存活率明显升高,而miRNA PC-3p-4759_93抑制物组的细胞存活率明显下降，差异均具有统计学意义 (P<0.001)。
此结果说明，miRNA PC-3p-4759_93可拮抗高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)诱导的细胞损伤，提高细胞活性。
实施例4：miRNA PC-3p-4759_93可抑制高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激后肺上皮细胞中KPNA6和IL-6的mRNA表达。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、台式常温及低温高速离心机、普通PCR仪器、实时定量PCR仪器等。
2)主要实验试剂：miRNA PC-3p-4759_93模拟物及阴性对照组、细胞转染试剂盒、Trizol 细胞裂解液，逆转录试剂盒，实时定量PCR试剂盒，氯仿，异丙醇，乙醇等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)细胞：小鼠肺上皮细胞(MLE-12)。
5)模拟物、转染试剂盒以及引物：均合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。
引物列表3
实验方法：
1)准备肺上皮细胞(MLE-12)：消化悬浮肺上皮细胞，分别按每孔约104个细胞铺于6 孔板中，置于CO2培养箱中37℃温育12小时待细胞贴壁；
2)病毒攻毒处理：给予高滴度的A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激细胞2小时；
3)在病毒刺激2小时后，分别将miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组给予相应的转染处理，置于CO2培养箱中37℃温育8小时，收集细胞；
4)细胞RNA样品收取：每组用1ml Trizol法提取细胞RNA，然后收集至1.5ml离心管中；
5)总RNA的提取：每管加入200μl氯仿，震荡混匀，室温静置5min后，4℃，10000rpm离心10min，收取上层液体，加入500μl预冷的异丙醇混匀，冰箱静置过夜，4℃，10000rpm 离心10min，收取RNA沉淀，再用75％冷乙醇洗涤两遍，保留RNA沉淀，晾干后用无核酸酶的水溶解RNA；
6)逆转录：按逆转录试剂盒操作步骤进行；
7)采用qPCR荧光定量技术检测各组肺上皮细胞中KPNA6及IL-6的mRNA表达量。
实验结果：
如图4所示，与阴性对照组相比，miRNA PC-3p-4759_93模拟物组肺上皮细胞中KPNA6和IL-6的表达量显著下调，且差异有统计学意义(p<0.001)。
此结果说明，miRNA PC-3p-4759_93可抑制高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激后肺上皮细胞中KPNA6和IL-6的mRNA表达。
实施例5：miRNA PC-3p-4759_93可抑制高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激后肺上皮细胞中KPNA6和IL-6蛋白的表达。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、移液器、移液管、台式常温及低温高速离心机、蛋白电泳仪、蛋白转膜仪等。
2)主要实验试剂：细胞蛋白裂解液、蛋白上样缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、封闭液、显色液等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)细胞：小鼠肺上皮细胞(MLE-12)。
5)所用抗体：KPNA6和IL-6抗体购自Abeam公司，P-actin抗体购自Sigma公司。
实验方法：
1)准备肺上皮细胞(MLE-12)：消化悬浮肺上皮细胞，分别按每孔约104个细胞铺于6 孔板中，置于CO2培养箱中37℃温育12小时待细胞贴壁；
2)病毒攻毒处理：给予高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激细胞2小时；
3)在病毒刺激2小时后，分别将miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组进行相应的转染处理，置于CO2培养箱中37℃温育8小时，收集细胞；
4)细胞蛋白样品收取：每组细胞用1ml细胞蛋白裂解液，收取细胞蛋白样品，收入1.5ml 离心管中；
5)采用Western-Blot方法检测各组肺上皮细胞中KPNA6和IL-6的蛋白表达情况。
实验结果：
如图5所示，与阴性对照组相比，miRNA PC-3p-4759_93模拟物组肺上皮细胞中KPNA6和IL-6蛋白的表达显著下调，差异有统计学意义(p<0.001)。
此结果说明，miRNA PC-3p-4759_93可抑制高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)刺激后肺上皮细胞中KPNA6和IL-6蛋白的表达。
实施例6：miRNA PC-3p-4759_93可靶向结合KPNA6的3'-UTR靶向调节KPNA6的表达。
实验材料：
1)主要实验仪器：超净工作台、移液器、移液管、台式常温及低温高速离心机、Turner化学发光等。
2)主要实验试剂：双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。
3)细胞：小鼠肺上皮细胞(MLE-12)
实验方法：
1)准备肺上皮细胞细胞(MLE-12)：消化悬浮肺上皮细胞，分别按每孔105个细胞铺于6 孔板中；
2)转染miRNA PC-3p-4759_93模拟物及相应阴性对照：细胞贴壁12小时后，每孔转染10 nMmiRNA PC-3p-4759_93模拟物及相应阴性对照；
3)转染psiCHECKTM-KPNA6 3'-UTR-野生型及-突变型质粒：转染miRNA PC-3p-4759_93 模拟物及相应阴性对照24小时后，相应孔转染1jig psiCHECKTM-KPNA6 3'-UTR-野生型或-突变型质粒；
4)双荧光素酶活性检测：按照Promega公司双荧光素酶报告检测试剂盒说明书操作步骤，检测出各孔双荧光素酶活性。
5)统计分析：计算海肾荧光素酶(Renilla)相对活性。
实验结果：
如图6所示，转染miRNA PC-3p-4759_93模拟物显著降低psiCHECKTM-KPNA6 3， -UTR-野生型质粒转染组海肾荧光素酶(Renilla)的活性，miRNA PC-3p-4759_93模拟物对psiCHECKTM-KPNA6 3，-UTR-突变型质粒转染组海肾荧光素酶(Renilla)的活性的降低效果被显著抑制。这是因为突变型质粒中miRNA PC-3p-4759_93模拟物结合位点被删除，导致miRNA PC-3p-4759_93模拟物无法再靶向结合到KPNA6 3,-UTR。差异有统计学意义(p＜0.05)
此结果说明，miRNA PC-3p-4759_93是通过靶向结合KPNA6的3'-UTR靶向调节肺损伤关键蛋白KPNA6的表达。
实施例7：给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可显著改善野生型C57BL/6小鼠感染A型流感病毒引起的肺部病变。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。
2)主要实验试剂：miRNA PC-3p-4759_93模拟物及其相应阴性对照物，2％戊巴比妥钠溶液、A型流感病毒稀释液、消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠(4周龄)，购于湖南省斯莱克景达动物有限责任公司。
实验方法：
1)分组：实验分为miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组和流感病毒模型组，每组小鼠各为10只；
2)初次给药：安全抓取固定小鼠，各组小鼠分别用1ml无菌注射器腹腔注射miRNAPC-3p-4759_93模拟物、阴性对照物和生理盐水，每只小鼠给予模拟物量均为10mg/Kg；
3)病毒攻毒处理：初次给药24小时后，进行病毒攻毒处理。首先安全固定小鼠，用1ml 无菌注射器腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液麻醉，将麻醉小鼠头部向上向后倾斜，使其鼻腔向上，使用1ml注射器缓慢滴入小鼠鼻腔100μl的高滴度A型流感病毒稀释液 (MOI＝0.5)；
4)保持小鼠此体位30秒，使病毒充分进入肺部，将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予充足必要的水及食物；
5)攻毒后12小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
6)攻毒后24小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
7)感染小鼠3天后，采取颈椎脱臼法使小鼠死亡；
8)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠完整肺脏取出，去除表面血液及多余结缔组织，用无菌PBS洗去表面血液，置于4％多聚甲醛固定液中室温固定48h；
9)病理切片置于显微镜下观察，并进行肺损伤指数和炎症细胞浸润计数；进行统计分析。
实验结果
图7中(HE染色)病理照片显示：感染高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)后，阴性对照物组C57BL/6小鼠肺组织中出现严重的病理损伤。肺组织正常结构被破坏，伴随出血、炎性渗出及大量红细胞、炎症细胞浸润等病理损伤。但是，miRNA PC-3p-4759_93 模拟物组小鼠肺组织未见显著病理损伤，无显著的出血、渗出或者炎症细胞浸润等病理变化，肺组织纹理清晰，结构完整。
此结果说明：给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可以改善因A型流感病毒感染引起的肺损伤。
实施例8：给予PC-3p-4759_93模拟物显著改善野生型C57BL/6小鼠肺部A型流感病毒的载量。
实验材料
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。
2)主要实验试剂：miRNA PC-3p-4759_93模拟物及其相应阴性对照物，2％戊巴比妥钠溶液、A型流感病毒稀释液、消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠(4周龄)，购于湖南省斯莱克景达动物有限责任公司。
5)引物：均合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。
表4引物序列
实验方法：
1)分组：实验分为miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组和流感病毒模型组，每组小鼠各为10只；
2)初次给药：安全抓取固定小鼠，各组小鼠分别用1ml无菌注射器腹腔注射miRNAPC-3p-4759_93模拟物、阴性对照物和生理盐水，每只小鼠给予模拟物量均为10mg/Kg；
3)病毒攻毒处理：初次给药24小时后，进行病毒攻毒处理。首先安全固定小鼠，用1ml 无菌注射器腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液麻醉，将麻醉小鼠头部向上向后倾斜，使其鼻腔向上，使用1ml注射器缓慢滴入小鼠鼻腔100μl的高滴度A型流感病毒稀释液 (MOI＝0.5)；
4)保持小鼠此体位30秒，使病毒充分进入肺部，将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予充足必要的水及食物；
6)攻毒后12小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
7)攻毒后24小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
8)感染小鼠3天后，用颈椎脱臼法使小鼠死亡；
9)将小鼠固定于小动物手术台，移除胸部皮肤及骨骼，暴露胸腔，将小鼠完整肺脏取出，去除表面血液及多余结缔组织，用无菌PBS洗去表面血液。
10)将肺组织用Trizol裂解液匀浆、裂解；提取总RNA并逆转录；qPCR法检测病毒NP基因表达情况。
实验结果：
如图8中结果显示：在小鼠感染高滴度A型流感病毒(MOI＝0.5)前后，给予miRNAPC-3p-4759_93模拟物显著降低小鼠肺部流感病毒载量。且差异有统计学意义(P<0.05)。
此结果说明，给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可以抑制小鼠肺部流感病毒的复制。
实施例9：给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可以显著提高野生型C57BL/6感染A型流感病毒小鼠的生存率。
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。
2)主要实验试剂：miRNA PC-3p-4759_93模拟物及其相应阴性对照物、2％戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠(4周龄)，购于湖南省斯莱克景达动物有限责任公司。
实验方法：
1)分组：实验分为miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组和流感病毒模型组，每组小鼠各为10只；
2)初次给药：安全抓取固定小鼠，各组小鼠分别用1ml无菌注射器腹腔注射miRNAPC-3p-4759_93模拟物、阴性对照物和生理盐水，每只小鼠给予模拟物量均为10mg/Kg；
3)病毒攻毒处理：初次给药24小时后，进行病毒攻毒处理。首先安全固定小鼠，用1ml 无菌注射器腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液麻醉，将麻醉小鼠头部向上向后倾斜，使其鼻腔向上，使用1ml注射器缓慢滴入小鼠鼻腔100μl的高滴度A型流感病毒稀释液 (MOI＝0.5)；
4)保持小鼠此体位30秒，使病毒充分进入肺部。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予充足必要的水及食物；
5)攻毒后12小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
6)攻毒后24小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
7)每日观察小鼠状态，观察小鼠死亡情况，统计小鼠生存率。
实验结果
如图9中结果显示：与模型组比较，miRNA PC-3p-4759_9模拟物组小鼠生存率得到显著的提高，差异有统计学意义(p＜0.05)。
此结果说明，给予miRNA PC-3p-4759_9模拟物可以显著提高A型流感病毒感染小鼠的生存率。
实施例10：给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物组可以明显恢复野生型C57BL/6小鼠体重。实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。
2)主要实验试剂：miRNA PC-3p-4759_93模拟物及其相应阴性对照物，2％戊巴比妥钠溶液、病毒稀释液、消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠(4周龄)，购买于湖南省斯莱克景达动物有限责任公司。
实验方法：
1)分组：实验分为miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组和流感病毒模型组，每组小鼠各为10只；
2)初次给药：安全抓取固定小鼠，各组小鼠分别用1ml无菌注射器腹腔注射miRNAPC-3p-4759_93模拟物、阴性对照物和生理盐水，每只小鼠给予模拟物量均为10mg/Kg；
3)病毒攻毒处理：初次给药24小时后，进行病毒攻毒处理。首先安全固定小鼠，用1ml 无菌注射器腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液麻醉，将麻醉小鼠头部向上向后倾斜，使其鼻腔向上，使用1ml注射器缓慢滴入小鼠鼻腔100μl的高滴度A型流感病毒稀释液 (MOI＝0.5)；
4)保持小鼠此体位30秒，使病毒充分进入肺部。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予充足必要的水及食物；
5)攻毒后12小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
6)攻毒后24小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
7)每日观察小鼠状态，每日称小鼠体重，统计体重变化。
实验结果：
如图10中结果显示：与模型组比较，miRNA PC-3p-4759_93模拟物组小鼠体重明显恢复，差异有统计学意义(P<0.05)。
此结果说明，给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可以显著恢复A型流感病毒感染的小鼠体重。
实施例11：给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可以显著降低小鼠血清白介素6(IL-6) 水平
实验材料：
1)主要实验仪器：三级生物安全实验室、三级生物安全柜、动物饲养柜、小鼠饲养笼、小动物手术器械、无菌注射器、移液器、移液管等。
2)主要实验试剂：PC-3p-4759_93模拟物及其相应阴性对照物，2％(W/V)戊巴比妥钠溶液、A型流感病毒稀释液、消毒剂(2.5％碘酒和75％酒精)等。
3)病毒：H1N1型，流感病毒小鼠肺适应株(A型，A/PR/8/34)。
4)实验动物：SPF级野生型(WT)C57BL/6小鼠(4周龄)，购买于湖南省斯莱克景达动物有限责任公司。
实验方法：
1)分组：实验分为miRNA PC-3p-4759_93模拟物组、阴性对照物组和流感病毒模型组，每组小鼠各为10只；
2)初次给药：安全抓取固定小鼠，各组小鼠分别用1ml无菌注射器腹腔注射miRNAPC-3p-4759_93模拟物、阴性对照物和生理盐水，每只小鼠给予模拟物量均为10mg/Kg；
3)病毒攻毒处理：初次给药24小时后，进行病毒攻毒处理。首先安全固定小鼠，用1ml 无菌注射器腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液麻醉，将麻醉小鼠头部向上向后倾斜，使其鼻腔向上，使用1ml注射器缓慢滴入小鼠鼻腔100μl的高滴度A型流感病毒稀释液 (MOI＝0.5)；
4)保持小鼠此体位30秒，使病毒充分进入肺部。将小鼠置于鼠笼内，待其恢复清醒后，给予充足必要的水及食物；
5)攻毒后12小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
6)攻毒后24小时，按照初次给药方法和剂量，再次给药；
7)感染小鼠3天后，采用摘眼球采血法，收集小鼠血液入促凝管中；
8)4℃，12000rpm离心15min，收取血清；
9)采用ELISA法测定血清中IL-6含量。
实验结果11：
如图11所示，与模型组比较，miRNA PC-3p-4759_93模拟物组的小鼠血清IL-6水平显著减低，差异有统计学意义(P<0.01)。
此结果说明，给予miRNA PC-3p-4759_93模拟物可以下调A型流感病毒感染后的小鼠血清中IL-6的水平，从而调控A型流感病毒感染引起的炎症反应，预防肺损伤。
以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南中医药大学
<120> miRNAPC-3p-4759_93的应用
<141> 2022-01-21
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 1
cgggacggct gggaagggc 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 2
agagaagatt agcatggccc ctg 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 3
ttgtactaca caaaagtact g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 4
gcccttccca gccgtcccg 19
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 5
cagtactttt gtgtagtaca a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 6
gctcttttcc agccttcctt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 7
cgggacggct gggaagggc 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 8
tgctcttctc ggacgactct ga 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 9
cctgtgtgta tggacctgcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> null
<400> 10
gctcttttcc agccttcctt 20

Claims (3)

1.miRNAPC-3p-4759_93的激动剂在制备治疗肺损伤药物中的应用，其特征是，所述肺损伤是指由流感病毒H1N1感染引起，所述miRNAPC-3p-4759_93的激动剂的序列如SED IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述miRNAPC-3p-4759_93来源于外泌体。
3.一种miRNAPC-3p-4759_93的激动剂，其特征是，所述激动剂的序列如SED ID NO.1所示。
CN202210070208.5A 2022-01-21 2022-01-21 miRNAPC-3p-4759_93的应用 Active CN114366755B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210070208.5A CN114366755B (zh) 2022-01-21 2022-01-21 miRNAPC-3p-4759_93的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210070208.5A CN114366755B (zh) 2022-01-21 2022-01-21 miRNAPC-3p-4759_93的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114366755A CN114366755A (zh) 2022-04-19
CN114366755B true CN114366755B (zh) 2023-08-08

Family

ID=81146243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210070208.5A Active CN114366755B (zh) 2022-01-21 2022-01-21 miRNAPC-3p-4759_93的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114366755B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103656681A (zh) * 2013-12-05 2014-03-26 南京大学 一种用于治疗脓毒症急性肺损伤的小核酸药物
CN104436195A (zh) * 2013-09-18 2015-03-25 上海交通大学医学院附属仁济医院 miR-155在制备防治急性肺损伤药物中的用途
CN104548132A (zh) * 2014-10-24 2015-04-29 杭州师范大学 miR-127抑制剂在制抗炎和肺损伤保护药物的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019168977A1 (en) * 2018-02-27 2019-09-06 Musc Foundation For Research Development Compositions and methods for treating and/or preventing sepsis and/or inflammatory conditions

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104436195A (zh) * 2013-09-18 2015-03-25 上海交通大学医学院附属仁济医院 miR-155在制备防治急性肺损伤药物中的用途
CN103656681A (zh) * 2013-12-05 2014-03-26 南京大学 一种用于治疗脓毒症急性肺损伤的小核酸药物
CN104548132A (zh) * 2014-10-24 2015-04-29 杭州师范大学 miR-127抑制剂在制抗炎和肺损伤保护药物的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114366755A (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cornelissen et al. Differential innate responses of chickens and ducks to low-pathogenic avian influenza
Zhang et al. Astragalus polysaccharides inhibit avian infectious bronchitis virus infection by regulating viral replication
Xu et al. MicroRNA-216a inhibits NF-κB-mediated inflammatory cytokine production in teleost fish by modulating p65
Wen et al. Function of shrimp STAT during WSSV infection
JP7266534B2 (ja) 天然化合物および線維症
Susta et al. Expression of interferon gamma by a highly virulent strain of Newcastle disease virus decreases its pathogenicity in chickens
Chen et al. Identification, expression profiling of a grass carp TLR8 and its inhibition leading to the resistance to reovirus in CIK cells
Huang et al. Down‐regulation of miR‐301a suppresses pro‐inflammatory cytokines in T oll‐like receptor‐triggered macrophages
Tian et al. Roles of Toll-like receptors 2 and 6 in the inflammatory response to Mycoplasma gallisepticum infection in DF-1 cells and in chicken embryos
Chen et al. LGP2 plays extensive roles in modulating innate immune responses in Ctenopharyngodon idella kidney (CIK) cells
Zhang et al. miR-27a suppresses EV71 replication by directly targeting EGFR
Zhang et al. p-STAT1 regulates the influenza A virus replication and inflammatory response in vitro and vivo
Hartmann et al. Avian metapneumovirus infection of chicken and turkey tracheal organ cultures: comparison of virus–host interactions
Li et al. Molecular characterisation of porcine miR-155 and its regulatory roles in the TLR3/TLR4 pathways
Sun et al. Exosomal miR-181a-5p reduce Mycoplasma gallisepticum (HS strain) infection in chicken by targeting PPM1B and activating the TLR2-mediated MyD88/NF-κB signaling pathway
Bao et al. MicroRNA-589-5p modulates the expression of hemocyanin as part of the anti-WSSV immune response in Litopenaeus vannamei
Yu et al. Effects of moroxydine hydrochloride and ribavirin on the cellular growth and immune responses by inhibition of GCRV proliferation
Wang et al. Different roles of a novel shrimp microRNA in white spot syndrome virus (WSSV) and Vibrio alginolyticus infection
Jaiswal et al. Lin28B regulates angiotensin II-mediated let-7c/miR-99a MicroRNA formation consequently affecting macrophage polarization and allergic inflammation
CN103667286B (zh) 日本血吸虫PGMRC2基因的siRNA及其应用
CN114366755B (zh) miRNAPC-3p-4759_93的应用
CN112870359A (zh) Trim41抑制物、其抗炎作用及应用
Jin et al. Inhibition of highly pathogenic avian H5N1 influenza virus propagation by RNA oligonucleotides targeting the PB2 gene in combination with celecoxib
US10240150B2 (en) Avian influenza virus miRNA, and appraisal, detection, and application thereof
JP2012522036A (ja) 抗ウイルス療法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant