CN102180968A - 一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用，属于寄生虫病免疫诊断技术领域。本发明提供了一种抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCCC201118的杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生。所述的抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体的应用，在血吸虫感染免疫诊断中用于检测血吸虫感染患者或动物血液中循环抗原Sj14-3-3蛋白所使用的抗体。本发明制备的抗Sj14-3-3蛋白分子特异性单克隆抗体可以用于建立各种检测抗Sj14-3-3蛋白循环抗原的免疫学诊断方法。以抗Sj14-3-3蛋白特异性单克隆抗体建立的检测循环抗原Sj14-3-3蛋白的时间荧光分辩方法可以进一步提高检测血吸虫循环抗原Sj14-3-3蛋白的准确性和阳性率，有良好的应用前景。

Description

一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用

技术领域

本发明涉及一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用，属于寄生虫病免疫诊断技术领域。

背景技术

在世界上的热带与亚热带地区，有76个国家有血吸虫病流行，有近6亿人口受到血吸虫感染的威胁，每年有2000多万人死于血吸虫病。在中国虽然血吸虫病的防治工作取得了巨大的成就，但全国仍有454个县有血吸虫病流行，有病人近42万（2008年全国流调资料），血吸虫病依然是危害世界及我国人民身体健康的重要公共卫生问题。建立有效的血吸虫病诊断方法，对血吸虫病人、家畜及中间宿主做出准确的诊断，并及时进行治疗，对消灭血吸虫病传染源，控制血吸虫病的流行具有重要的意义。常用的血吸虫病诊断方法有多种：

病原学检测

采用显微镜检测病人粪便中是否有血吸虫的虫卵，或采用孵化法检测病人粪便是否能孵化出血吸虫的毛蚴来判断患者是否感染了血吸虫。该方法是血吸虫病诊断的金标准。缺点是虫卵进入粪便的时间与部位是不均一的，极易造成漏检，假阴性率高。此外，虫卵的产生要在血吸虫感染后3-4周，没有早期诊断的价值；以粪便为检测对象，方法难以为检测人员所接受。

DNA检测

DNA是生命体的重要组成成分，是生命体存在的重要证据。检测到血吸虫特异性DNA分子表明宿主体内存在血吸虫活动性感染，具有重要的诊断价值。目前已经建立的血吸虫病DNA检测诊断方法包括：聚合酶链反应方法（PCR）及环介导温DNA扩增方法（LAMP）等。PCR方法由于操作复杂，需要特殊的仪器设备，在基层血吸虫病防治单位难以开展。LAMP法由于操作间单，敏感性高，容易被基层血吸虫病防治人员所掌握，缺点是容易污染，假阳性高，需要进一步改进操作过程，建立标准的操作规范，才能满足现场应用的需要。

免疫学诊断

血吸虫感染宿主后在宿主体内进行生长发育，其排泄分泌物（抗原）进入宿主体内，刺激宿主免疫系统产生特异性免疫反应，产生特异性的抗体。通过免疫学方法检测宿主体内血吸虫特异性抗原或抗体同样具有血吸虫病诊断价值。

抗体在血吸虫感染发生后1-2周即出现，并且持续存在于患者体内。对于血吸虫初次感染者，检测抗体具有诊断与早期诊断的价值；对于有继往感染史者，检测抗体则确诊价值不足，但抗体水平的变化对诊断有一定的参考意义。已经建立的检测血吸虫特异性抗体检测方法有很多。包括：酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫层析法（试纸条法）、免疫渗滤法、间接血凝法（IHA）、环卵沉淀法（COPT）、免疫磁珠法、免疫印渍法等，这些方法均已在血吸虫感染筛查中获得应用。它们的共同缺点是检测结果的特异性受到所用抗原纯度及抗原本身的特异性所影响，对有继往感染史者没有确诊价值。

存在于宿主血液中的血吸虫特异性抗原是指从血吸虫虫体上脱落或分泌到宿主血液中的蛋白、脂类或糖类成份，这类成份随虫体存在而存在，随虫体消失而消失，是宿主体内存在血吸虫活动性感染的直接证据。检测这类成份或其抗原表位能对血吸虫活动性感染进行确诊，并具有疗效考核价值。检测循环抗原的关键是要制备特异性的单克隆抗体，并建立相应的敏感而特异的检测方法。针对血吸虫的各类循环抗原，国内、外分别制备了一些特异性单克隆抗体，常用的检测方法是酶联免疫吸附法（ELISA）。但是，这类方法的一个共同缺点是检测的循环抗原靶标不明确，检测结果的特异性存在问题，此外，常规ELISA的敏感性不足，难以满足现场应用的需要。

因此，进一步改进现有的循环抗原检测方法的效能，需要选择明确的检测靶标，制备特异性单克隆抗体，采用更灵敏的检测方法，以提高其特异性与敏感性。

发明内容

本发明提供一种日本血吸虫信号传导蛋白Sj14-3-3的特异性单克隆抗体，以及检测患者血清中循环抗原Sj 14-3-3蛋白的时间分辩荧光检测方法（TRFIA），可以进一步提高血吸虫循环抗原检测的特异性与敏感性。

本发明的技术方案：为达到上述目的，本发明选择日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3分子（Sj14-3-3）为循环抗原检测的靶标。

一种抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCC C201118的杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生。

产生所述单克隆抗体的重组Sj14-3-3蛋白的表达，将编码Sj14-3-3蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO：2插入到一种表达载体pEGX-4T-3编码谷胱甘肽转移酶GST基因的下游，构建重组表达载体Sj14-3-3/pEGX-4T-3，然后将重组表达载体Sj14-3-3/pEGX-4T-3转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中表达一种含有由载体编码的谷胱甘肽转移酶GST与日本血吸虫Sj14-3-3蛋白组成的GST- Sj14-3-3融合蛋白粗制品；

采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法对GST- Sj14-3-3融合蛋白粗制品进行纯化，获得纯化的GST-Sj14-3-3融合蛋白；

将纯化的GST-Sj14-3-3融合蛋白用凝血酶切割，使GST-Sj14-3-3融合蛋白裂解为GST和重组Sj14-3-3蛋白两部分，再用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法去除酶切产物中的GST蛋白，从而获得纯化的重组Sj14-3-3蛋白。

所述的重组Sj14-3-3蛋白的表达，重组Sj14-3-3蛋白分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2保持有至少90%的同源性。

所述的重组Sj14-3-3蛋白的表达，重组Sj14-3-3蛋白分子的氨基酸序列与Sj14-3-3蛋白分子的氨基酸序列蛋白SEQ ID NO：1保持有至少90%的同源性。

所述的抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体的应用，在血吸虫感染免疫诊断中用于检测血吸虫感染患者或动物血液中循环抗原Sj14-3-3蛋白所使用的抗体。

所述的重组Sj14-3-3蛋白的制备方法，包括转录，翻译，蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。

本发明为了获得纯化的重组Sj14-3-3蛋白，采用融合蛋白策略，使表达出来的重组Sj14-3-3蛋白可以通过酶切与亲和层析方法纯化制备。

所述重组Sj14-3-3蛋白应用包括：1)用于通过免疫学方法检测血吸虫特异性抗体的抗原，用于血吸虫感染患者的筛查与诊断。包括但不局限于酶联免疫吸附法（ELISA）, 免疫印渍法（Immunoblot）, 免疫层析法，免疫渗滤法，放射免疫法，时间分辩荧光法（TRFIA）, 免疫磁珠法，等等。2)用于制备抗日本血吸虫病信号传导蛋白Sj14-3-3的特异性多克隆抗体与单克隆抗体。

本发明优选的表达质粒是pEGX-4T-3 (美国GE Healthcare Life Science公司产品)，适合在大肠杆菌工程菌中表达。但是，本发明中的Sj14-3-3蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统常用的质粒。

具体地，该表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动子包括但是不局限于以下所述的tac启动子, 优选的启动子为T7。

本发明提供重组Sj14-3-3蛋白的表达质粒的构建方法及工程菌构建方法。

首先克隆获得编码Sj14-3-3蛋白的核苷酸序列。编码Sj14-3-3蛋白氨基酸序列的核苷酸序列与序列SEQ ID NO：2保持有至少90%的同源性。

具体地，通过RT-PCR技术，从血吸虫mRNA中反转录合成编码Sj14-3-3蛋白核苷酸片段，并使Sj14-3-3基因片段的5′端带有BamH1的酶切位点，3′端带有Sal1的酶切位点。将Sj14-3-3基因片段克隆到TA克隆载体pGEM-T中构建重组质粒Sj14-3-3/pGEM-T进行DNA序列分析，确定其基因序列的正确性。

然后将Sj14-3-3基因片段通过BamH1, Sal1酶切位点插入到表达质粒pGEX-4T-3中构建重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3。将该重组表达质粒转化到大肠杆菌DH5α，再转种到含有氨苄青霉素（AMP）的LB平板（1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，琼脂粉1.2%，氨苄青霉素100μg/mL）上进行繁殖和保种。

本发明表达重组Sj14-3-3蛋白的重组质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3可在多种大肠杆菌中表达，其优选的菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明提供一种工程菌大规模表达GST-Sj14-3-3融合蛋白的方法。具体地，将含有重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3的单个菌落接种到选择性培养基LB（1%的蛋白胨，0.5%的酵母抽提物，1%氯化钠，氨卞青霉素100μg/mL)中，37℃振摇过夜。第二天按1︰10稀释接种到新鲜的LB培养基中，37℃振摇培养4h (OD₆₀₀≈0.4), 加入1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Sj14-3-3融合蛋白。

GST-Sj14-3-3融合蛋白的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于：SDS-PAGE，Western blotting等。

本发明也提供一种GST-Sj14-3-3融合蛋白的分离纯化方法。

具体地，将含有GST-Sj14-3-3融合蛋白的表达产物与Glutathione Sepharose 4B胶混合，使Glutathione Sepharose 4B捕获表达产物中的GST-Sj14-3-3，再用还原型谷胱甘肽溶液洗脱结合在胶上的GST-Sj14-3-3融合蛋白。GST-Sj14-3-3融合蛋白的纯度可以达95%以上。

本发明还提供一种重组Sj14-3-3蛋白的纯化方法。

具体地，将纯化的GST-Sj14-3-3融合蛋白用凝血酶（Thrombin）切割，使融合蛋白裂解为GST和重组Sj14-3-3蛋白两部分，再用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法去除酶切产物中的GST蛋白，从而获得纯化的重组Sj14-3-3蛋白。

本发明提供一种制备抗重组Sj14-3-3蛋白特异性单克隆抗体的方法。

具体地，以纯化的重组Sj14-3-3蛋白与福氏佐剂混合，免疫BALB/c小鼠，连续加强免疫2次后，通过酶联免疫吸咐法测定小鼠血清中是否有抗重组Sj14-3-3蛋白特异性抗体产生。然后取免疫小鼠的脾脏细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行杂交融合，通过一系列的筛选，制备能产生抗重组Sj14-3-3蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞进行大量培养，收集上清液，或将杂交瘤细胞种植到同系小鼠腹腔形成实体瘤制备含单克隆抗体的腹水。用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析胶经亲和层析法制备纯化的抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体。

本发明还提供一种抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体特异性的鉴定方法。

具体地，将重组Sj14-3-3蛋白，健康人血清，血吸虫成虫，排泄分泌抗原，可溶性虫卵抗原，肝吸虫抗原，疟原虫抗原，大肠杆菌抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采用电转移方法将蛋白条带转移到硝酸纤维素（NC）膜上，将含有各抗原蛋白条带的NC膜与抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体反应，加入酶标记抗鼠IgG二抗后，用底物3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）显色，观察单克隆抗体与各抗原的反应情况，以判断此单克隆抗体的特异性。

本发明提供的抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体可用于检测血吸虫感染者血液中循环抗原Sj14-3-3蛋白。检测方法分直接法和间接法两类，包括但不局限于：斑点法、酶联免疫吸附法、免疫印渍法（Immunoblot）, 免疫层析法，免疫渗滤法，放射免疫法，时间分辩荧光法（TRFIA）, 免疫磁珠法，等等。

本发明提供一种检测日本血吸虫信号传导蛋白Sj14-3-3分子的时间荧光分辩方法。

具体地，以稀有元素铕标记抗Sj14-3-3蛋白单克隆抗体为检测抗体，以抗Sj14-3-3蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体为捕获抗体包被酶标板，与待检者血清进行反应后加入铕标记抗Sj14-3-3蛋白单克隆抗体进行检测，通过时间荧光分辩分析仪检测以判定被检测血清样本中是否含有Sj14-3-3蛋白分子。

本发明的有益效果：日本血吸虫信号传导蛋白Sj14-3-3分子是血吸虫排泄分泌物中的一个高丰度循环抗原，检测病人体内血吸虫特异性的Sj14-3-3蛋白分子对血吸虫活动性感染具有确诊价值。本发明制备的抗Sj14-3-3蛋白分子特异性单克隆抗体可以用于建立各种检测抗Sj14-3-3蛋白循环抗原的免疫学诊断方法。以抗Sj14-3-3蛋白特异性单克隆抗体建立的检测循环抗原Sj14-3-3蛋白的时间荧光分辩方法可以进一步提高检测血吸虫循环抗原Sj14-3-3蛋白的准确性和阳性率，有良好的应用前景，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

生物材料样品保藏

一种抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生，杂交瘤细胞JYQ5C6-1已保藏在中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为：CCTCC C 201118，保藏日期为：2011年3月23日。

附图说明

图1日本血吸虫信号蛋白Sj14-3-3基因扩增

1、DNA分子量标志物；2、RT-PCR扩增产物。

图2 重组表达质粒构建结果

1、重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3

2、表达质粒pGEX-4T-3

3、1kb DNA分子量标志物

图3 重组质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3酶切分析结果

1、1kb DNA分子量标志物

2、未被酶切的重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3

3、经BamH1+Sal1双酶切的Sj14-3-3/pGEX-4T-3质粒DNA产物

图4 重组日本血吸虫信号转导蛋白Sj14-3-3融合表达

1、蛋白质分子量标志物；

2、E.coli BL21对照；

3-5、含重组质粒转化子细菌表达产物

图5 亲和层析纯化重组日本血吸虫信号转导蛋白Sj14-3-3

1、蛋白质分子量标志物；

2、纯化的重组日本血吸虫信号转导蛋白Sj14-3-3

图6抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体的特异性分析

1、重组Sj14-3-3蛋白；

2、可溶性虫卵抗原；

3、成虫排泄分泌抗原；

4、成虫抗原；

5、蛋白分子量标志物；

6、大肠杆菌蛋白；

7、健康人血清；

8、华支睾吸虫可溶性蛋白；

图7  TRFIA与ELISA两种方法检测Sj14-3-3蛋白效能的比较

TRFIA:时间分辩荧光法，敏感性为0.78 ng/mL，检测线性范围为0.78-800ng/mL

ELISA:酶联免疫吸附法，敏感性为6.25 ng/mL，检测线性范围为6.25-200ng/mL。

具体实施方式

下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内容。

实施例1：日本血吸虫信号转导蛋白Sj14-3-3基因克隆：

日本血吸虫信号转导蛋白Sj14-3-3基因通过RT-PCR技术，从血吸虫成虫组织的mRNA中反转录合成而来，具体制备方法如下：

1、血吸虫成虫mRNA的制备

取新鲜分离的血吸虫成虫0.5g, 在液氮中冷冻后，在陶瓷研钵中粉碎，再用GE Healthcare公司的mRNA纯化试剂盒（Illustra QuickPrep^TM mRNA purification kit）制备纯化mRNA, 操作方法严格按试剂盒的操作说明书。用紫外分光光度计测mRNA的纯度与含量。

2、Sj14-3-3基因扩增

2.1引物设计：

Sj14-3-3 1: ttggatccatgagggattcgttcgt，（划线处为BamH1酶切位点），

Sj14-3-3 2: ttgtcgactcagccatcatttccgt，（划线处为Sal1酶切位点），

2.2 第一链cDNA合成

采用Phusion^TM RT-PCR Kit(购自NEB北京分公司). 在一0.2mL的PCR管中，加入mRNA 2μL(约10ng), 10 mM dNTP 混合物1 μL，Oligo(dT) primer 1 μL，加无离子水至10 μL。混匀，离心收集于管底。65°C 水浴预变性5min，置冰上冷却。加入10×反转录缓冲液2 μL, 反转录酶混合物2μL，无核糖核酸酶水（无Rnase水）6μL。混匀，离心收集于管底。25°C保温10min，再在40°C保温30min以合成cDNA。80°C保温5min以中止反应。

2.3 目的基因扩增

在一个0.2mL的PCR管中，加入2×Phusion^R Master Mix 25μL，第一链cDNA 3μL，引物Sj14-3-3 1：0.5μL (25μM)，Sj14-3-3 2：0.5μL (25μM)，加无核糖核酸酶水到终体积50μL。PCR条件：98 ℃ 30 Sec；然后98℃变性10 Sec；65℃ 30 Sec，72℃ 50 Sec，一共30个循环；最后，72℃保温5min。采用低融点琼脂糖凝胶电泳方法回收纯的Sj14-3-3基因片段。具体是用1%的低融点agarose胶电泳PCR扩增产物，切下分子量约750bp左右的目的DNA条带，再用Promega公司的PCR产物回收试剂盒纯化Sj14-3-3基因DNA片段。如图1所示。

TA克隆与序列分析

Sj14-3-3的3′端加腺嘌呤（A）尾巴 将纯化的Sj14-3-3片段置于PCR 反应管中，加入10× Taq DNA 聚合酶链反应缓冲液10μL，MgCl₂ 10μL（25 mmol/L），dATP 1μL(10 mmol/L)，Taq DNA 聚合酶1μL (5 U/μL)，加灭菌无离子水至100μL，在PCR 仪上72 ℃保温30 min，使Sj14-3-3基因片段的3′端加上“A”尾巴。用Promega 公司的酶切产物纯化试剂盒纯化加A 尾后的Sj14-3-3基因DNA片段。将Sj14-3-3 DNA片段与TA clone 载体pGEM-T(美国PROMEGA公司产品) 按照3︰1 的比例混合，在T4 DNA 连接酶的作用下连接，反应体系如下：2× ligase buffer 5μL，pGEM-T vector 1μL (50ng), Sj14-3-3 DNA片段 3μL，T4 DNA ligase 1μL（1U），总体积 10μL。混匀后，短暂离心，16℃水浴连接过夜,形成重组质粒Sj14-3-3/pGEM-T。

电转化：1）取5μL 连接产物加入到50μL 感受态细胞E.coli DH5α中，小心混匀，勿使有气泡产生，放置冰浴上30 min。2）将连接产物与E.coli DH5α的混合物转移到冰上预冷的狭缝为0.1cm 的电击杯中，勿使有气泡产生，小心拭去电击杯外的冷凝水。3）设置电脉冲仪（BIO-RAD）脉冲参数：电压2.5 kV，电容25 μF，电阻200Ω。将电击杯插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止。4）取出电击杯，加入0.5 mL 37 ℃预热的SOC 培养基，混匀后将电击后的菌液转移到一无菌玻璃试管中，37 ℃、200 rpm 振荡培养40 min。5）取200μL菌液均匀涂布于表面预先涂有40μL X-gal（40 mg/mL）的LB 平板上（含Amp 100μg/mL）。室温下放置待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37 ℃培养箱过夜。在LB 平板上出现的白色菌落可初步判定为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。将白色菌落细菌送到上海英俊公司进行DNA序列分析。

实施例2：重组Sj14-3-3蛋白表达质粒的构建

本发明采用pGEX-4T-3为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备质粒后-20℃保存待用。

具体如下，对表达载体质粒pGEX-4T-3及重组质粒Sj14-3-3/pGEM-T分别进行BamH1、 Sal1双酶切。具体条件如下。质粒（pGEX-4T-3或Sj14-3-3/pGEM-T）DNA 10μL，Nco1 1μL，Xho1 1μL, 10×酶切缓冲液5μL；ddH₂O 33μL，总体积为50μL。37℃恒温水浴锅内温浴3小时，通过低琼脂糖凝胶电泳回收线性化的pGEX-4T-3质粒DNA和Sj14-3-3 DNA片段。将回收的Sj14-3-3 DNA片段与表达质粒pGEX-4T-3 DNA片段连接,构建融合蛋白表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3。连接体系为10uL，双酶切的pGEX-4T-3质粒与双酶切Sj14-3-3 DNA的摩尔比为1︰2-10，10×T4 DNA ligase 缓冲液1μL, T4 DNA ligase 1μL, 加无菌水至总体积为10μL。连接反应16℃恒温水浴内温浴16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。阳性克隆的鉴定是通过含Ampicilin的LB平板挑选阳性克隆，抽提质粒，并通过双酶切分析确定目的基因是否被插入到表达载体中（图2，3所示）。

实施例3：重组Sj14-3-3蛋白表达工程菌的构建

具体方法如下。

首先挑选含有Sj14-3-3/pGEX-4T-3重组质粒的细菌克隆，提取质粒DNA。然后，用电转化的方法把质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中。

质粒DNA提取方法按Promega公司质粒DNA纯化试剂盒操作说明进行。

电转化方法转化大肠杆菌具体如下。

先进行感受态细胞的准备。挑取新鲜的BL21（DE3）单菌落，接种至含有3mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min培养过夜。然后取1mL的培养物接种至含有500mL新鲜LB培养基的2L三角摇瓶中，37℃、250-300r/min培养过夜，至OD₆₀₀小于0.4，将细菌培养物置于冰上冷却，2500g离心20min，去上清，用500mL的冰预冷的ddH₂O将菌体沉淀重悬。离心后，再用250mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用10mL的冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用冰预冷的10%的甘油溶液将菌体沉淀重悬，调节菌液OD_600nm=10.0。以每管100μL的体积分装感受态细胞，-70℃保存备用。

电击转化，具体如下。

将Sj14-3-3/pGEX-4T-3重组质粒DNA溶解在5~10μL TE溶液中，与80μL的上述感受态菌体混匀，转至0.1cm狭缝的预冷电转化杯中，冰浴30min。然用1.8kv电压、25μF电容； 200Ω电阻的条件进行电击。电击完毕后，加入1mL 37℃预温的LB液体培养基悬浮，并转至无菌的玻璃试管中，37℃、250-300r/min培养40min。将菌液涂布到含有Ampicilin的LB平板上，置于37℃培养过夜。

实施例4：GST-Sj14-3-3融合蛋白表达和纯化

重组GST-Sj14-3-3融合蛋白的表达

将表达菌株接种于50mL LB液体培养基中(AMP，100μg/mL)，37℃、200 rpm过夜培养。取10mL过夜培养菌液，按照1︰100 分别转种于1,000 mL LB肉汤培养基中(AMP，100μg/mL)中，37 ℃、200 rpm振荡培养，培养3～4 h至菌液光密度OD_600 nm约为0.5。加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4 h。4℃、5,000 rpm 离心10 min，收集所有细菌。取少量的细菌进行SDS-PAG电泳，观察目的蛋白的表达情况。如图4所示。用100 mL PBS重悬浮细菌沉淀。 -30 ℃反复冻融2－3次，冰浴中超声破碎细菌7次（功率200W），每次20 sec，间隔20 sec。裂解液以14,000×g、4 ℃离心10 min，收集上清液。

按GST融合蛋白纯化试剂盒(购自Pharmacia 公司)说明书准备50%的Glutathione Sepharose 4B胶，每100 mL上清中加入2 mL胶, 充分混匀, 室温结合60 min, 500 ×g 离心10 min, 收集沉淀, 用PBS洗涤数次, 去除未结合的蛋白质。用1 mL PBS悬浮凝胶，加入还原型谷胱甘肽溶液（50 mol/L Tris、pH 8.0，10 mol/L 谷胱甘肽）2 mL，室温下作用10 min，洗脱结合在凝胶上的GST-Sj14-3-3融合蛋白。重复洗脱3次，收集合并全部洗脱液。

实施例5：重组Sj14-3-3蛋白的纯化

在含GST-Sj14-3-3融合蛋白的溶液中，加入40 U的凝血酶, 混匀后, 22 ℃水浴消化12 h。将酶解产物重复过 Glutathione Sepharose 4B 胶柱（2 mL床体积）以吸附其中的GST蛋白，将过柱液进行SDS-PAGE检测，直至溶液中的GST蛋白全部消除，制备纯化的重组Sj14-3-3。如图5所示。

实施例6：抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体的制备

取8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠3只，首次免疫用完全福氏佐剂加纯化的重组Sj14-3-3蛋白为抗原免疫，剂量为100 μg/只，其后每隔2周用相同剂量的不完全佐剂加抗原进行加强免疫，连续加强免疫3次。当小鼠血清抗体效价>1:10,000时，取免疫小鼠的脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞（骨髓瘤细胞）在50%PEG4000的作用下进行细胞融合，用HAT选择培养基对融合细胞进行筛选。采用间接ELISA法对有杂交瘤细胞生长的细胞孔上清液进行检测，对上清液能识别重组Sj14-3-3蛋白的且反应较强的杂交瘤细胞采用有限稀释法进行多次克隆化，直至每个单克隆细胞孔上清液检测均为阳性，建立杂交瘤细胞株。

将杂交瘤细胞进行大量培养，收集上清液，或将杂交瘤细胞种植到同系小鼠腹腔形成实体瘤，收集含单克隆抗体的腹水。用金黄色葡萄球菌A蛋白亲和层析胶经亲和层析法制备纯化的抗重组Sj14-3-3蛋白单克隆抗体。

按照抗体类型及亚类鉴定试剂盒操作说明书的要求，采用间接ELISA法对单抗进行分型鉴定。结果获得一株产特异性高亲和力的单克隆抗体的杂交瘤细胞JYQ5C6-1,属IgG1亚类。亲和常数为8.82×10⁸ L/MOL。

实施例7：单克隆抗体JYQ5C6-1特异性分析

将将重组Sj14-3-3蛋白，健康人血清，血吸虫成虫，排泄分泌抗原，可溶性虫卵抗原，肝吸虫抗原，疟原虫抗原，大肠杆菌抗原进行12% SDS-PAGE，电泳结束后立即用半干转印缓冲液（Tris 5.82g，glycine 2.93g，methanol 200mL，加无离子水至1L)平衡胶15 min。准备预先切割好的厚滤纸和硝酸纤维素膜（切割至与电泳凝胶大小一致），使用前放置于半干转印缓冲液中浸泡15-30 min。将转膜装置的各组件从下至上依次按阳极、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极的顺序放好，滤纸、NC膜、凝胶精确对齐，每一步都要去除气泡。在室温，恒电压20V条件下电转化30min。硝酸纤维素（NC）膜用5%脱脂牛奶PBST(PBS含0.05%Tween-20)封闭，室温 1 h或4℃过夜；将NC膜纵切成0.3cm宽的长条，编上号码，在水化盘槽内分别与单克隆抗体JYQ5C6-1进行反应，室温摇床上反应1 h。用TBST洗涤NC膜条3次，每次10min，加入用PBS作1:10000稀释的HRP标记抗鼠IgG，室温反应1 h。再用TBST洗涤3次后用3,3-二氨基联苯胺钠盐（DAB）底物液(6mg DAB溶于10mL PBS中, 用前加10μL H₂O₂)显色2 min，用蒸馏水漂洗NC膜条终止反应，观察结果。结果显示单克隆抗体JYQ5C6-1可与重组Sj14-3-3蛋白、血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原及成虫抗原中的天然Sj14-3-3蛋白结合，但不与大肠杆菌蛋白、健康人血清、华支睾吸虫可溶性蛋白反应，显示出良好的特异性。如图6所示。

实施例8 单克隆抗体JYQ5C6-1时间分辩荧光法检测Sj14-3-3蛋白

以单克隆抗体JYQ5C6-1包被酶标板，与不同浓度的重组Sj14-3-3蛋白抗原反应后，再用稀土元素铕标记的单克隆抗体JYQ5C6-1反应，在时间荧光分辩仪上检测，以建立检测循环抗原Sj14-3-3蛋白的时间分辩荧光方法（TRFIA）。同时以酶联免疫吸附方法(ELISA)为对照。时间荧光分辩方法的灵敏度为0.78ng/mL，检测线性范围为0.78-800ng/mL。如图7所示。

分别用TRFIA和ELISA法检测500条尾蚴感染后0、7、14、21天后的家兔血清中的循环抗原Sj14-3-3蛋白，TRFIA的阳性率分别为：0、30%、70%、100%，而常规的ELISA法检测的阳性率则分别为：0, 10%, 30%, 60%。TRFIA检测循环抗原Sj14-3-3的效能明显优于常规的ELISA法。

<110>江苏省血吸虫病防治研究所

 

<120>一株抗日本血吸虫Sj14-3-3蛋白单克隆抗体及其在免疫诊断中的应用

 

<160> 2

 

<210>  SEQ ID NO: 1

<211>  254

<212>  PRT

<213>  日本血吸虫Sj14-3-3蛋白

      

<400>  1

Met Arg Asp Ser Phe  Val Leu Gln Gln Lys  Asp Leu Ser Pro Ser 

                  5                   10                   15

Asp Leu Val Gln Ile  Ala Lys Leu Ala Glu  Gln Ala Glu Arg Tyr 

                 20                   25                   30

Asp Asp Met Ala Ala  Ala Met Lys Ala Tyr  Ala Glu Leu Pro Ala   

                 35                   40                   45

Glu Leu Gly Ser Glu  Glu Arg Asn Leu Phe  Ser Val Ala Tyr Lys   

                 50                   55                   60

Asn Val Val Gly Ala  Arg Arg Ser Ala Trp  Arg Val Ile Ser Ala

                 65                   70                   75

Val Glu His Lys His  Asp Glu Asn Ser Lys  Lys Arg Gln Leu Thr

                 80                   85                   90

Lys Glu Tyr Arg Val  Lys Met Glu Glu Glu  Leu Asn Glu Ile Cys

                 95                  100                  105

Arg Glu Val Leu Thr  Leu Leu Ser Lys Tyr  Leu Thr Pro Lys Ser  

                110                  115                  120

Asn Gly Phe Glu Ser  Gln Val Phe Tyr Arg  Lys Met Glu Gly Asp 

                125                  130                  135

Tyr Tyr Arg Phe Leu  Ala Glu Val Ala Thr  Gly Asp Ala Arg Lys 

                140                  145                  150

Glu Val Val Glu Lys  Ser Gln Ala Ala Tyr  Glu Lys Ala Thr Glu  

                155                  160                  165

Ile Ala Glu Glu Met  Leu Pro Ser Thr His  Pro Ile Arg Leu Gly

                170                  175                  180

Leu Ala Leu Asn Phe  Ser Met Phe Tyr Tyr  Glu Ile Lys Cys Asp

                185                  190                  195

Pro Thr Gln Ala Cys  Asn Leu Ala Lys Arg  Ala Phe Asp Thr Ser 

                200                  205                  210

Ile Gly Glu Leu Asp  Ser Leu Gln Asp Asp  Ser Tyr Lys Asp Ser

                215                  220                  225

Thr Leu Ile Met Gln  Leu Leu Arg Asp Asn  Leu Thr Leu Trp Ala

                230                  235                  240

Ser Asp Gln Pro Glu  Ala Glu Asp Val Asp  Gly Asn Asp Gly

              245                  250              254   

 

<210>  SEQ ID NO: 2

<211>  765

<212>  DNA

<213>  日本血吸虫Sj14-3-3蛋白

 

<400>  2

atgagggatt cgttcgtatt acaacagaaa gatctgtctc catccgacct tgtccagata    60

gctaaacttg cagaacaagc tgaacgctat gatgacatgg ctgctgctat gaaggcttat    120

gctgaattgc cagcggagtt aggaagtgaa gaacggaatt tattttcggt tgcatataaa    180

aatgttgttg gtgctcgaag atcagcctgg agagttatat ctgcagttga gcacaaacat    240

gatgagaact ctaagaaaag gcaactaacg aaggagtacc gtgtcaaaat ggaagaagag    300

ttaaacgaaa tttgcagaga agttcttact ctacttagta aatacttaac accgaagtcc    360

aatggtttcg aaagccaagt tttttatagg aagatggaag gcgattacta ccggtttctt    420

gctgaagttg ccacaggtga tgctcgaaag gaagtagttg aaaagtcgca agctgcatat    480

gaaaaggcaa ctgaaatcgc tgaagaaatg ttaccatcca ctcatcctat tcgccttggc    540

ttagccctta acttctcaat gttctattat gaaataaaat gtgatcctac tcaagcatgc    600

aatcttgcaa aacgggcttt tgatacctcg atcggagaat tggatagcct tcaagatgac    660

tcctacaaag acagtacact aatcatgcaa cttttaagag ataacctaac gttatgggcc    720

agtgaccaac cagaagcaga ggatgttgac ggaaatgatg gctga                    765

 

Claims (5)

1.一种抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体，由保藏号为CCTCC C201118的杂交瘤细胞JYQ5C6-1产生。

2.产生权利要求1所述单克隆抗体的重组Sj14-3-3蛋白的表达，其特征在于将编码Sj14-3-3蛋白分子核苷酸片段SEQ ID NO：2插入到一种表达载体pEGX-4T-3编码谷胱甘肽转移酶GST基因的下游，构建重组表达载体Sj14-3-3/pEGX-4T-3，然后将重组表达载体Sj14-3-3/pEGX-4T-3转化入一种宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中表达一种含有由载体编码的谷胱甘肽转移酶GST与日本血吸虫Sj14-3-3蛋白组成的GST- Sj14-3-3融合蛋白粗制品；

采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法对GST- Sj14-3-3融合蛋白粗制品进行纯化，获得纯化的GST-Sj14-3-3融合蛋白；

将纯化的GST-Sj14-3-3融合蛋白用凝血酶切割，使GST-Sj14-3-3融合蛋白裂解为GST和重组Sj14-3-3蛋白两部分，再用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法去除酶切产物中的GST蛋白，从而获得纯化的重组Sj14-3-3蛋白。

3.权利要求2所述的重组Sj14-3-3蛋白的表达，其特征在于重组Sj14-3-3蛋白分子的核苷酸序列与SEQ ID NO：2保持有至少90%的同源性。

4.权利要求2所述的重组Sj14-3-3蛋白的表达，其特征在于重组Sj14-3-3蛋白分子的氨基酸序列与Sj14-3-3蛋白分子的氨基酸序列蛋白SEQ ID NO：1保持有至少90%的同源性。

5.权利要求1所述的抗重组Sj14-3-3蛋白的单克隆抗体的应用，其特征在于在血吸虫感染免疫诊断中用于检测血吸虫感染患者或动物血液中循环抗原Sj14-3-3蛋白所使用的抗体。

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