CN108440656A

CN108440656A - 结核分枝杆菌pka蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用

Info

Publication number: CN108440656A
Application number: CN201810189255.5A
Authority: CN
Inventors: 刘海鹰; 宋辉; 张艳; 金奇; 陈心春
Original assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Current assignee: Institute of Pathogen Biology of CAMS
Priority date: 2018-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: CN108440656B

Abstract

本发明公开了结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用。本发明提供一种结核分枝杆菌蛋白质PKA及其与ESAT6融合表达而来的融合蛋白。本发明的实验证明，本发明获得的PKA蛋白和融合蛋白可以激活机体宿主细胞产生结核分枝杆菌抗原特异性IFN‑γ，候选为辅助诊断肺结核病的抗原，为提高肺结核病诊断的敏感性和特异性及开发新型诊断试剂盒提供新的思路。

Description

结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及活动性肺结核病(含菌阳、菌阴性肺结核病)患者的辅助诊断；尤其涉及一种结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病的应用。

背景技术

WHO发布的《2016年全球结核病报告》估算2015年全球新发结核病患者达1040万，约有180万人死于结核病。大量结核分枝杆菌潜伏感染者的存在也会导致未来结核病的发病率和患病率居于较高水平。近年来，由于流动人口的剧增、耐药结核分枝杆菌(DR-MTB)的出现及流行，以及人类免疫缺陷病毒(HIV)共感染，导致活动性结核病的发病率和死亡率大幅度上升,至今仍是一个不容忽视的世界性公共卫生难题。我国是结核病高负担国家之一,结核病的疫情严重，位居世界第二。在我国，结核病防控目前仍然面临以下问题：痰菌阳性结核病诊断方法敏感性和特异性低，临床诊断结核病病人中仅50％左右有病原学证据(痰涂片、痰培养和PCR检测)；而临床诊断结核病患者中占较大比例的痰菌阴性结核病(～50％)缺乏特异且敏感的诊断技术和方法，目前菌阴结核病的临床诊断仅靠X光检测或者实验性治疗，造成了临床误诊或者贻误患者合理治疗；耐药结核病诊断时间过长，耐多药结核病患者的负担越来越高；结核/非结核分枝杆菌混合感染鉴别诊断漏检率高；无法区别不同感染时期、无法早期诊断合并感染、无法客观地监测结核病疗效；缺乏有效保护成人结核病的预防性疫苗以及针对潜伏感染重点人群的干预治疗策略与措施等。其中，缺乏早期、快速的诊断技术和方法，缺乏菌阴结核病的诊断方法很大程度上导致了结核病患者的漏诊和社会播散、直接或间接增加了结核病的发病率和死亡率。从目前研究现状看，新疫苗和新药研制在短期内突破的可能性非常小。因此，如何尽快解决结核病诊断问题、早期诊断和治疗患者及研发新型疫苗是国际上的研究热点，是有效控制结核病发病率和死亡率最强有力的保证。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种结核分枝杆菌蛋白质。

本发明提供的蛋白质，为如下a)-e)中任一种蛋白质：

a)氨基酸序列包括序列表中序列1所示的氨基酸序列的蛋白质；

b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；

c)将a)或b)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

d)与a)或b)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

e)a)-d)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列3；

2)其编码序列为序列表中序列3；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

本发明另一个目的是提供一种融合蛋白，包括上述蛋白和ESAT6蛋白。

上述融合蛋白为如下1)-5)中任一种蛋白质：

1)氨基酸序列包括序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；

2)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

3)将1)或2)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

4)与1)或2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

5)1)-4)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

编码上述融合蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列4；

2)其编码序列为序列表中序列4；

上述的蛋白或上述融合蛋白在制备肺结核疫苗中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述的蛋白或上述融合蛋白在制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品中的应用；

或上述的蛋白或上述融合蛋白在制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品中的应用；

或上述的蛋白或上述融合蛋白在制备检测肺结核患者体内结核抗原/抗体产品中的应用；

或上述的蛋白或上述融合蛋白在制备诊断或辅助诊断肺结核患者的产品中的应用。

本发明第3个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品，其活性成分为权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白；所述产品为如下1)-5)中任一种：1)肺结核疫苗；2)激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；3)促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品；4)检测肺结核患者体内结核抗原/抗体产品；5)诊断或辅助诊断肺结核患者。

上述中，所述肺结核患者为菌阳性肺结核患者或菌阴性肺结核患者。

本发明的实验结果证明，本发明筛选了一种新型结核分枝杆菌PKA蛋白，其蛋白本身及其融合ESAT6得到的融合蛋白，可以刺激机体宿主细胞产生特异性IFN-γ，该蛋白可以为辅助诊断肺结核病提供依据。

附图说明

图1为结核分枝杆菌PKA蛋白表达及纯化的SDS-Page鉴定图；A图为PKA蛋白诱导表达结果图，B图为PKA蛋白纯化结果图。

图2为融合蛋白(EP1.2)表达及纯化的SDS-Page鉴定图；A图为EP1.2诱导表达结果图，B图为EP1.2纯化结果图。

图3为蛋白刺激宿主细胞IFN-γELISPOT检测结果(含正常人，菌阳、菌阴性肺结核病患者)。

图4为蛋白刺激宿主细胞IFN-γELISPOT检测结果(含正常人，菌阳、菌阴性肺结核病患者)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、PKA蛋白的获得

1、表达载体及重组菌的构建

PKA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列1；

编码蛋白PKA核酸的核苷酸序列为序列表中序列3。

重组质粒pET30a-GST-PKA为将序列表中序列3所示的编码蛋白PKA核酸替换pET30a-GST载体(BPI,PT-00113)的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点间的DNA分子，得到的载体。

将重组质粒pET30a-GST-PKA导入BL21菌中，得到重组菌。

将空载体pET30a-GST转入BL21菌中，得到对照重组菌。

2、目的蛋白的表达

(1)接1μl活化的1得到的重组菌菌液到10ml LB液体培养基中，37℃培养，200rpm。

(2)将培养的菌液转接到500ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)37℃诱导4h。

(3)收菌：6,000rpm，离心5min。弃上清。

(4)超声破菌：菌体用30ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500W,60次，每次10s，间隔15s)。

(5)取100μl超声后的菌悬液，12,000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。电泳检测，结果如图1A所示，可以看出，目标蛋白存在于沉淀中，大小为72KD。

采用同样的方法表达纯化对照重组菌，没有目标蛋白的表达。

3、蛋白质纯化

(1)30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬上述3的步骤(5)超声离心得到的沉淀，静置10min。

(2)12,000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。

(3)30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min。

(4)12,000rpm，离心10min，弃上清。

(5)重复(3)、(4)一次。

(6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5ml含8M尿素的10mMTris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白。

(7)12,000rpm，离心10min，收集上清。

取50μl电泳检测，结果如图1B所示，可以看出，得到纯化的目标蛋白。

实施例2、PKA-ESAT-6融合蛋白的获得

1、表达载体及重组菌的构建

融合蛋白EP1.2为将蛋白ESAT6和PKA通过连接肽融合连接，得到的蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列2；其中序列2第1-95位为蛋白ESAT6，第96-100位为连接肽，第101-437位为蛋白PKA。

编码融合蛋白EP1.2核酸的核苷酸序列为序列表中序列4；其中序列4第1-285位为编码蛋白ESAT6核酸，第286-300位为编码连接肽核酸，第301-1311位为编码PKA核酸。

重组质粒pET28a-EP1.2为将序列表中序列4所示的编码蛋白EP1.2核酸替换pET28a载体(Solarbio，P3110)的EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点间的DNA分子，得到的载体。

将重组质粒pET28a-EP1.2导入BL21菌中，得到重组菌。

2、目的蛋白的表达

(1)接1μl活化的1得到的重组菌菌液到5ml LB液体培养基中，37℃培养，200rpm。

(2)将培养的菌液转接到250ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)37℃诱导4h。

(3)收菌：8,000rpm，离心5min。弃上清。

(5)取100μl超声后的菌悬液，12,000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。电泳检测，结果如图2A所示，可以看出，目标蛋白存在于沉淀中，大小为50KD。

3、蛋白质纯化

(1)30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬上述2的步骤(5)超声离心得到的沉淀，静置10min。

(2)12,000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存。

(3)30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min。

(4)12,000rpm，离心10min，弃上清。

(5)重复(3)、(4)一次。

(7)12,000rpm，离心10min，收集上清。

取50μl电泳检测，结果如图2B所示，可以看出，得到纯化的目标蛋白。

实施例3、PKA蛋白及融合蛋白EP1.2刺激宿主细胞抗原特异性IFN-γ分泌水平

IFN-γELISPOT检测是目前临床用于诊断肺结核病的一种辅助方法，也是免疫学实验中用于检测淋巴细胞被抗原刺激后IFN-γ的分泌水平的经典实验，从而评价抗原对淋巴细胞的激活情况。具体如下：

血浆收集：首先从离体的肺结核病患者(已鉴定感染了结核分枝杆菌)血液和健康人(已鉴定无症状、结核分枝杆菌感染阴性)的血液中分别分离得到的肺结核病患者以及健康人对照的血浆后，-80℃冰箱保存。

外周血细胞分离：从离体的肺结核病患者(已鉴定感染了结核分枝杆菌)血液和健康人(已鉴定无症状、结核分枝杆菌感染阴性)的血液中分别分离得到的肺结核病患者外周血淋巴细胞(PBMC)以及健康人对照的PBMC，以每孔2.5x10⁵个细胞加入到96孔板中；分别进行如下实验：

阳性对照组1：向肺结核病患者外周血淋巴细胞(PBMC)中加入10ul PHA，终浓度为2.5ug/ml；

阳性对照组2：向健康人对照的PBMC中加入10ul PHA，终浓度为2.5ug/ml；

阴性对照组1：向肺结核病患者PBMC中加入10ul溶剂PBS；

阴性对照组2：向健康人对照的PBMC中加入10ul溶剂PBS；

阴性对照组3：向肺结核病患者PBMC中加入10ul GST(载体蛋白对照)，终浓度为10ug/ml；

阴性对照组4：向健康人对照的PBMC中加入10ul GST(载体蛋白对照)，终浓度为10ug/ml；

ESAT6(E6)对照组1：将ESAT6蛋白(以下简称E6，记载在如下文献中：Chen,X.,etal.,Diagnosis of Active Tuberculosis in China Using an In-House GammaInterferon Enzyme-Linked Immunospot Assay.Clinical and Vaccine Immunology,2009.16(6):p.879-884.)加入肺结核病患者PBMC中，使ESAT蛋白6在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

ESAT6(E6)对照组2：将ESAT6蛋白加入健康人对照的PBMC中，使ESAT6蛋白在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

Peptide pool B对照组1：将混合多肽Peptide pool B(也可称为P8.P10，记载在如下文献中：Chen,X.,et al.,Diagnosis of Active Tuberculosis in China Using anIn-House Gamma Interferon Enzyme-Linked Immunospot Assay.Clinical and VaccineImmunology,2009.16(6):p.879-884.)加入肺结核病患者PBMC中，使混合多肽在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

Peptide pool B对照组2：将混合多肽Peptide pool B(也可称为P8.P10)加入健康人对照的PBMC中，使混合多肽在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

实验PKA组1：将实施例1纯化得到的PKA蛋白加入肺结核病患者PBMC中，使PKA蛋白在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

实验PKA组2：将实施例1纯化得到的PKA蛋白加入健康人对照的PBMC中，使PKA蛋白在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

实验PKA-ESAT6组1：将实施例2纯化得到的融合蛋白EP1.2加入肺结核病患者PBMC中，使融合蛋白EP1.2在PBMC中的浓度均为10ug/ml；

实验PKA-ESAT6组2：将实施例2纯化得到的融合蛋白EP1.2加入健康人对照的PBMC中，使融合蛋白EP1.2在PBMC中的浓度均为10ug/ml。

将各组蛋白与PBMC共同于37℃，5％CO₂孵育16至20个小时。洗涤后，加入生物素标记的IFN-γ单抗(达科为，DKW22-1000-500s)孵育1小时。洗涤后，再加入亲和素标记的辣根过氧化酶孵育1小时。洗涤后，加入显色底液，显色反应终止后，每孔的斑点数通过ELISPOTreader(bioReader4000Pro-X；公司：Biosys，Germany)系统计数。

按照ROC(receiver operating characteristic)曲线采用约登指数计算的cut-off值。

若待测样本的斑点数大于等于cut-off值，则可辅助临床诊断怀疑为肺结核病患者，或者诊断待测样本感染结核分枝杆菌；

若待测样本的斑点数小于cut-off值，则此次检测结果不支持待测样本感染结核分枝杆菌。

阳性率＝阳性患者数/总患者数

结果如图3和图4所示，与正常人相比，PKA(cut-off值为25.25)和EP1.2(cut-off值为46)能激活菌阳菌阴性结核患者的抗原特异性T细胞免疫反应；注：上述图中阳性率1为E6和Peptide pool B诊断阴性，PKA和EP1.2诊断阳性的阳性率；阳性率2为各抗原的总阳性率。

对于临床诊断菌阳(痰涂片、痰培养或者分子生物学诊断中至少一个为阳性)的肺结核患者：(1)如图3阳性率统计表所示，PKA蛋白用于诊断肺结核的阳性率与蛋白E6相近，分别为41.8％和52.5％，融合蛋白EP1.2能更显著的激活抗原特异性T细胞的免疫反应，阳性率为68.9％；(2)E6和Peptide pool B诊断阴性的菌阳性肺结核患者中，PKA和EP1.2检测阳性率分别为31.7％和31.7％。

对于临床诊断菌阴(菌阴性肺结核：3次痰涂片及1次培养阴性，且具有以下(1)～(6)中3项或(7)～(8)中任何1项即可确诊。(1)典型肺结核病临床症状和胸部X线表现。(2)抗结核治疗有效。(3)临床可排除其他非结核性肺部疾病。(4)PPD(5单位)强阳性，血清抗结核抗体阳性。(5)痰结核菌PCR+DNA探针检测呈阳性。(6)肺外组织病理证实结核病变。(7)支气管肺泡灌洗液(BALF)检出抗酸分枝杆菌。(8)支气管或肺部组织病理证实结核病变)的肺结核患者：(1)如图4阳性率统计表所示，PKA蛋白阳性率与E6蛋白相近，分别为46.9％和45.7％，融合蛋白EP1.2能更显著的激活抗原特异性T细胞的免疫反应，阳性率高达72.8％。(2)对于E6和Peptide pool B诊断阴性的菌阴性肺结核患者，PKA和EP1.2诊断的阳性率分别为42.4％和51.5％。

综上所述，对于临床诊断为肺结核患者，PKA蛋白和融合蛋白EP1.2可以显著激活宿主细胞产生抗原特异性T细胞免疫反应，菌阳性肺结核患者中，实验室检测阳性率高于或者等同于同类型商品化抗原；菌阴性肺结核患者，实验室检测阳性率显著高于同类型商品化抗原，提高敏感性。因此说明，结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白EP1.2可以提高临床诊断结核分枝杆菌的敏感性和特异性，弥补目前公认的ESAT-6和CFP10抗原的不足；并且具有作为候选结核分枝杆菌特异性功能抗原的潜力。

序列表

<110>中国医学科学院病原生物学研究所

<120>结核分枝杆菌PKA蛋白及其融合蛋白在辅助诊断肺结核病中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Pro Arg Val Gly Val Thr Leu Ser Gly Arg Tyr Arg Leu Gln

1 5 10 15

Arg Leu Ile Ala Thr Gly Gly Met Gly Gln Val Trp Glu Ala Val Asp

20 25 30

Asn Arg Leu Gly Arg Arg Val Ala Val Lys Val Leu Lys Ser Glu Phe

35 40 45

Ser Ser Asp Pro Glu Phe Ile Glu Arg Phe Arg Ala Glu Ala Arg Thr

50 55 60

Thr Ala Met Leu Asn His Pro Gly Ile Ala Ser Val His Asp Tyr Gly

65 70 75 80

Glu Ser Gln Met Asn Gly Glu Gly Arg Thr Ala Tyr Leu Val Met Glu

85 90 95

Leu Val Asn Gly Glu Pro Leu Asn Ser Val Leu Lys Arg Thr Gly Arg

100 105 110

Leu Ser Leu Arg His Ala Leu Asp Met Leu Glu Gln Thr Gly Arg Ala

115 120 125

Leu Gln Ile Ala His Ala Ala Gly Leu Val His Arg Asp Val Lys Pro

130 135 140

Gly Asn Ile Leu Ile Thr Pro Thr Gly Gln Val Lys Ile Thr Asp Phe

145 150 155 160

Gly Ile Ala Lys Ala Val Asp Ala Ala Pro Val Thr Gln Thr Gly Met

165 170 175

Val Met Gly Thr Ala Gln Tyr Ile Ala Pro Glu Gln Ala Leu Gly His

180 185 190

Asp Ala Ser Pro Ala Ser Asp Val Tyr Ser Leu Gly Val Val Gly Tyr

195 200 205

Glu Ala Val Ser Gly Lys Arg Pro Phe Ala Gly Asp Gly Ala Leu Thr

210 215 220

Val Ala Met Lys His Ile Lys Glu Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Asp

225 230 235 240

Leu Pro Pro Asn Val Arg Glu Leu Ile Glu Ile Thr Leu Val Lys Asn

245 250 255

Pro Ala Met Arg Tyr Arg Ser Gly Gly Pro Phe Ala Asp Ala Val Ala

260 265 270

Ala Val Arg Ala Gly Arg Arg Pro Pro Arg Pro Ser Gln Thr Pro Pro

275 280 285

Pro Gly Arg Ala Ala Pro Ala Ala Ile Pro Ser Gly Thr Thr Ala Arg

290 295 300

Val Ala Ala Asn Ser Ala Gly Arg Thr Ala Ala Ser Arg Arg Ser Arg

305 310 315 320

Pro Ala Thr Gly Gly His Arg Pro Pro Arg Arg Thr Phe Ser Ser Gly

325 330 335

Gln Arg Ala Leu Leu Trp Ala Ala Gly Val Leu Gly Ala Leu Ala Ile

340 345 350

Ile Ile Ala Val Leu Leu Val Ile Lys Ala Pro Gly Asp Asn Ser Pro

355 360 365

Gln Gln Ala Pro Thr Pro Thr Val Thr Thr Thr Gly Asn Pro Pro Ala

370 375 380

Ser Asn Thr Gly Gly Thr Asp Ala Ser Pro Arg Leu Asn Trp Thr Glu

385 390 395 400

Arg Gly Glu Thr Arg His Ser Gly Leu Gln Ser Trp Val Val Pro Pro

405 410 415

Thr Pro His Ser Arg Ala Ser Leu Ala Arg Tyr Glu Ile Ala Gln

420 425 430

<210> 2

<211> 437

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

35 40 45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Gly

85 90 95

Gly Ser Gly Gly Met Ser Pro Arg Val Gly Val Thr Leu Ser Gly Arg

100 105 110

Tyr Arg Leu Gln Arg Leu Ile Ala Thr Gly Gly Met Gly Gln Val Trp

115 120 125

Glu Ala Val Asp Asn Arg Leu Gly Arg Arg Val Ala Val Lys Val Leu

130 135 140

Lys Ser Glu Phe Ser Ser Asp Pro Glu Phe Ile Glu Arg Phe Arg Ala

145 150 155 160

Glu Ala Arg Thr Thr Ala Met Leu Asn His Pro Gly Ile Ala Ser Val

165 170 175

His Asp Tyr Gly Glu Ser Gln Met Asn Gly Glu Gly Arg Thr Ala Tyr

180 185 190

Leu Val Met Glu Leu Val Asn Gly Glu Pro Leu Asn Ser Val Leu Lys

195 200 205

Arg Thr Gly Arg Leu Ser Leu Arg His Ala Leu Asp Met Leu Glu Gln

210 215 220

Thr Gly Arg Ala Leu Gln Ile Ala His Ala Ala Gly Leu Val His Arg

225 230 235 240

Asp Val Lys Pro Gly Asn Ile Leu Ile Thr Pro Thr Gly Gln Val Lys

245 250 255

Ile Thr Asp Phe Gly Ile Ala Lys Ala Val Asp Ala Ala Pro Val Thr

260 265 270

Gln Thr Gly Met Val Met Gly Thr Ala Gln Tyr Ile Ala Pro Glu Gln

275 280 285

Ala Leu Gly His Asp Ala Ser Pro Ala Ser Asp Val Tyr Ser Leu Gly

290 295 300

Val Val Gly Tyr Glu Ala Val Ser Gly Lys Arg Pro Phe Ala Gly Asp

305 310 315 320

Gly Ala Leu Thr Val Ala Met Lys His Ile Lys Glu Pro Pro Pro Pro

325 330 335

Leu Pro Pro Asp Leu Pro Pro Asn Val Arg Glu Leu Ile Glu Ile Thr

340 345 350

Leu Val Lys Asn Pro Ala Met Arg Tyr Arg Ser Gly Gly Pro Phe Ala

355 360 365

Asp Ala Val Ala Ala Val Arg Ala Gly Arg Arg Pro Pro Arg Pro Ser

370 375 380

Gln Thr Pro Pro Pro Gly Arg Ala Ala Pro Ala Ala Ile Pro Ser Gly

385 390 395 400

Thr Thr Ala Arg Val Ala Ala Asn Ser Ala Gly Arg Thr Ala Ala Ser

405 410 415

Arg Arg Ser Arg Pro Ala Thr Gly Gly His Arg Pro Pro Arg Arg Thr

420 425 430

Phe Ser Ser Gly Gln

435

<210> 3

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagccccc gagttggcgt gacgctgtcg ggcagatacc gcctgcagcg cctcatcgcc 60

accggtggta tgggccaagt ctgggaggcc gtggataacc ggttgggccg gcgtgttgcg 120

gtgaaggtgc tcaagagcga gttctcctcc gatccggagt tcatcgaacg gttccgggcc 180

gaagcgcgca ccaccgcgat gctgaaccat ccgggcatcg ccagcgtgca cgactacggc 240

gaaagccaga tgaacgggga gggtcgcacg gcctacctgg tgatggagct ggtcaacggc 300

gagccactaa attcggtgct caaacgcacc ggccggctgt cgttgcggca cgcactggac 360

atgctcgagc agaccggccg cgctctgcag atcgcgcatg ccgctggcct ggtgcaccgc 420

gacgtcaaac cgggcaacat cttgatcacc cccaccgggc aggtgaagat caccgacttc 480

ggcatcgcca aagccgtcga tgcagcgccc gtgacccaga ccggcatggt gatgggcacc 540

gcccaataca tcgcgccgga gcaggccctc ggtcacgacg ccagcccggc cagcgacgtc 600

tattcactgg gagttgttgg gtatgaagcg gtttcgggta aacggccgtt cgccggcgat 660

ggtgccctga ccgtggcaat gaagcacatc aaggagccgc cgccgccgct gcctcccgac 720

ctgccgccca atgtgcgaga actcatcgag ataactctgg tgaagaaccc cgcgatgcgc 780

tatcgcagtg ggggaccgtt cgccgacgcg gtggcagcgg tgcgcgccgg ccgccggccc 840

ccgcggccca gccagacacc cccccctggc cgggccgccc cggcggccat tccgtcgggt 900

acgacagcca gggtcgcggc caactctgct ggccggactg cggcatcccg tcgatcccgc 960

ccggccacgg gtggtcaccg gccgccgcgg cgcacgtttt cgtccggtca gcgtgcgctg 1020

ctctgggccg cgggggtgct gggggcgctg gcaatcatca tcgccgtgct gctcgtcatc 1080

aaagcgcccg gggacaacag cccgcagcag gcaccgacgc cgaccgtgac caccaccggg 1140

aaccctccgg ccagcaacac tggcgggact gatgctagcc cgcgactcaa ttggacggaa 1200

cgcggggaaa cacgtcattc tggactgcaa agctgggttg tcccgccgac accgcattcg 1260

cgcgcgtcgc tggcccgata cgagatagcg caatga 1296

<210> 4

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcaggagg atcaggaggt 300

atgagccccc gagttggcgt gacgctgtcg ggcagatacc gcctgcagcg cctcatcgcc 360

accggtggta tgggccaagt ctgggaggcc gtggataacc ggttgggccg gcgtgttgcg 420

gtgaaggtgc tcaagagcga gttctcctcc gatccggagt tcatcgaacg gttccgggcc 480

gaagcgcgca ccaccgcgat gctgaaccat ccgggcatcg ccagcgtgca cgactacggc 540

gaaagccaga tgaacgggga gggtcgcacg gcctacctgg tgatggagct ggtcaacggc 600

gagccactaa attcggtgct caaacgcacc ggccggctgt cgttgcggca cgcactggac 660

atgctcgagc agaccggccg cgctctgcag atcgcgcatg ccgctggcct ggtgcaccgc 720

gacgtcaaac cgggcaacat cttgatcacc cccaccgggc aggtgaagat caccgacttc 780

ggcatcgcca aagccgtcga tgcagcgccc gtgacccaga ccggcatggt gatgggcacc 840

gcccaataca tcgcgccgga gcaggccctc ggtcacgacg ccagcccggc cagcgacgtc 900

tattcactgg gagttgttgg gtatgaagcg gtttcgggta aacggccgtt cgccggcgat 960

ggtgccctga ccgtggcaat gaagcacatc aaggagccgc cgccgccgct gcctcccgac 1020

ctgccgccca atgtgcgaga actcatcgag ataactctgg tgaagaaccc cgcgatgcgc 1080

tatcgcagtg ggggaccgtt cgccgacgcg gtggcagcgg tgcgcgccgg ccgccggccc 1140

ccgcggccca gccagacacc cccccctggc cgggccgccc cggcggccat tccgtcgggt 1200

acgacagcca gggtcgcggc caactctgct ggccggactg cggcatcccg tcgatcccgc 1260

ccggccacgg gtggtcaccg gccgccgcgg cgcacgtttt cgtccggtca g 1311

Claims

1.一种蛋白质，为如下a)-e)中任一种蛋白质：

b)氨基酸序列由序列表中序列1所示的氨基酸残基组成；

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列3；

2)其编码序列为序列表中序列3；

4.一种融合蛋白，包括权利要求1所述的蛋白和EST6蛋白。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：

所述融合蛋白为如下1)-5)中任一种蛋白质：

2)氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

6.编码权利要求4或5所述融合蛋白的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下1)-4)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列4；

2)其编码序列为序列表中序列4；

8.权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白在制备肺结核疫苗中的应用；

或，权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白在制备激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品中的应用；

或权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白在制备促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品中的应用；

或权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白在制备检测肺结核患者体内结核抗原/抗体产品中的应用；

或权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白在制备诊断或辅助诊断肺结核患者的产品中的应用。

9.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白；所述产品为如下1)-5)中任一种：1)肺结核疫苗；2)激活或促进肺结核患者体内特异性IFN-γ产生的产品；3)促进或激活结核分枝杆菌抗原特异性IFN-γ产生的产品；4)检测肺结核患者体内结核抗原/抗体产品；5)诊断或辅助诊断肺结核患者。

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述肺结核患者为菌阳性肺结核患者或菌阴性肺结核患者。