CN103409453A - 重组大熊猫il-6免疫佐剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤，A1大熊猫IL-6全基因克隆；A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养；A12总RNA提取；A13cDNA的合成；A14引物的设计与合成；A15目的基因的PCR扩增；A16目的基因PCR产物的TA克隆；A17重组质粒的初步鉴定；A2大熊猫白介素6的原核表达、多克隆抗体的制备；犬瘟热素有“毁灭性传染病”之称，已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病，严重影响了大熊猫的健康发展。本发明重组大熊猫IL-6免疫佐剂能显著增强犬瘟热疫苗免疫效果，对犬瘟热的防治具有重要意义。

Description

重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法

技术领域

本发明涉及，尤其涉及的是一种重组大熊猫IL-6(gpIL-6)免疫佐剂的制备方法。 

背景技术

大熊猫被誉为中国的“国宝”，是世界级珍稀野生动物，然而它却濒临灭绝，除了人为原因对大熊猫栖息地的破坏以外，疾病死亡成为当前大熊猫种群濒危的关键原因之一。在大熊猫所患的40多种疾病中，犬瘟热IL-6是威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病。疫苗免疫目前是预防控制CDV的主要措施，但当前使用的疫苗并不十分理想，存在免疫效率低与安全性差两大难题。因此，在安全剂量疫苗接种下提高大熊猫机体的免疫力，成为当今疫苗开发研究的焦点。细胞因子是由免疫效应细胞和其他相关细胞产生，具有多种生物学活性。在免疫应答的产生和调节中具有重要作用。 

对于IL-6(白细胞介素6)的研究，最早可追溯到1980年，Weissenbach J等人发现成纤维细胞经Poly I-C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子，当时称其为干扰素β2(Inteferonβ2，IFNβ2)。后经实验证实，干扰素β2与随后克隆得到的一系列生长因子，如B细胞分化因子(BCDF-2)，细胞毒T细胞分化因子(CDF)，肝细胞刺激因子(HSF)等，均是分子量为21～30kD的同种蛋白，因此为了避免名称使用的混乱，统一称之IL-6。IL-6是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一。 

IL-6的来源十分广泛，机体的许多淋巴和非淋巴细胞均可表达IL-6，如T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、上皮细胞、造血干细胞等，其中以巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞为主。其中血液IL-6主要来源于活化的单核细胞，局部组织IL-6由成纤维细胞与局部巨噬细胞产生，T细胞、B细胞、骨髓基质细胞等都能在不同条件下产生IL-6。另外，细胞因子(IL-1、IL-2)、促分裂原(LPS、PHA)、微生 物(某些细菌、病毒)和防线菌酮均能刺激或增加IL-6产生。 

人和小鼠的IL-6基因分别定位于染色体7p15-21和517.0cM，都有5个外显子和4个内含子。人IL-6前体为212个氨基酸残基，包括一段含28个氨基酸残基的信号肽，在分泌到胞外时信号肽被切割。成熟的IL-6含184个氨基酸残基，其1-28位氨基酸残基区无重要功能，主要跟蛋白的正确折叠有关；97-104位氨基酸残基区主要作用是维持蛋白结构完整；29-34位氨基酸残基区与180-184位氨基酸残基区紧密靠近，构成hIL-6的活性位点，在与受体结合、发挥生物功能过程中起关键作用。转录后修饰包括N糖基化、O糖基化和磷酸化，位于45aa，51aa，74aa，84aa的4个半胱氨酸形成两对二硫键，这对维持hIL-6的构象至关重要，N端28个氨基酸残基虽不直接与IL-6生物学活性有关，但对整个IL-6分子的组成起稳定作用。同时，研究表明，IL-6翻译后能被糖基化修饰或丝氨酸磷酸化，在原核表达中磷酸化与否不影响其生物学活性。对hlL-6的二级结构进行预测，发现IL-6由4个反向平行排列的α螺旋，2个长的和1个短的襻结构组成。X射线晶体衍射技术研究表明，IL-6和粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)具有共同的结构特征，并且在氨基酸序列上有高度的同源性。IL-6是一种糖蛋白，分子量由于在不同组织与个体间蛋白糖基化，磷酸化差异很大在19-28KDa之间。 

IL-6受体(IL-6R)分布细胞表面，并且分布数量有一些差别，从几百到上万个不等。IL-6受体在整个IL-6信号传导过程中起到重要的作用，IL-6只有与细胞膜上的受体结合后才能催发一系列级联反应，最终产生生物学效应。 

IL-6R为异源二聚体，由80KD的α链和130KD的β链(gp130)组成，α链cDNA全长约5.0kb，cDNA编码的蛋白为468个氨基酸，其中含有19个氨基酸残基的疏水信号肽，成熟的IL-6Rα链由以下三部分组成：339个氨基酸组成的胞外区，28个氨基酸组成的跨膜区和胞浆内82个氨基酸组成的功能区，胞膜外区含一个Ig样区(C2，约100个氨基酸)、2个III型纤维结合蛋白结构(各含100个氨基酸)及1个细胞因子受体的同源区所组成，后者含4个保守的Cys和一个WSXWS结构。gp130只有在糖基化后才能由胞浆内移到细胞表面，成为成熟的gp130，从而发挥生物学功能。成熟的gp130由三部分组成：597个氨基酸残基组成的膜外区、22氨基酸残基组成的跨膜区和277个氨基酸残基 组成的胞浆区。 

IL-6在血液或组织中与各种细胞表面的IL-6受体结合，通过传导不同的信号途径发挥出不同甚至全然相反的生物学功能。IL-6主要通过JAK／STATS与RaS／MAPK这两条信号途径将外界信号传导至核内，调节靶基因的表达。 

早年已知IL6可作用于B细胞，使其增殖分化为分泌抗体的浆细胞。近年陆续发现，IL6有多种靶细胞和较多生活物性，实际上这是IL6的第二个特征。 

IL-6在B细胞增殖和分化过程中起调节作用，它是诱导B细胞分泌Ig的必需因子之一，主要直接影响成熟的B细胞产生免疫球蛋白IgM、IgG和IgA，对同型Ig无选择性。这一点与其它白细胞介素不同，如IL-4使休止期B细胞分泌IgG1和IgE，1L-5使激活的B细胞选择性分泌lgA。IL-6对B细胞的作用归纳为三方面：①诱导B细胞增殖、分化并产生抗体；②诱导B细胞形成克隆.也可促进B细胞型杂交瘤生长；③参刀豆蛋白A(ConA)与B细胞型心肌粘液瘤的发生；在EB病毒感染B细胞并使其转化为淋巴母细胞时，IL6是这类细胞的生长因子；IL-6还能使这类细胞膜表面呈现IgG型B细胞表面免疫球蛋白(Smlg)。 

IL-6也与T细胞的活化、增殖和分化有关。已知T细胞在抗原或分裂原激活后，必须有辅助信号存在，才能产生增殖反应。IL-6具有这种辅助信号作用，它能促进植物凝集素(PHA)或激活的T细胞增殖分化。IL-6能协同IL-1，IL-4，肿瘤坏死因子-α(TNF)的促胸腺细胞增殖效应，刺激IL-2的产生，进而诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)增殖、分化。 

在诱导小鼠多种造血前体细胞增殖方面，IL-6诱导这些细胞由休眠状态转入细胞周期，IL-3促使这些造血前体细胞继续增殖。同正常骨髓细胞及单独IL-3刺激的骨髓细胞集落(造血干细胞)相比，经IL-6和IL-3体外共同刺激的骨髓细胞集落在体内具有更强的重建造血能力。 

IL-6作为肝细胞刺激因子，主要诱导培养肝细胞产生急性反应期蛋白质的合成。IL-6具有神经生长因子的功能，诱导PC12细胞分化成神经细胞。 

参考文献 

向骏.鸭瘟病毒VP19c蛋白的表达，细胞内定位及RNA干扰抑制病毒复制的初步研究[D]；四川农业大学，2011. 

林华.PRRSV变异株的分离鉴定，鉴别诊断和新型基因疫苗的研究[D]；四川农业大学，2010. 

陈弟诗.猪乙型脑炎病毒-细小病毒-伪狂犬病毒活载体疫苗的研究[D]；四川农业大学，2011. 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法。 

本发明的技术方案如下： 

一种重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤 

A1大熊猫IL-6全基因克隆； 

A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养； 

无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA-Na₂真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀释；缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r／min离心20min。小心将白细胞移于另一试管，加等量RPMI1640液，2000r／min离心15min，去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗涤2次，去上清；沉淀淋巴细胞用含10μg／mL ConA、10％小牛血清、100μg／mL青霉素和100μg／mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10μL细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×10⁶个／mL，分装于细胞培养瓶中，CO₂培养箱中37℃培养24h； 

A12总RNA提取； 

A13cDNA的合成； 

A14引物的设计与合成； 

根据GenBank中已报道的大熊猫IL-6cDNA序列，运用引物设计软件Oligo6.0分别设计两对扩增IL-6全基因的引物，具体序列如下表所示： 

A15目的基因的PCR扩增； 

以大熊猫基因组cDNA为模板，IL-6P1／P2为引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存； 

A1.6目的基因PCR产物的TA克隆； 

A161目的片段的回收 

A162目的片段与克隆载体连接 

将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，16℃连接过夜； 

A163DH5α感受态细胞的制备； 

A164连接产物的转化； 

A17重组质粒的初步鉴定； 

A171重组质粒的小量提取； 

A172重组质粒双酶切鉴定； 

A173核苷酸序列的测定； 

将鉴定后的阳性重组质粒菌种保存液送宝生物公司测序； 

A2大熊猫白介素6的原核表达、多克隆抗体的制备； 

A21引物设计与合成； 

根据大熊猫IL-6基因测序结果以及信号肽分析结果，运用Oligo7.0设计引物：IL-6P1／P2，扩增编码IL-6成熟肽的cDNA碱基序列，引物见下表： 

A22目的片段的PCR扩增； 

以重组质粒pMD18-T-IL6作为模板，加入特异性引物，进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存； 

A23目的基因的TA克隆 

A231IL-6的TA克隆 

将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，16℃连接过夜；将上述TA连接液转化克隆菌DH5α，活化培养后将转化菌涂布含Amp(50mg／L)的LB固体培养基，置于37℃培养箱中，正置吸附0.5h，然后倒置培养12～24h； 

A24重组质粒的初步鉴定； 

A25原核表达载体的构建； 

A26重组表达菌株的培养及表达； 

A27原核表达条件的优化； 

A28重组表达蛋白的可溶性检测。 

细胞因子是由免疫效应细胞和相关细胞产生的，具有重要的生物学活性，它在调节免疫应答方面具有重要作用，可以作为新一代免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。目前己有许多细胞因子被证实能加强疫苗免疫效果，增强机体抵抗力。犬瘟热素有“毁灭性传染病”之称，已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病，严重影响了大熊猫的健康发展。因此本发明重组大熊猫IL-6免疫佐剂能显著增强犬瘟热疫苗免疫效果，对犬瘟热的防治具有重要意义。 

附图说明

图1为IL-6基因的克隆；A：M.DL2000Marker；1.IL-6基因扩增产物； 

图2为pMD-IL-6双酶切鉴定图谱，M：DNA分子质量标准1：pMD-IL-6酶切产物； 

图3为克隆载体的酶切鉴定，M.DL2000Marker；1.pMD-6酶切产物； 

图4为重组表达质粒的酶切鉴定，M.DNA Marker III；1.pET-32-6双酶切产物； 

图5为重组蛋白的SDS-PAGE分析，M.蛋白marker；1.空载体pET-32；2.超声波破碎后的上清；3.包涵体用2M尿素洗涤后的上清；4.包涵体用4M尿素洗涤后的上清；5.包涵体用6M尿素洗涤后的上清；6.包涵体用8M尿素洗涤后的上清； 

图6为抗血清的琼扩效价分析； 

图7为重组蛋白的纯化与免疫印迹分析，M.蛋白marker；1.纯化的重组蛋白pET-32-IL-6；2.兔抗IL-6为一抗；3.阴性对照。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。 

实施例1 

大熊猫IL-6全基因克隆 

实验方法 

1.1大熊猫外周血淋巴细胞体外培养 

无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA-Na₂真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀释。缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r/min离心20min。小心将白细胞移于另一试管，加等量RPMI1640液，2000r/min离心15min，去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗涤2次，去上清；沉淀淋巴细胞用含10μg／mL ConA、10％小牛血清、100μg／mL青霉素和100μg／mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10μL细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×10⁶个／mL，分装于细胞培养瓶中，CO₂培养箱中37℃培养24h。 

1.2总RNA提取 

总RNA提取参照Promega公司的RNA提取试剂盒进行，具体步骤如下： 

(1)将培养24h后的细胞瓶取出，用巴氏吸管吹打瓶底面，然后倒入离心管中4000r／min离心5min，弃上清。 

(2)向离心管中加300μL的裂解液，室温下作用5min。 

(3)然后加入600μL的Blue buffer，混匀。放置于70℃的水中作用2.5min。 

(4)离心10min，将上清转移至另外的干净EP管中，加入200μL95％的乙醇，混匀后转入吸附柱中，作用5min，12000r／min离心1min，弃收集管中的液体。 

(5)向吸附柱中加洗涤液600μL洗涤1次，离心，弃收集管中的液体。 

(6)加DNAase混合液50μL作用15min后加终止液200μL，12000r／min离心1min，弃收集管中的液体。 

(7)加入600μL洗涤液洗涤1次，弃收集管中的液体。 

(8)再加入250μL洗涤液洗涤，弃收集管中的液体，12000r／min空载离心3min。 

(9)换一洁净的EP管代替收集管，往吸附柱上加入80μL的无核酸酶水，13000r／min离心1min，收集EP管中的液体，保存于-70℃备用。 

1.3cDNA的合成 

以上步抽提的总RNA为模板，按照Prime Script^TM RT reagent kit反转录试剂盒的操作步骤进行反转录，其反转录体系为： 

表1 

37℃15min，85℃5sec。反转录后的cDNA保存于-20℃备用。 

1.4引物的设计与合成 

根据GenBank中已报道的大熊猫IL-6cDNA序列，运用引物设计软件Oligo6.0分别设计两对扩增IL-6全基因的引物，具体序列如下表所示： 

表2 

1.5目的基因的PCR扩增 

以大熊猫基因组cDNA为模板，IL-6P1／P2为引物进行PCR扩增，基因扩增反应体系如下： 

表3 

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存。 

取5μl PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增结果。 

1.6目的基因PCR产物的TA克隆 

1.6.1目的片段的回收 

目的片段的回收参照天根公司DNA胶回收试剂盒提供的说明书进行，回收步骤如下： 

(1)往吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r／min离心1min，弃收集管中废液，再将吸附柱放回收集管； 

(2)将琼脂糖凝胶中含有目的片段的DNA条带切下吸干表面的缓冲液放入离心管 中并称取重量； 

(3)加入3倍体积溶胶液于胶块中。55℃水浴，期间不断轻柔地上下翻转离心管，以使胶块充分溶解，水浴直至完全溶解； 

(4)待溶胶液冷却至室温时，将其加入己平衡过的吸附柱中，静置2min，12000r／min离心1min，倒掉收集管内废液； 

(5)加入700μl漂洗液(使用前先检验是否已加入无水乙醇)于吸附柱中，静置2min，8000r／min离心1min，倒掉收集管内废液； 

(6)加入500μL漂洗液PW于吸附柱中，12000r／min离心1min，倒掉收集管内废液； 

(7)12000r／min空载离心2min，尽量除去漂洗液。放置吸附柱于室温数分钟，直至无酒精味； 

(8)将吸附柱放入一个干净的离心管中，于吸附膜中间位置悬空滴加60μl的洗脱缓冲液，室温静置2min。12000r／min离心2min收集DNA溶液； 

1.6.2目的片段与克隆载体连接 

将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，连接体系如下： 

表4 

总体积10μL，混匀后16℃连接过夜。 

1.6.3DHSα感受态细胞的制备 

(1)从长有大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落，接种到5mL LB液体培养基中，于37℃200r／min培养过夜； 

(2)取1mL过夜培养液，转接于10mi LB液体培养基中，振荡培养2h(OD600约0.6)； 

(3)将上述所得的菌液10mL无菌转移到15mL离心管，冰浴30min；4℃4000r／min离心8min； 

(4)弃上清，向离心管中加入12mL预冷的0.1mol／L CaCl2重悬，冰浴10min后4000r／min离心10min； 

(5)重复上述步骤一次； 

(6)弃上清，再向沉淀中加入事先冰预冷的0.1mol／L CaCl2lmL重悬并分装为0.15mL／每管，置于冰浴中过夜(12～24h)。 

1.6.4连接产物的转化 

(1)将连接产物加入到己制备好的感受态细胞中，充分混匀，冰浴30min； 

(2)42℃热休克2min，再迅速放入0℃冰浴5min； 

(3)加入LB液体培养基800μμL，37℃振荡培养45min； 

(4)无菌条件取菌液300μL，均匀的涂布于预先制备好的氨卞青霉素琼脂LB平板上，37℃恒温培养过夜，出现透明白色转化菌落。 

1.7重组质粒的初步鉴定 

1.7.1重组质粒的小量提取 

参照OMEGA质粒小提试剂盒的说明书进行，具体操作如下： 

(1)取4mL菌液，12000r／min离心10min收集菌体； 

(2)弃菌上清，加入冷藏碱裂解液I250μl，漩涡仪上振荡混匀，将重悬的细菌转移到1.5ml EP管中； 

(3)加入碱裂解液II250μl，缓慢反复颠倒数次，直至粗丝变为细丝为止； 

(4)加入Solution III350μL，轻轻颠倒混匀至白色絮状物出现； 

(5)4℃12000r／rnin离心10min后，将上清液移至吸附柱内，静置2min； 

(6)加入700μL漂洗液(使用前先检验是否已加入无水乙醇)，12000r／min离心1min，弃收集管中废液； 

(7)重复上述步骤一次后，12000r／min空载离心2min； 

(8)将吸附柱置于洁净的EP管上，于吸附膜中间位置悬空滴加60μl的洗脱缓冲 液，室温下放置3min； 

(9)12000r／min4℃离心1min，收集洗脱液，一20℃保存备用。 

1.7.2重组质粒双酶切鉴定 

将[1.7.1]抽提得到的3个重组质粒分别用EcoR I、Sal I进行酶切鉴定，酶切反应体系如下： 

表5 

37℃2h后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 

1.7.3核苷酸序列的测定 

将鉴定后的阳性重组质粒菌种保存液送宝生物公司测序。 

2.结果与分析 

2.1IL-6基因的PCR扩增 

以大熊猫基因组DNA为模板，加入特异性引物PCR扩增后，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增片段大小与预期相符(见图1)。 

2.2IL-6基因TA克隆质粒鉴定 

将上述扩增产物连接到pMD18-T载体，重组质粒通过EcoR I和Sal I双酶切鉴定显示，获得预期大小片段(见图2)，阳性质粒命名为pMD18-T-IL-6。经测序显示，扩增的片段与基因参考序列相同。 

实施例2 

大熊猫白介素6的原核表达、多克隆抗体的制备 

实验方法 

2.1引物设计与合成 

根据大熊猫IL-6基因测序结果以及信号肽分析结果，运用Oligo7.0设计引物(IL-6P1／P2)扩增编码IL-6成熟肽的cDNA碱基序列。具体引物情况见下表(酶切位点用下划线表示)。 

表6引物序列 

2.2目的片段的PCR扩增 

以重组质粒pMD18-T-IL6作为模板，加入合成的1对特异性引物，进行PCR扩增。PCR反应体系如下： 

表7 

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存。 

2.3目的基因的TA克隆 

2.3.1IL-6的TA克隆 

PCR扩增产物于1％琼脂糖凝胶板上进行电泳检测，目的片段的回收参照天根公 司DNA胶回收试剂盒提供的说明书进行。将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，连接体系如下： 

表8 

总体积10μL，混匀后16℃连接过夜。 

将上述TA连接液转化克隆菌DH5α，活化培养后将转化菌涂布含Amp(50mg／L)的LB固体培养基，置于37℃培养箱中，正置吸附0.5h，然后倒置培养12～24h。 

2.4重组质粒的初步鉴定 

在含Amp(50mg／L)的LB固体培养基平板挑取单个菌落，接种于5mL含Amp(50mg／L)的LB液体培养基，37℃振荡过夜，并抽取质粒。将上步抽提的质粒用限制性内切酶EcoR I和Sal I做双酶切鉴定，最后将初步鉴定正确的质粒送宝生物进行测序。 

2.5原核表达载体的构建 

T克隆鉴定正确的质粒，按照下表中的酶切体系同时对T-IL6以及pET32a(+)载体进行双酶切。 

表9 

按胶回收试剂盒进行胶回收，连接体系如下： 

表10 

总体积10μL，混匀后于16℃连接过夜。将连接液转化入DHSa感受态细胞，抽取质粒后，通过对重组质粒进行双酶切鉴定，将初步鉴定正确的原核表达质粒送宝生物公司测序。 

2.6重组表达菌株的培养及表达 

将重组原核表达质粒转化表达菌E.coli Rosetta(DE3)，抽提重组质粒，进行PCR鉴定和限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切鉴定。 

把鉴定正确含重组表达质粒的E.coli Rosetta(DE3)细菌培养液100μl接种于10mL含Amp(50mg/L)的LB液体培养基，37℃剧烈振荡培养过夜，次日以1：100的比例接种新鲜的LB液体培养基中，培养至OD600＝0.6为左右时，加入IPTG，继续培养4h。同时设立阴性对照。取IPTG诱导后的菌液1mL，13000r／min离心1min，收集菌体用50μl PBS重悬，再加入50μl2×SDS上样缓冲液50μl，样品经过处理后进行SDS-PAGE，染色、脱色后观察结果。 

2.7原核表达条件的优化 

将重组表达菌于含Amp(50mg／L)的LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，以1：100比例分别接种含Amp(50mg／L)的LB液体培养基培养，分别对IPTG浓度(0.1mmol／L、0.3mmol／L、0.5mmol／L、0.7mmol／L和1.0mmol／L)、诱导时间(2h、3h、4h、5h、6h)和诱导温度(25℃、30℃和37℃)进行优化。收集各种条件下的样品进行处理，SDS-PAGE电泳分析。 

2.8重组表达蛋白的可溶性检测 

诱导表达100mL菌液，12000r／min4℃离心10min收集菌体，用20ml20mMTris-C1(pH8.0)重悬。冰浴条件下超声波破碎菌体5min，每分钟间隔30s，然后4℃， 12000r／min离心10min收集沉淀和上清，处理后进行SDS-PAGE电泳，检测表达产物是可溶性形式存在(上清中)还是包涵体形式存在(沉淀中)。 

2.9白介素6多克隆抗体的制备及其效价测定 

2.9.1多克隆抗体的制备 

将免疫原与等体积完全费氏佐剂混合，充分乳化，于家兔颈部，背部多点皮下注射。2周后，将重组蛋白与等体积不完全费氏佐剂相混，进行加强免疫。后每周加强免疫一次，且每周采血检测产生抗体效价。直至抗体水平升到符合要求，心脏采血收集血清，置-20℃保存备用(免疫程序见表11)。 

表11免疫接种程序 

2.9.2饱和硫酸铵法粗提IgG： 

具体操作步骤参照参考文献^[1]粗提IgG方法。 

2.9.3琼脂扩散实验测定抗体效价 

(1)将培养皿用水洗净后用75％乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用； 

(2)将0.9％的NaCl溶解的琼脂糖(1％)融化后在培养皿内铺胶，约3mm厚，凝固后用打孔器打孔； 

(3)中心孔加20ul抗原样品(IL6纯化蛋白)，周围孔内每孔加20ul抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等比例)； 

(4)培养皿置于湿盒内，然后于37℃培养箱内放置24h，观察结果。 

2.10融合表达产物的免疫印迹(Western-Blot) 

以纯化的重组蛋白IL-6为抗原，以粗提的免疫兔血清作为一抗，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG，显色用DAB试剂。设兔阴性血清为对照，具体操作参见参考文献。 

2.]1表达产物的纯化与复性 

2.11.1可溶性蛋白的纯化 

按照HisTrap FF组氨酸标签融合蛋白纯化试剂盒说明书进行，具体步骤如下： 

(1)收集菌体后，每克菌体(湿重)加入5-10ml结合缓冲液悬浮，冰浴条件下超声波破碎菌体5min，每分钟间隔30s，4℃，10000r／min离心10min收集上清，并用0.45um的滤膜过滤，除去细胞碎片和块状物质； 

(2)将注射器用蒸馏水填满，旋开层析柱顶部堵头，把柱子连接至注射器，保持连接处一直有液体，避免引入气泡； 

(3)除去层析柱底部堵头，用3-5倍体积的去离子水洗去柱子里含有的无水乙醇，然后用至少5个体积的结合缓冲液平衡柱子，建议流速是1ml／min； 

(4)用注射器加入预处理的样品，为了获得最好的效果，在上样时保持0.2ml／min的速度； 

(5)用结合缓冲液洗涤至少5-10个柱体积，在洗涤的过程中保持流速是1-2ml／min； 

(6)用洗脱缓冲液洗脱，通常5个柱体积即可； 

(5)洗脱后，使用3-5倍柱体积的结合缓冲液洗涤，再用5倍柱体积20％的乙醇平衡，4℃保存于20％的乙醇中，以便下次纯化。 

2.11.2包涵体蛋白的纯化 

诱导表达200mL菌液，10000r／min离心10min，收集菌体，用40ml菌体重悬液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15mM NaCl，1mg／ml溶菌酶，pH＝8.0)重悬。冰浴条件下超声波破碎菌体5min，每分钟间隔30s，然后4℃，10000r／min离心10min收集沉淀。加入包涵体洗涤液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.15mM NaCl，2M尿素，pH＝8.0)，使用移液管吹洗数次，然后10000r／min离心10min，收集沉淀。重复洗涤三次，沉淀用包涵体溶解液(50mM Tris-HCl，8M尿素，0.1M DTT，pH8.0)溶解，-20℃保存备用。 

2.11.3纯化蛋白的复性 

透析袋的处理：把透析袋剪成10cm的小段，在2％NaHCO₃(1000ml)中将透析 袋煮沸10min，然后用蒸馏水清洗干净，放在浓度为1mmol／L EDTA(1000ml)中继续煮沸10min，冷却后将上述8mol／L尿素溶解的包涵体转移入透析袋中，放入装有透析复性液(50mM Tris-HCl，5mM EDTA，150mM NaCl，1.25mM GSH，和0.25mM GSSG，20％的甘油，pH＝8.0，复性基础液中依次加入6mol／L、4mol／L、2mol／L尿素和PBS)的烧杯中，在4℃冰箱中进行透析，每个浓度透析12h，透析复性后的蛋白用来做活性测定。 

2.12MTT法检测表达产物活性 

将小鼠断颈处死，无菌取脾放入盛有PBS安瓶中，剥离白色结缔组织后放回安瓶中，加入4-6ml HankS，用眼科剪剪碎脾脏，通过铜网过滤去除组织碎片，将细胞悬液加入15ml离心管中，2000r／min离心10min，弃去上清；加入5ml去红细胞裂解液，室温放置10min，2000r／min离心10min，弃去上清；加入5ml HankS洗涤并进行细胞记数，2000r／min离心10min后用10％1640培养液调整细胞数为5×10⁵个^[2-3]，将制备的淋巴细胞悬液加入到96孔板中，每孔100μL，再加入50μL复性蛋白样品(终浓度分别为1、2、5、10μg·mL^-1)，设6个重复孔，并设生理盐水和ConA为阴、阳对照，置5％CO₂、37℃培养箱中培养48h后，弃上清，每孔加入5mg／mL MTT10μL，继续培养4h，加入100μLDMSO作用30min，酶联免疫检测A₅₇₀值。 

3.结果与分析 

3.1目的片段TA克隆质粒双酶切鉴定 

将扩增的成熟片段IL-2连接到pMD18-T载体，重组质粒通过EcoR I和Sal I双酶切鉴定显示，获得预期大小片段(图3)，测序结果与对应序列完全一致，证明目的片段的TA克隆质粒构建成功。阳性质粒命名为pMD-2。 

3.2目的片段原核表达载体的双酶切鉴定 

将上述三个片段从重组克隆载体上酶切下，定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，转化Rosetta(DE3)，抽提质粒双酶切鉴定，酶切结果与预期大小相符，证明重组原核表达质粒构建成功，将阳性质粒命名为pET-32-6，电泳结果见图4。 

3.3目的基因的诱导表达、可溶性检测与条件的优化 

挑取含有重组原核表达质粒的Rosetta(DE3)阳性重组表达菌，IPTG诱导培养4h，离心收集菌体后，超声波破碎，收集上清和沉淀，将沉淀用不同浓度的尿素清洗(2M，4M，6M，8M)收集不同浓度下的上清液，经过处理做SDS-PAGE电泳检测，结果表明，重组菌诱导后样品在特定位置有明显的融合表达条带，重组蛋白IL-6以包涵体的形式存在(见图5)。 

通过对不同IPTG浓度、不同诱导时间以及不同诱导温度进行比对发现，白介素6在37℃，IPTG浓度为0.3mmol／L下诱导3h的量最大。 

3.4多克隆抗体效价的测定 

按照试验方法[2.9.1]免疫试验兔子，收集并分离血清，通过琼脂扩散试验测得制备的抗大熊猫IL-6多克隆抗体效价为1：8(图6)。 

3.5目的蛋白的纯化与免疫印迹分析 

通过组氨酸标签蛋白纯化试剂盒以及包涵体洗涤等方法，获得纯化的重组蛋白(图7)。经Western blot分析重组蛋白，结果显示其均可与抗大熊猫IL-6阳性血清发生特异性免疫反应(图7)，证明获得产物是目的基因所表达的，且具有良好的反应原性。 

3.7表达产物生物活性的检测 

以纯化复性的融合蛋白为样品，生理盐水和ConA为对照，进行小鼠淋巴细胞增殖刺激活性检测，结果如下所示： 

表12回收重组融合蛋白IL-6对小鼠淋巴母细胞增殖刺激活性检测结果 

结果表明，纯化复性的融合蛋白IL-6对小鼠淋巴细胞均有明显的刺激增殖作用，但 不同的浓度对于淋巴细胞的增殖效果存在差异。当IL-610μg·mL^-1时重组蛋白对小鼠淋巴母细胞的增殖效果最明显。 

实施例3 

重组大熊猫白细胞介素6在小鼠模型中对犬瘟热病毒基因工程苗的佐剂效应研究 

小鼠犬瘟热病毒抗体(CDV-Ab)酶联免疫分析(ELISA)、小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒、小鼠白细胞介素4(IL-4)ELISA检测试剂盒购自上海时代生物科技有限公司，其余试剂均为国产分析纯。 

实验方法 

2.1细胞因子佐剂的免前制备 

将提纯的重组细胞因子蛋白经生物学活性检测后，与矿物油等体积相混，充分混匀，保存于4℃备用。免前将重组细胞因子蛋白与犬瘟热基因工程疫苗等体积相混，充分混匀。重组蛋白的终浓度依照MTT实验结果为依据，IL-6的终浓度分别为10μg·mL^-1。 

2.2实验小鼠的分组与免疫 

2.2.1动物分组 

将4～6周龄、体重为18～25g的18只BALB／c小鼠随机分成3组，6只／组，分别为A.肌肉注射CDV重组疫苗(辉瑞制药有限公司，美国)(0.2mL)+IL-6(终浓度10μg·mL^-1)；B.肌肉注射CDV重组疫苗(0.2mL)+PBS；和C.PBS空白对照组。 

2.2.2免疫方法 

按先前的分组情况接种疫苗，并且每日分两次注射含IL-6的乳化的重组细胞因子蛋白，连续注射3天。一免2周后加强免疫，免疫方式与一免相同。 

2.3血清处理 

分别于首免后7、14、21、28、35、42d从尾静脉采集血样，并将采集的血样放于37℃培养箱内一小时后，置于4℃过夜。第二天将血样8000rp／min离心10min，吸出血清，56℃灭活半小时后置-20℃冰柜内保存。至第6周血清也收集后同时作常规ELASA检测，检测被免小鼠在不同时期产生抗CDV的IgG水平以及血清中IL-4、IFN-γ水平。 

2.4CDV抗体检测 

具体操作步骤参照小鼠犬瘟热病毒抗体(CDV-Ab)酶联免疫分析(ELISA)说明书进行。 

2.5血清中IFN-γ、IL-4含量测定 

操作步骤按照小鼠γ干扰素(IFN-γ)ELISA检测试剂盒、小鼠白细胞介素4(IL-4)ELISA检测试剂盒说明书进行。 

(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃； 

(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50uL； 

(3)样本孔先加待测样本10uL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加； 

(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min； 

(5)将板中液体甩去后在吸水纸上拍干，往孔中加配置好的洗涤液，静置1min，弃洗涤液，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。 

(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。 

(7)每孔加入50ul终止液混匀。在450nm处测定各孔的OD值。 

2.6统计学分析 

收集ELISA实验测量得到的OD值数据，绘制标准曲线(以标准物的浓度为横坐标，测量得到的OD值为纵坐标)，对照标准曲线根据样品的OD值由查找对应的浓度。使用SPSS17.0统计软件对数据进行方差分析，并用配对样本t检验法检验各试验组数据均值间的差异显著性，使用Microsorft Excel软件绘制图表。 

3.结果与分析 

3.1血清中CDV抗体监测 

结果显示，免疫前所有小鼠血清样本均呈CDV阴性。免疫1周后免疫小鼠开始产生CDV特异性抗体，但各试验组之间没有明显差异。到免疫后第2周，CDV+IL6试验组佐剂效应明显，抗体水平与CDV+PBS对照组相比，差异显著。 

表13免疫小鼠血清中CDV抗体含量(ng／L) 

注：CDV疫苗+IL-6组和CDV疫苗+PBS组间在0.01水平上和0.05水平上差异显著； 

3.2血清中IL-4检测结果 

检测免疫小鼠血清中细胞因子IL-4的含量。结果显示，各免疫组IL-4的水平与空白对照组PBS相比都有显著增高(表14)。CDV疫苗+IL-6组自免疫后IL-4产生水平普遍高于CDV疫苗+PBS。 

表14免疫小鼠血清中IL-4的含量(pg／mL) 

注：CDV疫苗+IL-6组和CDV疫苗+PBS组间在0.01水平上和0.05水平上差异显著 

3.3血清中IFN-γ检测结果 

检测免疫小鼠血清中细胞因子IFN-γ的含量。结果显示，自免疫后IL-6免疫组IFN-γ的产生水平比CDV疫苗+PBS组和空白对照组PBS都要高(见表15)。CDV疫苗+IL-6免疫组在诱导小鼠产生IFN-γ的作用明显，与CDV疫苗+PBS具有显著差异性。 

表15细胞因子IFN-γ的检测(pg／mL) 

注：CDV疫苗+IL-6组和CDV疫苗+PBS组间在0.01水平上和0.05水平上差异显著； 

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 

Claims (1)

1.一种重组大熊猫IL-6免疫佐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤

A1大熊猫IL-6全基因克隆；

A11大熊猫外周血淋巴细胞体外培养；

无菌条件下采取健康大熊猫抗凝血2ml，置于EDTA-Na₂真空管中，然后往里加入等量D-Hanks液稀释；缓慢加入4ml淋巴细胞分离液于稀释后的大熊猫外周血中，2000r／min离心20min。小心将白细胞移于另一试管，加等量RPMI1640液，2000r／min离心15min，去上清，沉淀物再加入4mlRPM11640液，洗涤2次，去上清；沉淀淋巴细胞用含10μg／mL ConA、10％小牛血清、100μg／mL青霉素和100μg／mL链霉素的RPMI1640液悬浮，取10μL细胞悬液计数，将细胞悬液稀释至5×10⁶个／mL，分装于细胞培养瓶中，CO₂培养箱中37℃培养24h；

A12总RNA提取；

A13cDNA的合成；

A14引物的设计与合成；

根据GenBank中已报道的大熊猫IL-6cDNA序列，运用引物设计软件Oligo6.0分别设计两对扩增IL-6全基因的引物，具体序列如下表所示：

A15目的基因的PCR扩增；

以大熊猫基因组cDNA为模板，IL-6P1／P2为引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存；

A1.6目的基因PCR产物的TA克隆；

A161目的片段的回收

A162目的片段与克隆载体连接

将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，16℃连接过夜；

A163DH5α感受态细胞的制备；

A164连接产物的转化；

A17重组质粒的初步鉴定；

A171重组质粒的小量提取；

A172重组质粒双酶切鉴定；

A173核苷酸序列的测定；

将鉴定后的阳性重组质粒菌种保存液送宝生物公司测序；

A2大熊猫白介素6的原核表达、多克隆抗体的制备；

A21引物设计与合成；

根据大熊猫IL-6基因测序结果以及信号肽分析结果，运用0ligo7.0设计引物：IL-6P1／P2，扩增编码IL-6成熟肽的cDNA碱基序列，引物见下表：

A22目的片段的PCR扩增；

以重组质粒pMD18-T-IL6作为模板，加入特异性引物，进行PCR扩增；反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s，60℃退火40s，72℃复性50s，该步骤进行30个循环；72℃延伸10min；于10℃保存；

A23目的基因的TA克隆

A231IL-6的TA克隆

将上步回收的产物与pMD18-T Simple Vector进行连接，16℃连接过夜；将上述TA连接液转化克隆菌DH5α，活化培养后将转化菌涂布含Amp(50mg／L)的LB固体培养基，置于37℃培养箱中，正置吸附0.5h，然后倒置培养12～24h；

A24重组质粒的初步鉴定；

A25原核表达载体的构建；

A26重组表达菌株的培养及表达；

A27原核表达条件的优化；

A28重组表达蛋白的可溶性检测。

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