CN1692941A - 猪白细胞介素－6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

该发明所属技术领域：1.生物技术，2.分子免疫学。本发明克隆了成华猪白细胞介素－6基因，并构建了其真核表达质粒(VPIL－6)，以分子量为150000、脱乙酰度95％以上的壳聚糖制备了壳聚糖纳米颗粒，提供了利用壳聚糖纳米颗粒对质粒VPIL－6进行分子包装以制备抗感染基因制剂的方法，公开了该纳米颗粒基因制剂作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒分子包装VPIL－6质粒，将此制备的基因纳米颗粒制剂以肌注、口服方式单独或协同疫苗免疫实验动物，增强实验动物的特异性和非特异性细胞和体液免疫应答，提供了壳聚糖纳米颗粒包装VPIL－6质粒作为新型动物抗感染分子免疫增强剂提高动物非特异性和特异性免疫力的应用技术。

Description

猪白细胞介素-6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用

技术领域

1.生物技术  2.分子免疫学

具体涉及壳聚糖纳米颗粒包装成华猪白细胞介素-6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用技术。

背景技术

现代畜牧业的发展日益趋于集约化和规模化，由于抗生素在治疗和饲料添加剂的广泛应用，病原在药物和免疫压力下持续突变(病毒、细菌表现尤为突出)，抗原不断漂移，抗药性日益增强；加之环境污染，密集的饲养与管理经常使动物处于应激状态，使动物免疫防御能力下降，对灭活疫苗接种免疫应答抑制或削弱，免疫保护率降低，造成传染性疾病在密集的动物群体中更易发生或流行。现代免疫学研究进一步发展：许多病原(病毒、细菌、寄生虫等)感染动物后，其自身分泌或诱导机体产生多种免疫抑制物质，使机体的重要免疫调节因子生成减少，补体含量下降。这些均造成宿主免疫功能低下，疫苗免疫失败或对灭活疫苗接种免疫抑制或削弱，免疫保护率降低，动物易并发或继发其它感染，引起重大损失。

增强动物抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率是当前防治传染性疾病最可靠的简便途径。因此研制和应用新型高效动物抗感染免疫增强剂对防治现代畜牧业的疾病具有十分重要的现实作用和紧迫性。DNA疫苗免疫实验的结果初步证实细胞因子DNA基因作为“第三代免疫增强剂”能够显著增强病毒和细菌以及寄生虫抗原基因的免疫应答，提高机体抗感染免疫力。第三代免疫增强剂是经历了第一代外源性化学药物分子和植物源分子的免疫增强剂，以及“细胞因子”类物质的第二代免疫增强剂，发展起来的一类新型免疫增强剂。第三代免疫增强剂利用现代生物工程技术，将免疫调节效应很强的细胞因子基因克隆入高效真核表达载体，构建重组真核质粒，将其有效转染导入机体细胞，使之持久稳定表达出所需的细胞因子，增强其浓度，从而能够特异高效而持久地增强机体免疫防御能力，达到经济防治目前难以控制的病毒，细菌性传染病和寄生虫病的目的；并且预防条件性病原造成难以控制的复杂感染和疾病。

近年来，人们对于用细胞因子表达性质粒直接转染动物方面进行了研究，取得了许多结果。其特点是这些细胞因子可以在动物体内表达，达到免疫刺激增强作用，并且具有大规模生产容易，纯化简便，体内活性效应持久，理化性质稳定，易保存等特点。所以，构建高效重组细胞因子表达质粒作为研制新型抗感染制剂是一个行之有效的方法，必将首先在动物医学及保健方面获得广泛应用，有力推动各类动物传染性疾病的预防和治疗，保障畜牧业的顺利发展和人类健康及食品卫生安全。

白细胞介素-6是迄今发现的功能最为广泛的细胞因子之一，它可以促进多种细胞的增殖和分化。IL-6基因含有5个外显子和4个内含子，编码212个氨基酸，其信号肽由21-23个氨基酸组成。IL-6可由各种淋巴细胞和非淋巴细胞所产生，其产生可对各种刺激应答。成纤维细胞、单核细胞、某些T细胞系等都可以产生IL-6。IL-6具有多种细胞调节活性，IL-6是B细胞刺激因子。活化的T细胞产生B细胞分化因子，这种因子在金黄色葡萄球菌Cowan1刺激下可使未成熟的正常B细胞或受EB病毒转化的B细胞系高速率分泌免疫球蛋白。自然或重组的IL-6可诱导B细胞分泌IgM和IgG。IL-6的作用方式是：它同其它的B细胞因子或IL-6预先刺激B细胞，使其最终成为免疫球蛋白高速率分泌的细胞，但不刺激其增殖，IL-6也是成熟T细胞产生IL-2的第二信号。抗原依赖T细胞的增殖需T细胞受体复合物与抗原提呈细胞(antigen-presenting cell)产生的非特异性细胞因子。如果提供了这些信号，T细胞就会合成并分泌IL-2或IL-4，接着它们就会作为自分泌生长因子而发挥作用。

抗原MHC的第1信号可取代丝裂原或抗体与T细胞抗原受体结合。这些信号都能刺激纯化T细胞对外源性IL-2应答，但不产生IL-2。白细胞介素-6则能够作为第二信号刺激纯化的T细胞产生IL-2。IL-6并不作为T细胞邻近因子(Proximal factor)发挥作用，而是通过刺激已被提供了第1信号的T细胞起间接作用。

Nijsten等人发现血清中IL-6水平与急性相反应(即急性炎性反应)之间的关系。他们观察到IL-6可对兔子引起强烈致热作用。利用对IL-6极敏感的生物检测方法对严重烧热病人的急性相反应的IL-6、CRP(C反应蛋白)、ATT(抗胰蛋白)及α₂巨球蛋白的监测表明，在损伤后几小时内IL-6的浓度即升高到正常的2～100倍。虽然没有CRP、ATT升得高，但IL-6的增加比急性反应蛋白相反应要早，且与发热关系密切。即IL-6可直接地或通过IL-1或TNF间接地在急性相反应里起作用。

近年的研究表明将IL-6基因质粒转入小鼠可以抑制小鼠肿瘤成瘤率并延长荷瘤小鼠的寿命，IL-6基因对于小鼠抗病毒作用非常明显，IL-6表达质粒共注射对流感病毒核蛋白(NP)DNA疫苗可产生极强的保护性免疫应答反应，抵抗流感病毒的攻击。成华猪是四川特有的地方猪种，具有较高的经济价值。目前国内外均未见有关成华猪白细胞介素-6基因及其应用的研究报道，因此成华猪IL-6基因抗感染DNA制剂的制备及应用技术具有广阔的应用前景，可望发展成新型抗感染分子制剂用于提高猪抗传染性疾病的免疫应答能力，防治动物疾病的感染。

因免疫途径和免疫方式不同，所涉及的抗原呈递细胞、抗原呈递方式均有不同，故可产生不同类型、不同强度的免疫应答。当今，由于畜牧养殖业正趋于工业化生产，对免疫方式也提出了新的要求。在群体免疫中，口服免疫简易安全，尤其对于肠道疫苗的免疫，口服是一种有效的免疫方式，不需要额外的设备，可以激发机体粘膜免疫系统，诱导出大量分泌性IgA以及有效的局部细胞免疫，来抵抗某些病原的原发性感染和再感染。但由于口服经消化道所需的DNA量大，效率较低。为了进一步提高实验动物对质粒DNA的免疫应答水平，必须采用有效的免疫投递系统来增强免疫效果。

壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被体内多种酶类降解、降解产物安全无毒，并能被生物体完全吸收；而且由于其具有独特的聚阳离子特性，已有的研究结果显示它是一种具有很大潜力的缓释材料。近年来，在基因转染表达研究领域已出现了基于壳聚糖的纳米颗粒系统。大量研究表明，壳聚糖可包裹浓缩DNA，形成小的分散颗粒，将壳聚糖DNA复合物用于基因运载和转染表达时，能有效携带目的基因进入靶细胞中。包封于壳聚糖颗粒中的物质，其释放率主要取决于壳聚糖的生物降解和溶蚀，因此物质释放明显延长。初步研究结果发现：基于壳聚糖的颗粒系统在生物医学方面具有广阔的应用前景。此外，壳聚糖还具有多种生物学功能，尤其是可作为药物增效剂。

由于壳聚糖纳米颗粒良好的生物相容性使其在DNA制剂的包裹应用中显示了广阔的前景，因此利用壳聚糖纳米颗粒包装成华猪白细胞介素-6基因作为抗感染DNA制剂的制备及应用技术，在科研，动物保健，和产业化方面具有潜在的巨大价值。

本发明首次将克隆的成华猪白细胞介素-6基因构建入真核表达载体，以壳聚糖纳米颗粒分子对成华猪白细胞介素-6基因真核表达质粒进行分子包装，并将其应用于增强动物免疫应答和免疫保护力，发现对动物免疫机能和免疫保护效应有显著的增强作用，可用作高效安全和效应持久的新型动物免疫增强剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题具体包括藏猪白细胞介素-6基因真核表达质粒的构建、壳聚糖纳米颗粒对藏猪白细胞介素-6基因真核质粒的分子包装及其增强动物免疫应答和免疫保护力的应用技术。主要包括下列步骤：

1、成华猪白细胞介素-6基因的克隆

应用淋巴细胞分离技术，分离了成华猪外周血液淋巴细胸进行体外培养，在ConA的刺激下培养24h后，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT-PCR扩增出成华猪淋巴细胞白细胞介素-6基因的cDNA，克隆到pMD18-T载体上，并进行了序列分析；将得到的序列在GenBank和EMBL数据库中进行了同源比较，证实本实验克隆到了成华猪白细胞介素-6的cDNA。

2、成华猪白细胞介素-6基因的真核表达与活性检测

将成华猪白细胞介素-6基因克隆到真核分泌型表达载体VR1020上，命名为VPIL-6；重组质粒转染Cos7细胞株后，RT-PCR结果显示转染细胞24小时总RNA中已含有目的cDNA片段对应的mRNA；猪淋巴母细胞增殖实验证明VPIL-6在转染Cos7细胞株后，能够表达出有生物活性的猪PIL-6蛋白质，对猪淋巴细胞具有增殖刺激作用：此结果表明已成功构建了能正确表达成华猪IL-6的真核表达质粒，其表达产物具有正常的生物学活性，为研究其体内基因转移表达的免疫调节作用奠定了坚实基础。

3、纳米颗粒的制备

以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)：将VPIL-6质粒溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A、B液置于50℃水浴分别恒温20min。将DNA溶液按一定比例加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是VPIL-6质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。

4、纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位测定

取少量VPIL-6质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米颗粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。

5、成华猪白细胞介素-6基因抗感染基因制剂的应用

昆明鼠60只，随机分为4组，每组15只。其中2组为非特异性免疫组，2组为疫苗免疫组。采用口服的方法，非特异性免疫组每只小鼠接种剂量为壳聚糖包装质粒30pmol/头小鼠，疫苗免疫组每只小鼠均按猪免疫剂量1/50接种大肠杆菌、沙门氏菌和支原体疫苗以及壳聚糖纳米颗粒包装的相应质粒30pmol。五周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K99 0.4ml进行攻毒(3×10⁹/ml)。

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，检测了口服VPIL-6质粒对小鼠的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对常规疫苗在壳聚糖包装的VPIL-6质粒分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统地分析。在小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88/K99口服攻毒实验小鼠，观察发病情况；49天时对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况，检测免疫保护效应。

结果发现：以VPIL-6质粒壳聚糖纳米颗粒作为免疫增强剂时，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平比对照组显著升高；同时，白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞数量也明显增加；与常规疫苗联合使用，同样可以显著提高实验动物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等细胞因子水平，免疫细胞数量，特异性抗体水平，对疫苗的特异性免疫应答显著加强。

这些结果表明：壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒能显著提高小鼠的免疫应答水平，增强体液免疫和细胞免疫反应。提示壳聚糖纳米颗粒包裹VPIL-6质粒可提高机体细胞免疫和体液免疫水平，增强免疫应答及免疫保护力，可望作为有效的新型抗感染免疫调节剂，具有潜在的广泛应用前景。

附图说明

表1非特异性免疫小鼠分组(CNP：壳聚糖纳米颗粒)

表2疫苗免疫小鼠分组(CNP：壳聚糖纳米颗粒)

表3VPIL-6重组质粒真核表达产物对猪淋巴细胞增殖刺激活性检测结果(0D₅₇₀)

图1PIL-6 RT-PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)

   1：PIL-6 cDNA  2：λDNA/EcoRI+HindIII

图2重组VPIL-6质粒的菌落PCR筛选

   1：λDNA/EcoRI+HindIII  2、3：阳性菌落

图3VPIL-6 BamHI酶切电泳图谱(1.2％琼脂糖凝胶)

   1：λDNA/EcoRI+HindIII    2：VR1020/BamHI  3：VR1020

   4：VPIL-6/BamHI           5：VPIL-6

图4PIL-6在VR1020插入方向酶切电泳图谱(1.2％琼脂糖凝胶)

   1：DNA Mark    2、4、5、7、8、9：pVPIL-6/PstI，反向重组子

   3、6：pVPIL-6/PstI，正向重组子

图5VPIL-6 PstI酶切电泳图谱(1.2％琼脂糖凝胶)

   1：λDNA/EcoRI+HindIII   2：VR1020   3：  VR1020/PstI

   4：VPIL-6  5：VPIL-6/PstI

图6真核表达RT-PCR电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)

   1：λDNA/EcoRI+HindIII   2：24h      3：72h

图7VPIL-6质粒壳聚糖纳米颗粒透射电镜图(放大倍数：50000)

图8壳聚糖纳米颗粒粒径分布

图9非特异性免疫组小鼠血清中IgG含量

图10非特异性免疫组小鼠血清中IgA含量

图11非特异性免疫组小鼠血清中IgM含量

图12非特异性免疫组小鼠血清中IL-2含量

图13非特异性免疫组小鼠血清中IL-4含量

图14非特异性免疫组小鼠血清中IL-6含量

图15非特异性免疫组小鼠白细胞数量变化

图16非特异性免疫组小鼠单核细胞数量变化

图17非特异性免疫组小鼠淋巴细胞数量变化

图18非特异性免疫组小鼠中性粒细胞数量变化

图19疫苗免疫组小鼠血清中IgG含量

图20疫苗免疫组小鼠血清中IgA含量

图21疫苗免疫组小鼠血清中IgM含量

图22疫苗免疫组小鼠血清中沙门氏菌特异性抗体含量

图23疫苗免疫组小鼠血清中支原体特异性抗体含量

图24疫苗免疫组小鼠血清中大肠杆菌特异性抗体含量

图25疫苗免疫组小鼠血清中IL-2含量

图26疫苗免疫组小鼠血清中IL-4含量

图27疫苗免疫组小鼠血清中IL-6含量

图28疫苗免疫组小鼠白细胞数量变化

图29疫苗免疫组小鼠单核细胞数量变化

图30疫苗免疫组小鼠淋巴细胞数量变化

图31疫苗免疫组小鼠中性粒细胞数量变化

具体实施方式

1、成华猪IL-6基因(PIL-6基因)的克隆

从健康成华猪前腔静脉取血10mL，分离藏猪外周血淋巴细胞，加入10ug/ml ConA刺激，在C02培养箱中37℃培养72h，分时段(24、48、70h)提取藏猪总RNA，设计一对成华猪IL-6基因cDNA扩增引物。引物序列如下：

引物1：CGG GAT CCA CCA GGA ACG AAA GAG AG

引物2：CGG GAT CCA GGT TTC TGA CCA GAG GAG

以总RNA为模板，在50μl反应体系中加24、5ul的ddH₂O，4ul 10mM dNTP，1ulRNase Inhibitor(40units/ul)2.5ul DTT solution，IL-6上游、下游引物各1ul(15pmol/L)，猪淋巴细胞总RNA 1ul，10ul 5*RT-PCR Buffer，1ul RT-PCR酶混合液。RT-PCR循环参数为：50℃，30min；94℃，2min，然后进行30个PCR循环(94℃变性60s，58℃退火30s，72℃延伸60s)后继续在72℃延伸10min，4℃保存。

回收cDNA片段，克隆到pMD-T18载体中，转化感受态细胞，筛选和鉴定含重组质粒的菌落，小规模提取质粒DNA，酶切及电泳观察质粒DNA，确定重组质粒中的插入片段的大小同目的片段的大小一样后(附图1)，进行序列测定。序列测定结果采用DNAtools5.1进行分析(基因序列见说明书13页)。

用M13通用引物对含有目的基因片断的pMPIL-6质粒进行正反向测序，通过重叠序列的拼接，得到了完整的PIL-6基因的cDNA序列，并用DNAtools 5.1对其编码氨基酸进行了分析，cDNA长度为675个碱基，开放阅读框为645个碱基，编码215个氨基酸，分子量为24.0kD。

2、成华猪IL-6基因真核表达质粒的构建及表达活性检测

将pMPIL-6质粒用BamHI酶切后，将PIL-6片段与BamHI酶切、脱磷酸化的VR1020质粒DNA在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化子经菌落PCR鉴定，得到含有目的PIL-6片段的重组质粒的菌落，菌落PCR图见附图2。

得到含PIL-6的重组质粒后，利用BamHI酶切可见675bp片段；根据PIL-6片段的测序结果，PIL-6片段片段上有2个PstI位点，为580-586和649-654bp，VR1020载体上有1个PstI位点，位于1862bp，因此，用PstI酶切重组质粒DNA，通过观察其酶切片段的大小来判定PIL-6片段的插入方向，其正向插入PIL-6 cDNA应切出180bp的片段，反向插入切出670bp的片段。将正确方向插入的重组表达质粒命名为VPIL-6，其BamHI酶切及PstI酶切电泳图谱见附图3、4、5。

使用Life Technology公司Lipofect AMINE^TM Reagent进行Cos7细胞的转染，参照试剂说明书进行。培养48小时，检测基因表达产物活性。以RT-PCR检测基因在真核细胞中表达，结果显示，只有VPIL-6转染的Cos7细胞总RNA出现PIL-6的特征带，表明VPIL-6重组质粒在Cos7细胞中能表达基因的片段相应的mRNA。RT-PCR结果见附图6。

制备猪淋巴母细胞，MTT比色法检测PIL-6生物学活性，分别使用转染后24小时、48小时和72小时细胞培养液上清进行分析，结果见附图表3。此结果表明：VPIL-6转染后24小时、36小时和72小时的细胞培养液上清中表达了具有生物学活性的PIL-6，对猪淋巴细胞具有增殖刺激作用。

3、纳米颗粒的制备

以分子量150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；将质粒DNA溶解于三聚磷酸盐溶液(B液)。将A液、B液置于50℃水浴分别恒温20min，将DNA溶液按一定比例加入壳聚糖溶液，磁力搅拌使其充分混合，静置过滤得到粒径40-60nm的复合物微粒。即是质粒壳聚糖纳米颗粒样品液。

4、纳米颗粒的形态、粒径及Zeta电位测定

取少量质粒壳聚糖纳米样品液于透射电子显微镜下观察纳米颗粒形态并拍照。另取纳米颗粒样品液适量，加双蒸水稀释后用Zetasizer3000HS/IHPL纳米颗粒度分析仪测定粒径、分散度及Zeta电位。

透射电镜观察结果表明：壳聚糖纳米颗粒多呈球形(见说明书附图7)。纳米颗粒度分析仪测定结果为：平均粒径为45nm；多分散度为0.190(见说明书附图8)；zeta电位为+25.6mV，说明纳米颗粒表面带有正电荷。

5、实验动物的免疫

昆明鼠60只，随机分为4组，每组15只。其中2组为非特异性免疫组，2组为疫苗免疫组。采用口服的方法，非特异性免疫组每只小鼠接种剂量为壳聚糖包装质粒30pmol/头小鼠，疫苗免疫组每只小鼠均按猪免疫剂量1/50接种大肠杆菌、沙门氏菌和支原体疫苗以及壳聚糖纳米颗粒包装的相应质粒30pmol。五周后每只小鼠口服大肠杆菌K88和K990.4ml进行攻毒(3×10⁹/ml)。

动物免疫分组见说明书附图表1，表2。表1为非特异性免疫组分组情况，表2为疫苗免疫组分组情况。

6、壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒对小鼠非特异性免疫应答的影响

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，分离血清，用以检测各项免疫指标。

(1)IgG、IgA及IgM的测定含量

实验鼠血清分别作10⁵(IgG)和10⁴(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。

结果见说明书附图9、10、11。从图可见，小鼠在口服壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著增高；与对照组差异显著(P＜0.05)。第6周大肠杆菌攻毒后，免疫组小鼠IgG、IgA、IgM较对照组血清中IgG、IgA、IgM含量有显著增加。

(2)细胞因子的检测

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。

结果见说明书附图12、图13、图14。由图可知，壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒免疫组小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均较对照组明显升高(P＜0.05)。

(3)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。

结果见说明书附图15、16、17、18。免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化是考察小鼠细胞免疫应答的一个重要指标。从图可见：口服壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒后，免疫小鼠外周血白细胞、单核细胞、淋巴细胞数量较对照组都有显著增加，中性粒细胞在攻毒前也较对照组明显升高，但攻毒后中性粒细胞数量则较对照组低。

7、壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒对疫苗特异性免疫应答的调节

(1)IgG、IgA及IgM的测定含量

实验鼠血清分别作10⁵(IgG)和10⁴(IgM、IgA)稀释包被Costar酶标板，用特异性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重链抗体(美国Bethyl公司生产)作一抗，酶标羊抗兔IgG为二抗(华美生物工程公司)，TMB(四甲基联苯胺)为底物，测定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。

结果见说明书附图19、20、21。图19、20、21显示了壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒与支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的变化情况。结果表明：在同时口服了壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒后，实验动物的IgG、IgA、IgM含量比对照组有显著提高，可以协同疫苗免疫。

(2)特异性抗体的测定

制备支原体抗原、沙门氏菌抗原、大肠杆菌抗原包被Costar酶标板，实验鼠血清100倍稀释为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法测定小鼠血清中支原体特异性抗体、伤寒特异性抗体、大肠杆菌特异性抗体含量。

结果见说明书附图22、23、24。图22、23、24显示了支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗与质粒联合免疫动物后实验动物特异性抗体变化情况。结果显示：动物在免疫一周后，就检测到特异性抗体的产生；在同时口服壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒后，实验小鼠的上述特异性抗体比对照组显著提高(P＜0.05)。

(3)细胞因子的检测

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，实验鼠血清100倍稀释包被Costar酶标板，兔抗鼠IL-2、IL-4、IL-6IgG抗体(武汉博士德生物工程公司提供)为一抗，TMB(四甲基联苯胺)为底物，SABC法检测血清中IL-2、IL-4及IL-6含量，观测小鼠细胞免疫应答情况。

结果见说明书附图25、26、27。图结果显示：壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒与支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量较对照组高，对免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提升作用差异显著(P＞0.05)。

(4)免疫小鼠外周血免疫细胞数量的动态变化

小鼠免疫前及免疫后每周自尾静脉采血，常规法计白细胞总数；血涂片Giemsa染色，镜检分类计数中性粒细胞、单核细胞核、淋巴细胞。

结果见说明书附图28、29、30、31。用支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗联合壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒免疫小鼠，小鼠外周血免疫细胞数量的变化情况结果同样发现口服壳聚糖纳米颗粒包装VPIL-6质粒对实验小鼠外周血免疫细胞有较好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒细胞数量较对照组低。

8、实验小鼠免疫保护检测

小鼠免疫35天后，以大肠杆菌K88和K99口服攻毒实验小鼠，观察小鼠的生长情况；49天时用常规方法对所有小鼠进行解剖，观察各种器官的生理病变情况。攻毒3周后剖解实验小鼠发现，VPIL-6质粒接种小鼠均健康存活，肝、脾、十二指肠、等消化道和呼吸道组织器官未出现明显病变，而对照小鼠均发病，精神萎靡，被毛耸立，粪便稀软，带棕褐色；解剖观察发现，对照组小鼠均出现以胃、十二指肠、空肠粘膜等处出血、肝脾肿大等为主的病变。

成华猪白细胞介素-6基因序列

<110>四川大学

<120>猪白细胞介素-6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用

<160>1

<210>1

<211>675

<212>DNA

<213>成华猪(Sus scrofa，Chenghua，China)

<220>

<400>1

atgaactccc tctccacaag cgccttcagt ccagtcgcct tctccctggg gctgcttctg 60

gtgatggcta ctgccttccc taccccggga cgcctggaag aagatgccaa aggtgatgcc 120

acctcagaca aaatgctctt cacctccccg gacaaaactg aagaactcat taagtacatc 180

ctcggcaaaa tctctgcaat gagaaaggag atgtgtgaga agtatgagaa gtgtgaaaac 240

agcaaggagg tactggcaga aaacaacctg aaccttccaa aaatggcaga aaaagacgga 300

tgcttccaat ctgggttcaa tcaggagacc tgcttgatga gaatcaccac cggtcttgtg 360

gagtttcaga tatacctgga ctacctccag aaagagtatg agagcaataa gggaaatgtc 420

gaggctgtgc agattagtac caaagcactg atccagaccc tgaggcaaaa gggaaagaat 480

ccagacaaag ccaccacccc taaccccacc acaaatgccg gcctgctgga taagctgcag 540

tcacagaacg agtggatgaa ggtttctgac cagaggaggg aatgcccgtg gacggcatca 600

atctcaggtg ccccagctac attatccgaa tggccctcag gctgaactgc aggaaatcct 660

caaggctgcg cagga                                                  675

      表1非特异性免疫小鼠分组

组别	免疫程序
		K	CNP包裹VPIL-6口服免疫小鼠
C	CNP包裹VR1020口服免疫小鼠

注：CNP：壳聚糖纳米颗粒

       表2疫苗免疫小鼠分组

组别	免疫程序
		YK	CNP包裹VPIL-6口服免疫小鼠+疫苗
YC	CNP包裹VR1020口服免疫小鼠+疫苗

注：CNP：壳聚糖纳米颗粒

表3VPIL-6重组质粒真核表达产物对猪淋巴细胞

       增殖刺激活性检测结果OD₅₇₀

时间	样品OD570平均值
		VR1020对照样品	0.067±0.0051c
24h表达样品	0.248±0.023b
		36h表达样品	0.413±0.034a
72h表达样品	0.1964±0.014b

Claims (4)

1、猪白细胞介素-6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用，其特点包括成华猪白细胞介素-6基因的克隆及其真核表达质粒(VPIL-6)的构建，壳聚糖纳米颗粒对成华猪白细胞介素-6基因真核表达质粒进行分子包装制备基因纳米颗粒制剂，并将此基因制剂应用于增强猪机体免疫应答及抗感染免疫力的应用技术。

2、根据权利要求1所述的成华猪白细胞介素-6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用，其特征在于所述的基因制剂的基质是以分泌型质粒VR1020为载体构建的成华猪白细胞介素-6基因真核表达质粒VPIL-6。

3、根据权利要求1所述的成华猪白细胞介素-6基因抗感染免疫增强剂的制备和应用，其特征在于所述的基因制剂的包裹材料是分子量为150000，脱乙酰度95％以上的壳聚糖，用离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒分子，粒径为40-60nm。

4、使用权利要求1要求的壳聚糖包装成华猪白细胞介素-6基因真核表达质粒VPIL-6纳米颗粒作为猪用新型抗感染分子免疫调节剂的应用技术，其特征在于以下几方面：

(1)以小鼠为实验动物，将制备的壳聚糖VPIL-6质粒纳米颗粒以口服的投递方式免疫小鼠，检测了壳聚糖包装VPIL-6质粒对小鼠的体液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特异性抗体的测定)和细胞免疫水平(细胞因子和外周血免疫细胞数量)的影响情况，并对常规疫苗在壳聚糖包装VPIL-6质粒分子免疫佐剂协同作用下细胞免疫和体液免疫应答的变化，进行了较为系统的分析；

(2)以制备的壳聚糖VPIL-6质粒纳米颗粒单独免疫实验动物，结果表明壳聚糖VPIL-6质粒纳米颗粒能有效提高实验动物细胞和体液免疫水平，增强其非特异性免疫力；

(3)以制备的壳聚糖VPIL-6质粒纳米颗粒联合疫苗(支原体疫苗、伤寒疫苗及大肠杆菌疫苗)共免疫实验动物，结果表明壳聚糖VPIL-6质粒纳米颗粒可显著增强实验动物对疫苗的特异性细胞免疫和体液免疫应答反应。

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