CN1467291A - 鸡白细胞介素-2(il-2)基因与真核表达质粒及禽类疫苗的免疫增强剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鸡白细胞介素－2(IL－2)基因。本发明还提供一种含有IL－2基因的真核表达质粒，它以pC工作为真核表达载体，含有上述白IL－2基因的编码序列的重组载体。本发明还提供了一种禽类疫苗的免疫增强剂，它为上述真核表达质粒的水溶液，其浓度为1－20μg/μl；或为含有上述真核表达质粒在真核细胞或动物体内所表达的鸡白细胞介素－2蛋白，鸡白细胞介素－2蛋白所占重量比为1－20％。该免疫增强剂可应用于多种禽类DNA疫苗，它具有生物学活性，价格低廉，它能增强疫苗诱导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答，延长免疫力和持续时间，也可降低疫苗的使用剂量，从而可降低成本，它具有免疫增强及免疫治疗作用，它可增强禽类对传染病的抵抗力。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡的白细胞介素-2(IL-2)基因、真核表达质粒及作为禽类疫苗的免疫增强剂。
背景技术
白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是由T淋巴细胞产生的一类淋巴因子，它能激活T细胞，促进B细胞分化及分泌抗体，诱导干扰素γ产生，增强单核细胞以及NK细胞的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有十分重要的调节作用。1976年Morgan等首先在鼠淋巴细胞培养上清中发现了鼠的IL-2，1983年Taniguchi等人IL-2基因宣告克隆成功，随后鼠、牛、绵羊、猪、马等至少有30多种哺乳动物的IL-2基因先后被克隆成功。但在这方面有关以鸡为代表的禽类IL-2研究却远远滞后于人及哺乳动物，原因有两个：(1)对鸡细胞因子和调节基因结构知之甚少，而且至今未发现鸡CD4+T细胞的Th1和Th2的亚型存在；(2)鸡IL-2与哺乳动物IL-2差异较大，并且IL-2具有很强的种属特异性，使得在哺乳动物中使用的许多成功技术和方法都无法有效地应用于禽类IL-2的研究。
在养禽业的发展过程中，传染病的成功控制与否已经成为制约养禽业进一步发展的瓶颈。据统计，尽管全球大约每年有100亿只鸡进行疫苗免疫接种，但仍不能完全控制传染病的发生。使用免疫增强剂是提高疫苗免疫效果、控制传染病的的有效途径，但目前广泛使用的免疫增强剂均为人工合成，价格昂贵，限制了其使用的范围，因此，研制一种廉价的禽类免疫增强剂已势在必行。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种鸡的白细胞介素-2(IL-2)基因。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种含有白细胞介素-2(IL-2)基因的真核表达质粒。本发明所要解决的另一个技术问题是提供廉价的禽类疫苗的免疫增强剂。
本发明提供的鸡的白细胞介素-2(IL-2)基因，其核苷酸序列如说明书附图中的图4，长度为737个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，在5’端前12个核苷酸为非编码区，在3’端前293个核苷酸为非编码区，其余为编码区。
本发明提供的真核表达质粒为以pCI(可购自Promega公司)作为真核表达载体，含有上述白细胞介素2(IL-2)基因的编码序列的重组载体(pCI-IL-2)，该重组载体保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC0719，保藏时间2002年3月4日。
研究表明在家禽中，一些造成重大经济损失的病原如传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、新城疫病毒、鸡传染性贫血病病毒以及球虫感染后均可引起免疫抑制，而这种免疫抑制大多伴有IL-2分泌异常或对IL-2反应异常。本发明对鸡IL-2的分子生物学进行了研究，成功地克隆出鸡IL-2基因、构建了该基因的真核表达质粒，不仅有助于了解传染病包括免疫抑制性疾病的发病机制以及疫苗的免疫机制，而且对新型基因工程疫苗及新型禽用免疫增强剂的研制等都具有十分重要的理论和应用价值。
本发明真核表达质粒以pCI作为表达载体，除了带有CMV的早期启动子/增强子以外，还含有来源于β球蛋白基因的内含子序列，此序列的存在可明显增强基因的表达效率，比无此内含子序列的载体表达能力强10-40倍。
本发明提供的禽类疫苗的免疫增强剂为上述真核表达质粒(pCI-IL-2)的水溶液，其浓度为1-20μg/μl。
该禽类疫苗免疫增强剂可应用于包括鸡传染性法氏囊病病毒DNA疫苗、传染性支气管炎病毒DNA疫苗、新城疫病毒DNA疫苗、马立克氏病病毒DNA疫苗、传染性喉气管炎病毒DNA疫苗、禽流感病毒DNA疫苗、鸡贫血因子DNA疫苗、鸡球虫DNA疫苗等疫苗。
本发明提供的禽类疫苗的免疫增强剂还可以为含有上述真核表达质粒在真核细胞或动物体内所表达的鸡白细胞介素-2蛋白，鸡白细胞介素-2蛋白所占重量比为1-20％。
该禽类疫苗的免疫增强剂可应用于包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
本发明提供的鸡白细胞真核表达质粒pCI-IL-2和重组鸡白细胞介素2蛋白作为禽类疫苗的免疫增强剂的优势表现在：(1)真核表达系统生产的重组鸡白细胞介素2蛋白，不仅具有生物学活性，而且比其它的人工佐剂廉价；(2)能增强疫苗诱导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答，延长免疫力和持续时间，也可降低疫苗的使用剂量，从而可降低成本；(3)鸡白细胞介素2不仅具有免疫增强作用，而且还具有免疫治疗作用，而人工佐剂一般仅具有免疫增强作用；(4)鸡白细胞介素2具有天然抗病作用，可增强禽类对传染病的抵抗力。
附图说明
图1：本发明使用RT-PCR扩增出737bp的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因的条带图。
图2：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)重组质粒T-IL-2的酶切鉴定图。
图3：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)重组质粒T-IL-2的构建图。
图4：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因的核苷酸序列。
图5：本发明使用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-2(IL-2)编码基因的条带图。
图6：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2的酶切鉴定图。
图7：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2的构建图。
图8：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)表达产物的SDS-PAGE检测图。
图9：本发明采用MTT法对重组鸡白细胞介素-2(IL-2)活性的检测图。
图10：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2增强IBDV DNA疫苗诱导的中和抗体反应结果图。
图11：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2增强法氏囊B淋巴细胞的增殖反应动态图。
图12：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2增强外周血液T淋巴细胞增殖反应动态图。
图13：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2增强胸腺T淋巴细胞的增殖反应动态图。
图14：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2增强脾脏T淋巴细胞的增殖反应动态图。
图15：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2增强IBDV DNA疫苗对强毒株的攻击保护率统计表。
图16：本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)蛋白增强IBDV弱毒疫苗对强毒株的攻击保护率的统计图。
图17：本发明提供的鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强IBDV弱毒疫苗诱导的中和抗体效价图。
图18：本发明提供的鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强IBDV基因工程疫苗对强毒株的攻击保护率的统计图。
图19：本发明提供的鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强IBDV基因工程疫苗诱导的中和抗体效价图。
图20：本发明提供的鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强鸡体的免疫功能数据图。
图21：本发明提供的鸡白细胞介素2(IL-2)质粒增强鸡体的免疫功能图。
本发明提供的真核表达质粒(pCI-IL-2)保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、保藏编号为CGMCC0719，保藏时间2002年3月4日。
具体实施方式
实施例1
本实施例描述了本发明提供的鸡白细胞介素-2(IL-2)基因的获得方法，包括以下步骤：
(1)鸡脾淋巴细胞悬液的制备 无菌分离浙江地方品种萧山鸡脾脏、用研钵在灭菌铜网(200目)研磨捣碎置于无Ca2+、Mg2+PBS(pH7.2)中，300g离心10min，取上清液500g离心30min收集淋巴细胞，PBS洗涤三次，再以RPMI 1640培养液洗涤2次。用1％台盼蓝(1％Trypan blue)染色法进行活细胞计数，活细胞数多于90％后，用RPMI 1640培养液将之稀释成一定浓度的单细胞悬液。
(2)RT-PCR合成鸡IL-2 cDNA 按筛选的体外诱导IL-2最佳条件培养脾脏淋巴细胞，分别经ConA刺激6、12、18、24、36、48、72 h后，Trizol试剂盒一步法提取淋巴细胞总RNA。设计一对引物：P1(5’-TGGGACACTGCCATGATG-3’)，P2(5’-AATTTATTAAATGTCATCTAGAAG-3’)，引物由上海生物工程公司合成。不同培养时间抽提的总RNA，分别用SuperscriptTM Preamplification System反转录试剂盒(可购自Gibco公司)进行反转录。反转录产物按Expand High Fidelity PCR System(可购自Gibco公司)进行PCR，经优化后的循环条件为：94℃预变性2min，94℃变性45s，48℃退火1min，72℃延伸1min，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果表明：鸡脾T淋巴细胞经ConA刺激不同时间后，抽提总RNA进行RT-PCR，结果表明仅在ConA诱导后6 h扩增出大约为737bp左右的特异性片段(见附图1，附图1中1表示DNA Marker DL2000；2表示737bp大小的鸡IL-2基因条带。)，其余时间段均没有目的片段。PCR产物回收后，直接克隆于pGEM-T Easy Vector(可购自Promega公司)，将重组质粒命名为T-IL-2(见附图2，附图2中1表示DNA Marker DL2000；2表示PCR鉴定可扩增出737bp的鸡IL-2基因条带；3-5表示EcoRI酶切重组质粒T-IL-2；6表示Maker：λDNA/HindIII。)EcoRI酶切T-IL-2，可见大小分别为3.0kb和737bp左右的条带，PCR鉴定能扩增出737bp左右的条带(见附图2)。
(3)鸡IL-2基因的克隆和序列获得低熔点胶回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T Easy Vector(见附图3)，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，培养于含Amp、IPTG和X-gal(均可购自Gibco公司)的LB平板，挑取白色菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定。序列测定在上海申有生物技术有限责任公司进行，ABI PRISM 377DNA Sequencer自动测序仪重复3个阳性克隆进行测序反应。
序列测定结果表明：克隆的萧山鸡IL-2 cDNA全长共737个核苷酸，编码143个氨基酸的前体蛋白，此外在5’端还包括12个核苷酸的非编码区(5’-UTR)，在3’端包括一个长293个核苷酸的非编码区(3’-UTR)。其核苷酸序列如图4所示。
实施例2
本实施例描述了鸡白细胞介素2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2的获得方法，其步骤包括：
(1)包含前导肽序列的鸡IL-2cDNA的扩增 在上述鸡IL-2基因的两端重新设计引物(全长共432bp，编码包括前导肽共143个氨基酸)，
P3(5’-CG
GAATTCATGATGTGCAAAGTACTGATC-3’)，
P4(5’-
GTCGACTTA(His)6TTTTTGCAGATATCTCACAAA-3’)，引物两端分别引入酶切位点EcoRI(P3划线处)和SalI(P4划线处)，考虑到表达的蛋白今后易于纯化，在引物P4设计了6个His。引物在上海生物工程公司合成。以T-IL-2为模板，P3和P4为引物，按以下PCR循环程序扩增包含前导肽序列的鸡IL-2cDNA：94℃预变性2min，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(2)鸡白细胞介素2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2的构建低熔点胶回收432bp的鸡IL-2基因，EcoRI和SalI双酶切后，直接克隆入pCI的EcoRI和SalI多克隆位点处。
结果表明：将包括前导肽序列的共432bp的鸡IL-2基因(见附图5，附图5中1表示DNA Marker DL2000；2表示PCR可扩增出432bp大小的鸡IL-2编码基因条带。)克隆入pCI，构建成pCI-IL-2真核表达质粒(见附图7)，EcoRI和SalI双酶切能切出4.01kb和432bp的条带，PCR能扩增出432bp的条带(见附图6，附图6中1表示DNA Marker DL2000；2表示PCR鉴定可扩增出432bp的鸡IL-2编码基因条带；3重组质粒pCI-IL-2的EcoRI+SalI酶切条带；4重组质粒pCI-IL-2的EcoRI酶切条带；5重组质粒pCI-IL-2的SalI酶切条带；6表示Maker：λDNA/HindIII)。
实施例3
本实施例描述了重组鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白的获得方法，包括以下步骤：
(1)鸡白细胞介素2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2在哺乳动物Vero细胞中的表达
脂质体介导鸡pCI-IL-2在Vero细胞中的表达的操作步骤如下：
在6孔细胞培养板上接种2×105个细胞数于2ml含有胎牛血清的培养基；37℃ 5％CO2培养箱培养18-24h至40-60％的细胞汇片；在Eppendorf管中准备以下液体：Solution A：将8μgDNA稀释到100μl不含血清的OPTI-MEMI Reduced Serum Medium培养基(可购自Gibco公司)中；Solution B：稀释10μl Lipofectin Reagent(可购自Life Technology)到100μl不含血清的OPTI-MEM I Reduced Serum Medium培养基中。为了达到最佳的转染效果，DNA不能超过20μg/ml和Lipofectin Reagent不能超过200μg/ml；将SolutionA和Solution B轻轻混匀，室温放置10-15min，溶液可能会出现浑浊，但不会影响随后的转染效果；用2ml不含血清的OPTI-MEM I Reduced SerumMedium培养基洗涤培养的Vero细胞；加0.8ml不含血清的OPTI-MEM IReduced Serum Medium培养基到DNA-Lipofectin混合物中，混匀后，将混合物轻轻铺在Vero细胞上，在整个过程都不能加抗生素；37℃ 5％CO2培养箱培养6h；倾去DNA-Lipofectin混合物，加2ml含5％胎牛血清的OPTI-MEMI Reduced Serum Medium培养基继续培养48-72h，检测活性。表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定。
结果如附图8所示：重组质粒pCI-IL-2经纯化后，在脂质体的介导下，转染Vero细胞72h后，收集细胞上清液和细胞裂解液，进行SDS-PAGE电泳，结果发现体外表达的重组鸡IL-2分子有2种表现形式，分子量分别为18.5KDa和14.5KDa左右，前者是包括前导肽的鸡IL-2分子，后者是剪切了前导肽的成熟鸡IL-2蛋白(见附图8，附图8中1表示蛋白质分子量Marker；2表示正常Vero细胞裂解物；3-5表示pCI-IL-2转染Vero细胞48小时后的细胞裂解物；6表示pCI转染Vero细胞裂解物；7-9pCI-IL-2转染Vero细胞48小时后的细胞裂解物。)
(2)重组鸡白细胞介素2活性的检测 重组鸡IL-2的活性检测按MTT法进行，将脾脏淋巴细胞稀释成8×106个/ml，加入10mg/L的ConA培养24h后，收集淋巴细胞，用PBS洗两次，再用含0.05mol/L α-Methylamannoside(可购自Sigma公司)的RPMI 1640培养30分钟，PBS洗涤三次，重选于RPMI 1640中，活细胞计数后，加入待检IL-2样品，每个样品设5个重复孔，继续培养48小时，加入5g/L MTT溶液(可购自Sigma公司)10μl，继续培养4小时，每孔加入10％SDS 100μl，反应2小时后，测定λ＝570nm处的OD值。并以鸡脾脏淋巴细胞经ConA刺激72h后的上清液作为对照。按生物统计学上的方差分析法对鸡IL-2活性检测结果进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。鸡IL-2的活性以5只鸡的λ＝570nm处的OD值的算术平均数表示。
结果如附图9所示：MTT法检测鸡IL-2活性结果表明：在pCI-IL-2转染组的Vero细胞裂解液中检测到的IL-2活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液；pCI-IL-2转染组的Vero细胞上清液也能检测到IL-2活性，说明表达的鸡IL-2是分泌型蛋白；阴性对照组(即未加检测样品)、pCI对照组的细胞裂解液和细胞上清液均无特异性的IL-2活性(见附图9，附图9中1表示ConA诱导的T淋巴细胞上清液；B pCI-IL-2转染Vero细胞后的上清液；C pCI-IL-2转染Vero细胞裂解物；D阴性对照；E pCI转染Vero细胞上清液；F pCI转染Vero细胞裂解物)。
实施例4
本实施例描述了本发明提供的鸡白细胞介素2(IL-2)基因真核表达质粒pCI-IL-2对传染性法氏囊病毒DNA疫苗的免疫增强效果。
(1)鸡IL-2真核表达质粒增强DNA疫苗对强毒株的攻击保护
本试验所采用的传染性法氏囊病毒DNA疫苗(浙江大学动物科学学院提供)的主要成分为pCI-VP2/VP4/VP3。14日龄非免疫来杭鸡105只，共分成7组，即pCI-VP2/VP4/VP3(以pCI-VP0表示，下同)+pCI-IL-2组、pCI-VP2/VP4/VP3组、pCI-VP2/VP4/VP3-ISCOM组、pCI-IL-2组、pCI组、正常对照组和攻毒对照组，每组15只，ISCOM为人工免疫增强剂(见Le etal，Vaccine，2001)。所有免疫组于14日龄首次免疫，14天后，进行二次免疫，免疫途径均为肌肉注射，免疫剂量为200μg质粒/只，pCI-IL-2的浓度可以在1-20μg/μl任意选择。二次免疫后14天，分别攻击IBDV中国标准强毒株BC6/85株(购自中国兽医兽药监察所)，攻击后3天人工扑杀，称取鸡体重、法氏囊重和脾重，计算平均囊体比和脾体比，检查鸡的法氏囊、脾脏等器官的眼观病变，所有法氏囊用10％甲醛固定。常规法石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，镜检，观察法氏囊的病理组织学变化。按生物统计学上的方差分析法对平均囊体比、平均脾体比进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果见附图15，在附图15中A表示法氏囊的病变等级：0级(无病变)；1(轻微病变)；2(中等病变)；3(严重病变)。B表示器官与鸡体重的重量比。a表示与对照组差异显著(p＜0.05)。如附图15所示，pCI-VP2/VP4/VP3组的攻击保护率仅达60％，而pCI-VP2/VP4/VP3+pCI-IL-2组的攻击保护率达80％，说明鸡IL-2质粒能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒的攻击保护。pCI-VP2/VP4/VP3+pCI-IL-2组与pCI-VP2/VP4/VP3-ISCOM组的免疫保护力相当，说明pCI-IL-2可起到与ISCOM人工免疫增强剂同样的免疫增强效果。pCI-IL-2对照组、pCI对照组、攻毒对照组均出现IBD典型的临床症状、病理组织学变化。病鸡主要表现为精神萎顿、羽毛蓬松、拉白色粪便，并出现鸡只的死亡，剖检发现法氏囊水肿(P＜0.05)、内有大量干酪样物质、法氏囊粘膜有点状出血，脾脏肿大(P＜0.05)。组织病理学变化表现为法氏囊淋巴细胞减少、萎缩、坏死，淋巴滤泡消失，呈空泡状，结缔组织大量增生。
(2)鸡IL-2质粒增强DNA疫苗诱导的体液免疫应答效果观察
随机翅静脉定期采集上述各组鸡的血液，分离血清，56℃灭活30min。常规法制备鸡胚成纤维细胞，采用固定病毒稀释血清法测定鸡群的中和抗体效价动态变化规律。某个时间的中和抗体效价以5只鸡的中和抗体的几何平均数(GMT值)表示。按生物统计学上的方差分析法对中和抗体数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如附图10所示：pCI-VP2/VP4/VP3组首次免疫后10天内基本检测不到抗体，免疫后2周开始上升，至二免后14天的中和抗体效价达2599，免疫后49天开始下降。pCI-VP2/VP4/VP3+pCI-IL-2组在首次免疫后10天便可检出中和抗体，至二免后14天可达3057.4，至二免后56天还呈上升趋势，整个检测过程中的抗体效价显著高于pCI-VP2/VP4/VP3组(P＜0.05)，说明共注射鸡IL-2质粒能显著增强DNA疫苗诱导的中和抗体水平。
(3)鸡IL-2质粒增强DNA疫苗诱导的脾脏T淋巴细胞增殖反应
上述各组鸡在首免后1、2周，二免后1、2、3、4、5、6周随机剖杀5只鸡，无菌采集脾脏制成单细胞悬液，MTT法测定脾脏T的增殖反应。取50μl脾淋巴细胞分别加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48h；上述培养物均加入10μl MTT(5mg/ml)，继续培养3h后加入10％SDS-0.01mol/L HCl溶液100μl，混匀，继续培养2h后，以对照孔调零，测定λ＝570nm处的OD值，每个样品设5个重复孔。某个时间内的淋巴细胞增殖反应以5只鸡的OD570平均数表示。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如附图11所示：共注射IL-2质粒组的脾脏T细胞的增殖反应显著地高于单注射pCI-VP2/VP4/VP3组(P＜0.05)，说明IL-2质粒能协同促进DNA疫苗诱导脾脏T细胞的增殖。
(4)鸡IL-2质粒增强DNA疫苗诱导的胸腺T淋巴细胞增殖反应
上述各组鸡在首免后1、2周，二免后1、2、3、4、5、6周随机剖杀5只鸡，无菌采集胸腺制成单细胞悬液，MTT法分别测定胸腺T淋巴细胞的增殖反应。取50μl胸腺淋巴细胞加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48h；以下步骤同(3)。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如附图12所示：共注射IL-2质粒组的胸腺T细胞的增殖反应显著地高于单注射pCI-VP2/VP4/VP3组(P＜0.05)，说明IL-2质粒能协同促进DNA疫苗诱导下胸腺T细胞的增殖。
(5)鸡IL-2质粒增强DNA疫苗诱导的外周血液T淋巴细胞增殖反应
上述各组鸡在首免后1、2周，二免后1、2、3、4、5、6周随机心脏采血5只鸡，加淋巴细胞分层液，分离外周血液T淋巴细胞，制成单细胞悬液，MTT法测定脾脏T的增殖反应。取50μl脾淋巴细胞分别加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48h；以下步骤同(3)。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
如附图13所示：共注射IL-2质粒组的外周血液T细胞的增殖反应显著地高于单注射pCI-VP2/VP4/VP3组(P＜0.05)，说明IL-2质粒能协同促进DNA疫苗诱导下外周血液的T细胞淋巴细胞增殖。
(6)鸡IL-2质粒增强DNA疫苗诱导的法氏囊B淋巴细胞增殖反应
上述各组鸡在首免后1、2周，二免后1、2、3、4、5、6周随机剖杀5只鸡，无菌采集法氏囊制成单细胞悬液，MTT法分别测定法氏囊B淋巴细胞增殖反应。取50μl法氏囊淋巴细胞加入50μl PMA溶液(1μg/ml)，5％CO2培养箱40℃培养21h；以下步骤同(3)。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如附图14所示：共注射IL-2质粒组法氏囊B细胞的增殖反应显著地高于单注射pCI-VP2/VP4/VP3组(P＜0.05)，说明IL-2质粒能协同促进DNA疫苗诱导下的B细胞的增殖。
实施例5
本实施例描述了鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白对传染性法氏囊病毒弱毒疫苗和基因工程疫苗的免疫增强效果。
(1)鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强传染性法氏囊病毒弱毒疫苗对强毒攻击保护效果
本试验以IBD弱毒苗B87(购自杭州万马药厂)为试验材料，14日龄非免疫来杭鸡100只，共分成5组，即B87弱毒苗+IL-2蛋白组、弱毒苗组、IL-2蛋白组、正常对照组和攻毒对照组，每组20只。所有免疫组于14日龄首次免疫，14天后，进行二次免疫，免疫途径均为肌肉注射法。二次免疫后14天，分别攻击IBDV中国标准强毒株BC6/85株，攻击后3天人工扑杀，称取鸡体重、法氏囊重和脾重，计算平均囊体比和脾体比，检查鸡的法氏囊、脾脏等器官的眼观病变，所有法氏囊用10％甲醛固定。常规法石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，镜检，观察法氏囊的病理组织学变化。按方差分析法对平均囊体比、平均脾体比进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果见图16，在附图16中A表示法氏囊的病变等级：0级(无病变)；1(轻微病变)；2(中等病变)；3(严重病变)；B表示器官与鸡体重的重量比；a表示与对照组差异显著(p＜0.05)。如图16所示，B87弱毒苗+IL-2蛋白组对强毒攻击的保护率可达90％，而单独使用弱毒苗B87组对强毒攻击的保护率仅达70％，说明鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白能显著增强传染性法氏囊病毒弱毒疫苗对强毒攻击保护效果。攻毒对照组均出现IBD典型的临床症状、病理组织学变化。病鸡主要表现为精神萎顿、羽毛蓬松、拉白色粪便，并出现鸡只的死亡，剖检发现法氏囊水肿(P＜0.05)、内有大量干酪样物质、法氏囊粘膜有点状出血，脾脏肿大(P＜0.05)。组织病理学变化表现为法氏囊淋巴细胞减少、萎缩、坏死，淋巴滤泡消失，呈空泡状，结缔组织大量增生。
(2)鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强传染性法氏囊病毒弱毒疫苗诱导的中抗体效价
随机翅静脉定期采集各组鸡的血液，分离血清，56℃灭活30min。常规法制备鸡胚成纤维细胞，采用固定病毒稀释血清法测定鸡群的中和抗体效价动态变化规律。某个时间的中和抗体效价以5只鸡的中和抗体的几何平均数(GMT值)表示。按方差分析法对中和抗体数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如图17所示，B87弱毒苗+IL-2蛋白组诱导鸡体产生的中和抗体效价显著高于单独使用弱毒苗B87组的中和抗体效价(P＜0.05)，说明鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白能显著增强传染性法氏囊病毒弱毒疫苗诱导的中抗体效价。
(3)鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强传染性法氏囊病毒基因工程疫苗对强毒攻击保护效果
本试验以家蚕为生物反应器生产的IBDV VP2基因工程疫苗(浙江大学动物科学学院提供)为试验材料，14日龄非免疫来杭鸡100只，共分成5组，即IBDV基因工程疫苗+IL-2蛋白组、IBDV基因工程疫苗组、IL-2蛋白组、正常对照组和攻毒对照组，每组20只。所有免疫组于14日龄首次免疫，14天后，进行二次免疫，免疫途径均为肌肉注射法。二次免疫后14天，分别攻击IBDV中国标准强毒株BC6/85株，攻击后3天人工扑杀，称取鸡体重、法氏囊重和脾重，计算平均囊体比和脾体比，检查鸡的法氏囊、脾脏等器官的眼观病变，所有法氏囊用10％甲醛固定。常规法石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，镜检，观察法氏囊的病理组织学变化。按方差分析法对平均囊体比、平均脾体比进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果见附图18，在附图18中A表示法氏囊的病变等级：0级(无病变)；1(轻微病变)；2(中等病变)；3(严重病变)；B表示器官与鸡体重的重量比；a表示与对照组差异显著(p＜0.05)。如图18所示，IBDV基因工程疫苗+IL-2蛋白组对强毒攻击的保护率可达80％，而单独使用基因工程疫苗组对强毒攻击的保护率仅达60％，说明鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白能显著增强传染性法氏囊病毒基因工程疫苗对强毒攻击保护效果。攻毒对照组均出现IBD典型的临床症状、病理组织学变化。病鸡主要表现为精神萎顿、羽毛蓬松、拉白色粪便，并出现鸡只的死亡，剖检发现法氏囊水肿(P＜0.05)、内有大量干酪样物质、法氏囊粘膜有点状出血，脾脏肿大(P＜0.05)。组织病理学变化表现为法氏囊淋巴细胞减少、萎缩、坏死，淋巴滤泡消失，呈空泡状，结缔组织大量增生。
(4)鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强传染性法氏囊病毒基因工程疫苗诱导的中抗体效价
随机翅静脉定期采集各组鸡的血液，分离血清，56℃灭活30min。常规法制备鸡胚成纤维细胞，采用固定病毒稀释血清法测定鸡群的中和抗体效价动态变化规律。某个时间的中和抗体效价以5只鸡的中和抗体的几何平均数(GMT值)表示。按生物统计学上的方差分析法对中和抗体数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如图19所示，IBDV基因工程疫苗+IL-2蛋白组诱导鸡体产生的中和抗体效价显著高于单独使用IBDV基因工程疫苗组的中和抗体效价(P＜0.05)，说明鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白能显著增强传染性法氏囊病毒基因工程疫苗诱导的中抗体效价。
实施例6
本实施例描述了鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白和鸡白细胞介素2质粒增强鸡体的免疫功能，进而增强了各种禽类疫苗的免疫效果和鸡体对各种病原的抵抗能力。这些禽类疫苗包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
(1)鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白增强了鸡体的免疫功能。
14日龄非免疫来杭鸡40只，共分2组，每组20只，即注射鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白组和正常对照组，各组鸡在注射射后4周剖杀，无菌采集脾脏、胸腺、法氏囊、外周血液制成单淋巴细胞悬液，MTT法测定脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B淋巴细胞的增殖反应，并与正常对照组做比较。取50μl上述制备的淋巴细胞分别加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48h；上述培养物均加入10μl MTT(5mg/ml)，继续培养3h后加入10％SDS-0.01mol/L HCl溶液100μl，混匀，继续培养2h后，以对照孔调零，测定λ＝570nm处的OD值，每个样品设5个重复孔。某个时间内的淋巴细胞增殖反应以5只鸡的OD570平均数表示。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果如图20所示，在附图20中A表示注射鸡IL-2蛋白4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；B表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2蛋白)4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；C表示注射鸡IL-2蛋白4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；D表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2蛋白)4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；E表示注射鸡IL-2蛋白4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；F表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2蛋白)4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；G表示注射鸡IL-2蛋白4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应；H表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2蛋白)4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应。如附图20所示：鸡体注射鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白后的脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B淋巴细胞的增殖反应均显著地高于正常对照组(P＜0.05)，说明鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白具有增强鸡体免疫功能的作用。因此，鸡白细胞介素2(IL-2)蛋白可以提高禽类弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的免疫效果，这些禽类疫苗包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等的弱毒疫苗、基因工程疫苗和DNA疫苗。
(2)鸡白细胞介素2(IL-2)质粒增强了鸡体的免疫功能。
14日龄非免疫来杭鸡40只，共分2组，每组20只，即注射鸡白细胞介素2(IL-2)质粒组和正常对照组，各组鸡在注射射后4周剖杀，无菌采集脾脏、胸腺、法氏囊、外周血液制成单淋巴细胞悬液，MTT法测定脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B淋巴细胞的增殖反应，并与正常对照组做比较。取50μl上述制备的淋巴细胞分别加入50μl ConA溶液(40μl/ml)，5％CO2培养箱40℃培养48h；上述培养物均加入10μl MTT(5mg/ml)，继续培养3h后加入10％SDS-0.01mol/L HCl溶液100μl，混匀，继续培养2h后，以对照孔调零，测定λ＝570nm处的OD值，每个样品设5个重复孔。某个时间内的淋巴细胞增殖反应以5只鸡的OD570平均数表示。按方差分析法对细胞增殖反应数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。
结果见附图21所示，附图21中A表示注射鸡IL-2质粒4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；B表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2质粒)4周后的脾脏T淋巴细胞的增殖反应；C表示注射鸡IL-2质粒4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；D表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2质粒)4周后的胸腺T淋巴细胞的增殖反应；E表示注射鸡IL-2质粒4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；F表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2质粒)4周后的外周血液T淋巴细胞的增殖反应；G表示注射鸡IL-2质粒4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应；H表示正常对照鸡(未注射鸡IL-2质粒)4周后的法氏囊B淋巴细胞的增殖反应。如附图21所示：鸡体注射鸡白细胞介素2(IL-2)质粒后的脾脏、胸腺、外周血液T淋巴细胞的增殖反应和法氏囊B淋巴细胞的增殖反应均显著地高于正常对照组(P＜0.05)，说明鸡白细胞介素2(IL-2)质粒具有增强鸡体免疫功能的作用。因此，鸡白细胞介素2(IL-2)质粒可以提高禽类DNA疫苗的免疫效果，这些禽类DNA疫苗包括鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒、鸡贫血因子、鸡球虫等的DNA疫苗。
Claims (4)
1、具有下列核苷酸序列的鸡白细胞介素2(IL-2)基因，TGGGACACTGCCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGCTGTATTTCGGT 50AGCAATGCTAATGACTACAGCTTATGGAGCATCTCTATCATCAGCAAAAA 100GGAAACCTCTTCAAACATTAATAAAGGATTTAGAAATATTGGAAAATATC 150AAGAACAAGATTCATCTCGAGCTCTACACACCAACTGAGACCCAGGAGTG 200CACCCAGCAAACTCTGCAGTGTTACCTGGGAGAAGTGGTTACTCTGAAGA 250AAGAAACTGAAGATGACACTGAAATTAAAGAAGAATTTGTAACTGCTATT 300CAAAATATCGAAAAGAACCTCAAGAGTCTTACGGGTCTAAATCACACCGG 350AAGTGAATGCAAGATCTGTGAAGCTAACAACAAGAAAAAATTTCCTGATT 400TTCTCCATGAACTGACCAACTTTGTGAGATATCTGCAAAAATAAGCAACT 450AATCATTTTTATTTTACTGCTATGTTATTTATTTAATTATTTAATTACAG 500ATAATTTATATATTTTATCCCGTGGCTAACTAATCTGCTGTCCATTCTGG 550GACCACTGTATGCTCTTAGTCTGGGTGATATGACGTCTGTTCTAAGATC 600ATATTTGATCCTTTCTGTAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTACGTTGGAAA 650ACTGATTGATTCTCACTTTGTCGGTAAAGTGATATGTGTTTACTGAAAGA 700
ATTTTTAAAAGTCACTTCTAGATGACATTTAATAAATT 737
长度为737个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，在5’端前12个核苷酸为非编码区，在3’端前293个核苷酸为非编码区，其余为编码区。
2、真核表达质粒，其特征在于它为以pCI作为真核表达载体，含有权利要求1所述的白细胞介素-2(IL-2)基因的编码序列的重组载体(pCI-IL-2)，其保存号为CGMCC0719。
3、禽类疫苗的免疫增强剂，其特征在于它为权利要求2所述的真核表达质粒(pCI-IL-2)的水溶液，其浓度为1-20g/μl。
4、禽类疫苗的免疫增强剂，其特征在于它含有权利要求2所述的真核表达质粒在真核细胞或动物体内所表达的鸡白细胞介素-2蛋白，鸡白细胞介素-2蛋白所占重量比为1-20％。
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