CN110055194B - 一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌 - Google Patents

一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌，其保藏编号为CCTCC NO:M2018849。本发明所提供的杀鲑气单胞菌用于制备疫苗。本发明所提供的杀鲑气单胞菌是从发病的冷水虹鳟中筛选获得的，该菌株相比于目前杀鲑气单胞菌产生了变异，用于制备疫苗，从而对虹鳟鱼提供更完善的免疫保护。

Description

一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌
技术领域
本发明属于病原微生物筛选技术领域，具体涉及一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌。
背景技术
虹鳟鱼是属于鲑科的一种冷水性鱼类，是目前最广泛的世界性养殖的淡水鱼类之一，由于虹鳟鱼最适合进行人工集约化养殖，具有高产、高效、市场广阔等特点，所以虹鳟鱼养殖发展迅速，养殖面积范围及养殖产量在逐年增长。
但随着养殖规模的扩大，养殖密度的逐渐增大，在冷水虹鳟的养殖过程中出现了诸多病害问题，而近年来在虹鳟养殖过程中细菌性疾病的发生比较频繁，给养殖户造成了很大的经济损失。常用的孔雀石绿、呋喃唑酮、氯霉素等有效控制细菌疾病的药物，由于会产生残留，已经被国家禁止使用。
疫苗的使用可提高养殖鱼类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，不污染环境，无药物残留等问题，是今后鱼类疾病防控的主流发展方向。
但在微生物疫苗制备领域中，已正式上市的疫苗所使用的抗原菌株为已多年流行的标准菌株，但随着时间推移和环境变化，致病菌株会由于免疫导致的选择压力发生变异，使原有疫苗免疫产生的抗体无法针对变异菌株提供完全的免疫保护，临床应用效果不佳。另一个可能因素是当两个或以上的病菌同时侵袭一个宿主细胞时，基因片段之间相互作用，在转录复制过程中发生交换、交叉或重排，引起基因的变异。而突变株有一定的几率使已有的疫苗的免疫效果降低或完全没有效果。因此，筛选变异菌株就成为疫苗制备领域的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌，能够用于制备灭活疫苗，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种RB0506(Aeromonassalmonicida subsp.masoucida RB0506)，于2018年12月03日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018849；
本发明所提供的杀鲑气单胞菌在制备疫苗中的应用。
所述的疫苗为灭活疫苗。
本发明所提供的杀鲑气单胞菌是从发病的冷水虹鳟中筛选获得的，该菌株相比于目前杀鲑气单胞菌产生了变异，用于制备疫苗，从而对虹鳟鱼提供更完善的免疫保护。
具体实施方式
下面对本发明进行详细说明。
实施例1：杀鲑气单胞菌菌株的分离及其毒性分析
1)患病虹鳟取自山东日照养鱼厂，但发病虹鳟鱼之前已进行了单胞菌疫苗注射免疫。发病的病鱼平均体重为(100±5)g，平均体长(17±2)cm，主要症状为体表溃烂、腹鳍基部充血发红、肛门突出、肠道充血。
2)取症状典型的濒死病鱼，无菌条件下从鳍基部、肠道等病灶处挑取部分组织，划线于MH琼脂平板上，28℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌。
3)将分离获得各菌株纯培养物，在MH琼脂平板上进行扩大培养，28℃培养24h后，用0.9％无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，利用比浊法将菌株的细菌浓度定为1×107CFU/mL，用于注射感染。
4)实验用健康虹鳟每20尾1组，大小规格与患病虹鳟相同，并设生理盐水对照组。养殖水温为17±1℃，全天充气，每天换水50％。暂养7d后，腹腔注射0.2mL不同菌株的菌悬液，对照组注射同体积的0.9％无菌生理盐水。定时观察记录，取濒死鱼的病灶及内脏器官进行细菌再分离，所分离优势菌株再次感染虹鳟，观察结果。
5)感染实验结果显示，仅有菌株RB0506显示出对健康虹鳟具有较高的毒力，可引起90％虹鳟死亡，且死亡虹鳟出现与患病虹鳟相同的症状。因此，证实菌株RB0506为引起虹鳟皮肤溃疡的病原。且在感染患病的虹鳟体内可再次分离到该菌株。
菌株RB0506于2018年12月03日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018849。
6)从GenBank下载已知杀鲑气单胞菌的封闭带毒素(ZOT)、OmpW基因和气溶素Aerolysin基因的序列，经过alignment分析比对后，根据保守序列设计用于扩增Primer5.0软件设计封闭带毒素(ZOT)、OmpW基因和气溶素Aerolysin基因的扩增引物，采用RT-PCR方法扩增各基因节段序列，并用BLASTn分析各基因编码情况。与GenBank上已发表的三个抗原基因进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。
结果表明，三种抗原蛋白都存在5-10个氨基的差异。分子生物学分析结果表明新分离的杀鲑气单胞菌RB0506菌株与已报到的杀鲑气单胞菌有着明显区别，主要表现为各基因片段核苷酸之间的点突变和基因重组。
其中RB0506菌株ZOT基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,OmpW基因的序列为SEQ IDNO:2，气溶素Aerolysin基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
实施例2：使用杀鲑气单胞菌制备灭活疫苗
将MH肉汤中过夜培养的杀鲑气单胞菌RB0506菌株室温6000rpm离心10min，细菌沉淀用生理盐水(0.9％NaCl溶液)重悬，再离心收集沉淀，重复2次，最后用生理盐水重悬并调整细菌浓度至1.5×109个/mL，分装于50mL离心管内，每管30mL，利用0.1％的甲醛溶液在28℃条件下对杀鲑气单胞菌灭活5h制成灭活疫苗抗原悬液。
取19ml上述灭活疫苗抗原悬液，加入1ml灭菌Tween-80搅拌混匀，制备成乳化疫苗的水相；而后用疫苗用白油38.4ml，1.6ml Span-80，0.6g硬脂酸铝相混合，加热使硬脂酸铝完全溶化，灭菌制备成乳化疫苗的油相；使用分散机10000rpm转速，将40ml的油相缓慢加入到20ml水相中，搅拌3分钟形成乳白色油包水性油乳疫苗。
实施例3：疫苗的效果检测
按照步骤2制备疫苗的步骤，将杀鲑气单胞菌CICC 23564株和杀鲑气单胞菌E11I4株(CGMCC1.16015)作为抗原制备成疫苗，
将3种灭活疫苗浓度调整至OD600为0.1±0.01，利用腹腔注射的方法分别免疫健康虹鳟，每尾100μL，对照组注射同体积的无菌生理盐水，每组免疫20尾，每组做4个重复。养殖水温为17±1℃，全天充气，每天换水50％；免疫后40d用三种杀单胞菌菌株进行攻毒，每尾腹腔注射浓度为5.0×108CFU/mL的菌液100μL；每天定时观察并记录各实验组鱼体死亡数量，计算3种灭活疫苗对杀鲑气单胞菌感染的相对免疫保护率。
结果表明，攻毒后注射生理盐水组的鱼体在攻毒后第2天便开始出现死亡，并且鱼体在接下来的一周内出现大量死亡，直至攻毒后第10天死亡率达到96.7％；攻毒受感的鱼体表现出腹鳍基部充血发红、肛门突出、肌肉出血、肠道出血等杀鲑气单胞菌感染的典型临床症状，并能从受感死亡鱼体中再次分离到该菌株。而3种疫苗免疫组鱼体的死亡率显著低于生理盐水对照组。但实施例2中使用RB0506菌株制备的灭活疫苗的免疫组，在RB0506菌株攻毒组的死亡率显著低于另外两株杀鲑气单胞菌制备的疫苗(表1)。
表1：三种菌株制备的疫苗的免疫保护试验结果表
Figure BDA0002037038110000061
注：表示存活数/攻毒总数，
上述结果表明本发明所筛选获得的杀鲑气单胞菌相比于已报到的杀鲑气单胞菌发生了变异，从而在感染保护上与已有细菌株在感染保护上有着显著的差异。
序列表
<110> 山东省海洋生物研究院
<120> 一种冷水虹鳟来源的杀鲑气单胞菌
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> 杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)
<400> 1
Met Ala Ile Val Ile Glu His Gly His Asn Gly Ser Tyr Lys Arg Ser
1 5 10 15
Ser Val Ile Trp Tyr Arg Leu Pro Pro Ala Leu Arg Ala Gly Arg Leu
20 25 30
Val Val Thr Asn Ala Ala Gly Ala Tyr Pro Leu His Arg Ile Glu Glu
35 40 45
Gly Leu Gly Glu Lys Phe Pro Leu Thr Ala Arg Leu Phe Arg Val Ser
50 55 60
Ser Gln Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Leu Trp Arg Val Trp His His Trp
65 70 75 80
Met Pro Ile Gly Ala Phe Val Phe Ile Asp Glu Cys Cys Asp Ile Tyr
85 90 95
Asp Arg Asp Val Phe Lys Gly Gly Pro Glu Phe Asn Leu Glu Pro Ile
100 105 110
Glu His Tyr Ser Asn Val Leu Pro Pro Asp Arg Ile Gln Leu Phe Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Glu Ser Phe Lys Pro Glu Thr Ile Glu Ser Cys Asp Thr
130 135 140
Asp Asp Thr Gly Arg Val Val Phe Asp Asp Arg Gly Leu Ile Met Tyr
145 150 155 160
Pro Thr Ser Pro Lys Glu Ser Phe Met Arg His Arg His Tyr Asn Trp
165 170 175
Asp Val Val Glu Ala Thr Pro Asp Ile Thr Ser Ile Pro Arg Pro Val
180 185 190
Arg Ala Cys Cys Glu Val Ala Phe Ala Tyr Arg Ser Lys Asp Ser Phe
195 200 205
Phe Phe Ser Lys Arg Lys Pro Arg Ile Tyr Glu His Asn Pro Asp Asp
210 215 220
Asn Gly Ile Pro Thr Lys Gln Ser Val Thr Phe Lys Arg His Val Pro
225 230 235 240
Leu Ala Val His Arg Leu Tyr Lys Ser Thr Gln Gln Ser Ala Ile Thr
245 250 255
Lys Ser Gly Gln Ser Gly Gly Pro Leu Ser Ser Phe Lys Ile Arg Phe
260 265 270
Val Leu Phe Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Leu Phe Trp Met Trp His
275 280 285
Tyr Ser Thr Arg Leu Gly Ala Asp Pro Ala Ala Ser Glu Thr Gly Asp
290 295 300
Pro Val Ala Val Glu Ser Arg Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ala
305 310 315 320
Ile Ser Val Pro Val Pro Asp Val Ser Asn Arg Gly Ala Gln Ser Ala
325 330 335
Phe Val Met Pro Ala Gln Val Thr Glu Leu Phe Thr Asn Gly Ala Ser
340 345 350
Gly Ala Ile Tyr Ala Gly Arg Phe Asp Gly Gln Gly
355 360
<210> 2
<211> 204
<212> PRT
<213> 杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)
<400> 2
Met Lys Lys Ile Leu Pro Leu Met Glu Val Ala Ala Leu Ala Ser Pro
1 5 10 15
Val Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Ile Leu Ile Arg Gly Gly Leu
20 25 30
Ala Phe Val Ser Pro Gln Thr Ser Ser Asp Asp Val Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Glu Phe Glu Ile Asp Ser Asn Met Gln Arg Gly Pro Thr Leu Ser
50 55 60
Tyr Leu Ile Thr Asp Asn Trp Gly Val Glu Leu Leu Ala Glu Thr Pro
65 70 75 80
Phe Ser His Ser Val Ser Leu Ala Gly Thr Glu Val Ala Lys Asp Thr
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Thr Leu Met Ala Gln Tyr Tyr Phe Gly Asp Ala Lys
100 105 110
Ser Lys Val Arg Pro Tyr Val Gly Val Gly Val Asp Tyr Thr Asn Phe
115 120 125
Phe Asp Glu Lys Gly Arg Gly Pro Leu Ala Asn Glu Asp Ile Thr Leu
130 135 140
Asp Asp Ser Trp Gly Val Ala Gly Pro Val Gly Leu Asp Met Ala Ile
145 150 155 160
Asn Asp Arg Trp Phe Val Asn Ala Ser Asp Trp Ile Met Asp Ile Asp
165 170 175
Thr Glu Val His Val Asn Gly Gly Asp Gly Ile Lys Thr Ser Val Asp
180 185 190
Pro Met Ala Phe Met Phe Gly Val Gly Tyr Arg Phe
195 200
<210> 3
<211> 216
<212> PRT
<213> 杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)
<400> 3
Met Lys Lys Leu Lys Ile Thr Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Gly Asp
1 5 10 15
Leu Met Ala Gln Ala Gln Ala Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu
20 25 30
Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gly Asp Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro
35 40 45
Glu Arg Glu Glu Ala Gln Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met
50 55 60
Gly Gln Trp Ala His Tyr Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly
65 70 75 80
Pro Gly Tyr Asn Gly Glu Ile Lys Pro Gly Ser Ala Ser Ser Thr Trp
85 90 95
Cys Tyr Asp Ile Asn Pro Ala Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala
100 105 110
Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp Glu Pro Asp Val Gln Trp Arg Leu Val
115 120 125
His Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Asp Lys Thr Tyr Leu Ala His Tyr
130 135 140
Leu Gly Tyr Ala Trp Val Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Met
145 150 155 160
Asp Met Asp Val Thr Arg Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Glu Gly Asn
165 170 175
Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ser Ile
180 185 190
Lys Ile Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Glu Lys His
195 200 205
Gly Asp Val Thr Gln Ser Asp Arg
210 215

Claims (3)

1.一种杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida subsp.masoucida) RB0506株，其特征在于，所述的杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida subsp.masoucida) RB0506株的保藏编号为CCTCC NO:M2018849。
2.权利要求1所述的杀鲑气单胞菌 (Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)RB0506株在制备疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为灭活疫苗。
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