CN113214407B

CN113214407B - Ii型草鱼呼肠孤病毒vp4-ns38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用

Info

Publication number: CN113214407B
Application number: CN202110243753.5A
Authority: CN
Inventors: 尹纪元; 王庆; 王英英; 李莹莹; 吴斯宇; 石存斌; 张德锋
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN113214407A

Abstract

本发明公开了一种II型草鱼呼肠孤病毒VP4‑NS38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用。本发明通过融合PCR的方式将能够引起草鱼产生不同方式免疫应答反应的VP4和NS38蛋白以柔性linker连接，构建能够在枯草芽孢杆菌芽孢体中融合表达GCRVVP4‑NS38蛋白的重组芽孢杆菌。以该重组芽孢杆菌口服免疫草鱼能够刺激鱼体产生具有中和活性的黏膜抗体和血清抗体，而且能够引起草鱼产生体液免疫反应，也能够引起草鱼产生细胞免疫反应；同时还能够减少草鱼在病毒感染过程中的炎症反应。具有很好的安全性，对草鱼的生长不产生显著影响，也不会对草鱼的组织器官造成病理损害，可以应用在草鱼出血病口服疫苗的研究中。

Description

II型草鱼呼肠孤病毒VP4-NS38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及II型草鱼呼肠孤病毒VP4-NS38融合蛋白基因、载体、菌株及其应用。

背景技术

草鱼是我国最主要的淡水养殖鱼类，据统计仅2017年我国养殖草鱼产量高达534.56万吨，但是由于草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)导致的草鱼出血病可引起患病草鱼鱼种各器官、组织不同程度的充血、出血症状，严重可导致患鱼死亡，致死率高达85％。目前草鱼出血病在我国湖北、湖南、广东、广西、江苏、浙江、安徽、福建、上海、四川等草鱼主养地区广泛流行，具有流行范围广、致死率高的特点，为我国渔业生产带来了巨大的经济损失。目前，对于草鱼出血病的防治，还没有特异有效的治疗药物和方法，最为有效的办法仍然是疫苗免疫预防。草鱼出血病土法疫苗和商品化的细胞灭活疫苗与细胞弱毒疫苗的应用，对减少草鱼出血病的发生起到了一定的效果。然而草鱼出血病灭活疫苗和弱毒活疫苗都需要通过肌肉注射途径免疫接种，操作复杂限制了草鱼出血病疫苗在生产上的推广和应用。

GCRV病毒粒子呈正二十面体，直径65～72nm，核心直径约为50nm，无囊膜，具有双层衣壳。成熟的GCRV病毒粒子主要由蛋白质和核酸组成，还含有少量的糖类，以糖蛋白形式存在，不含脂类。研究表明以GCRV具有中和活性保护性抗原制备的亚单位疫苗能够很好的诱导机体产生特异性免疫保护。方勤，郝贵杰等人研究发现GCRV外衣壳蛋白VP5和VP7的特异性抗体具有中和活性。方勤等制备GCRV-VP5蛋白的多克隆抗体能够封闭GCRV病毒体外感染，利用VP5的抗体中和GCRV病毒粒子上的VP5蛋白，结果发现病毒对宿主细胞的感染能力显著降低。徐诗英、刘林等在pFast Bac Dual中构建的GCRV VP6和VP7核酸疫苗，免疫注射草鱼，攻毒实验也表明其核酸疫苗对草鱼出血病有很好的免疫保护作用。

GCRV基因组包括11条分节段的双链RNA，编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。基于GCRV基因组编码蛋白的同源性比较和三维结构分析，GCRV与哺乳动物正呼肠孤病毒基因同源性较高，且结构相似。其中S6节段编码的外衣壳蛋白VP4与MRVμ1为同源蛋白，可能是GCRV外衣壳复合体的主要组成蛋白，在病毒入侵细胞过程中扮演重要角色。外衣壳蛋白通常为病毒诱导宿主产生适应性免疫的主要蛋白，前期研究结果表明GCRV VP4蛋白能够很好的中和活性，是制备草鱼出血病亚单位疫苗最的理想抗原表位。

鱼类口服接种疫苗不受时间、地点和鱼体大小的限制，适用于大群体接种，操作方便、省时、省力，便于大规模推广应用。但蛋白抗原在水体环境中稳定性差、利用率低，易被消化道内的蛋白酶降解，口服接种后免疫保护效果不佳。因此，能递呈抗原并维持抗原在动物消化道和环境中稳定性的载体是研制安全高效的鱼类口服疫苗的关键共性问题。近年来，尝试采用新型材料，如海藻酸盐、可生物降解高分子聚合材料(如聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物)包裹疫苗抗原，制备能在环境和动物胃肠道中保持抗原稳定性的口服微球疫苗。尽管口服微球疫苗免疫效果有所提高，但还有诸多尚待解决的问题。譬如，微球共聚物制备工艺中添加的有机金属催化剂(如三基铝化合物)和机溶剂(如二氯甲烷等)残留对接种动物和环境生物的毒副作用；在微球制备后期的冷冻干燥过程中，添加避免影响抗原活性的多种稳定剂仍存留其中。

以枯草芽孢杆菌做为活载体携带草鱼呼肠孤病毒保护性抗原VP4或者NS38制备黏膜免疫口服疫苗，通过肠黏膜进行抗原递呈，可经不同的免疫通路产生特异性和非特异性免疫应答反应，获得与常规注射类似的免疫保护效果。草鱼呼肠孤病毒重组芽孢杆菌口服疫苗克服了传统灭活疫苗和弱毒疫苗肌肉注射接种操作复杂的缺点，还具有不受时间、场所、鱼体大小、天气因素的限制和影响，对鱼体不产生应激等优势。芽孢杆菌作为黏膜免疫载体具有许多益生功能和免疫增强作用。

但是与传统注射免疫，芽孢杆菌口服疫苗的免疫保护率较低，限制了其应用效果。以枯草芽孢杆菌作为载体制备表达GCRV VP4蛋白的重组芽孢杆菌口服免疫草鱼能够有效刺激鱼体产生免疫保护，但是与传统弱毒疫苗注射免疫相比，GCRV VP4蛋白的重组芽孢杆菌口服的免疫保护率较低，免疫保护效果不理想；GCRV NS38蛋白口服免疫草鱼，虽然不能够刺激草鱼产生特异性免疫应答，但是可以显著提高草鱼的非特异性免疫水平。此外攻毒保护实验结果表明，表达GCRV VP4蛋白和GCRV NS38蛋白均能够刺激鱼体产生一定免疫保护效果，但是两相对保护率均相对较低。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为了提高草鱼出血病重组芽孢杆菌口服疫苗的保护效果，使其在操作简便的优点的同时，能够更高效的刺激鱼体产生特异性免疫保护，获得更高的保护率。本研究构建融合表达GCRV VP4和NS38的重组芽孢杆菌，利用GCRV NS38蛋白能够提高消化道黏膜免疫系统非特异性免疫的功能，进一步提高VP4蛋白的特异性免疫保护效果，制备具有更加方便高效的草鱼出血病重组芽孢杆菌口服疫苗。为此，本发明提出一种融合蛋白，所述融合蛋白包含GCRV VP4蛋白和GCRV NS38蛋白，所述GCRV VP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述GCRV NS38蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供一种核酸分子，所述编码上述融合蛋白。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子包含GCRV VP4基因和GCRV NS38基因，两者之间通过Linker连接。

在本发明的一些实施方式中，所述Linker位于GCRV NS38基因的5’端。

在本发明的一些实施方式中，所述GCRV VP4基因的序列如SEQ ID NO.1所示，所述GCRV NS38基因的序列如SEQ ID NO.2所示，所述Linker的序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提出一种载体，所述载体含有上述核酸分子。

在本发明的一些实施方式中，所述载体为原核或真核表达载体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述载体为枯草芽孢杆菌质粒载体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述载体为枯草芽孢杆菌质粒载体PEB03。

在本发明的一些实施方式中，所述载体是由上述核酸分子插入质粒PEB03的Sal I和BamH I位点间来构建的。

在本发明的一些实施方式中，所述载体中以芽孢衣壳蛋白基因CotC为分子载体。

在本发明的一些实施方式中，所述芽孢衣壳蛋白基因CotC的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明还提出一种菌株，所述菌株含有上述载体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述菌株为枯草芽孢杆菌WB600，已于2021年1月18日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021102，分类命名为枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600(Bacillus subtilis GCRV VP4-N S38-Cot C/W600)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

本发明还提供一种制备上述融合蛋白的方法，包括以下步骤：

1.将上述核酸分子插入枯草芽孢杆菌质粒载体PEB03的Sal I和BamH I位点间构建重组表达载体。

2.将上述芽孢衣壳蛋白基因CotC与步骤1的重组载体相连接，得到新的重组表达载体。

3.将步骤2得到的重组表达载体转化枯草芽孢杆菌，获得含有该重组表达载体的菌株，接种培养，诱导表达后离心裂解。

本发明还提出上述核酸分子或上述融合蛋白或上述载体或上述菌株在制备草鱼出血病药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述药物为疫苗。

在本发明的一些优选实施方式中，所述疫苗为口服疫苗。

本发明还提出一种用于治疗草鱼出血病的疫苗，所述疫苗包括上述核酸分子或上述融合蛋白或上述载体或上述菌株。

本发明的有益效果是：

本发明通过融合PCR的方式将能够引起草鱼产生不同方式免疫应答反应的两种蛋白以柔性linker连接，并通过酶切连接的方式和枯草芽孢杆菌Cot C蛋白、pEB03载体连接，构建能够在枯草芽孢杆菌芽孢体中融合表达GCRV VP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌。以该重组芽孢杆菌口服免疫草鱼能够刺激鱼体同时产生具有中和活性的黏膜抗体和血清抗体，中和效价测定结果表明草鱼的血清抗体中和效价为1:40，抗体效价水平显著高于单独免疫VP4蛋白。

细胞因子检测结果表明，口服免疫GCRV VP4-NS38融合蛋白既能够引起草鱼产生体液免疫反应，也能够引起草鱼产生细胞免疫反应；同时还能够减少草鱼在病毒感染过程中的炎症反应；但是融合蛋白不能够促进草鱼CD4L和CD8分化。口服免疫融合表达GCRVVP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌具有很好的安全性，对草鱼的生长不产生显著影响，也不会对草鱼肠绒毛、肝、脾、肾等组织器官造成病理损害。可以应用在草鱼出血病口服疫苗的研究中。

附图说明

图1为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4和NS38基因PCR鉴定。

图2为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38蛋白融合表达western-blot分析图；其中M为Marker，1为GCRV VP4-Cot C/W600的表达产物分析、2为GCRV NS38-Cot C/W600的表达产物分析、3为GCRV VP4-NS38-Cot C/W600的表达产物分析、4为Cot C/W600(对照组)。

图3为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后血清抗体中和效价分析结果。

图4为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后免疫后草鱼黏膜和中枢免疫器官IL-4/13A表达水平检测。

图5为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后免疫后草鱼黏膜和中枢免疫器官IFN-γ表达水平检测。

图6为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后免疫后草鱼黏膜和中枢免疫器官IL-6表达水平检测。

图7为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后免疫后草鱼黏膜和中枢免疫器官IL-1β表达水平检测。

图8为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后免疫后草鱼黏膜和中枢免疫器官CD4L表达水平检测。

图9为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后免疫后草鱼黏膜和中枢免疫器官CD8表达水平检测。

图10为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后对草鱼体重影响。

图11为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后对草鱼肠绒毛的病理分析结果；其中A组为B.s-Cot-VP4芽孢组；B组为B.s-Cot-NS38芽孢组；C组为B.s-Cot-VP4-NS38芽孢组；D组为B.s-CotC空芽孢组。

图12为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后对草鱼脾脏的病理分析结果；其中A组为B.s-Cot-VP4芽孢组；B组为B.s-Cot-NS38芽孢组；C组为B.s-Cot-VP4-NS38芽孢组；D组为B.s-CotC空芽孢组。

图13为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后对草鱼肝脏的病理分析结果；其中A组为B.s-Cot-VP4芽孢组；B组为B.s-Cot-NS38芽孢组；C组为B.s-Cot-VP4-NS38芽孢组；D组为B.s-CotC空芽孢组。

图14为重组枯草芽孢杆菌GCRV VP4-NS38-Cot C/W600口服免疫草鱼后对草鱼肾脏的病理分析结果；其中A组为B.s-Cot-VP4芽孢组；B组为B.s-Cot-NS38芽孢组；C组为B.s-Cot-VP4-NS38芽孢组；D组为B.s-CotC空芽孢组。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实验动物：草鱼，体长15～20cm，购于广州市花都区某鱼种繁育场。

材料和试剂：基因II型草鱼呼肠孤病毒、枯草芽孢杆菌w600株由珠江水产研究所水产病害与免疫研究室分离保存；LB培养基、DSM芽孢培养基购于北京陆桥技术有限责任公司；异丙醇、Tris-HCl、EDTA、SDS、山梨醇、甘露醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁、氯化锰、氯化钙均购自广州化学试剂厂；壮观霉素、苯甲基磺酰氟、溶菌酶、限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

实施例1设计融合蛋白的基因序列

本实施例制备一种融合蛋白，含有基因II型草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白、NS38蛋白。所述编码基因II型草鱼呼肠孤病毒VP4蛋白的核苷酸序列对应于如SEQ ID NO.1所示，具体为：

TTTGGCAATATTCGCAACATTACCGACTTCTCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAGCGCGGCAGGCAATTACTATCTATGGCCGACCGTAATCGGTGATGCATCAATGACATCAGATTGGGGGACAATTAGCACATCCCTAGCTAATGGCAGACTCCGTGTCGCACCTCTGGACCTGACTCATGCACTCCACAAAGGCAATGTCGTGGAGCCGATCGTACCATCTGATGTGCTAGGTAATGCCTCACCAGAGGAAATGCGTTCCGCGTTGCCAGCAGATGTGCTGACAGCTTTCAAAGCCAAGCTCACAACAGTGGCTTCCGTAGTCGGCCGTGCCTTAAATCCCAACGACAGTGCGCATGCACCATCATCCGGCACCGTCCTCGGCCCGCTTGCAATCGAAAACAAGGCCCAATCAAAACCTAAACCCGTATCAGATCTGTGGATAGCCGCTYGTCGTGGTGTGAATCTATTCGTAGCCTCTCCAAGCGCGAGTCTGCAAACAGGTGTGCCGGTCATGGGGGACAGCAGCGTGTTGACAAGCTTGACGGGTGGTGCAACTACCGCGTTGAATACTGGTGACATGGGTACCCCAAGCTTGGAGGCCACAGCGAAACGGGCAGCTAGAGTTGCTGGAGGACTGCTACGACAGAGAGTCATGGACAAACTAACTCGATACTGGCCCCTCCGTC(SEQ ID NO.1)。

所述编码基因II型草鱼呼肠孤病毒NS38蛋白的核苷酸序列对应于如SEQ ID NO.2所示，具体为：

ATGGCGGGTGTGTCTCTCAACATCAATCGCAACATCTCAAACTCGGCATCAACGATCTTTCTCGAAGATATTCCATTACTGTCATGTTCAGTGCGGTGTGAACCCGGTAAAGGACGCGAATTACCAAAATTTAACATGAGCTGCCCTGCTATTAACGCGATGGGTCGATGTCTTAATCCAATGAAGTTCATTGCTGAGCACTGGGTCCCCAACAGTCCAAGTCGTAAACCATCCAGACAGCATTGGCGTAATGTTTTGAATGGACTGGAATTCAGTAATGGTCGTGGATTCGATGTGCTGAGTTTCTCACCAGCGGGCATGGCTGTTCTTCGTGACATCCTGACAGAAGATAGCGTGAACTATTGCTTTGACGAGGGTAACACTTGCAGTTTGTTCACCTTGCTGCACACTTTGTGCTGCGATGCCGCAGGCGTAGAACCGATGGACTTGGATTCACGTCAGACGGACGCCAGTGCCCGGATGGTGAGCTACCAAGATCGCGCTATCGTGCTGACCTCTAATGAGGCAGGAGATAGAATTGAGCCGTGGAATGTTGAGCTCGACAAGGAGTTTGGAAATCCAGATCTGCTCAGCCGTCTGAACATCTCATATGGCGTGCAACGATATGGCGACTCCAAAGCCAGCACAGACACTCTGACCTTGGCTGATGCCCCAGAGAGGTCCAAGCCTGCTCTGATTACTGTGCAACCCTTGTTGGTGGCTATGTGCATCAAACAGTCTTTGGACGGCTTGCTGGCTTTATCTGATTTGCGCCTGAGATTCGATCAGTATCCTGGATACGCAAATGCTCTCATGAATGCTATGGCCATGTACGCTTGCCTAGATCGTGACTTGATGCGTTTTCTGCTCCGCTTAGAAATGACTCACGCGAGCACGGTGTCTGAAGTGGCTGAGTGCTGGAGGAACTCTCGCAACTCTCGCGATGCGACAGGTTGTCATATTGTCCCACGTCAAGGTTTGCTCATCATCGTTTCCGGAGATGTCGAGGTAAGACGTATATTGCGCAGATGCTGTAGA(SEQ ID NO.2)。

以P3和P4为引物通过PCR方法将柔性linker加入到基因II型草鱼呼肠孤病毒NS38基因的5’端，引物序列如表1所示。

融合PCR方法以柔性linker将基因II型草鱼呼肠孤病毒VP4基因和NS38基因连接，优选的柔性linker的核苷酸序列对应于如SEQ ID NO.3所示，具体为：GGCGGCGGCGGCTCGGGCGGCGGCGGCTCGGGCGGCGGCGGCTCG(SEQ ID NO.3)。同时在VP4-NS38基因片段两端引入Bam HI和Sac I酶切位点。

表1引物序列表

P1	GGATCCTTTGGCAATATTCGCAACATTACCG(SEQ ID NO.9)
		P2	GCCGCCGCCCGAGCCGCCGCCCGAGCCGCCGCCGACGGAGGGGCCAGTAT(SEQ ID NO.10)
P3	GGCGGCGGCTCGGGCGGCGGCTCGGGCGGCGGCTCGATGGCGGGTGTGT(SEQ ID NO.11)
		P4	GAGCTCTCTACAGCATCTGCGCAATATACGT(SEQ ID NO.12)
P5	GTCGACTGTAGGATAAATCGTT(SEQ ID NO.13)
		P6	GGATCCGTAGTGTTTTTTATGC(SEQ ID NO.14)

最后得到的表达GCRV VP4-NS38融合蛋白的编码核苷酸序列为：

GGATCCTTTGGCAATATTCGCAACATTACCGACTTCTCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAGCGCGGCAGGCAATTACTATCTATGGCCGACCGTAATCGGTGATGCATCAATGACATCAGATTGGGGGACAATTAGCACATCCCTAGCTAATGGCAGACTCCGTGTCGCACCTCTGGACCTGACTCATGCACTCCACAAAGGCAATGTCGTGGAGCCGATCGTACCATCTGATGTGCTAGGTAATGCCTCACCAGAGGAAATGCGTTCCGCGTTGCCAGCAGATGTGCTGACAGCTTTCAAAGCCAAGCTCACAACAGTGGCTTCCGTAGTCGGCCGTGCCTTAAATCCCAACGACAGTGCGCATGCACCATCATCCGGCACCGTCCTCGGCCCGCTTGCAATCGAAAACAAGGCCCAATCAAAACCTAAACCCGTATCAGATCTGTGGATAGCCGCTYGTCGTGGTGTGAATCTATTCGTAGCCTCTCCAAGCGCGAGTCTGCAAACAGGTGTGCCGGTCATGGGGGACAGCAGCGTGTTGACAAGCTTGACGGGTGGTGCAACTACCGCGTTGAATACTGGTGACATGGGTACCCCAAGCTTGGAGGCCACAGCGAAACGGGCAGCTAGAGTTGCTGGAGGACTGCTACGACAGAGAGTCATGGACAAACTAACTCGATACTGGCCCCTCCGTCGGCGGCGGCTCGGGCGGCGGCTCGGGCGGCGGCATGGCGGGTGTGTCTCTCAACATCAATCGCAACATCTCAAACTCGGCATCAACGATCTTTCTCGAAGATATTCCATTACTGTCATGTTCAGTGCGGTGTGAACCCGGTAAAGGACGCGAATTACCAAAATTTAACATGAGCTGCCCTGCTATTAACGCGATGGGTCGATGTCTTAATCCAATGAAGTTCATTGCTGAGCACTGGGTCCCCAACAGTCCAAGTCGTAAACCATCCAGACAGCATTGGCGTAATGTTTTGAATGGACTGGAATTCAGTAATGGTCGTGGATTCGATGTGCTGAGTTTCTCACCAGCGGGCATGGCTGTTCTTCGTGACATCCTGACAGAAGATAGCGTGAACTATTGCTTTGACGAGGGTAACACTTGCAGTTTGTTCACCTTGCTGCACACTTTGTGCTGCGATGCCGCAGGCGTAGAACCGATGGACTTGGATTCACGTCAGACGGACGCCAGTGCCCGGATGGTGAGCTACCAAGATCGCGCTATCGTGCTGACCTCTAATGAGGCAGGAGATAGAATTGAGCCGTGGAATGTTGAGCTCGACAAGGAGTTTGGAAATCCAGATCTGCTCAGCCGTCTGAACATCTCATATGGCGTGCAACGATATGGCGACTCCAAAGCCAGCACAGACACTCTGACCTTGGCTGATGCCCCAGAGAGGTCCAAGCCTGCTCTGATTACTGTGCAACCCTTGTTGGTGGCTATGTGCATCAAACAGTCTTTGGACGGCTTGCTGGCTTTATCTGATTTGCGCCTGAGATTCGATCAGTATCCTGGATACGCAAATGCTCTCATGAATGCTATGGCCATGTACGCTTGCCTAGATCGTGACTTGATGCGTTTTCTGCTCCGCTTAGAAATGACTCACGCGAGCACGGTGTCTGAAGTGGCTGAGTGCTGGAGGAACTCTCGCAACTCTCGCGATGCGACAGGTTGTCATATTGTCCCACGTCAAGGTTTGCTCATCATCGTTTCCGGAGATGTCGAGGTAAGACGTATATTGCGCAGATGCTGTAGAGAGCTC(SEQ ID NO.4)。

实施例2表达重组载体PEB03-CotC-GCRV VP4-NS38的构建

本实施例制备一种表达载体。将GCRV VP4-NS38基因片段连接至枯草芽孢杆菌质粒载体PEB03上获得重组载体PEB03-GCRV VP4-NS38，提取枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA，将CotC目的片段以引物P5，P6从枯草芽孢杆菌基因组DNA中PCR扩增后，同时引入限制性酶切位点：Sal I和Bam H I，将扩增片段与重组载体PEB03-GCRV VP4-NS38连接，构建融合表达CotC蛋白和GCRV VP4-NS38蛋白的PEB03-CotC-GCRV VP4-NS38重组载体。

所述GCRV VP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：

FGNIRNITDFSMSAIWEPETVSAAGNYYLWPTVIGDASMTSDWGTISTSLANGRLRVAPLDLTHALHKGNVVEPIVPSDVLGNASPEEMRSALPADVLTAFKAKLTTVASVVGRALNPNDSAHAPSSGTVLGPLAIENKAQSKPKPVSDLWIAA*RGVNLFVASPSASLQTGVPVMGDSSVLTSLTGGATTALNTGDMGTPSLEATAKRAARVAGGLLRQRVMDKLTRYWPLR(SEQ ID NO.5)。

所述GCRV NS38蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：

MAGVSLNINRNISNSASTIFLEDIPLLSCSVRCEPGKGRELPKFNMSCPAINAMGRCLNPMKFIAEHWVPNSPSRKPSRQHWRNVLNGLEFSNGRGFDVLSFSPAGMAVLRDILTEDSVNYCFDEGNTCSLFTLLHTLCCDAAGVEPMDLDSRQTDASARMVSYQDRAIVLTSNEAGDRIEPWNVELDKEFGNPDLLSRLNISYGVQRYGDSKASTDTLTLADAPERSKPALITVQPLLVAMCIKQSLDGLLALSDLRLRFDQYPGYANALMNAMAMYACLDRDLMRFLLRLEMTHASTVSEVAECWRNSRNSRDATGCHIVPRQGLLIIVSGDVEVRRILRRCCR(SEQ ID NO.6)。

所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：

FGNIRNITDFSMSAIWEPETVSAAGNYYLWPTVIGDASMTSDWGTISTSLANGRLRVAPLDLTHALHKGNVVEPIVPSDVLGNASPEEMRSALPADVLTAFKAKLTTVASVVGRALNPNDSAHAPSSGTVLGPLAIENKAQSKPKPVSDLWIAA*RGVNLFVASPSASLQTGVPVMGDSSVLTSLTGGATTALNTGDMGTPSLEATAKRAARVAGGLLRQRVMDKLTRYWPLRGGGSGGGSGGGSMAGVSLNINRNISNSASTIFLEDIPLLSCSVRCEPGKGRELPKFNMSCPAINAMGRCLNPMKFIAEHWVPNSPSRKPSRQHWRNVLNGLEFSNGRGFDVLSFSPAGMAVLRDILTEDSVNYCFDEGNTCSLFTLLHTLCCDAAGVEPMDLDSRQTDASARMVSYQDRAIVLTSNEAGDRIEPWNVELDKEFGNPDLLSRLNISYGVQRYGDSKASTDTLTLADAPERSKPALITVQPLLVAMCIKQSLDGLLALSDLRLRFDQYPGYANALMNAMAMYACLDRDLMRFLLRLEMTHASTVSEVAECWRNSRNSRDATGCHIVPRQGLLIIVSGDVEVRRILRRCCR(SEQ IDNO.7)。

所述CotC目的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

TGTAGGATAAATCGTTTGGGCCGATGAAAAATCGGCTCTTTATTTGATTTGTTTTGTGTCATCTGTCTTTTTCTATCATTTGGACAGCCCTTTTTTCCTTCTATGATTTTAACTGTCCAAGCCGCAAAATCTACTCGCCGTATAATAAAGCGTAGTAAAAATAAAGGAGGAGTATATATGGGTTATTACAAAAAATACAAAGAAGAGTATTATACGGTCAAAAAAACGTATTATAAGAAGTATTACGAATATGATAAAAAAGATTATGACTGTGATTACGACAAAAAGTATGATGACTATGATAAAAAATATTATGATCACGATAAAAAAGACTATGATTATGTTGTAGAGTATAAAAAGCATAAAAAACACTAC(SEQ ID NO.8)。

基因工程技术在大肠杆菌复制菌株DH5α中操作，将CotC基因片段和PEB03质粒以Sal I和Bam H I进行双酶切，胶回收酶切产物以T4连接酶在16℃条件下连接CotC基因片段和PEB03载体，将连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中，获得重组大肠杆菌PEB03-CotC/DH5α。分别以实验室保存的pMD18T-NS38为模板，以P3，P4引物对，通过PCR将柔性Linker加入NS38基因片段5’端获得L-NS38片段，以pMD18T-VP4和L-NS38作为模板，以P1、P2、P3作为引物，通过融合PCR获得VP4-NS38片段。将VP4-NS38基因片段和PEB03-CotC以BamH I和Sac I进行双酶切，胶回收酶切产物以T4连接酶在16℃条件下连接VP4-NS38片段和PEB03-CotC载体，将连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中，获得重组大肠杆菌PEB03-CotC-VP4-NS38/DH5α。提重组质粒PEB03-CotC-VP4-NS38，重组质粒测序鉴定无误后常规保存用于电转化枯草芽孢杆菌构建融合表达GCRV VP4蛋白和NS38蛋白的重组枯草芽孢杆菌。

实施例3重组表达载体PEB03-CotC-VP4-NS38的转化

本实施例将构建的重组质粒PEB03-CotC-VP4-NS38电转化至枯草芽孢杆菌WB600，具体步骤如下：

1)接菌WB600于3ml LB培养基中，37℃，250rpm，培养过夜；

2)将2.6ml菌液转入40ml电转化A培养基中，37℃，250rpm，摇至OD值0.8～0.9；

3)菌液冰水浴10min；5000g，4℃离心5min；

4)用50ml预冷的电转化B培养基吹悬菌体；5000g，4℃离心5min；重复此步骤4次；

5)将菌体吹悬于1ml电转化B培养基，分装10管，每个EP管分装100μl；

6)将100μl WB600感受态细胞中加入5μl(约1μg)重组质粒PEB03-CotC-VP4，冰上静置2min；

7)将100μl WB600感受态细胞吸入到预冷的电击杯中(1mm)，调整电转化仪参数：2.0kV，1mm，25μF，200Ω，4.5-5.0ms，电击一次；

8)电击结束后吸出电击杯中感受态细胞转移至新的EP管中，立即加入1ml电转化C培养基，37℃，150rpm，复苏3h，涂LB平板(壮观霉素抗性)，37℃温箱中培养20h；

9)挑取单克隆至LB培养基中(含壮观霉素)，37℃，250rpm，培养过夜；

10)菌液提取质粒，并对S6基因片段和S10基因片段进行PCR鉴定，其中S6基因片段编码蛋白是VP4，S10基因片段编码蛋白是NS38。

PCR鉴定结果如图1所示，说明重组表达载体PEB03-CotC-VP4-NS38成功电转化到芽孢杆菌W600中。

实施例4重组芽孢杆菌GCRV VP4-NS38蛋白表达鉴定

本实施例对实施例3中的重组芽孢杆菌GCRV VP4-NS38蛋白表达鉴定。

分别挑取单克隆菌落GCRV VP4-Cot C/W600、GCRV NS38-Cot C/W600以及GCRVVP4-NS38-Cot C/W600以及Cot C/W600(对照组)于含有壮观霉素的LB培养基中37℃摇床培养过夜后，转入DSM芽孢培养基中，37℃，250rpm诱导培养24h，离心芽孢培养基制备芽孢，将芽孢悬于破壳缓冲液，冰上超声5min，12000g离心10min，分离上清蛋白和衣壳蛋白行Western blotting，在蛋白凝胶上的目的蛋白电转移至PVDF膜上，然后分别将PVDF膜与大鼠抗VP4和NS38混合血清及羊抗大鼠IgG孵育，鉴定融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达。Western-Blot鉴定结果如图2所示，结果表明GCRV VP4-NS38蛋白在重组芽孢杆菌中成功表达。

实施例5融合表达GCRV VP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌口服疫苗的制备

将活化的重组芽孢杆菌pEB03-Cot C-VP4-NS38/WB600菌液按1:100转入500mlDSM芽孢培养基(不含抗生素)，37℃，250rpm，培养24h。8000r/min离心15min收集菌体，以4mg/m1溶菌酶作用30min。用1MNa Cl洗涤芽孢，同时加入PMSF至终溶度1mM，充分混匀。8000r/min离心15min，弃上清留取沉淀，再用1MKCl洗涤芽孢同时加入PMSF至终溶度1mM，充分混匀。去离子水洗涤芽孢三次，8000r/min离心15min，弃上清留取沉淀。40ml去离子水吹悬芽孢沉淀，68℃水浴静置1h以杀灭残留的枯草杆菌繁殖体。取3μL芽孢用去离子稀释，显微镜下用细胞计数池计数，其余芽孢于-20℃保存备用。

实施例6 GCRV VP4-NS38融合蛋白动物免疫实验

对实施例5制备的融合表达GCRV VP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌口服疫苗进行免疫草鱼保护评价。

1.分组：将120尾草鱼随机分成四组每组30尾，分别设为B.s-CotC-VP4芽孢组、B.s-CotC-NS38芽孢组、B.s-CotC-VP4-NS38芽孢组和B.s-CotC空芽孢对照组。分别用1.0×10¹⁰个含有B.s-CotC-VP4芽孢，1.0×10¹⁰个含有B.s-CotC-NS38芽孢，1.0×10¹⁰个含有B.s-CotC-VP4-NS38芽孢及1.0×10¹⁰个含有B.s-CotC空芽孢经口灌胃各组草鱼，连续免疫2周，在整个实验过程中，为保证水质，隔天更换30％的除氯水，并及时处理鱼缸中的粪便等杂质，给予充足的氧气，并保持水温在一个舒适的范围(25℃～28℃)。

2.样品的采集和处理：口服免疫第0d、14d、21d、28d，分别随机从每组草鱼中取3条鱼，收集其血清、肝脏、脾脏、肾脏及肠道等组织。注射器尾静脉采血，4℃静置过夜，次日于4℃，3000rpm离心10min，分离血清，-80℃冻存备用。同时使用无菌剪刀和镊子小心摘取肝脏、脾脏、肾脏和肠道，置于样品保护液中保存备提取RNA用。以上所有处理过的组织样品均贮放在-80℃备用。

3.对实施例5制备的融合表达GCRV VP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌口服疫苗免疫后草鱼血清抗体效价及血清中和活性分析：采用固定病毒稀释抗体法检测经过口服免疫重组芽孢杆菌后草鱼的血清抗体的中和活性每孔病毒含量为200TCID50，血清做2倍比连续稀释，并将稀释的抗体与病毒混合，37℃条件下孵育1h，并将混合抗体的病毒接种在GSB细胞，每个稀释度进行4次重复。采用RT-qPCR的方法检测各组病毒含量。结果如图3所示，说明口服免疫重组芽孢杆菌能够刺激鱼体产生具有中和活性的特异性抗体，抗体中和效价约为1:40。

(2)对实施例5制备的融合表达GCRV VP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌口服疫苗对草鱼的免疫调节作用评价。

众所周知，用抗原免疫机体会刺激其某些免疫相关基因的表达，为了探究口服免疫重组芽孢后草鱼机体产生的免疫反应及相关免疫机制，用qRT-PCR检测了连续口服免疫后草鱼的肝脏脾脏肾脏后肠中，草鱼免疫调节关键基因的表达水平。因此，取收集的肝脏、脾脏、肾脏、肠道组织使用TRIzol法提取总RNA并定量。主要包括以下步骤：

将1μg总RNA逆转录为cDNA，1:4用DEPC水稀释后行real-time PCR检测中枢免疫器官的IL-1β、IL-6、IL-4/13A、IFN-γ、CD4L、CD8等细胞因子的表达水平，评价重组芽孢杆菌对草鱼炎症反应、细胞免疫、体液免疫和淋巴细胞分化的调节。其中IL-4/13A的检测结果见图4，IFN-γ的检测结果见图5，IL-6的检测结果见图6，IL-1β的检测结果见图7，CD4L的检测结果见图8，CD8的检测结果见图9。

结果表明口服免疫GCRV VP4-NS38融合蛋白能够既能够刺激草鱼产生体液免疫应答，也能够刺激草鱼产生细胞免疫应答，与单独免疫VP4蛋白或NS38蛋白，相关细胞因子水平都显著提高。口服免疫GCRV VP4-NS38融合蛋白能够显著降低炎症反应，与单独免疫VP4蛋白相比较，在草鱼GCRV感染过程中可以极显著降低鱼体应激反应。

(3)于免疫前、免疫2w后对各组草鱼进行称重，结果如图10所示，结果显示各组草鱼体重无明显变化。

(4)融合表达GCRV VP4-NS38蛋白的重组芽孢杆菌口服疫苗毒理分析：将重组杆菌芽孢免疫后草鱼肠道的组织学分析口服免疫2w后，将草鱼处死后取出肠组织和相同部位的肝脏、脾脏、肾脏组织，浸泡于4％多聚甲醛固定后进行HE染色。其中图11为肠组织染色情况，图12为肝脏组织染色情况，图13为脾脏组织染色情况，图14为肾脏组织染色情况。

从结果可以看出各组肠组织没有观察到明显的炎症细胞浸润和损伤情况，且肠绒毛完整，绒毛密度和绒毛长度与对照组相比较无明显差异。草鱼肝脏组织切片HE染色观察结果表明与阴性对照相比较口服免疫重组芽孢杆菌草鱼肝脏、脾脏、肾脏等实质脏器均未产生显著的炎症细胞浸润和损伤情况，且没有产生病理变化。表明口服试验剂量的重组芽孢对草鱼的肠道无不良影响，说明重组芽孢的安全性较好。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> II型草鱼呼肠孤病毒VP4-NS38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttggcaata ttcgcaacat taccgacttc tcaatgtctg caatttggga accagagaca 60

gtcagcgcgg caggcaatta ctatctatgg ccgaccgtaa tcggtgatgc atcaatgaca 120

tcagattggg ggacaattag cacatcccta gctaatggca gactccgtgt cgcacctctg 180

gacctgactc atgcactcca caaaggcaat gtcgtggagc cgatcgtacc atctgatgtg 240

ctaggtaatg cctcaccaga ggaaatgcgt tccgcgttgc cagcagatgt gctgacagct 300

ttcaaagcca agctcacaac agtggcttcc gtagtcggcc gtgccttaaa tcccaacgac 360

agtgcgcatg caccatcatc cggcaccgtc ctcggcccgc ttgcaatcga aaacaaggcc 420

caatcaaaac ctaaacccgt atcagatctg tggatagccg ctygtcgtgg tgtgaatcta 480

ttcgtagcct ctccaagcgc gagtctgcaa acaggtgtgc cggtcatggg ggacagcagc 540

gtgttgacaa gcttgacggg tggtgcaact accgcgttga atactggtga catgggtacc 600

ccaagcttgg aggccacagc gaaacgggca gctagagttg ctggaggact gctacgacag 660

agagtcatgg acaaactaac tcgatactgg cccctccgtc 700

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcgggtg tgtctctcaa catcaatcgc aacatctcaa actcggcatc aacgatcttt 60

ctcgaagata ttccattact gtcatgttca gtgcggtgtg aacccggtaa aggacgcgaa 120

ttaccaaaat ttaacatgag ctgccctgct attaacgcga tgggtcgatg tcttaatcca 180

atgaagttca ttgctgagca ctgggtcccc aacagtccaa gtcgtaaacc atccagacag 240

cattggcgta atgttttgaa tggactggaa ttcagtaatg gtcgtggatt cgatgtgctg 300

agtttctcac cagcgggcat ggctgttctt cgtgacatcc tgacagaaga tagcgtgaac 360

tattgctttg acgagggtaa cacttgcagt ttgttcacct tgctgcacac tttgtgctgc 420

gatgccgcag gcgtagaacc gatggacttg gattcacgtc agacggacgc cagtgcccgg 480

atggtgagct accaagatcg cgctatcgtg ctgacctcta atgaggcagg agatagaatt 540

gagccgtgga atgttgagct cgacaaggag tttggaaatc cagatctgct cagccgtctg 600

aacatctcat atggcgtgca acgatatggc gactccaaag ccagcacaga cactctgacc 660

ttggctgatg ccccagagag gtccaagcct gctctgatta ctgtgcaacc cttgttggtg 720

gctatgtgca tcaaacagtc tttggacggc ttgctggctt tatctgattt gcgcctgaga 780

ttcgatcagt atcctggata cgcaaatgct ctcatgaatg ctatggccat gtacgcttgc 840

ctagatcgtg acttgatgcg ttttctgctc cgcttagaaa tgactcacgc gagcacggtg 900

tctgaagtgg ctgagtgctg gaggaactct cgcaactctc gcgatgcgac aggttgtcat 960

attgtcccac gtcaaggttt gctcatcatc gtttccggag atgtcgaggt aagacgtata 1020

ttgcgcagat gctgtaga 1038

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcggcggcg gctcgggcgg cggcggctcg ggcggcggcg gctcg 45

<210> 4

<211> 1783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatcctttg gcaatattcg caacattacc gacttctcaa tgtctgcaat ttgggaacca 60

gagacagtca gcgcggcagg caattactat ctatggccga ccgtaatcgg tgatgcatca 120

atgacatcag attgggggac aattagcaca tccctagcta atggcagact ccgtgtcgca 180

cctctggacc tgactcatgc actccacaaa ggcaatgtcg tggagccgat cgtaccatct 240

gatgtgctag gtaatgcctc accagaggaa atgcgttccg cgttgccagc agatgtgctg 300

acagctttca aagccaagct cacaacagtg gcttccgtag tcggccgtgc cttaaatccc 360

aacgacagtg cgcatgcacc atcatccggc accgtcctcg gcccgcttgc aatcgaaaac 420

aaggcccaat caaaacctaa acccgtatca gatctgtgga tagccgctyg tcgtggtgtg 480

aatctattcg tagcctctcc aagcgcgagt ctgcaaacag gtgtgccggt catgggggac 540

agcagcgtgt tgacaagctt gacgggtggt gcaactaccg cgttgaatac tggtgacatg 600

ggtaccccaa gcttggaggc cacagcgaaa cgggcagcta gagttgctgg aggactgcta 660

cgacagagag tcatggacaa actaactcga tactggcccc tccgtcggcg gcggctcggg 720

cggcggctcg ggcggcggca tggcgggtgt gtctctcaac atcaatcgca acatctcaaa 780

ctcggcatca acgatctttc tcgaagatat tccattactg tcatgttcag tgcggtgtga 840

acccggtaaa ggacgcgaat taccaaaatt taacatgagc tgccctgcta ttaacgcgat 900

gggtcgatgt cttaatccaa tgaagttcat tgctgagcac tgggtcccca acagtccaag 960

tcgtaaacca tccagacagc attggcgtaa tgttttgaat ggactggaat tcagtaatgg 1020

tcgtggattc gatgtgctga gtttctcacc agcgggcatg gctgttcttc gtgacatcct 1080

gacagaagat agcgtgaact attgctttga cgagggtaac acttgcagtt tgttcacctt 1140

gctgcacact ttgtgctgcg atgccgcagg cgtagaaccg atggacttgg attcacgtca 1200

gacggacgcc agtgcccgga tggtgagcta ccaagatcgc gctatcgtgc tgacctctaa 1260

tgaggcagga gatagaattg agccgtggaa tgttgagctc gacaaggagt ttggaaatcc 1320

agatctgctc agccgtctga acatctcata tggcgtgcaa cgatatggcg actccaaagc 1380

cagcacagac actctgacct tggctgatgc cccagagagg tccaagcctg ctctgattac 1440

tgtgcaaccc ttgttggtgg ctatgtgcat caaacagtct ttggacggct tgctggcttt 1500

atctgatttg cgcctgagat tcgatcagta tcctggatac gcaaatgctc tcatgaatgc 1560

tatggccatg tacgcttgcc tagatcgtga cttgatgcgt tttctgctcc gcttagaaat 1620

gactcacgcg agcacggtgt ctgaagtggc tgagtgctgg aggaactctc gcaactctcg 1680

cgatgcgaca ggttgtcata ttgtcccacg tcaaggtttg ctcatcatcg tttccggaga 1740

tgtcgaggta agacgtatat tgcgcagatg ctgtagagag ctc 1783

<210> 5

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Phe Gly Asn Ile Arg Asn Ile Thr Asp Phe Ser Met Ser Ala Ile Trp

1 5 10 15

Glu Pro Glu Thr Val Ser Ala Ala Gly Asn Tyr Tyr Leu Trp Pro Thr

20 25 30

Val Ile Gly Asp Ala Ser Met Thr Ser Asp Trp Gly Thr Ile Ser Thr

35 40 45

Ser Leu Ala Asn Gly Arg Leu Arg Val Ala Pro Leu Asp Leu Thr His

50 55 60

Ala Leu His Lys Gly Asn Val Val Glu Pro Ile Val Pro Ser Asp Val

65 70 75 80

Leu Gly Asn Ala Ser Pro Glu Glu Met Arg Ser Ala Leu Pro Ala Asp

85 90 95

Val Leu Thr Ala Phe Lys Ala Lys Leu Thr Thr Val Ala Ser Val Val

100 105 110

Gly Arg Ala Leu Asn Pro Asn Asp Ser Ala His Ala Pro Ser Ser Gly

115 120 125

Thr Val Leu Gly Pro Leu Ala Ile Glu Asn Lys Ala Gln Ser Lys Pro

130 135 140

Lys Pro Val Ser Asp Leu Trp Ile Ala Ala Arg Gly Val Asn Leu Phe

145 150 155 160

Val Ala Ser Pro Ser Ala Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Val Met Gly

165 170 175

Asp Ser Ser Val Leu Thr Ser Leu Thr Gly Gly Ala Thr Thr Ala Leu

180 185 190

Asn Thr Gly Asp Met Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Thr Ala Lys Arg

195 200 205

Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly Leu Leu Arg Gln Arg Val Met Asp Lys

210 215 220

Leu Thr Arg Tyr Trp Pro Leu Arg

225 230

<210> 6

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Ala Gly Val Ser Leu Asn Ile Asn Arg Asn Ile Ser Asn Ser Ala

1 5 10 15

Ser Thr Ile Phe Leu Glu Asp Ile Pro Leu Leu Ser Cys Ser Val Arg

20 25 30

Cys Glu Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Pro Lys Phe Asn Met Ser Cys

35 40 45

Pro Ala Ile Asn Ala Met Gly Arg Cys Leu Asn Pro Met Lys Phe Ile

50 55 60

Ala Glu His Trp Val Pro Asn Ser Pro Ser Arg Lys Pro Ser Arg Gln

65 70 75 80

His Trp Arg Asn Val Leu Asn Gly Leu Glu Phe Ser Asn Gly Arg Gly

85 90 95

Phe Asp Val Leu Ser Phe Ser Pro Ala Gly Met Ala Val Leu Arg Asp

100 105 110

Ile Leu Thr Glu Asp Ser Val Asn Tyr Cys Phe Asp Glu Gly Asn Thr

115 120 125

Cys Ser Leu Phe Thr Leu Leu His Thr Leu Cys Cys Asp Ala Ala Gly

130 135 140

Val Glu Pro Met Asp Leu Asp Ser Arg Gln Thr Asp Ala Ser Ala Arg

145 150 155 160

Met Val Ser Tyr Gln Asp Arg Ala Ile Val Leu Thr Ser Asn Glu Ala

165 170 175

Gly Asp Arg Ile Glu Pro Trp Asn Val Glu Leu Asp Lys Glu Phe Gly

180 185 190

Asn Pro Asp Leu Leu Ser Arg Leu Asn Ile Ser Tyr Gly Val Gln Arg

195 200 205

Tyr Gly Asp Ser Lys Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr Leu Ala Asp Ala

210 215 220

Pro Glu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Ile Thr Val Gln Pro Leu Leu Val

225 230 235 240

Ala Met Cys Ile Lys Gln Ser Leu Asp Gly Leu Leu Ala Leu Ser Asp

245 250 255

Leu Arg Leu Arg Phe Asp Gln Tyr Pro Gly Tyr Ala Asn Ala Leu Met

260 265 270

Asn Ala Met Ala Met Tyr Ala Cys Leu Asp Arg Asp Leu Met Arg Phe

275 280 285

Leu Leu Arg Leu Glu Met Thr His Ala Ser Thr Val Ser Glu Val Ala

290 295 300

Glu Cys Trp Arg Asn Ser Arg Asn Ser Arg Asp Ala Thr Gly Cys His

305 310 315 320

Ile Val Pro Arg Gln Gly Leu Leu Ile Ile Val Ser Gly Asp Val Glu

325 330 335

Val Arg Arg Ile Leu Arg Arg Cys Cys Arg

340 345

<210> 7

<211> 590

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Phe Gly Asn Ile Arg Asn Ile Thr Asp Phe Ser Met Ser Ala Ile Trp

1 5 10 15

Glu Pro Glu Thr Val Ser Ala Ala Gly Asn Tyr Tyr Leu Trp Pro Thr

20 25 30

Val Ile Gly Asp Ala Ser Met Thr Ser Asp Trp Gly Thr Ile Ser Thr

35 40 45

Ser Leu Ala Asn Gly Arg Leu Arg Val Ala Pro Leu Asp Leu Thr His

50 55 60

Ala Leu His Lys Gly Asn Val Val Glu Pro Ile Val Pro Ser Asp Val

65 70 75 80

Leu Gly Asn Ala Ser Pro Glu Glu Met Arg Ser Ala Leu Pro Ala Asp

85 90 95

Val Leu Thr Ala Phe Lys Ala Lys Leu Thr Thr Val Ala Ser Val Val

100 105 110

Gly Arg Ala Leu Asn Pro Asn Asp Ser Ala His Ala Pro Ser Ser Gly

115 120 125

Thr Val Leu Gly Pro Leu Ala Ile Glu Asn Lys Ala Gln Ser Lys Pro

130 135 140

Lys Pro Val Ser Asp Leu Trp Ile Ala Ala Arg Gly Val Asn Leu Phe

145 150 155 160

Val Ala Ser Pro Ser Ala Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Val Met Gly

165 170 175

Asp Ser Ser Val Leu Thr Ser Leu Thr Gly Gly Ala Thr Thr Ala Leu

180 185 190

Asn Thr Gly Asp Met Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Thr Ala Lys Arg

195 200 205

Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly Leu Leu Arg Gln Arg Val Met Asp Lys

210 215 220

Leu Thr Arg Tyr Trp Pro Leu Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Met Ala Gly Val Ser Leu Asn Ile Asn Arg Asn Ile

245 250 255

Ser Asn Ser Ala Ser Thr Ile Phe Leu Glu Asp Ile Pro Leu Leu Ser

260 265 270

Cys Ser Val Arg Cys Glu Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Pro Lys Phe

275 280 285

Asn Met Ser Cys Pro Ala Ile Asn Ala Met Gly Arg Cys Leu Asn Pro

290 295 300

Met Lys Phe Ile Ala Glu His Trp Val Pro Asn Ser Pro Ser Arg Lys

305 310 315 320

Pro Ser Arg Gln His Trp Arg Asn Val Leu Asn Gly Leu Glu Phe Ser

325 330 335

Asn Gly Arg Gly Phe Asp Val Leu Ser Phe Ser Pro Ala Gly Met Ala

340 345 350

Val Leu Arg Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ser Val Asn Tyr Cys Phe Asp

355 360 365

Glu Gly Asn Thr Cys Ser Leu Phe Thr Leu Leu His Thr Leu Cys Cys

370 375 380

Asp Ala Ala Gly Val Glu Pro Met Asp Leu Asp Ser Arg Gln Thr Asp

385 390 395 400

Ala Ser Ala Arg Met Val Ser Tyr Gln Asp Arg Ala Ile Val Leu Thr

405 410 415

Ser Asn Glu Ala Gly Asp Arg Ile Glu Pro Trp Asn Val Glu Leu Asp

420 425 430

Lys Glu Phe Gly Asn Pro Asp Leu Leu Ser Arg Leu Asn Ile Ser Tyr

435 440 445

Gly Val Gln Arg Tyr Gly Asp Ser Lys Ala Ser Thr Asp Thr Leu Thr

450 455 460

Leu Ala Asp Ala Pro Glu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Ile Thr Val Gln

465 470 475 480

Pro Leu Leu Val Ala Met Cys Ile Lys Gln Ser Leu Asp Gly Leu Leu

485 490 495

Ala Leu Ser Asp Leu Arg Leu Arg Phe Asp Gln Tyr Pro Gly Tyr Ala

500 505 510

Asn Ala Leu Met Asn Ala Met Ala Met Tyr Ala Cys Leu Asp Arg Asp

515 520 525

Leu Met Arg Phe Leu Leu Arg Leu Glu Met Thr His Ala Ser Thr Val

530 535 540

Ser Glu Val Ala Glu Cys Trp Arg Asn Ser Arg Asn Ser Arg Asp Ala

545 550 555 560

Thr Gly Cys His Ile Val Pro Arg Gln Gly Leu Leu Ile Ile Val Ser

565 570 575

Gly Asp Val Glu Val Arg Arg Ile Leu Arg Arg Cys Cys Arg

580 585 590

<210> 8

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgtaggataa atcgtttggg ccgatgaaaa atcggctctt tatttgattt gttttgtgtc 60

atctgtcttt ttctatcatt tggacagccc ttttttcctt ctatgatttt aactgtccaa 120

gccgcaaaat ctactcgccg tataataaag cgtagtaaaa ataaaggagg agtatatatg 180

ggttattaca aaaaatacaa agaagagtat tatacggtca aaaaaacgta ttataagaag 240

tattacgaat atgataaaaa agattatgac tgtgattacg acaaaaagta tgatgactat 300

gataaaaaat attatgatca cgataaaaaa gactatgatt atgttgtaga gtataaaaag 360

cataaaaaac actac 375

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggatcctttg gcaatattcg caacattacc g 31

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gccgccgccc gagccgccgc ccgagccgcc gccgacggag gggccagtat 50

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggcggcggct cgggcggcgg ctcgggcggc ggctcgatgg cgggtgtgt 49

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagctctcta cagcatctgc gcaatatacg t 31

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgactgta ggataaatcg tt 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggatccgtag tgttttttat gc 22

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌WB600，已于2021年1月18日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021102，分类命名为GCRV VP4-NS38-Cot C/W600，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在制备治疗草鱼出血病的药物中的应用。

3.一种用于治疗草鱼出血病的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1所述枯草芽孢杆菌。