CN101041830A - 一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体 - Google Patents
一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于在枯草芽胞杆菌中高效表达的载体。该表达载体包含SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列、23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α－Amylase转录终止和degQ序列。本发明还进一步涉及用该载体转化的枯草芽胞杆菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽胞杆菌胞外分泌的表达载体，以及用该载体转化的枯草芽胞杆菌。
背景技术
大肠杆菌表达系统是最早应用于基因工程领域表达外源性蛋白，现在虽然仍然广泛应用在该领域，但存在一些越来越明显的缺点和难以解决的问题。比如，表达产物以包涵体形式存在、分泌的内毒素等，给下游纯化增加困难。与大肠杆菌表达系统相比，枯草杆菌表达系统具有以下明显的点：(1)枯草杆菌有完善的分泌特征，可将产物分泌到细胞外，极大地减少了对产物的分离纯化步骤，提高了回收率；(2)枯草杆菌是一种无致病性的安全微生物，长期以来作为工业微生物得到广泛的应用；(3)已经在枯草杆菌表达系统中建立了成熟的工业化生产工艺和流程；(4)诸如IL-1等利用大肠杆菌不能表达的基因，能在枯草杆菌表达并且得到有活性的产物。因此，将枯草杆菌表达系统应用于基因工程领域引起人们很大的兴趣。
虽然在以上多个方面，枯草杆菌表达系统优于大肠杆菌表达系统，但在表达量上却不如大肠杆菌。造成的原因主要是因为枯草杆菌分泌大量蛋白酶，会将表达产物分解；科学技术人员对此研究后，已得到了枯草杆菌的突变株(缺失多种蛋白酶基因的菌株，如WB600、WB700)，该突变株不分泌或分泌少量蛋白酶，因而减少了蛋白酶对表达产物分解的现象。但是由于对枯草杆菌的研究不如大肠杆菌深入，目前仍缺乏像大肠杆菌一样齐全多样的高效表达载体。
发明内容
本发明的目的在于克服枯草杆菌表达系统在表达量上低的缺陷，利用分子生物学的技术手段，致力于转录和外分泌两个环节，人工合成了含枯草芽胞杆菌适用的启动子、增强子、SD序列和信号肽、转录终止序列等元件。构建了一种适用于在枯草芽胞杆菌中高效表达的载体。
为了完成上述目的，本发明首先人工合成了核苷酸片段，其包含的7个元件依次为SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列和23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止、degQ序列。然后，将核苷酸片段拼装后克隆进pBR322质粒(购自天为时代公司)，该载体可作为穿梭质粒载体。
本发明提供的枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体是通过如图1所示的流程构建的。
首先合成58条寡核苷酸引物，如图3和图4所示，其中29条正链(标号为A)和29条负链(标号为B)间均有部分碱基互补，退火可以形成双链的片段1。片段1从5’端到3’端的序列依次包括SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列、信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止和degQ序列。这样设计的原因是由于构建本载体所用的各模块是分散在基因组中，不连续的。所以一次PCR不能达到将所有模块扩增出来。如用多次PCR的方法则增加了错误和突变率。所以采用了多组的引物互相互补，然后退火的方法，该方法简单易行。按照设计，片段1的5’端退火后形成NheI酶切位点，3’端退火后形成BamHI酶切位点。pBR322的3’端经BamHI酶切后形成BamHI酶切位点，5’端用NheI酶切形成NheI酶切位点，正好与片段1相对应。所以片段1可以克隆进pBR322的NheI、BamHI位点。最终得到了本发明构建的载体pFYS.1(如图2所示)。
本发明克隆进pBR322质粒中的7个元件序列如下所示：
(1)SacB启动子
ccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgatattttctgaattgtgattaaaaaggcaactt
tatgcccatgcaacagaaactataaaaaatacagagaatgaaaagaaacagatagattttttagttctttagg
(2)果聚糖蔗糖酶增强子
CCCGTAGTCTGCAAATCCTTTTATGATTTTCTATCAAACAAAAGAGGAA
AATAGACCAGTTGCAATCCAAACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAA
AAGTAAATCGCGCGGGTTTGTTACTGATAAAGCAGGCAAGACCTAAAA
TGTGTAAAGGGCAAAGTGTATACTTTGGCGTCACCCCTTACATATTTTAG
GTCTTTTTTTATTGTGCGTAACTAACTTGCCATCTTCAAACAGGAG
(3)SD序列
GGCTGGAAGAAGCAGACCGCTAACACAGTACATAAAAAAGGAGACAT
GAACGATGAACATCAAAAAGTTTG
(4)23个氨基酸残基组成的完整信号肽
CAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAG
GCGCAACTCAAGCGTTTGCGA
(5)多克隆位点
CTGCAGGTCGACTCTAGAtgatcGTCGACAAGCTTGGATCCCCGGGTACC
GAG
(6)α-Amylase转录终止
CTTTTTCAATTCATCCGTCACAGTCTCAGGATGATTGATCACCCGCGATA
CCGTCATTTTCGACACATTTGCTTTCTTTGCTACATCAGATAACGTTGCC
ATTTCATCCCCGCCTTACCTATGCGATTCAAACTGTCAGCAAGTCCTTCC
TGAGGGCTGAAGGACACTTTGTTAAAATTAATTATAAAATGTAATCAAA
GAAATTTATAAGACGGGCAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAA
TCCGTCCTCTCTGCTCTTCTATCTTTGAACATAAATTGAAACCGACCCGC
CGTTTACGTGAAACTCTCCCCAGCCTTCCGAATTGATGACAACCGGCTC
CGAACGGTTTCCGGTAATGTCATGCCATGTCTCACCGGCGTTTTGCCGG
CCGACATACATTCGCTTTGCCCCACCGGGTCGGTCGACTCTAGGATCCG
AATTCATCGATGATCTGGCACGACAGGTTTTCCCGACTGGAAAGCGGGC
AGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCC
AGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC
GGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAAG
ATCCGGACAGAATCTAAACATA
(7)degQ序列
TCTGCTCAATAACGACTTCCCCCCTCCCATTCCATTTTACTAAATGGGAC
ATTTAAAGGACAGCAGGTTTTTCGTTTTTTAACAATCATATAATACTTTAT
CCATTTATTGTATCGGTAGAACGAAAAAAAAGACTTGTTTCCAAGTCTT
TTTCACGAAATTTTCATTGCATAATTGTATTTATCGAGTTGATCAATGCTT
TTGTTAATGTTTCGTAATGAATCTGTCGTTTCTTTAATATCAAGTTCGAGT
CGGAATAACAATTGTTTTACTTCTTCAAGTTTCTTTTCCATCGTTTCCAC
ACTCCTTTTTTTGAAAGATCCCCATCAGATCTGCCGGTCGCCCTATAGTG
AGTCGTATTAC
附图说明
图1为质粒pFYS.1的构建流程；
图2为质粒pFYS.1的结构图
图3为化学合成29条正向寡核苷酸引物A
图4为化学合成29条反向寡核苷酸引物B
图5完整的片段1(1622bp)的序列组成
图6枯草杆菌和大肠杆菌中表达效果的比较
泳道1为分子量Marker，泳道2为枯草杆菌表达的酶，泳道3为大肠杆菌表达的酶。
具体实施方式
实施例1、29条正向寡核苷酸引物A和29条反向寡核苷酸引物B的合成及片段1的组装
所述的58条寡核苷酸引物的碱基序列如图3和图4所示，使用固相亚磷酞胺法化学合成，然后经PAGE纯化；在所述的58条寡核苷酸引物中，正链(标号为A)和负链(标号为B)间均有部分碱基互补，退火可以形成互补链，利于片段的正确连接；
分别取已纯化好的寡核苷酸引物，用去离子水溶解。58种引物分别取1.72pmol，共100pmol，放在一个管中，在含有1×T4多核苷酸激酶缓冲液，10mmol ATP，5个单位的T4多核苷酸激酶的40μl反应体系中，37℃温育1小时进行5’末端磷酸化，将磷酸化的正、反向引物等摩尔混合，90℃退火，自然冷却至室温，得到片段1。片段1依次包括SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列和23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止、degQ序列，片段1的序列如图5所示。
实施例2、质粒pFYS.1的构建
实施例1的反应中得到的片段1，由于事先设计在退火后，自动分别在5’端和3’端形成了NheI和BamHI位点：
采用引物A1：5’ctagcccatcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgagatattatgata，和引物B1：5’AGTGAACGGCAGGTATATGTGATGGG，退火后在引物A1的5’端形成NheI酶切位点。
采用引物A29：5’CGCCCTATAGTGAGTCGTATTACg和引物B29：5’GATCCGTAATACGACTCACTATAGGGCGACCGGCAGATCTGATGGGGATCTTTCAAA，退火后在引物A1的3’端形成BamHI酶切位点。
先用BamHI酶切pBR322后，然后用NdeI酶切分离出大片段。得到的pBR322酶切大片段10pmol和100pmol上述得到的片段1，在含有1mMATP、10mM DTT、1×T4DNA连接酶缓冲液、10单位T4DNA连接酶的反应体系中，于12℃连接过夜。从而片段1插入到pBR322，构建成质粒pFYS.1。
实施例3利用该质粒pFYS.1表达淀粉酶外源蛋白
我们以前的工作曾克隆了淀粉酶基因(蒋专，2006，北京科技大学硕士学位论文，淀粉酶的基因工程研究)，其基因序列的GeneBank的号码为AE006718.1。淀粉酶基因已经用PstI和HimdIII酶切处理后，被克隆进pFYS.1表达载体的PstI和HimdIII位点中，得到重组质粒。重组质粒纯化后，通过电转化方法转化枯草芽孢杆菌。转化的枯草芽孢杆菌在5ug/ml的硫酸卡那霉素的LB平板筛选阳性转化子。将所得到的重组子直接接种到LB培养基中，培养48h后，离心取上清液进行SDS-PAGE电泳(6％浓缩胶，12％分离胶)，同时取上清测酶活。
作为对照，在大肠杆菌表达系统中，将淀粉酶基因重组进pET-21质粒(购自Invitrogen公司)的NdeI和BamHI位点中，得到重组质粒。重组质粒纯化后，通过电转化方法转化大肠杆菌。在50ug/ml的氨苄青霉素的LB平板筛选阳性转化子。将所得到的重组子直接接种到LB培养基中，培养48h后，离心取上清液进行SDS-PAGE电泳(6％浓缩胶，12％分离胶)，同时取上清测酶活。电泳的结果见图6。从图中可见，在枯草芽孢杆菌的蛋白清晰可见，而大肠杆菌中的蛋白不清楚。酶活测定的结果表明，在枯草芽孢杆菌中的最高产酶水平达到4.5U/ml，在大肠杆菌中的最高产酶水平达到0.22U/ml。枯草芽孢杆菌的表达水平是大肠杆菌产酶水平的20倍。
序列表.txt
SEQUENCE LISTING
<110>北京中天诺亚体育科技有限公司
<120>一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体
<130>FPI06093
<160>59
<170>PatentIn version 3.3
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caaatccttt tatgattttc tatcaaacaa aagaggaaaa tagaccagtt gcaatcc 57
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agccttccga attgatgaca accggctccg aacggtttcc ggtaatgtca tgccatg 57
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ctctaggatc cgaattcatc gatgatctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcg 57
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tatctgctca ataacgactt cccccctccc attccatttt actaaatggg acattta 57
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aaggacagca ggtttttcgt tttttaacaa tcatataata ctttatccat ttattgt 57
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atcggtagaa cgaaaaaaaa gacttgtttc caagtctttt tcacgaaatt ttcattg 57
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tcgtttcttt aatatcaagt tcgagtcgga ataacaattg ttttacttct tcaagtt 57
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tcttttccat cgtttccaca ctcctttttt tgaaagatcc ccatcagatc tgccggt 57
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aaagctcggt acccggggat ccaagcttgt cgacgatcat ctagagtcga cctgcag 57
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gaaaatgacg gtatcgcggg tgatcaatca tcctgagact gtgacggatg aattgaa 57
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gtaaggcggg gatgaaatgg caacgttatc tgatgtagca aagaaagcaa atgtgtc 57
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ttaacaaagt gtccttcagc cctcaggaag gacttgctga cagtttgaat cgcatag 57
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ttttatgatt ttctatcaaa caaaagagga aaatagacca gttgcaatcc aaacgagagt 240
ctaatagaat gaggtcgaaa agtaaatcgc gcgggtttgt tactgataaa gcaggcaaga 300
cctaaaatgt gtaaagggca aagtgtatac tttggcgtca ccccttacat attttaggtc 360
tttttttatt gtgcgtaact aacttgccat cttcaaacag gagggctgga agaagcagac 420
cgctaacaca gtacataaaa aaggagacat gaacgatgaa catcaaaaag tttgcaaaac 480
aagcaacagt attaaccttt actaccgcac tgctggcagg aggcgcaact caagcgtttg 540
cgactgcagg tcgactctag atgatcgtcg acaagcttgg atccccgggt accgagcttt 600
ttcaattcat ccgtcacagt ctcaggatga ttgatcaccc gcgataccgt cattttcgac 660
acatttgctt tctttgctac atcagataac gttgccattt catccccgcc ttacctatgc 720
gattcaaact gtcagcaagt ccttcctgag ggctgaagga cactttgtta aaattaatta 780
taaaatgtaa tcaaagaaat ttataagacg ggcaaaataa aaaaacggat ttccttcagg 840
aaatccgtcc tctctgctct tctatctttg aacataaatt gaaaccgacc cgccgtttac 900
gtgaaactct ccccagcctt ccgaattgat gacaaccggc tccgaacggt ttccggtaat 960
gtcatgccat gtctcaccgg cgttttgccg gccgacatac attcgctttg ccccaccggg 1020
tcggtcgact ctaggatccg aattcatcga tgatctggca cgacaggttt cccgactgga 1080
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 1140
ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 1200
acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaaagatcc ggacagaatc taaacatatc 1260
tgctcaataa cgacttcccc cctcccattc cattttacta aatgggacat ttaaaggaca 1320
gcaggttttt cgttttttaa caatcatata atactttatc catttattgt atcggtagaa 1380
cgaaaaaaaa gacttgtttc caagtctttt tcacgaaatt ttcattgcat aattgtattt 1440
atcgagttga tcaatgcttt tgttaatgtt tcgtaatgaa tctgtcgttt ctttaatatc 1500
aagttcgagt cggaataaca attgttttac ttcttcaagt ttcttttcca tcgtttccac 1560
actccttttt ttgaaagatc cccatcagat ctgccggtcg ccctatagtg agtcgtatta 1620
cg 1622
Claims (3)
1.一种表达载体，包含SacB启动子、果聚糖蔗糖酶翻译增强子、SD序列、23个氨基酸残基组成的完整信号肽、多克隆位点、α-Amylase转录终止和degQ序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其具有图2所示的基因图谱并且被命名为pFYS.1。
3.一种枯草芽胞杆菌，其被权利要求1或2所述的表达载体所转化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610065686 CN101041830A (zh) | 2006-03-21 | 2006-03-21 | 一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200610065686 CN101041830A (zh) | 2006-03-21 | 2006-03-21 | 一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101041830A true CN101041830A (zh) | 2007-09-26 |
Family
ID=38807625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200610065686 Pending CN101041830A (zh) | 2006-03-21 | 2006-03-21 | 一种枯草芽胞杆菌胞外分泌表达载体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101041830A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108409843A (zh) * | 2018-03-08 | 2018-08-17 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白及其制备方法 |
| CN110004166A (zh) * | 2018-01-05 | 2019-07-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法 |
| CN113214407A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-08-06 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | Ii型草鱼呼肠孤病毒vp4-ns38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用 |
-
2006
- 2006-03-21 CN CN 200610065686 patent/CN101041830A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110004166A (zh) * | 2018-01-05 | 2019-07-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 高效表达分泌β-甘露聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌菌株及其获得方法 |
| CN108409843A (zh) * | 2018-03-08 | 2018-08-17 | 中国农业科学院特产研究所 | 一种枯草芽孢杆菌表达的牛分支杆菌esat-6蛋白及其制备方法 |
| CN113214407A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-08-06 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | Ii型草鱼呼肠孤病毒vp4-ns38融合蛋白基因、表达载体、菌株及其应用 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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