CN1778930A

CN1778930A - 激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN1778930A
Application number: CN 200510108341
Authority: CN
Inventors: 汪明; 周建民; 徐守振; 吴绍强
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2005-10-12
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2006-05-31

Abstract

本发明公开了一种激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白与应用。该融合基因，是由鸡球虫的3－1E基因、钙调蛋白激酶基因、TA4基因、热休克蛋白HSP70基因中的至少一种抗原基因与IFN－γ、GM－CSF、IL、TGF－β4中至少一种细胞因子基因中至少一种细胞因子基因组成。它是下述DNA序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)序列表中的SEQ ID №：2；3)序列表中的SEQ ID №：3；4)序列表中的SEQID №：4；5)序列表中的SEQ ID №：5；6)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1或2或3或4或5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

Description

激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及融合基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一种激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白与应用。

背景技术

鸡球虫病是一种鸡的寄生虫病。病原为艾美球虫，主要寄生于鸡肠道上皮细胞内。该病分布广泛，各地普遍存在，且多在温暖季节流行。主要侵害15-50日龄雏鸡，常给家禽养殖业造成重大经济损失。球虫极易产生耐药性和药物残留等问题，而球虫活苗存在毒力返强及免疫常常失败等，这些问题使研制安全高效的球虫基因工程疫苗成为新的发展方向。以往的基因工程疫苗多建立在一种抗原基因的基础上，难以抵抗大剂量球虫的攻击感染。

鸡球虫3-1E、钙调蛋白激酶基因(CDPK)、TA4基因、热休克蛋白HSP70基因等是鸡球虫的保护性抗原，IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4序列等是基因工程疫苗的良好的分子免疫佐剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白。

本发明所提供的激发机体抗鸡球虫感染的融合基因，是由鸡球虫的3-1E基因、钙调蛋白激酶基因(CDPK)、TA4基因、热休克蛋白HSP70基因中的至少一种抗原基因与IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4中至少一种细胞因子基因组成。所述抗原基因优选为3-1E基因与CDPK基因，所述细胞因子基因优选为IFN-γ。

在该融合基因中可以是鸡球虫的3-1E基因、CDPK基因、TA4基因、HSP70抗原基因处于5’端，细胞因子基因处于3’端，也可以是细胞因子基因处于5’端，抗原基因处于3’端。

所述融合基因，是下述DNA序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：2；

3)序列表中的SEQ ID NO：3；

4)序列表中的SEQ ID NO：4；

5)序列表中的SEQ ID NO：5；

6)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1或2或3或4或5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列由1005个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第1005位碱基；自5’端第1到第513位碱基为编码鸡球虫3-1E蛋白的序列，编码171个氨基酸；自5’端第514到第1005位碱基为细胞因子IFN-γ的编码序列，编码164个氨基酸。

序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列由1962个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第1962位碱基；自5’端第1到第1470位碱基为编码鸡球虫CDPK的序列，编码490个氨基酸；自5’端第1471到第1962位碱基为细胞因子IFN-γ的编码序列，编码164个氨基酸。

序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列由2415个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第2415位碱基；自5’端第1到第513位碱基为编码鸡球虫3-1E蛋白的序列，编码171个氨基酸；自5’端第514到第1983位碱基为编码鸡球虫CDPK蛋白的序列，编码490个氨基酸；自5’端第1984到第2415位碱基为细胞因子GM-CSF的编码序列，编码144个氨基酸。

序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列由945个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第945位碱基；自5’端第1到第513位碱基为编码鸡球虫3-1E蛋白的序列，编码171个氨基酸；自5’端第514到第945位碱基为细胞因子GM-CSF的编码序列，编码144个氨基酸。

序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列由1902个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第1到第1902位碱基；自5’端第1到第1470位碱基为编码鸡球虫CDPK蛋白的序列，编码490个氨基酸；自5’端第1471到第1902位碱基为细胞因子GM-CSF的编码序列，编码144个氨基酸。

所述融合基因的编码蛋白也属于本发明的保护范围，它是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：6；

2)序列表中的SEQ ID NO：7；

3)序列表中的SEQ ID NO：8；

4)序列表中的SEQ ID NO：9；

5)序列表中的SEQ ID NO：10；

6)将序列表中SEQ ID NO：6或7或8或9或10的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体抗鸡球虫感染的蛋白质。

序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列是由334个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-170位为鸡球虫3-1E蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第171-334位为细胞因子IFN-γ的氨基酸残基序列，将具有序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为3-1E/IFN-γ；序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列是由654个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-490位为鸡球虫CDPK蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第491-654位为细胞因子IFN-γ的氨基酸残基序列，将具有序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为CDPK/IFN-γ；序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列是由824个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-170位为鸡球虫3-1E蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第171-660位为鸡球虫CDPK蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第661-824位为细胞因子IFN-γ的氨基酸残基序列，将具有序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为3-1E/CDPK/IFN-γ；序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列是由314个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-170位为鸡球虫3-1E蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第171-314位为细胞因子GM-CSF的氨基酸残基序列，将具有序列表中SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为3-1E/GM-CSF；序列表中SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列是由634个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第1-490位为鸡球虫CDPK蛋白的氨基酸残基序列，自氨基端第491-634位为细胞因子GM-CSF的氨基酸残基序列，将具有序列表中SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列的融合蛋白命名为CDPK/GM-CSF。

含有所述激发机体抗鸡球虫感染的融合蛋白编码基因的表达载体，转基因细胞系和工程菌也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述激发机体抗鸡球虫感染的融合蛋白的方法。

本发明所提供的融合蛋白的表达方法，是构建含有所述融合蛋白编码基因的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离出融合蛋白。

本发明的激发机体抗鸡球虫感染的融合基因及其编码蛋白可用于制备预防和/或治疗性鸡球虫疫苗。

本发明将鸡球虫的3-1E基因、钙调蛋白激酶基因(CDPK)、TA4基因、热休克蛋白HSP70基因中的至少一种基因作为抗原基因与IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4中的至少一种细胞因子基因作为免疫佐剂基因形成的融合基因及其编码蛋白，可激发动物机体产生鸡球虫免疫防护作用，对鸡球虫具有较好的免疫保护效果，可用于鸡球虫病的预防和治疗中。该融合蛋白稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产。

本发明在动物医学领域具有重要的应用前景和实际意义。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、含有融合基因3-1E/IFN-γ的重组质粒的构建

一、3-1E基因和IFN-γ基因的克隆

1、3-1E基因的克隆

从孢子化卵囊中提取总RNA，反转录为cDNA并以其为模板，在上游引物：5’-CGAGTCTTCATTGTTTGTAGTTTC-3’和下游引物：5’-TTTTTCCTTCTCATCAAGTGGTT-3’的引导下，用常规PCR方法进行扩增，PCR反应条件为：先94℃5分钟，94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，32个循环；再72℃ 10分钟。反应结束后，将513bp的3-1E基因的目的片段克隆入载体pGEM-T Easy(购于北京新经科公司)中，得到含有3-1E基因的克隆载体，命名为pGEM-T Easy/3-1E。

2)IFN-γ基因的克隆

提取鸡抗凝血的总RNA，反转录为cDNA并以其为模板，在上游引物：5’-TCAGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和下游引物：5’-GGCTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引导下，用常规PCR方法进行扩增，PCR反应条件为：先98℃ 5分钟，94℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，5个循环；再94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，28个循环；最后72℃ 10分钟。反应结束后，将492bp的IFN-γ基因的目的片段克隆入载体pGEM-T Easy中，得到含有IFN-γ基因的克隆载体，命名为pGEM-T Easy/IFN-γ。

二、含3-1E/IFN-γ融合基因的重组质粒的获得

1)以步骤一构建的含3-1E基因的克隆载体pGEM-T Easy/3-1E为模板，在引物5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和引物5’-AAGAATTCTTAGAAGCCGCCCTGGTACAGGTACTC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆3-1E基因；以步骤一构建的含IFN-γ基因的克隆载体pGEM-T Easy/IFN-γ为模板，在引物5’-TCAAAGCTTGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和引物5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆IFN-γ基因。

2)将3-1E基因用限制性内切酶BamH I与EcoR I酶切，将IFN-γ基因用限制性内切酶Hind III与Kpn I酶切，再用限制性内切酶BamH I与EcoR I、Hind III与Kpn I对载体pcDNA3.1/Zeo(+)(购于Invitrogen公司)酶切后，将三种酶切产物用T₄ DNA连接酶连接，连接反应时间为16小时。

3)将步骤2)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、提质粒，用限制性内切酶BamH I与EcoR、Hind III与Kpn I进行酶切鉴定，得到513bp和492bp酶切片段的为阳性克隆质粒，再对该阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步的鉴定，所用的引物序列为5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’，可扩增出1005bp片段的为阳性克隆质粒，再对其进行测序分析，得到正确的含有3-1E/IFN-γ融合基因的重组质粒，命名为pcDNA3.1-3-1E /IFN-γ。

实施例2、含有融合基因CDPK/IFN-γ的重组质粒的构建

一、CDPK基因和IFN-γ基因的克隆

1、CDPK基因的克隆

从孢子化卵囊中提取总RNA，反转录为cDNA并以其为模板，在上游引物：5’-ATGCCGGCAGCGTCCAAGTCAG-3’和下游引物：5’-CGCCGCGGTATCTCCGCACAAC-3’的引导下，用常规PCR方法进行扩增，PCR反应条件为：先94℃ 5分钟，94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，32个循环；再72℃ 10分钟。反应结束后，将1470bp的CDPK基因的目的片段克隆入载体pGEM-T Easy中，得到含有CDPK基因的克隆载体，命名为pGEM-T Easy/CDPK。

2、IFN-γ基因的克隆

IFN-γ基因的克隆方法与实施例1相同。

二、含CDPK/IFN-γ融合基因的重组质粒的获得

1)以步骤一构建的含CDPK基因的克隆载体pGEM-T Easy/CDPK为模板，在引物5’-TAGAATTCACCATGCCGGCAGCGTCCAAGTC-3’和引物5’-CCCTGCAGCTACGCCGCGGTATCTCGCACAAC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆CDPK基因；以步骤一构建的含IFN-γ基因的克隆载体pGEM-T Easy/IFN-γ为模板，在引物5’-TCAAAGCTTGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和引物5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆IFN-γ基因。

2)将CDPK基因用限制性内切酶EcoR I与Pst I酶切，将IFN-γ基因用限制性内切酶Hind III与Kpn I酶切，再用限制性内切酶EcoR I与Pst I、Hind III与Kpn I对载体pcDNA3.1/Zeo(+)酶切后，将三种酶切产物用T₄ DNA连接酶连接，连接反应时间为16小时。

3)将步骤2)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、提质粒，用限制性内切酶EcoR I与Pst I、Hind III与Kpn I进行酶切鉴定，得到1470bp和492bp酶切片段的为阳性克隆质粒，再对该阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步的鉴定，所用的引物序列为5’-TAGAATTCACCATGCCGGCAGCGTCCAAGTC-3’和5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’，可扩增出1962bp片段的为阳性克隆质粒，再对其进行测序分析，得到正确的含有3-1E/IFN-γ融合基因的重组质粒，命名为pcDNA3.1-CDPK/IFN-γ。

实施例3、含有融合基因3-1E/CDPK/IFN-γ的重组质粒的构建

一、融合基因3-1E、CDPK和IFN-γ的克隆

1)3-1E基因的克隆

3-1E基因的克隆方法与实施例1相同。

2)CDPK基因的克隆

CDPK基因的克隆方法与实施例2相同。

3)IFN-γ基因的克隆

IFN-γ基因的克隆方法与实施例1相同。

二、含3-1E/CDPK/IFN-γ融合基因的重组质粒的获得

1)以步骤一构建的含3-1E基因的克隆载体pGEM-T Easy/3-1E为模板，在引物5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和引物5’-AAGAATTCTTAGAAGCCGCCCTGGTACAGGTACTC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆3-1E基因；以步骤一构建的含CDPK基因的克隆载体pGEM-T Easy/CDPK为模板，在引物5’-TAGAATTCACCATGCCGGCAGCGTCCAAGTC-3’和引物5’-CCCTGCAGCTACGCCGCGGTATCTCGCACAAC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆CDPK基因；以步骤一构建的含IFN-γ基因的克隆载体pGEM-T Easy/IFN-γ为模板，在引物5’-TCAAAGCTTGCCGCCAAGATGACTTGCCAGACTT-3’和引物5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’的引导下，用PCR的方法亚克隆IFN-γ基因。

2)将3-1E基因用限制性内切酶BamH I与EcoR I酶切，将CDPK基因用限制性内切酶EcoR I与Pst I酶切，将IFN-γ基因用限制性内切酶Hind III与Kpn I酶切，再用限制性内切酶BamH I与EcoR I、EcoR I与Pst I、Hind III与Kpn I对载体pcDNA3.1/Zeo(+)酶切后，将酶切产物用T₄ DNA连接酶连接，连接反应时间为16小时。

3)将步骤2)的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取长出的单菌落摇菌、提质粒，用限制性内切酶BamH I与EcoR I、EcoR I与Pst I、Hind III与Kpn I进行酶切鉴定，得到513bp、1470bp和492bp酶切片段的为阳性克隆质粒，再对该阳性克隆质粒用PCR的方法做进一步的鉴定，所用的引物序列为5’-AAGGATCCGCCGCCAAAATGGGTGAAGAGGCTG-3’和5’-GGCCTCGAGTTAGCAATTGCATCTCCTCTGAGAC-3’，可扩增出2475bp片段的为阳性克隆质粒，再对其进行测序分析，得到正确的含有3-1E/CDPK/IFN-γ融合基因的重组质粒，命名为pcDNA3.1-3-1E/CDPK/IFN-γ。

实施例4、免疫保护实验

分别将实施例1、2、3获得的重组质粒pcDNA3.1-3-1E/IFN-γ、pcDNA3.1-CDPK/IFN-γ、pcDNA3.1-3-1E/CDPK/IFN-γ经胸肌多点注射免疫鸡，以非免疫鸡为对照，每次免疫剂量为50μg/只，7日龄鸡只为首免，14日龄鸡只为二免，21日龄后经口感染鸡球虫，每只鸡感染5-6×10⁴个卵囊，28日龄剖杀称重。淋巴细胞转化实验结果表明，淋巴细胞转化水平显著高于对照组(P＜0.05)，最高可达到0.7854；取盲肠内容物捣碎混匀后用血球计数板计数，并换算成卵囊值，结果表明免疫后的鸡存活率达100％，卵囊减少率达78％，病变减少率为50-60％，相对增重率为90-98％，综合抗球虫指数(ACI)达171、抗体滴度等免疫学指标明显高于感染不给苗组，表明经免疫的鸡对鸡球虫的免疫力显著提高。

序列表

<160>10

<210>1

<211>1005

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ATGGGTGAAG AGGCTGATAC TCAGGCGTGG GATACCTCAG TGAAGGAATG GCTCGTGGAT 60

ACGGGGAAGG TATACGCCGG CGGCATTGCT AGCATTGCAG ATGGGTGCCG CCTGTTTGGC 120

GCTGCAATAG ACAATGGGGA GGATGCGTGG AGTCAGTTGG TGAAGACAGG ATATCAGATT 180

GAAGTGCTTC AAGAGGACGG CTCTTCAACT CAAGAGGACT GCGATGAAGC GGAAACCCTG 240

CGGCAAGCAA TTGTTGACGG CCGTGCCCCA AACGGTGTTT ATATTGGAGG AATTAAATAT 300

AAACTCGCAG AAGTTAAACG TGATTTCACC TATAACGACC AGAACTACGA CGTGGCGATT 360

TTGGGGAAGA ACAAGGGTGG CGGTTTCCTG ATTAAGACTC CGAACGACAA TGTGGTGATT 420

GCTCTTTATG ACGAGGAGAA AGAGCAGAAC AAAGCAGATG CGCTGACAAC GGCACTTGCC 480

TTCGCTGAGT ACCTGTACCA GGGCGGCTTC TAAATGACTT GCCAGACTTA CAACTTGTTT 540

GTTCTGTCTG TCATCATGAT TTATTATGGA CATACTGCAA GTAGTCTAAA TCTTGTTCAA 600

CTTCAAGATG ATATAGACAA ACTGAAAGCT GACTTTAACT CAAGTCATTC AGATGTAGCT 660

GACGGTGGAC CTATTATTGT AGAGAAACTG AAGAACTGGA CAGAGAGAAA TGAGAAAAGG 720

ATCATACTGA GCCAGATTGT TTCGATGTAC TTGGAAATGC TTGAAAACAC TGACAAGTCA 780

AAGCCGCACA TCAAACACAT ATCTGAGGAG CTCTATACTC TGAAAAACAA CCTTCCTGAT 840

GGCGTGAAGA AGGTGAAAGA TATCATGGAC CTGGCCAAGC TCCCGATGAA CGACTTGAGA 900

ATCCAGCGCA AAGCCGCGAA TGAACTCTTC AGCATCTTAC AGAAGCTGGT GGATCCTCCG 960

AGTTTCAAAA GGAAAAGGAG CCAGTCTCAG AGGAGATGCA ATTGC 1005

<210>2

<211>1962

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ATGCCGGCAG CGTCCAAGTC AGACAAACTG GCTGCCACGC CGGGCATGTT TGTGCAGCAC 60

TCTACAGCAG CCTTCAGCGA TAGGTACAAG GGCCAGCGCG TGTTGGGCAA GGGCAGTTTC 120

GGTGAAGTTA TTTTGTGCAA AGATAAAGTA ACTGGACAGG AATATGCCGT GAAGGTGATT 180

TCAAAACGGC AAGTGAAGCA GAAGACGGAC AAAGAGCTGC TGCTCAAGGA GGTGGAGCTC 240

CTTAAGAAGC TGGACCACCC CAACATCATG AAGCTCTACG AGTTCTTCGA GGACAAGGGC 300

TACTTCTACT TAGTCACAGA AGTCTATACC GGCGGAGAGC TCTTCGACGA GATCATCAGC 360

AGAAAGAGGT TCAGCGAGGT TGACGCTGCC CGCATCATTC GACAAGTGCT TTCGGGCATT 420

ACGTATATGC ACAAGAACAA AATCGTTCAC AGAGACCTCA AGCCTGAAAA TCTGCTGCTG 480

GAAAACAAAA GAAAAGATGC TAACATTCGC ATCATTGACT TCGGCCTTTC CACTCACTTT 540

GAGTCCACCA AGAAAATGAA GGACAAGATC GGAACGGCCT ATTACATTGC CCCAGAGGTC 600

TTGCATGGGA CCTACGACGA GAAGTGCGAC GTGTGGTCCA CAGGGGTCAT TTTGTATATC 660

CTTCTTTCTG GATGCCCCCC ATTTAACGGG GCAAACGAAT TTGACATTTT GAAGAAAGTC 720

GAAAAAGGAA AGTTCACCTT CGATCTGCCG CAATGGAAGA AGGTGAGCGA GCCAGCCAAA 780

GACTTGATTC GTAAGATGCT GGCGTACGTG CCCACAATGC GGATATCTGC ACGAGACGCC 840

CTCGAGCACG AGTGGCTCAA GACTACAGAC GCAGCCACTG ACAGTATTGA TGTGCCTTCG 900

CTTGAGAGCA CCATACTTAA CATCAGACAG TTCCAGGGGA CGCAAAAGCT TGCCGCGGCT 960

GCGCTGCTCT ATATGGGCAG CAAGCTGACC ACCAACGAAG AGACAGTTGA GCTCAACAAG 1020

ATTTTCCAAA GGATGGACAA AAACGGAGAT GGCCAGCTTG ATAAGCAGGA GCTCATGGAA 1080

GGCTACGTGG AGCTGATGAA GCTGAAAGGC GAAGACGTTT CGGCGCTGGA CCAGAGCGCC 1140

ATCGAGTTCG AGGTGGAGCA GGTGCTCGAC GCTGTGGCCT TTGACAAGAA CGGCTTCATA 1200

GAGTACTCAG AGTTCGTCAC AGTGGCAATG GACCGCAAGA CACTCTTGTC TCGCCAGCGA 1260

CTGGAAAGAG CCTTTGGAAT GTTCGACGCT GACGGCTCGG GCAAGATTTC CTCTTCAGAG 1320

TTGGCCACCA TATTCGGGGT GAGCGAGGTC GACTCCGAAA CCTGGCGCCG CGTCCTCGCG 1380

GAGGTGGACA GAAACAACGA CGGGGAAGTG GACTTTGAGG AGTTCCGGCA GATGCTCCTG 1440

AAGTTGTGCG GAGATACCGC GGCGGAATTC ATGACTTGCC AGACTTACAA CTTGTTTGTT 1500

CTGTCTGTCA TCATGATTTA TTATGGACAT ACTGCAAGTA GTCTAAATCT TGTTCAACTT 1560

CAAGATGATA TAGACAAACT GAAAGCTGAC TTTAACTCAA GTCATTCAGA TGTAGCTGAC 1620

GGTGGACCTA TTATTGTAGA GAAACTGAAG AACTGGACAG AGAGAAATGA GAAAAGGATC 1680

ATACTGAGCC AGATTGTTTC GATGTACTTG GAAATGCTTG AAAACACTGA CAAGTCAAAG 1740

CCGCACATCA AACACATATC TGAGGAGCTC TATACTCTGA AAAACAACCT TCCTGATGGC 1800

GTGAAGAAGG TGAAAGATAT CATGGACCTG GCCAAGCTCC CGATGAACGA CTTGAGAATC 1860

CAGCGCAAAG CCGCGAATGA ACTCTTCAGC ATCTTACAGA AGCTGGTGGA TCCTCCGAGT 1920

TTCAAAAGGA AAAGGAGCCA GTCTCAGAGG AGATGCAATT GC 1962

<210>3

<211>2415

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ATGGGTGAAG AGGCTGATAC TCAGGCGTGG GATACCTCAG TGAAGGAATG GCTCGTGGAT 60

ACGGGGAAGG TATACGCCGG CGGCATTGCT AGCATTGCAG ATGGGTGCCG CCTGTTTGGC 120

GCTGCAATAG ACAATGGGGA GGATGCGTGG AGTCAGTTGG TGAAGACAGG ATATCAGATT 180

GAAGTGCTTC AAGAGGACGG CTCTTCAACT CAAGAGGACT GCGATGAAGC GGAAACCCTG 240

CGGCAAGCAA TTGTTGACGG CCGTGCCCCA AACGGTGTTT ATATTGGAGG AATTAAATAT 300

AAACTCGCAG AAGTTAAACG TGATTTCACC TATAACGACC AGAACTACGA CGTGGCGATT 360

TTGGGGAAGA ACAAGGGTGG CGGTTTCCTG ATTAAGACTC CGAACGACAA TGTGGTGATT 420

GCTCTTTATG ACGAGGAGAA AGAGCAGAAC AAAGCAGATG CGCTGACAAC GGCACTTGCC 480

TTCGCTGAGT ACCTGTACCA GGGCGGCTTC TAAATGCCGG CAGCGTCCAA GTCAGACAAA 540

CTGGCTGCCA CGCCGGGCAT GTTTGTGCAG CACTCTACAG CAGCCTTCAG CGATAGGTAC 600

AAGGGCCAGC GCGTGTTGGG CAAGGGCAGT TTCGGTGAAG TTATTTTGTG CAAAGATAAA 660

GTAACTGGAC AGGAATATGC CGTGAAGGTG ATTTCAAAAC GGCAAGTGAA GCAGAAGACG 720

GACAAAGAGC TGCTGCTCAA GGAGGTGGAG CTCCTTAAGA AGCTGGACCA CCCCAACATC 780

ATGAAGCTCT ACGAGTTCTT CGAGGACAAG GGCTACTTCT ACTTAGTCAC AGAAGTCTAT 840

ACCGGCGGAG AGCTCTTCGA CGAGATCATC AGCAGAAAGA GGTTCAGCGA GGTTGACGCT 900

GCCCGCATCA TTCGACAAGT GCTTTCGGGC ATTACGTATA TGCACAAGAA CAAAATCGTT 960

CACAGAGACC TCAAGCCTGA AAATCTGCTG CTGGAAAACA AAAGAAAAGA TGCTAACATT 1020

CGCATCATTG ACTTCGGCCT TTCCACTCAC TTTGAGTCCA CCAAGAAAAT GAAGGACAAG 1080

ATCGGAACGG CCTATTACAT TGCCCCAGAG GTCTTGCATG GGACCTACGA CGAGAAGTGC 1140

GACGTGTGGT CCACAGGGGT CATTTTGTAT ATCCTTCTTT CTGGATGCCC CCCATTTAAC 1200

GGGGCAAACG AATTTGACAT TTTGAAGAAA GTCGAAAAAG GAAAGTTCAC CTTCGATCTG 1260

CCGCAATGGA AGAAGGTGAG CGAGCCAGCC AAAGACTTGA TTCGTAAGAT GCTGGCGTAC 1320

GTGCCCACAA TGCGGATATC TGCACGAGAC GCCCTCGAGC ACGAGTGGCT CAAGACTACA 1380

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<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

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<223>

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Trp Leu Val Asp Thr Gly Lys Val Tyr Ala Gly Gly Ile Ala Ser Ile

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Ala Trp Ser Gln Leu Val Lys Thr Gly Tyr Gln Ile Glu Val Leu Gln

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Glu Asp Gly Ser Ser Thr Gln Glu Asp Cys Asp Glu Ala Glu Thr Leu

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Arg Gln Ala Ile Val Asp Gly Arg Ala Pro Asn Gly Val Tyr Ile Gly

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Gly Ile Lys Tyr Lys Leu Ala Glu Val Lys Arg Asp Phe Thr Tyr Asn

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Asp Gln Asn Tyr Asp Val Ala Ile Leu Gly Lys Asn Lys Gly Gly Gly

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Phe Leu Ile Lys Thr Pro Asn Asp Asn Val Val Ile Ala Leu Tyr Asp

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Glu Glu Lys Glu Gln Asn Lys Ala Asp Ala Leu Thr Thr Ala Leu Ala

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Phe Ala Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Gly Phe Met Thr Cys Gln Thr Tyr

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Asn Leu Phe Val Leu Ser Val Ile Met Ile Tyr Tyr Gly His Thr Ala

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Ser Ser Leu Asn Leu Val Gln Leu Gln Asp Asp Ile Asp Lys Leu Lys

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Ile Val Glu Lys Leu Lys Asn Trp Thr Glu Arg Asn Glu Lys Arg Ile

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Ile Leu Ser Gln Ile Val Ser Met Tyr Leu Glu Met Leu Glu Asn Thr

245 250 255

Asp Lys Ser Lys Pro His Ile Lys His Ile Ser Glu Glu Leu Tyr Thr

260 265 270

Leu Lys Asn Asn Leu Pro Asp Gly Val Lys Lys Val Lys Asp Ile Met

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Asp Leu Ala Lys Leu Pro Met Asn Asp Leu Arg Ile Gln Arg Lys Ala

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<220>

<223>

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Phe Val Gln His Ser Thr Ala Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Lys Gly Gln

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Arg Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Glu Val Ile Leu Cys Lys Asp

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Lys Val Thr Gly Gln Glu Tyr Ala Val Lys Val Ile Ser Lys Arg Gln

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Val Lys Gln Lys Thr Asp Lys Glu Leu Leu Leu Lys Glu Val Glu Leu

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Leu Lys Lys Leu Asp His Pro Asn Ile Met Lys Leu Tyr Glu Phe Phe

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Glu Asp Lys Gly Tyr Phe Tyr Leu Val Thr Glu Val Tyr Thr Gly Gly

100 105 110

Glu Leu Phe Asp Glu Ile Ile Ser Arg Lys Arg Phe Ser Glu Val Asp

115 120 125

Ala Ala Arg Ile Ile Arg Gln Val Leu Ser Gly Ile Thr Tyr Met His

130 135 140

Lys Asn Lys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu

145 150 155 160

Glu Asn Lys Arg Lys Asp Ala Asn Ile Arg Ile Ile Asp Phe Gly Leu

165 170 175

Ser Thr His Phe Glu Ser Thr Lys Lys Met Lys Asp Lys Ile Gly Thr

180 185 190

Ala Tyr Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu His Gly Thr Tyr Asp Glu Lys

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Cys Pro Pro Phe Asn Gly Ala Asn Glu Phe Asp Ile Leu Lys Lys Val

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Glu Lys Gly Lys Phe Thr Phe Asp Leu Pro Gln Trp Lys Lys Val Ser

245 250 255

Glu Pro Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met Leu Ala Tyr Val Pro Thr

260 265 270

Met Arg Ile Ser Ala Arg Asp Ala Leu Glu His Glu Trp Leu Lys Thr

275 280 285

Thr Asp Ala Ala Thr Asp Ser Ile Asp Val Pro Ser Leu Glu Ser Thr

290 295 300

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<223>

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<223>

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Glu Asn Lys Arg Lys Asp Ala Asn Ile Arg Ile Ile Asp Phe Gly Leu

165 170 175

Ser Thr His Phe Glu Ser Thr Lys Lys Met Lys Asp Lys Ile Gly Thr

180 185 190

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Cys Pro Pro Phe Asn Gly Ala Asn Glu Phe Asp Ile Leu Lys Lys Val

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Glu Tyr Ser Glu Phe Val Thr Val Ala Met Asp Arg Lys Thr Leu Leu

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530 535 540

Asp Ile Arg Asp Lys Thr Cys Leu Arg Asn Asn Leu Lys Thr Phe Ile

545 550 555 560

Glu Ser Leu Lys Thr Asn Gly Thr Glu Glu Glu Ser Gly Ile Val Phe

565 570 575

Gln Leu Asn Arg Val His Glu Cys Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ile Thr

580 585 590

Pro Thr Pro Gln Val Pro Asp Lys Glu Cys Arg Thr Ala Gln Val Ser

595 600 605

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610 615 620

Asp Val Leu Pro Glu Glu Lys Asp Cys Ile

625 630

Claims

1、一种激发机体抗鸡球虫感染的融合基因，是由鸡球虫的3-1E基因、钙调蛋白激酶基因、TA4基因、热休克蛋白HSP70基因中的至少一种抗原基因与IFN-γ、GM-CSF、IL、TGF-β4中至少一种细胞因子基因组成。

2、根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述抗原基因为3-1E与CDPK，细胞因子基因为IFN-γ。

3、根据权利要求1所述的融合基因，其特征在于：所述融合基因是下述DNA序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)序列表中的SEQ ID NO：2；

3)序列表中的SEQ ID NO：3；

4)序列表中的SEQ ID NO：4；

5)序列表中的SEQ ID NO：5；

4、权利要求1所述的融合基因的编码蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID NO：6；

2)序列表中的SEQ ID NO：7；

3)序列表中的SEQ ID NO：8；

4)序列表中的SEQ ID NO：9；

5)序列表中的SEQ ID NO：10；

5、含有权利要求1所述融合基因的表达载体。

6、含有权利要求1所述融合基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求1所述融合基因的工程菌。

8、一种表达权利要求4所述激发机体抗鸡球虫感染的融合蛋白的方法，是构建含有权利要求1所述融合基因的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离出融合蛋白。

9、权利要求1所述激发机体抗鸡球虫感染的融合基因在制备预防和/或治疗性鸡球虫疫苗中的应用。

10、权利要求4所述激发机体抗鸡球虫感染的蛋白在制备预防和/或治疗性鸡球虫疫苗中的应用。