CN1186448C - 重组人α胸腺素原－白介素2基因及其表达、应用 - Google Patents

重组人α胸腺素原－白介素2基因及其表达、应用 Download PDF

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CN1186448C CNB031138292A CN03113829A CN1186448C CN 1186448 C CN1186448 C CN 1186448C CN B031138292 A CNB031138292 A CN B031138292A CN 03113829 A CN03113829 A CN 03113829A CN 1186448 C CN1186448 C CN 1186448C
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Abstract

本发明提供一种由人源α-胸腺素原和白介素-2组成的基因及其表达和应用，该基因具有更强的生物学活性，可用于制备治疗病毒性感染疾病、抗肿瘤及其他免疫缺陷性疾病的药物。

Description

重组人α胸腺素原-白介素2基因及其表达、应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种重组人α胸腺素原-白介素2基因及其表达、应用。
背景技术
人α-胸腺素原(prothymosin-α)为胸腺分泌的多肽激素，由110个氨基酸残基组成，组织分布广泛。α-胸腺素原有两方面的功能，一是作为核蛋白参与细胞增殖；二是具有免疫刺激活性，调节细胞和体液免疫功能状态，提高免疫系统的自身稳定性。人α-胸腺素原的应用包括治疗肝炎、爱滋病等和作为免疫调节剂(包括抗衰老和肿瘤辅助治疗)。目前国内从猪、牛等胸腺分离提取的胸腺肽混合物作为免疫增强剂广泛用于临床，但由于猪、牛等来源的胸腺肽与人胸腺肽相比，在多肽的氨基酸组成和结构上的不同，存在着异源性和异种动物的安全性问题，可产生排异反应和将异种动物疾病传染给人类，影响其在人体的应用；另外胸腺肽在生理状态下的含量极微，从组织提取分离纯化的产品难以满足临床对其的质量和数量的要求，而通过生物工程技术可大量生产重组的人α-胸腺素原，满足临床应用的要求。
人白介素-2(interleukin2，IL-2)主要由T细胞或T细胞系产生，具有广泛的生物学活性：Th、Tc和Ts细胞都是IL-2的反应细胞；诱导CTL、NK和LAK等多种杀伤细胞的分化和效应功能，并诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子；直接作用于B细胞，促进其增殖、分化和Ig分泌；活化巨噬细胞。其临床主要用于治疗肿瘤以及感染性疾病。然而IL-2在体内大剂量使用时，毒副作用较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种比人α胸腺素原和白介素2具有更高生物学活性的重组人α胸腺素原-白介素2基因；
本发明的另一目的在于提供该融合蛋白的表达；
本发明的另一目的在于提供该融合蛋白的应用。
本发明的目的通过以下方法实现：
分别合成人α-胸腺素原、白介素-2的上下游引物，并通过人胸腺细胞和人T细胞分别分离出人α-胸腺素原和白介素-2mRNA，分别进行逆转录及PCR扩增获得人α-胸腺素原和白介素-2功能区片段；利用二次PCR扩增出融合基因，酶切后连接克隆载体，筛选测序鉴定出阳性克隆，并将此融合基因连接至表达载体，转化工程菌诱导表达、分离纯化后获得具有人α-胸腺素原人白介素-2双活性的融合蛋白，并且该蛋白序列内还可以含有连接子。
本融合基因cDNA可由α-胸腺素原1-230bp序列，IL-2250-652bp序列以及长度为15-45bp连接子组成，连接子编码的氨基酸可由丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸等组成，特指[G-G-G-G-S]n。
本发明的融合基因，从N端到C端，可按α胸腺素原-白介素2或白介素2-α胸腺素原排列；编码白介素-2的基因的第3个半胱氨酸可替换为其它保守氨基酸，例如丝氨酸，从而有利于多肽的正确折叠。
本发明还构建了表达载体pProTM/IL-2，由本发明的基因克隆到表达载体pBV220中得到。本发明的表达载体，可用于制备基因治疗药物。
本发明的融合基因，来源于人源的cDNA，利用基因工程技术进行重组表达。本发明提供的重组人α-胸腺素原-白介素-2融合蛋白克服了IL-2在体内大剂量使用时，毒副作用较大的缺点，并利用了IL-2的协同作用增强人α-胸腺素原的免疫刺激活性；另外本发明克服了异源性和异种动物的安全性问题；重组人α-胸腺素原/白介素-2融合蛋白较α-胸腺素原、白介素-2单因子或双因子联合有更高生物学活性。本发明的融合基因，可用于制备治疗病毒性感染疾病、抗肿瘤及其他免疫缺陷性疾病的药物。
附图说明
图1是胸腺素原cDNA克隆图谱；
图2是二次PCR扩增融合蛋白PTM-IL-2；
图3是pProTM/IL-2融合蛋白表达载体的构建。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明，但并不以任何形式限制本发明。
实施例1胸腺细胞总RNA提取和反转录PCR
取3-4个月的胎儿胸腺，制备成单个细胞，悬浮于RPMI1640培养液中，细胞密度为1×107ml，在20ug/ml PHA和500U/ml IL-2的联合刺激下于37℃，5％CO2条件下培养24小时，取培养的胸腺细胞按TAKARA公司总RNA试剂盒的方法提取总RNA，溶于DEPC处理过的去离子水中，取一定量的RNA，加下游引物(P2)和dNTP，在42℃下反转录酶作用30分钟，将α-胸腺素原mRNA反转录成单链cDNA，进一步加上游引物(P1)及Taq酶进行PCR，得到α-胸腺素原cDNA。其中所述的上、下游引物分别如下所示：上游引物5’GTC AAG CTT ATG TCA GAC GCA GCC GTA G3’下游引物5’ACT GGA TCC TTA GTC ATC CTC GTC GGT CTT C3’
实施例2IL-2基因RT-PCR过程
取肝素抗凝血5ml，用密度梯度法在淋巴细胞分离液分离外周血PBMC，用RPMI1640将细胞数调为(2～3)×106/ml，分别加入PHA10ug、白细胞介素-250IU，在37℃，5％CO2条件下培养24～48小时；收集上述细胞，离心1000r/min，5分钟，取底层细胞以PBS缓冲液冼涤后，用异硫氰酸胍酚氯仿一步法提取细胞总RNA。得到的RNA沉淀用焦碳酸二乙酯(DECP)处理水溶解，经乙二醛1％的琼脂糖凝胶电泳(含0.5μg的溴化乙锭)鉴定，紫外分光光度计测定总RNA浓度，OD260nm/280nm为1.8～2.0之间，-20℃冰箱保存；按TAKARA的逆转录试剂盒说明操作，以提取的总RNA为模板，加IL-2下游引物(P4)逆转录合成单链cDNA；再加入上游引物(P3)PCR扩增出人源IL-2基因。将扩增的IL-2基因进行限制性内切酶酶切(HindIII/BamHI)，再克隆入PUC19载体，得PUC19-IL2。其中上、下游引物分别如下：
P3：gtc-AAgCTT-atggcacctacttcaagttctacaaagaa
P4：act-ggATCC-tta agttagtgttgagatgatgctttg
实施例3人α-胸腺素原功能区基因克隆
利用bio-soft、sequence等生物软件通过计算机分析确定最佳的退火温度，避免可能干扰转译起始的mRNA二级结构；确保两个引物之间无特异序列的配对，引物模板之间具有特异互补配对以避免扩增不必要的序列；在实施例1所述的上、下游引物中5’分别导入BamHI、XbaI酶切位点，人工合成寡核苷酸引物：以人α-胸腺素原cDNA为模板，PCR扩增后得到人α-胸腺素原基因片段，将上述片段经BamHI/XbaI限制性内切酶处理后，经酚/氯仿抽提蛋白质，乙醇沉淀萃取DNA，定向克隆至PUC19载体，转化大肠杆菌，筛选白斑菌落，酶切鉴定获得阳性克隆PUC19-胸腺素原。克隆图谱见图1。
实施例4融合蛋白的基因克隆
不改变实施例1和2所设计的胸腺素原上游引物及IL-2下游引物，重新设计胸腺素原下游引物(P2’)及IL-2上游引物(P3’)，两引物之间为具胸腺素原基因3’端20个碱基、中间连接子18个碱基以及IL-2基因5’端26个碱基完全互补配对序列，其中连接子序列为5’TCGGGTGGCGGTGGCTCT 3’。先分别以PUC19-胸腺素原、PUC19-IL-2为模板进行PCR扩增；再以两者扩增产物混合物为模板，用胸腺素原上游引物(P1)、IL-2下游引物(P4)进行二次PCR，扩增得到胸腺素原-IL-2融合基因，经酶切后定向克隆至PUC19载体，转化入大肠杆菌筛选白斑菌落酶切鉴定获得阳性克隆PUC19-胸腺素原-IL-2。克隆图谱见图2。其中P2’、P3’引物完全互补，分别为：
P2’：ttctttgtagaacttgaagtaggtgc-AgAgCCACCGCCACCCgA-gtcatcctcgtcggtcttct
P3’：agaagaccgacgaggatgac-TCgggTggCggTggCTCT-gcacctacttcaagttctacaaagaa
黑体为融合蛋白连接肽段的碱基序列，其编码的氨基酸序列为S-G-G-G-G-S。
实施例5融合蛋白表达载体构造
根据胸腺素原cDNA序列，参考大肠杆菌偏爱密码子，在不改变氨基酸编码的前提下设计出A、T含量高的上游引物，将PCR扩增获得的胸腺素原/白细胞介素-2融合蛋白基因克隆入表达载体pBV220，得表达载体pProTM/IL-2，载体构建过程见图3。所述的引物分别为：
上游引物：gtc- GAATTC- -atgtcagacgcagccgtag
             EcoRI酶切位点
下游引物：gtc- GAATTC-tta agttagtgttgagatgatgctttg
          EcoRI酶切位点
实施例6大肠杆菌高效表达融合蛋白
将上述阳性克隆，制备过夜培养物，30℃振摇约1小时OD600达到0.4-0.6后，升温至42℃诱导4-6小时，常规收菌、裂解、SDS-PAGE电泳，用薄层扫描仪测得表达蛋白占菌体总蛋白的20％。
实施例7融合蛋白的复性、纯化
将低温冻存的细菌重悬于6倍体积的溶解缓冲液(50mMTris HCl，pH8.0，1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，2mg/ml溶菌酶)并用超声波破碎仪裂解细菌(5mm超声头，50W，8个循环和50％的时间间隔，冰浴10分钟)。通过离心将溶解液中的包涵体分离，溶于变性液(6M脲素、100mM Tris-醋酸/氢氧化钠pH9.5，25mM EDTA，5mM二硫苏糖醇)中。将抽提的融合蛋白逐渐加于氧化还原缓冲液(50mM Tris HCl，pH9.0，5mM EDTA，0.2mM氧化型谷胱甘肽及0.4mM还原型谷胱甘肽)进行再折叠反应。经再折叠而复性的融合蛋白溶液经离子交换层析和分子筛过滤得到进一步纯化，得95％左右纯品。
实施例8IL-2改造位点
利用定点突变或直接人工合成对IL-2进行基因改造，将其基因序列中的第3个半胱氨酸密码子改成丝氨酸密码子(tgt→tct)，从而利于多肽的正确折叠，而不改变IL-2的功能。
实施例9活性测定
1.融合蛋白免疫活性鉴定：采用E-玫瑰花结试验检测：
用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞，用Hanks液配成2×106/ml，实验管加一定量的融合蛋白表达上清，对照则加相同量对照菌上清，于30℃水浴孵化90min，加0.5％绵羊红细胞后，涂片，染色，于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合4个及以上绵羊红细胞)，计算玫瑰花形成细胞的百分数，可用公式求得表达上清的激活率。
Figure C0311382900071
以健康成年人T淋巴细胞的玫瑰花结激活率为100％，不同浓度的α-胸腺素原和融合蛋白玫瑰花结相对激活率如下：
α-胸腺素原 玫瑰花结激活 融合蛋白     玫瑰花结激活
(ug/1ml)    率(％)       (ug/1ml)     率(％)
16          30           12           28
8           51           6            50
4           65           3            65
2           100          1.5          100
1           57           0.75         53
0.5         33           0.38         32
2.IL-2活性检测：采用IL-2依赖的CTLL-2细胞MTT法：将检测细胞配成5×105ml细胞液，96孔培养板中每板加100ul。取100ul不同稀释度的IL-2标准品和融合蛋白表达上清加入各孔中，每个稀释度做3个复孔，并附培养液对照孔，置37℃，5％CO2中育24-48小时；吸去上清，加PBS洗涤，加10ulMTT溶液，继续培养4-6小时；各加入含10％SDS的0.01mol/l HCl，充分混匀，静置数分钟，让形成的甲腊颗粒充分溶解；在酶联仪上选择波长为570nm，参考波长630nm，分别测定D值。用log2稀释度(X)和各稀释度对应的D值(Y)作直线回归。按概率单位分析法计算IL-2活性。最终所测得的融合蛋白比活性为2×106U/mg。
<110>广州拜迪生物医药有限公司
<120>重组人α胸腺素原-白介素2基因及其表达、应用
<130>
<140>
<141>
<160>8
<170>PatentIn Ver.2.1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<221>CDS
<222>(1)..(729)
<400>1
atg tca gac gca gcc gta gac acc agc tcc gaa atc acc acc aag gac   48
Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp
  1               5                  10                  15
tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat gga aga gac   96
Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp
             20                  25                  30
gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aat ggg gag cag gag gct   144
Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala
         35                  40                  45
gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag   192
Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu
     50                  55                  60
gag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gag gag ggt gga gat gaa gat gag   240
Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu
 65                  70                  75                  80
gaa gct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat   288
Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp
                 85                  90                  95
gac gat gtc gat acc aag aag cag aag acc gac gag gat gac gca cct   336
Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp Ala Pro
            100                 105                 110
act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat tta ctg   384
Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu
        115                 120                 125
ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag aat ccc   432
Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
    130                 135                 140
aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag aag gcc   480
Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala
145                 150                 155                 160
aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa cct ctg   528
Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
                165                 170                 175
gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta aga ccc   576
Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro
            180                 185                 190
agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta aag gga   624
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
        195                 200                 205
tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca acc att   672
Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile
    210                 215                 220
gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tgt caa agc atc atc tca   720
Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser
225                 230                 235                 240
aca cta act                                                       729
Thr Leu Thr
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<212>PRT
<213>人工序列
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Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp
             20                  25                  30
Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala
         35                  40                  45
Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu
     50                  55                  60
Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp
                 85                  90                  95
Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp Ala Pro
            100                 105                 110
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Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro
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Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala
145                 150                 155                 160
Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu
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Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly
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Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
  1               5                  10                  15
tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag aat ccc aaa ctc   96
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             20                  25                  30
acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag aag gcc aca gaa   144
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
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    130                 135                 140
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Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg
145                 150                 155                 160
gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aat ggg gag cag gag   528
Asp Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu
                165                 170                 175
gct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag   576
Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu
            180                 185                 190
gag gag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gag gag ggt gga gat gaa gat   624
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp
        195                 200                 205
gag gaa gct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag   672
Glu Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu
    210                 215                 220
gat gac gat gtc gat acc aag aag cag aag acc gac gag gat gac gca   720
Asp Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp Ala
225                 230                 235                 240
cct act tca                                                       729
Pro Thr Ser
<210>4
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp
  1               5                  10                  15
Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu
             20                  25                  30
Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu
         35                  40                  45
Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu
     50                  55                  60
Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp
 65                  70                  75                  80
Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu
                 85                  90                  95
Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu
            100                 105                 110
Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
        115                 120                 125
Thr Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys
    130                 135                 140
Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg
145                 150                 155                 160
Asp Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu
                165                 170                 175
Ala Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp
        195                 200                 205
Glu Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu
    210                 215                 220
Asp Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp Ala
225                 230                 235                 240
Pro Thr Ser
<210>5
<211>750
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<400>5
atg tca gac gca gcc gta gac acc agc tcc gaa atc acc acc aag gac   48
Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp
  1               5                  10                  15
tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat gga aga gac   96
Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp
             20                  25                  30
gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aat ggg gag cag gag gct   144
Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala
         35                  40                  45
gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag   192
Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu
     50                  55                  60
gag gaa gaa gaa ggt gat ggt gag gag gag ggt gga gat gaa gat gag   240
Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu
 65                  70                  75                  80
gaa gct gag tca gct acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat   288
Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp
                 85                  90                  95
gac gat gtc gat acc aag aag cag aag acc gac gag gat gac tcg ggt   336
Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp Ser Gly
            100                 105                 110
ggc ggt ggc tct gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta   384
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
        115                 120                 125
caa ctg gag cat tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att   432
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
    130                 135                 140
aat aat tac aag aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt   480
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
145                 150                 155                 160
tac atg ccc aag aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa   528
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
                165                 170                 175
gaa gaa ctc aaa cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa   576
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
            180                 185                 190
aac ttt cac tta aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata   624
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
        195                 200                 205
gtt ctg gaa cta aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct   672
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
    210                 215                 220
gat gag aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt   720
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
225                 230                235                  240
tgt caa agc atc atc tca aca cta act taa                           750
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
                245
<210>6
<211>249
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp
  1               5                  10                  15
Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp
             20                  25                  30
Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala
         35                  40                  45
Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu
     50                  55                  60
Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp
                 85                  90                  95
Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp Ser Gly
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
        115                 120                 125
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
    130                 135                 140
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
                165                 170                 175
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
            180                 185                 190
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
        195                 200                 205
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
    210                 215                 220
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
225                 230                 235                 240
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
                245
<210>7
<211>747
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<400>7
gca cct act tca agt tct aca aag aaa aca cag cta caa ctg gag cat   48
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
  1               5                  10                  15
tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att aat aat tac aag   96
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
aat ccc aaa ctc acc agg atg ctc aca ttt aag ttt tac atg ccc aag   144
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
aag gcc aca gaa ctg aaa cat ctt cag tgt cta gaa gaa gaa ctc aaa   192
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
cct ctg gag gaa gtg cta aat tta gct caa agc aaa aac ttt cac tta   240
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
aga ccc agg gac tta atc agc aat atc aac gta ata gtt ctg gaa cta   288
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
aag gga tct gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gct gat gag aca gca   336
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt tgt caa agc atc   384
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
atc tca aca cta act tcg ggt ggc ggt ggc tct atg tca gac gca gcc   432
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asp Ala Ala
    130                 135                 140
gta gac acc agc tcc gaa atc acc acc aag gac tta aag gag aag aag   480
Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys
145                 150                 155                 160
gaa gtt gtg gaa gag gca gaa aat gga aga gac gcc cct gct aac ggg   528
Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala Asn Gly
                165                 170                 175
aat gct aat gag gaa aat ggg gag cag gag gct gac aat gag gta gac   576
Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp
            180                 185                 190
gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag gag gaa gaa gaa ggt   624
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly
        195                 200                 205
gat ggt gag gag gag ggt gga gat gaa gat gag gaa gct gag tca gct   672
Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ser Ala
    210                 215                 220
acg ggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gat gtc gat acc   720
Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Val Asp Thr
225                 230                 235                 240
aag aag cag aag acc gac gag gat gac                               747
Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp
                245
<210>8
<211>249
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
  1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
             20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
         35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
     50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
 65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                 85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Asp Ala Ala
    130                 135                 140
Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys
145                 150                 155                 160
Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp Ala Pro Ala Asn Gly
                165                 170                 175
Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala Asp Asn Glu Val Asp
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly
        195                 200                 205
Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu Glu Ala Glu Ser Ala
    210                 215                 220
Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Val Asp Thr
225                 230                 235                 240
Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp
                245

Claims (10)

1、一种重组人α胸腺素原-白介素2基因，其核苷酸序列如序列表中序列号5所示。
2、权利要求1所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因，其特征在于从N端到C端，可按α胸腺素原-白介素2或白介素2-α胸腺素原排列。
3、权利要求2所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因，其特征在于编码白介素-2基因序列的第3个半胱氨酸密码子可替换为其它保守氨基酸密码子。
4、权利要求3所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因，其特征在于编码白介素-2基因序列的第3个半胱氨酸密码子可替换为丝氨酸密码子。
5、权利要求2所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因，其特征在于该基因序列内还含有连接子。
6、权利要求5所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因，其特征在于所述的连接子序列为5’TCGGGTGGCGGTGGCTCT 3’。
7、权利要求2所述的基因在制备治疗病毒性感染疾病、抗肿瘤及其他免疫缺陷性疾病药物中的应用。
8、一种表达载体pProTM/IL-2，其特征在于含有权利要求2所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因。
9、权利要求8所述的表达载体在制备基因治疗药物中的应用。
10、一种融合蛋白，其特征在于由权利要求2所述的重组人α胸腺素原-白介素2基因表达所得，其编码的氨基酸序列如序列表中序列号6所示。
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