CN103230586B - 重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用,涉及重组人胸腺素alpha原蛋白。将重组胸腺素alpha原应用于伤口创面,动物和体外实验结果显示,胸腺素alpha原能够促进正常小鼠伤口愈合,糖尿病小鼠伤口愈合。体外培养人脐带静脉血管内皮细胞划线后,添加胸腺素alpha原能够显著促进划线的愈合。胸腺素alpha原应用于伤口愈合尤其是糖尿病伤口愈合药物用途有重要意义。胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。胸腺素α原通过降低MMP-9和TIMP-1水平,从而降低MMP-9/TIMP-1比值。胸腺素α原通过增加胶原纤维表达水平达到促进伤口愈合作用。
Description
技术领域
本发明涉及重组人胸腺素alpha原蛋白,尤其是涉及重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用。
技术背景
1984年,Haritos等从大鼠胸腺分离出一种含有111个氨基酸残基的多肽,由于其N端含已发现的所有胸腺素α原家族成员的序列,因此命名为胸腺素α原。胸腺素alpha原有明显的中心酸性区和亲核序列。胸腺素alpha原具有广泛的生物学活性,在细胞增殖、免疫调控和生殖活性等多方面起重要作用[1.曹俊霞,金礼吉,王梅,等.胸腺素α原研究进展[J].细胞生物学杂志2003,25(1):21-25.]。作为一类有效的免疫增强药物,胸腺素alpha原对各种免疫缺陷病毒、病毒感染以及肿瘤都具有一定的作用,可用于治疗乙型、丙型肝炎和其他病毒性疾病,并可作一些肿瘤早期诊断的生物标签用于辅助治疗[2.张俊彦,龚兴国.胸腺素原α的分子结构与作用机制研究进展[J].医学分子生物学杂志2004,1(3):186-189.]。有文献报道,应用胸腺素alpha原治疗乙肝的疗效比IFN更具耐受性[3.Andreone,P.A.randomized controlled trial of thymosin-alpha1versus interferon alfa treatmentin patients with hepatitis B eantigen antibody--and hepatitis B virus DNA-positivechronichepatitis B[J].Hepatology,1996,24(4):774-777.];对于慢性丙型肝炎患者,联合应用胸腺素alpha原和IFN-α疗效优于单独应用IFN[4.Sherman,K.E.Combinationtherapy with thymosin alpha1and in-terferon for the treatment of chronic hepatitisC infection:arandomized,placebo-controlled double-blind trial[J].Hepatology,1998,27(4):1128-1135.]。
细胞外基质(extracellμlar matrixc,ECM)的过度沉积或降解将导致创面修复异常,在ECM合成和降解的代谢平衡中MMPs/TIMPs两个酶系统起着重要作用。两者的平衡对伤口的愈合起至关重要的作用。
本申请人在中国专利200810072084.4中公开一种重组蛋白在制备预防糖尿病口服药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供重组人胸腺素alpha原蛋白在制备伤口愈合药物中的应用。
本发明将重组胸腺素alpha原应用于伤口创面,动物和体外实验结果显示,胸腺素alpha原能够促进正常小鼠伤口愈合,糖尿病小鼠伤口愈合。体外培养人脐带静脉血管内皮细胞划线后,添加胸腺素alpha原能够显著促进划线的愈合。实验结果为胸腺素alpha原应用于伤口愈合尤其是糖尿病伤口愈合药物用途有重要意义。
所述胸腺素α原为重组人胸腺素α原和提取的胸腺素α原。
所述胸腺素α原通过降低MMP-9和TIMP-1水平,从而降低MMP-9/TIMP-1比值。
所述胸腺素α原通过增加胶原纤维表达水平达到促进伤口愈合作用。
所述胸腺素α原体外对正常细胞的生长有促进作用。
药效学动物实验:
1.病理切片结果:
1).对正常小鼠伤口愈合作用:用自制圆形模具制作直径为1.2cm的圆形伤口(深及浅筋膜),随机将正常27只小鼠分为两个ProTa处理组和一个对照组。处理组分别用60μg/ml、120μg/ml的ProTa滴入伤口区,对照组用灭菌过的PBS滴入,每只25μl/次/天。每组分别于用药3、6、9d后测量伤口大小并颈椎脱臼处死3只,取伤口处皮肤用于RNA提取及后续半定量PCR检测。
HE结果证明,ProTa能够明显促进正常小鼠伤口愈合率,并且具有量效关系,其中120μg/ml剂量效果最明显。差异显著(P<0.05)
2).对糖尿病小鼠伤口愈合作用:应用STZ诱导的糖尿病小鼠模型成功后按以上制备伤口模型和药物处理,其中药物只用效果最佳的120μg/ml组。HE实验结果同样证明ProTa能够明显促进正常小鼠伤口愈合率。差异显著(P<0.05)。Masson染色还发现ProTa能够明显提高伤口处新生胶原纤维的含量,从另一个途径证明ProTa对伤口愈合有作用的机制。
2.ProTa对MMP9/TIMP-1表达水平的影响:对正常小鼠和糖尿病小鼠伤口皮肤材料的半定量PCR分析。结果显示,ProTa能够降低MMP9的表达量,同时升高TIMP-1的表达水平。总体降低了MMP9/TIMP-1的比值,从基因水平进一步揭示了ProTa促进伤口愈合的重要作用机理。
3.ProTa体外对人脐带静脉内皮细胞划线愈合速度的影响:通过原代培养的第三代人脐带静脉内皮细胞划线实验证明,ProTa能够明显促进划线部位两倍细胞的增长,显著缩短划线部位细胞愈合的时间。以胸腺素a1和重组人表皮因子(rh-EGF)作为比较发现,ProTa效果最明显。
以上实验结果证明,ProTa能够通过降低MMP9水平,提高TIMP-1水平,总体降低了MMP9/TIMP-1的比值的途径,在促进伤口愈合,减少感染,促进损伤组织的修复方面具有重要的生物学功能。因此,ProTa能够用于制备各种伤口,包括正常人伤口(皮肤伤口和眼睛伤口)和糖尿病病人伤口的药物。
附图说明
图1为不同浓度的胸腺素alpha原对小鼠皮肤伤口愈合效果的影响。在图1中,横坐标代表时间(天);纵坐标代表愈合率(%);60μg/ml胸腺素alpha原,120μg/ml胸腺素alpha原,PBS treated分别代表不同浓度胸腺素alpha原处理组和PBS处理组;*,**,分别代表差异显著和极显著,a为120ug/ml ProTa Treated,b为60ug/ml ProTa Treated,c为PBCControl。
图2为不同组伤口处理后皮肤组织切片情况(HE染色)(E代表实验用药组;F代表对照组)。图中英文reconstitute epidermis重建的上皮;subsidiary organs附属器官。
图3为胸腺素alpha原对MMP-9/TIMP-1比值的影响。横坐标代表损伤时间(天),纵坐标代表MMP9/TIMP1比值。
图4为胸腺素alpha原对糖尿病小鼠伤口愈合作用(伤口照片)。第一排代表正常小鼠皮肤伤口愈合情况;第二排代表糖尿病小鼠伤口经过胸腺素alpha原处理后愈合情况;第三排代表糖尿病小鼠伤口非处理组愈合情况。A,0天;B,2天;C,4天;D,6天;E,8天;F,10天。
图5为胸腺素alpha原对糖尿病小鼠伤口愈合作用组织切片图(HE染色)。C,实验用药组;D,对照组。
图6为胸腺素alpha原对糖尿病小鼠伤口组织的胶原纤维水平的影响(Masson染色结果)。G,实验用药组;H,对照组。
图7为胸腺素alpha原体外对人脐带内皮细胞增殖的影响。第一排为0h划线细胞生长情况图;第二排5h划线细胞生长情况图;第三排10h划线细胞生长情况图;第四排为20h划线细胞生长情况图;A代表PBS对照组,B代表30用药组;C代表90用药组;D代表120用药组。
图8为胸腺素alpha原与Tα1及rh-EGF体外对人脐带内皮细胞增殖效果比较。第一排为0h划线细胞生长情况图;第二排10h划线细胞生长情况图;第三排15h划线细胞生长情况图.A代表胸腺素alpha原,B代表rh-EGF,C代表Tα1.A+B代表胸腺素alpha原+rh-EGF;A+C代表胸腺素alpha原+Tα1。
具体实施方式
具体步骤如下:
1.动物伤口模型制备:昆明小鼠动物房内适应性饲养一周后开始进行实验。小鼠脱毛后用75%酒精对欲制作伤口区进行消毒处理。用自制圆形模具制作直径为1.2cm的圆形伤口(深及浅筋膜),创面自然止血。伤口制作后将小鼠放于无垫料的鼠笼中,每笼单只饲养,禁食禁水过夜,于第二天才给予标准饲料和饮水。随机将27只小鼠分为两个ProTa处理组和一个对照组。处理组分别用60μg/ml、120μg/ml的ProTa滴入伤口区,对照组用灭菌过的PBS滴入,每只25μl/次/天。每组分别于用药3、6、9d后测量伤口大小并颈椎脱臼处死3只,取伤口处皮肤用于下一步RNA的提取及RT-PCR实验,分析转录水平的差异。结果见图1,图2,图3.从图1中可以看出,用药组小鼠伤口愈合率明显比PBS对照组伤口愈合率高,差异显著(P<0.05)。从图2的HE染色结果同样可以看出,用药组伤口组织生长情况,附属组织包括毛囊血管等数量明显比PBS对照组好。从图3可以看出,用药组对MMP9/TIMP1比值有明显影响,能够明显降低这一比值,从转录水平揭示ProTa对伤口愈合的作用机理。
2.伤口愈合率测量及数据处理:分别于小鼠伤口制作后(即0d)到处死前隔天观察伤口的形态变化,同时于0,3,6,9d测量小鼠的伤口面积。本实验采用数码相机联合计算机软件分析法测量伤口面积。所得图片用Image J医学图像分析软件结合Excel2000按照以下公式计算伤口愈合率:(初始面积-残留面积)/初始面积×100%。每个伤口重复测量三次,其平均值作为最终的伤口面积。将实验所得到的数据用Excel、Graphpad Prim5软件进行统计学分析并作图。实验数据符合正态分布者用均数±标准差表示,正态数据两组间比较采用Student’s T检验;P<0.05为显著性差异,P<0.01,P<0.0001为极显著性差异。
3.ProTa促进糖尿病小鼠皮肤愈合的实验:应用Streptozotoxin(STZ)制备糖尿病小鼠,糖尿病小鼠模型的建立:选用25g左右清洁级昆明小鼠随机分为PBS对照组、120μg/ml ProTa处理组。STZ(以无菌0.01mol/L枸橼酸一枸橼酸钠缓冲液在冰浴中新鲜配制,PH4.5)注射前基础随机血糖小于6.7mmol/L,适应性饲养1周后,小鼠禁食24h后再给予40mg/kg腹腔注射STZ,连续5d注射以诱导糖尿病,注射5d后尾静脉采血检测随机血糖水平,注射后随机血糖水平≥11.0mmol/L,视为糖尿病模型建立成功。两组小鼠实验期间自由进食、饮水,每隔5天监测体重和血糖,重复6次,如果血糖值≥11.0mmol/L即说明糖尿病模型制作成功。
用自制圆形模具制作直径为1.2cm的圆形伤口(深及浅筋膜),创面自然止血。伤口制作后将小鼠放于无垫料的鼠笼中,每笼单只饲养,禁食禁水过夜,于第二天才给予标准饲料和饮水。120μg/ml ProTa处理组用120μg/ml的ProTa滴入伤口区,PBS对照组用灭菌过的PBS滴入,每只25μl/次/天。每组分别于用药2、4、6、8、10d后测量伤口大小,实验结束,颈椎脱臼处死动物。皮肤伤口用于HE染色。结果见图4,图5.从图4可以看出,正常小鼠伤口愈合速度最快,好于糖尿病小鼠伤口;而糖尿病小鼠的两组中用药组,即120μg/ml ProTa处理组明显比PBS对照组愈合效果好。图5的HE切片结果同样可以发现,用药组伤口填补的速度明显比对照组要好。
4.皮肤组织HE染色,实验步骤为:
1)取将上述1,3实验处理的伤口切下后,放入4%多聚甲醛中固定约24h;
2)将皮肤组织依次放入70%、80%、95%、100%乙醇逐级脱水,每级45min;
3)置于二甲苯中,透明20min,并重复1次;
4)置于液体石蜡中,在60℃烘箱中透蜡1h,重复3次;
5)使用石蜡包埋机包埋;
6)使用石蜡切片机进行石蜡切片,切片厚度为5μm;
7)将石蜡切片依次放入二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水中各5min,进行脱蜡复水;
8)将切片放入苏木精染液中,染色4min;
9)用自来水水冲洗切片1min;
10)将切片放入伊红染液中,染色3min;
11)用自来水水冲洗切片1min;
12)将切片依次放入70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯中各1min,进行脱水;
13)将切片从二甲苯中取出立即滴加适量中性树胶封片;
14)显微镜观察切片并拍照。
5.Masson三色染色法其实验步骤为:
1)将部分实验3的伤口组织通过常规HE染色的组织切片过程后,切片脱蜡经过系列酒精复水。
2)Harris’s苏木素染胞核10min,水洗;
3)入Masson复合染色液染色10-20min,0.2%醋酸速洗1-2s两次,1%磷钼酸处理5-8min,不用水洗直接染亮绿,1%亮绿SF染色2-4min;
4)用新鲜95%乙醇分化20-30s,脱水、透明、封片。
实验结果为:胶原纤维,粘液、软骨呈绿色或蓝色,胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质纤维呈红色,胞核呈兰黑色,红细胞呈橘红色。结果见图6,从图6中可以看出,用药组蓝色成分明显比对照组深,面积大,说明,用药组能够明显提高胶原纤维的含量,对伤口的有效愈合有促进作用。
6.ProTa促进人脐带静脉内皮细胞增殖的实验:
通过原代培养的第三代人脐带静脉内皮细胞用灭菌枪头划线,形成一条无细胞的沟痕,分成四组,A:空白对照组,加PBS;B:加ProTa30/mL;C:加ProTa90/mL;D:加ProTa120/mL。第一排0h划线细胞生长情况;第二排5h划线细胞生长情况图;第三排10h划线细胞生长情况图;第四排为20h划线细胞生长情况图。二氧化碳培养箱中培养,每两h在显微镜观察细胞生长情况及划线位置细胞生长情况。显微拍照。结果见图7,从图7中可以看出,第一排0h划线细胞生长情况各组没有明显差别;第二排,第三排高浓度的D组细胞明显增殖快,而A和B,C差别不明显.第四排开始,高浓度的D组明显比其他三组细胞增殖快,并且划线部位已经填忙满了细胞,C组与A,B组也有明显差别,划线部位只剩下小缝隙。而A,B两组到20h仍然有明显的缝隙.说明ProTa能够促进细胞分裂和转移,并且有量效关系。
7.胸腺素alpha原与Tα1及rh-EGF体外对人脐带内皮细胞增殖效果比较实验:
通过原代培养的第三代人脐带静脉内皮细胞用灭菌枪头划线,形成一条无细胞的沟痕,分成六组,对照组:空白对照组,加PBS;A:加ProTa120/mL;B:加rh-EGF120/mL;C:加Tα1120/mL。A+B:胸腺素alpha原+rh-EGF(各120/mL);A+C:胸腺素alpha原+Tα1(120/mL).二氧化碳培养箱中培养,每两h在显微镜观察细胞生长情况及划线位置细胞生长情况。显微拍照结果见图8,从图8中可以明显看出,实验开始后12hProTa120/mL组明显划线部位比其他各组窄,ProTa+Ta1和ProTa+rh-EGF其次。而Ta1组和rh-EGF与空白组没有明显差别。说明ProTa120/mL组细胞生长明显比其他各组快,15h后,ProTa120/mL高剂量组的划线部位已经长满了细胞,而对照组划线部位还有一条明显的沟壑。以上实验从体外证实ProTa能够明显加速细胞的增值生长。并且效果比EGF及Ta1效果明显好。而ProTa与EGF及Ta1组合则明显比单独使用EGF及Ta1效果要好。
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