CN104248644A - 一种促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂及其制备方法。本发明成功制备了温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂,并将其用于糖尿病鼠皮肤创伤的修复,结果显示该复合制剂能够抑制糖尿病鼠皮肤创面炎症反应、促进创伤快速愈合。本发明为临床糖尿病皮肤创伤以及其他慢性皮肤溃疡等重症皮肤损伤的治疗提供了重要的用药参考。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,特别涉及一种促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂及其制备方法。
背景技术
糖尿病是以持续的高血糖为特征的慢性代谢性疾病。糖尿病对患者最大的威胁来自其并发症,如视网膜病变、糖尿病性肾病、神经病变和创面难愈等。其中糖尿病难愈创面的修复及皮肤自发溃疡的治疗不仅困扰着临床医生,也是医学界面临的重大难题。糖尿病的并发症已成为糖尿病患者致残和致死的主要原因,也是医疗费用增加的主要因素。近年来,针对糖尿病皮肤创面难愈的机制提出许多新的学说和观点,主要集中在以下几个方面:1.代谢紊乱及晚期糖基化终末产物增多;2.微血管的改变;3.基质金属蛋白酶的表达异常;4.表皮生长因子受体的改变;5.表皮细胞增殖障碍。
虽然传统的皮肤创伤修复材料对普通的皮肤创伤有很好的治疗作用,但是对于糖尿病皮肤溃疡等重症皮肤创伤治疗作用不大,一方面是因为糖尿病皮肤创伤会有持续的炎症反应,普通的创伤修复材料没有能够很好的抑制炎症反应。另一方面,在选用细胞联合生物材料治疗重症皮肤创伤时,一般选择自体的角朊细胞和成纤维细胞,但是自体的角朊细胞和成纤维细胞的培养周期较长,不能及时做皮肤移植,增加了患者的住院时间和花费,同时也增加了感染的风险。
近年来,随着组织工程学研究的不断深入,干细胞受到前所未有的重视,特别是来源于骨髓的骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs),由于其具有向各种组织相比分化的巨大潜能,且免疫原性小,所以骨髓间充质干细胞的应用为糖尿病溃疡的愈合提供了可能。BMSCs起源于中胚层,具有较强的自我更新和多向分化的潜能,经过适当的诱导分化可以向成骨、肌腱、神经细胞、皮肤细胞等不同的组织细胞分化。在机体的组织损伤修复过程中,BMSCs在损伤组织的特殊信号作用下迁移至损伤部位,在局部增殖,并依据不同的损伤信息分化为不同的功能性细胞。移植迁移到组织损伤部位的BMSCs通过两种功能发挥其组织损伤的修复作用:一是在局部微环境作用下,定向分化为特定类型的功能性细胞,例如:表皮细胞,成纤维细胞,血管内皮细胞,巨噬细胞等,直接参与组织修复;二是通过分泌多种生长因子等活性物质,例如:EGF,FGF,VEGF,PDGF等,改善损伤部位的再生微环境,促进组织修复。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种促进糖尿病皮肤溃疡修复的复合制剂及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂,其包含温敏性水凝胶和骨髓间充质干细胞。
优选的,所述温敏性水凝胶由硫酸胍基丁胺、N,N'-双(丙稀酰)胱胺和N-异丙基丙烯酰胺合成。
优选的,所述复合制剂中骨髓间充质干细胞的浓度为1×105~1×107个/mL。
更优选的,所述骨髓间充质干细胞的浓度为1×106~1×107个/mL。
优选的,所述骨髓充质干细胞为第3~6代细胞。
上述促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂的制备方法,包括如下步骤:
当传代培养的骨髓充质干细胞长至60%~80%时,更换成无血清的DMEM培养基中培养6~12h,加入胰蛋白酶进行消化,然后收集细胞,离心后,将其与温敏性水凝胶混合均匀,得到温敏性水凝胶-骨髓充质干细胞复合制剂。
本发明的有益效果是:
本发明成功制备了温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂,并将其用于糖尿病鼠皮肤创伤的修复,结果显示该复合制剂能够抑制糖尿病鼠皮肤创面炎症反应、促进创伤快速愈合。本发明为临床糖尿病皮肤创伤以及其他慢性皮肤溃疡等重症皮肤损伤的治疗提供了重要的用药参考。
附图说明
图1为糖尿病鼠皮肤创伤愈合情况;
图2为糖尿病鼠皮肤创伤愈合期间巨噬细胞免疫组化染色的结果。
具体实施方式
本发明所用温敏性水凝胶由加拿大曼尼托巴大学邢梦秋教授提供,该温敏性水凝胶由硫酸胍基丁胺、N,N'-双(丙稀酰)胱胺和N-异丙基丙烯酰胺合成。
糖尿病皮肤溃疡创面存在持续低水平的慢性炎症反应,这种慢性炎症反应使得创面的各类生长因子降解或者失去活性,损害了创面修复。在本发明中,我们使用的水凝胶能很好抑制糖尿病皮肤溃疡慢性炎症反应,并且这种水凝胶具有很好的生物兼容性,适合包裹干细胞。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞,并且具有低免疫原性,异体移植不受免疫排除,因此BMSCs可以作为治疗糖尿病皮肤创伤等重症皮肤创伤理想的细胞来源。本发明选择上述能够抑制糖尿病皮肤创伤炎症反应的生物材料—水凝胶,再利用BMSCs的优势,成功制备了温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂,联合治疗糖尿病皮肤创伤等重症皮肤创伤。
下面结合实施例,进一步阐述本发明。
实施例1
BMSCs细胞的分离、培养:
选择8周龄健康雄性C57BL/6小鼠(购自南方医科大学动物实验中心),脱臼处死后,用75%乙醇浸泡5min;无菌条件下取出股骨、胫骨,用灭菌PBS缓冲液冲洗;剪断骨两端,暴露骨髓腔,用1ml 注射器抽取培养液(含有10v/v%胎牛血清,1 v/v%双抗,1 v/v%谷氨酰胺的DMEM)注入骨髓腔,冲出骨髓,反复冲洗3~5次,至骨髓腔发白;将含骨髓细胞的培养液移入离心管,1000rpm离心5min,弃上清液,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养基重悬细胞,移入培养皿,放入37℃、5%CO2培养箱孵育,进行原代培养;48h后首次换液,以后每3~4d换液,6~7d铺满瓶底90%时进行传代培养。取第3~6代BMSCs应用。
实施例2
温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂1#的制备:
待第3代BMSCs长至80%后,更换成无血清的DMEM培养基,37℃、5%CO2培养箱中培养6h后,用0.25%胰酶消化,离心,弃上清液,用DHanks液重悬并计数,离心收集细胞沉淀,根据细胞计数结果,加入温敏性水凝胶,混合均匀,制成细胞终浓度为1×105个/ml的复合生物制剂备用。
实施例3
温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂2#的制备:
待第6代BMSCs长至60%后,更换成无血清的DMEM培养基,37℃、5%CO2培养箱中培养12h后,用0.25%胰酶消化,离心,弃上清液,用DHanks液重悬并计数,离心收集细胞沉淀,根据细胞计数结果,加入温敏性水凝胶,混合均匀,制成细胞终浓度为1×107个/ml的复合生物制剂备用。
实施例4
温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂3#的制备:
待第4代BMSCs长至70%后,更换成无血清的DMEM培养基,37℃、5%CO2培养箱中培养8h后,用0.25%胰酶消化,离心,弃上清液,用DHanks液重悬并计数,离心收集细胞沉淀,根据细胞计数结果,加入温敏性水凝胶,混合均匀,制成细胞终浓度为3.5×106个/ml的复合生物制剂备用。
实施例5
温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂促进糖尿病皮肤创伤修复的小鼠试验:
1)从南京大学模式动物中心购买36只C57BKS.Cg-m+/+ Leprdb 基因型Ⅱ型糖尿病小鼠。
2)皮肤损伤模型的建立:先用脱毛膏将小鼠背部双侧毛发脱除,再用皮肤打孔器在双侧做8mm的圆形全层皮肤切除伤口。
3)试验分组和给药方法:取皮肤损伤模型的小鼠36只,按体重随机分为3组:对照组(12只,不加任何处理),水凝胶组(12只,伤口处涂附水凝胶),水凝胶+BMSCs复合生物制剂组(12只,伤口处涂附由实施例4制备的温敏性水凝胶-BMSCs复合制剂3#)。给药方式为外敷,创伤模型制备完成后立即敷药。
4)观察创面变化:给药后每天观察创口愈合的情况,并近距离对小鼠溃疡面进行拍照,采用Image-Pro Plus 6.0软件测定溃疡创面未愈合面积。
5)免疫组织化学染色:5μm石蜡切片,二甲苯脱蜡,复水,0.1M柠檬酸缓冲溶液 (pH 6.0) 抗原修复;将石蜡切片放入10% H2O2中浸泡10min,灭活内源性酶;用5%BSA封闭2h,4℃过夜孵育一抗,PBS清洗后,兔抗大鼠(博士德)二抗孵育2h,PBS清洗,Sabc反应20min,用DAB显色试剂盒显色,苏木精复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片。利用Image-pro plus软件统计F4/80阳性细胞数量,每个组每个时间点随机选取5个视野,统计单位面积内阳性细胞数。
结果:
所有试验小鼠均存活至试验完成。
糖尿病小鼠皮肤创伤愈合情况如图1所示,其中,A图为愈合期间对糖尿病小鼠溃疡面所拍的照片,B图为创伤早期各组伤口剩余面积的比较。结果发现术后第5 天水凝胶联合BMSCs组伤口收缩较对照组和水凝胶组明显,尤其是术后第7天水凝胶联合BMSCs组伤口平均未愈合面积仅为24.6±4.21%,而对照组和水凝胶组分别为 79.54±5.92%和66.5±6.67%。
糖尿病小鼠皮肤创伤愈合期间巨噬细胞免疫组化染色的结果如图2所示,其中,A图为创伤早期观察巨噬细胞免疫组化染色的结果,B图为巨噬细胞的统计结果。如图2所示,创伤后5d,在对照组伤口部位的脂肪层中检测到大量的F4/80阳性细胞,并在第7天的时候有所下降。与对照组相比,创伤后第5、7天,水凝胶组和水凝胶+BMSCs组伤口部位脂肪层中的巨噬细胞数量显著下降。这说明我们设计的水凝胶能够有效的抑制创面的慢性炎症反应。
发明人使用一种新的可抑制糖尿病鼠皮肤溃疡创面慢性炎症反应的温敏性水凝胶,成功制备了温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂,将其用于修复糖尿病鼠皮肤创伤。结果显示单纯温敏性水凝胶具有抑制炎症、促进创面愈合的作用,但温敏性水凝胶-BMSCs复合生物制剂促进糖尿病鼠皮肤创面愈合作用更明显,这可能与BMSCs分泌生长因子,分化成效应细胞参与创伤愈合有关。本发明为临床糖尿病皮肤创伤以及其他慢性皮肤溃疡等重症皮肤损伤的治疗提供了重要的用药参考。
Claims (6)
1.一种促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂,其包含温敏性水凝胶和骨髓间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的复合制剂,其特征在于:所述温敏性水凝胶由硫酸胍基丁胺、N,N'-双(丙稀酰)胱胺和N-异丙基丙烯酰胺合成。
3.根据权利要求1所述的复合制剂,其特征在于:所述复合制剂中骨髓间充质干细胞的浓度为1×105~1×107个/mL。
4.根据权利要求3所述的复合制剂,其特征在于:所述骨髓间充质干细胞的浓度为1×106~1×107个/mL。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的复合制剂,其特征在于:所述骨髓充质干细胞为第3~6代细胞。
6.一种权利要求1~5任意一项所述的促进糖尿病皮肤创伤修复的复合制剂的制备方法,包括如下步骤:
当传代培养的骨髓充质干细胞长至60%~80%时,更换成无血清的DMEM培养基中培养6~12h,加入胰蛋白酶进行消化,然后收集细胞,离心后,将其与温敏性水凝胶混合均匀,得到温敏性水凝胶-骨髓充质干细胞复合制剂。
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