CN103736080B - 用于伤口愈合的制剂、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于伤口愈合的制剂、制备方法及其用途，该用于伤口愈合的制剂，包括培养过人脂肪干细胞的细胞培养液。该用于伤口愈合的制剂富含多种营养因子包括bFGF、VEGF、TGF-β、GM-CSF、HGF、PDGF、IL2和IL10等，该用于伤口愈合的制剂在创伤修复中起到良好的作用。

Description

用于伤口愈合的制剂、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及伤口愈合制剂。

背景技术

皮肤创伤是人们在日常生活中经常碰到的伤害，特别是达到全皮层损害的创伤，皮肤愈合过程慢，处理不当还会发生感染、溃烂而经久不愈。当表皮受到大面积损伤或皮肤损伤深到使真皮层受损，就使得损伤部位的皮肤不能再生，大量的纤维细胞、胶原以及增生的血管生长出来，就形成了瘢痕。各种原因造成的深度皮肤挫伤、擦伤，外科手术、妇科手术、美容整形手术的伤口在愈合过程中都容易形成瘢痕，给人们带来极大的忧虑和烦恼。如何在加快伤口愈合的，一直是医学科研人员试图解决的难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种富含丰富的营养因子帮助加速伤口愈合并且不留瘢痕和色素沉着的混合物和制法。

本发明提供了培养过人脂肪干细胞的培养液，其用于作为伤口愈合的药物的新用途。

根据本发明的一个方面，提供了用于伤口愈合的制剂，包括培养过人脂肪干细胞的细胞培养液。由于富含多种营养因子有利于伤口愈合。

根据本发明的一个方面，所使用的细胞培养液为无血清培养基。由于不含血清可以方便于使用，避免了血清中可能的有害物质。

根据本发明的一个方面，无血清培养基由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成。由此提供了一种可以培养人脂肪干细胞的无血清培养液。

根据本发明的一个方面，伤口愈合的制剂还包括地塞米松磷酸钠、硫酸庆大霉素、盐酸达克罗宁、克霉唑。

盐酸达克罗宁能阻断各种神经冲动或刺激的传导，抑制触觉和痛觉，在本方中起着对创伤部位有止痛作用，继而在愈合和结痂过程中起到止痒作用，避免患者因抓痒造成继发感染。

硫酸庆大霉素为氨基糖苷类广谱抗生素，对各种革兰阴性细菌及革兰阳性细菌都有良好抗菌作用。在本方中用于伤口强力杀菌，预防感染。

地塞米松磷酸钠是肾上腺皮质激素类药，能够抑制炎症细胞，包括巨噬细胞和白细胞在创伤部位的集聚，减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。在本方中起到与抗菌素抗感染的协同作用，增强本发明消除炎症，减轻水肿，从而利于加速愈合的作用，同时增强局部新生皮肤组织代谢活动，清除代谢产物中的色素。

克霉唑具广谱抗真菌作用，可杀灭浅表真菌及某些深部真菌，在本方中起着杀灭霉菌，预防霉菌感染的作用。

根据本发明的一个方面，其中地塞米松磷酸钠的含量为0.03～0.4g/L、硫酸庆大霉素的含量为64～160万U/L、盐酸达克罗宁的含量为大于0.05g/L、克霉唑的含量为16～30g/L。

地塞米松磷酸钠剂量小促进伤口愈合能力减弱；剂量过大则增加伤口真菌感染风险。

硫酸庆大霉素剂量小影响抗感染能力；剂量过大吸收入血到达内耳，有造成内耳的毒性风险。

盐酸达克罗宁对皮肤有止痛、止痒及杀菌作用，大量使用无副作用，量小影响对损伤部位的麻醉止痛效果。

克霉唑剂量小杀灭霉菌能力减弱，剂量过大皮肤伤口外用后可引发皮疹、皮肤烧灼感等皮肤刺激征象。

根据本发明的一个方面，地塞米松磷酸钠含量为0.4g/L、硫酸庆大霉素含量为160万U/L、盐酸达克罗宁含量为8.5g/L、克霉唑含量为16g/L。此浓度为最佳。

根据本发明的一个方面，伤口愈合的制剂为软膏或液剂。由此可以方便使用。

根据本发明的一个方面，培养过人脂肪干细胞的培养液可以用于伤口愈合的药物。可以取得良好的效果。

根据本发明的另一个方面，用于伤口愈合的制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：取培养过人脂肪干细胞的细胞培养上清液注入到容器中，然后依次加入地塞米松磷酸钠，硫酸庆大霉素，盐酸达克罗宁，克霉唑。

步骤2：将步骤1容器放在磁力搅拌器上，缓慢搅拌至所有加入的成分完全溶解。

步骤3：加入防腐剂。

步骤4：在缓慢搅拌的条件下，缓缓加入脂肪干细胞培养上清液定容，停止搅拌，得到混合溶液。

步骤5：取注射用水，依次加入硬脂酸，白凡士林，十六醇，液体石蜡，丙二醇，充分混匀，再加入注射用水，搅拌均匀呈软膏状。

步骤6：取步骤4制得的混合溶液加入步骤5所制得的膏状物中，充分研合均匀，配制成乳液状。

在无菌条件下对脂肪干细胞使用无血清培养基对人体脂肪干细胞在细胞培养箱中进行孵育，每当干细胞增殖至约80%铺满培养皿时，收取脂肪干细胞进行换代培育，同时收集培养过培养干细胞的培养基分离取清液进行所含激素和各种细胞因子的检测，结果发现其中含有丰富的营养因子，列出如下表：

bFGF的生物学作用十分强烈，是重要的促有丝分裂因子，也是新生皮肤细胞形态发生和分化的诱导因子，能促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生。在皮肤再生的过程中，bFGF能够改善细胞生长的微环境，促进弹性纤维和胶原蛋白的合成，使肌肤富有弹性，使皮肤处于滑嫩的状态。bFGF还能够降低皮肤细胞中黑色素和有色细胞的含量，减轻皮肤色素的沉着。bFGF具有很强的刺激皮肤肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，调节胶原降解及更新，从而缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用。

VEGF是最有效的促血管生长因子，是一种选择性促内皮细胞有丝分裂原，它能增加血管通透能力，促进内皮细胞增殖，并通过受体的结合数量调节血管的发展，促进血管和淋巴管的生成，为皮肤创伤修复过程提供足够的氧气和营养物质，被认为是组织再生的基础。

TGF-β是一种多肽生长因子，其生物功能是影响细胞的增殖、分化，还在胞外基质形成、组织形成和重建等方面起着重要作用。TGF-β还特别在增强细胞的免疫功能起到重要作用。

GM-CSF不仅是一种多潜能的造血生长因子，而且能有效地促进创伤愈合。由于创伤愈合是一个包含免疫以及血管生成的过程，GM-CSF作用于造血祖细胞，促进其增殖、分化，并刺激其向外周血释放，可维持造血祖细胞的存活。近年的研究已表明，内皮祖细胞参与血管新生。因此，GM-CSF通过促进内皮祖细胞的增殖、分化和迁移，促进新生皮肤细胞和组织的生成及发育。

HGF是刺激肝细胞的DNA合成，在肝再生过程中起重要作用一种蛋白激活因子。近年来愈来愈多的报道表明，HGF不只是作用于肝再生，而且对许多组织和细胞的生长、分化起重要调控作用。HGF具有强大的促进内皮细胞增殖作用，作用明显强于bFGF和VEGF。HGF还可通过刺激血管内皮细胞的增殖而促进受伤组织的血管新生。

PDGF是多种细胞的主要有丝分裂刺激原，特别能刺激邻近的结缔组织细胞生长。这些结缔组织细胞是重建受损组织、愈合创口的先锋队。实验表明PDGF在创面愈合的全过程中起重要作用,加强肉芽组织的形成，促进伤口愈合并缩短愈合时间。PDGF还能促进胶原蛋白的合成，使得新生皮肤具有良好的弹性。

IL2和IL10是白细胞介素因子家族的两个重要成员，它们在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用，此外它们还参与机体的多种生理及病理反应，在创伤修复中起到重要作用。

附图说明

图1为本发明培养过脂肪干细胞的培养液上清液促进皮肤伤口愈合的动物实验效果图；

图2本发明效果实验生理盐水对照组皮肤创伤愈合后组织切片图；

图3本发明效果实验培养基对照组皮肤创伤愈合后组织切片图；

图4本发明效果实验伤愈灵治疗组皮肤创伤愈合后组织切片图。

具体实施方式

下面结合附图对发明作进一步详细的说明。

实施例1

步骤1培养过人脂肪干细胞的培养液的获取

将1×10⁶个的脂肪干细胞分别接种到400个含有5ml无血清培养基的直径100mm培养皿中混匀；

无血清培养基组分如下：

高糖型DMEM基础培养基基液（上述成分溶于高糖型DMEM基础培养基,Sigma，D-6546）

每当干细胞增殖至约80%铺满培养皿时，收取脂肪干细胞进行换代培育，同时收集培养干细胞的培养基离心分离取上清液。上清液所含激素和各种细胞因子的检测，结果发现其中含有丰富的营养因子，检测结果列出如下表：

表1

步骤2培养过脂肪干细胞的培养液上清液促进皮肤伤口愈合的动物实验

皮肤创伤模型制备：选取大鼠40只，随机分成4组分别为空白对照组C、培养基对照组B、本发明培养过人脂肪干细胞的培养液组（伤愈灵组）A、无血清培养基组D，每组10只。麻醉大鼠后，将其四肢展平俯卧位固定于板面上，将背部正中左侧1.5cm、尾部向上8cm的区域，共计3cm×8cm的臀背部区域作为手术区。手术区体毛要尽量剪除、剔净，同时避免造成皮肤受伤异常。在备好的皮肤区域用紫药水进行切口标记。切口设计在其臀背部脊柱相距2cm处，分别标出1.5cm×2.0cm大小的矩形创面，然后全背部用酒精反复消毒3次后，用手术刀片去除全真皮，但不损伤肌肉表面的深筋膜，去除组织量使初始创腔容积均达到1ml，以保证每个伤口的初次用药量达到一致。后用止血海绵填塞创腔并充分压迫止血，后为成模动物，如表2。

表2

治疗给药：制作与皮肤创面大小相一致的消毒棉球，每个棉球能饱吸1ml的实验用液体，即生理盐水（空白对照）C、高糖型DMEM培养基（Sigma，D-6546）B、步骤1配方的无血清培养基D以及步骤1方法所制培养过人脂肪干细胞的培养液上清液A，制成治疗棉球分别填充于创腔之中，注意操作时切勿让治疗液被挤压溢出，影响药量。

创面愈合观察：于手术后4、7、14、21、28d，将动物创面大小描印于透明薄膜上，测算其面积，然后计算伤口愈合率。

公式：伤口愈合率（%）=[（原有创面面积-观察时创面面积）/原有创面面积]×100

皮肤病理和创面组织学观察：在7d、14d、21d的每个时间点牺牲2只动物，取创面周围皮肤组织用于组织病理研究，包括组织包埋，切片制作，HE染色和病理观察拍照和半定量评价。评价指标包括：

（1）炎性反应：白细胞浸润。

（2）肉芽组织

（3）胶原纤维束数量和排列（半定量）

（4）表皮细胞分化程度及分层情况

根据病变轻重程度，依次半定量为轻度“+”，中度“++”，重度“+++”。

统计学分析：所有数据均以Mean±SEM表示。对数据进行t检验。

大鼠创伤面积结果见图1（B组与D组线重合，以B组表示）。给药后第4、7天，A组（脂肪干细胞培养液上清液）大鼠平均创伤面积显著性小于培养基组（P<0.01，P<0.05）;给药后第21天，A组大鼠平均创伤面积显著性小于空白对照组（P<0.01）。

2、动物皮肤创面组织学观察

C空白对照组：本组中2例皮肤均可见局部表皮上覆盖痂皮，出血（+），表皮复层鳞状上皮细胞中度变性、坏死、糜烂（++）。真皮层见少量炎细胞浸润（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）。4例皮肤均可见表皮复层鳞状上皮，真皮层见少量炎细胞浸润（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）。生理盐水对照组随机取皮肤创伤愈合后组织切片如图2。

B培养基对照组：本组3例皮肤均可见局部表皮上覆盖痂皮，出血（++），表皮鳞状上皮细胞中度变性、坏死、糜烂（+++），大量炎细胞浸润（+++），真皮层见少量炎细胞浸润（+），毛细血管增生（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）；1例皮肤均可见局部表皮鳞状上皮细胞中度变性、坏死、糜烂（++），中度炎细胞浸润（++）。真皮层见少量炎细胞浸润（+），毛细血管增生（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）；2例皮肤均可见表皮复层鳞状上皮，真皮层见大量炎细胞浸润（++），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）；余6例皮肤均可见表皮复层鳞状上皮，真皮层见少量炎细胞浸润（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）。培养基对照组皮肤创伤愈合后随机取组织切片图如图3。

A伤愈灵组：本组仅1例皮肤均可见局部表皮上覆盖痂皮，表皮鳞状上皮细胞中度变性（++），真皮层见少量炎细胞浸润（+），毛细血管增生（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）；其余各例皮肤均可见表皮复层鳞状上皮组织结构，真皮层见少量炎细胞浸润（+），真皮纤维结缔组织增生（++），皮肤附件明显减少（++）。伤愈灵治疗组皮肤创伤愈合后随机取组织切片图如图4。

D培养基组2：愈合外观情况如同B培养基组故略。

3、结论

A伤愈灵组的大鼠给药后第4、7天，A伤愈灵组的大鼠平均创伤面积显著性小于培养基组B（P<0.01，P<0.05）;给药后第21天，A伤愈灵组的大鼠平均创伤面积显著性小于空白对照组C（P<0.01）。其新生表皮上皮呈正常组织结构，而DMEM培养基组和生理盐水治疗组的创面区皮肤则见细胞变性、坏死、糜烂，表皮炎细胞浸润等病理特征。动物实验充分说明本发明申请的制剂不但能有效促进加速皮肤创伤的愈合，而且新生皮肤呈正常皮肤的组织学特征。

实施例2一种用于伤口愈合的溶液的制备

取实施例1方法所制培养过人脂肪干细胞培养液上清液800mL注入到预置有一枚磁搅拌棒的消毒量筒中（容量1000mL），然后依次加入地塞米松磷酸钠0.4g，硫酸庆大霉素160万U，盐酸达克罗宁8.5g，克霉唑16g。

将量筒放在磁力搅拌器上，缓慢搅拌，不要引起泡沫，至所有加入的成分完全溶解。

加入防腐剂10mL（0.3%的苯氧乙醇溶解于聚山梨醇酯20）

在缓慢搅拌的条件下，缓缓加入瑞思坦公司脂肪干细胞培养上清液至混合液面达到1000mL，停止搅拌，分装成100mL/瓶的包装，置2-8冷藏贮存。

实施例3一种用于伤口愈合的乳膏制备

乳液基质制备：取商售注射用水50mL，依次加入硬脂酸1.5g，白凡士林6.0g，十六醇1.5g，液体石蜡12mL，丙二醇10mL，充分混匀，再加入注射用水至总量为100mL，搅拌均匀呈软膏状。

取例实施例2用于伤口愈合的溶液400mL与上述100mL乳液基质充分研合均匀，配制成乳液状的外用软膏，经灌装、检测，即得成品伤愈灵软膏。

将用于伤口愈合的组合物制成软膏可以很容易被均匀涂抹在外伤创面上，能形成一层保护膏垫，有效隔离外界空气，起到保护创面保湿不干裂，又能保持伤愈灵液不会流失，其有效成分缓缓释入创面，更加强了加速伤口愈合的效力。

取健康成年SD大鼠,190～220g，SPF级，雌雄各半，每只动物臀背部用手术刀切出1.5cmX2.0cm大小的矩形创面，去除全真皮，但不损伤肌肉表面的深筋膜，制成一侧重度皮肤损伤模型。将皮肤损伤动物随机分成两组：“a”组为空白对照组，将饱蘸生理盐水的棉球填充于创腔之中。“b”组为伤愈灵软膏治疗组，将1.0mL的伤愈灵软膏填充于创腔之中，注意操作时切勿让软膏被挤压溢出，影响用药量。2天后，每两天用透明有机玻璃置创面上方，描画其形状，观察创面情况，并将其图形复制到透明玻璃纸上，在图像分析仪上精确测量出创面面积，计算创面愈合速度。实验中主要观察指标为大体观察各组大鼠创面愈合情况及平均愈合时间和速度。实验持续到a组实验动物的伤口完全愈合为止。

实验结果：

（1）各组大鼠创面愈合情况：切割伤后2天时，各组动物的创面大小基本一致，平均为360±42mm²（mean±SD）。伤愈灵软膏治疗组创面边缘整齐无红肿，无明显渗出；空白对照组动物创面炎症明显，创面边缘红肿，创口有液体渗出。第5天时，伤愈灵软膏治疗组创口边缘有大量新生肉芽组织，外周结痂伴中心少量渗出，创口面积明显缩小，随着时间推移，创面迅速愈合；而空白对照组动物创面外周结痂，中心红肿，伴渗出，愈合进程缓慢。

（2）各组大鼠创面愈合时间：伤愈灵软膏治疗组创面平均愈合时间为11.45±0.22天；空白对照组创面平均愈合时间为25.31±2.36天，统计学t检验，p<0.01。伤愈灵软膏治疗组创面的愈合时间明显快于空白对照组，具有显著的统计学差异。

（3）各组大鼠创面愈合速度:伤愈灵软膏治疗组创面平均愈合速度为33.53±0.19mm²/d；空白对照组创面平均愈合速度为15.17±1.12mm²/d，统计学t检验，p<0.01。伤愈灵软膏治疗组创面的愈合速度比空白对照组快了2.2倍，并具有显著的统计学差异。

结果列出如表3。

表3各组动物皮肤创伤愈合时间和速度

随后再改变地塞米松磷酸钠、硫酸庆大霉素、盐酸达克罗宁、克霉唑的浓度后进行小鼠伤口愈合实验。

配制地塞米松磷酸钠0.03g/L、硫酸庆大霉素64万U/L、盐酸达克罗宁大于0.05g/L、克霉唑16g/L的软膏和地塞米松磷酸钠0.4g/L、硫酸庆大霉素160万U/L、盐酸达克罗宁大于60g/L、克霉唑30g/L的软膏。

得到的数据实验与表2数据无明显差距，可见上述四种成分在本发明合理浓度范围内对伤口愈合的速度并没有影响。

地塞米松磷酸钠剂量小促进伤口愈合能力减弱；剂量过大则增加伤口真菌感染风险。

硫酸庆大霉素剂量小影响抗感染能力；剂量过大吸收入血到达内耳，有造成内耳的毒性风险。

盐酸达克罗宁对皮肤有止痛、止痒及杀菌作用，大量使用无副作用，量小影响对损伤部位的麻醉止痛效果。

克霉唑剂量小杀灭霉菌能力减弱，剂量过大皮肤伤口外用后可引发皮疹、皮肤烧灼感等皮肤刺激征象。

综合上述实验结果得到以下结论:利用培养过人脂肪干细胞培养上清液为基础的软膏制剂进行皮肤创面涂敷，能有效促进创面皮肤修复,用于皮肤重度缺损治疗是可行的。培养过人脂肪干细胞培养上清液具有促进创面皮肤修复的作用，可以作为愈合伤口的药物。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.用于伤口愈合的制剂，其特征在于，包括培养过人脂肪干细胞的细胞培养液离心分离后的上清液；

所述细胞培养液为无血清培养基；

所述无血清培养基由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁

蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成；

所述人血清白蛋白为1.25mg/mL，所述转铁蛋白为6.25μg/mL，所述

牛磺酸为1.25μg/mL，所述还原型谷胱甘肽为10μg/mL，所述铜蓝蛋白为0.25U/mL，所述L-抗坏血酸-2-硫酸酯为50μg/mL，所述α-生育酚琥珀酸单酯为9×10^-7mol/L，所述亚油酸为5.35μg/mL，所述α-酮戊二酸为1×10^-4mol/L，所述硒为6.25ng/mL；

所述上清液当中包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子、粒细胞集落刺激生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生因子、白介素2和白介素10。

2.根据权利要求1所述的用于伤口愈合的制剂，其特征在于，还包括地塞米松磷酸钠、硫酸庆大霉素、盐酸达克罗宁、克霉唑。

3.根据权利要求2所述的用于伤口愈合的制剂，其特征在于，所述地塞米松磷酸钠的含量为0.03～0.4g/L、硫酸庆大霉素的含量为64～160万U/L、盐酸达克罗宁的含量为大于0.05g/L、克霉唑的含量为16～30g/L。

4.根据权利要求3所述的用于伤口愈合的制剂，其特征在于，所述地塞米松磷酸钠含量为0.4g/L、硫酸庆大霉素含量为160万U/L、盐酸达克罗宁含量为8.5g/L、克霉唑含量为16g/L。

5.根据权利要求4所述的用于伤口愈合的制剂，其特征在于，所述制剂为软膏或液剂。

6.如权利要求1至5中任一项所述的用于伤口愈合的制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：取培养过人脂肪干细胞的细胞培养上清液注入到容器中，然后依次加入地塞米松磷酸钠，硫酸庆大霉素，盐酸达克罗宁，克霉唑；步骤2：将步骤1容器放在磁力搅拌器上，缓慢搅拌至所有加入的成分完全溶解：步骤3：加入防腐剂；步骤4：在缓慢搅拌的条件下，缓缓加入脂肪干细胞培养上清液定容，停止搅拌，得到混合溶液。

7.根据权利要求6所述用于伤口愈合的制剂的制备方法，还包括如下步骤：步骤5：取注射用水，依次加入硬脂酸，白凡士林，十六醇，液体石蜡，丙二醇，充分混匀，再加入注射用水，搅拌均匀呈软膏状；步骤6：取步骤4制得的混合溶液加入步骤5所制得的膏状物中，充分研合均匀，配制成乳液状。