CN102319425A - 一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，该试剂盒由单独存放的黄芪提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板组成，所述创面愈合剂的制备方法为：主要由下列步骤组成：第一步：将冻干血小板和灭菌注射用水混合置于30～37℃的水浴中，使冻干血小板充分溶解得到冻干血小板溶液；将冻干凝血酶加入黄芪提取物溶液中得到复合凝血酶溶液；第二步：将冻干血小板溶液和复合凝血酶溶液混合均匀即得创面愈合剂。本发明中的黄芪提取物溶液和凝血酶混合后，体外具有激活纤维蛋白原成为纤维蛋白胶的作用，从而达到创面愈合的效果。

Description

一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒

技术领域

本发明涉及一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，属于药物制备技术领域。

背景技术

创面愈合是复杂的生物学过程，临床上尤以慢性难愈性创面的愈合颇为棘手。当前，人们对这一课题的研究已经深入到细胞、分子及基因水平。临床上可见到各类的生长因子开始应用，如表皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，临床试用取得一定效果。慢性难愈性创面产生的主要原因为：慢性难愈性创面中有大量的包括金属蛋白酶在内的蛋白酶存在，后者分解了伤口细胞分泌的内源性生长因子和加入的外源性生长因子，从而导致伤口愈合速度减慢或停止；白细胞介素8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）含量也很高，以自分泌的形式对组织修复起抑制作用；成纤维细胞产胶原作用减弱；创面细胞凋亡增多等。

富血小板血浆（Plate Rich Plasma，PRP）为从全血中分离出来的含高浓度血小板的血浆。经检测，PRP中的血小板经激活后，释放出多种高浓度的促进创面组织修复和再生的生长因子，如血小板源性生长因子（PDGF），转化生长因子-β（TGF-β），类胰岛素样生长因子，血管内皮生长因子（VEGF）,表皮生长因子（EGF）等。已有大量的研究表明PRP凝胶用于糖尿病足溃疡能明显缩短愈合期限，用于口腔、骨科能明显促进新骨的再生，缩短成骨时间。其局部释放的高浓度多种生长因子具有协同促进创面修复作用，一定程度上弥补了单一生长因子修复创面不佳的缺点。

PRP凝胶虽然有着良好的医学应用前景，但是在临床上并末得到推广应用，这是因为目前的PRP凝胶都是现场抽取自身血，需经多次离心提取PRP后自行制作。需要离心机等临床科室基本不配置的设备，或者在有实验室的条件下才能完成，手续流程较为繁杂。现在虽然已有发明提取PRP，制作血浆的设备，但尚需要临床科室花钱专门为此购买。因此以上缺点，限制了PRP凝胶在临床上的应用。

目前血小板的体外保存上，冻干血小板技术为血小板的保存提供了新方法。不仅可以延长血小板的储存时间，且能存放于室温相当长时间，更方便存放和运输。需要时经水化还原，血小板的存活率可达70%以上，激活率达95%，保障了血小板的生物活性。冻干血小板制品为富血小板凝胶的产业化提供了方便。

中药黄芪，传统治疗慢性难愈性伤口的一味常用中药，“乃疮家之圣药”，具有补气托毒、排脓、敛疮生肌、利水消肿、益卫固表等功效。黄芪的提取液含有黄芪皂甙、多糖、黄酮和大量微量元素。在临床上治疗气血不足，疮疡内陷的脓成不溃或溃久不敛的慢性伤口。在创伤愈合过程中对细胞的增殖和胶原代谢失常、调节创面免疫功能起着至关重要的作用。临床和动物实验均证明治疗慢性皮肤溃疡疗效显著。

发明内容

本发明目的是提供一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案是：一种黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，由黄芪提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板组成，所述黄芪提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板单独存放；所述黄芪提取物溶液的浓度为每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.08～0.12毫克。

为达到上述目的，本发明采用的第二种技术方案是：一种创面愈合剂，所述创面愈合剂的制备方法为：主要由下列步骤组成：

第一步：将冻干血小板和灭菌注射用水混合置于30～37℃的水浴中，使冻干血小板充分溶解得到冻干血小板溶液，所述冻干血小板与灭菌注射用水的质量比例为1:5～6；将冻干凝血酶加入黄芪提取物溶液中得到复合凝血酶溶液，其中，所述复合凝血酶溶液中每毫升含有40～100U的凝血酶，所述黄芪提取物溶液的浓度为每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.08～0.12毫克；

第二步：将冻干血小板溶液和复合凝血酶溶液混合均匀即得创面愈合剂，所述复合凝血酶溶液和冻干血小板溶液的体积比为1:1。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述方案中，所述黄芪提取物溶液为黄芪水提取物溶液。所述黄芪水提取物溶液的方法一般为：取黄芪份数为1，加水量份数为10，提取两次，每次两小时，然后进行浓缩使得每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.08～0.12毫克即得。

2、上述方案中，所述冻干血小板采用血小板浓度为1×10¹²个/L以上的血浆经冷冻干燥制得，即选用的血浆每升中含有1×10¹²个/L以上的血小板。

3、上述方案中，所述冻干血小板可选用商品化的冻干血小板制品。其冻干血小板产品中应含有血浆成分，可选择用海藻糖负载或其它冻干保存剂。选用的冻血干血小板产品应分别标注ABO血型型号，应和受用者血型一致。或选用通用型血浆制备的血小板。

4、上述方案中，冻干凝血酶为商品化人凝血酶冻干制品，浙江杭康药业有限公司产品。

5、上述方案中，黄芪提取物溶液可用黄芪注射液，剂量为1ml含黄芪甲苷0.1mg，哈尔滨圣泰制药有限公司。

6、上述方案中，U是酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

本发明中的黄芪提取物溶液和凝血酶混合后，体外具有激活纤维蛋白原成为纤维蛋白胶的作用，从而达到创面愈合的效果。

附图说明

附图1为术后第15天两组创面愈合观察；

附图2为对照组组术后第6天；

附图3为使用本发明创面愈合剂术后第6天；

附图4为使用本发明创面愈合剂后第15天；

附图5为对照组术后第15天。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒

一种黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，由黄芪水提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板组成，所述黄芪水提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板单独存放；所述黄芪水提取物溶液的浓度为每毫升黄芪水提取物溶液中含有黄芪甲苷0.1毫克。

一、创面愈合剂应用方法如下：

 A、冻干血小板的复水  

将装有冻干血小板的小瓶及灭菌注射用水瓶置于30～37℃的水浴中温热数分钟。注射器吸取0.5ml灭菌注射用水注入装有冻干血小板的小瓶后将瓶重新置于水浴中，轻轻震荡，注意应避免产生气泡。10～15分钟后取出瓶子，直至完全溶解于复水溶液中得到冻干血小板溶液。所述冻干血小板与灭菌注射用水的质量比例为1:5；

B、将冻干凝血酶用黄芪注射液稀释得到复合凝血酶溶液，使得所述复合凝血酶溶液中每毫升含有40～100U的凝血酶，所述黄芪水提取物溶液的浓度为每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.1毫克。

C、用双联注射器吸取等量分别装有冻干血小板溶液和复合凝血酶溶液的液体，将包装内的平头针或喷头之一装到双联注射座上。创伤表面上薄而均匀地涂抹一层。

D、轮换涂抹方法:将冻干血小板溶解液涂抹于创伤表面，然后立即涂抹复合凝血酶溶液。

二、冻干血小板再水化后功能评价 

（1）、将自行制备的人冻干血小板粉（180天）用0.9%生理盐水稀释，在37℃水浴箱中轻轻震荡直至完全溶解。海藻糖（上海恒信化学试剂有限公司），冻干凝血酶（浙江杭康药业有限公司）。

（2）、评价指标

1、血小板回收率计算

血小板数量检测，使用血细胞分析仪测定。血小板回收率=（复水后血小板数目／冻干前血小板数目）×100％。  

2、血小板聚集反应

以2种不同浓度的凝血酶、ADP作为诱导剂，普利生LBY-NJ血小板聚集仪，分别测定冻干前新鲜血小板、冻干再水化血小板的聚集反应。

3、EGF、VEGF释放含量测定

用ELASA法检测复水的冻干血小板经复合凝血酶溶液激活后，生长因子EGF、VEGF释放量。VEGF、TGF-1试剂盒购自南京凯基生物技术公司。

（3）、结果   

1、人血小板经冷冻干燥、6个月后再水化，血小板计数明显低于冻干前，但回收率在70.55±3.58%。与全血血小板浓度比较，为其浓度的3.86倍。

2. 血小板聚集反应 

当凝血酶浓度为1.0 U/ml时，冻干前新鲜血小板最大聚集率达101±3.347%，冻干后血小板最大聚集率为70.17±7.36%。当凝血酶浓度为100U/ml时，最大聚集率为90.17±7.36%。见表1。

表1 冻干血小板水化后最大聚集率比较（n=8）

	凝血酶（1.0U/ml）	凝血酶（100U/ml）	ADP（20μmol/L）
				新鲜	101±3.34%	103±5.82%	72.40±5.98%
冻干6个月	70.17±7.36%＊	90.26±8.48%▲	58.00±8.23%▲

表中，＊P＜0.05，▲P＞0.05。

3、VEGF、TGF-β1含量

冻干血小板复水后的TGF-β1含量与新鲜血小板激活后含量无显著性差异。见表2。

表2  血小板冻干6个月前后TGF-β1和VEGF含量比较（n=8）

	TGF-β1（ng/ml）	VEGF(pg/ml)
			冻干前	314.80±36.47	385.16±52.83
冻干6个月	276.31±48.68▲	428.77±60.52▲

表中，＊P＜0.05，▲P＞0.05。

（4）、 结论  

冻干血小板再水化后具备近70%的回收率，并且具备凝血和聚集反应活性、释放活性。

复合冻干血小板凝胶促进SD大鼠全层皮肤缺损的修复

一、实验设计

选取健康成年SD大鼠24只（苏州大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重（250～300g）。对称取脊柱两侧皮肤，剪毛后，分别制作2cm×2cm至皮下筋膜层的全层缺损，随机选择一侧为实验组，另一侧为对照组。术后实验组用冻干血小板复合凝胶涂抹伤口，每三天一次。对照组以血浆涂抹伤口。无菌干纱布覆盖，伤口换药每三天一次，

二、观察指标

1、创面愈合大体观察

观察创面生长、渗出、感染情况。

2、创面愈合面积计算

用OLYMPUS数码相机给伤口创面拍照，导入麦克奥迪MOTIC-2000自动图像分析系统，勾画出创面边缘，计算出创面面积。愈合率=（起始创面面积-某天创面面积）/起始创面面积。

3、伤口愈合时间观察

伤口愈合标准以创面面积小于总面积的5%或愈合面积大于95%为完全愈合。观察创面完全上皮化所需时间。

4、组织学观察

术后3、6、15天处死动物，取整个创面及边缘部分全层皮肤组织，常规固定石蜡包埋切片，HE染色。光学显微镜下观察。

三、结果 

1、大体观察

术后第三天，实验组比对照组肉芽组织数量多，颜色鲜红，炎性渗出少，创面较干燥。血浆组创面苍白、创面收缩、创面变浅。第6天，血小板组创面收缩较对照组明显，见有新生上皮覆盖；对照组术后第15天，血小板组创面愈合，表皮完全覆盖伤口，有多量毛发覆盖。对照组部分创面仍未完全愈合，未完全表皮化，毛发少。如附图1～2所示。

2、创面愈合率比较

表3  创面愈合率比较

	n	6	15	19
					实验组	6	58.16±5.32	100	100
对照组	6	39.22±4.61	90.24±6.11	100

3、伤口愈合时间

冻干血小板组愈合时间为13.52±1.32天，对照组时间为17.38±2.52天，有显著性差异。愈合平均时间比对照组提前4～5天。

4、组织学观察

术后3天，冻干血小板组可见创面局部较多修复细胞，少量新生毛细血管。对照组修复细胞少，新生血管少。术后6天，血小板组肉芽组织更致密，有大量的成纤维细胞和新生血管，可见明显的角质细胞。对照组新生血管密度小，角质细胞少；第15天，血小板组皮肤结构完整，纤维排列整齐。对照组皮肤结构尚不完整，纤维排列较乱。见附图2～5。  

四、结论

冻干血小板凝胶可明显提高皮肤组织创面修复，提前愈合时间。

实施例二：一种创面愈合剂及制备创面愈合剂的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒

一种黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，由黄芪水提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板组成，所述黄芪水提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板单独存放；所述黄芪水提取物溶液的浓度为每毫升黄芪水提取物溶液中含有黄芪甲苷0.1毫克。所述冻干血小板采用血小板浓度为1×10¹²个/L以上的血浆经冷冻干燥制得。

所述创面愈合剂的制备方法为：主要由下列步骤组成：

第一步：将冻干血小板和灭菌注射用水混合置于30～37℃的水浴中，使冻干血小板充分溶解得到冻干血小板溶液，所述冻干血小板与灭菌注射用水的质量比例为1:5；将冻干凝血酶加入黄芪提取物溶液中得到复合凝血酶溶液，其中，所述复合凝血酶溶液中每毫升含有40～100U的凝血酶，所述黄芪提取物溶液的浓度为每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.1毫克；

第二步：将冻干血小板溶液和复合凝血酶溶液混合均匀即得创面愈合剂，所述复合凝血酶溶液和冻干血小板溶液的体积比为1:1。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，其特征在于：由黄芪提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板组成，所述黄芪提取物溶液、冻干凝血酶和冻干血小板单独存放；所述黄芪提取物溶液的浓度为每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.08～0.12毫克。

2.根据权利要求1所述的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，其特征在于：所述黄芪提取物溶液为黄芪水提取物溶液。

3.根据权利要求1所述的黄芪复合冻干血小板凝胶剂试剂盒，其特征在于：所述冻干血小板采用血小板浓度为1×10¹²个/L以上的血浆经冷冻干燥制得。

4.一种创面愈合剂，其特征在于：所述创面愈合剂的制备方法为：主要由下列步骤组成：

第一步：将冻干血小板和灭菌注射用水混合置于30～37℃的水浴中，使冻干血小板充分溶解得到冻干血小板溶液，所述冻干血小板与灭菌注射用水的质量比例为1:5～6；将冻干凝血酶加入黄芪提取物溶液中得到复合凝血酶溶液，其中，所述复合凝血酶溶液中每毫升含有40～100U的凝血酶，所述黄芪提取物溶液的浓度为每毫升黄芪提取物溶液中含有黄芪甲苷0.08～0.12毫克；

第二步：将冻干血小板溶液和复合凝血酶溶液混合均匀即得创面愈合剂，所述复合凝血酶溶液和冻干血小板溶液的体积比为1:1。

5.根据权利要求4所述的创面愈合剂，其特征在于：所述黄芪提取物溶液为黄芪水提取物溶液。

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