CN110585240A - 一种含再生因子的冻干制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种含再生因子的冻干制剂及其制备方法和应用。所述含再生因子的冻干制剂包括第一冻干制剂和第二冻干制剂；第一冻干制剂包括激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物被冻干后得到的冻干产物；第二冻干制剂包括贫血小板血浆被冻干后得到的冻干产物，冻干制剂包含独立冻干的被激活的血小板血浆和贫血小板血浆，更好的保全了血浆中的功能因子和营养物质，避免了激活剂提前激活血浆中的纤维蛋白原。本发明还提供了所述冻干制剂的制备方法，该制备方法工艺简单、耗时短，使冻干制剂可以得到更好的利用、保存；且该制备方法可用于产业化批量生产含再生因子的冻干制剂，也可应用于医疗场所，采集伤患的自体血液，现场制作使用。

Description

一种含再生因子的冻干制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种含再生因子的冻干制剂及其制备方法和应用。
背景技术
作为哺乳动物血液中的主要成分之一，血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。富血小板血(Platelet-rich plasma，PRP)是通过离心血提取的血小板浓聚物，主要成分有高浓度的血小板(数目比全血中数目高3倍以上)、白细胞和纤维蛋白。富血小板血浆(PRP)治疗术是一项再生修复治疗技术，主要用于组织创伤修复，如难愈合骨折、骨缺损、骨髓炎、关节软骨肌腱韧带损伤等修复及难愈合的创面(如压疮、烧烫伤、皮肤软组织缺损等)修复。该技术主要采用自源性富血小板血浆(PRP)进行治疗，从根本上避免了外源性生长因子引起的免疫排斥、传播疾病以及异种重组基因产品可能改变人类遗传结构的担忧。富血小板血浆(PRP)治疗技术在欧美等国已开展数十年，并在国内开展了多中心临床观察，证实安全、有效，能解决临床组织修复的难题，相比传统的组织修复方法可以缩短病程、减轻疼痛、加速功能恢复等，为医生、患者提供了一种全新的治疗手段。
虽然PRP在治疗难愈合创面中有明显作用，但仍有不易存储、容易变质失活、使用不便、每次使用均需要重复抽血、重新制备等局限性。目前的富血小板血浆(Platelet-richplasma，PRP)在临床应用时有许多缺点，包括：生长因子含量较低；不易保存，每次治疗均须采血，病人离开医院则不能自行使用；使用过程患者行动受限等。
可见，现有技术有待改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含再生因子的冻干制剂及其制备方法和应用。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
一种含再生因子的冻干制剂，包括：第一冻干制剂和第二冻干制剂；所述第一冻干制剂包括激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物被冻干后得到的冻干产物；所述第二冻干制剂包括贫血小板血浆被冻干后得到的冻干产物；所述第一冻干制剂和所述第二冻干制剂可以是来源于同一个体，也可以是来源于不同个体。
进一步的，用于制备所述第一冻干制剂的所述激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物的体积与用于制备所述第二冻干制剂的贫血小板血浆的体积的比例范围为3:1～1:1；优选2:1。
进一步的，所述激活剂包括凝血酶；所述凝血酶在激活剂中的用量为400U/ml。
一种含再生因子的冻干制剂的制备方法，包括步骤：
获得富血小板血浆和贫血小板血浆；
加入激活剂，激活所述的富血小板血浆；
将激活后的所述的富血小板血浆和激活剂的混合物制成第一冻干制剂；
将贫血小板血浆制成第二冻干制剂。
其中所述将贫血小板血浆制成第二冻干制剂的操作可在获得贫血小板血浆后的任一步骤进行。
进一步的，所述的获得富血小板血浆和血浆的操作包括：采血；进行第一次离心；分离第一次离心得到的离心产物，得到第一分离产物；将第一分离产物进行第二次离心；分离第二次离心得到的离心产物，获得第二分离产物和贫血小板血浆。所述第二分离产物即为富血小板血浆。
进一步的，所述第一次离心条件为：15-25℃，离心力100-500g(优选100-300g，更优选200g)，离心10min。第一次离心后全血分为3层，上层为血浆层，下层为红细胞，两层交界处浅黄色分界层即PRP层；
所述第二次离心条件为：温度15-25℃，离心力不低于400g，离心10min。
进一步的，所述分离第一次离心得到的离心产物的操作包括：吸弃红细胞层总体积90％～95％的红细胞，余下的离心产物即为所述的第一分离产物；将所述第一分离产物充分混匀，作为所述第二次离心的起始物。
进一步的，所述第二次离心的产物的上层血浆层即为贫血小板血浆层；所述分离第二次离心得到的离心产物的操作包括：吸取贫血小板血浆层总体积的90％～95％的贫血小板血浆待用，余下的离心产物即为所述的第二分离产物；从待用的贫血小板血浆中取与所述的第二分离产物的体积比为3:1～1:1的贫血小板血浆待用。
进一步的，所述富血小板血浆的激活操作包括：将上述制得的富血小板血浆与激活剂混合，常温静置1小时激活，然后再-80℃冷冻保存至结冰以方便冻干。所述的富血小板血浆与所述激活剂的体积比为10:1～10:100。
进一步的，所述激活剂包括凝血酶；所述凝血酶在激活剂中的用量为400U/ml。优选所述激活剂组成为：每1mL 5％的氯化钙溶液中含400U的凝血酶。
本发明的含再生因子的冻干制剂，或本发明制备方法制得的含再生因子的冻干制剂在临床治疗中的应用，具体应用场景包括但不限于：浅表新鲜创面、陈旧创面(各类感染创面)、深层组织或器官创面(如溃疡面等)、烧伤等。
进一步的，所述含再生因子的冻干制剂使用时先用溶剂溶解，再将溶解物覆于创面。所述溶剂包括生理盐水、医用无菌水、去离子水、蒸馏水等。
进一步的，所述第一冻干制剂和第二冻干制剂可以先分别溶解后再同时使用于创面，也可以现将冻干粉混合后再溶解，再用于创面。
本发明的有益效果：
本发明的冻干制剂包含独立冻干的含激活剂的被激活的PRP和血浆，更好的保全了血液中的功能因子和营养物质，避免了激活剂提前激活血浆中的纤维蛋白原，保护了血浆中的纤维蛋白原。本发明冻干制剂使用时，复溶后的含激活剂的PRP与血浆混合，激活剂中的凝血酶可以和未激活过的血浆即时形成凝胶(凝血酶通过切除血浆中可溶解的纤维蛋白原中的血纤肽A和B而生成的单体蛋白质，形成不溶解的纤维蛋白，从而形成凝胶)，所形成的可以保持创面的湿性愈合状态，并且有效的防止其它功能因子和营养物质的流失，隔绝了因环境中污染物接触创面而给创面愈合带来的不良影响。
本发明的冻干制剂的制备方法分别分离出PRP和血浆，并只在PRP中加入激活剂，然后将加了激活剂的PRP和血浆分别冻干保存，更好的保全了血液中的功能因子和营养物质，避免了激活剂提前激活血浆中的纤维蛋白原，保证了本发明的冻干制剂的疗效。而如果不将血浆分离出来单独冻干保存，并于冻干前激活的话，血浆中的纤维蛋白原将会被提前激活(纤维蛋白原只能被凝血酶激活一次)，纤维蛋白原被提前激活后再制成的冻干制品，一方面不能很好地被保存，另一方面复融后使用时不能形成凝胶，无法附着在创面上。
本发明的冻干制剂的制备方法中，激活剂的加入量在完成富血小板血浆激活的同事，保证了贫血小板血浆冻干产物复溶后被激活所需要激活剂量；且多余量的激活剂(每5mL 5％氯化钙溶液中加入2000U凝血酶)也不会影响疗效。在冻干前加入激活剂激活PRP，使其中生长因子充分释放。
本发明技术方案的激活-冻干-复溶的方法工艺简单、耗时短，使冻干制剂可以得到更好的利用、保存；病人可以避免多次抽血及多次往返医院的困扰，制作成冻干制剂后可以自行使用。且本发明的冻干制剂的制备方法可以用于产业化批量生产本发明的含再生因子的冻干制剂，也可以应用于医疗场所如医院等，采集伤患的自体血液，现场制作使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为本发明冻干制剂的制备流程示意图，其中01环节指第一次离心；02环节指第二次离心；03环节指血浆和PRP分离；031为PRP；032为血浆；04环节指低温冷藏；05环节指冻干；06环节指获得第一冻干制剂和第二冻干制剂；061为第一冻干制剂；062为第二冻干制剂。
图2为本发明冻干制剂使用时的复溶流程示意图；其中07环节指分别复溶第一冻干制剂和第二冻干制剂；071为第一冻干制剂的复溶物；072为第二冻干制剂的复溶物；08环节指第一冻干制剂的复溶物和第二冻干制剂的复溶物同时使用形成凝胶。
图3为复溶实验的复溶物对照图，其中(A)为对比例1的冻干制剂的复溶物；(B)为本发明的冻干制剂的复溶物；(C)为对比例2的冻干制剂的复溶物。
图4为复溶实验中复溶物置于倾斜面的保持状态对照图；其中(A)为对比例1的冻干制剂的复溶物；(B)为本发明的冻干制剂的复溶物；(C)为对比例2的冻干制剂的复溶物。
图5为本发明冻干制剂复溶物所形成的凝胶状况；其中(A)为对比例1的冻干制剂的复溶物；(B)为本发明的冻干制剂的复溶物；(C)为对比例2的冻干制剂的复溶物。
图6为成分分析结果图。
图7为创面愈合情况图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本发明提供一种含再生因子的冻干制剂，包括：第一冻干制剂和第二冻干制剂；所述第一冻干制剂包括激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物被冻干后得到的冻干产物；所述第二冻干制剂包括贫血小板血浆被冻干后得到的冻干产物。
在一些实施例中，用于制备所述第一冻干制剂的所述激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物的体积与用于制备所述第二冻干制剂的贫血小板血浆的体积的比例范围为3:1～1:1；包括但不限于3:1、2:1、1:1、2.5:1、1.6:1等。
在一些实施例中，所述激活剂包括凝血酶；所述凝血酶在激活剂中的用量为400U/ml。优选所述激活剂组成为：每1mL 5％的氯化钙溶液中含400U的凝血酶。
在一些实施例中，所述第一冻干制剂和所述第二冻干制剂来源于同一个体；在另一些实施例中，所述第一冻干制剂和所述第二冻干制剂也可以是来源于不同个体。
一种含再生因子的冻干制剂的制备方法，包括步骤：
获得富血小板血浆和贫血小板血浆；
加入激活剂，激活所述的富血小板血浆；
将激活后的所述的富血小板血浆和激活剂的混合物制成第一冻干制剂；
将贫血小板血浆制成第二冻干制剂。
其中所述将贫血小板血浆制成第二冻干制剂的操作可在获得贫血小板血浆后的任一步骤进行。
在一些实施例中，所述的获得富血小板血浆和血浆的操作包括：采血；进行第一次离心；分离第一次离心得到的离心产物，得到第一分离产物；将第一分离产物进行第二次离心；分离第二次离心得到的离心产物，获得第二分离产物和贫血小板血浆。所述第二分离产物即为富血小板血浆。
在一些实施例中，所述第一次离心条件为：15-25℃(包括但不限于15℃、18℃、20℃、23℃、25℃等)，离心力100-500g(优选100-300g，更优选200g)，离心10min。第一次离心后全血分为3层，上层为血浆层，下层为红细胞，两层交界处浅黄色分界层即PRP层。
在一些实施例中，所述分离第一次离心得到的离心产物的操作包括：吸弃红细胞层总体积90％～95％(包括但不限于90％、90.9％、93％、95％等)的红细胞，保留紧挨分界层的5％～10％体积的红细胞；余下的离心产物即为所述的第一分离产物；将所述第一分离产物充分混匀，作为所述第二次离心的起始物。
在一些实施例中，所述第二次离心条件为：离心力不低于400g(包括但不限于400g、600g、745g、1000g等)，离心10min。
在一些实施例中，所述第二次离心的产物的上层血浆层即为贫血小板血浆层；所述分离第二次离心得到的离心产物的操作包括：吸取贫血小板血浆层总体积的90％～95％(包括但不限于90％、91.2％、92.8％、94％、95％等)的贫血小板血浆待用，余下的离心产物即为所述的第二分离产物；从待用的贫血小板血浆中取与所述的第二分离产物的体积比为3:1～1:1(包括但不限于3:1、2.6:1、2:1、1:1等)的贫血小板血浆待用。
由于全血组分和组分比例基本都是相同的，故在采用全血作为原材料按照上述制备方法操作时，每一份全血材料均可以获得一份激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物(冻干后即为第一冻干制剂)和至少一份贫血小板血浆(冻干后即为第二冻干制剂)，故本发明实施例中均以采用同一份全血原材料制备第一冻干制剂和第二冻干制剂为例。但在一些实施例中，也是可以采用两份全血原材料，从其中一份中获得富血小板血浆(PRP)，激活冻干后得到第一冻干制剂；从另一份中获得贫血小板血浆，冻干得到第二冻干制剂；然后将这来自两份全血的第一冻干制剂和第二冻干制剂组合成本发明的含再生因子的冻干制剂。但在实际生产中，后者所述的采用两份全血原材料制备一份本发明冻干制剂的方法中，如果将剩余的PRP和贫血小板血浆丢弃，则会存在原材料浪费，故通常会将每一份全血原材料所得到的PRP和贫血小板血浆均继续处理制得第一冻干制剂和第二冻干制剂，但在临床应用上不限制本发明的冻干制剂必须要来自于同一份全血材料或者来自同一个体，只是优选来源于同一个体的联用。
在一些实施例中，将上述制得的富血小板血浆与激活剂混合，常温静置1小时激活，然后再-80℃冷冻保存至结冰以方便冻干。所述的富血小板血浆与所述激活剂的体积比为10:1～10:100(包括但不限于10:1、10:10、10:30、10：50、10:70、10:95、10:100等)。
在一些实施例中，所述激活剂包括凝血酶；所述凝血酶在激活剂中的用量为400U/ml。优选所述激活剂组成为：每1mL 5％的氯化钙溶液中含400U的凝血酶。
氯化钙对富血小板血浆有一定激活作用，可以激活血小板的a颗粒释放生长因子，但其反应慢、耗时长，本发明的原料从采血到冻干有时间限制，激活剂采用凝血酶与氯化钙联用后，可以在1小时时间内使激活率达到90％以上，为后续流程预留了充足的时间。
本发明的含再生因子的冻干制剂，或本发明制备方法制得的含再生因子的冻干制剂在临床治疗中的应用，具体应用场景包括但不限于：浅表新鲜创面、陈旧创面(各类感染创)、深层组织或器官创面(如溃疡面等)、烧伤等。
在一些实施例中，所述含再生因子的冻干制剂使用时先用溶剂溶解，再将溶解物覆于创面。所述溶剂包括生理盐水、医用无菌水、去离子水、蒸馏水等，所述溶剂将冻干粉完全溶解即可，如需要降低其粘稠度，可自行增加溶剂的量，不视为对本发明保护范围的限制。
在一些实施例中，所述第一冻干制剂和第二冻干制剂可以先分别溶解后再同时使用于创面，也可以现将冻干粉混合后再溶解，再用于创面。但实际应用中，从使用部位和形成凝胶的时间综合考虑，较多的选择先分别溶解，在边混合边使用于创面，使本发明制剂能在创面形成凝胶。将冻干粉混合的优点是可以降低包装成本和储存运输成本，但缺点在于在实际使用时一复溶就很容易形成凝胶，需要很快速地应用于创面，比如可用于浅表明显曝露的创面等，如果应用于较深部位或较复杂的创面，可能时间会很紧张，且有堵塞注射器或传送通道的风险。故实际生产中多运用将第一冻干制剂和第二冻干制剂独立冻干包装的产品形式，但这并不表示对本发明保护范围的限制。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1本发明的含再生因子的冻干制剂的制备方法
本发明的含再生因子的冻干制剂的制备方法，参见图1，包括以下操作：
(1)在无菌条件下，用含有枸橼酸钠抗凝剂的抗凝管于患者肘前静脉取血约40mL用于制备PRP；另采集1管用于全血血小板和白细胞计数，以确保全血原材料的质量；
注：
A.采血后上下颠倒混匀，血小板容易受到外源性刺激而破坏或激活，因此动作要轻柔，抽血时间不要过长，操作熟练，减少放置时间(临床经验丰富的医护人员均可实现)。
B.治疗中，也可采用自体血液现制的手段，可根据患者创面大小决定采血量和所需PRP的量，根据创面生长情况决定采血次数，本实施例仅以40ml采血量为例。
(2)将用于PRP制备的采集血液转移至无菌离心管中，进行第一次离心；离心条件为：25℃，离心力200g，离心10min。第一次离心后，全血分为3层，上层为血浆，下层为红细胞，两层交界处浅黄色层即PRP层(如图1中01环节所示)。
(3)第一次离心结束后取出离心管放于生物安全柜试管架，打开PRP离心管，吸除下层的95％体积的红细胞，保留紧挨分界层的5％体积的红细胞；保留血浆层、分界层及分界层下剩余红细胞，并将其重新混匀；
(4)进行第二次离心，离心条件为：离心力400g，离心10min。第二次离心后，可见在离心管底部红细胞表面有白膜样物质，为血小板和白细胞沉积层(即富血小板血浆)；其上部为透明的贫血小板血浆层(如图1中02环节所示)。
(5)在百级生物安全柜下，打开离心管，吸除上层90％体积的贫血小板血浆转移至另一只无菌离心管保存待用，保留剩余10％体积的贫血小板血浆层、分界层及分界层下的红细胞约5.5ml，充分摇匀后即为富血小板血浆(PRP)；混匀后取0.5mL PRP用于浓缩后血小板及白细胞检测计数，计算回收率，回收率大于70％，即达到PRP标准；剩下5ml的PRP(即031)待用；从待用的贫血小板血浆中取与富血小板血浆体积比为1:1的贫血小板血浆5ml(如图1中032所示)。如图1中03所示，分别获得了贫血小板血浆032和富血小板血浆(PRP)031。
注：所有检测在样本制备后1h内检测完成，富血小板血浆(PRP)031的浓度较高，可以采用稀释模式分析。富血小板血浆(PRP)031在抗凝状态下一般可保存8h，即冻干操作越早进行越好，最迟不能超过采血后8小时。
(6)按10:1的比例将制备的富血小板血浆(PRP)031与促凝剂(2000U凝血酶中加入5mL 5％氯化钙溶液)混合，(如图1中04环节所示)常温放置1h以等待活性因子释放，获得富激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物，再-80℃冷冻保存至结冰以方便冻干。
(7)分别冻干步骤(6)获得的激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物和贫血小板血浆032(如图1中06所示)：将激活1h后的PRP成品(即步骤(6)获得的激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物)及贫血小板血浆032分别放入消毒后的冻干瓶里，连接并启动冻干机(普通冻干操作即可，如图1中05环节所示)，48h后取出制成的激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物被冻干后得到的冻干产物061(即第一冻干制剂)及贫血小板血浆冻干产物062(即第二冻干制剂)。
为保证本发明冻干制剂制备成功，所有采血及血液样本处理操作均按行业标准完成。所有操作都在同一无菌制备室内由同一批操作熟练的人员严格按照行业标准操作完成。
对比例1无凝血酶的PRP冻干粉和贫血小板血浆冻干粉
本对比例的冻干制剂(PRP冻干粉和贫血小板血浆冻干粉)制备方法与实施例1的制备方法基本相同，唯一的区别在于：PRP冻干前激活时，只加入了与实施例1相同体积的浓度为5％的氯化钙溶液，没有加入凝血酶，由于冻干前反应时间短，故本实施例冻干前的PRP相当于没激活。
对比例2本发明冻干制剂中的第一冻干制剂
本对比例的第一冻干制剂的制备方法与实施例1的第一冻干制剂的制备方法相同，本对比例与实施例1的区别在于：本对比例只有第一冻干制剂，并没有单独冻干贫血小板血浆。
实验方法及结果
一、复溶实验
将对比例1制备得到的冻干制剂、实施例1制备得到的冻干制剂、对比例2制备得到的冻干制剂分别用生理盐水复溶混合。复溶后的状态如图3：(A)为对比例1冻干制剂的复溶物；(B)为本发明(实施例1)的冻干制剂的复溶物；(C)为对比例2的冻干制剂的复溶物。
将三种复溶产物置于斜面，其保持状况见图4，其中(A)冻干前和复溶后均未被完全激活，状态接近于全血，直接从斜面滑落；(B)牢牢附着在斜面上；(C)为冻干前激活的，冻干后无法再被激活，保留着冻干前被激活的状态，几乎不附着在斜面。
用注射器拨动实施例1制备得到的本发明冻干制剂的复溶物，可见(参见图5)其中(B)中本发明的冻干制剂的复溶物呈胶冻状凝胶。
二、复溶物功能成分分析
将对比例1制备得到的冻干制剂的复溶物、实施例1制备得到的本发明冻干制剂的复溶物和WB(全血)组进行成分检测分析，其中与细胞再生相关的成分：EGF(表皮细胞生长因子)、PDGF(血小板衍生因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)含量结果如图6所示：对比例1中未被激活完全的PRP由于浓缩导致其中各成分的浓度远高于全血中各成分的浓度，被激活了的本发明的冻干制剂中各成分的浓度也远高于全血中各成分的浓度，同时均高于未被激活完全的PRP中各成分的浓度。
三、动物实验
3.1实验设计：采用SD大鼠，分组3组：空白组、实验组和对比组；每组15只SD大鼠，使用皮钻在大鼠背包制造圆形皮肤创面，创面直径：10mm，术后使用头罩固定，其它饲养、管理条件均相同。在第7、14天拍照、取材，最后统计数据。
3.2实验处理：空白组不做任何处理；实验组采用本发明实施例1的冻干制剂处理；对比组采用对比例2的冻干制剂处理。
3.2.1实验组具体处理操作为：
(1)开放原始创面，进行清创；
(2)使用生理盐水分别溶解第一冻干制剂061及第二冻干制剂062(如图2中07所示)；复溶得到第一冻干制剂的复溶物071及第二冻干制剂的复溶物072，按照2：1的比例将第一冻干制剂的复溶物071及第一冻干制剂的复溶物072同时缓慢注射(如图2中08所示)在创口表面上；
(3)由于动物的活动很难控制，故待创面表面形成一层凝胶后，分别取大小合适的3M无菌纱布轻轻覆盖于创口，四周固定确保创口不会被其它外来因素污染或损伤，对实验结果造成干扰。
3.2.2对比组的处理方法：对比例2的冻干制剂的复溶物与实验组的第一冻干制剂061的处理部分相同，最后只有第一冻干制剂的复溶物071应用于创面治疗。
3.3实验结果：第7、14天各组创面愈合情况统计参见图7：实验组愈合速度略高于对比(对比例2)组，完全愈合时间与对比(对比例2)组相当，均优于空白组。
造成这种结果是因为对比例2的冻干粉复溶后没有形成凝胶，其无法在创面良好附着，功能成分容易流失。故理论上可以预期的：对比组创面的愈合速度会较实验组更慢，愈合时间会更长。本实验由于防护纱布的使用，会对实验结果有一定影响(该影响可以预期，且较不采取防护措施可能会带来的不良影响更可控)，故本实验结果只能体现“实验组愈合速度略高于对比(对比例2)组，完全愈合时间与对比(对比例2)组相当”。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种含再生因子的冻干制剂，其特征在于，所述冻干制剂包括：第一冻干制剂和第二冻干制剂；所述第一冻干制剂包括激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物被冻干后得到的冻干产物；所述第二冻干制剂包括贫血小板血浆被冻干后得到的冻干产物。
2.根据权利要求1所述的含再生因子的冻干制剂，其特征在于，用于制备所述第一冻干制剂的所述激活后的富血小板血浆和激活剂的混合物的体积与用于制备所述第二冻干制剂的贫血小板血浆的体积的比例范围为3:1～1:1。
3.根据权利要求1所述的含再生因子的冻干制剂，其特征在于，所述激活剂包括凝血酶；所述凝血酶在激活剂中的用量为400U/ml。
4.一种含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：
获得富血小板血浆和贫血小板血浆；
加入激活剂，激活所述的富血小板血浆；
将激活后的所述的富血小板血浆和激活剂的混合物制成第一冻干制剂；
将贫血小板血浆制成第二冻干制剂。
5.根据权利要求4所述的含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述的获得富血小板血浆和血浆的操作包括：采血；进行第一次离心；分离第一次离心得到的离心产物，得到第一分离产物；将第一分离产物进行第二次离心；分离第二次离心得到的离心产物，获得第二分离产物和贫血小板血浆。
6.根据权利要求5所述的含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述第一次离心的条件为：温度15-25℃，离心力100-500g；所述第二次离心的条件为：温度15-25℃，离心力不低于400g。
7.根据权利要求5所述的含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述分离第一次离心得到的离心产物的操作包括：吸弃红细胞层总体积90％～95％的红细胞，余下的离心产物即为所述的第一分离产物；将所述第一分离产物充分混匀，作为所述第二次离心的起始物。
8.根据权利要求5所述的含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述分离第二次离心得到的离心产物的操作包括：吸取贫血小板血浆层总体积的90％～95％的贫血小板血浆待用，余下的离心产物即为所述的第二分离产物；从待用的贫血小板血浆中取与所述的第二分离产物的体积比为3:1～1:1的贫血小板血浆待用。
9.根据权利要求4所述的含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述的富血小板血浆与所述激活剂的体积比为10:1～10:100。
10.根据权利要求9所述的含再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述激活剂包括凝血酶；所述凝血酶在激活剂中的用量为400U/ml。
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