CN115006711A - 一种负载活性自体再生因子的微针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载活性自体再生因子的微针及其制备方法和应用。具体地，两次离心血液，保留下层10％体积产物，37℃下放置1h，再0℃继续激活24h，释放ARF；再每1h降温10℃，梯度降温至‑80℃进行预冷，冷冻干燥得到ARF冻干制剂，其ARF浓度高，活性佳，无细胞碎片，更纯净。用水复溶此冻干制剂，混合透明质酸，填充微针模具，真空干燥后得到负载ARF的微针，该微针形貌完整和优异，没有空针和破针，储存2周后仍能保持ARF浓度，刺皮性能佳、溶解性能好、药物递送性能精准、材料降解性能优异，促进毛发生长相关蛋白表达，维持毛乳头细胞的细胞活性，减缓细胞凋亡，生物相容性好，且优于皮下注射PRP。

Description

一种负载活性自体再生因子的微针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地，涉及一种负载活性自体再生因子的微针及其制备方法和应用。
背景技术
头发是一个人的形象特征之一，头发的“价值”从古到今就一直存在。由于疾病、创伤、年龄、遗传、药物、压力和应激等各种原因，脱发已经成为一种常见病。雄激素性脱发(AGA)是最常见的脱发类型，通常发生在青春期之后，男性和女性身上都可出现。从宏观上来说，AGA的发病机制是遗传、雄激素代谢及雄激素受体的相互作用、毛囊(hair follicle，HF)及毛乳头细胞(dermal papilla cells，DPC)的自分泌和旁分泌功能等。AGA的病理表现是在皮肤富含毛发生长干细胞区域发现缩小的毛囊，毛囊周围有淋巴细胞和肥大细胞浸润。这种病理表现其实是跟脱发区域生长期缩短、静止毛囊增多和休止期延长有关。毛发生长周期包括三个不同的阶段，即生长期、退化期和休止期。毛囊是皮肤的附属物，包含上皮细胞和间质细胞。毛乳头(DP)位于毛囊底部，一般被认为是毛囊形态改变和毛发周期转换的基础。毛囊形态改变发生在毛发周期变化的过程中，而毛发再生就是在生长期激活的。
虽然AGA的治疗方式很多，但目前针对AGA的治疗效果还不确切，且会存在一些副作用和其他问题。如外用米诺地尔会引起多毛症、皮肤刺激或者过敏性皮炎、心血管疾病方面的意外，口服非那雄胺会引起女性的妇科、乳腺方面的疾病，性功能异常，抑郁症等。这两种药物都需要较长用药时间且需要患者有良好的医从性。螺内酯、环丙孕酮等仅局限女性患者使用。毛囊移植术则需要患者有一定的经济基础和承担手术过程、术后并发症的风险。还有其他一些新型药物缺乏大量的循证医学证据。
雄激素是通过与真皮毛乳头细胞上的受体相互作用来刺激身体某些部位的毛发生长，并通过促进毛发缩小和缩短生长期来抑制头皮毛发的生长。而真皮毛乳头细胞参与调节多种旁分泌生长因子的产生，包括胰岛素样生长因子(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)，均可刺激头发生长。富集血小板血浆(PRP)均含有丰富的各种生长因子，目前也是临床上用来治疗AGA的手段之一。但全球对治疗AGA使用的PRP的制备方法没达成统一标准，因此现阶段使用PRP仅作为AGA治疗的辅助手段。此外，PRP的制备设备价格昂贵，且制剂保质期短，不利于运输和保存。如果患者需要反复治疗就更需要多次抽血操作，增加了患者治疗过程不必要的痛苦，且降低患者的医从性。
活性自体再生因子(autologous regeneration factors，ARF)富集技术是一种基于提取自身血小板、脂肪组织或其他自体组织的固有细胞因子复合物而开发的完整工艺技术，为实现多种生长因子之间相互协同作用而产生的。ARF的优势是自体来源，无疾病传播、免疫排斥反应；其次，ARF中含有多种高浓度的生长因子，各种生长因子的比例与体内正常比例相符，使各生长因子发挥最佳的协同作用。但ARF冻干过程中，因无法引入外源性低温保存剂，存在水结晶的情况，会破坏ARF蛋白质，无法保持ARF高浓度和高活性。
若用ARF治疗脱发的方式像PRP一样是通过多次抽血多次皮下注射，患者可能无法忍受痛苦，进一步可能会影响治疗的效果。因此迫切需要研发一种新的给药途径来应用ARF技术，最终达到促进毛发再生的目的。经皮给药既没有口服药的首过消除效应，也避免注射过程引起的不适及必须到医院操作。但皮肤表皮层最外层的角质层肩负起皮肤的屏障功能，它能阻滞800～1000Da以上的物质从皮肤表面直接渗透进入真皮层或以下。而ARF里面富含的生长因子和蛋白的分子量已超过1000Da，因此单纯使用ARF涂抹在皮肤表面来吸收利用是无效的。微针(Microneedle，MN)是一种长度为10～2000μm，底座直径是10μm以上的微米级针矩阵，是一种新型的经皮给药方式。微针具有高效、安全、方便、无创、无痛和患者医从性高的优势。把目标物质掺和在可溶性微针里面，当微针插入真皮层后，目标物质随着高分子材料的溶解进入真皮层并在真皮层弥散开，最终通过局部皮肤附属器吸收。现有的微针制备方法，无法保证完整和优异的微针形貌，容易出现空针和破针，也无法保证负载ARF微针的刺皮性能、溶解性、药物递送性能及材料降解性能等，影响ARF治疗AGA的效果。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种负载活性自体再生因子的微针及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种含活性自体再生因子的冻干制剂的制备方法。
本发明的第二个目的是所述制备方法制备得到的含活性自体再生因子的冻干制剂。
本发明的第三个目的是提供一种负载所述活性自体再生因子的微针。
本发明的第四个目的是提供一种负载活性自体再生因子的微针的制备方法。
本发明的第五个目的是提供所述微针在制备防治脱发产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种含活性自体再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S11：混合血液和抗凝血剂，
进行离心，离心后，除去底层红细胞后混匀；
S12：离心，保留下层0.1％～20％体积的产物，与凝血剂和CaCl2充分混匀，25～40℃下静置0.9～1.1h，再0～4℃静置23～25h，得到活性自体再生因子初产物；
S13：将步骤S12得到的活性自体再生因子初产物平均每1h降温4～10℃，梯度降温至-10～-100℃，继续预冷1～8h，冷冻干燥。
优选地，步骤S11中离心的条件为300～600g，步骤S12离心的条件为700～1000g。优选地，步骤S11中离心的条件为400g，步骤S12离心的条件为800g。
优选地，步骤S12中37℃下静置1h，再0℃静置24h，得到活性自体再生因子初产物。
优选地，将步骤S12得到的活性自体再生因子初产物梯度降温至-80℃，每1h降温10℃，降温速度恒定。
优选地，将步骤S13得到的预冷的活性自体再生因子继续预冷4h，冷冻干燥。
所述制备方法制备得到的含活性自体再生因子的冻干制剂。
一种负载所述活性自体再生因子的微针。
一种负载活性自体再生因子的微针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S21：用水复所述含活性自体再生因子的冻干制剂，1400～1600g离心取上清液；
S22：混合透明质酸和步骤S21的上清液，所述透明质酸和步骤S21的上清液的用量比为800～1000mg：1.9～2.1mL，得到ARF-HA水溶液；
混合透明质酸和水，透明质酸和水的用量比为0.9～1.1g：0.9～1.1mL，得到HA空白水溶液；
S23：取步骤S22的ARF-HA水溶液填充微针模具，真空干燥4～6min；
S24：2900～3100g条件下离心含ARF-HA水溶液的微针模具9～11min，去除微针模具外面的ARF-HA水溶液，重复离心，得到离心后的微针模具；
S25：用步骤S22的HA空白水溶液填充步骤S24离心后的微针模具，制备微针贴片基座；
S26：待微步骤S25的针贴片干燥后，分离微针贴片和微针模具。
优选地，步骤S21中，离心1500g。
优选地，步骤S22中，所述透明质酸和步骤S21的上清液的用量比为900mg：2mL；
透明质酸和水的用量比为1g：1mL。
优选地，步骤S23中，真空干燥5min。
优选地，步骤S24中，3000g条件下离心含ARF-HA水溶液的微针模具10min。
优选地，所述微针模具的规格为：高度750～850μm，底座150～250μm，间距18～22μm，8～12×8～12阵列。
更优选地，所述微针模具的规格为：高度800μm，底座200μm，间距20μm，10×10阵列。
所述制备方法制备得到的负载活性自体再生因子的微针。
所述微针在制备防治脱发产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种负载活性自体再生因子的微针及其制备方法和应用。具体地，两次离心血液，保留下层10％体积产物，37℃下放置1h，再0℃继续激活24h，释放ARF，得到活性自体再生因子(ARF)初产物；再平均每1h降温10℃，梯度降温至-80℃进行预冷，冷冻干燥得到ARF冻干制剂，其ARF浓度高，活性佳，无细胞碎片，更纯净。用水复溶此冻干制剂，混合透明质酸，得到ARF-HA水溶液，填充微针模具，真空干燥后得到负载ARF的微针，该微针形貌完整和优异，没有空针和破针，储存2周后仍能保持ARF浓度，刺皮性能佳、溶解性能好、药物递送性能精准、材料降解性能优异，促进毛发生长相关蛋白表达，维持毛乳头细胞的细胞活性，减缓细胞凋亡，生物相容性好，且优于皮下注射富血小板血浆(PRP)。
附图说明
图1为ARF微针贴片制备方法示意图。其中，1为向微针模具表面添加载有ARF的HA溶液；2为抽真空、离心模具，将载有ARF的HA溶液推进模具的微针孔道；3为去除表面剩余的溶液；4为再次离心将微针孔道里面的药液压实；5为加入空白HA溶液离心以形成底座；6为室温干燥ARF微针贴片并从模具上分离。
图2为ARF微针贴片形貌尺寸图。其中，a为微针贴片整体尺寸；b和c为载有ARF的HA微针整体形貌，针尖处为棕色ARF，底座是透明的空白透明质酸；d为微针扫描电镜(SEM)图可见材料均匀无缺损的微针贴片；e为FITC标记的ARF针头和罗丹明b标记的透明质酸底座的ARF微针荧光图像。
图3为苏木素伊红(HE)染色后的大、小鼠皮肤切片。其中，a和b是使用微针贴片刺皮后大鼠皮肤的冰冻切片HE染色；c和d是使用微针贴片刺皮后小鼠皮肤的石蜡切片HE染色。
图4为在小鼠背部皮肤使用ARF微针后，分别在使用微针贴片0.5h、1h、2h、6h、12h、24h和48h时，从皮肤部位取出微针，并用体视镜观察微针溶解的情况。
图5为皮肤切片荧光显微镜图像，其中a和b分别是用罗丹明B和2.5％(w/v)FD4标记的ARF微针贴片刺皮1h后的皮肤切片荧光显微镜图像。
图6为ARF微针贴片的体内降解情况，微针贴片用FITC-dextran标记HA制作，分别在0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h监测皮肤荧光成像情况。(前面的0.5h、1h、2h、4h是在微针拔除前监测，每个组别3只小鼠)。
图7为不同浓度的ARF对人真皮毛乳头细胞增殖的影响。
图8为加入不同药物的培养基对人真皮毛乳头细胞增殖的影响。
图9为流式细胞技术检测ARF微针、空白微针、1％PRP和空白对照组处理对人真皮毛乳头细胞的凋亡的影响。
图10为分别使用ARF微针、空白微针、皮下注射PRP、外敷米诺地尔的方式来治疗脱发模型C57BL/6J小鼠。
图11为分别使用ARF微针、空白微针、皮下注射PRP、外敷米诺地尔的方式对脱发C57BL/6J小鼠的治疗效果。
图12为皮肤镜和扫描电镜评估新生毛发情况，其中，a为治疗12天皮肤镜检查；b和c分别为治疗21天新生毛发扫描电镜检查和毛干厚度统计。
图13为小鼠皮HE染色情况。其中a为治疗12天、20天小鼠皮肤HE染色；b和c分别为治疗12天和20天小鼠皮肤真皮厚度；d为治疗20天小鼠皮肤毛囊生长周期转换。
图14分别使用ARF微针、空白微针、皮下注射PRP、外敷米诺地尔的方式治疗15天后毛囊β-catenin免疫荧光染色图，其中β-catenin(绿色)位于毛囊，细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图15分别使用ARF微针、空白微针、皮下注射PRP、外敷米诺地尔的方式治疗15天后毛乳头Ki67+免疫荧光染色图，其中Ki67+细胞(绿色)位于毛乳头，细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图16为经过APF微针、空白微针、皮下注射PRP、外敷米诺地尔和未作任何处理(空白对照)这5种方式处理后15天小鼠表皮和毛发生长相关蛋白表达水平的Western blot检测，其中a为5种治疗方式中，5种目标蛋白与house-keeping基因的相对表达量结果，b为在经过5种治疗方式后，b-catenin蛋白的表达量，c为经过5种治疗方式后，CD34蛋白的表达量，d为经过5种治疗方式后，k15蛋白的表达量，e为经过5种治疗方式后，Loricrin蛋白的表达量，f为经过5种治疗方式后，K14蛋白的表达量。
图17为方法1和2的微针扫描电镜(SEM)图，其中a为方法1制备的微针，b为方法2制备的微针。
图18为方法4制备的微针形态。
图19为方法5制备得到的微针。
图20为3种方法复溶后提取蛋白的浓度。
图21为3种方法制备的微针对脱发C57BL/6J小鼠的治疗效果。
图22为3种方法制备的微针的皮肤镜和扫描电镜评估新生毛发情况，其中，a为治疗12天皮肤镜检查；b和c为治疗21天新生毛发扫描电镜检查和毛干厚度统计。
图23为方法1制备的APF微针在不同保存时间复溶后提取APF的浓度。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下为实施例中所用材料：
主要试剂：高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清，FBS(美国Gibco公司)；磷酸盐缓冲液，PBS(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶0.25％Trypsin-EDTA(美国Gibco公司)；青酶素(美国Gibco公司)；链霉素(美国Gibco公司)；二甲基亚砜DMSO(美国GIBCO公司)；透明质酸(MW≈9kDa)(山东华熙生物)；OCT包埋剂(日本sakura公司)；二甲苯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；无水乙醇(广州牌化学试剂厂)；冰醋酸(广州牌化学试剂厂)；苏木素染液(美国Sigma公司)；伊红染液(美国Sigma公司)；中性树胶(海德创业(北京)生物科技有限公司)；异硫氰酸荧光素葡聚糖(FD4)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；罗丹明B(上海麦克林生化科技有限公司)；异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；CCK-8试剂盒(中国同仁化学研究所)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；总蛋白提取试剂盒(美国Thermo公司)；蛋白浓度检测试剂BCA Protein Assay Kit(美国Pierce公司)；Anti-β-Catenin抗体(美国Santa Cruz Biotechnology)；Anti-CD34抗体(美国Thermo公司)；Anti-Cytokeratin15抗体(英国abcam公司)；Anti-Cytokeratin14抗体(美国SantaCruz Biotechnology)；Anti-loricrin抗体(美国Proteintach公司)；Anti-β-actin抗体(英国abcam公司)；HRP标记山羊抗兔IgG(美国Proteintach公司)；HRP标记山羊抗鼠IgG(美国Proteintach公司)；蛋白上样缓冲液Laemmli Sample Buffer(英国abcam公司)；硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad公司)；蛋白Marker(美国Thermo公司)；考马斯亮蓝(美国Bio-Rad公司)；显影液(美国Thermo公司)；Western blot一抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)；Western blot二抗稀释液(上海碧云天生物技术有限公司)；Anti-Ki67抗体(英国abcam公司)；驴抗小鼠IgG(H+L)(英国abcam公司)；枸橼酸修复液(英国abcam公司)；过氧化氢液(英国abcam公司)；DAPI(英国abcam公司)；人真皮毛乳头细胞(Human dermal papillacells，HDPCs)(上海青旗生物技术发展有限公司)。
主要实验耗材：6孔板(美国Corning公司)；96孔板(美国Corning公司)；T25 cm2Flask(美国Corning公司)；T75 cm2 Flask(美国Corning公司)；0.22μm孔径细菌过滤器(美国MILLIPORE公司)；细胞一次性计数板(美国Thermo公司)；50mL离心管(美国Corning公司)；15mL离心管(美国Corning公司)；5mL EP管(美国Axygen公司)；2mL EP管(美国Axygen公司)；1.5mL EP管(美国Axygen公司)；10cm培养皿(美国Corning公司)。
主要仪器设备：生物安全柜(美国Thermo公司)；细胞培养箱(美国Thermo公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；智能细胞分析仪(上海睿钰生物科技有限公司)；微量移液器(美国Ependorf公司)；微量注射器(瑞士Halmiton公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；离心机(美国Thermo公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；低温混和型研磨仪(德国Retsch公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；酶标仪(瑞士Tecan公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；chemiDoc-It515化学发光成像系统(美国UVP公司)；病理冰冻切片机(日本sakura公司)；病理石蜡切片机(德国Leica公司)；体视镜(日本OLYMPUS公司)；IVIS小动物活体成像系统(日本PerkinElmer公司)；扫描电镜(SEM)(德国Zeiss公司)。
实施例1人、大鼠ARF和PRP提取及纯化
一、实验方法
1.人活性自体再生因子(ARF)的提取及纯化
(1)从健康志愿者中收集36mL人外周血，从中提取ARF：使用含3.2％柠檬酸钠抗凝剂试管(9mL)收集健康志愿者的外周血样品。采血后轻微摇晃使血液与抗凝剂充分混合。
(2)ARF通过两步离心法进行制备：步骤1采集的血液在第1次离心后，除去底层的红细胞后摇匀，离心的条件为400g，离心10min；第2次离心，离心的条件为800g，离心10min，抽去上层大部分血清，保留下层10％体积的产物，重复摇匀后转移到装有凝血酶+CaCl2的15mL离心管中，在37℃下放置1h，再0℃冰箱继续激活24h，以使其释放ARF，得到活性自体再生因子初产物。
(3)将步骤2活性自体再生因子初产物按照每1h降温10℃的方式，经8h降温到-80℃，继续预冷4h后，再使用冻干机冻干48h，得到ARF冻干制剂。将ARF冻干制剂储存在-20℃冰箱备用。
2.大鼠、小鼠活性自体再生因子(ARF)的提取及纯化
(1)大鼠、小鼠ARF是从SD大鼠主动脉中抽取的9mL动脉血制备得到。用2％戊巴比妥钠(20mg/mL)按2mL/kg体重的剂量对SD大鼠麻醉，用1％戊巴比妥钠(10mg/mL)按0.08mL/10g体重的剂量对C57BL/6J小鼠麻醉。麻醉成功后开腹暴露腹主动脉并进行腹主动脉穿刺，使用含3.2％柠檬酸钠抗凝剂试管(9mL)收集血液样品。采血后轻微摇晃使血液与抗凝剂充分混合。
(2)ARF提取纯化和冻干方法与人来源ARF提取纯化方法一致。
3.人、大鼠富血小板血浆(PRP)的提取
分别按照上述人、大鼠ARF的提取纯化方法至第2次离心后，去除上层血浆，将底层混合保存下来，即得到人、大鼠富血小板血浆(PRP)。
二、实验结果
实施例1制备出纯度和活性较好的ARF和PRP。
实施例2人、大鼠ARF提取及纯化
一、实验方法
1.人活性自体再生因子(ARF)的提取及纯化
(1)人外周血获取方法与实施例1一致。
(2)ARF通过两步离心法进行制备：步骤1采集的血液在第1次离心后，除去底层的红细胞后摇匀，离心的条件为300g，离心10min；第2次离心，离心的条件为700g，离心10min，抽去上层大部分血清，保留下层0.1％体积的产物，重复摇匀后转移到装有凝血酶+CaCl2的15mL离心管中，在25℃下放置0.9h，再0℃冰箱继续激活23h，以使其释放ARF，得到活性自体再生因子初产物。
(3)将步骤2活性自体再生因子初产物按照每1h降温4℃的方式，降温到-10℃，继续预冷1h后，再使用冻干机冻干48h，得到ARF冻干制剂。将ARF冻干制剂储存在-20℃冰箱备用。
2.大鼠、小鼠活性自体再生因子(ARF)的提取及纯化
(1)大鼠、小鼠收集血液样品的方法与实施例1一致。
(2)ARF提取纯化和冻干方法与实施例2人来源ARF提取纯化方法一致。
二、实验结果
实施例2制备出纯度和活性较好的ARF。
实施例3人、大鼠ARF提取及纯化
一、实验方法
1.人活性自体再生因子(ARF)的提取及纯化
(1)人外周血获取方法与实施例1一致。
(2)ARF通过两步离心法进行制备：步骤1采集的血液在第1次离心后，除去底层的红细胞后摇匀，离心的条件为600g，离心10min；第2次离心，离心的条件为1000g，离心10min，抽去上层大部分血清，保留下层20％体积的产物，重复摇匀后转移到装有凝血酶+CaCl2的15mL离心管中，在40℃下放置1.1h，再4℃冰箱继续激活25h，以使其释放ARF，得到活性自体再生因子初产物。
(3)将步骤2活性自体再生因子初产物按照每1h降温10℃的方式，降温到-100℃，继续预冷8h后，再使用冻干机冻干48h，得到ARF冻干制剂。将ARF冻干制剂储存在-20℃冰箱备用。
2.大鼠、小鼠活性自体再生因子(ARF)的提取及纯化
(1)大鼠、小鼠收集血液样品的方法与实施例1一致。
(2)ARF提取纯化和冻干方法与实施例3人来源ARF提取纯化方法一致。
二、实验结果
实施例3制备出纯度和活性较好的ARF。
实施例4 ARF微针的制备
一、实验方法
1.制备微针：
(1)称取450mg实施例1制备得到的小鼠和大鼠的ARF冻干制剂，加入3mL去离子水，搅拌和漩涡振荡，使ARF充分混合复溶，1500g离心后抽取上清液备用。
(2)称量900mg透明质酸(HA)(MW≈9kDa)，用2mL步骤1复溶的ARF上清液溶解，制备成ARF-HA水溶液。另外称量2g透明质酸(MW≈9kDa)，与2mL去离子水混合均匀，制备成HA空白水溶液。
(3)选用微针的规格：高度800μm，底座200μm，间距20μm，10×10阵列的PDMS模具，取30μL步骤2制备的ARF-HA水溶液滴入所述PDMS模具，放在真空干燥皿，抽真空至-0.06MPa，并保持5min。
(4)将步骤3加有ARF-HA水溶液的PDMS模具放进50mL离心管，3000g离心10min后，将ARF-HA水溶液推进模具的微针孔道，铲去表面多余ARF-HA水溶液。
(5)重新将步骤3的PDMS模具放进50mL离心管，用3000g离心5min，将微针孔道里面的ARF-HA水溶液压实。
(6)取50μL HA空白水溶液滴入PDMS模具，用3000g离心5min以制备微针贴片基座。
(7)10～37℃条件下干燥12h后轻柔地将微针贴片从PDMS模具上分离下来，得到ARF微针贴片。
2、通过体视镜、光学显微镜和扫描电镜拍摄观察上述方法制备得到的ARF微针贴片。
二、实验结果
如图1所示，ARF微针贴片是通过模具法制备的，操作流程如图1所示，需要抽真空、两步离心和干燥分离。其中，1为向微针模具表面添加载有ARF的HA溶液；2为抽真空、离心模具，将载有ARF的HA溶液推进模具的微针孔道；3为去除表面剩余的溶液；4为再次离心将微针孔道里面的药液压实；5为加入空白HA溶液离心以形成底座；6为室温干燥ARF微针贴片并从模具上分离。
图2是ARF微针贴片通过体视镜、光学显微镜和扫描电镜拍摄的整体和放大视图。微针贴片是10×10阵列，共100个微针。针头呈三棱锥，尺寸均匀。每根针的高度约为800μm，底部直径为200μm，针与针之间的间距为500μm。其中，a为微针贴片整体尺寸；b和c为载有ARF的HA微针整体形貌，针尖处为棕色ARF，底座是透明的空白透明质酸；d为微针扫描电镜(SEM)图可见材料均匀无缺损的微针贴片；e为FITC标记的ARF针头和罗丹明b标记的透明质酸底座的ARF微针荧光图像。
实施例5 ARF微针的制备
一、实验方法
1.制备微针：
(1)称取450mg实施例1制备得到的小鼠和大鼠的ARF冻干制剂，加入3mL去离子水，搅拌和漩涡振荡，使ARF充分混合复溶，1400g离心后抽取上清液备用。
(2)称量800mg透明质酸(HA)(MW≈9kDa)，用1.9mL步骤1复溶的ARF上清液溶解，制备成ARF-HA水溶液。另外称量1.8g透明质酸(MW≈9kDa)，与2.2mL去离子水混合均匀，制备成HA空白水溶液。
(3)选用微针的规格：高度750μm，底座150μm，间距18μm，8×12阵列的PDMS模具，取30μL步骤2制备的ARF-HA水溶液滴入所述PDMS模具，放在真空干燥皿，抽真空至-0.06MPa，并保持4min。
(4)将步骤3加有ARF-HA水溶液的PDMS模具放进50mL离心管，2900g离心9min后，将ARF-HA水溶液推进模具的微针孔道，铲去表面多余ARF-HA水溶液。
(5)重新将步骤3的PDMS模具放进50mL离心管，用2900g离心5min，将微针孔道里面的ARF-HA水溶液压实。
(6)取50μL HA空白水溶液滴入PDMS模具，用2900g离心5min以制备微针贴片基座。
(7)10～37℃条件下干燥12h后轻柔地将微针贴片从PDMS模具上分离下来，得到ARF微针贴片。
2、通过体视镜、光学显微镜和扫描电镜拍摄观察上述方法制备得到的ARF微针贴片。
二、实验结果
得到的ARF微针贴片整体形貌优异，均匀无缺损。
实施例6 ARF微针的制备
一、实验方法
1.制备微针：
(1)称取450mg实施例1制备得到的小鼠和大鼠的ARF冻干制剂，加入3mL去离子水，搅拌和漩涡振荡，使ARF充分混合复溶，1600g离心后抽取上清液备用。
(2)称量1000mg透明质酸(HA)(MW≈9kDa)，用2.1mL步骤1复溶的ARF上清液溶解，制备成ARF-HA水溶液。另外称量2.2g透明质酸(MW≈9kDa)，与1.8mL去离子水混合均匀，制备成HA空白水溶液。
(3)选用微针的规格：高度850μm，底座250μm，间距22μm，12×8阵列的PDMS模具，取30μL步骤2制备的ARF-HA水溶液滴入所述PDMS模具，放在真空干燥皿，抽真空至-0.06MPa，并保持6min。
(4)将步骤3加有ARF-HA水溶液的PDMS模具放进50mL离心管，3100g离心11min后，将ARF-HA水溶液推进模具的微针孔道，铲去表面多余ARF-HA水溶液。
(5)重新将步骤3的PDMS模具放进50mL离心管，用3100g离心5min，将微针孔道里面的ARF-HA水溶液压实。
(6)取50μL HA空白水溶液滴入PDMS模具，用3100g离心5min以制备微针贴片基座。
(7)10～37℃条件下干燥12h后轻柔地将微针贴片从PDMS模具上分离下来，得到ARF微针贴片。
2、通过体视镜、光学显微镜和扫描电镜拍摄观察上述方法制备得到的ARF微针贴片。
二、实验结果
得到的ARF微针贴片整体形貌优异，均匀无缺损。
实施例7微针刺皮性能检测
一、实验方法
1.ARF微针贴片大鼠刺皮性能检测
(1)用2％戊巴比妥钠(20mg/mL)按2mL/kg体重的剂量对SD大鼠麻醉。将实施例4制备的ARF微针贴片插入剃毛后的SD大鼠的背部皮肤，5min后拔除微针贴片，切下使用了微针贴片的皮肤。立即向皮肤中加入O.C.T凝胶包裹，冷冻固定后放在切片机上，调整皮肤组织切片厚度为7μm。
(2)用4％多聚甲醛浸泡大鼠皮肤组织切片1min，得到4％多聚甲醛浸泡的大鼠皮肤组织切片。
(3)用蒸馏水浸泡步骤2的皮肤组织切片5s，得到蒸馏水浸泡的大鼠皮肤组织切片。
(4)用苏木素液染色步骤3的皮肤组织切片1min，再用流水冲洗5s，得到苏木素液染色的大鼠皮肤组织切片。
(5)用1％盐酸酒精对步骤4的皮肤组织切片分色2s，得到分色后的大鼠皮肤组织切片。
(6)用伊红液染色步骤5的皮肤组织切片1min，再用流水冲洗5s，得到伊红液染色的大鼠皮肤组织切片。
(7)步骤6的皮肤组织切片依次经80％酒精浸泡2s、95％酒精浸泡2s、无水乙醇浸泡2次，每次2s，二甲苯浸泡2次，每次3s，中性树胶封片。
(8)显微镜下观察拍照。
2.ARF微针小鼠皮刺皮性能检测
(1)用1％戊巴比妥钠(10mg/mL)按0.08mL/10g体重的剂量对C57BL/6J小鼠麻醉。将实施例4制备的ARF微针贴片插入剃毛后的小鼠背部皮肤，30min后连同微针贴片切下皮肤。皮肤组织用4％的多聚甲醛固定24h，蒸馏水冲洗干净后，用70％酒精浸泡保存。
(2)将步骤1的小鼠皮肤组织依次用70％、80％、90％、95％、100％不同体积浓度梯度的乙醇脱水，再用二甲苯使皮肤组织透明，包埋于石蜡中，用切片机将蜡块切成7μm厚度的皮肤组织切片。
(3)将步骤2的皮肤组织切片经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡15min脱蜡，再依次经100％、95％、90％、80％、70％体积浓度的乙醇和蒸馏水各浸泡5min复水，得到复水后的皮肤组织切片。
(4)用苏木素液将步骤3复水后的皮肤组织切片染色5min，再用流水冲洗1min，得到苏木素液染色的小鼠皮肤组织切片。
(5)用含有1％盐酸的乙醇将步骤4苏木素液染色的小鼠皮肤组织切片分色5s，再用流水冲洗30s，得到分色后的小鼠皮肤组织切片。
(6)用伊红液将步骤5分色后的小鼠皮肤组织切片染色1min，再用流水冲洗5s，得到伊红液染色的小鼠皮肤组织切片。
(7)将步骤6伊红液染色的小鼠皮肤组织切片依次经95％乙醇浸泡5s、100％乙醇浸泡3min脱水，二甲苯Ⅱ浸泡5min、二甲苯Ⅰ浸泡5min使皮肤组织透明，再用中性树胶封片。
(8)显微镜下观察拍照。
二、实验结果
微针突破皮肤表皮层的角质层，把药物递送到真皮层，使药物得到吸收利用，是微针生效的关键。通过观察微针插入皮肤的深度来判断微针是否到达真皮层。图3a和b表明微针能够刺穿表面的角质层，并且深度能到达274.11±29.27μm(n＝10)。图3c和d表明从皮肤表面至真皮层有微针形成的若干孔道，孔道内仍有微针存在，部分微针针尖可见基质材料HA已溶解，微针深度能到达231.34±17.58μm(n＝10)。小鼠的皮肤角质层厚度是5μm，表皮层厚度是13μm。大鼠的皮肤角质层厚度是18μm，表皮层厚度是32μm。因此，微针插入的深度能够超过大鼠和小鼠的表皮层并到达真皮层。
实施例8微针溶解性能检测
一、实验方法
(1)用实施例7的方法对小鼠麻醉。将实施例1制备的微针贴片插入剃毛后的小鼠的背部皮肤，并用胶带固定微针贴片。
分别在使用微针贴片0.5h、1h、2h、6h、12h、24h和48h时，从皮肤部位取出微针，并用体视镜观察微针溶解情况。
二、实验结果
结果如图4所示，微针贴片成功地刺入小鼠皮肤而且没有任何弯曲或断裂。在0.5h微针贴片已经有轻微溶解，在1h已经大部分溶解，2h后针头完全溶解，只剩下贴底座部分，6h后与2h后状况相当，到12h底座也出现溶解，48h后底座开始崩解，以上结果显示实施例1制备的微针溶解性能好。
实施例9微针介导的药物递送性能检测
一、实验方法
(1)用实施例7的方法对小鼠麻醉。
(2)分别用加入罗丹明B10ug/mL和异硫氰酸荧光素葡聚糖(Fluoresceinisothiocyanate-labeled dextran，FD4)1mg/mL的微针，插入剃毛后的小鼠的背部皮肤，1h后擦除微针并切下这部分皮肤。立即向皮肤中加入O.C.T凝胶包裹，冷冻固定后放在切片机上，调整皮肤组织切片厚度为7μm。
(3)显微镜下观察拍照。
二、实验结果
分别用荧光标志物罗丹明B和异硫氰酸荧光素葡聚糖，标记实施例1制备的微针贴片的基质材料HA，以检测微针溶解的同时，能否把ARF释放出来并且在真皮层扩散传递。通过图5a可观察到，使用罗丹明B标记的微针，针道附近的皮肤组织有强烈的荧光信号，并且有部分荧光信号已经扩散。通过图5b可观察到，4000Da分子量的异硫氰酸荧光素葡聚糖标记的ARF微针，成功地将FD4送入皮肤，FD4的沉积定位于所产生的微通道附近。随着微针的溶解，FD4从可溶性微针阵列中释放出来，并通过扩散传递到真皮层。
实施例10微针基质材料HA降解性能检测
一、实验方法
(1)用异硫氰酸荧光素葡聚糖标记的透明质酸，按照实施例1的方法制备微针贴片，底座使用不含异硫氰酸荧光素葡聚糖标记的HA。
(2)用用实施例7的方法对小鼠麻醉。
将步骤1制备的微针贴片插入剃毛后的小鼠的背部皮肤，4小时后拔除微针。用IVIS光谱成像系统，分别在0.5h、1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h监测皮肤荧光成像情况。(前面的0.5h、1h、2h、4h是在微针拔除前监测，每个组别3只小鼠)
二、实验结果
结果如图6所示，通过生物荧光图像可见0～1h过程中，微针形态相对较为稳定，未发生较大变化；2h后微针覆盖面积开始扩大，提示药物开始扩散，4～48h中微针覆盖面积逐步扩大，提升药物进一步向四周扩散，至72h后信号完全消失，提示微针完全溶解。
实施例11ARF微针对人真皮毛乳头细胞活性检测
一、实验方法
1、人真皮毛乳头细胞(Human dermal papilla cells，HDPCs)的传代步骤如下：
(1)购置的HDPCs(T25 cm2 Flask)在培养箱静置4h
(2)在超净工作台配置培养HDPCs的高糖DMEM培养基：10％胎牛血清(FBS)、1％Penicilllin-Streptomycin Solution(青霉素Penicilllin 10000U/mL、链霉素Streptomycin 10000U/mL)和高糖DMEM基础培养基。
(3)在37℃水浴箱中预热步骤2配置好的高糖DMEM培养基。
(4)在超净工作台更换在T25 cm2 Flask静置4h HDPCs的培养基。
(5)在超净工作台中倒掉步骤4的培养基，加入胰蛋白酶-EDTA消化HDPCs 1min。
(6)用显微镜观察，可见部分HDPCs已悬浮，再加入步骤3 37℃预热的高糖DMEM培养基，终止消化并用移液枪轻轻吹打细胞，得到细胞悬液。
(7)将步骤6得到的细胞悬液收集到15mL离心管中，1200rpm离心5min。
(8)弃步骤7离心后的上清液，用步骤3 37℃预热的高糖DMEM培养基重悬细胞，用细胞计数器计数细胞，以10000个/cm2的密度将人真皮毛乳头细胞接种于75cm2培养瓶中。
(9)将步骤8的培养瓶移入培养箱中，37℃、5％CO2条件下培养HDPCs，每隔1～2天更换一次高糖DMEM培养基，待细胞融合至80％左右进行传代，冻存传代培养的HDPCs，用于后续实验。
2、使用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)测定加入不同组分的HDPCs增殖活性。
(1)用PBS分别浸泡实施例1制备的ARF微针和空白微针的针尖处30min，收集溶解后的液体，分别命名为ARF微针提取物和空白微针提取物。
(2)将上述传代培养后的HDPCs按照2000个/孔的量接种于96孔板中培养4h，待其贴壁后加入步骤1制备的含有不同组分的培养基(ARF微针提取物、空白微针提取物、含1％ARF的PBS溶液和含1％PRP的PBS溶液)进行干预。
(3)在预设的时间点(24h、48h和72h)吸走原有培养基，在每个孔中加入含有10％CCK-8试剂的高糖DMEM培养基。
(4)于培养箱中孵育4h。
(5)使用多功能酶标仪在波长450nm处测定每孔的吸光度。(每个组别有5个生物学重复)。
进行上述实验前已进行ARF最佳实验浓度测试，通过在培养基中添加0％～15％浓度的ARF来进行HDPCs的细胞增殖活性测试，经过测试后优选细胞增殖活性最高的浓度，即1％ARF进行实验。
二、实验方法
CCK-8分析显示，HDPCs中加入ARF 24h后，ARF能在≤5％的浓度下促进HDPC增殖，并在1％的浓度下达到最大值(图7)。如图8所示，加入PBS溶解ARF微针针尖得到的提取物、1％ARF、1％PRP在24h、48h和72h这3个时间段对HDPC的增殖效果都优于PBS溶解空白微针针尖得到的提取物和空白对照组，而在24h往培养基中加入PBS溶解ARF微针针尖得到的提取物、1％ARF、1％PRP这3者对HDPC无显著差异，在48h(P<0.05)和72h(P<0.01)，往培养基中用加入PBS溶解ARF微针针尖得到的提取物和1％ARF比加入1％PRP对HDPC的增殖效果好。
实施例12ARF微针对人真皮毛乳头细胞凋亡检测
一、实验方法
膜联蛋白V(Annexin V)可在凋亡早期与由细胞膜内外翻到细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸特异性结合。碘化丙啶(PI)虽然不能透过完整的细胞膜，但是可以在凋亡的中晚期和坏死细胞中进入细胞，并与细胞核进行特异性结合。因此使用两者染料匹配即可区分细胞早晚期凋亡。使用Annexin V-FITC/PI试剂盒测量加入不同组分(ARF微针提取物、空白微针提取物、1％ARF、1％PRP)的培养基培养人真皮毛乳头细胞后，细胞的凋亡情况，具体步骤如下：
(1)用PBS分别浸泡ARF微针和空白微针针尖处30min后收集溶解后的液体，分别命名为ARF微针提取物和空白微针提取物。
(2)将HDPCs按照50万/孔的量接种于6孔板中培养4h，待其贴壁后加入含有不同组分的培养基(ARF微针提取物、空白微针提取物、1％ARF、1％PRP)进行干预。另外有两孔加入高糖DMEM全培养基。
(3)24h后每孔加入500μL胰蛋白酶消化1min，加入含FBS的高糖DMEM培养基1mL终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，收集至对应15mL离心管中。
(4)每管加入2mL PBS，1000rpm，离心5min。
(5)弃上清，将细胞重悬于100μL binding buffer，加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后继续加入10μL PI，混匀冰上避光孵育15min。
(6)使用BD流式细胞仪检测细胞凋亡情况。同时以不加Annexin V-FITC和PI作为阴性对照。
二、实验结果
使用基于Annexin V和PI染色的HDPC荧光活化细胞分选(FACS)评估VPA的生物相容性(图9)，鉴定活细胞(-/-)、早期凋亡细胞(+/-)和晚期凋亡细胞(+/+)。ARF微针、空白微针、1％PRP和空白对照组处理分别维持94.6％、90％、94.2％和97.5％的活细胞。因此，实施例1制备的ARF微针具有良好的生物相容性。
实施例13 ARF微针治疗C57BL/6J小鼠脱发模型的疗效验证
一、实验方法
1、建立C57BL/6J小鼠脱发模型
实验动物为SPF级别的C57BL/6J小鼠，周龄为6周，来源于广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号:SCXK(粤)2013-0002，所有动物实验过程均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》相关条例规定。
(1)6周龄新购小鼠在广州医科大学动物试验中心饲养1周。
(2)用实施例7的方法对7周龄小鼠麻醉。
(3)麻醉成功后用剃毛器剃光小鼠背部皮肤。
(4)用脱毛膏涂抹剃毛处皮肤10min，用温水清洗干净至脱毛处皮肤光滑无毛发。
(5)麻醉复苏后观察小鼠情况待第2天实验。
2、实验分组及治疗方式
剃毛的C57BL/6J小鼠随机分为五组：ARF微针组，空白微针组、PRP皮下注射组、米诺地尔外敷组和空白对照组，所有组数量为n＝10。
(1)ARF微针组：在小鼠剃毛后的第1d、3d、5d、7d和第9d插入实施例4制备的ARF微针，用胶布固定后4h拔除。
(2)空白微针组：在小鼠剃毛后第1d、3d、5d、7d和第9d插入空白微针，用胶布固定后4h拔除。
(3)PRP皮下注射组：在小鼠剃毛后1d用微量注射器注射相当于5次ARF微针里面ARF蛋白总量的PRP。
(4)米诺地尔外敷组：在小鼠剃毛后第1d、3d、5d、7d和第9d，在剃毛区涂抹2％的米诺地尔。
(5)空白对照组：在小鼠剃毛后不行任何操作。
实验过程监测小鼠体重和食物效率比、生长环境。
3、小鼠皮皮肤镜检测
(1)用实施例7的方法对小鼠麻醉。
(2)用皮肤镜观察按上述5个组别治疗小鼠后第12天背上治疗区域情况。(所有组别数量为n＝4)
4、小鼠毛发扫描电镜检测
(1)用实施例7的方法对小鼠麻醉。
(2)切取按上述5个组别治疗小鼠后第21天背上治疗区域的带有表面毛发的皮肤。
(3)用扫描电镜(SEM)观察毛发与皮肤连接处的毛发情况。(所有组别数量为n＝4)
5、小鼠皮组织学检测
按上述5个组别治疗小鼠，用实施例7的方法对小鼠麻醉，用剃毛器剃光小鼠背部皮肤，用脱毛膏涂抹剃毛处皮肤10min，用温水清洗干净至脱毛处皮肤光滑无毛发后，切取皮肤组织。小鼠组织制片、HE染色步骤与实施例7制备和处理小鼠组织切片相同，显微镜下观察拍照。
(3)免疫荧光分析
大鼠皮肤组织获取、制片、染色步骤与实施例7制备和处理大鼠组织切片相同，显微镜扫描观察结果。
6、Western blot检测小鼠皮肤表皮和毛囊相关蛋白表达
(1)小鼠皮肤总蛋白提取并检测
①按上述5个组别治疗小鼠，用相同的麻醉方法和去毛方法处理治疗区域毛发，切取皮肤组织，用PBS漂洗残留血液，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂，用电动匀浆器在冰上将小鼠皮肤组织研磨成浆。待充分裂解后，4℃、14000×g条件下离心10min，上清即为细胞总蛋白，取上清分装2～3管并于-80℃保存。
②BCA法：1mg/mL蛋白标准品按稀释好的浓度梯度加到96孔板的标准品孔中测量标准曲线。用标本稀释液将提取好的总蛋白样本稀释10倍，加到96孔板的样品孔中。试剂A与试剂B(50:1)混匀，配制成工作液。每孔加入200μL工作液，37℃孵育30min后用酶标仪测量OD值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。所述试剂A为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16％酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调PH值至11.25；试剂B为：4％硫酸铜；试剂A和试剂B中各组分百分含量按质量分数计算。
(2)蛋白电泳和western blot检测
①配制电泳凝胶体系：
12％分离胶：超纯水1.6mL、1.5M Tris1.3 mL、30％丙烯酰胺2.0mL、10％SDS0.05mL、10％APS0.05mL、TMEMD 0.002mL。
4％聚合胶：超纯水1.1mL、1.0M Tris0.19 mL、30％丙烯酰胺0.201mL、10％SDS0.015 mL、10％APS0.015 mL、TMEMD0.0015 mL。
②电泳分离蛋白
1)将提取的小鼠皮肤总蛋白样品与Loading buffer(2X)以1：1比例混匀，沸水煮10min。
2)按照上述配方配制12％的分离胶和4％的聚合胶，准备好电泳模具。
3)每孔上样10μg蛋白，以1×电泳缓冲液，65V 30min、105V 2h的条件进行电泳，待溴酚蓝移动至凝胶下缘处停止电泳。
③western blot检测
1)取出凝胶，浸泡于转膜液中，按照Marker切胶，裁剪硝酸纤维素膜，按照阴极－海绵－胶－膜－海绵－阳极的顺序将夹板夹紧，进行转膜。
2)采用湿转法进行转膜，以1×转膜缓冲液按105V 1h的条件转膜。转膜完成后，取下硝酸纤维素膜，用含5％脱脂奶粉的洗膜缓冲液(Tris buffered saline Tween,TBST)室温摇床上封闭2h。用TBST冲洗一次。
3)按比例稀释并孵育β-catenin、K14、Loricrin，CD34、K15、β-actin，在4℃摇床上孵育过夜。
4)孵育一抗后，用1×TTBS在摇床上洗涤共5次，每次5min。
5)按比例稀释并孵育二抗，在室温摇床上孵育2h。
TBST洗膜五次，每次5min，后转移至TBST浸泡保存。在暗室内将发光剂A、B混匀，滴加在膜上，使用chemiDoc-It515化学发光成像系统检测蛋白条带。
二、实验结果
1、体内实验治疗的直观效果
如图10所示，以剃毛后不做任何处理为空白对照组，分别使用ARF微针、空白微针、皮下注射PRP、外敷米诺地尔的方式来治疗脱发模型C57BL/6J小鼠。如图11所示，治疗第5天(经两次治疗后)ARF微针组小鼠的治疗部位已经出现色素沉着，与其他4组形成鲜明对比。到治疗第9天ARF微针组小鼠的治疗部位已经出现毛发，非微针治疗区域也出现强烈的色素沉着。皮下注射PRP组治疗部位也开始出现色素沉着，外敷米诺地尔也出现较浅的色素沉着，而空白微针和空白对照组仍无色素沉着表现。到第12天与出现色素沉着的空白微针组和空白对照组相比，ARF微针组毛发覆盖区域已经覆盖至剃毛的全部区域，长出比较浓密的毛发。皮下注射PRP组和外敷米诺地尔组的治疗区域也出现毛发。治疗第十五天后，ARF微针组毛发已经极为浓密，空白微针覆盖面积约为70％，PRP组约为60％，米诺地尔外敷组约为90％，但是毛发不够浓密，空白组则则只是刚刚长出毛发。一直到治疗第20天，无论是从毛发的浓密程度，还是毛发的长度的治疗效果来看，均是ARF微针组优于皮下注射PRP组和外敷米诺地尔组，再优于剩余两组。
2、皮肤镜和扫描电镜评估新生毛发
图12a显示治疗第12天用皮肤镜观察新生毛发情况，毛发的浓密程度和毛干长度从高到低排序为：ARF微针组﹥皮下注射PRP组、外敷米诺地尔组﹥空白微针组﹥空白对照组；图12b扫描电子显微镜(SEM)显示，5个组别的新生毛干表面均未见损伤；图12b和图12c显示，新生毛干以ARF微针组最粗(50.26±4.24μm)，其次为外敷米诺地尔组(35.91±2.01μm)和皮下注射PRP组(36.88±2.21μm)，最后则为空白微针组(22.50±2.33μm)和空白对照组(26.38±1.27μm)。ARF微针治疗后的毛干厚度(50.26±4.24μm)明显高于PRP皮下注射的毛干厚度(36.88±2.21μm)。(n＝3)
3、小鼠皮组织学检测
(1)小鼠皮HE染色
如图13a提示，治疗第12天可见ARF微针组的毛囊较其余4组更加粗大和致密，其次是PRP皮下注射组和米诺地尔外敷组，最后是空白微针组和空白对照组。图13b提示ARF微针治疗后的真皮厚度大于其余4组(P<0.01)，而其余4组之间的真皮厚度没有明显差异。治疗第20天可见5组治疗组已经不存在生长期的毛囊，图13d表明除了ARF微针、PRP皮下注射和米诺地尔外敷组的大部分满囊仍处于退化期，空白微针和空白对照组的毛囊已基本过渡至休止期。图13c提示第20天时ARF微针治疗后的真皮相比其余4组增厚(P<0.001)，外敷米诺地尔组的真皮厚度其次，比起除ARF微针组外的剩余3组均有统计学差异。而PRP皮下注射组则比空白微针组有所不足。
(2)小鼠皮免疫荧光染色
为了进一步研究各组处理后的信号转导的变化，我们在第15天进行了毛囊β-catenin免疫荧光染色(图14)。结果可观察到用ARF微针处理的小鼠β-catenin染色最强，在整个毛囊中都存在，其次是用PRP皮下注射和米诺地尔处理的小鼠。Ki67+在细胞核中表达，主要在毛基质细胞中表达。用Ki67+免疫荧光法检测毛乳头毛囊中的细胞活力。图15显示，Ki67+在第15天的表达在ARF微针治疗组中表达量最高，其次是皮下注射PRP和外敷米诺地尔组。皮下注射PRP组和米诺地尔组小鼠Ki67+的表达高于剩余的空白微针组和空白对照组，而皮下注射PRP组和米诺地尔组之间没有差异。
4、Western blot检测小鼠皮肤表皮和毛发生长相关蛋白量
为检测ARF微针与其他各组在促进毛发再生方面的影响，对表皮和毛发生长相关的蛋白量做了分析。如图16所示，图16a为5种治疗方式中，5种目标蛋白与house-keeping基因的相对表达量结果，图16b为在经过5种治疗方式后，b-catenin蛋白的表达量，图16c为经过5种治疗方式后，CD34蛋白的表达量，图16d为经过5种治疗方式后，k15蛋白的表达量，图16e为经过5种治疗方式后，Loricrin蛋白的表达量，图16f为经过5种治疗方式后，K14蛋白的表达量。治疗15天后，ARF微针组相对于空白微针和空白对照组，β-catenin、K14、Loricrin、CD34和K15表达都是升高的。ARF微针组比皮下注射PRP组，β-catenin(P<0.05)、K14(P<0.01)、CD34(P<0.001)和K15(P<0.01)表达量高，Loricrin表达无明显差异。ARF微针组比外敷米诺地尔组，在β-catenin(P<0.05)、K14(P<0.01)和K15(P<0.001)表达量高，在CD34和Loricrin上表达无明显差异。皮下注射PRP组和外敷米诺地尔组比较，在β-catenin和K14表达量上无差异，外敷米诺地尔组在CD34(P<0.001)和Loricrin(P<0.05)的表达量高于皮下注射PRP组，皮下注射PRP组在K15的表达上高于外敷米诺地尔组(P<0.01)。皮下注射PRP组和外敷米诺地尔组相比于空白微针组和空白对照组，在β-catenin、CD34和Loricrin表达上均升高，在K15的表达方面，只有皮下注射PRP组比空白微针组和空白对照组表达量升高。以上提示ARF微针能上调Wnt/β-Catenin通路蛋白以及表皮和毛发生长相关蛋白的表达。皮下注射PRP和外敷米诺地尔也能上调上述部分蛋白，但效果不如ARF微针。
实施例14活性自体再生因子(ARF)制备方法对ARF微针促毛发生长的影响
一、实验方法
1、分别按照以下3组方法制备微针：
方法1：按照实施例1的方法提取ARF，按照实施例4的方法制备ARF微针。
方法2：按照实施例1的方法提取PRP，PRP微针的制备方法与实施例4相同，不同的是，将有效成分ARF替换为PRP，制备PRP微针时未抽真空。
方法3：按照实施例1的方法提取ARF，ARF微针的制备方法与实施例4相同，不同的是，预冷前，未将2次离心后的产物置于0℃冰箱继续激活24h；也未采用梯度降温预冷的方法，而是直接将ARF放入-80℃冰箱预冷12h。
方法4：按照实施例1的方法提取PRP，PRP微针的制备方法与实施例4相同，不同的是，将有效成分ARF替换为PRP，提取得到PRP后直接冻干，再制备微针。
方法5：按照实施例1的方法提取ARF，按照实施例4的方法制备ARF微针，但制备微针时未抽真空。
2、通过扫描电镜分别拍摄观察上述方法制备得到的ARF微针贴片。
3、检测方法1～3制备的微针复溶后的蛋白浓度的方法见实施例13。
4、按照实施例13的方法建立C57BL/6J小鼠脱发模型，去毛，分别用方法1、2和3制备的微针治疗小鼠，观察在小鼠剃毛后第1d、3d、5d、7d和第9d插入微针的小鼠毛发生长情况，并用皮肤镜和扫描电镜评估新生毛发。
5、将方法1制备得到的ARF微针贴片置于常温干燥环境中存放2周，再检测其复溶后的ARF浓度。
二、实验结果
1、如图17所示，图17a为按照方法1制备得到的微针，微针形貌完整，无空针和破针，提取得到的ARF无细胞碎片，更为纯净，制备得到的微针形貌完整，无空针和破针；图17b为按照方法2制备得到的微针，出现空针和破针。如图18所示，方法4制备的微针因有细胞残留，容易导致微针破裂。图19为按照方法5制备得到的微针，针尖不理想，会出现破针。可见方法1比方法2、4和5制备得到的微针形貌更加完整和优异，不会出现空针和破针。
2、如图20所示，通过方法1设计的特定降温方式预冷2次离心后的产物，可以降低水结晶过程中对ARF或PRP蛋白质的破坏作用，收获更高浓度的蛋白，即收获浓度更高的ARF。
3、如图21所示，方法1制备的微针贴片治疗9天后开始出现毛发再生，至15天毛发已较为浓郁，而方法2和方法3制备的微针则在第12天才出现毛发再生，第20天仍能观察到斑秃区域。如图22所示，毛发镜显示方法1制备的毛发更为浓密，直径也更宽，而方法2和方法3再生的毛发则直径相当。通过方法1设计的特定降温方式预冷，可以显著提升ARF的活性，在用相同蛋白浓度ARF或PRP进行微针贴片制备时，方法1提取的ARF治疗效果更加优效。
4、如图23所示，方法1制备的ARF微针在常温干燥环境中存放2周后复溶ARF浓度未出现统计学差异，表明方法1制备的ARF微针能在常温下干燥环境中存放2周后依然保持高ARF浓度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含活性自体再生因子的冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S11：混合血液和抗凝血剂，
进行离心，离心后，除去底层红细胞后混匀；
S12：离心，保留下层0.1％～20％体积的产物，与凝血剂和CaCl2充分混匀，25～40℃下静置0.9～1.1h，再0～4℃静置23～25h，得到活性自体再生因子初产物；
S13：将步骤S12得到的活性自体再生因子初产物平均每1h降温4～10℃，梯度降温至-10～-100℃，继续预冷1～8h，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S11中离心的条件为300～600g，步骤S12离心的条件为700～1000g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S12中37℃下静置1h，再0℃静置24h，得到活性自体再生因子初产物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤S12得到的活性自体再生因子初产物梯度降温至-80℃，每1h降温10℃，降温速度恒定。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤S13得到的预冷的活性自体再生因子继续预冷4h，冷冻干燥。
6.权利要求1～5任一所述制备方法制备得到的含活性自体再生因子的冻干制剂。
7.一种负载权利要求6所述活性自体再生因子的微针。
8.一种负载活性自体再生因子的微针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S21：用水复溶权利要求6所述含活性自体再生因子的冻干制剂，1400～1600g离心取上清液；
S22：混合透明质酸和步骤S21的上清液，所述透明质酸和步骤S21的上清液的用量比为800～1000mg：1.9～2.1mL，得到ARF-HA水溶液；
混合透明质酸和水，透明质酸和水的用量比为0.9～1.1g：0.9～1.1mL，得到HA空白水溶液；
S23：取步骤S22的ARF-HA水溶液填充微针模具，真空干燥4～6min；
S24：2900～3100g条件下离心含ARF-HA水溶液的微针模具9～11min，去除微针模具外面的ARF-HA水溶液，重复离心，得到离心后的微针模具；
S25：用步骤S22的HA空白水溶液填充步骤S24离心后的微针模具，制备微针贴片基座；
S26：待步骤S25的针贴片干燥后，分离微针贴片和微针模具。
9.权利要求8所述制备方法制备得到的负载活性自体再生因子的微针。
10.权利要求7或9所述微针在制备防治脱发产品中的应用。
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