CN112889813A - 一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，具体的更涉及一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法。一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，步骤包括：(1)消化和终止消化：将不超过5代的人脐带间充质干细胞酶解消化1～5min，再加入终止液终止消化；(2)洗涤离心：离心弃去上清，加洗涤剂重复洗涤、离心操作2～3次；(3)程序冻存：以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取1～5m细胞悬液至程序降温仪中进行程序降温冻存。本发明通过在特殊的冻存液的存在下配合适合的冻存步骤后，使细胞冻存前后细胞存活率并未明显降低、存活率在97％以上，除此之外细胞数量仍然保持较高的浓度。

Description

一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体的更涉及一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法。
背景技术
人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多能干细胞，与其他来源的间充质干细胞比较有明显的临床应用优势，如取材容易、易收集、冷冻保存及相对纯净等，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化，如成骨细胞、软骨细胞、类肝细胞、类胰岛素细胞、神经细胞和心肌细胞等，且无伦理方面的问题。目前，人脐带间充质干细胞已经在临床领域得到应用并取得令人鼓舞的治疗效果。
人脐带间充质干细胞的种子库在临床上已经广泛应用，但也存在受冻存条件限制而不能大规模应用的问题，干细胞的冻存过程中无外源性污染是脐带间充质干细胞在临床治疗应用中安全可靠的关键，一方面由于常规冻存液中的胎牛血清含有各种不明确的细胞生长因子，会对细胞的分化形成干扰，另一方面采用动物血清培养的干细胞进行临床应用，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发成分明确的人脐带间充质干细胞无血清冻存液。
人脐带间充质干细胞种子库细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存方法对人脐带间充质干细胞有着重要影响，当冻存方法出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老，且细胞的生物学特性和遗传稳定性都可能发生变化，优化干细胞的冻存条件将为干细胞技术的规范化应用起到积极意义。
发明内容
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
本发明人为了解决上述问题经过认真研究后提供了细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，通过在特殊的冻存液的存在下配合适合的冻存步骤后，使细胞冻存前后细胞存活率并未明显降低、存活率在97％以上，除此之外细胞数量仍然保持较高的浓度。
本发明的细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，步骤包括，
(1)消化和终止消化：将不超过5代的人脐带间充质干细胞酶解消化1～5min，再加入终止液终止消化；
(2)洗涤离心：离心弃去上清，加洗涤剂重复洗涤、离心操作2～3次；
(3)程序冻存：以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取1～5m细胞悬液至程序降温仪中进行程序降温冻存。
在本发明方法步骤(1)中，酶消化所使用的的酶可以是本领域常规使用的任一种，优选酶包括胰蛋白酶，浓度为0.2ml/cm2，此外为了使消化时间更短，也可以采用复合酶，例如复合酶可以是胰蛋白酶和EDTA共同消化，两者之间的比例可以是任意比例。终止液配方为：MEMalpha+10％FBS，加入量一般为5～10倍消化液的量。
在本发明方法步骤(2)中，通过洗涤离心将edta洗掉，一般用生理盐水洗涤；在本发明中，通过进一步研究在洗涤剂中除了生理盐水外，还添加有葡萄糖衍生物，这里的葡萄糖衍生物优选葡萄糖-β-环糊精，进一步优选在洗涤剂中的质量浓度为0.5～3。
葡萄糖-β-环糊精的添加使其在细胞中能稳定蛋白质，不仅如此在冷冻过程中由于羟丙基-β-环糊精的存在，两者相似的组成能促进水分子与羟丙基-β-环糊精的集合从而在冷冻过程中抑制冰晶形成，保护细胞不受损伤。
在步骤(3)中，对冻存液的研究发现冻存液的组成不同，相变点不同，在降温程序中通过调节温度为梯度缓慢降温可保证在降温的过程中最大限度的保护细胞的活性。
细胞冻存是最大限度的保存细胞活力的重要手段。目前常用二甲基亚砜作保护剂，利用其与水分子结合，可使冰点下降，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶损伤。
但常用的二甲基亚砜对细胞存在一定毒性，研究表明其能与蛋白质结合导致蛋白质变性从而产生危害；因此本发明在此基础上进行研究后得出一种新的冻存液，能大大降低二甲基亚砜的含量。
具体的说，本发明优选的冻存液中至少包括人血白蛋白、二甲基亚砜、复方电解质液、氯化钠液、葡萄糖液。
其中，优选的人血白蛋白可代替血清进一步保护细胞降低二甲基亚砜对细胞的毒害，此外还能够提供一定的营养，使细胞在快融后仍然维持较好的活性。除此之外，避免了因血清的加入带来的病毒感染的风险，最优选人血白蛋白为20％人血白蛋白。
通过研究冻存液的组分比例对冻存效果有较大影响，优选冻存液按体积百分比计至少包括20％～50％的人血白蛋白、5％的二甲基亚砜、40％～60％的复方电解质液、1％～10％的氯化钠液、1％～10％的葡萄糖液。
本发明的冻存方法中基本核心是以较低的二甲基亚砜的含量来尝试不同的组分用以非渗透性保护剂来部分替代二甲基亚砜的用量比例。
研究以5％的二甲基亚砜作为保护剂，通过使用不同的组分提高细胞冻存效果，研究结果显示在以上述的优选组分以上述合适的范围内复配后得到的冻存液具有较好的冻存效果，而针对该冻存液，优选出适宜的降温程序进一步使存活率达到97％以上。
对于冻存液中的人血白蛋白可以是购买的到，或是通过健康人血浆低温分离提取得到，本发明对此不作任何限定；二甲基亚砜优选分子生化级(BR)的二甲基亚砜，例如WAK-Chemie的二甲基亚砜。
复方电解质液为水、电解质的补充源和碱化剂；优选复方电解液为复方电解质注射液，其中的氯化钠、氯化钾、氯化镁为氯化物盐，共同用来维持离子渗透压和胶体渗透压的系统平衡、葡萄糖酸钠、醋酸钠协调形成适宜的生理环境有利于细胞的存活。
氯化钠液优选氯化钠注射液，是0.9％的氯化钠水溶液，可以当成生理盐水来使用，维持细胞渗透压。葡萄糖液优选葡萄糖注射液，用以提供营养。
进一步，优选本发明的冻存液中还包括1％～10％的右旋糖苷40葡萄糖液，优选为右旋糖苷40葡萄糖注射液。右旋糖苷40的重均分子量在32000～42000之间，可以维持渗透压和PH，同时提供适宜细胞生存的环境。
进一步，优选本发明的冻存液中还包括羟丙基-β-环糊精，优选40％羟丙基-β-环糊精水溶液，且40％羟丙基-β-环糊精水溶液在冻存液中的体积百分比为0.5％～5％。
通常而言，降温过程是循序渐进的梯度式降温，而梯度式的降温过程实质在冻存中会因为保护剂二甲基亚砜的用量少，所以仍然会有少量的冰晶在细胞内造成细胞损伤。
进一步研究中，本发明通过改变降温的梯度，降温过程并不再试单一的梯度式降温法，而是在降温到某一温度点时采取适当升温的过程使冻存中的细胞受损伤的程度大大减少，最终通过细胞存活率的实验结果优选出可分为6个步骤的降温程序。
具体的说，上述优选的6个步骤的降温程序为：
Figure BDA0002924306200000041
冻存液的配方的不同，在程序降温时，冻存液相变点则不同，使优选的冻存液的相变点出现在降温至最低点到升温的这一阶段时，冻存液潜热吸收越多，此时冻存效果是最好的，最终存货率也会达97％以上。
有益效果：本发明采用新的冻存液配合程序降温步骤后，使细胞冻存前后细胞存活率并未明显降低、存活率在97％以上，除此之外细胞数量仍然保持较高的浓度。
附图说明
图1为实施例1的程序降温曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，以下实施例只能用于本发明做进一步说明，并不能理解为本发明保护的限制，该领域的专业技术人员根据上述发明的内容作出的非本质的改正和调整，仍属于本发明的保护的范围。
实施例1
1.1冻存液的配制：
配方：DMSO 5ml、复方电解质注射液56ml、20％人血白蛋白25ml、右旋糖酐40葡萄糖注射液8.5ml、0.9％氯化钠注射液3ml、10％葡萄糖注射液2.5ml，共制成100ml。
制法：准备一个100ml离心管，先加入5mlDMSO溶液，再加入56ml复方电解质注射液、8.5ml的右旋糖酐40葡萄糖注射液、3ml的0.9％氯化钠注射液、2.5ml的10％葡萄糖注射液，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。
1.2人脐带间充质干细胞的冻存：
将不超过5代的人脐带间充质干细胞中加入0.2ml/cm2的0.25％胰蛋白酶和0.04％的EDTA消化1min，加入6倍消化液的终止液(MEMalpha+10％FBS)进行终止酶解，离心弃去上清，加0.5％葡萄糖-β-环糊精的生理盐水重复洗涤、离心操作3次，弃去上清液，之后按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液进行冻存，冻存3管，分别标记为A1、A2、A3，另准备1管标记为A0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将4个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：(附图1为实施例1的程序降温曲线)
Figure BDA0002924306200000051
1.3细胞复苏：
于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：A1、A2、A3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
1.4检测：
1.4.1冻存前取样：
细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
1.4.2冻存后取样：
①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。
1.5分析
1.5.1细胞计数结果：
冻存后A组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(P＞0.05)。详见表1。
表1各组细胞计数结果
组 细胞浓度(个/ml) 存活率(％)
冻存前 1.09×10<sup>7</sup> 98.9
冻存后A组 1.06×10<sup>7</sup> 97.6
实施例2
1.1冻存液的配制：
配方：DMSO 5ml、复方电解质注射液56ml、20％人血白蛋白25ml、右旋糖酐40葡萄糖注射液6.5ml、0.9％氯化钠注射液3ml、10％葡萄糖注射液2.5ml，40％羟丙基-β-环糊精水溶液2.5ml，共制成100ml。
制法：准备一个100ml离心管，先加入5mlDMSO溶液，再加入56ml复方电解质注射液、6.5ml的右旋糖酐40葡萄糖注射液、3ml的0.9％氯化钠注射液、2.5ml的10％葡萄糖注射液，40％羟丙基-β-环糊精水溶液2.5ml，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。
1.2人脐带间充质干细胞的冻存：
将不超过5代的人脐带间充质干细胞中加入0.2ml/cm2的0.25％胰蛋白酶和0.04％的EDTA消化1min，加入6倍消化液的终止液(MEMalpha+10％FBS)进行终止酶解，离心弃去上清，加0.5％葡萄糖-β-环糊精的生理盐水重复洗涤、离心操作3次，弃去上清液，之后按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液进行冻存，冻存3管，分别标记为A1、A2、A3，另准备1管标记为A0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将4个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。
降温程序为：
Figure BDA0002924306200000071
1.3细胞复苏：
于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：B1、B2、B3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
1.4检测：
1.4.1冻存前取样：
细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
1.4.2冻存后取样：
①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。
1.5分析
1.5.1细胞计数结果：
冻存后A组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(P＞0.05)。详见表2。
表2各组细胞计数结果
组 细胞浓度(个/ml) 存活率(％)
冻存前 1.10×10<sup>7</sup> 99.2
冻存后B组 1.07×10<sup>7</sup> 98.4
实施例3
1.1冻存液的配制：
配方：DMSO 10ml、复方电解质注射液56ml、20％人血白蛋白25ml、右旋糖酐40葡萄糖注射液6.5ml、0.9％氯化钠注射液3ml，共制成100ml。
制法：准备一个100ml离心管，先加入5mlDMSO溶液，再加入56ml复方电解质注射液、6.5ml的右旋糖酐40葡萄糖注射液、3ml的0.9％氯化钠注射液，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。
1.2人脐带间充质干细胞的冻存：
将不超过5代的人脐带间充质干细胞中加入0.2ml/cm2的0.25％胰蛋白酶和0.04％的EDTA消化1min，加入6倍消化液的终止液(MEMalpha+10％FBS)进行终止酶解，离心弃去上清，加0.5％葡萄糖-β-环糊精的生理盐水重复洗涤、离心操作3次，弃去上清液，之后按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液进行冻存，冻存3管，分别标记为A1、A2、A3，另准备1管标记为A0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将4个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：
Figure BDA0002924306200000081
1.3细胞复苏：
于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：C1、C2、C3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
1.4检测：
1.4.1冻存前取样：
细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
1.4.2冻存后取样：
①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。
1.5分析
1.5.1细胞计数结果：
冻存后A组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(P＞0.05)。详见表3。
表3各组细胞计数结果
Figure BDA0002924306200000082
Figure BDA0002924306200000091
实施例4
1.1冻存液的配制：
配方：DMSO 3ml、复方电解质注射液56ml、20％人血白蛋白25ml、右旋糖酐40葡萄糖注射液6.5ml、0.9％氯化钠注射液3ml、10％葡萄糖注射液3.5ml，40％羟丙基-β-环糊精水溶液3.5ml，共制成100ml。
制法：准备一个100ml离心管，先加入3mlDMSO溶液，再加入56ml复方电解质注射液、6.5ml的右旋糖酐40葡萄糖注射液、3ml的0.9％氯化钠注射液、3.5ml的10％葡萄糖注射液，40％羟丙基-β-环糊精水溶液3.5ml，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。
1.2人脐带间充质干细胞的冻存：
将不超过5代的人脐带间充质干细胞中加入0.2ml/cm2的0.25％胰蛋白酶和0.04％的EDTA消化1min，加入6倍消化液的终止液(MEMalpha+10％FBS)进行终止酶解，离心弃去上清，加0.5％葡萄糖-β-环糊精的生理盐水重复洗涤、离心操作3次，弃去上清液，之后按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液进行冻存，冻存3管，分别标记为A1、A2、A3，另准备1管标记为A0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将4个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。
降温程序为：
Figure BDA0002924306200000092
1.3细胞复苏：
于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：D1、D2、D3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
1.4检测：
1.4.1冻存前取样：
细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
1.4.2冻存后取样：
①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。
1.5分析
1.5.1细胞计数结果：
冻存后A组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(P＞0.05)。详见表4。
表4各组细胞计数结果
组 细胞浓度(个/ml) 存活率(％)
冻存前 1.10×10<sup>7</sup> 99.3
冻存后D组 1.01×10<sup>7</sup> 91.7
实施例5
1.1冻存液的配制：
配方：DMSO 5ml、复方电解质注射液56ml、20％人血白蛋白25ml、右旋糖酐40葡萄糖注射液6.5ml、0.9％氯化钠注射液3ml、10％葡萄糖注射液2.5ml，40％羟丙基-β-环糊精水溶液2.5ml，共制成100ml。
制法：准备一个100ml离心管，先加入5mlDMSO溶液，再加入56ml复方电解质注射液、6.5ml的右旋糖酐40葡萄糖注射液、3ml的0.9％氯化钠注射液、2.5ml的10％葡萄糖注射液，40％羟丙基-β-环糊精水溶液2.5ml，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。
1.2人脐带间充质干细胞的冻存：
将不超过5代的人脐带间充质干细胞中加入0.2ml/cm2的0.25％胰蛋白酶和0.04％的EDTA消化1min，加入6倍消化液的终止液(MEMalpha+10％FBS)进行终止酶解，离心弃去上清，加0.5％葡萄糖-β-环糊精的生理盐水重复洗涤、离心操作3次，弃去上清液，之后按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液进行冻存，冻存3管，分别标记为A1、A2、A3，另准备1管标记为A0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将4个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：
Figure BDA0002924306200000111
1.3细胞复苏：
于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：E1、E2、E3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
1.4检测：
1.4.1冻存前取样：
细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
1.4.2冻存后取样：
①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。
1.5分析
1.5.1细胞计数结果：
冻存后A组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(P＞0.05)。详见表5。
表5各组细胞计数结果
组 细胞浓度(个/ml) 存活率(％)
冻存前 1.08×10<sup>7</sup> 98.5
冻存后E组 0.99×10<sup>7</sup> 90.1
实施例6
1.1冻存液的配制：
配方：DMSO 5ml、复方电解质注射液56ml、20％人血白蛋白25ml、右旋糖酐40葡萄糖注射液6.5ml、0.9％氯化钠注射液3ml、10％葡萄糖注射液2.5ml，40％羟丙基-β-环糊精水溶液2.5ml，共制成100ml。
制法：准备一个100ml离心管，先加入5mlDMSO溶液，再加入56ml复方电解质注射液、6.5ml的右旋糖酐40葡萄糖注射液、3ml的0.9％氯化钠注射液、2.5ml的10％葡萄糖注射液，40％羟丙基-β-环糊精水溶液2.5ml，边加边摇晃；混匀后，最后缓慢滴加入25ml20％人血白蛋白，加入时同时摇晃离心管。配制后，充分混匀，放于2～8℃冰箱中预冷至少30min。
1.2人脐带间充质干细胞的冻存：
将不超过5代的人脐带间充质干细胞中加入0.2ml/cm2的0.25％胰蛋白酶和0.04％的EDTA消化1min，加入6倍消化液的终止液(MEMalpha+10％FBS)进行终止酶解，离心弃去上清，加0.5％葡萄糖-β-环糊精的生理盐水重复洗涤、离心操作3次，弃去上清液，之后按照计数结果，以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取3ml细胞悬液进行冻存，冻存3管，分别标记为A1、A2、A3，另准备1管标记为A0，加入3ml冻存液，用于程序降温仪温度探头插入进行测温操作。完成后，将4个冻存管2～8℃低温运输至程序降温仪中进行程序降温，运输时间一般控制在15min内；程序降温结束后，转入液氮罐中保存。降温程序为：
Figure BDA0002924306200000121
1.3细胞复苏：
于冻存后的第3天复苏细胞。取3个50ml离心管，分别标记为：F1、F2、F3。复苏时：先吸取20ml完全培养基至50ml离心管中，再将冻存细胞放于37℃水浴锅中，待细胞溶解后，加入至对应的离心管中重悬，配平后，400g离心5min，弃上清，沉淀加入20ml完全培养基混匀。
1.4检测：
1.4.1冻存前取样：
细胞数、存活率：分别在最后一次离心前、在加入冻存液重悬后，各取100μl细胞悬液上Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
1.4.2冻存后取样：
①细胞数、存活率：细胞复苏溶解后，取100μl细胞悬液进行检测。
1.5分析
1.5.1细胞计数结果：
冻存后A组在细胞浓度、存活率方面均无显著性差异(P＞0.05)。详见表6。
表6各组细胞计数结果
组 细胞浓度(个/ml) 存活率(％)
冻存前 1.01×10<sup>7</sup> 98.5
冻存后F组 0.95×10<sup>7</sup> 92.7

Claims (10)

1.一种细胞存活率高的人脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，步骤包括：
(1)消化和终止消化：将不超过5代的人脐带间充质干细胞酶解消化1～5min，再加入终止液终止消化；
(2)洗涤离心：离心弃去上清，加洗涤剂重复洗涤、离心操作2～3次；
(3)程序冻存：以1×107/ml细胞密度加入预冷的冻存液，重悬后，吸取1～5m细胞悬液至程序降温仪中进行程序降温冻存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻存液中至少包括人血白蛋白、二甲基亚砜、复方电解质液、氯化钠液、葡萄糖液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冻存液按体积百分比计至少包括20％～50％的人血白蛋白、5％的二甲基亚砜、40％～60％的复方电解质液、1％～10％的氯化钠液、1％～10％的葡萄糖液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖液为10％葡萄糖液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述人血白蛋白和二甲基亚砜的体积比为(20～30):5。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括1％～10％的右旋糖苷40葡萄糖液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括0.5％～5％的羟丙基-β-环糊精。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤剂中包含葡萄糖衍生物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述消化步骤中所使用的的酶包括胰蛋白酶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述程序降温具体为：20℃等待；1℃/min降温至-16℃；25℃/min降温至-60℃；10℃/min升温至-18℃；1℃/min降温至-60℃；10℃/min降温至-90℃。
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