CN111838139A - 一种无蛋白细胞冻存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一种新型细胞冻存液及其应用，所述的细胞冻存液包含DMEM/F12、苏氨酸、羟乙基淀粉、棉子糖、聚乙烯醇(PVA)、二甲基亚砜(DMSO)和丙二醇。所述的细胞冻存液无蛋白成分，无动物源成分，化学成分明确，普遍适用于多种细胞类型或组织的超低温存储。本发明还提供了一种细胞冻存液的使用方法，即可进行程序化冷冻，也适用于非程序化冷冻方式。本发明所述细胞冻存液，成分明确，稳定，排除了含血清冻存液的不稳定性，解决了传统含血清冻液可能引入病原菌的风险，无蛋白成分，排除了外源蛋白可能引起的机体免疫反应，安全性更高，尤其适用于临床应用领域。用本发明冻存液保存的细胞，短期冻存一个月后复苏细胞，细胞活率可保持95％以上，保存一年以后复苏，细胞活率仍然可达90％以上，且细胞活性和功能不受影响。
Description
技术领域
本发明属于属于细胞培养技术领域，具体为一种细胞冻存液。
背景技术
细胞冻存即将细胞置于低温环境下保存，以使细胞暂时脱离生长状态，并保持细胞特性。通过冷冻方式保存细胞，成本较低，可以在需要时进行复苏及继续培养。同时，低温保存也能够避免，在培养中因细胞污染而导致的细胞品种丢失。
细胞冻存液作为细胞冻存时必须使用的一种保护试剂，其作用是将需要冻存的细胞悬浮，并供给细胞生命代谢所需的营养物质，同时，通过冷冻保护剂在冻存过程对细胞进行保护，防止或减少冷冻过程中冰晶产生对细胞造成的损伤。
传统的细胞冻存液是在基础培养基中添加胎牛血清和渗透性保护剂DMSO配制而成，或使用90％胎牛血清加入10％DMSO配制而成，但是此种冻存液需依赖血清，受血清批次间的成分波动影响。同时动物来源的血清，成分复杂，需进行病原体鉴定排除人畜共患病风险，即使排除病原体风险，血清内蛋白组分在临床实验或应用中仍有可能引起受体免疫反应，带来安全隐患。随着细胞培养技术的不断更新，无血清培养技术已是一种普遍应用但现有无血清冻存液因含外源蛋白可能引起的免疫反应，也被限制应用，因此无血清且无蛋白，化学成分明确的冻存液越来越受研发人员的青睐。DMSO具有细胞毒性，较高浓度的DMSO对于细胞冻存及临床应用构成风险。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型无蛋白细胞冻存液，该细胞冻存液具有高效、广谱、安全等优势，无血清无蛋白、成分明确、易于使用，同时能够高效的维持细胞活性及功能等优点，且非程序化冻存同样适用，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。本发明的细胞冻存液DMSO含量可使用在2-10％，低DMSO含量有助于降低DMSO对于细胞的毒性作用，对于临床类应用风险更低。
本发明提供一种新型无蛋白细胞冻存液及其应用，旨在解决现有技术的冻存液成分不明确，安全性差，冻存操作繁琐的技术缺陷。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明公开了一种无蛋白细胞冻存液，包括DMEM/F12、苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇和二甲基亚砜(DMSO)。
优选的，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为88-93％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3-10g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1-10g/L；所述二甲基亚砜(DMSO)在细胞冻存液中占体积比为5-10％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为0.5-5.0g/L；所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为0.1-2％。
优选的，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为93％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1g/L；所述DMSO在细胞冻存液中体积占比为5％，所述棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为2％；
优选的，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为91.5％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为5g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1.5g/L；所述DMSO在细胞冻存液中体积占比为7.5％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为1％；
优选的，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为90％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为2g/L；所述DMSO在细胞冻存液中体积占比为10％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为0.5g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为0.1％。
优选的，所述DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的88％，羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为10g/L，苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L，聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为10g/L，DMSO在细胞冻存液中占比为10％，棉子糖在细胞冻存液中浓度为5.0g/L，丙二醇在细胞冻存液中体积占比为2％。
优选的，所述冻存液在哺乳动物细胞冻存中的应用。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明的冻液优势在于：
本发明提供了一种无蛋白细胞冻存液及其配制方法和应用，该冻液不含血清和蛋白成分，成分简单明了，易于使用，冻存细胞复苏活率高，且不影响细胞性能，应用范围广，，可应用于细胞库的建立，科研细胞株保存，间充质干细胞、单核细胞、免疫细胞以及所涉及到的大部分哺乳动物细胞的长期保存；与传统含血清冻液相比，避免了血清可能引入外源病毒的风险，与现有无血清冻液相比，解决了含外源蛋白存在的缺点；冻液保质期长，用配制9个月后的冻存液冻存细胞，细胞复苏活率仍然保持在95％以上。
附图说明
图1是本发明实施例1中，本发明冻存液与对比例1(传统细胞冻存液)冻存的细胞复苏24h生长情况图；(图片于100x下拍摄)
图2是本发明实施例1中，本发明冻存液与对比例1(传统细胞冻存液)冻存的细胞复苏48h收获率。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明
作进一步说明。
本发明的无蛋白细胞冻存液的配制方法步骤如下：
A在无菌环境条件下，将上述DMEM/F12和DMSO按照比例混合，涡旋混匀后制得Mix1混合液；
B将上述苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇分别按照比例加入到步骤A所得到的Mix1混合液中，充分涡旋溶解后得到Mix2混合液；
C采用0.2um过滤器，对上述Mix2混合液进行无菌过滤，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格，得到一种无蛋白细胞冻存液；
D盖上试剂分装瓶瓶盖，封口膜封好瓶口密封，并置于2-8℃医用冰箱冷藏。
实施例1一种无蛋白细胞冻存液
1.一种无蛋白细胞冻存液，
其中DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的93％，羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3g/L，苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L，聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1g/L，DMSO在细胞冻存液中占比为5％，棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L，丙二醇在细胞冻存液中占比为2％；
2.该无蛋白细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，将上述DMEM/F12和DMSO按比例涡旋混合均匀，使DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的93％，使DMSO占总无蛋白细胞冻存液总体积的5％，得到Mix1；
S2将上述苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇分别按照比例加入到S1所得到的Mix1混合液中，涡旋溶解后得到一种无蛋白细胞冻存液，使苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇在无蛋白细胞冻存液中的终浓度分别为0.05g/L，3g/L，1g/L，1g/L，2％，充分涡旋溶解后得到Mix2混合液；
S3采用0.2um过滤器，对上述Mix2混合液进行无菌过滤，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格，得到一种无蛋白细胞冻存液
3.无蛋白细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，消化处于对数生长期且汇合度达到80％以上的hUC-MSC细胞，离心收集细胞沉淀后并去除上清；
S2将步骤S1中收集后得到的活细胞与上述的无蛋白细胞冻存液混合，得到细胞冻存悬液，冻存悬液的活细胞密度为1×106/mL，并分装入冻存管；
S3将步骤S2的冻存管直接置于-80℃冰箱冷冻过夜，后续转入液氮罐继续保存。
实施例2一种无蛋白细胞冻存液
1.一种无蛋白细胞冻存液，其中DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的91.5％，DMSO占总无蛋白细胞冻存液总体积的7.5％，羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为5g/L，苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L，聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1.5g/L，DMSO在细胞冻存液中占比为7.5％，棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L，丙二醇在细胞冻存液中占比为1％；
2.该无蛋白细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，将上述DMEM/F12％基础和DMSO按比例涡旋混合均匀，使DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的91.5％，使DMSO占总无蛋白细胞冻存液总体积的7.5％，得到Mix1；
S2将上述苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇分别按照比例加入到S1所得到的Mix1混合液中，涡旋溶解后得到一种无蛋白细胞冻存液，使苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇在无蛋白细胞冻存液中的终浓度分别为0.05g/L，5g/L，1.5g/L，1g/L，1％，充分涡旋溶解后得到Mix2混合液；
S3采用0.2um过滤器，对上述Mix2混合液进行无菌过滤，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格，得到一种无蛋白细胞冻存液。
3.无蛋白细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，消化处于对数生长期且汇合度达到80％以上的Vero细胞，离心收集细胞沉淀后并去除上清；
S2将步骤S1中收集后得到的活细胞与上述的无蛋白细胞冻存液混合，得到细胞冻存悬液，冻存悬液的活细胞密度为1×106/mL，并分装入冻存；
S3将步骤S2的冻存管直接置于-80℃冰箱冷冻过夜，后续转入液氮罐继续保存。
实施例3一种无蛋白细胞冻存液
1.一种无蛋白细胞冻存液，其中DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的90％，DMSO占总无蛋白细胞冻存液总体积的10％，羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3/L，苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L，聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为2g/L，DMSO在细胞冻存液中占比为10％，棉子糖在细胞冻存液中占比为0.5g/L，丙二醇在细胞冻存液中占比为0.1％；
2.该无蛋白细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，将上述DMEM/F12基础和DMSO按比例涡旋混合均匀，使DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的90％，使DMSO占总无蛋白细胞冻存液总体积的10％，得到Mix1
S2将上述苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇分别按照比例加入到S1所得到的Mix1混合液中，涡旋溶解后得到一种无蛋白细胞冻存液，使苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇在无蛋白细胞冻存液中的终浓度为0.05g/L，3g/L，2g/L，0.5g/L，0.1％，充分涡旋溶解后得到Mix2混合液；
S3采用0.2um过滤器，对上述Mix2混合液进行无菌过滤，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格，得到一种无蛋白细胞冻存液
3.无蛋白细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，消化293T细胞，离心收集细胞沉淀后并去除上清；
S2将步骤S1中收集后得到的活细胞与上述的无蛋白细胞冻存液混合，得到细胞冻存悬液，冻存悬液的活细胞密度为1×106/mL，并分装入冻存管；
S3将步骤S2的冻存管直接置于-80℃冰箱冷冻过夜，后续转入液氮罐继续保存。
实施例4一种无蛋白细胞冻存液
1.一种无蛋白细胞冻存液，其中DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的88％，羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为10g/L，苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L，聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为10g/L，DMSO在细胞冻存液中占比为10％，棉子糖在细胞冻存液中占比为5.0g/L，丙二醇在细胞冻存液中占比为2％；
2.该无蛋白细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，将上述DMEM/F12基础和DMSO按比例涡旋混合均匀，使DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的88％，使DMSO占总无蛋白细胞冻存液总体积的10％，得到Mix1
S2将上述苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇分别按照比例加入到S1所得到的Mix1混合液中，涡旋溶解后得到一种无蛋白细胞冻存液，使苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇在无蛋白细胞冻存液中的终浓度为0.05g/L，10g/L，10g/L，5g/L，2％，充分涡旋溶解后得到Mix2混合液；
S3采用0.2um过滤器，对上述Mix2混合液进行无菌过滤，并取样进行微生物、内毒素、支原体检测均为阴性为合格，得到一种无蛋白细胞冻存液
3.无蛋白细胞冻存液在细胞冻存中的应用，包括以下步骤：
S1在正常工作的生物安全柜中，消化293T细胞，离心收集细胞沉淀后并去除上清；
S2将步骤S1中收集后得到的活细胞与上述的无蛋白细胞冻存液混合，得到细胞冻存悬液，冻存悬液的活细胞密度为1×106/mL，并分装入冻存管；
S3将步骤S2的冻存管直接置于-80℃冰箱冷冻过夜，后续转入液氮罐继续保存。
对比例1
为本发明所述无蛋白细胞冻存液的一种对比例，本对比例所述冻存液包含以下体积百分比含量的组分：二甲基亚砜10％和胎牛血清90％；(传统细胞冻存液)
该对比例冻存液在细胞冻存中的应用参照实施例1中所述的冻存液在细胞中的应用步骤，但冻存悬液需先程序降温，再转入-80℃冰箱和液氮罐中保存；
对比例2
该对比例冻存液的配制步骤参照本发明实施例1中所述细胞冻存液的配制步骤配制，唯一不同之处在于所述苏氨酸在冻存液中的浓度为0g/L，即未添加苏氨酸成分；
该对比例冻存液冻存细胞的步骤参照实施例1中所述的在细胞冻存中的应用步骤；
对比例3
该对比例冻存液的配制步骤参照本发明实施例2中所述细胞冻存液的配制步骤配制，唯一不同之处在于所述苏氨酸在冻存液中的浓度为0g/L，即未添加苏氨酸成分；
该对比例冻存液冻存细胞的步骤参照实施例1中所述的在细胞冻存中的应用步骤；
对比例4
该对比例冻存液的配制步骤参照本发明实施例3中所述细胞冻存液的配制步骤配制，唯一不同之处在于所述苏氨酸在冻存液中的浓度为0g/L，即未添加苏氨酸成分；
该对比例冻存液冻存细胞的步骤参照实施例1中所述的在细胞冻存中的应用步骤；
实验例1
将实施例1-4和对比例1-4保存的细胞悬液在液氮冻存5天、3个月、6个月和9个月后，用37℃水进行水浴锅复苏，通过台盼蓝染色计算细胞存活率，结果见表。
| 组别 | 5天 | 3个月 | 6个月 | 9个月 |
| 实施例1 | 97.2％ | 96.9％ | 97.1％ | 95.3％ |
| 实施例2 | 96.5％ | 94.1％ | 93.6％ | 93.5％ |
| 实施例3 | 95.8％ | 95.3％ | 94.7％ | 93.4％ |
| 实施例4 | 59.1％ | 52.3％ | 55.7％ | 50.4％ |
| 对比例1 | 98.8％ | 95.3％ | 94.6％ | 94.7％ |
| 对比例2 | 86.4％％ | 82.3％ | 78.8％ | 70.1％ |
| 对比例3 | 88.2％ | 83.1％ | 76.7％ | 72.5％ |
| 对比例4 | 80.9％ | 77.6％ | 71.9％ | 69.1％ |
由上表可知，利用本发明提供的无蛋白细胞冻存液冻存各类哺乳动物细胞，细胞复苏后的存活率显著提高，且大部分细胞在冻存9个月后，细胞复苏活率仍然在95％以上，而细胞的贴壁能力和生长能力与冻存前也无明显差别。但在缺少了苏氨酸的成分以后，复苏活率即大幅下降，说明在细胞冻存中，苏氨酸的保护作用很重要，这也是本发明所述的无蛋白冻存液优点之一。
实验例2
用上述实施例1及对比例1中的的冻存液同时冻存hAT-MSC细胞，冻存步骤如下：
S1在正常工作的生物安全柜中，消化处于对数生长期且汇合度达到80％以上的hAT-MSC细胞，消化后收集细胞悬液，
S2将上述细胞悬液均分至2个离心管中进行离心，得到2份相同细胞量的细胞沉淀；
S3将步骤S2中收集得到的2份细胞沉淀，分别与上述实施例1和对比例1冻存液混合，得到细胞冻存悬液，使冻存悬液的活细胞密度为1×106/mL，并分装入冻存管；
S4将步骤S3的冻存管置于-80℃冰箱冷冻过夜，后续转入液氮罐继续保存，其中对比例1冻存液冻存的hAT-MSC细胞需程序降温后放入-80℃冰箱，再转入液氮；
S5于液氮中保存72h后，用37℃水进行水浴复苏，检测细胞冻存复苏活率，并接种于培养皿中，24h后检测细胞活率及细胞数，48h后检测复苏细胞生长情况，结果如图1和图2所示。
检测结果表明，利用本发明提供的无蛋白细胞冻存液冻存哺乳动物细胞，与含血清含10％DMSO的传统细胞冻存液(对比例1)相比较，细胞复苏后生长情况无明显差异，细胞复苏活率高、收获率高，形态佳，冻存过程无需程序性降温，操作更为简便，48h细胞收获率无显著差异。本发明的无蛋白细胞冻存液冻不含有任何蛋白成分，更安全，DMSO含量可使用2-10％范围内，5％含量效果更佳，细胞毒性更小。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种无蛋白细胞冻存液，其特征在于，包括DMEM/F12、苏氨酸、羟乙基淀粉、聚乙烯醇(PVA)、棉子糖、丙二醇和二甲基亚砜(DMSO)。
2.根据权力要求1所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为88-93％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3-10g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1-10g/L；所述二甲基亚砜(DMSO)在细胞冻存液中占体积比为5-10％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为0.5-5.0g/L；所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为0.1-2％。
3.根据权力要求2所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为93％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1g/L；所述二甲基亚砜(DMSO)在细胞冻存液中体积占比为5％，所述棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为2％。
4.根据权力要求2所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为91.5％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为5g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为1.5g/L；所述二甲基亚砜(DMSO)在细胞冻存液中体积占比为7.5％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为1g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为1％。
5.根据权力要求2所述的无蛋白细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM/F12在细胞冻存液中体积占比为90％；所述苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L；所述羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为3g/L；所述聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为2g/L；所述二甲基亚砜(DMSO)在细胞冻存液中体积占比为10％；所述棉子糖在细胞冻存液中占比为0.5g/L、所述丙二醇在细胞冻存液中体积占比为0.1％。
6.根据权利要求2所述的一种无蛋白细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM/F12占总无蛋白细胞冻存液总体积的88％，羟乙基淀粉在细胞冻存液中的浓度为10g/L，苏氨酸在细胞冻存液中的浓度为0.05g/L，聚乙烯醇(PVA)在细胞冻存液中的浓度为10g/L，DMSO在细胞冻存液中占比为10％，棉子糖在细胞冻存液中浓度为5.0g/L，丙二醇在细胞冻存液中体积占比为2％；。
7.根据权利要求1-6所述任一项无蛋白细胞冻存液，其特征在于，所述冻存液在哺乳动物细胞冻存中的应用。
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