CN113519506A - 一种无蛋白、无dmso细胞冻存液、应用及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液、应用及其制备方法，所述的细胞冻存液包含多种氨基酸、多种维生素、多种无机盐、糖类、多元醇、有机大分子化合物。所述的细胞冻存液成分简单明确，成本低廉，且采用了安全性较高的大分子化合物、糖类、多元醇联合其他成分，保护细胞在低温及超低温状态下的高效保存，成分明确、稳定且无蛋白成分，可避免临床应用中可能引起的免疫反应，提高安全性，且本品普遍适用于多种类型细胞的冷冻存储。本发明还提供了一种细胞冻存液的应用方法，用本发明冻存液保存的细胞，短期冻存一个月后复苏细胞，细胞活率可保持95%以上，保存一年以后复苏，细胞活率仍然可达90%以上，且细胞活性和功能不受影响。

Description

一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液、应用及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液及其用途。

背景技术

随着医疗技术的发展，细胞治疗手段的进步，体外细胞培养的要求也越来越高，现有技术中的细胞培养基和冻存液通常含有动物源性物质，成分复杂，在临床应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率。因此引入无血清，无蛋白的细胞培养基和冻存液，对于医疗科研领域的研发极其重要，也为后续基因编辑和个体化细胞治疗提供必要的技术基础。

细胞冻存，即通过在溶液中加入冷冻保护剂，保护细胞免受冻存时的冰晶损伤和溶质损伤，从而使复苏后的细胞仍然保存其正常的结构和功能。DMSO是细胞保存中最常用的渗透型冷冻剂，但它对细胞也存在一定的毒性，常温下能使胞内蛋白变性，具有血管毒性和肾脏毒性，吸入高挥发浓度可导致头痛和晕眩，另一方面，DMSO对间充质干细胞（MSC）的效力及其分化潜力可能产生损害。但目前还未发现冻存保护效果能与DMSO媲美的物质，因此，降低或者不使用DMSO，寻找其替代物并联合其它成分，形成新的配方是较为现实的选择。

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型无蛋白、无DMSO细胞冻存液，替代了传统毒性较高的DMSO保护剂，选用安全性高、毒性低的多元醇作为渗透性保护剂，同时联合非渗透性冷冻保护剂、维生素、氨基酸等有效成分，降低毒性，排除外源血清引起的不稳定性和外源蛋白引起的排斥反应的同时，还能够高效的维持细胞活性及功能，且非程序化冻存同样适用，可广泛用于各种哺乳动物细胞的冷冻保存。

发明内容

本发明提供一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液、应用及其制备方法，旨在解决现有技术的冻存液成分不明确，添加DMSO成分具有细胞毒性，需要程序化冷冻操作繁琐的技术缺陷。

本发明公开了一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液，包括多种氨基酸、多种维生素、多种无机盐、蔗糖、丙二醇、羧甲基纤维素钠成分。

本发明中，本公司设计开发的一种细胞冻存液，其成分简单明确，成本低廉，不含有DMSO等具有细胞毒性的成分，适用于非程序化冷冻，不需要程序化降温设备，支持存储于-80℃环境，并可广泛用于多种哺乳动物细胞的保存。细胞冻存液内含有多种盐离子，能有效维持细胞内外关键离子平衡，并维持pH环境的稳定；含有多种氨基酸、多种维生素，具有抗氧化性，可提高细胞活性，增加抗冻存伤害能力，保证细胞冻存前后状态良好；采用丙二醇作为主要的抗冻成分之一，相比于常用的乙二醇和丙三醇等，其含有甲基和羟基，在本发明的冻存液体系中具有更加优异的抑制冰晶形成的效果，细胞复苏活率高，且其可作为药用注射剂辅料使用，更安全，更适用于细胞制剂类产品；采用羧甲基纤维素钠作为稳定剂和增黏剂，降低冻存过程形中游离水形成冰晶对细胞的伤害；所述的蔗糖是一种非渗透性低温保护剂，属大分子物质，不能穿透细胞，在冰晶形成之前优先结合溶液中水分子，降低细胞外溶液的电解质浓度，减少阳离子进入细胞的数量。

通过上述物质成分的含量设计与组合，最大程度上提高冻存前后细胞活性，提高复苏效率，广泛适用于多种哺乳动物细胞的冷冻保存。

本发明所述的无蛋白、无DMSO细胞冻存液，所述细胞冻存液以体积计，每1000mL中包括水及以下组分：二水合氯化钙0.1-0.4g、氯化钾0.1-0.4g、氯化钠3-10g、无水磷酸氢二钠0.05-0.1g、一水合磷酸二氢钠0.01-0.1g、七水合硫酸锌0.0001-0.001g、碳酸氢钠1-4g、D-葡萄糖1-6g、丙酮酸0.01-0.15g、DL-硫辛酸0.0001-0.001g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.00001-0.0001g、亚油酸0.00001-0.0001g、L-丙氨酸0.01-0.08g、L-丙氨-L-谷氨酰胺0.1-1g、L-精氨酸盐酸盐0.07-0.3g、L-天冬酰胺0.01-0.1g、L-天冬氨酸0.06-0.3g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.01-0.15g、L-胱氨酸盐酸盐0.01-0.08g、L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.01-0.04g、L-谷氨酸0.005-0.03g、甘氨酸0.01-0.1g、L-组氨酸盐酸盐一水物0.01-0.1g、L-异亮氨酸0.01-0.2g、L-亮氨酸0.01-0.2g、L-赖氨酸盐酸盐0.01-0.2g、L-蛋氨酸0.001-0.03g、L-苯丙氨酸0.01-0.06g、L-脯氨酸0.01-0.06g、L-丝氨酸0.01-0.07g、L-苏氨酸0.01-0.1g、L-色氨酸0.001-0.1g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.01-0.5g、L-缬氨酸0.01-0.1g、L抗坏血酸钠0.01-0.5g、D-生物素0.0001-0.005g、氯化胆碱0.001-0.05g、叶酸0.001-0.01g、肌醇1-20g、烟酰胺0.0005-0.005g、维生素B12 0.0001-0.005g、D-泛酸钙0.0005-0.005g、盐酸吡哆醛0.0005-0.005g、盐酸吡哆醇0.00001-0.0001g、核黄素0.00005-0.0005g、盐酸硫铵0.0005-0.005g、次黄嘌呤0.0001-0.005g、蔗糖10-100g、丙二醇20-200g、羧甲基纤维素钠0.5-5g。

作为本发明的一种优选实施方案，所述细胞冻存液每1000mL中包括水及以下组分：二水合氯化钙0.2g、氯化钾0.2g、氯化钠6.8g、无水磷酸氢二钠0.1g、一水合磷酸二氢钠0.0543g、七水合硫酸锌0.000432g、碳酸氢钠1.8g、D-葡萄糖2g、丙酮酸0.06g、DL-硫辛酸0.00015g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.000081g、亚油酸0.000042g、L-丙氨酸0.034g、L-丙氨-L-谷氨酰胺0.54253g、L-精氨酸盐酸盐0.1475g、L-天冬酰胺0.04g、L-天冬氨酸0.13g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.075g、L-胱氨酸盐酸盐0.025g、L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.02g、L-谷氨酸0.0147g、甘氨酸0.04g、L-组氨酸盐酸盐一水物0.03148g、L-异亮氨酸0.055g、L-亮氨酸0.055g、L-赖氨酸盐酸盐0.08g、L-蛋氨酸0.016g、L-苯丙氨酸0.034g、L-脯氨酸0.029g、L-丝氨酸0.036g、L-苏氨酸0.05g、L-色氨酸0.01g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.054g、L-缬氨酸0.049g、L抗坏血酸钠0.1g、D-生物素0.0002g、氯化胆碱0.009g、叶酸0.0018g、肌醇20g、烟酰胺0.0015g、维生素B12 0.001g、D-泛酸钙0.0015g、盐酸吡哆醛0.0015g、盐酸吡哆醇0.000031g、核黄素0.00015g、盐酸硫铵0.0016g、次黄嘌呤0.0021g、蔗糖50g、丙二醇50g、羧甲基纤维素钠2g。

本发明使用的各成分均可通过商业途径购买，本发明使用的材料：羧甲基纤维素钠购自阿拉丁（货号：P110607），蔗糖购自Sigma公司（货号：V900116），丙二醇购自Sigma公司（货号：134368），多种氨基酸及维生素均购自Sigma公司。

本发明还公开了一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液的配制方法，所述配制方法步骤如下：

A 在无菌环境条件下，称取丙酮酸0.6g、DL-硫辛酸0.0015g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.00081g、亚油酸0.00042g、L-丙氨酸0.34g、L-丙氨-L-谷氨酰胺5.4253g、L-精氨酸盐酸盐1.475g、L-天冬酰胺0.4g、L-天冬氨酸1.3g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.75g、L-胱氨酸盐酸盐0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.2g、L-谷氨酸0.147g、甘氨酸0.4g、L-组氨酸盐酸盐一水合物0.3148g、L-异亮氨酸0.55g、L-亮氨酸0.55g、L-赖氨酸盐酸盐0.8g、L-蛋氨酸0.16g、L-苯丙氨酸0.34g、L-脯氨酸0.29g、L-丝氨酸0.36 g、L-苏氨酸0.5g、L-色氨酸0.1g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.54g、L-缬氨酸0.49g、L抗坏血酸钠1g、D-生物素0.002g、氯化胆碱0.09g、叶酸0.018g、烟酰胺0.015g、维生素B12 0.01g、D-泛酸钙0.015g、盐酸吡哆醛0.015g、盐酸吡哆醇0.00031g、核黄素0.0015g、盐酸硫铵0.016g、次黄嘌呤0.021g，加无菌水定容至100mL，配制为100倍混合储液；

B 向烧杯中加入适量的注射水，依次加入二水合氯化钙0.2g、氯化钾0.2g、氯化钠6.8g、无水磷酸氢二钠0.1g、一水合磷酸二氢钠0.0543g、七水合硫酸锌0.000432g、碳酸氢钠1.8g，并用磁力搅拌器搅拌溶解，配制上述所述的多种无机盐，得到MIX1溶液；

C 向溶解后的上述MIX1溶液中加入D-葡萄糖和肌醇组分，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX2溶液；

D 取10mL上述S1步骤配制好的100倍混合储液添加至上述MIX2溶液中，得到MIX3溶液；

E 将羧甲基纤维素钠2g、蔗糖50g、丙二醇50g依次加入上述MIX3溶液中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，并调节pH在6.9-7.2以内，定容至1000mL，得到MIX4溶液；

F 采用0.2μm过滤器过滤上述MIX4溶液，使pH保持在7.0-7.4以内，得到一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液。

本发明公开了一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液在细胞冻存中的应用 ，所述细胞为哺乳动物细胞，包括：多种组织来源的间充质干细胞、293T细胞、CHO细胞、Vero细胞、PBMC等多种细胞。

无蛋白、无DMSO细胞冻存液在细胞冻存中，操作方法如下：

A 收集细胞：消化处于指数生长期的贴壁细胞，（对于悬浮细胞直接离心分离收集细胞）；

B 冻存细胞：将步骤A中收获的细胞，用上述配制的无蛋白、无DMSO细胞冻存液重悬后，移入细胞冻存管内，并置于程序降温盒内，放入-80℃环境，保存4h以上；或直接将冻存的细胞置于-80℃环境，保存4h以上（短期存储可置于-80℃环境，存储6个月以上；或转移至-196℃超低温保存容器，长期存储）；

C 复苏细胞：复苏细胞进行接种，并记录0h的细胞细胞活率和细胞数，并拍照记录细胞状态；

D 24h后拍照记录细胞状态，并消化细胞进行取样计数（对于悬浮细胞直接进行取样计数），记录24h的细胞细胞活率和细胞数，然后将细胞继续接种至培养皿中培养；

E 24h后再进行拍照记录细胞状态，并消化细胞进行计数（对于悬浮细胞直接进行取样计数），记录48h的细胞细胞活率和细胞数。

作为优选方案，所述的细胞冻存悬液中的活细胞密度为1-5×10⁶个/mL。

与现有技术相比，本发明的冻存液优势在于：

本发明提供了一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液及其配制方法和应用，该冻存液不含血清和蛋白成分，更不含DMSO，成分明确，且更加安全，易于使用，冻存细胞复苏活率高，且不影响细胞性能，应用范围广，可应用于细胞库的建立，科研细胞株保存，间充质干细胞、单核细胞、免疫细胞以及所涉及到的大部分哺乳动物细胞的长期保存；与传统含血清冻存液相比，避免了血清可能引入外源病毒的风险；与现有无血清、无DMSO冻存液相比，解决了含外源蛋白存在的缺点；冻存液保质期长，用配制12个月后的冻存液冻存细胞，细胞复苏活率仍然保持在90%以上。

附图说明

图1是实施例1中，本发明冻存液与对比冻存液1（传统细胞冻存液）及对比冻存液2（商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液）冻存的hUC-MSC细胞，复苏后第48h生长情况图（图片于100x下拍摄）。

图2是实施例1中，本发明冻存液与对比冻存液1（传统细胞冻存液）及对比冻存液2（商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液）冻存的hUC-MSC细胞，复苏后第0h、24h和48h的细胞活率和细胞数对比图。

图3是实施例2中，本发明冻存液与对比冻存液1（传统细胞冻存液）及对比冻存液2（商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液）冻存的PBMC细胞，复苏后第0h和24h细胞活率和细胞回收率对比图。

图4是实施例2中，本发明冻存液与对比冻存液1（传统细胞冻存液）及对比冻存液2（商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液）冻存的PBMC细胞，复苏后24h使用经 CD3/CD28 抗体激活的T细胞在D3天的生长情况图（图片于100x下拍摄）。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液：

包括以下组分：多种氨基酸、多种维生素、多种无机盐、蔗糖、丙二醇、羧甲基纤维素钠。

优选地，所述细胞冻存液各成分组成为：二水合氯化钙0.2g/L、氯化钾0.2g/L、氯化钠6.8g/L、无水磷酸氢二钠0.1g/L、一水合磷酸二氢钠0.0543g/L、七水合硫酸锌0.000432g/L、碳酸氢钠1.8g/L、D-葡萄糖2g/L、丙酮酸0.06g/L、DL-硫辛酸0.00015g/L、1,4-丁二胺双盐酸盐0.000081g/L、亚油酸0.000042g/L、L-丙氨酸0.034g/L、L-丙氨-L-谷氨酰胺0.54253g/L、L-精氨酸盐酸盐0.1475g/L、L-天冬酰胺0.04g/L、L-天冬氨酸0.13g/L、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.075g/L、L-胱氨酸盐酸盐0.025g/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.02g/L、L-谷氨酸0.0147g/L、甘氨酸0.04g/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物0.03148g/L、L-异亮氨酸0.055g/L、L-亮氨酸0.055g/L、L-赖氨酸盐酸盐0.08g/L、L-蛋氨酸0.016g/L、L-苯丙氨酸0.034g/L、L-脯氨酸0.029g/L、L-丝氨酸0.036g/L、L-苏氨酸0.05g/L、L-色氨酸0.01g/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.054g/L、L-缬氨酸0.049g/L、L抗坏血酸钠0.1g/L、D-生物素0.0002g/L、氯化胆碱0.009g/L、叶酸0.0018g/L、肌醇20g/L、烟酰胺0.0015g/L、维生素B120.001g/L、D-泛酸钙0.0015g/L、盐酸吡哆醛0.0015g/L、盐酸吡哆醇0.000031g/L、核黄素0.00015g/L、盐酸硫铵0.0016g/L、次黄嘌呤0.0021g/L、蔗糖50g/L、丙二醇50g/L、羧甲基纤维素钠2g/L。

该无蛋白、无DMSO细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：以1000mL为例

S1 在无菌环境条件下，称取丙酮酸0.6g、DL-硫辛酸0.0015g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.00081g、亚油酸0.00042g、L-丙氨酸0.34g、L-丙氨-L-谷氨酰胺5.4253g、L-精氨酸盐酸盐1.475g、L-天冬酰胺0.4g、L-天冬氨酸1.3g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.75g、L-胱氨酸盐酸盐0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.2g、L-谷氨酸0.147g、甘氨酸0.4g、L-组氨酸盐酸盐一水物0.3148g、L-异亮氨酸0.55g、L-亮氨酸0.55g、L-赖氨酸盐酸盐0.8g、L-蛋氨酸0.16g、L-苯丙氨酸0.34g、L-脯氨酸0.29g、L-丝氨酸0.36 g、L-苏氨酸0.5g、L-色氨酸0.1g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.54g、L-缬氨酸0.49g、L抗坏血酸钠1g、D-生物素0.002g、氯化胆碱0.09g、叶酸0.018g、烟酰胺0.015g、维生素B12 0.01g、D-泛酸钙0.015g、盐酸吡哆醛0.015g、盐酸吡哆醇0.00031g、核黄素0.0015g、盐酸硫铵0.016g、次黄嘌呤0.021g，加无菌水定容至100mL，配制为100倍混合储液；

S2 向烧杯中加入500mL注射水，依次加入二水合氯化钙0.2g、氯化钾0.2g、氯化钠6.8g、无水磷酸氢二钠0.1g、一水合磷酸二氢钠0.0543g、七水合硫酸锌0.000432g、碳酸氢钠1.8g，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX1溶液；

S3 向溶解后的上述MIX1溶液中加入2g的D-葡萄糖组分和20g的肌醇，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX2溶液；

S4 取10mL上述S1步骤中配制好的100倍混合储液，添加至上述MIX2溶液中，得到MIX3溶液；

S5 将羧甲基纤维素钠2g、蔗糖50g、丙二醇50g依次加入上述MIX3溶液中，充分涡旋溶解，调节pH在6.9-7.2以内，定容至1000mL得到MIX4溶液；

S6 采用0.2μm过滤器，对上述MIX4溶液进行无菌过滤，使pH保持在7.0-7.4以内，得到一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液。

对比冻存液1的配制：所述冻存液包含以下体积百分比含量的组分：二甲基亚砜10％和胎牛血清90％（即传统细胞冻存液）；

对比冻存液2 ：所述冻存液为购买的友康品牌商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液（货号：NC1010）。

一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液在脐带间充质干细胞（hUC-MSC）冻存中的应用，包括以下步骤：

S1 收集细胞：在正常工作的生物安全柜中，消化处于指数生长期且汇合度达到80%以上的hUC-MSC细胞，离心收集细胞沉淀后并去除上清；

S2 冻存细胞：将步骤S1中收集后得到的活细胞，分别与上述本发明的无蛋白、无DMSO细胞冻存液及对比细胞冻存液1和对比冻存液2混合，得到细胞冻存悬液，冻存悬液的活细胞密度为1×10⁶/mL，并分装入冻存管；

S3 将步骤S2中本发明冻存液冻存的细胞直接置于-80℃冰箱冷冻过夜，对比冻存液1和对比冻存液2冻存的细胞需先程序化降温，再转入-80℃冰箱，最后均转入液氮罐保存72h以上；

S4 复苏细胞：复苏本发明中无蛋白、无DMSO细胞冻存液及对比冻存液1和对比冻存液2冻存后的hUC-MSC细胞，进行接种，并记录0h的细胞活率和细胞数；

S5 24h后拍照记录细胞状态，并消化细胞进行取样计数，记录24h的细胞细胞活率和细胞数，然后将细胞继续接种至培养皿中培养；

S6 24h后再进行拍照记录细胞状态，并消化细胞进行计数，记录48h的细胞细胞活率和细胞数，结果如图1和图2所示。

实施例2

一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液：

包括以下组分：多种氨基酸、多种维生素、多种无机盐、蔗糖、丙二醇、羧甲基纤维素钠。

优选地，所述细胞冻存液各成分组成为：二水合氯化钙0.2g/L、氯化钾0.2g/L、氯化钠6.8g/L、无水磷酸氢二钠0.1g/L、一水合磷酸二氢钠0.0543g/L、七水合硫酸锌0.000432g/L、碳酸氢钠1.8g/L、D-葡萄糖2g/L、丙酮酸0.06g/L、DL-硫辛酸0.00015g/L、1,4-丁二胺双盐酸盐0.000081g/L、亚油酸0.000042g/L、L-丙氨酸0.034g/L、L-丙氨-L-谷氨酰胺0.54253g/L、L-精氨酸盐酸盐0.1475g/L、L-天冬酰胺0.04g/L、L-天冬氨酸0.13g/L、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.075g/L、L-胱氨酸盐酸盐0.025g/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.02g/L、L-谷氨酸0.0147g/L、甘氨酸0.04g/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物0.03148g/L、L-异亮氨酸0.055g/L、L-亮氨酸0.055g/L、L-赖氨酸盐酸盐0.08g/L、L-蛋氨酸0.016g/L、L-苯丙氨酸0.034g/L、L-脯氨酸0.029g/L、L-丝氨酸0.036g/L、L-苏氨酸0.05g/L、L-色氨酸0.01g/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.054g/L、L-缬氨酸0.049g/L、L抗坏血酸钠0.1g/L、D-生物素0.0002g/L、氯化胆碱0.009g/L、叶酸0.0018g/L、肌醇20g/L、烟酰胺0.0015g/L、维生素B120.001g/L、D-泛酸钙0.0015g/L、盐酸吡哆醛0.0015g/L、盐酸吡哆醇0.000031g/L、核黄素0.00015g/L、盐酸硫铵0.0016g/L、次黄嘌呤0.0021g/L、蔗糖50g/L、丙二醇50g/L、羧甲基纤维素钠2g/L。

该无蛋白、无DMSO细胞冻存液的制备方法包括以下步骤：以1000mL为例

S1 在无菌环境条件下，称取丙酮酸0.6g、DL-硫辛酸0.0015g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.00081g、亚油酸0.00042g、L-丙氨酸0.34g、L-丙氨-L-谷氨酰胺5.4253g、L-精氨酸盐酸盐1.475g、L-天冬酰胺0.4g、L-天冬氨酸1.3g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.75g、L-胱氨酸盐酸盐0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物0.2g、L-谷氨酸0.147g、甘氨酸0.4g、L-组氨酸盐酸盐一水合物0.3148g、L-异亮氨酸0.55g、L-亮氨酸0.55g、L-赖氨酸盐酸盐0.8g、L-蛋氨酸0.16g、L-苯丙氨酸0.34g、L-脯氨酸0.29g、L-丝氨酸0.36 g、L-苏氨酸0.5g、L-色氨酸0.1g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.54g、L-缬氨酸0.49g、L抗坏血酸钠1g、D-生物素0.002g、氯化胆碱0.09g、叶酸0.018g、烟酰胺0.015g、维生素B12 0.01g、D-泛酸钙0.015g、盐酸吡哆醛0.015g、盐酸吡哆醇0.00031g、核黄素0.0015g、盐酸硫铵0.016g、次黄嘌呤0.021g，加无菌水定容至100mL，配制为100倍混合储液；

S2 向烧杯中加入500mL注射水，依次加入二水合氯化钙0.2g、氯化钾0.2g、氯化钠6.8g、无水磷酸氢二钠0.1g、一水合磷酸二氢钠0.0543g、七水合硫酸锌0.000432g、碳酸氢钠1.8g，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX1溶液；

S3 向溶解后的上述MIX1溶液中加入2g的D-葡萄糖组分和20g的肌醇，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX2溶液；

S4 取10mL上述S1步骤中配制好的100倍混合储液，添加至上述MIX2溶液中，得到MIX3溶液；

S5 将羧甲基纤维素钠2g、蔗糖50g、丙二醇50g依次加入上述MIX3溶液中，充分涡旋溶解，调节pH在6.9-7.2以内，定容至1000mL得到MIX4溶液；

S6 采用0.2μm过滤器，对上述MIX4溶液进行无菌过滤，使pH保持在7.0-7.4以内，得到一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液。

对比冻存液1的配制：所述冻存液包含以下体积百分比含量的组分：二甲基亚砜10％和胎牛血清90％（即传统细胞冻存液）；

对比冻存液2 ：所述冻存液为购买的友康品牌商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液（货号：NC1010）。

一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液在外周血单个核细胞（PBMC）冻存中的应用，包括以下步骤：

S1 收集细胞：收集人外周血若干体积，使用淋巴细胞分离液通过离心的方式，收集分离出的PBMC，并去除上清；

S2 将步骤S1中收集后得到的PBMC细胞分别与上述本发明的无蛋白、无DMSO细胞冻存液及对比冻存液1和对比冻存液2混合，得到细胞冻存悬液，冻存悬液的活细胞密度为1×10⁶/mL，并分装入冻存管；

S3将步骤S2中本发明冻存液冻存的细胞直接置于-80℃冰箱冷冻过夜，对比冻存液1和对比冻存液2冻存的细胞需先程序化降温，再转入-80℃冰箱，最后均转入液氮罐保存72h以上；

S4 复苏细胞：复苏本发明中无蛋白、无DMSO细胞冻存液及对比细胞冻存液1和对比冻存液2冻存后的PBMC细胞进行接种，并分别取样记录0h和24h的细胞活率和细胞回收率，结果如图3所示；

S5 24h取样记录完PBMC细胞的细胞活率和细胞数以后，使用CD3/CD28 抗体激活T细胞，并分别记录激活后的T细胞在D1，D3和D6的增殖情况和细胞形态。其中D3的结果如图4所示。

效果例

按照实施例1的方法配制本发明冻存液和对比冻存液1（即传统细胞冻存液）和对比冻存液2（即友康品牌商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液），以对比冻存液1和对比冻存液2为对照组，将3种冻存液同时冻存hUC-MSC细胞，而后将冻存好的细胞在液氮中保存24h、3个月、6个月和12个月后，用37℃水进行水浴锅对应时间进行复苏工作，通过台盼蓝染色计录细胞活率，结果见表1，表1为冻存24h、3个月、6个月和12个月后细胞复活率统计表。

表1

结果与分析

根据附图1结果显示，用本发明的细胞冻存液冻存的hUC-MSC细胞能很好的维持细胞原有的形态。

根据附图2结果显示，用本发明的细胞冻存液冻存的hUC-MSC细胞能很好的维持细胞活性。

根据附图3结果显示，用本发明的细胞冻存液冻存的PBMC细胞能很好的维持细胞活性。

根据附图4结果显示，用本发明的细胞冻存液冻存的PBMC细胞能很好的维持细胞形态。

由上述效果例可知，利用本发明提供的无蛋白、无DMSO细胞冻存液冻存的哺乳动物胞，细胞复苏后的存活率明显提高，细胞在冻存12个月后，细胞复苏活率仍然在90％以上，且明显优于传统细胞冻存液和市场上的商品化无蛋白、无DMSO细胞冻存液。

以上足以说明本发明提供的无蛋白、无DMSO细胞冻存液冻优势在于：成分明确、安全低毒、冻存的细胞活率高、收获率高，形态佳，冻存过程无需程序性降温，操作更为简便，且适用于大部分哺乳动物细胞。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液，其特征在于，所述的细胞冻存液由多种成分组成，包括：多种氨基酸、多种维生素、多种无机盐、蔗糖、丙二醇、羧甲基纤维素钠；

所述细胞冻存液每1000mL 中包括水及以下组分：二水合氯化钙0.1-0.4g、氯化钾0.1-0.4g、氯化钠3-10g、无水磷酸氢二钠0.05-0.1g、一水合磷酸二氢钠0.01-0.1g、七水合硫酸锌0.0001-0.001g、碳酸氢钠1-4g、D-葡萄糖1-6g、丙酮酸0.01-0.15g、DL-硫辛酸0.0001-0.001g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.00001-0.0001g、亚油酸0.00001-0.0001g、L-丙氨酸0.01-0.08g、L-丙氨-L-谷氨酰胺0.1-1g、L-精氨酸盐酸盐0.07-0.3g、L-天冬酰胺0.01-0.1g、L-天冬氨酸0.06-0.3g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.01-0.15g、L-胱氨酸盐酸盐0.01-0.08g、L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.01-0.04g、L-谷氨酸0.005-0.03g、甘氨酸0.01-0.1g、L-组氨酸盐酸盐一水物0.01-0.1g、L-异亮氨酸0.01-0.2g、L-亮氨酸0.01-0.2g、L-赖氨酸盐酸盐0.01-0.2g、L-蛋氨酸0.001-0.03g、L-苯丙氨酸0.01-0.06g、L-脯氨酸0.01-0.06g、L-丝氨酸0.01-0.07g、L-苏氨酸0.01-0.1g、L-色氨酸0.001-0.1g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.01-0.5g、L-缬氨酸0.01-0.1g、L抗坏血酸钠0.01-0.5g、D-生物素0.0001-0.005g、氯化胆碱0.001-0.05g、叶酸0.001-0.01g、肌醇1-20g、烟酰胺0.0005-0.005g、维生素B12 0.0001-0.005g、D-泛酸钙0.0005-0.005g、盐酸吡哆醛0.0005-0.005g、盐酸吡哆醇0.00001-0.0001g、核黄素0.00005-0.0005g、盐酸硫铵0.0005-0.005g、次黄嘌呤0.0001-0.005g、蔗糖10-100g、丙二醇20-200g、羧甲基纤维素钠0.5-5g。

2.根据权利要求1所述的一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液各成分组成为：每1000mL 细胞冻存液中包括水及以下组分：二水合氯化钙0.2g、氯化钾0.2g、氯化钠6.8g、无水磷酸氢二钠0.1g、一水合磷酸二氢钠0.0543g、七水合硫酸锌0.000432g、碳酸氢钠1.8g、D-葡萄糖2g、丙酮酸0.06g、DL-硫辛酸0.00015g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.000081g、亚油酸0.000042g、L-丙氨酸0.034g、L-丙氨-L-谷氨酰胺0.54253g、L-精氨酸盐酸盐0.1475g、L-天冬酰胺0.04g、L-天冬氨酸0.13g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.075g、L-胱氨酸盐酸盐0.025g、L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.02g、L-谷氨酸0.0147g、甘氨酸0.04g、L-组氨酸盐酸盐一水物0.03148g、L-异亮氨酸0.055g、L-亮氨酸0.055g、L-赖氨酸盐酸盐0.08g、L-蛋氨酸0.016g、L-苯丙氨酸0.034g、L-脯氨酸0.029g、L-丝氨酸0.036g、L-苏氨酸0.05g、L-色氨酸0.01g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.054g、L-缬氨酸0.049g、L抗坏血酸钠0.1g、D-生物素0.0002g、氯化胆碱0.009g、叶酸0.0018g、肌醇20g、烟酰胺0.0015g、维生素B12 0.001g、D-泛酸钙0.0015g、盐酸吡哆醛0.0015g、盐酸吡哆醇0.000031g、核黄素0.00015g、盐酸硫铵0.0016g、次黄嘌呤0.0021g、蔗糖50g、丙二醇50g、羧甲基纤维素钠2g。

3.根据权利要求1或2所述的一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液，其特征在于，所述无蛋白、无DMSO细胞冻存液的pH为7.0-7.4。

4.根据权利要求1或2所述的一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液的应用，其特征在于，用于哺乳动物细胞的保存。

5.一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1 在无菌环境中称取丙酮酸0.6g、DL-硫辛酸0.0015g、1,4-丁二胺双盐酸盐0.00081g、亚油酸0.00042g、L-丙氨酸0.34g、L-丙氨-L-谷氨酰胺5.4253g、L-精氨酸盐酸盐1.475g、L-天冬酰胺0.4g、L-天冬氨酸1.3g、L-天冬酰胺甲酯盐酸盐0.75g、L-胱氨酸盐酸盐0.25g、L-半胱氨酸盐酸盐一水物0.2g、L-谷氨酸0.147g、甘氨酸0.4g、L-组氨酸盐酸盐一水合物0.3148g、L-异亮氨酸0.55g、L-亮氨酸0.55g、L-赖氨酸盐酸盐0.8g、L-蛋氨酸0.16g、L-苯丙氨酸0.34g、L-脯氨酸0.29g、L-丝氨酸0.36 g、L-苏氨酸0.5g、L-色氨酸0.1g、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.54g、L-缬氨酸0.49g、L抗坏血酸钠1g、D-生物素0.002g、氯化胆碱0.09g、叶酸0.018g、烟酰胺0.015g、维生素B12 0.01g、D-泛酸钙0.015g、盐酸吡哆醛0.015g、盐酸吡哆醇0.00031g、核黄素0.0015g、盐酸硫铵0.016g、次黄嘌呤0.021g，加无菌水定容至100mL，配制为100倍混合储液；

S2 向烧杯中加入适量的注射水，依次加入二水合氯化钙0.2g、氯化钾0.2g、氯化钠6.8g、无水磷酸氢二钠0.1g、一水合磷酸二氢钠0.0543g、七水合硫酸锌0.000432g、碳酸氢钠1.8g，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX1溶液；

S3 向溶解后的上述MIX1溶液中加入D-葡萄糖2g和肌醇20g，并用磁力搅拌器搅拌溶解，得到MIX2溶液；

S4 取10mL上述S1步骤配制好的100倍混合储液添加至上述MIX2溶液中，得到MIX3溶液；

S5 将羧甲基纤维素钠2g、蔗糖50g、丙二醇50g依次加入上述MIX3溶液中，磁力搅拌器搅拌至完全溶解，并调节pH在6.9-7.2以内，定容至1000mL，得到MIX4溶液；

S6 采用0.2μm过滤器过滤上述MIX4溶液，使pH保持在7.0-7.4以内，得到一种无蛋白、无DMSO细胞冻存液。

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