RU2731065C1 - Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов - Google Patents
Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2731065C1 RU2731065C1 RU2019143588A RU2019143588A RU2731065C1 RU 2731065 C1 RU2731065 C1 RU 2731065C1 RU 2019143588 A RU2019143588 A RU 2019143588A RU 2019143588 A RU2019143588 A RU 2019143588A RU 2731065 C1 RU2731065 C1 RU 2731065C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- panexin
- nta
- serum
- cells
- dmso
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к составу криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов. Криоконсервант содержит питательную среду DMEM/F12, дополнительно содержит заменитель сыворотки Panexin NTA, криопротектор DMSO и альфа-липоевую кислоту в концентрации 200 мкМ, растворенную в DMSO, при следующем соотношении ингредиентов, %: питательная среда DMEM/F12 - 70-75%; заменитель сыворотки Panexin NTA - 10-15%; криопротектор DMSO - 9,999%; альфа-липоевая кислота - 0,001%, причем увеличение доли заменителя сыворотки Panexin NTA в итоговом растворе происходит за счет уменьшения доли питательной среды DMEM/F12. Изобретение позволяет увеличить выход живых и способных к активному росту кератиноцитов человека из глубокой заморозки после длительного хранения. 1 пр., 1 ил.
Description
Изобретение относится к клеточной биологии, криобиологии, а именно к созданию раствора для хранения запаса кератиноцитов кожи человека при отрицательных температурах и созданию клеточных банков. Изобретение можно отнести к регенеративной медицине, а именно к созданию заготовки стратегических запасов клеточных трансплантатов в безопасных для реципиента средах.
Известна среда для консервации клеток печени (RU 2161198, опубликовано: 27.12.2000 Бюл. №36), содержащая в качестве криопротектора содержащая в качестве криопротектора низкомолекулярный поливинилпирролидон, отличающаяся тем, что в качестве жизнеобеспечивающих компонентов дополнительно содержит питательную среду RPMI-1629, 1%-ный раствор альбумина человеческого, калий оротат при следующем соотношении компонентов, мас.ч.: Среда RPMI-1629 - 10-10,5 Поливинилпирролидон - 1-1,5 1%-ный раствор альбумина человеческого - 3-3,6 Калий оротат - 1-1,2 рН - 7,6.
Недостатками данного способа являются то, что данный известный криоконсервант содержит сниженное количество питательных веществ, в частности не содержит аналогов сыворотки, что снижает способность кератиноцитов после хранения образовывать жизнеспособные клеточные культуры. Кроме того, в данном способе достигается отсутствие слипания клеток в суспензии, за счет пресыщения раствора калием, что является недостатком в случае хранения кератиноцитов кожи, т.к. жизнеспособность и физиологическая активность данных клеток обусловлена их способностью быстро прилипать к субстрату после размораживания и образовывать многоклеточные колонии.
Известен способ кратковременного хранения клеток гепатоцитов (RU 2396748, опубликовано: 20.08.2010 Бюл. №23), в котором эти клетки помещают в жидкую клеточную среду, содержащую а) солевой раствор, выбранный из солевого раствора, содержащего, в частности, хлорид натрия, глюконат натрия, ацетат натрия, хлорид калия, хлорид магния и цитрат натрия, раствора Рингера-лактата, забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР), и/или водный раствор высокомолекулярного сахара, в частности гидроксиэтилкрахмала, b) глюкозу и с) сывороточный альбумин и/или плазму крови, и хранят в этой клеточной среде.
Недостатком данного способа является то, что данный способ предполагает кратковременное хранение клеток (печени) в криоконсерванте, содержащем набор солей, без содержания питательных добавок, а именно сыворотки и ее аналогов.
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является среда для криоконсервации клеток человека и животных (RU 2303631, опубликовано: 27.07.2007 Бюл. №21), содержащая в своем составе аутологичную к донорскому костному мозгу сыворотку крови, при следующем соотношении компонентов, в об. %: сыворотка крови - 45-65, диметилсульфоксид - 5-15, сульфаниламиды и антибиотики - 0,1-1,5 и среда ДМЕМ - остальное, до 100.
Недостатком способа является обязательное внесение в состав криоконсерванта аутологичной сыворотки крови, что делает невозможным использование замораживаемых клеток в качестве донорских и препятствует созданию на основе данных клеток стратегического донорского запаса клеток в криобанках, т.к. сыворотка является фактором риска как в качестве переносчика вирусных и других инфекций, так и может быть причиной иммунной несовместимости донора и реципиента. Кроме того, при заготовлении клеток кожи (кератиноцитов) не предполагается дополнительное вмешательство (забор крови) у донора.
Способы длительного низкотемпературного хранения первичных клеточных культур и тканей человека является актуальной проблемой современной клеточной биологии и регенеративной медицины. Первичные кератиноциты человека и тканеинженерные конструкты на их основе незаменимы для исследований и разработок как в прикладной (комбустиология, дерматология, косметология, тест-системы для исследования действия терапевтических препаратов), так и в фундаментальной области. Данные клетки отличаются тем, что крайне плохо переживают замораживание в обычных (известных) криоконсервантах. Для обеспечения стабильной работы необходимы криобанки готовых образцов с сохранной жизнеспособностью.
Любые криоконсерванты содержат криопротекторы - вещества, способствующие снижению повреждающего действия негативных факторов отрицательных температур, за счет снижения количества и размеров кристаллов льда в замораживаемых клетках. Данные вещества хорошо проникают через мембраны внутрь клетки и препятствуют росту кристаллов льда. Однако зачастую это достигаются при повышении концентрации криопротекторов, что в свою очередь также может оказывать негативное воздействие на выживаемость клеток - т.к. высокие концентрации криопротекторов (DMSO) токсичны для клеток животных и человека. Токсическое побочное действие криопротекторов, связанное, например, с генерацией активных форм кислорода и/или индукцией апоптотической гибели, может быть снижено за счет активности дополнительных компонентов, например, антиоксидантов, стабилизаторов мембран и т.п.
Одним из таких веществ является альфа-липоевая кислота. Присутствие ее в криоконсерванте позволяет стабилизировать клеточные мембраны, повреждаемые криопротектором и кристаллами льда, что приводит к увеличению процента выживших после заморозки-разморозки клеток. Альфа-липоевая кислота является антиоксидантом, подавляющим образование активных форм кислорода в процессе криоконсервации.
Так же, для обеспечения выживаемости при криоконсервации культур клеток человека ранее использовали эмбриональную сыворотку телят (FBS) в качестве питательной добавки, позволяющий снизить концентрацию криопротектора (использовать его не более 10% в среде), а также за счет повышения вязкости криоконсерванта. Для создания клеточных криобанков, основной задачей которых является обеспечение бесперебойной работы производства биомедицинских клеточных продуктов использование животной сыворотки не приемлемо. В качестве заменителя сыворотки в предложенном составе криоконсерванта выступает Panexin NTA, позволяющий обеспечить бессывороточное хранение первичных клеточных культур.
Технический результат заключается в увеличении выхода живых и способных к активному росту кератиноцитов человека из глубокой заморозки после длительного хранения.
Технический результат достигается предлагаемым составом криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов, содержащим питательную среду DMEM/F12, причем он дополнительно содержит заменитель сыворотки Panexin NTA, криопротектор DMSO и альфа-липоевую кислоту в концентрации 200 мкМ растворенную в DMSO при следующем соотношении ингредиентов, %:
питательная среда DMEM/F12 | 70-85%; |
заменитель сыворотки Panexin NTA | 10-15%; |
криопротектор DMSO | 9,999-14,999%; |
альфа-липоевая кислота | 0,001%. |
Предлагаемый состав криоконсерванта используют следующим образом.
Кератиноциты кожи человека после этапа культивирования снимают с поверхности культурального пластика при помощи раствора Трипсина и раствора Версена любым известным способом, после чего центрифугируют, а осадок ресуспендируют в растворе предлагаемого криоконсерванта в концентрации от 1 до 3 млн. клеток на 1 мл раствора и помещают в специальные криопробирки. Затем, полученную суспензию кератиноцитов в пробирках постепенно охлаждают, со скоростью 1-3°С в минуту и доводят температуру суспензии до -70°С. Замороженные по такому протоколу кератиноциты закладывают на хранение в жидкий азот (температура хранения в жидком азоте -196°С), где пробирки с клеточной суспензией могут храниться по несколько лет. Для размораживания кератиноциты вынимают из азота и быстро нагревают до +37°С. Оттаявшую суспензию центрифугируют, осадок ресуспендируют в стандартной среде для культивирования кератиноцитов и высевают в культуральные флаконы. После хранения в предложенном криоконсерванте и размораживания культура кератиноцитов кожи человека в течение 7 суток полностью восстанавливает свою морфологию и физиологическую активность.
Пример использования
Для создания запаса криоконсервированных первичных кератиноцитов кожи человека разработан способ хранения их в виде замороженной клеточной суспензии в криоконсерванте в жидком азоте. Для повышения жизнеспособности и пролиферативной активности клеток, прошедших стадию хранения было проведено сравнение криоконсервантов разного состава: криосреда созданная на основе DMEM/F12 (Панеко, Россия) с 10% DMSO добавлением 10% сыворотки коров (FBS), как положительный контроль; криосреда созданная на основе DMEM/F12 (Панеко, Россия) с 10% DMSO добавлением 10% Panexin NTA (PAN-Biotech, Германия) - заменитель животной сыворотки; криопротектор заявленного состава созданный на основе DMEM/F12 (Панеко, Россия) с 10% DMSO добавлением 10% Panexin NTA (PAN-Biotech, Германия) и Альфа-липоевой кислотой (далее LA) в количестве 0,001% (200 мкМ р-р в ДМСО).
Стоит отметить, что для оценки жизнеспособности кератиноцитов недостаточно оценить количество живых клеток, вышедших из разморозки экспресс-тестом по вытеснению клетками красителя Трипанового синего, т.к. данные клетки отличаются тем, что могут погибать в течение нескольких суток после произведенного воздействия отрицательными температурами.
Для более точной оценки состояния культуры размороженных кератиноцитов был выбран МТТ - тест, колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Только активные НАДФ-Н-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты в живых клетках могут, при определенных условиях, восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Интенсивность образования гранул формазана коррелирует с жизнеспособностью клеток, таким образом данный тест является косвенным показателем жизнеспособности культуры. МТТ тестирование проводили на размороженных культурах клеток после их посева на культуральный пластик через 2,5, 24, 48 часов, 7 и 10 дней после разморозки. Результаты приведены на фиг. 1 - «Изменения показателей оптической плотности при МТТ-тестировании культур кератиноцитов, прошедших стадию хранения в криосредах разного состава». По горизонтальной оси время культивирования культуры после размораживания. На рисунке D+P - криоконсервант на основе среды DMEM с добавлением заменителя сыворотки Panexin NTA, D+P +LA криоконсервант на основе среды DMEM с добавлением заменителя сыворотки Panexin NTA и с альфа-липоевой кислотой, согласно заявленному составу, D+FBS - стандартный криоконсервант с бычьей сывороткой в составе.
Проведя анализ полученных данных можно сказать, что в течение суток после размораживания происходит уменьшение числа активных клеток во всех вариантах криосред. Добавление LA (р=0,001). Через сутки проявляется особенность кератиноцитов кожи - гибель части клеток, через несколько часов (суток) после воздействия отрицательными температурами. Добавление LA в процессе криоконсервации приводит к более интенсивной пролиферации клеток в процессе их культивирования после размораживания. Через 10 дней культивирования количество клеток, замороженных в присутствии D+P +LA возрастает. Таким образом, добавление LA к криоконсервантам повышает выживаемость клеток.
Динамика изменения числа клеток, замороженных в присутствии Panexin NTA, несколько отличается от динамики числа клеток, замороженных с использованием сыворотки: количество жизнеспособных клеток в присутствии сыворотки в течение 24 часов меняется незначительно, однако уже к 3 суткам после разморозки уровень живых клеток сопоставим во всех вариантах. Добавление LA к Panexin NTA активирует пролиферацию клеток, начиная с 7 дня культивирования.
Показано, что заявляемый состав криоконсерванта позволяет хранить кератиноциты кожи человека длительное время с сохранностью их жизнеспособности и при этом, использовать данные клетки для нужд регенеративной медицины, т.к. в нем не содержится сыворотки крови животных. Добавление альфа-липоевой кислоты к криоконсерванту позволяет увеличить выход жизнеспособных клеток из глубокой заморозки.
Таким образом, использование заявляемого криоконсерванта, содержащего Panexin NTA и альфа-липоевую кислоту, позволяет увеличить выход жизнеспособных клеток в культуре кератиноциов.
Claims (3)
- Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов, содержащий питательную среду DMEM/F12, отличающийся тем, что дополнительно содержит заменитель сыворотки Panexin NTA, криопротектор DMSO и альфа-липоевую кислоту в концентрации 200 мкМ, растворенную в DMSO, при следующем соотношении ингредиентов, %:
-
питательная среда DMEM/F12 70-75% заменитель сыворотки Panexin NTA 10-15% криопротектор DMSO 9,999% альфа-липоевая кислота 0,001% - причем увеличение доли заменителя сыворотки Panexin NTA в итоговом растворе происходит за счет уменьшения доли питательной среды DMEM/F12.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019143588A RU2731065C1 (ru) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019143588A RU2731065C1 (ru) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2731065C1 true RU2731065C1 (ru) | 2020-08-28 |
Family
ID=72421516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019143588A RU2731065C1 (ru) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2731065C1 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2178865C2 (ru) * | 1995-01-30 | 2002-01-27 | Органодженисис Инк. | Способ криоконсервации заготовленной ткани млекопитающих или культивированного эквивалента ткани и устройство для его осуществления |
RU2303631C1 (ru) * | 2006-05-19 | 2007-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием |
EA009073B1 (ru) * | 2001-10-17 | 2007-10-26 | Бёрингер Ингельхайм Фарма Гмбх Унд Ко. Кг | Препарат выделенных кератиноцитов, носитель, покрытый этими клетками, способ криоконсервации препарата и способ лечения ран |
WO2014083169A1 (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
-
2019
- 2019-12-24 RU RU2019143588A patent/RU2731065C1/ru active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2178865C2 (ru) * | 1995-01-30 | 2002-01-27 | Органодженисис Инк. | Способ криоконсервации заготовленной ткани млекопитающих или культивированного эквивалента ткани и устройство для его осуществления |
EA009073B1 (ru) * | 2001-10-17 | 2007-10-26 | Бёрингер Ингельхайм Фарма Гмбх Унд Ко. Кг | Препарат выделенных кератиноцитов, носитель, покрытый этими клетками, способ криоконсервации препарата и способ лечения ран |
RU2303631C1 (ru) * | 2006-05-19 | 2007-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Транс-Технологии" | Среда для криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и биотрансплантат с ее использованием |
WO2014083169A1 (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Pharmacosmos A/S | Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11497206B2 (en) | Cell cryopreservation protective composition and use thereof | |
US20200170244A1 (en) | Methods for preserving, transporting and storing living biological materials | |
Seo et al. | Cryopreservation of amniotic fluid-derived stem cells using natural cryoprotectants and low concentrations of dimethylsulfoxide | |
JP2000198701A (ja) | 眼科用の規定された無血清医療溶液およびそれを用いた処置方法 | |
JP6353615B1 (ja) | 哺乳動物細胞凍結保存液 | |
JP2000344602A (ja) | 動物の細胞または臓器の保存剤およびその保存方法。 | |
US10104881B2 (en) | Composition comprising plant-derived recombinant human serum albumin, lipids, and plant protein hydrolysates as active ingredients for cryopreservation of stem cells or primary cells | |
JP5796290B2 (ja) | 膵島組織保存溶液及びそれを用いる方法 | |
CN112841174A (zh) | 一种用于人脐带间充质干细胞长期保存的冻存液 | |
US6946241B2 (en) | Physiological medium for perfusing, preserving and storing isolated cell, tissue and organ samples | |
JP2024098028A (ja) | 細胞および/または組織の輸送用組成物および/または凍結保存用組成物 | |
US20190275088A1 (en) | Preservative solution for live cells or composition containing live cells | |
CN111602648B (zh) | 一种免疫细胞无血清冻存液及冻存方法 | |
CN114585255A (zh) | 干细胞用冷藏保存液 | |
CN108684653A (zh) | 一种胎盘保存液及其制备方法 | |
CN109511650B (zh) | 一种可以扩大供肝来源的常温机械灌注液 | |
CN113854280B (zh) | 一种低温保存液及其制备方法和应用 | |
RU2731065C1 (ru) | Состав криоконсерванта для длительного хранения первичных кератиноцитов | |
WO2013047665A1 (ja) | 生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法 | |
Pasch et al. | Variation of the HES concentration for the cryopreservation of keratinocytes in suspensions and in monolayers | |
US20070087320A1 (en) | Medium for conservation of organs, biological tissues or living cells | |
KR102319110B1 (ko) | 세포성 바이오 의약품의 장기 보존을 위한 동결보존액 조성물 | |
CN107787960B (zh) | 视网膜色素上皮细胞的冻存液及其应用 | |
CN112602703B (zh) | 一种细胞、组织或器官冷保存液的制备方法与应用 | |
CN114831107A (zh) | 一种细胞和组织低温保存液及其配制方法、应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210315 Effective date: 20210315 |