KR102319110B1

KR102319110B1 - 세포성 바이오 의약품의 장기 보존을 위한 동결보존액 조성물

Info

Publication number: KR102319110B1
Application number: KR1020210090980A
Authority: KR
Inventors: 홍슬기; 이가헌
Original assignee: 주식회사 이노스템바이오
Priority date: 2021-07-12
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2021-10-29
Also published as: KR102319110B9; WO2023286962A1

Abstract

본 발명은 세포성 바이오 의약품의 장기 보존을 위한 동결보존액 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 동결보존액은 우태아혈청 혹은 동물 혈청 유래 알부민을 포함하지 않아 동물성 제제로부터 유래할 수 있는 감염 가능성을 배제할 수 있으며, 동결보존된 세포성 바이오 의약품을 해동 후 이차적 정제 혹은 수세 단계 없이 바로 생체 내 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 동결보존액은 HES 도입을 통하여 저농도의 DMSO 만으로도 동결 및 해동 과정 중 얼음 결정(ice crystal) 손상을 억제할 수 있으며, 그 결과 동결보존액 내 DMSO 함량을 낮출 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 동결보존액은 NAC 및 DEX의 도입을 통하여 동결 및 해동 과정 중 발생하는 ROS 및 세포죽음을 억제할 수 있는 방법을 제공하는데, 본 발명은 어떠한 생물학적 제제를 포함하지 않아 생체 내 주입 시 감염 위험성을 배제할 수 있으며, 장기간 바이오 의약품을 보관하고 운송할 수 있는 방법을 제공하여, 바이오 의약품의 안정성을 증대시키고 유효성을 장기간 보존할 수 있는 방법을 제공한다. 또한, -70도 초저온 냉동고에 보관하여 바이오 의약품의 접근성을 향상시킬 수 있다.

Description

세포성 바이오 의약품의 장기 보존을 위한 동결보존액 조성물{Composition of cryopreservation solution for long-term storage of cellular bio drugs}

본 발명은 동물성 제제를 포함하지 않으며 화학적 조성물로만 구성된 동결보존액 조성물로서, 세포성 바이오 의약품의 장기간 동결보존을 위한 용도에 관한 것이다.

식물이나 동물의 세포, 조직, 또는 식품 등의 물을 포함하는 물질을 장기 보존하기 위해 0℃ 이하의 온도에서의 동결 보존법이 일상적으로 사용되고 있다. 그러나, 이들 물을 함유하는 물질을 동결하면, 동결 중에 물 분자끼리 용질이나 혼입물의 매질을 배제하면서 결정화하여 물 분자만으로 이루어진 얼음 결정을 형성하므로, 함수물 중에서 용질이나 혼입물의 매질이 불균일하게 확산되어, 동결 농축이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 동결 농축을 방지하기 위해, 여러 가지 저분자 화합물을 첨가하는 방법이 실시되고 있다. 예를 들어, 세포의 동결 보전을 실시하는 경우에 동결 보존 중에 일어나는 세포내의 물의 결정화에 의한 세포 손상을 최소화하기 위해 동결 보호제로서 디메틸설폭시드(DMSO)나 글리세롤 등을 첨가하는 방법이 널리 활용되고 있다.

그러나, 동결과 해동과정에서 필연적으로 동반되는 얼음결정의 형성과 이온 및 삼투압의 불균형에 따른 세포의 손상을 피할 수가 없어 동결과 해동과정으로 인한 손상이 증대된다. 이러한 손상을 최소화하고 동결 및 해동 후 생존율과 세포능을 극대화하기 위하여 해당 세포의 생화학적, 물리적 특성에 따라 동결 및 해동과정에서 동반되는 손상을 최소화하기 위한 동결보존제의 개발과 동결방법의 개발은 매우 중요하다.

또한, 동결보존하고자 하는 세포의 종류에 따라 동결보존용 조성물에 포함되는 성분의 종류 및 조성비가 달라질 수 있어, 세포의 효과적인 동결보존을 가져올 수 있는 조성물을 개발하기 위해서는 세포에 적합한 성분 및 상기 성분들의 적절한 조성비는 규명되어야 한다. 따라서, 안전성 및 안정성을 모두 가진 세포의 동결보존용 조성물을 개발하기 위해서는, 동물성 제제를 포함하지 않으면서도 세포의 동결보존을 효과적으로 가져올 수 있는 성분, 및 각 성분 간의 적절한 조성비를 개발해야 한다.

한편, 세포성 바이오 의약품은 동결보존 기술의 한계로 냉장 상태로 보관되며 이송된다. 그 결과 세포성 바이오 의약품의 보관 기간은 통상 48시간 내로 한정된다. 줄기세포치료제의 경우 중간 단계 산물 혹은 원료의약품의 경우 동결보존하여 사용하는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 중간산물 혹은 원료의약품 동결보존 시 우태아혈청 혹은 인간혈청 유래 알부민을 포함하고 있어 생물학적 제제로부터 전파될 수 있는 감염원의 위험성이 문제시 된다. 그 결과 중간산물 혹은 원료의약품에 포함된 동결보존액을 제거하고, 수세하며, 재현탁하는 단계가 요구되며, 이 경우 해동 후 바로 생체 내 주입할 수 없는 한계가 대두된다.

한국공개특허 제10-2020-0064680호 (2020.06.08 공개)

본 발명의 목적은 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES), N-아세틸 시스테인(N-Acetyl Cystein; NAC) 및 덱사메타손(Dexamethasone; DEX)을 포함하는 저온보관용액; 및 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES) 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)을 포함하는 2배동결용액을 포함하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 동물성 제제를 포함하지 않으며 상기 화학적 조성물로만 구성된 동결보존액으로 세포성 바이오 의약품을 장기간 동결보존하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES), N-아세틸 시스테인(N-Acetyl Cystein; NAC) 및 덱사메타손(Dexamethasone; DEX)을 포함하는 저온보관용액; 및 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES) 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)을 포함하는 2배동결용액을 포함하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) HES, NAC 및 DEX를 포함하는 저온보관용액을 제조하는 단계; 2) HES 및 DMSO를 포함하는 2배동결용액을 제조하는 단계; 3) 상기 1) 단계에서 제조된 저온보관용액에 세포성 바이오 의약품을 현탁하는 단계; 4) 상기 2) 단계에서 제조된 2배동결용액에 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품을 혼합하는 단계; 및 5) 상기 4) 단계에서 혼합된 세포성 바이오 의약품을 동결보존하는 단계를 포함하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법을 제공한다.

도 1은 동결보존용액에 따른 3T3-L1 세포의 해동 후 회수율(Recovery Rate), 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS 및 CryoStor.
도 2는 동결보존용액에 따른 C2C12 세포의 해동 후 회수율(Recovery Rate), 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)를 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 3은 동결보존용액에 따른 SH-SY5Y 세포의 해동 후 회수율(Recovery Rate), 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 4는 동결보존용액에 따른 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC) 세포의 해동 후 회수율(Recovery Rate), 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 5는 동결보존용액에 따른 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC) 세포의 해동 후 회수율(Recovery Rate), 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)를 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 6은 동결보존용액에 따른 말초신경 유래 줄기세포(Peripheral Nerve-Derived Stem Cells, PNSC) 세포의 해동 후 회수율(Recovery Rate), 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 7은 동결보존용액에 따른 심장줄기세포 미세구(Cardiac Stem Cells Spheroid, CSC-SP) 및 말초신경줄기세포 미세구(Peripheral Nerve-Derived Stem Cell Spheroid, PNSC-SP)의 해동 후 생존율(Viability) 및 파종 후 배양용기 내 부착율(Attachment Rate)를 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 8은 동결보존용액에 따른 해동 후 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC), 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC) 및 말초신경줄기세포(Peripheral Nerve-Derived Stem Cells, PNSC)의 해동 후 유리산소라디칼(Radical Oxygen Species, ROS)의 세포 내 축적 및 Annexin-V 발현율을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 9는 동결보존용액 내 덱사메타손(Dexamethasone; DEX, 1μM) 및 N-아세틸 시스테인(N-Acetylcystein; NAC, 1mM) 첨가 여부에 따른 해동 후 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC), 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC) 및 말초신경줄기세포(Peripheral Nerve-Derived Stem Cells, PNSC)의 해동 후 유리산소라디칼(Radical Oxygen Species, ROS)의 세포 내 축적 및 Annexin-V 발현율을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. HES.
도 10은 동결보존용액에 따른 해동 후 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC), 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC) 및 말초신경줄기세포(Peripheral Nerve-Derived Stem Cells, PNSC)의 해동 후 세포배가시간(Population Doubling Time, PDT) 및 세포배가수준(Population Doubling Level, PDL)을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 11은 동결보존용액에 따른 해동 후 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC), 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC) 및 말초신경줄기세포(Peripheral Nerve-Derived Stem Cells, PNSC)의 해동 후 지방세포 및 조골세포로의 분화 유도 후 세포질 내 지방질(Triglyceride) 축적 및 세포외기질 미네랄(Alizarin Red) 침착 정도를 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 12는 동결보존용액에 따른 해동 후 골수 유래 중간엽줄기세포(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells, BMSC), 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC) 및 말초신경줄기세포(Peripheral Nerve-Derived Stem Cells, PNSC)의 해동 후 SDF-1 mRNA 발현율을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. D-FBS.
도 13은 동결보존 절차에 따른 심장줄기세포(Cardiac Stem Cells, CSC)의 회수율 및 생존율을 나타낸다. *, p < 0.05 vs. 4℃_Cryo-VM 혹은 4℃_Cryo-VM+2XCryo.

본 발명은 살아있는 세포로 구성된 바이오 의약품인 세포치료제, 줄기세포치료제, 오가노이드, 미세구, 인공조직의 장기간 생명, 구조, 그리고 생리활성을 유지할 수 있는 장기간 보존하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 세포성 바이오 의약품을 액체질소 내 보관을 통하여 장기간 보존할 수 있는 방법이며, 해동 후 세척과정 없이 생체 내 바로 주입할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 세포 비투과성 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES), 세포 투과성 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 라디칼 매개 세포손상 억제제인 N-아세틸 시스테인(N-Acetyl Cystein; NAC) 및 덱사메타손(Dexamethasone; DEX)으로 구성되며, 어떠한 동물성 유래 제제를 포함하지 않고 화학적 조성으로 구성된 동결보존 조성액으로 구성하여 그 목적을 달성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES), N-아세틸 시스테인(N-Acetyl Cystein; NAC) 및 덱사메타손(Dexamethasone; DEX)을 포함하는 저온보관용액; 및 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES) 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)을 포함하는 2배동결용액을 포함하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 HES는 테트라-하이드록시에틸 스타치(tetra-hydroxyethyl starch; T-HES), 펜타-하이드록시에틸 스타치(penta-hydroxyethyl starch; P-HES) 또는 헥사-하이드록시에틸 스타치(hexa-hydroxyehtyl starch; H-HES)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 전체 동결보존액 조성물에 대하여 상기 HES는 3 내지 10 중량부로 포함되고, 상기 DMSO는 3 내지 10 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는 상기 동결보존액 조성물은 0.1 내지 5 mM NAC 및 0.1 내지 5 μM DEX를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 저온보관용액은 필수아미노산, 인슐린 및 포도당을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 세포성 바이오 의약품은 세포치료제, 줄기세포치료제, 면역치료제, 오가노이드, 미세구 또는 인공조직일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 상기 동결보존액은 DMEM 혹은 MEM과 같은 세포 배양배지, PlasmaLyte 혹은 PBS와 같은 생리 완충액을 포함할 수 있다.

본 발명은 1) HES, NAC 및 DEX를 포함하는 저온보관용액을 제조하는 단계; 2) HES 및 DMSO를 포함하는 2배동결용액을 제조하는 단계; 3) 상기 1) 단계에서 제조된 저온보관용액에 세포성 바이오 의약품을 현탁하는 단계; 4) 상기 2) 단계에서 제조된 2배동결용액에 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품을 혼합하는 단계; 및 5) 상기 4) 단계에서 혼합된 세포성 바이오 의약품을 동결보존하는 단계를 포함하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 HES는 T-HES, P-HES 또는 H-HES일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 전체 저온보관용액 또는 2배동결용액에 대하여 상기 HES는 3 내지 10 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 저온보관용액은 0.2 내지 10 mM NAC 및 0.2 내지 10 μM DEX를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 2배동결용액에 대하여, 상기 DMSO는 6 내지 20 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품은 4℃에서 보관하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 4) 단계는 상기 2) 단계에서 제조된 2배동결용액 및 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품을 1 : 1의 중량비로 혼합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 동결보존하는 단계는 -1℃/min의 속도로 -75℃까지 동결한 후, -135℃ 내지 -196℃의 액체질소에서 보관할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

HES는 식물에서 추출한 스타치(starch)를 화학적으로 변형시킨 성분으로 혈장 대체제 혹은 혈장 확장제로 환자 치료제로 적용되고 있다. HES는 글루코스 백본(glucose backbone)에 붙어있는 하이드록시에틸 체인의 수와 밀도에 따라 분자량이 결정되며, 120 kDa 전후의 저분자 다당류인 테트라스타치(tetrastarch), 200 kDa 전후의 중 분자량인경우 펜타스타치(pentastarch), 600 kDa 전후 고 분자의 경우 헥사스타치(hexastarch)로 분류되며, 분자량이 증가할수록 질량 치환율, 수분 함수율, 그리고 분해율은 영향을 받게된다. 동결보존 과정 중 세포 내외 수분의 이동에 따라 얼음 결정체가 형성되며, 얼음결정체 형성이 세포손상과 죽음을 유발하는 주된 인자로 작용한다.

본 발명은 동결보존용액 내 포함된 HES 분자량에 따라 얼음결정체 형성에 의한 세포죽음을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 분자량이 높은 펜타스타치(pentastarch) 내지 헥사스타치(hexastarch)를 이용하여 동결보존 과정 중 발생하는 세포손상과 죽음을 방지하는 조성을 제공한다. HES의 분자량이 클수록 질량 대체율이 높아 수분의 함수율이 증가하여 얼음 결정체 형성을 억제하여 삼투압 및 전해질 불균형을 최소화할 수 있다.

HES는 세포 내로 침투할 수 없는 비침투성 동결보존제이며, 세포 내 수분의 동결로 인한 얼음결정체로 의한 세포죽음를 억제할 수 없다. 본 발명은 세포 내 침투성 동결보존제인 DMSO를 사용하여 세포 내 얼음 결정체로 인한 세포손상과 죽음을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 동결보존액 포함된 HES 분자량에 따라 DMSO 함량을 조절하는 방법을 제공한다. 고 농도의 DMSO를 첨가한 경우 동결과정 수분의 급격한 이동에 따라 삼투압 및 전해질 불균형이 야기되어 세포손상과 죽음을 유발할 수 있다. 또한 해동 후 바로 생체 내 주입할 경우 고 농도 DMSO에 따른 독성반응을 유발할 수 있으므로 동결보존용액 내 DMSO는 최소한 용량만 포함하여야 된다. 본 발명은 HES를 동시에 사용하여 DMSO 용량을 줄일 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 동결보존액은 항유리산소라디칼로부터 세포를 보호할 수 있는 제제를 포함할 수 있다. 억제제를 첨가하여 세포를 보호할 수 있다. 본 발명은 동결 및 해동 과정 중 세포에서 생성되는 ROS로부터 세포를 보호할 수 있는 화학적 제제는 DEX 및 NAC를 포함할 수 있다. DEX 및 NAC 첨가를 통하여 ROS 매개 세포손상 및 죽음을 억제할 수 있다.

본 발명의 동결보존액은 동결 및 해동 과정 중 에너지 공급을 위하여 덱스트로스(dextrose) 및 인슐린(insuline)을 포함할 수 있다. 동결보존액 내 1~50 mM 덱스트로스(dextrose)와 0.1~1 IU/mL 인슐린(insuline)을 포함하여 무산소환경에서 세포에게 에너지원을 제공하여 생존할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 동결보존액은 DMSO를 포함하지 않고 HES만 포함한 저온보관용액과 DMSO를 포함한 2배 동결용액으로 구성된다. DMSO에 장시간 노출 시 삼투압 및 전해질 불균형의 결과 세포손상과 죽음을 유발할 수 있어, 동결보존 과정 중 세포손상을 최소화하기 위하여 DMSO 노출시간을 최소화하여야 한다. 본 발명은 HES, NAC, DEX, 덱스트로스, 인슐린 만으로 구성된 저온보관용액을 이용하여 세포성 바이오 의약품을 현탁하고 저온에서 장기간 세포손상과 죽음을 최소화하는 방법을 제공한다. 이후 DMSO를 포함한 동결용액과 혼합하여 최종 동결보존용액 내 세포성 바이오 의약품을 동결하는 방법을 제공한다.

상기 저온보관용액으로 세포성 바이오 의약품을 현탁하여 저온에서 보관하여 최종 완제의약품의 충전(filling) 전까지 세포손상과 죽음을 최소화하고, DMSO를 포함한 동결용액과 혼합하여 세포성 바이오 의약품의 충전 전까지 세포손상과 죽음을 최소화하는 방법을 제공한다.

상기 동결보존액은 단계별 냉동과정을 통하여 세포성 바이오 의약품을 동결하는 과정을 진행한다. 동결보존용액에 현탁한 세포성 바이오 의약품은 4도에서 10분간 거치한 후 controlled freezer 혹은 freezing container를 이용하여 분당 -1도 속도로 냉동하는 단계를 거쳐 최종 동결하게 된다.

상기 동결보존액을 이용하여 동결한 바이오 의약품은 액체질소통에 보관하여 장기간 보관할 수 있다. 액체질소통 내 vapor phase 혹은 liquid phase에서 보관하며 최소 3년 이상 보관할 수 있는 방법을 제공한다. 상기 동결보존액에 보관한 세포성 바이오 의약품은 dry ice를 통하여 운송할 수 있으며, 의료기관에서는 -60도 미만의 초저온 냉동고에서 사용 전까지 보관할 수 있는 방법을 제공한다. 영하 60도 이하의 초저온 냉동고에서는 상기 동결보존액으로 동결한 세포성 바이오 의약품은 3개월 이상 세포의 생명, 구조, 생리활성을 유지할 수 있는 방법을 제공한다.

상기 동결보존액을 이용하여 보존한 세포성 바이오 의약품은 급속 해동하여 생체 내 주입할 수 있다. 상기 동결 보존한 바이오 의약품은 37도에서 42도에서 1분 내 해동하는 단계를 통하여 해동할 수 있다. 해동한 바이오 의약품은 이차적 수세, 정제, 농축 단계없이 바로 주입할 수 있다. 상기 해동 후 바이이 의약품은 식염수 혹은 수액제제와 혼합하여 희석하여 주입할 수 있으며, 혹은 수액제제와 혼합하여 접종할 수 있는 방법을 제공한다.

상기 동결보존액을 포함한 세포성 바이오 의약품은 근육, 피하층, 혈관, 척수강, 병변 부위에 바로 주사할 수 있는 방법을 제공한다. 동결보존액 내 생체 내 독성반응을 유발할 수 있는 DMSO 농도는 7.5% 미만으로 조성하여 독성반응을 유발할 수 있는 순 총량이 적어 독성반응을 유발하지 않는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포성 바이오 의약품의 장기간 보관이 관한 동결보존액에 관한 것이다. 상기 동결보존액은 생물학적 제제를 포함하지 않으며, 화학적 제제로만 구성되어 해동 후 세척, 정제 및 현탁 단계 없이 바로 생체 내 주입할 수 있으며, 3년 이상 안정적으로 보관할 수 있다.

본 발명은 생물학적 성분이 전혀 포함되지 않으며 화학적 제형으로 구성된 동결보존 제형이며, 생체 내 바로 주입 시 독성반응을 유발하지 않는 것으로 밝혀진 제형으로 구성되어 있어 해동 후 바로 주입할 수 있는 특성이 있다.

살아있는 세포 혹은 세포로 구성된 오가노이드, 미세구, 그리고 인공조직 등을 포함한 세포성 치료제는 치료제를 구성하는 세포의 생존이 보존되어야만 그 생물학적 작용기전을 유지할 수 있다. 생 세포로 구성된 바이오 의약품의 생존은 냉장 혹은 실온에서 24시간밖에 보존할 수 있으며, 그 이상의 기간 동안 세포의 생존을 유지할 수 없어 치료제의 작용기전이 소실된다. 본 발명의 동결보존 방법은 -136도 미만으로 보관하여 세포 내 수분의 이동을 방지하여 대사활동을 중단하여 장기간 세포를 보존할 수 있다.

통상적인 동결보존은 동물성 혈청 성분이 우태아혈청 혹은 인간 혈청 유래 알부민이 이용된다. 동물성 성분은 동결보전 과정 중 발생하는 급격한 삼투압 및 전해질 이동과 얼음 결정체로부터 세포를 보호하는 용도로 사용되고 있으나, 동물성 성분에서 유래할 수 있는 인간 혹은 외인성 감염원으로부터의 위험은 피할 수 없다는 단점이 제시되었다. 이러한 위험성은 의약품으로서 안전성과 인허가에 큰 걸림돌로 작용한다.

본 발명은 HES를 이용하여 우태아혈청 혹은 인간 혈청 유래 알부민의 역할을 대체하는 방법을 제공한다. HES는 화학적으로 합성한 제제로 분자량(molecular weight, MW), 질량 치환율(molar substitution, MS), 그리고 C2 및 C6에 부착된 hydroxyethyl residue의 비율(C2/C6 비율)에 따라 결정되는 분해도에 따라 그 화학적 구조적 특성이 결정된다. 특히 생체 외 경우 MW이 세포 내외 삼투압 변화에 따라 수분의 이동을 조절하는 주요 인자이며, MS 및 C2/C6 비율은 생체 내 amylase에 의한 분해특성을 결정짓는 인자로 작용한다. 본 발명은 세포성 바이오 의약품의 동결보존에 작용하는 HES 분자량 및 HES 분자량 및 농도 조절을 통하여 세포성 바이오 의약품의 동결보존에 대한 방법을 제공한다.

HES는 세포 내로 투과할 수 없는 고분자 화학물로서, 얼음결정체로 인한 세포손상을 보호할 수 있으나, 세포 내 얼음결정에 의한 세포손상은 억제 혹은 방지할 수 없다. 본 발명은 HES와 더불어 세포 내로 투과할 수 있는 동결보존제인 DMSO를 사용하여 동결보존 시 세포 생존율을 증가하는 방법을 제공한다. DMSO는 세포의 동결보존에 가장 적용하는 동결보존제이나 그 농도가 높을수록 얼음결정에 의한 세포손상을 억제할 수 있으나, 고농도 DMSO에 의한 삼투압 변화와 전해질 이동에 의한 세포손상이 증가된다. 더불어 해동 후 세포성 바이오 의약품을 세척 과정 없이 생체 내 직접 주입하는 경우 고농도 DMSO에 의한 독성반응이 야기된다. 본 발명은 HES의 병합 사용을 통하여 동결보존에 요구되는 DMSO 농도를 낮추어 해동 후 바로 동결보존제 내 포함된 바이오 의약품을 생체 내 주입하는 방법을 제공한다.

본 발명은 동결보존 과정 중 발생하는 활성 산소 유리기(radical oxygen species, ROS)에 의한 세포손상을 억제 혹은 방지할 수 있는 기술을 제공한다. 본 발명은 NAC 및 저농도 DEX를 동결보존액 내 도입하여 동결과정 중 발생하는 ROS 생성의 억제, 생성된 ROS의 제거, ROS에 의한 세포손상을 억제하여 세포를 보호할 수 있는 기술을 제공한다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 저온보관용액 및 2배동결용액의 제조

저온보관용액은 4가지 운반용액을 이용하여 제조하였다. 본 실시예는 HTK(히스티딘-트립토판-케토글루타르산, Custodiol Solution, 제니스팜), 테트라-하이드록시에틸 스타치(tetra-hydroxyethyl starch; T-HES, 130 kDa, 볼루벤주, 프레지니우스카비 코리아), 펜타-하이드록시에틸 스타치(penta-hydroxyethyl starch; P-HES, 200 kDa, 제일펜타스타치, 제일약품) 혹은 헥사-하이드록시에틸 스타치(hexa-hydroxyehtyl starch; H-HES, 600 kDa, 헥스텐드, 에이치케이이노엔)을 포함하여 4가지 운반용액을 사용하였다. 각 운반용액은 최종 5 중량부가 되도록 첨가하여 제조하였다. 상기 운반용액 내 필수아미노산(헤파타민주, 중외제약)은 최종 2 중량부가 되도록 첨가하였고, 인슐린(100 IU/mL, 휴물린알주, 한국릴리)는 최종 2 중량부가 되도록 첨가하고, 포도당(50% dextrose solution, 중외제약)은 최종 2 중량부가 되도록 첨가하였으며, NAC(100 mg/mL, 뮤테란주, 환화제약)은 최종 2 중량부로 되도록 첨가하였고, DEX(5 mg/mL, 유한양행)은 최종 1 μg/mL 농도가 되도록 첨가한 후 혼합하였다. HTK, T-HES, P-HES, H-HES 운반용액을 기반으로 4가지 조성의 저온보관용액을 제조하였다.

2배동결용액 또한 저온보관용액과 동일하게 4가지 운반용액을 이용하여 제조하였다. HTK, T-HES, P-HES, H-HES는 최종 5 중량부가 되도록 사용하였다. 상기 운반용액 내 DMSO는 5, 10, 13, 15, 20 중량부가 되도록 첨가한 후 혼합하여 제조하여 혼합하였으며, 운반용액과 DMSO 농도에 따라 10가지 2배동결용액을 제조하였다.

대조군으로 DMEM 배양액 내 20% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 및 10% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액과 무혈청 운반용액인 CryoStor(STEMCELL Technologies) 내 10% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액을 사용하였다.

< 실시예 2> 세포주 배양

세포주는 3T3-L1, C2C12 및 SH-SY5Y를 이용하였고, 상기 세포주는 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포주는 배양용기 cm² 당 2,000개 세포를 파종한 후 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM:F12 세포배양액을 첨가한 후 배양하였다. 배양용기 내 세포가 차지하는 밀도가 90% 이상일 때 0.5% trypsin/1 mM EDTA 용액으로 처리하여 배양용기로부터 세포를 수거하였다. 수거한 세포는 300 × g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿은 저온보관용액을 첨가하여 2.0E+07/mL 세포 수가 되도로록 현탁하였다. 세포 현탁액은 동량의 0.4% trypan blue(웰진)과 혼합하여 세포 수는 세포 수 측정기(TC20 Autmated Cell Counter, Bio-Rad)를 이용하여 세포 수 및 생존율을 평가하였다. 저온보관용액 내 현탁한 세포는 동결보존 전까지 4도에 보관하였다.

< 실시예 3> 줄기세포치료제 배양

장기배양법을 이용하여 분리 배양한 골수 유래 중간엽줄기세포(BMSCs), 심장줄기세포(CSC), 신경줄기세포(PNSC)를 사용하였다. 세포은행에서 보관 중인 BMSC, CSC, PNSC를 해동 한 후 배양용기 단위면적 cm² 당 5,000개 세포를 파종하였으며, 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM:F12 세포배양액을 이용하여 배양하였다. 배양용기 내 세포가 차지하는 밀도가 90% 이상일 때 0.5% trypsin/1 mM EDTA 용액으로 처리하여 배양용기로부터 세포를 수거하였고, 수거한 세포는 300 x g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿은 저온보관용액을 첨가하여 2.0E+07/mL 세포 수가 되도록 현탁하였으며, 동량의 0.4% trypan blue(웰진)과 혼합하여 TC20 Autmated Cell Counter로 세포 수 및 생존율을 측정하였다. 동결보존 전까지 4도에 보관하였다.

< 실시예 4> 다 세포성 미세구 제조

본 실시예는 부유배양을 통하여 다 세포성 미세구를 제조하였다. 배양한 CSC 혹은 PNSC는 2% 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 1 μM DEX, 1 mM NAC로 구성된 부유세포배양액을 이용하여 현탁하였다. 세포부착이 방지되는 Ultra Low Attachment T75 Flask 배양용기(Corning)에 1.0E+07 세포를 파종한 후 3일간 부유배양하였다. 배양 후 형성된 다 세포성 미세구는 10 mL transfer pipette을 이요하여 회수 한 후 원심분리하고 상층액을 제거하였고, 저온보관용액을 첨가한 후 2.0E+07 세포로 구성된 다 세포성 미세구는 1 mL 저온보관용액 내 현탁하고 동결보존 전까지 4도에 보관하였다.

< 실시예 5> 세포성 바이오 의약품의 동결 및 해동

저온보관용액 내 현탁하여 4도에 보관한 3T3-L1, C2C12 및 SH-SY5Y 세포와 BMSC, CSC, PNSC 성분의 줄기세포 치료제는 동일한 성분의 운반용액으로 제조한 2배동결용액과 1:1로 혼합하였다. 즉 HTK 용액으로 제조한 저온보관용액 내 현탁한 세포는 HTK 용액으로 제조한 2배동결용액으로 혼합하였으며, T-HES로 제조한 저온보관용액은 T-HES로 제조한 2배동결용액과 혼합하였다. 최종 5, 10, 13, 15, 20 중량부 DMSO를 포함한 2배동결용액과 저온보관용액과 1:1 용량 비율로 혼합하여 최종 동결보존용액 내 2.5, 5, 6.5, 7.5, 10 중량부 DMSO와 1.0E+07/mL 세포 혹은 줄기세포가 포함된 동결보존용액은 4도에 보관하였다.

세포 혹은 줄기세포치료제가 포함한 동결보존액 1 mL은 cryovial(Thermo)에 첨가한 후 freezing container(Mr. Frosty, Thermo)에 넣고 단계별 과정을 통하여 동결하였다. Freezing container는 -70도 초저온 냉동고에 옮긴 후 6시간 동안 보관하여 분당 1도 속도로 온도를 낮추었으며, 이후 초저온 냉동고에서 freezing container 내 cryovial을 꺼낸 후 액체질소통에 넣어 -196도에서 해동 전까지 보관하였다. 동결보존 후 해동은 액체질소통에 보관 중인 cryovial을 꺼낸 후 -20도 냉동고에 10분간 보관하였다. 이후 cyrovial은 37도 항온수조 내 넣어 1분 내 급속 해동하였다.

해동 후 cryovial은 ice bucket에 넣어 냉장 상태로 유지하였다. Cryovial 내 동결보존액과 동량의 냉장 1M 슈크로즈 용액을 동량 첨가한 후 3분간 ice bucket에 거치하였다. 이후 1M 슈크로즈 용액과 혼합된 동결보존액과 동량의 0.5M 슈크로즈 용액을 첨가한 후 3분간 ice bucket에 거치하였다. 이후 냉장 PBS를 첨가하여 혼합한 후 300 × g에서 5분간 원심분리하였다.

< 실시예 6> 세포주 및 세포성 바이오 의약품의 회수율 및 생존율

해동 후 동결보존한 세포의 회수율(Recovery Rate, %), 생존율(Viability, %) 및 배양용기에 파종한 후 부착율(Attachment Rate, %)을 평가하였다. 회수율은 동결 전 세포 수 대비 해동 후 세포 수를 백분율로 표기하였으며, TC20 Cell Counter로 동결 전 및 해동 후 세포 수를 측정하였다. 생존율은 해동 후 동결보존액 내 현탁된 세포 20 μL를 취하여 동량의 0.4% trypan blue와 혼합한 후 TC20 Cell Counter에서 trypan blue 음성 세포 수를 측정하여 생존율을 평가하였다. 부착율은 동결보존액 내 현탁된 세포 20 μL를 200 μL 세포배양액이 미리 첨가된 48-multiwell에 첨가한 후 혼합하였고, 2시간 동안 37도 인큐베이터에 거치하였다. 이후 세포배양액을 제거한 후 200 μL PBS를 첨가하고 세척한 후 다시 상층액을 제거하였다. 이후 48-multiwell plate는 분석 전까지 -20도 냉동고에 밀봉하여 보관하였다. 세포 부착율은 dsDNA 함량을 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit(Invitrogen)을 이용하여 분석하였다. 세포 부착율은 파종한 세포의 dsDNA 함량 대비 부착한 세포의 dsDNA 함량을 백분율로 산정하여 평가하였다.

도 1, 도 2, 도 3에 제시하였듯이, 3T3-L1, C2C12 및 SH-SY5Y 세포주를 대상으로 평가한 동결보존에서 HES 기반 동결보존용액 및 HES 분자량에 따른 효과는 유사한 경향을 보였다. HES 분자량이 낮을수록 높은 농도의 DMSO가 함유된 동결보존 조건에서 해동 후 세포의 높은 회수율과 생존율을 보였다. 반면에 HES 분자량이 높을수록 낮은 농도의 DMSO가 포함된 동결보존 조건에서 해동 후 세포의 회수율과 생존율이 높았다. 특히 T-HES를 운반용액으로 사용한 경우 10% 중량부 DMSO를 포함한 동결보존용액에서 대조군인 20% 중량부 FBS 및 10% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액과 10% 중량부 DMSO를 포함한 CryoStor 보다 해동 후 유의하게 높은 해동 후 3T3-L1, C2C12, SH-SY5Y 세포의 높은 회수율과 파종 후 부착율을 확인할 수 있었다. P-HES 경우 6.5 내지 7.5% 중량부 DMSO를 함유한 동결보존용액에서 평가한 모든 세포주에서 해동 후 높은 회수율, 생존율, 그리고 부착율을 확인할 수 있었으며, CryoStor 혹은 FBS를 포함한 동결보존용액보다 효능이 유의하게 높았다. 분자량이 가장 높은 H-HES를 사용한 경우 동결보존 시 DMSO 함량을 유의하게 낮출 수 있었으며, 5% 중량부의 DMSO를 포함한 동결보존액에서 대조 동결보존용액 대비 해동 후 모든 세포 주에서 회수율, 생존율, 그리고 부착율이 높았다. 상기 결과는 동결보존용액 내 HES를 통하여 동결과정 중 세포의 손상과 죽음을 방지할 수 있으며, 동결보존용액 내 FBS 또한 혈청과 같은 생물학적 조성 없이도 세포를 동결보존 할 수 있는 결과를 나타낸다. 그러나 HES를 운반용액으로 사용한 경우에도 동결보존용액에 DMSO는 필수적인 조성으로 첨가하여야 되며, 분자량이 큰 H-HES로 구성하는 경우에도 최소 5% 중량부 이상의 DMSO가 요구되는 것을 알 수 있다.

도 4, 도 5 및 도 6에 제시하였듯이, BMSC, CSC 및 PNSC 줄기세포 치료제를 대상으로 평가한 결과 또한 세포주와 유사하는 효과를 나타내었다. 분자량이 낮은 T-HES를 적용한 경우 고 농도 DMSO에서 해동 후 가장 높은 세포 회수율, 생존율, 그리고 부착율을 보였으며, 평가한 모든 줄기세포치료제 성분인 BMSC, CSC 그리고 PNSC에서 동일한 결과를 보였다. 분자량이 200 kDa인 P-HES를 운반용액으로 사용한 경우 6.5% 중량부 DMSO가 첨가된 동결보존용액에서 해동 후 세포의 회수율, 생존율 그리고 부착율이 가장 높았다. 분자량이 가능 큰 600 kDa인 H-HES를 운반용액으로 사용한 경우 5.0% 중량부 DMSO를 첨가한 동결보존용액으로 동결보존한 BMSC, CSC 그리고 PNSC에서 해동 후 세포의 회수율, 생존율 그리고 부착율이 가장 높았다. 또한 HES를 운반용액으로 사용한 동결보존용액으로 동결보존한 줄기세포치료제에서 FBS가 함유된 동결보존용액으로 동결보존한 줄기세포치료제 보다 해동 후 세포 회수율, 생존율 그리고 부착율이 높았다.

도 7은 CSC 혹은 PNSC를 부유배양 환경에서 제조한 다 세포성 미세구인 살아있는 세포로 구성된 인공조직에서 HES를 함유한 동결보존용액의 유효성을 평가한 결과를 나타내고 있다. 세포주 및 줄기세포 치료제와 동일한 경향으로 분자량이 큰 HES가 함유된 동결보존용액에서 미세구의 생존율과 부착율이 높았다. 특히 분자량이 가장 큰 H-HES와 5% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액으로 동결한 CSC 및 PNSC 미세구에서 해동 후 생존율과 부착율이 가장 높았으며, FBS를 함유한 동결보존용액과 비교하여 유의하게 높은 생존율과 부착율을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 줄기세포 바이오 의약품 또한 HES를 운반용액으로 사용한 경우 안정적으로 동결보존할 수 있음을 확인하였고, 분자량이 높은 HES와 5%~7.5% 중량부의 DMSO로 구성된 동결보존용액이 줄기세포 바이오 의약품의 안정적 동결보존에 활용될 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7> 해동 후 세포성 바이오 의약품의 ROS 함량과 Annexin -V 발현율

해동 후 동결보존용액 현탁된 세포주 및 줄기세포 치료제의 세포 내 유리산소라디칼 함량 후 세포죽음 표지자인 annexin-V 발현을 통하여 세포손상 및 세포죽음 정도를 평가하였다. 유리산소라디칼(Radical Oxygen Species, ROS)는 세포투과성 ROS 표지자인 dichlorofluores cin diacetate(DCF-DA, Thermo)를 이용하여 측정하였다. 세포주 혹은 줄기세포 치료제를 함유한 동결보존용액 20 μL를 취하여 20 μM DCF-DA를 첨가한 후 37도에서 30분간 반응하였다. DCF-DA로 라벨링된 세포는 cytocentrifuge를 이용하여 glass slide에 옮긴 후 fluorescent microscope을 이용하여 영상을 취득하였다. 세포 내 축적은 세포 내 ROS Intenstiy를 측정하고 비교 평가하였다. 세포죽음 표지자로서 annexin-V 발현율을 평가하였다. FITC-conjugated Annexin-V(Invitrogen) 10 μL를 동결보존용액 내 포함된 세포와 실온에서 30분간 거치하여 반응시킨 후 cytocentrifuge를 이용하여 glass slide에 옮긴 후 fluorescent microscope을 이용하여 총 1,000개 세포에서 발현되는 annexin-V 발현을 백분율로 평가하였다.

도 8은 동결보존 과정 중 발생하는 삼투압, 수분 및 전해질의 급속한 변화 혹은 불균형과 얼음 결정체에 의한 손상의 결과 세포 내 ROS이 축적되고 Annexin-V 발현이 증가되며, 그 결과 세포의 손상과 죽음을 야기한다. 동결보존용액에 따른 줄기세포치료제 내 ROS의 축적정도 및 Annexin-V 발현을 평가하였다. 동결보존용액을 구성하는 HES의 분자량이 높고 DMSO 함량이 낮을수록 ROS 함량은 낮았으며 Annexin-V 발현 또한 낮았다. 특히 600 kDa 분자량인 H-HES를 운반용액으로 5% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액 혹은 200 kDa 분자량인 P-HES 및 6.5% 중량부 DMSO 조성의 동결보존액을 이용하여 동결보존한 BMSC, CSC 그리고 PNSC 줄기세포 치료제 내 ROS 함량이 낮았으며 동시에 Annexin-V 발현이 낮았다. 특히 HES를 운반용액으로 사용한 경우 FBS를 포함한 동결보존용액과 비교하여 ROS 함량과 Annexin-V 발현율이 낮아 HES의 세포보호 효과를 확인할 수 있었다.

< 실시예 8> DEX 및 NAC에 의한 항산화 및 세포보호 기능

P-HES를 운반용액으로 사용하여 저온보관용액과 2배동결용액을 제조하였다. 저온보관용액 내 2 uM DEX, 2 mM NAC 혹은 2 uM DEX와 2 mM NAC가 첨가된 3가지 조성의 저온보관용액을 제조하였다. BMSC, CSC 및 PNSC를 2.0E+07/mL 밀도로 P-HES로 제조된 저온보관용액으로 현탁한 후 P-HES로 제조한 2배동결용액과 1:1 비율로 혼합하여 최종 동결보존용액 내 줄기세포 치료제를 현탁하였다. 실시예 5에서 제시된 방법으로 동결과정과 해동과정을 거친 후 줄기세포 치료제의 ROS 축적 정도 및 Annexin-V 발현율을 실시예 7에 제시한 방법으로 평가하여 DEX 및 NAC에 의한 동결 및 해동 과정 중 세포의 항산화 및 세포보호 기능을 평가하였다.

저농도 DEX 및 NAC는 항산화 기능과 더불어 세포보호 기능이 제시되어 있다. 도 9에 제시하였듯이 동결보존용액 내 DEX 및 NAC의 첨가에 의한 항산화 효과 및 세포보호 효과를 평가하였다. 1 μM DEX, 1 mM NAC, 혹은 DEX와 NAC 모두 첨가한 동결보존용액을 이용하여 동결보존한 BMSC, CSC, 그리고 PNSC 줄기세포 치료제가 DEX 혹은 NAC를 첨가하지 않은 동결보존용액으로 동결보존한 줄기세포 치료제 보다 유의하게 낮은 ROS 함량 및 Annexin-V 발현율을 보였다. 동결보존요액 내 NAC 첨가에 의한 ROS 및 Annexin-V 발현 감소는 미미하였으나, DEX의 첨가에 의한 ROS 및 Annexin-V 발현의 억제는 유효하게 증가하였다. 특히 DEX 및 NAC 모두 첨가된 동결보존용액이 동결보존 과정 중 세포의 손상과 죽음을 유의하게 감소할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 9> 해동 후 세포성 바이오 의약품의 성장 능력

T-HES, P-HES 및 H-HES를 운반용액으로 사용하여 3가지 조성의 저온보관용액을 제조하였으며, 저온보관용액 내 1 μM DEX 및 1 mM NAC를 첨가하였다. 더불어 5, 10, 13, 15, 20 중량부 DMSO를 포함한 2배동결용액을 제조하였다. BMSC, CSC 및 PNSC는 2.0E+07/mL 밀도로 저온보관용액을 이용하여 현탁하여 냉장 보관하였다. 이후 동량의 2배동결용액과 1:1 비율로 혼합한 후 상기 제시한 실시예 5에 따라 동결보존하였다. 실시예 5에 제시된 방법으로 해동 한 후 6-well plate에 cm² 당 3,000개 세포를 파종한 후 5일간 배양하였다.

파종한 세포와 배양 5일째 세포는 CelLytic^TM 용액(Sigma Aldrich)을 이용하여 세포를 용해하였고, 용해된 샘플 내 dsDNA 함량은 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit을 사용하여 측정하였다. 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, Synergy^TM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany)를 사용하여 발광 (emission) 485nm, 여기 (excitation) 540nm의 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도는 세포 수로 전환하기 위해 BMSC, CSC 및 PNSC를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 이 표준곡선을 이용하여 샘플 내 형광강도를 세포수로 변환하였다. 세포배가시간(population doubling time, PDT)는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(배양시간)/((logN2-logN1)/log2)] 수식을 이용하여 산정하였으며, N1은 파종 시 dsDNA 함량이며, N2는 배양 후 dsDNA함량이다. 세포배가수준(population doubling level, PDL)은 다음 공식에 따라 계산하였다. PDL = [PDL0 + 3.322(logN2-logN1)] 수식을 이용하였고, N1은 파종 시 dsDNA 함량이었고, N2는 세포 배양 후 dsDNA 함량이다.

도 10은 화학적 조성물로만 구성된 동결보존용액으로 동결보존한 BMSC, CSC, PNSC 줄기세포 치료제의 해동 후 줄기세포로서의 성장능력을 평가한 결과를 보여주고 있다. 해동 후 세포의 회수율, 생존율, 그리고 부착율과 동일한 경향으로 분자량이 높은 HES를 운반용액으로 적용하고 DMSO 함량이 낮을수록 해동 후 줄기세포 치료제의 성장능력이 유의하게 높았다. T-HES를 이용한 경우보다 P-HES 및 H-HES를 운반용액과 5 내지 7.5% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액으로 동결보존한 줄기세포 치료제에서 세포배가시간(PDT)이 가장 낮었으며 세포배가수준(PDL)이 가장 높았으며, FBS를 함유한 대조 동결보존용액 대비 유의하게 줄기세포 치료제의 성장능력이 유지되는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 10> 해동 후 세포성 바이오 의약품의 분화 능력

해동 후 줄기세포 치료제의 지방세포 및 조골세포로의 분화능력을 평가하였다. 해동 후 2.0E+05개 줄기세포를 24-well 배양용기에 파종한 후 90% DMEM에 10% CS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 80 μM indomethacin (Sigma), 1 μM DEX, 5 μg/mL insulin이 첨가된 분화배지를 첨가한 후 14일 동안 배양하였다. 줄기세포의 지방세포로의 분화정도는 분화 유도 2주 후에 세포질 내 지방축적의 지표인 0.5% Oil Red O (Sigma)용액을 상온에서 1시간 염색하여 세포질 내 triglyceride 함량을 Triglyceride-Glo kit(Promega)를 이용하여 평가하였다. 해동 후 줄기세포의 조골세포로의 분화능력을 평가하기 위해서 2.0E+05개 세포를 24-well 배양용기에 파종한 후 1 μM DEX, 50 μM Ascorbic Acid, 10 mM β-glycerol phosphate, 10% calf serum을 함유한 α-MEM을 첨가한 후 2주간 배양하여 분화를 유도하였다. 조골세포로의 분화여부는 분화 유도 2주 후 Alizarin Red(Sigma)을 첨가한 후 염색하였으며, 미네랄의 침착 정도는 520 nm에서 흡광도를 측정하여 optical density로 비교 분석하였다.

도 11에서 제시하였듯이, 동결보존 후 해동한 줄기세포 치료제의 지방세포 및 조골세포로의 분화능력과 그 정도를 평가한 결과를 제시하고 있다. 해동 후 줄기세포 치료제의 성장능력과 동일한 경향으로 분자량이 높은 P-HES 혹은 H-HES를 보관용액으로 사용하고 5% 내지 7.5% 중량부 DMSO로 제조한 동결보존용액으로 동결보존한 줄기세포 치료제에서 가장 높은 분화능력을 보였다. 특히 H-HES 혹은 P-HES와 5% 내지 7.5% 중량부 DMSO로 구성된 동결보존용액을 이용하여 다 분화능력이 유지된 줄기세포 치료제를 동결보존할 수 있는 방법을 제공한다.

< 실시예 11> 해동 후 세포성 바이오 의약품의 생리활성도

T-HES, P-HES 및 H-HES를 운반용액으로 사용하여 3가지 조성의 저온보관용액을 제조하였으며, 저온보관용액 내 1 μM DEX 및 1 mM NAC를 첨가하였다. 더불어 5, 10, 13, 15, 20 중량부 DMSO를 포함한 2배동결용액을 제조하였다. BMSC, CSC 및 PNSC는 2.0E+07/mL 밀도로 저온보관용액을 이용하여 현탁하여 냉장 보관하였다. 이후 동량의 2배동결용액과 1:1 비율로 혼합한 후 상기 제시한 실시예 5에 따라 동결보존하였다. 실시예 5에 제시된 방법으로 해동 한 후 300 × g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. TRIzol 1 mL을 첨가한 후 total RNA를 분리하기 전까지 -20도 냉동보관하였다. PureLink RNA 키트(Thermo)을 이용하여 total RNA를 추출 정제하였으며, 역전사효소(Reverse Transcriptase)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. SDF-1 mRNA 특이 시발체와 SYBR Green Real-Time PCR kit를 이용하여 실시간 유전자 증폭을 통하여 SDF-1 mRNA 유전자를 증폭하였으며, SH-SY5Y 대비 SDF-1 mRNA 발현율을 2^-ΔΔCt방법으로 평가하였다.

도 12에 제시하였듯이, 동결보존한 줄기세포 치료제의 생리활성도를 mRNA 수준에서 평가하였다. 줄기세포 치료제의 조직재생 기전을 매개하는 대표적인 작용인자인 SDF-1 mRNA 발현을 통하여 동결보존한 줄기세포 치료제의 역가를 평가하였다. HES와 DMSO로 구성된 동결보존용액을 이용하여 동결보존한 줄기세포 치료제에서 FBS 및 DMSO로 구성된 대조군 동결보존요액으로 동결한 줄기세포보다 유의하게 높은 SDF-1 mRNA 발현을 보였다. 특히 CSC 및 PNSC 줄기세포 치료제가 SDF-1 mRNA 발현율이 높았다. 분자량이 높은 P-HES 및 H-HES와 5% 내지 7.5% 중량부 DMSO로 구성한 동결보존용액으로 동결보존한 줄기세포 치료제에서 해동 후 세포의 회수율, 생존율, 부착율, 성장률, 그리고 분화능력 및 생리활성도가 유의하게 높게 유지되는 것을 확인할 수 있으며, 본 실시예를 통하여 화학적 조성물만으로도 바이오 의약품을 안정적으로 동결보존할 수 있는 기술을 제공할 수 있었다.

< 실시예 12> 동결방법에 따른 세포성 바이오 의약품의 회수율 및 생존율

본 발명에서는 저온보관용액과 2배동결용액의 혼합 절차와 거치 온도에 따른 바이오 의약품의 회수율 및 생존율을 평가하였다. P-HES를 운반용액으로 사용하였으며 1 μM DEX 및 1 mM NAC를 첨가하여 저온보관용액을 제조하였다. P-HES를 이용하여 15 중량부의 DMSO가 포함된 2배동결용액을 제조하였다. CSC는 증복배양한 후 trypsin/EDTA로 세포를 수거하고, 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 회수한 CSC는 저온보관용액과 혼합하여 2.0E+07/mL 세포밀도로 현탁하였다. 저온보관용액 내 현탁한 CSC는 실온(room temperature, RT)에서 혹은 4도 냉장상태에서 보관하였다. 더불어 저온보관용액 내 현탁한 CSC는 2배동결용액과 1:1로 혼합한 후 실온(room temperature, RT)에서 혹은 4도 냉장상태에서 보관하였다. 각 조건에 보관 중인 CSC의 세포수 및 생존율을 TC20 cell counter를 이용하여 평가하였다.

도 13에서 제시하였듯이, 동결보존하는 공정 및 조건에 따라 바이오 의약품의 회수율과 생존율에 영향을 받을 수 있으며, 특히 소량 생산배치 대비 대량 생산배치에서 충전 시 소요되는 시간과 환경에 따라 바이오 의약품의 품질에 영향을 받을 수 있다. 동결보관용액 내 현탁한 세포치료제의 보관 온도 및 거치시간에 따른 줄기세포 치료제의 회수율 및 생존율에 미치는 영향을 평가하였으며, 실온보다 냉장 상태에서 P-HES로 구성한 저온보관용액(4℃_Cryo-VM)에서 현탁하여 보관 시 줄기세포를 20시간 이상 안정적으로 보관할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 더불어 2배동결용액과 혼합 후 실온에서 보관할 경우(RT_Cryo-VM+2XCryo) 줄기세포 치료제의 생존율과 회수율이 유의하게 감소할 수 있는 것을 확인할 수 있다. 이상의 결과는 HES로 구성한 저온보관용액을 이용하여 줄기세포를 장시간 안정적으로 보관할 수 있는 기술을 제공하고, 충전 직전 2배동결용액과 최종 혼합하여 동결과정을 통하여 세포의 손상을 최소화하며 줄기세포 치료제를 동결보존할 수 있는 기술을 제공한다.

Claims

하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES), N-아세틸 시스테인(N-Acetyl Cystein; NAC) 및 덱사메타손(Dexamethasone; DEX)을 포함하는 저온보관용액; 및 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch; HES) 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)을 포함하는 2배동결용액을 포함하며, 전체 동결보존액에 대하여 상기 DMSO는 5 내지 7.5 중량부로 포함되고, 히스티딘-트립토판-케토글루타르산(HTK)은 포함되지 않는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 HES는 테트라-하이드록시에틸 스타치(tetra-hydroxyethyl starch; T-HES), 펜타-하이드록시에틸 스타치(penta-hydroxyethyl starch; P-HES) 또는 헥사-하이드록시에틸 스타치(hexa-hydroxyehtyl starch; H-HES)인 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물.
제1항에 있어서, 전체 동결보존액 조성물에 대하여 상기 HES는 3 내지 10 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 동결보존액 조성물은 0.1 내지 5 mM NAC 및 0.1 내지 5 μM DEX를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 저온보관용액은 필수아미노산, 인슐린 및 포도당을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포성 바이오 의약품은 세포치료제, 줄기세포치료제, 면역치료제, 오가노이드, 미세구 또는 인공조직인 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존액 조성물.
1) HES, NAC 및 DEX를 포함하는 저온보관용액을 제조하는 단계;
2) HES 및 DMSO를 포함하는 2배동결용액을 제조하는 단계;
3) 상기 1) 단계에서 제조된 저온보관용액에 세포성 바이오 의약품을 현탁하는 단계;
4) 상기 2) 단계에서 제조된 2배동결용액에 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품을 혼합하는 단계; 및
5) 상기 4) 단계에서 혼합된 세포성 바이오 의약품 동결보존액을 동결보존하는 단계를 포함하며, 전체 동결보존액에 대하여 상기 DMSO는 5 내지 7.5 중량부로 포함되고, 히스티딘-트립토판-케토글루타르산(HTK)은 포함되지 않는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
제7항에 있어서, 상기 HES는 T-HES, P-HES 또는 H-HES인 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
제7항에 있어서, 전체 저온보관용액 또는 2배동결용액에 대하여 상기 HES는 3 내지 10 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
제7항에 있어서, 상기 저온보관용액은 0.2 내지 10 mM NAC 및 0.2 내지 10 μM DEX를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품은 4℃에서 보관하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
제7항에 있어서, 상기 4) 단계는 상기 2) 단계에서 제조된 2배동결용액 및 상기 3) 단계에서 현탁된 세포성 바이오 의약품을 1 : 1의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
제7항에 있어서, 상기 동결보존하는 단계는 -1℃/min의 속도로 -75℃까지 동결한 후, -135℃ 내지 -196℃의 액체질소에서 보관하는 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.
제7항에 있어서, 상기 세포성 바이오 의약품은 세포치료제, 줄기세포치료제, 면역치료제, 오가노이드, 미세구 또는 인공조직인 것을 특징으로 하는 세포성 바이오 의약품의 장기 보존용 동결보존 방법.